JPH08506011A

JPH08506011A - ｃＤＮＡ合成のための方法及び組成物

Info

Publication number: JPH08506011A
Application number: JP6514432A
Authority: JP
Inventors: イー．ミラー，ジェフリー
Original assignee: イー．ミラー，ジェフリー
Priority date: 1992-12-09
Filing date: 1993-12-09
Publication date: 1996-07-02
Also published as: CA2151484A1; EP0673382A4; AU5871094A; WO1994013689A1; EP0673382A1; US6498025B1

Abstract

(57)【要約】ｃＤＮＡをインビボで合成する方法及び組成物が開示されており、そこでは、ＲＮＡ鋳型分子にインビボでアニールする合成ポリヌクレオチド分子が、逆転写酵素のためのプライマーとしてインビボで用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】 cDNA合成のための方法及び組成物技術の分野本発明は、DNA合成、特にインビボでの相補的DNAの合成のための方法及び組成物に係わる。発明の背景本発明は、分子生物学のための道具である。分子生物学の術語、DNA、RNA及びタンパクの構造、及びこれらの分子の相互関係についての概説は、Darnell et a l.のSynthesis of Proteins andNucleic Acids第４章、Molecular Cell Biology ，Scientific American Books（1989）に見られる。これらの問題については、D arnell et al.，（1989）の本文全体及びLewin，Genes IV，Oxford University Press（1990）により詳細に取り扱われている。遺伝情報は生物の遺伝子にコードされている。遺伝子は核酸、通常はデオキシリボ核酸（DNA）のポリマーからなる。DNAは４種のヌクレオチド塩基の連続からなり、遺伝子により運ばれる遺伝情報はDNA分子中のヌクレオチド塩基の特異的配列によりコードされている。構造遺伝子中の遺伝情報はタンパクをコードし、特定のタンパクの配列及び構造（従って機能）は、そのタンパクをコードする遺伝子内のヌクレオチド塩基の順番により決定される。タンパクは、細胞構造から環境に対する生物の反応まで、生物のアイデンティティーを決定する。即ち、これらのタンパクをコードする遺伝子が生物のアイデンティティーを決定するのである。構造遺伝子内にコードされる情報は、転写及び翻訳の工程を経て「発現」される。転写によりメッセンジャーRNA（mRNA）と呼ばれる遺伝子コードの中間キャリアーが生産される。メッセンジャーRNAは遺伝子の効率的なコピーであり、デオキシリボ核酸ではなくリボ核酸（即ちRNA）のポリマーである。真核生物（これは一般に細菌よりも複雑な生物である）においては、遺伝子はコード領域（「エキソン」と呼ばれる）と非コード領域（「イントロン」と呼ばれる）からなる。エキソンは遺伝子のタンパク配列を直接コードする。イントロンは非常に大きいものもあり、特定の遺伝子中には多くのイントロン配列が存在し得る。非コードイントロンの役割は明確ではない。しかし、これらの介在配列は２つの重要な役割を果たす証拠がある。即ち、第１にこれらはエキソンのコード領域をより小さなタンパクコード単位に分け、転写及び翻訳の間のエラーを減らし、そして第２にそれらはタンパク配列の別々の部分あるいはカセットを進化の間により容易に組み換えられるエキソン単位に制御し、そして新たなタンパクの発生を容易にし、これは究極的には種の生き残りを促進するものである。転写の工程は遺伝子全体のmRNAコピーの形成を含む。即ち、転写工程により生産されたmRNAは、非コードイントロン配列とタンパクコードエキソン配列の両方を含んでいる。従って、転写により最初に生成されるmRNAはそれがコピーされた遺伝子と同じ長さを有する。次にこの未成熟なmRNAはプロセシング段階を経て、この間に非コードイントロン領域はスプライシングにより除かれる。従って得られるプロセシングを受けたmRNA分子はタンパクをコードするのに必要な情報のみを含む（即ち、結合されたエキソン配列のみのコピーを含む）。従ってこれらのプロセシングを受けたmRNA分子はそのmRNAが最初にコピーされた「ゲノム配列」（クロモソーム中に存在するままの遺伝子エキソン及びイントロン）よりも長さがかなり短い。プロセシングを受けたmRNAはこの段階においてポリリボアデニル酸、ポリ（Ａ）のテイルを分子の一方の末端（３’末端）に含み、分子の他端（５’末端）に「キャップ」構造を含むように改変もされる（標準的な命名法によれば、分子の末端化学基によりDNA及びRNA分子の一方の末端を５’末端とし、他端を３’末端としている）。イントロンを除去するようにプロセシングを受け、５’キャップと３’ポリ（Ａ）テールを有するmRNA分子は、「成熟」 mRNA分子と呼ばれる。非コードイントロン配列の除去を説明する、転写工程の極めて簡略化された図を図１に示す。成熟メッセンジャーRNAにより運ばれる情報をタンパクに変換する段階は翻訳と呼ばれる。翻訳は、構造遺伝子中にあるヌクレオチド配列によりコードされた情報をアミノ酸の配列からなる特定のタンパクに変換する手段の最後の段階である。遺伝子のクローニングは1970年代に可能になった。初期の実験においては、細菌から小さい遺伝子がクローン化された。それ以来、分子生物学及び遺伝子工学の進歩はとてつもない速度で進行し、ヒトゲノム全体の配列が現在決定されつつあるまでになった。しかしこの分野の技術の急速な進歩にもかかわらず、いくつかの限界が依然として存在する。その１つは非常に大きな構造遺伝子のクローニングが困難なことである。遺伝子のサイズは、それが含むヌクレオチド塩基の数により測定され、通常は塩基の千単位（キロ塩基、kb）で表される。より大きな遺伝子のいくつかの例はあるものの、殆どの構造遺伝子（エキソン）の全コード配列は典型的には全体で１〜10kbである。しかし、エキソンセグメントの間の多数の大きなイントロン配列の存在により、ゲノムレベルではこれらの遺伝子はずっと大きな領域にわたって拡がり、数十あるいは数百キロ塩基にわたることも多い。例えばYAC（Yeast A rtificial Chromosome）のような現在の遺伝子クローニングベクターにより非常に大きな（100〜300kb）ゲノムセグメントのクローニングが可能であるが、このようなゲノムインサートは非コードイントロン配列を含み、これは人工的な系におけるタンパクの発現を妨げる。部分的遺伝子配列、あるいはイントロンを含む配列は、非機能的な切断されたタンパクの発現を生じ、あるいは５’翻訳開始部位の配列がない場合は、関係のない誤ったタンパク配列の発現を生じる。スクリーニングの工程の間に部分的遺伝子が特定された場合でも、遺伝子の残りの部分を回復する必要がある。これは極めて複雑な工程である。遺伝子が多くのイントロン配列を含む場合、それ故に遺伝子が大きく、遺伝子の残りの部分を回復しようとすると何年もの努力を必要とするかもしれない。その後に遺伝子フラグメントの相対的な順番を決定し、イントロン配列からエキソン配列を区別するためにさらに労力を要する。遺伝子を一つの範囲内の（contiguous）タンパクをコードするカセットとしてクローン化する能力は、遺伝子の同定が、クローン化された遺伝子を同定する通常の方法である、組換え体細菌またはウィスル系におけるタンパクの産生と所望のタンパクの機能または構造についての「スクリーニング」による検出方法によりなされる場合には特に重要である。構造遺伝子をクローン化するために、分子生物学者は上記の細胞mRNAのプロセシング機能を利用した。それによりイントロン配列はスプライシングにより未成熟mRNAから除去され、当初の遺伝子よりもかなり小さい成熟mRNAが生成される。成熟mRNA分子を変換してDNA分子に戻す（従って「逆転写」と呼ばれる）ことにより、本質的部分ではないイントロン配列を含まない当初のコード配列（エキソン）を得ることができる。そのようなDNA分子はそれが由来するmRNA分子に相補的なものであるので、相補的DNAと呼ばれる。相補的DNA（cDNA）合成は遺伝子クローニングのための好ましい方法であり、これは組換えタンパク生産に順応できる比較的小さな一つの範囲内のタンパクコードカセット中に所望の遺伝子を回収できるからである。 cDNA技術の別の重要な使用は、特定の時期に細胞により発現される遺伝子を同定することである。遺伝子発現は細胞の部分においてかなりのエネルギー消費を必要とし、mRNA分子は短命な「タンパクを要請する者（protein requests）」として設計されている。従って僅かな例外（特に発生中の卵における）を除いてすぐに必要なタンパクをコードする遺伝子のみがmRNAに転写される。研究者は、細胞中に存在するmRNAの集団のcDNAコピーを作成し生成されたcDNAをクローニングすることにより、その時に発現された遺伝子からcDNAライブラリーを作成することができる。従って研究者は、発生の所与の段階において、あるいは与えた剌激に応答して、どの遺伝子が所与の組織タイプにおいて発現されたかを具体的に特定することができる。相補的DNAクローンは、研究及び産業の両方において非常に重要である。研究においては、タンパクの機能及び構造を決定するためにクローン化された遺伝子の発現を必要とする。さらに、大量のタンパクがポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生産に必要であり、これらはその後の研究プロトコールを通じて少量のタンパクに対して不可欠であり、そして細胞中のタンパクの位置を決定するのに不可欠である。細菌はクローン化された遺伝子を発現する宿主として一般的に使用される。細菌のような原核生物の遺伝子はイントロンを含んでいないので、これらの細胞は未成熟mRNAを機能的タンパクに翻訳されることのできる成熟mR NAにプロセシングするのに必要なスプライシング機構を有していない。真核生物遺伝子（即ちイントロン及びエキソンを含む）のゲノムクローンは細菌宿主中では発現され得ないが、同じ遺伝子のcDNAコピーは原核生物あるいは真核生物のいずれかにおいて発現され得る。従ってcDNAクローンは大きなスケールのタンパク生産に日常的に使用されている。この人工的なタンパク発現は、「組換え体タンパク」生産と呼ばれ、長年他の動物の組織からの単調で退屈な抽出により少量を手に入れることしかできなかった多くの医薬の製造の益々日常的な方法となりつつある。現在使用されているcDNA合成の方法はBerger and Kimmel，Guide to Molecula r Cloning Techniques．in Method in Enzymology Volume 152，Academic Press Inc．（1987）； Sambrook et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）及びOkayama，H.，et al.，Meth．Enzymol．159:3-27 （198 7）に概観されている。mRNA単離法の概観はSambrook et al．（1989）の７章及び８章にある。 mRNAの単離は、多くの技術的に困難な段階を含む単調で退屈な工程である。要約すると、細胞からのmRNA単離のための典型的な手順は、（１）細胞を破壊して細胞内容物を放出させること、（２）細胞からの全RNAを単離すること、（３）抽出されたRNAをオリゴ（dT）セルロースカラムを通してmRNA集団を選択すること、及び（４）単離されたmRNAをサイズにより分画化することを必要とする。すべての段階において、調製物がRNAを破壊し得る活性なリボヌクレアーゼ酵素に接触しないようにする細心の注意が必要である。cDNAクローニング方法の目的は、遺伝子の全コード配列を含む「完全長」cDNAクローンを得ることであるので、 mRNAの一体性を保持する方法を使用することが非常に重要である。リボヌクレアーゼ（RN アーゼ）酵素は非常に安定であるので、この活性酵素の非常に少量がm RNA調製物中に存在するだけで問題となる。RNアーゼは、ヒト皮膚を含む殆どあらゆる表面に存在し、従って非常に容易にRNA調製物に侵入し得る。汚染の問題をさけるため、全ての溶液、ガラス製品及びプラスチック製品を特別に処理しておかなければならない。そこからmRNAが分離される細胞は、非常に過酷で、どこにでもあるリボヌクレアーゼ酵素を直ちに不活性化する成分を含む溶液中で破壊され、その後RNA調製において使用される全ての溶液は、RNアーゼを不活性化する発癌物質と考えられているジエチルピロカーボネート（DEPC）により処理される。研究室においては、「リボヌクレアーゼフリー」と指定されるような特定の設備及び作業空間を別に確保しておくことも多いであろう。 RNA分解の可能性は細胞を破り開ける最初の段階に始まり（細胞自体がリボヌクレアーゼを含み、細胞の溶解に際してRNAと接触する）、方法を通じて継続する。細胞から抽出された全RNAはメッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA （tRNA）及びリボソームRNA（rRNA）からなる。mRNAは典型的には全細胞RNAのわずか１〜３％を構成するのみである（真核細胞あたり約１ｘ10^-12g mRNA，Sarge nt，T.D.，Methods Enzymol．152:423-432（1987））。殆どのcDNA合成反応は、成熟mRNA転写物のみに存在するポリ（Ａ）テイルの存在に依存している。成熟RN A転写物は細胞RNAの全部の中から、通常はアフィニティクロマトグラフィーにより選択的に抽出される。これはインビトロでうまくcDNAを合成するのに必須の段階であり、成熟mRNAの濃縮ができないことは、cDNAの低い収率や貧弱な品質を招く。 cDNA合成の前の最後の段階として、mRNA調製物をサイズにより選択する。これは通常、より小さいサイスの分子（通常はより大きいmRNAの分解された形態である）を除くことによって行われ、これらは除かれないとcDNAクローニング工程を妨害する。サイズによる選択は、既知のサイズのmRNA種を濃縮するためにも行われる。サイズ選択はアガロースゲルを通す電気泳動、カラムクロマトグラフィー、あるいはシュクロース勾配を通す沈殿分離により行うことができる。これらの方法は低収率を招き、二次分子内構造を破壊するために水酸化メチル水銀の存在を必要とし得る。水酸化メチル水銀は非常に毒性が強く、揮発性であり、取り扱いに細心の注意を要する。より安全な代替物（例えばグリオキサール／ジメチルスルホキシドまたはホルムアルデヒドを含むゲルの使用）が使用できるが、これらの方法はやはり危険な化学物質を必要とするものであり不利な点を有する。 cDNA合成に先立って細胞からmRNAを抽出する必要があることから別の欠点が発生する。例えば、特定の条件または生物の発生における特定の段階において細胞中でどの遺伝子が発現されるかを調べるのにcDNAクローニングがよく使用される。mRNAを抽出するために必要な時間及び条件はそれ自体が細胞の遺伝子発現パターンの変化を起こしかねない。さらに、非常に少量しか存在しない（細胞あたり 20コピーと考えられる）又は不安定なmRNA分子は、RNA単離工程の間に失われてしまい得る。現在のところ、mRNA単離工程に内在する損失のために、cDNAライブラリーを作成するのに必要な細胞数の下限がある。本発明は、最初のmRNA単離の必要を完全に避けることによりこの問題を解決しようとするものである。 mRNAの抽出と精製の後、cDNAの合成はインビトロで行われる。cDNA合成に現在使用されている方法は全て、mRNAの抽出と精製の後に行うものであるか、インビトロの条件下に死細胞について行われるものである。これらの方法については、 Kimmel and Berger（1987）； Okayama，H.，et al.，（1987）及びEmbleton，M .J.，et al.，Nucleic Acid Res.，20:3831-3837（1992）に詳細に記載されている。現在使用可能な方法は全てRNA依存性DNAポリメラーゼ酵素（より一般的には逆転写酵素と呼ばれる）を使用してmRNA鋳型からcDNAの第１の鎖を合成する。逆転写酵素は、他のDNAポリメラーゼと同様に、新たに核酸合成を開始できない。そうではなく、 mRNA鋳型にアニールした前もって存在するRNAまたはDNA鎖の３’末端のヒドロキシル基に、生成するcDNA鎖の第１のヌクレオチドを付加するのである。前記酵素が第１のヌクレオチドを付加する、この前もって存在する鎖はプライマーと呼ばれ、逆転写酵素活性に不可欠であるようである。その自然界における役割においては、逆転写酵素は感染レトロウィルス内で細胞に入る。この酵素は、ウィルスが先の感染の間に宿主細胞から除去した、特定の細胞トランスファーRNA（tRNA ）分子（全ての宿主細胞中に存在する）及びウィルスRNAクロモソームの両方と既に結合している。トランスファーRNAは短い（70〜80ヌクレオチド長）RNA分子であり、複雑な三次構造に折り畳まれている。これらの通常の細胞での役割は翻訳過程にある（Darnell et al．（1989），４章）。ウィルスが新たに感染した細胞に入った後、逆転写酵素−tRNA複合体は、この複合体が既に結合したウィルスRNA分子をRNA鋳型として使用したインビボ（細胞内）逆転写酵素反応のためのプライマーとして機能する。このインビボ反応から形成されたcDNAは次に、同じ逆転写酵素複合体により二本鎖DNAに変換され、感染細胞のクロモソームに組み込まれる。逆転写酵素に親和性を有するtRNA種（細胞中に存在する約40種のうちの２種）が特異的RNA分子上に存在する配列に相補的であり、従ってこれのみから発現するので、ウィルス複製に必要な逆転写酵素−tRNAプライマー複合体は細胞mRNA鋳型からのcDNA合成のためのプライマーとしては機能しないということは重要である。しかし、レトロウィルスに強い相同性を有する領域を持つマウス細胞中に存在するウィルス様の30S（VL30）エレメントが存在することは興味深い。これらのエレメントは欠陥Ｃ型ウィルスの性質を有し、逆転写され、レトロウィルスビリオン中にパッケージされる（Howk，R.S.，et al.，J．Virol．25:115-123（1978）； Besme r，P.U.，et al．J．Virol．29:1168-1176（1979））。逆転写酵素をインビトロ（細胞環境の外）cDNA合成に使用する場合、酵素のプライマー分子に対する必要性は通常、反応混合物中にオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを含有させることにより満足させられる。最も一般的なプライマーはデオキシリボチミジル酸のオリゴマー、オリゴ（dT）である。このプライマーは３’に位置し、mRNA分子のポリ（A）テイルに相補的なものである（“A”ヌクレオチドは“T”または“U”ヌクレオチドに相補的であり、アニールする）。従って、このオリゴ（dT）プライマー分子はポリ（A）テイル領域にアニールし、逆転写酵素のプライマーとして機能する。あるいは、インビトロcDNA合成ではRN A分子中の別の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用し得るが、アニーリングが起こるために必要な相補的ヌクレオチドの広い範囲のために、そのようなプライマーは、それがアニールするように設計されたmRNA分子について「配列特異的」なものとなる。そのような配列特異的プライマーの合成にはmRNA の部分のヌクレオチド配列を予め知っておく必要がある。逆転写酵素のプライマーの要件に関しては、Sambrook，et al．（1989）の５章に記載されている。最初のインビトロ逆転写酵素反応の生成物は、mRNA分子の単鎖相補的DNAコピーである。この反応は、「第１鎖cDNA合成」と指称されることが多い。その後、前記cDNAの第２の鎖を生成するために種々の方法が使用される。得られた二本鎖DNA（dsDNA）分子は次に末端を改変され、そして「ベクター」に挿入され、これにより各コピーの増殖、選択及び増幅が可能となる。最も一般的に使用される方法（例えば、Okayama and Berg， Molecular and Cell ular Biology 2:161-170（1982））は、以下のように要約することができる。mRNAの抽出と精製、及びmRNAのインビトロでの逆転写により単鎖cDNA分子を生産した後、mRNA鋳型を除去してDNAの第２の鎖を合成できるようにし、これにより二本鎖cDNA分子を形成する。次に特異的なDNAリンカーを二本鎖cDNAの平滑化した末端に結合し、そのcDNAを適当なクローニングベクターに結合する。現在使用されている方法は全て、mRNAのcDNAコピーを製造する逆転写酵素触媒段階を常にインビトロ条件下で行うものである。cDNA合成の品質（即ち、正確かつ完全長の相補的ＤＮＡを生成する能力）は、選択した酵素の忠実度と進行能力（processivity）、及び反応を行った条件に依存する。完全長cDNAよりも明らかに短いcDNAは許容できないし、高いエラー率は生成されるcDNAの有用性を減じてしまう。酵素が機能するように進化したインビボ条件ではなく、インビトロで逆転写酵素を使用すると、酵素の忠実度及び進行能力に悪影響を与えるようである。MuLV逆転写酵素のインビトロにおける忠実度は10^-4（即ち、10,000塩基について１つの誤ったヌクレオチド、あるいは100kbについて10の誤り）と見積もられ、最近の研究によればインビボにおける忠実度は約２ｘ10^-5（50,000塩基コピーについて１つの誤り、100kbあたり２つの誤り；Mont et al.，J．Virol．66:368 3-3689（1992））と測定されている。さらに、人工的な環境下では完全長の第１鎖の合成を得ることは困難であるが、インビボcDNA合成反応における酵素の進行能力は優れており、10kbの範囲を十分に越えて延びるcDNA導入が可能である（記載のデータを参照）。インビトロにおける逆転写酵素の性能を最適化するために条件が開発されてきたが、これらの条件はエラーの一定の頻度と、第１鎖cDNA合成の未成熟な終結とを招く。インビトロ条件は酵素についての最適な条件を反映するものではないことは明らかである。従って、現在のcDNA合成方法は、（１）mRNAが細胞から抽出及び精製されなければならないという必要、及び（２）インビトロ条件下における逆転写酵素の性能に制限されるものである。これらのファクターは組合わさって、cDNA合成の容易さ、cDNA合成の効率、生成できるcDNA分子のサイズ（これにより遺伝子はこの方法により容易にクローン化できるものである）、特定の条件下においてどの遺伝子が発現されるのかの決定におけるcDNA合成の正確さ、及び生成されたcDNAの忠実度を制限する。本発明の目的は、細胞からのmRNA分子の単離を必要としないcDNAの合成方法を提供することである。本発明の別の目的は、逆転写酵素のインビトロにおける活性を必要としないcD NAの合成方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、方法の効率、生成されるcDNAの忠実度、及びその方法により製造できるcDNAのサイズが、現在使用されているあらゆる方法よりも優れた、cDNAの合成方法を提供することである。発明の開示本発明は、インビボにおけるRNA鋳型の相補的DNAコピーの合成のための方法及び組成物に係わる。本発明によれば、RNA鋳型分子の相補的DNAコピーの合成のための方法が提供される。該方法は、RNA鋳型分子にインビボでアニールできるポリヌクレオチド分子を用意し、該ポリヌクレオチド分子をプライマーとして使用してDNA合成を開始できる少なくとも１の逆転写酵素を用意し、該逆転写酵素の存在下に前記ポリヌクレオチド分子を生存可能な標的細胞中に導入し、RNA鋳型分子に相補的なDNA 分子の合成を可能とする条件下に標的細胞をインキュベートすることを含む。本発明の別の形態は、少なくともその部分的な配列が既知のRNA鋳型分子の相補的DNAコピーをインビボで生成するための方法を提供する。この方法は、インビボでRNA鋳型分子にアニールでき、さらに少なくとも１の逆転写酵素のためのプライマーとして機能できるポリヌクレオチド分子をコードする配列に機能することができるように結合されたプロモーターをコードする配列を含むDNA分子を用意し、前記プロモーター配列の５’末端に位置する配列に相同なプライマーである第１のヌクレオチドプライマーを用意し、既知のRNA鋳型分子配列の部分に相補的な５’配列に結合したポリヌクレオチド分子の3’領域に相補的な3’配列を含むプライマーである第２のヌクレオチドプライマーを用意することを含む。その後、DNA分子を第１及び第２のプライマーと接触させ、そして混合物をクローン化DNA分子の増幅に適当な条件でクローン化DNA分子の増幅に適当な試薬により処理する。それにより生成された少なくとも１の増幅されたDNA分子を次に、コードされたRNA分子の生成に適当な条件でコードされたRNA分子の生成に適当な試薬により処理し、これを前記RNA分子をプライマーとして使用してDNA合成を開始できる少なくとも１の逆転写酵素の存在下に生存可能な標的細胞中に導入する。次に標的細胞を、少なくとも１のRNA鋳型分子に相補的なDNA分子が生成されるような条件下にインキュベートする。さらに本発明により、本発明の方法を実施するのに有用な組成物も提供される。そのような組成物は、インビボでRNA鋳型分子にアニールでき、さらに少なくとも１の逆転写酵素のためのプライマー分子として機能することができるポリヌクレオチド分子を、そのようなポリヌクレオチド分子をコードするDNA分子及び組換え体DNAベクターとともに含み、そのような組成物を含むキットが提供される。図面の簡単な説明図１は、真核生物のRNA転写工程の簡略化された図を示すものであり、mRNAのプロセシングの間の非コードイントロン配列の除去を説明するものである。図２は、本発明における遺伝子カセットのクローニングを示すものであり、ここで、図２Ａは、tRNA^pro遺伝子カセットのクローニングに使用する特定の方法の概略図を示し、図２Ｂは、Moloneyマウス白血病ウィルスに使用される「野性型」マウスtRNA^p ^ro _1,2 に対応するtRNA分子の構造及び配列を示し、実線はビリオンRNA鋳型にアニールし、レトロウィルス逆転写酵素反応を開始する3'ヌクレオチド配列を示す。図３は、cDNA合成に必要な、逆転写酵素、tRNAプライマー、及びRNA鋳型の相互作用における関係を示し、ここで、図３Ａは、Moloneyマウス白血病ウィルスに使用される同族の（cognate）tRNA^pro _wt の3'領域と、該tRNAが結合する、レトロウィルスRNAセグメント（真っ直ぐな実線）上の相補的プライマー結合部位の両方についてのレトロウィルスcDNA合成配列、及びレトロウィルス複製の最初の段階（破線はｃＤＮＡ合成を示す）を示し、図３Ｂは、ポリアデニル化メッセンジャーRNAからのインビボにおけるcDNAの合成を示し、ここではインビトロで改変され合成されたtRNA^pro _polyUの3'領域と、該tRNAが結合するmRNAポリアデニル化3'セグメントの両方について配列が示され、さらにインビボにおけるcDNA合成の最初の段階（破線）が示されている。図４は、tRNA−コードプロモーター−tRNAカセットの増幅−突然変異に使用される段階を示すものであり、ここでは第１及び第２のプライマーが破線で示され、5'から3'への方向を示す矢印が付されており、第２のプライマーは曲がった破線で示され、5'塩基が最初の鋳型DNA分子中の非相補的塩基にアニールできないことを示しており、下側の概略図は、3'の殆どの塩基が第２のプライマーにコードされた規定配列に変化させられた、増幅及び改変された転写カセットを示し、カセットの3'末端はこの第２のプライマー配列の末端で切断されている。図５は、昆虫Sf9細胞からのインビボにおけるcDNA生成物のエチジウムブロミド染色1%アガロース/TAEゲルを写真により再現したものであり、ここでレーン１及び10は１kbラダー（BRL）を示し、レーン２及び６は対照（［α-³²Ｐ］dCTPのみ）を示し、レーン３及び７は対照（［α-³²P ］dCTP＋逆転写酵素）を示し、レーン４及び８は対照（［α-³²P］dCTP＋逆転写酵素＋tRNA_wt）を示し、レーン５、９、11及び12は改変tRNAプライマーによる実験（［α-³²P］dCTP＋逆転写酵素＋tRNA_polyU）を示す。この実験においては、レーン11及び12の試料はRNアーゼAにより処理せず、レーン２〜５、及び11の試料は０.４cmキュベット中でのエレクトロポレーションであり、レーン６〜９、及び12における試料は0.2cmキュベット中でのエレクトロポレーションである。図６は、図５に示したゲル像のオートラジオグラフの写真による再現である。図７は、ハムスター（CHO）細胞からのインビボにおけるcDNA生成物のエチジウムブロミド染色1%アガロース/TAEゲルを写真により再現したものであり、ここでレーン１及び10は１kbラダー（BRL）を示し、レーン２及び６は対照（［α-³² P］dCTPのみ）を示し、レーン３及び７は対照（［α-³²P］dCTP＋逆転写酵素）を示し、レーン４及び８は対照（［α-³²P］dCTP＋逆転写酵素＋tRNA_wt）を示し、レーン５及び９は改変tRNAプライマーによる実験（［α-³²P］dCTP＋逆転写酵素＋tRNA_polyU）を示す。図８は、図６に示したゲル像のオートラジオグラフの写真による再現である。図９は、ハムスター（CHO）細胞からのインビボにおけるcDNA生成物のエチジウムブロミド染色1%アガロース/TAEゲルを写真により再現したものであり、ここでレーン１及び８は１kbラダー（BR L）を示し、レーン２及び３は対照（［α-³²P］dCTP＋逆転写酵素＋tRNA_wt）を示し、レーン４及び５は改変tRNAプライマーによる実験（［α-³²P］dCTP＋逆転写酵素＋tRNA_polyU）を示し、レーン６及び７は対照（［α-³²P］dCTP＋逆転写酵素＋オリゴ（dT）（５μｇ））を示す。この実験においては、レーン３、５及び７の試料はS1ヌクレアーゼにより処理した。図10は、図９に示したゲル像のオートラジオグラフの写真による再現である。発明の詳細な説明本発明は、相補的DNA（cDNA）の合成のための方法及び組成物に係わる。本発明は、インビボにおけるcDNA合成を可能とする方法を初めて提供するものである。この方法においては、逆転写酵素の存在下に適当なプライマー分子を生存可能な標的細胞に導入し、RNA鋳型分子に相補的なDNA分子が生成されるような条件下で標的細胞をインキュベートする。本発明のある態様においては、RNA鋳型分子はメッセンジャーRNA（mRNA）であり、多くの態様においてはポリヌクレオチド分子は改変された逆転写酵素同族プライマートランスファーRNA分子である。特に断らない限り、本発明が関連する技術分野の当業者の一般的な理解に従った技術用語及び科学的用語を使用する。本明細書で使用するように、以下の用語は、その用語が使用される文脈から明らかに異なった定義が示されているのでない限り、本来のその意味を有する。鋳型の用語は、そこから相補的配列が生成されるヌクレオチド配列を示す。アナローグの用語は、天然に存在するヌクレオチドの任意の配列特異的類似物（representative）を示すのに使用される。逆転写酵素の用語は、デオキシヌクレオチドトリホスフェートまたはそのアナローグのRNA鋳型にアニールしたプライマーへの付加を触媒できる任意のポリメラーゼを意味するのに使用される。ポリヌクレオチドの用語は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、及びそのアナローグのホモ及びヘテロポリマーを含む。改変された逆転写酵素同族プライマートランスファーRNA分子の用語は、人工的な生物学系により化学的に生成されたか、あるいは生物学的起源から精製された任意のtRNA分子であって、インビボで特異的逆転写酵素の活性を発現させるように改変されたものを示す。天然に存在するプライマー結合部位の用語は、特定の逆転写酵素の天然に存在する同族プライマーがアニールしてcDNA合成を開始する、RNA鋳型分子中の特定のヌクレオチド配列を示す。従って、プライマーがアニールするRNA鋳型配列中の変化を起こす、天然に存在する同族プライマー中の任意のヌクレオチド付加、欠失、あるいはその他の改変は、天然に存在するプライマー結合部位以外の部位における結合を生じる。発現カセットの用語は、コードされた生成物の発現に必要な全ての配列を含む DNA構築物を示す。従って、発現カセットは、少なくともプロモーター領域、所望の配列、及び転写終結領域をコード化するDNAを含むことになる。ベクター及びプラスミドの用語は、特定の系においてDNAが複製されたり選択されたりすることを可能とする任意の手段を含むのに使用され、互換的に使用できるものである。機能できるように結合（operative linkage）の用語は、結合の両側において配列間の機能的関係を維持するように結合したヌクレオチドをいうものである。例えば、DNA配列に機能することができるように結合したプロモーターは、転写の方向及び転写開始部位の両方について上流で、転写延長がDNA配列の端から端まで進行するように挿入されている。本発明のcDNA合成方法は、細胞からのmRNAの単離を必要としない。インビボで cDNAを合成することにより、mRNAの単離を必要とする（あるいは細胞が殺され、厳しい条件にかけられる）従来のインビトロにおける方法にみられる問題が回避されるので、mRNA鋳型は本来の形のままである可能性がより高く、完全長のcDNA クローンをより容易に得ることができる。さらに、インビボでのcDNA合成は逆転写酵素のインビトロ活性を必要とせず、逆転写段階をインビボ（即ち細胞内環境で）において行うことを可能とし、逆転写酵素の効率、忠実度、及び進行能力は最適化される。従って、この方法により、より長いcDNAクローンをヌクレオチド配列エラーが殆どない状態で生成することができる。さらに、これは実施するのがより容易で、かなり短い時間しか必要とせず、この手順は、より少ない最初の細胞数から出発してcDNA生成物を得ることができる能力を有している。前記の発明の背景の項に記載したように、従来のcDNA合成はインビトロcDNA合成段階の前に細胞からmRNAを単離し精製することを必要とする。インビトロcDNA 合成段階においては、逆転写酵素のためのプライマーの必要性は、mRNA分子のポリ（Ａ）テイルにアニールするオリゴ（dT）プライマー分子、あるいは標的mRNA配列の既知の部分に相補的なオリゴヌクレオチド分子を与えることで充足するのが最も一般的である。しかしこれらのタイプのオリゴヌクレオチドプライマーはいずれもインビボにおいては有効ではない（下記の実施例を参照）。なぜインビトロcDNA合成反応をうまく開始する相補的配列の単純なポリヌクレオチドオリゴマーがインビボcDNA合成反応を開始できないのかということを確認する具体的な証拠はないが、そのできないことについて少なくとも２つの説明が可能であり得る。即ち、１）逆転写酵素は、特定の配列、従って特定の三次元構造を有する同族tRNA分子を認識し結合することが知られている。これはHIVからの逆転写酵素を用いたゲル移動度シフト実験により天然及び合成tRNA分子の両方で詳細に研究されている（Barat，C.，et al. ，EMBO J．8:3279-3285（1989）；Barat，C，et al.，Nucleic Acid Res．19: 7 51-757（1991）；Weiss，S.，et al．Gene 111:183-197（1992））。単純なオリゴマーのプライマーはこの構造的な要件を充足しておらず、従ってそのポリヌクレオチドプライマーがmRNA鋳型にアニールできるとしても、逆転写酵素はインビボ条件でプライマーを認識し結合することができない可能性がある。２）あるいは単純に、インビトロ条件下でmRNA鋳型にアニールするポリヌクレオチドプライマーがインビボでmRNA鋳型にアニールできないのかもしれない。レトロウィルスの自然のライフサイクルにおいては、ウィルス逆転写酵素は宿主tRNA分子をプライマーとして利用して、単鎖レトロウィルスRNAゲノムのDNAコピーを合成する。動物細胞中には40を越える異なるタイプのtRNAが存在し得る。感染性のレトロウィルス粒子のそれぞれは、単鎖ウィルスRNAクロモソームの２つのコピーを含み、そのそれぞれは、プライマー結合部位と呼ばれるレトロウィルスRNAの特定の領域にアニールする特定の宿主tRNA分子と結合している。逆転写工程を開始するために、tRNA の3'末端の塩基の配列がレトロウィルスRNAのプライマー結合部位にアニールする。逆転写酵素（これは既にこの複合体と結合している）は次いでこのtRNAをプライマー分子として使用して、新生DNA分子の第１のヌクレオチドをtRNAの3'ヒドロキシ末端に付加する。レトロウィルス逆転写発現の特異性は、レトロウィルスゲノムにアニールする tRNA分子の3'末端の塩基対配列により決定される。各レトロウィルスは、レトロウィルスゲノム中に存在する特異的プライマー結合部位配列にアニールすることができるtRNAプライマーを利用する。例えば、ヒト免疫不全ウィルス（HIV）ゲノムはtRNA^Lys ₃をプライマーとして利用する。HIVウィルスのDNAコピーの合成を開始するために、tRNA^Lys ₃の3'末端の18ヌクレオチドが広がり、これはHIVプライマー結合部位を有する塩基対である（Weiss et al.，RNA Tumor Viruses，Col d Spring Harbor（1982）；Goff，J．Acquired Immune Deficiency Syndrome3:8 17-83（1990））。従って、tRNA^Lys ₃の3'末端の18ヌクレオチドは、HIVプライマー結合部位配列に相補的なものである。このtRNAプライマーのウィルスRNA鋳型へのアニーリングに加えて、同じtRNA分子の部分がウィルス逆転写酵素に認識されて、最終的に３分子複合体が形成される（tRNAプライマー−逆転写酵素−RNA 鋳型）。従って、全てのインビボcDNA合成反応について、プライマー分子は２つの基準を満足しなければならない。第１に、プライマー分子は標的RNA分子にインビボでアニールできなければならない。第２に、アニールしたプライマー−RNA複合体は逆転写酵素に利用され、該酵素がRNA鋳型とアニールしたプライマーを使用したcDNA合成を触媒できなければならない。現在インビトロcDNA合成に使用されているオリゴヌクレオチドプライマーは、インビボでは機能しない（記載したデータを参照）。さらに、特定のtRNA分子はレトロウィルスゲノム上での逆転写酵素のインビボ作用のためのプライマーとして機能できるが、これらのtRNAプライマーはレトロウィルスプライマー結合部位に特異的にアニールし、全ての成熟細胞mRNA分子中に存在する配列にアニールするようには設計されていない。本発明は、全てのポリアデニル化された細胞内mRNA分子にアニールし、逆転写酵素に利用されてプライマー分子がアニールするmRNA分子のcDNAコピーを生成するようなプライマー分子を与えることにより、インビボにおけるcDNA合成方法を提供するものである。本発明は、天然に存在する細胞tRNAプライマーを改変tRNAプライマーに換えて、レトロウィルス複製工程（実際にインビボcDNA合成反応である）を模倣するものである。本発明のある態様においては、プライマー分子は改変された逆転写酵素同族プライマーtRNA分子であって、該tRNA分子の3'領域（その部分はウィルスRNAプライマー結合部位にアニールし、レトロウィルス逆転写を発現する役割りを果たす）がポリウリジル酸配列により置き換えられており、tRNA分子は成熟細胞mRNA分子上に存在する3'ポリ（Ａ）テイルにアニールする。そのような好ましいtRNAプライマー（「ポリU tRNAプライマー」）は、生存可能な細胞に含まれている全ての成熟mRNA分子のcDNAコピーをインビボで合成するのに使用できる。このプライマーは全ての成熟mRNA分子とアニールするので、プライマーはcDNAライブラリーを作成するのに使用でき、これは所与の時点において細胞内で発現される構造遺伝子の全てを表すcDNA分子のコレクションである。本発明の別の態様においては、tRNAプライマーの3'領域は、それが特定のRNA 配列の部分に相補的であるように改変されている。これは、所望のRNA分子のヌクレオチド配列が既に判っているか、その相補的配列を含むRNAの集団からcDNA を製造することが望まれていることが必要である。特定のcDNA分子の合成は種々の方法において有用であり、限定するものではないが、以下のものが含まれる。配列特異的tRNAプライマーは既知の配列を有するcDNAをクローン化するのに、あるいは特定の遺伝子ファミリー（その全ては共通の配列を有する）を示す遺伝子からクローン化するのに利用できる。あるいは、RNA鋳型について選択的であるプライマーをインビボDNA配列決定反応に使用し、鋳型をクローン化及び単離する必要なしに所望のRNA鋳型の５’配列を決定できる。さらに、特定のmRNA種の発現が特定の疾患状態の信頼できる指示である場合には、インビボcDNA合成はポリメラーゼチェーンリアクション（PCR）に基づいた診断方法の有用な代替手段となり得、あるいはそのような診断方法と合わせて治療剤として利用できる。例えば、HIV特異性相補的プライマーは、改変されたデオキシヌクレオチド塩基をc DNA中に導入することができ、これは検出、配列決定あるいは並べ替えに使用でき（Link，H，et al.，J．Med．Virol.37:143-14 8（1992）；Prober，J．M．etal.，（1989））、あるいは導入されたヌクレオチドアナローグが細胞毒性になるように塩基を設計し、感染したCD4細胞のみが除去され、非感染の生存できるCD4細胞はそのままにすることができる。さらに、配列特異的tRNAプライマーは、細胞または組織中に存在する転写パターンの内部（インビボ）「スナップショット」を得、発生あるいは誘導の特定の期間におけるスプライス変異体あるいは遺伝子ファミリー転写物の相対的割合を決定するのに使用できる。ポリメラーゼチェーンリアクション（PCR）は、過去においてこの目的に使用されているが、最もよい状態でも増幅の間に起こる問題により信頼性がなく、誤差の大きいものである（Gilliland，G.，et al．in PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications,Academic Press（1990））。従って、本発明はインビボcDNA合成のために使用し得るプライマー分子を包含する。より具体的には、そして好ましい態様においては、これらのプライマー分子は改変された逆転写酵素同族プライマートランスファーRNA分子である。典型的には、3'末端におけるtRNAヌクレオチド配列の改変は同数のtRNA塩基の置換を使用し、置換された塩基が標的RNA分子に相補的な配列を形成するようにする。本発明の好ましい態様においては、tRNA分子の3'末端の塩基は置換配列によって置き換えられる。本発明の別の好ましい態様においては、Moloneyマウス白血病ウィルス逆転写酵素tRNA^proGGG同族プライマーの3'末端の20ヌクレオチド塩基がウラシル残基で置き換えられている。 tRNA分子の三次元構造は逆転写酵素によるtRNA分子の認識に重要であると考えられる。溶液中のトランスファーRNA分子は三次元構造に折り畳まれており、その主鎖はクローバーの葉に似たステムループ構造を有している。このクローバーの葉の４つのステムは、ワトソン−クリック塩基対形成により安定化されている（４つのステムのうち３つはループ内で終了している）。tRNA分子の構造の一体的な部分としてtRNAの3'末端の塩基はtRNAの5'末端の塩基と塩基対結合を形成している。簡略化したtRNA分子の一次構造を図２Ｂに示す。上記したようなtRNA分子の3'末端のヌクレオチド塩基の配列の改変は、tRNA分子の3'及び5'末端の塩基対形成相互作用を中断し得、従ってtRNA分子の全体的な三次元構造を阻害し得る。これらの改変による構造の破壊を最小にするために、tRNA配列の別の改変が必要となり得る。本発明のある態様においては、tRNA分子の5'末端の領域に補償的なヌクレオチド塩基の変更を行い、改変された分子の5'及び3'末端がワトソン−クリック塩基対を形成できるようにする。さらに、コード配列の5'末端に追加のグアニン残基を付加し、T7 RNAポリメラーゼを使用したtRNAプライマーのインビトロ生産を容易化した。分子の5'末端になされるヌクレオチド塩基の特定の補償的な変更は分子の3'末端になされる置換に依存することになることは当業者には明らかであろう。例えば、tRNA分子の3'末端がポリウリジル酸配列に改変される（ポリU tRNA プライマーにおいて）場合、tRNA分子の5'末端に存在する塩基をアデニン塩基で置換することにより、分子のこの領域におけるワトソン−クリック塩基対形成が復活され、従ってtRNAの三次元構造が保持される。当業者であれば、本発明の実施において、インビボcDNA合成に使用されるプライマー分子が先に存在するtRNA分子に由来するものである必要はないことが判るであろう。即ち、（a）RNA分子にインビボで結合することができ、（b）逆転写酵素のためのプライマーとして作用することができ、それによりそのRNA鋳型分子に相補的なDNA分子の合成が起こり得るような任意のオリゴヌクレオチドを本発明のインビボcDNA合成方法に使用することができる。特定のプライマーのインビボcDNA合成での使用についての適合性は、以下に記載するようにインビボcDNA 合成を行い、その合成の生成物をアッセイすることにより調べることができる。レトロウィルスのそれぞれは、その宿主細胞によりコード化されそれに由来する特定の同族tRNAプライマーを使用する逆転写酵素を、その複製サイクルの間に cDNA合成を発現し開始するために生成する。例えば、ヒト免疫不全ウィルス（HI V）からの逆転写酵素はtRNA^Lys ₃をプライマーとして使用し、Moloneyマウス白血病ウィルス（MoMuLV）逆転写酵素はtRNA^pro _1,2を発現のために使用し、Rous肉腫ウィルス（RSV）はtRNAT^TrDを発現のために使用する。これらの組合せにおいて、ウィルス逆転写酵素−細胞tRNA分子は結合し、検出可能な複合体を形成する。従って、tRNAプライマー分子の独特な3'ヌクレオチド配列がウィルスRNA鋳型の相補的塩基にアニールする場合は、これが実際に逆転写酵素を鋳型に運び、cDNA 合成の開始に使用される３分子複合体を形成する。この酵素、プライマー、鋳型結合による便宜はウィルス複製において不可欠な段階であり、本発明において模倣されるものである。tRNA分子は、これがインビトロ逆転写反応を発現するのに使用できるある程度の柔軟性を有すること（Kohlstaedt，L.A．and T.A.Steitz，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 89:9652-9656（１992））、及び組換え体同族tRNAプライマーのフラグメントでもインビトロで逆転写酵素と結合しcDNA合成を発現することが確かめられている（Weiss，S．et al．（１992））。しかし、使用される tRNA分子が、そこから合成が目論まれる鋳型に相補的な3'配列を有していなければならないという要件があるようである。もしそうだとしても、プライマーとして機能できるtRNA分子の範囲はインビトロにおいて限定され、この柔軟性はインビボにおけるtRNA利用の要件を反映するものではないであろう。本発明のインビボcDNA合成方法では、インビボcDNA合成プライマー分子（「プライマー」）が標的RNA分子にアニールし、この複合体が逆転写酵素によって利用される。本発明のこの形態においては、ある態様においては、プライマーと逆転写酵素の間の二成分複合体（duplex）を形成し、これによりプライマーがRNA 鋳型分子にアニールするのを容易化することが望ましい場合がある。プライマー及び逆転写酵素は細胞内に存在してもよく、いずれか一方あるいは両方が細胞内で合成されてもよく、また導入されてもよい。従って、本発明の１つの態様においては、逆転写酵素及びプライマー分子をコードする遺伝子を有する細胞系内でインビボcDNA合成を行うことができる。これらの遺伝子の発現により細胞内で逆転写酵素及びプライマーが合成される。他の態様においては、逆転写酵素及びプライマーをコードする遺伝子を誘導可能なプロモーターの制御下に発現させ、遺伝子の誘導により逆転写酵素とプライマーの発現を導き、これによりcDNA合成を開始するようにすることができる。より一般的には、プライマー及び逆転写酵素は外部起源から細胞に導入される。生物学的物質を生存可能な細胞中に導入するための方法が数多く確立されている。これらの方法の多くが刊行物に記載されており（Molecular Cloning；A Lab oratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor ，NY．（1989）；Keown，W.A．et al.，Meth．Enzymol．185:527-537（1990））、限定するものではないが、エレクトロポレーション（Neumann，E．et al.，EM BO J．1:841-845（1982）；Electroporation and electrofusion incell biolog y，Neumann，E．et al．eds.，Plenum Press，New York（1989）；Kamdar，P．e t al.，Nucleic Acids Res．20:3526（1992）；Rols，M-P，et al.，Eur．J．Bi ochem．206:115-121（1992）；Tsongalis，G.J.，et al.，Mutat．Res．244:257 -263（1990）；Lambert，H.，et al.，Biochem．Cell Biol．68:729-734（1990 ）；Yorifuji，T.，and H．Mikawa，Mutat．Res．243:121-126（1990）；Winega r，R.A.，et al.，Mutat.Res．225:49-53（１989））；DEAE-デキストラン（Lev esque，J.P.，et al.，Biotechniques 11:313-4，316-8（1991）；Ishikawa，Y. ，and C.J．Homcy，NucleicAcids Res．20:4367（1992）；カチオン性リポソーム（Jarnagin，W.R．et al.，Nucleic Acids Res.20:4205-4211（1992））あるいはカチオン性脂質（Walker，C．etal.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:7915 -7918（1992）；レセプター媒介導入（delivery）（Wagner，E．et al.，Proc． Natl．Acad．Sci．USA 89:6099-6103（1992）；マイクロインジェクション（Mar tin，P．et al.，Dev．Biol.，117:574-580（1986））；プロトプラスト融合；レーザーまたは粒子ボンバードメント；ウィルスベクター導入等が含まれる。当業者であれば、これらの方法はそれぞれ利点と欠点を有していることを理解し、使用する細胞の種類について最も適した導入方法を選択することができるであろう。本発明のある態様においては、インビボcDNA合成プライマーの細胞内への導入方法はエレクトロポレーションである。以下に記載するように、この方法を使用して改変されたtRNAプライマー、逆転写酵素、及び改変されたデオキシヌクレオチドトリホスフェートを多くの異なる細胞種に導入した。外部起源から逆転写酵素を細胞内に導入する場合は、インビボcDNA合成プライマーの選択は、選択された逆転写酵素の種類により決定されることになる。２種類の一般的に使用され市販されている逆転写酵素、即ち鳥類骨髄芽球症ウィルス逆転写酵素、及びMolonyマウス白血病ウィルス逆転写酵素がある。これらの酵素は以下のような販売者、Stratagene，11011 N．Torrey Pines Road，La Jolla， California 92037；Bethesda Research Laboratories，Inc.，P/O．Box 6009，G aithersberg，Maryland，20877；New England Bio Labs，Inc.，32 Tozer Road ．Beverly，Massachusetts，01915；Boehringer Mannheim Biochemicals，9115 Hague Road，P.O．Box 50816，Indianapolis，Indiana，46250等から商業ベースで入手可能である。これらの種々の酵素は固有のパラメーター、即ち忠実度（エラー率）、進行能力（cDNA合成を完遂する能力）及び構造（ヘテロダイマーあるいはモノマー）、並びに市場のパラメーター、例えば入手のし易さや評判等の両方を有しており、これらは酵素の選択において考慮しなければならないファクターである。本発明の目的のために、プロモーター配列に機能することができるように結合されたコードされた改変tRNA配列を含むDNAカセットを細菌ベクター中にクローン化した。これによりプロモーター配列を認識するRNAポリメラーゼを使用した、インビトロにおける改変されたtRNAプライマーの生産が可能となった。インビボcDNA合成プライマーがインビトロで転写される場合における使用のためのプロモーターの選択は、選択されたインビトロ転写系中において使用されるポリメラーゼ酵素により決まることになる。本発明の好ましい態様においては、改変されたtRNA^proGGGプライマーが、バクテリオファージT7プロモーターの制御下に、T7 RNAポリメラーゼ酵素を使用したインビトロ転写系において発現された。生成された改変tRNAプライマーを単離して逆転写酵素及び放射活性標識されたデオキシヌクレオチドとともに細胞中に導入した。これらの外来成分の導入の後、細胞を適当な条件下に十分な時間インキュベートし、インビボcDNA合成が起こるようにした。適当な条件は一般的に、問題となっている細胞種が通常増殖するような条件である。本発明の好ましい態様においては、プライマー及び逆転写酵素の導入の後、その細胞種の通常の培養条件下に標的細胞を0.5〜２時間インキュベートする。下記に挙げた実施例中に記載するように、放射活性標識dNTP（例えば、［ α-³²P］dCTP）を使用して特定の条件下で特定のプライマーを使用したインビボ cDNA合成の効率を測定できる。細胞のインキュベーションの後、インビボで生成されたcDNAを、Hirtの抽出方法（Hirt，B.，J．Mol．Biol．26:365-369（１967 ））を使用して標的細胞から抽出した。抽出されたcDNA生成物は二本鎖核酸であり、通常のクローニング方法を使用してうまくクローン化されたことが判った。別の方法として、プライマー及び／または酵素は細胞に導入された遺伝子から生成できた。酵素は細胞内の遺伝子から発現させ、プライマーを細胞内に導入することができ、あるいはプライマーを細胞内で発現させ、逆転写酵素を外部から導入することもできた。改変された（放射活性標識された）デオキシヌクレオチドトリホスフェートを反応において使用して、デオキシヌクレオチドの取り込みの追跡手段としたが、前記方法の要件となるものではない。しかし、改変されたデオキシヌクレオチドを使用することは、取り込み及び合成を追跡する便利な方法となり（α−標識されたデオキシヌクレオチドを使用した場合）、（ビオチニル化またはその他のデオキシヌクレオチドアナローグを使用した）インビボcDNA導入反応の生成物を選択または区別する手段を与えるものであることは注目すべきである。改変されたデオキシヌクレオチド及びデオキシヌクレオチドアナローグは全ての種類のポリメラーゼ反応において成功裏に使用でき、これらは当業者には自明の方法である（Prober，J.M ．et al.，Science 238:336-341（1987）；Klevan，L．and G．Gebeyehu，Meth ．Enzymol.，154:561-577（1987）；Chan，V．T-W.，et al.，Nucleic Acids Re s．13:8083-8091（1985）：Lo，Y-M．D.，et al.，Nucleic Acids Res．16:8719 （1988））。これらの反応の生成物は種々の方法において使用することができ、限定するものではないが、subtractive cDNAライブラリーの構築、特定の細胞毒性または感光性cDNA生成物の生産、インビボ DNA配列決定、及び分析的、診断的、または調製的な使用のためのcDNAプローブ等に使用できる。以下の実施例は本発明の特定の好ましい態様と形態を説明するためのものであり、その範囲を限定するものと解してはならない。実験以下の実験の開示において、下記の略号を適用する：eq（当量）；Ｍ（モル）；mM（ミリモル）；μM（マイクロモル）；Ｎ（規定）；モル（モル数）；ミリモル（ミリモル数）；μモル（マイクロモル数）；nモル（ナノモル数）；kg（キログラム）；g（グラム）；mg（ミリグラム）；μg（マイクログラム）；ng（ナノグラム）；Ｌ（リットル）；ml（ミリリットル）；μl（マイクロリットル）；cm（センチメートル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメートル）；n m（ナノメートル）；Ｖ（ボルト）；μF（マイクロファラッド）および℃（摂氏温度）。以下の実施例において、特にことわらない限り、制限酵素、T4DNAリガーゼ、およびポリヌクレオチドキナーゼはニューイングランド・バイオラボから得られる。［α-³²P］dCTP、［α-³²P］UTP、および［γ-³²P］ATPはアマシャム社から得られ、Molonyマウス白血病ウイルス逆転写酵素緩衝液および酵素はベセスダ・リサーチ・ラボラトリィズから得られる。これらの物質は、特にことわらない限り、製造業者の指示に従って使用される。エレクトロポレーションは、インビトロゲン社からのエレクトロポレーター、およびバイオラド社からのエレクトロポレーションキュベットを使用して行われる。オリゴヌクレオチドはオペロン・テクノロジーズ社から得られ、または、例えば、製造業者の指示に従ってアプライド・バイオシステムズDNA合成装置で合成し得る。サーマス・アクアチクス（The rmus aquaticus）DNAポリメラーゼＩはパーキン−エルマー・シータスから入手される。全ての通常の分子生物学技術は、参考として本明細書に含まれるSambro okら（1989）またはBergerおよびKimmel（1987）に従って行われる。本明細書に開示された核酸配列は便宜上10-mer以下のオリゴヌクレオチドに分けられ、特にことわらない限り、連続配列と解されるべきである。実施例１Ｉ.tRNAプライマーをコードする遺伝子の合成 Molonyマウス白血病ウイルス（MoMuLV）は、レトロウイルス DNAの合成のためのプライマーとしてマウスtRNA^pro _1,2イソアクセプター分子を使用する（Hara da，F．ら，J.Biol.Chem．254:10979-10985（1979）；PetersおよびDahlberg，J .Virol．31:398（1979））。これらの特定のtRNA分子はウイルス粒子中にMoMuLV 逆転写酵素と複合体形成されて見られ、この複合体は、順に、ウイルスRNAゲノムのプライマー結合部位にアニールする（図2Bおよび3Aを参照のこと）。アニールされたtRNA分子をプライマーとして使用できるMoMuLV逆転写酵素がDNA合成を開始し、そしてtRNAプライマーがアニールする鋳型RNA分子に相補的であるDNA分子を合成し続ける。マウスtRNA^proGGGプライマーのヌクレオチド配列が知られている（Haradaら，（1979））。このtRNA分子の２種のバージョンは遺伝子カセットからインビトロで転写され、これらのカセットはオリゴヌクレオチドを使用して合成され、次にクローン化され、そして配列分析により確認される。これらの反応を使用したデオキシリボヌクレオチドプライマーを以下に示す。プライマーNo.１（配列番号１）：プライマーNo.２（配列番号２）：プライマーNo.３（配列番号３）：プライマーNo.４（配列番号４）：プライマーNo.５（配列番号５）：プライマーNo.６（配列番号６）：オリゴヌクレオチドプライマーNo.１およびNo.２を、図2Aに示された“野生型 ”マウスtRNA^proGGGプライマーに相当する組換えtRNA分子を生成するように設計する。インビトロで転写されたtRNAは、それらの細胞相対物中に存在する改変リボヌクレオチド塩基を含まない点で、或る種の相違がある。しかしながら、これらの改変は逆転写酵素-tRNA相互作用、および天然産の同系tRNA（Barat，C．ら（1989）；Weiss，S．ら（1992）；Barat，C．ら（1991））のようにインビトロでのcDNA合成を開始するそれらの能力の両方に関して同じ効力を有することがわかった。これらのプライマーの3'末端は相補的であり、その結果、プライマーNo.１およびプライマーNo.２の3'末端がインビトロでアニールされ、次にdNTPの存在下でDNAポリメラーゼＩのクレノーフラグメントで処理されてT7 RNAポリメラーゼプロモーター−tRNA_wtをコードするカセットを含む二本鎖DNA分子を生成し得る。（図2Aを参照のこと）。このプライマー対を、このバクテリオファージT7プロモーター配列が tRNA分子の5'末端に操作により結合されるように設計する。このプロモーター-tRNAカセットは制限部位と隣接してそのカセットがクローニングベクターから開裂されることを可能にし、そしてEarI制限部位をカセットの3'末端にとり込み、その結果、インビトロでの転写反応の前のEarIエンドヌクレアーゼによるカセットの消化が、コードされた tRNA配列の正確な3'末端で鋳型の直鎖化（それ故、転写の終止）をもたらす。プライマーNo.１およびNo.２のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１および配列番号２に示す。第二プライマー対（プライマーNo.３およびNo.４）を、下記のtRNAの改変形態（その改変tRNA分子はtRNA_polyUと称される）をコードするように設計する。配列番号７ tRNA_wtと同様に、バクテリオファージT7プロモーター配列を、 tRNA配列および隣接制限部位の5'末端に操作により結合し、EarI部位をとり込む。そのtRNA_polyU分子の3'末端を含むプライマーNo.４は、野生型tRNA分子の3'末端ヌクレオチドに代えてポリ（U）配列をコードする（図3Aおよび3B中のtRNA配列と比較のこと）。プライマーNo.３およびNo.４をそれぞれ配列番号３および配列番号４に示す。等モル比のプライマーNo．１＆２、および３＆４を、T4 DNAキナーゼ（ポリヌクレオチドキナーゼ）を使用してキナーゼ処理する。キナーゼ処理されたオリゴマープライマー対No.１およびNo.２、並びにプライマーNo.３およびNo.４を、２ mMのdNTPを含むクレノー緩衝液（50mMのトリスークロリド（pH7.6）、25℃、10m MのMgCl₂、10mMのβ−メルカプトエタノール）中でアニールする（80℃で３分間、20分間にわたって60℃から37℃に徐々に冷却する）。次に、アニールしたプライマー対を、30μｌの容積中のDNAポリメラーゼＩのクレノーフラグメント10単位とともに37℃で30分間インキュベートして二本鎖DNA合成を完結する。次に、普通に利用できる技術を使用してこれらの二本鎖DNAカセットを抽出し、沈殿させ、1/10TE緩衝液（１mMのトリス−クロリド、0.1mMのEDTA（pH8.0））中で再度懸濁させ、そしてpUCl8クローニングベクター（Yannish- Perronら，Gene 33:10 3-119（1985））中の脱ホスホリル化SmaI位に連結する。プライマーNo.１および No.２の組み合わせにより生じた野生型tRNA遺伝子をpUC18にクローン化してpUC1 8-T7tRNA_wtをつくる。プライマーNo.３およびNo.４の組み合わせにより生じた改変tRNA遺伝子をpUCl8にクローン化してpUCl8-T7tRNA_polyUをつくる。これらの２種のプロモーター-tRNAカセットの配列および方向をDNA配列決定により確かめる（この配列決定は、供給業者の推奨に従ってシーケナーゼ（商標）2.0（U.S.バイオケミカルズ）を使用して行う）。 II．tRNAプライマーの合成 tRNAw_tまたはtRNA_polyUのいずれかをコードするクローン化DNA分子を上記のようにして生成する。そのtRNA遺伝子をバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼの存在下でインキュベートすることにより、これらのクローン化tRNA遺伝子からトランスファーRNA分子を生成する。RNAポリメラーゼは、それらが鋳型DNA配列中の転写終止シグナルに出会い、またはDNA鋳型を単に複写する（run off）まで鋳型DNAに相補的であるRNA分子を合成し続ける。T7 RNAポリメラーゼの作用により生成されたtRNA分子がそのtRNA遺伝子の末端で適当に終止することを確実にするために、与えられたtRNA鋳型をtRNA遺伝子の末端で直鎖化する。これは、幾つかの方法で行い得る。一つの技術はクローン化インサートを制限酵素消化により切断することを伴う。EarI制限エンドヌクレアーゼによる消化はプロモーター-tRNAカセットをpUCl8 -T7tRNAw_tから除去し、ベクター配列中で実質的に5'からT7プロモーター配列を消化し、そしてtRNA遺伝子鋳型の3'末端で正確に消化する。 tRNA_polyUインサートの3'末端にあるEarI制限部位は消化に対し耐性であることがわかっているので、上記のアプローチはpUC18-T7tRNA_polyUクローニングベクターと共に使用されなくてもよい。この問題を回避するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用する別の技術を使用して特定のプロモーター-tRNA_polyUフラグメントを増幅するとともに、鋳型をコードするtRNA_polyUの末端を規定する。この目的のために、２種のプライマーを使用する：第一プライマーはT7プロモーター領域配列に向けられた3'末端を有する挿入T7プロモーター領域に対し5'に位置されたpUC18 ベクター中の配列にアニールする市販のプライマーであり、第二プライマーは所望のT7プロモーター- tRNA_polyUカセットの塩基にアニールする“逆RNAプライマー”（配列番号５に示される）であり、その結果、逆RNAプライマーの最も5'側の塩基は、以下のようなコードされたtRNA_polyU鋳型の最も3'側の塩基である。配列番号８そのPCRを下記の条件に従って行う：PCR緩衝液：67mMのトリス（25℃でpH9.2 ）、16.6mMの（NH₄）₂SO₄、1.5mMのMgCl₂；50ngのそれぞれのプライマー、約１x 10⁸分子のpUC18-T7tRNA_polyU構築物、および250 μＭ濃度のそれぞれのデオキシヌクレオチドトリホスフェート。その反応混合物を100℃で３分間加熱し、次に1 5℃に冷却する。チューブを短時間遠心分離して内容物を回収し、次に１単位のT aqポリメラーゼおよび１滴の鉱油をそれぞれ20μｌの反応液に添加する。その反応を下記のレジメで40サイクルで行う：94℃で１分間；次に55℃で１分間。増幅生成物を５つの反応からプールし、クレノーフラグメントおよび１mMのdNTPでブラント末端にし、抽出してタンパク質および痕跡の鉱油を除去し、そして通常のプロトコルを使用してEtOH沈殿する。そのペレットを70％のエタノール（EtOH）ですすぎ、乾燥させる。次にそのペレットを1/10TE中で再度懸濁し、そしてフラグメントを既知のサイズの標準物質に対して２％のアガロース／TA Eゲルで調べる。 PCRは、鋳型依存性様式で増幅生成物の末端への単一ヌクレオチド（通常、デオキシリボアデニル酸残基）のとり込みを可能にすることが知られていることに留意すべきである（Clark，J．M.，Nucleic Acids Res．16:9677-9686（1988））。しかしながら、この鋳型依存性とり込みは稀に起こり、そして余分なアデニン残基が付加されると、それは鋳型をコードする配列にではなく3'末端（これは T7プロモーターの上流である）に付加される。これらの鋳型を使用するその後の試験管内の転写反応の放射能標識生成物を、既知のサイズの標準物質を用いて変性ポリアクリルアミド電気泳動を使用して調べたところ、所望のサイズのものである。 T7プロモーター-tRNA_wtカセットおよびT7プロモーター-tRNA_polyUカセットを含む直鎖状DNAフラグメントを、tRNA分子をインビトロで生成するための鋳型分子として使用する。これを、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ酵素を使用するラン−オフ（run-off）転写により行う（以下を参照のこと）。 tRNA_wtのインビトロでの生成につき、EarI直鎖化pUC18-tRNA_wt鋳型を使用して反応を行う。tRNA_polyUのインビトロでの生成につき、PCR増幅T7- tRNA_polyUカセットを鋳型として使用する。また、DraI感受性T7- tRNA_polyUカセットを直鎖化にし、インビトロでの転写反応のための鋳型として使用する（EarI適合性T7-t RNA_polyU鋳型の生成に使用されたのと同じプロトコルを使用して、オリゴマーNo.３および６を用いて生成した）。インビトロ反応につき、下記の条件が使用し得る（Gurevich，V.V.ら，Anal.Biochem．195:207-213（1991 ）：簡単に言えば、RNaseを含まないエッペンドルフチューブに、下記の成分を2 5℃で添加する：80mMのHepes-KOH（pH7.5）、12mMのMgCl₂、20mMのDTT、５mMのd NTP、２mMのスペルミジン；RNaseを含まないdH₂O； 50-100μg/mlの鋳型DNAおよび５μｌの［α-³²P］ATP（30μCi；3000Ci/ミリモル；生成物を調べ、定量するために添加した）。反応成分を混合し、次にその反応をT7 RNAポリメラーゼ酵素反応ミックス（1200-1800 U/mlの最終濃度まで）の添加で開始する。次にチューブを37℃で４時間インキュベートする。RNaseを含まないDNaseを反応に添加し、そして鋳型DNAの消化を15〜30分間進行させる。この時点で、とり込みの効率を測定するために、反応混合物の少量のアリコートを除去することができる。この測定を、過剰のRNaseを含まないキャリヤーDNAの存在下で反応混合物のアリコートの低温トリクロロ酢酸沈殿により行うことができる。この測定、合計カウントの対照を、同反応混合物から沈殿されなかった物質で行う。次に反応混合物のそれぞれに、150μｌのRNaseを含まないdH₂Oおよび20μｌの3MのNaOAcを添加し、その混合物を等容積のフェノール／CHCI₃（pH6.5）（pH6.5で緩衝されたフェノールを使用してRNA生成物の塩基触媒加水分解の可能性を最小にする）、続いてC HCl₃により抽出する。生成物を２−プロパノールで沈殿させ、ペレットをすすぎ、沈殿を乾燥させる。プライマー生成物をRNaseを含まないdH₂O中で再度懸濁させ、そして既知のサイズの標準物質で行われるポリアクリルアミド／尿素ゲルのオートラジオグラフィー露出を使用してアリコートをサイズにつきチェックする。 III.固相担体を使用する化学合成改変されていないオリゴヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドを固相で高収率で化学合成できることは、本発明を分取用、分析用および治療用に容易に採用されることを可能にする。改変オリゴリボヌクレオチド生成に有益な合成技術および試薬（例えば、本明細書に参考として含まれるSprout ，B.S.ら，Nucleic Acids Res．17:3373-3386（1989））は、RNAプライマーがDN A鋳型からインビトロで生成される場合に行い得なかった幾つかの実施態様を与える。例えば、２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドはRNase活性に耐性であることが知られている（Sprout，B.S.ら，（1989）；Inoue，H．ら，FEBS Let t．215:327- 330（1987））。それ故、オリゴリボヌクレオチドに代えて、インビボでのcDNA合成反応のプライマーとしてのこれらの改変RNA分子の使用は、初期のcDNA合成プライマーのRNaseＨ触媒除去（あらゆる既存の改変を含む）に対する耐性をもたらす。次に、これらのプライマーはビオチニル化でき、³²Ｐ標識でき、または初期の鋳型の塩基触媒加水分解後の第二鎖cDNA合成中に占有され、とり込まれる制限部位の如き配列要素を含むことができる（２’−Ｏ−メチルプライマーは、初期のRNA鋳型のアニールした相補部分も同様に保護するであろう）。これらの改変はタンパク質と会合するプライマーの能力を損なわないことが明らかであり（Sprout，B.S.ら，（1989））、そして改変オリゴリボヌクレオチドは予想された特異性でアニールする。２’−ＯＨ基の脱離はRNAプライマーを隣接３’，５’−ホスホジエステル結合に対する塩基触媒（求核性）攻撃に対し更に耐性にし、またそれは種々の汎存RNaseに耐性である。 IV．実験設計上記のようにして合成された改変tRNAプライマーを多種の細胞系におけるインビボcDNA合成反応に使用する。また、対照反応は、プライマーの不在下で、プライマーとしてオリゴ（dT）プライマー、またはインビトロで転写された野生型tR NA_wt分子を用いて行う。これらの実験において、プライマーを、Molonyマウス白血病ウイルス逆転写酵素および［α-³²P］dCTPと共に、エレクトロポレーションにより細胞に導入する。放射能標識dCTPは、これらの反応の生成物の分析を容易にするのに含まれる。インビボでのcDNA合成反応のための標的細胞の調製における注意が重要であり、そしてプライマー−逆転写酵素（そして、おそらく改変デオキシヌクレオチドトリホスフェート、またはアナローグ）送出の方式の評価を慎重に考慮すべきである。当業者に自明であるように、多くの別法が存在する。これらの技術の幾つかが上記されており、下記の実施例におけるエレクトロポレーションの使用は本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。標的細胞への反応成分のエレクトロポレーションおよび細胞のインキュベーション後に、反応の生成物をハート抽出技術（Hirt，B.，J.Mol.Biol．26:365-369 （1967））により細胞から抽出し、リボヌクレアーゼＡで完全に消化する。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿後に、とり込みを定量化することにより、またオートラジオグラフィーを使用して、既知のサイズの標準物質を用いてアガロースゲルで分離された生成物のサイズを調べることにより生成物を分析する。更にS1ヌクレアーゼ処理、およびRNase H 処理を使用してDNA生成物の性質を測定する。 V.昆虫細胞中のインビボでのcDNA合成昆虫Sf9細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から入手し、供給者により推奨されたように維持する。インビボでのcDNA合成につき、細胞をグレース培地中で１ｘ10⁷細胞/mlの濃度で懸濁させる。エレクトロポレーションの前に、逆転写酵素（1000単位）、tRNAプライマー（５μg）および［α-³²P］dCTP（50μCi）を含む反応成分を、ジチオスレイトール（DTT）（10mM）を含む逆転写緩衝液（BRLから入手した）中で合計容積50μｌで混合し、そして室温で10分間インキュベートする。次にSf9細胞（0.5ml中 5x1 0⁶細胞）を反応成分に添加し、その混合物を冷却した0.4cmのエレクトロポレーションキュベットに移す。次にエレクトロポレーションを200V、250μＦおよび無限抵抗にセットしたエレクトロポレーターで行う。エレクトロポレーション後に、温めたグレース培地１mlをキュベットに添加し、その混合物をプラスチックチューブ（ファルコン＃2059）に移す。次にその混合物を37℃で１時間インキュベートする。Sf9昆虫細胞系を維持するのに通常の温度は約25℃であるが、改変された酵素活性の取得が主たる関心事項である。 37℃のインキュベーション期間後に、細胞をエッペンドルフ型式5415Cマイクロフュージ（または均等物）中でセッティング５で５分間の遠心分離によりペレットにする。放射性上澄みを注意して除去し、適当に処理し、そして0.6％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）１ml、10mMのEDTA（pH7.5）を細胞ペレットに添加する。直ちに、このペレットを大きな穴のピペットマンP1000チップで軽く再度懸濁させる（チップの一部を除去して穴の直径を増大し、こうして剪断力およびゲノムDNAの断片化を低下する）。粘稠な溶解産物を氷上に５分間置き、次に5M のNaCl 250μｌを添加し、チューブを数回倒立させて混合する。次に管を氷上に置く。このハート抽出のインキュベーション期間（２〜12時間）後に、抽出物を低温エッペンドルフ・マイクロフュージ中でトップスピードで20分間遠心分離する。上澄みをペレット（これは放射性廃棄物中に捨てられる）から抜取り、そして上澄みを二つの新しい1.5mlのマイクロフュージ管の間で分離する。これらの上澄みをフェノール／クロロホルム（1:1）で２回抽出し、クロロホルムで１回抽出する。次に核酸フラクションを1/10容積の3MのNaOAcおよび1/6容積の２−プロパノールの添加で沈殿させる。そのペレットを70％のエタノールですすぎ、次に乾燥させる。ペレットを18μｌの１mMのトリス−クロリド、0.1mMのEDTA（pH7 .0）中で再度懸濁させる。再度懸濁した核酸フラクションをリボヌクレアーゼＡ（10mg/mlの原液２μｌ）で37℃で15分間処理し、続いて30μｌの１mMのトリス −クロリド、0.1mMのEDTA（pH7.0）を添加する。次にその溶液をフェノール／クロロホルム（1:1）で１回抽出し、次にクロロホルムで１回抽出する。次に核酸フラクションを1/10 容積の3MのNaOAcおよび２容積のエタノールの添加で沈殿させる。ペレットを70 ％のエタノールですすぎ、乾燥させる。セレンコフ（Cerenkov）・カウントを乾燥ペレットに関して得、ペレットを再度懸濁し、そしてアリコートをシンチラントでカウントする。放射標識した分子量標準物質を用いて、生成物をアガロース /TAEゲルで電気泳動にかける。次にゲルを臭化エチジウムで染色し、乾燥し、オートラジオグラフィーにより調べる。 VI．ハムスター細胞中のインビボでのcDNA合成ハムスターCHO細胞系をATCCから入手し、ATCCにより推奨されたようにして維持する。エレクトロポレーションの前に、トリプシン/EDTA溶液を使用してCHO細胞を単層培養から回収する。はがした細胞をカウントし、PBS中ですすぎ、そして1x10⁷または1x10⁸の細胞/ml でPBS中で再度懸濁する。反応成分はDTT（10mM）を含む逆転写緩衝液（BRL）中で50μｌの合計容積で混合した逆転写酵素（1000 単位）、tRNAプライマー（5μg）、および［α-³2P］dCTP（50μCi）であり、室温で10分間インキュベートする。プレインキュベーション後に、CHO 細胞0.5ml をその混合物に添加し、細胞を混合し、直ちに冷却した0.4cmのエレクトロポレーションキュベットに移す。エレクトロポレーションを下記の条件下で行う：33 0V、1000μFおよび無限抵抗。エレクトロポレーション後に、温めたCO₂平衡ハム（Ham's）培地（ギブコ）１mlをキュベットに添加し、その混合物をプラスチックチューブ（ファルコン＃2059）に移し、その混合物を37℃で１時間インキュベートする。そのインキュベーション期間後に、細胞をエッペンドルフ型式5415Cマイクロフュージ（または均等物）中でセッティング５で５分間の遠心分離によりペレットにする。放射性上澄みを注意して除去し、適当に処理し、そして0.6％のSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）１ml、10mMのEDTA（pH7.5）を細胞ペレットに添加する。直ちに、このペレットを大きくした穴のピペットマンP1000チップで穏やかに再度懸濁する。粘稠な溶解産物を氷上に５分間置き、次に5MのNaCl250μｌを添加し、チューブを数回倒立させて混合する。次に管を氷上に置く。このハート抽出のインキュベーション期間（２〜12時間）後に、抽出物を低温エッペンドルフ・マイクロフュージ中でトップスピードで20分間遠心分離する。上澄みをペレット（これは放射性廃棄物中に捨てられる）から抜取り、そして上澄みを二つの新しい1.5mlのマイクロフュージ管の間で分離する。これらの上澄みをフェノール／クロロホルム（1:1）で２回抽出し、次にクロロホルムで１回抽出する。次に核酸フラクションを1/10容積の3MのNaOAcおよび1/6容積の２−プロパノールの添加で沈殿させる。そのペレットを70％のエタノールですすぎ、乾燥させる。ペレットを18μｌの１mMのトリス−クロリド、0.1mMのEDTA（pH7.0）中で再度懸濁する。再度懸濁した核酸フラクションをリボヌクレアーゼＡ（10mg/mlの原液２ μｌ）で37℃で15分間処理し、続いて30μｌの１mMのトリス−クロリド、0.1mM のEDTA（pH7.0）を添加する。次にその溶液をフェノール／クロロホルム（1:1）で１回抽出し、次にクロロホルムで１回抽出する。次に核酸フラクションを1/10 容積の3MのNaOAcおよび２容積のエタノールの添加で沈殿させる。ペレットを70 ％のエタノールですすぎ、乾燥させる。次に第Ｖ節に記載されたようにしてセレンコフ・カウントを乾燥ペレットに関して得る。 VII.ヒト細胞中のインビボでのcDNA合成ヒトヒーラ（HeLa）細胞系をATCCから入手し、ATCCにより推奨されたようにして維持する。エレクトロポレーションの前に、トリプシン／EDTA溶液を使用してヒーラ細胞を単層培養から回収する。はがした細胞をカウントし、PBS中ですすぎ、そして1x10⁷の細胞／mlでPBS中で再度懸濁する。反応成分はDTT（10 mM）を含む逆転写緩衝液（BRL）中で50μｌの合計容積で混合した逆転写酵素（1000単位）、tRNAプライマー（５μg）、および［α-³²P］dCTP（50μCi）であり、室温で10分間インキュベートする。次にヒーラ細胞（5x10⁶）0.5mlをその反応成分に添加し、その混合物を冷却した0.4cmのエレクトロポレーションキュベット（バイオラド）に移す。次にエレクトロポレーションを下記のセッティングで行う：330V、1000μＦおよび無限抵抗。エレクトロポレーション後に、温めたCO₂− 平衡イーグル最小必須培地（ギブコ）１mlをキュベットに添加し、その混合物をプラスチックチューブ（ファルコン＃2059）に移し、次にその混合物を37℃で１時間インキュベートする。そのインキュベーション期間後に、細胞を第Ｖ節に記載されたようにしてハート抽出にかけ、そしてセレンコフ・カウントを乾燥ペレットに関して得る。下記の条件を、試験した細胞系の全てにおけるインビボでのcDNA合成反応の対照として使用する：全ての反応液は［α-³²P］dC TP 50μCi（約3000Ci/ミリモル）を含む。含む場合、逆転写酵素（MoMuLV；BRL ）1000単位を反応混合物に添加する。tRNAプライマーを必要とする反応において、プライマー１〜10μｇを細胞0.5mlに対し添加し、その量を全ての利用可能な逆転写酵素と複合体を形成するのに所望される量により決定する。オリゴ（dT）プライマーは、デオキシリボチミジル酸の12〜18塩基のオリゴマーからなることが好ましい。示される場合、このオリゴヌクレオチドプライマー１または５μｇを反応液に添加する。 VIII．生成物の分析第Ｖ、VIおよびVII節において記載するように、セレンコフ・カウントを乾燥ペレットに関して得ることができる。ペレットを再度懸濁することができ（そしてアリコートをシンチラントでカウントし）、そして生成物をアガロース/TAEゲルで電気泳動にかけることができる。これらのゲルを放射標識した分子量標準物質を用いて泳動し、そしてゲルをEtBrで染色することができ（図５、７、および９を参照のこと）、乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーにより調べることができる（図６、８、および10を参照のこと）。反応生成物をS1ヌクレアーゼで処理してポリデオキシリボヌクレオチド生成物の性質を調べる。S1ヌクレアーゼは二本鎖核酸分子を制限された範囲で消化するが、その酵素は一本鎖核酸基質に対し最も有効に作用する。こうして、一本鎖である（または一本鎖領域を含む）ポリヌクレオチドをS1ヌクレアーゼ処理（Samb rook 1989）により非常に迅速に完全に消化する。図10に見られるように、S1ヌクレアーゼで処理された試料は、未処理の試料と比較した場合、認められる分解を示さない（図10；レーン２＆３、およびレーン４＆５を比較のこと）。実際に、主要なcDNA生成物（約1.9kbのサイズ）（これはtRNA_wtプライマーで得られたインビボでのcDNA合成反応中に現れる）は、S1ヌクレアーゼ処理の前後で認められる相違を示さない（図10：レーン２と３を比較のこと）。インビボでのcDNA生成物を更に同定するために、S1ヌクレアーゼ処理をリボヌクレアーゼＨ処理の前後の並行試料につき行う。リボヌクレアーゼＨはDNA-RNA ヘテロ二本鎖のRNA鎖を消化する活性を有する。二本鎖cDNA生成物がヘテロニ本鎖である場合、リボヌクレアーゼＨによるその物質の処理、続いてS1ヌクレアーゼによる処理は、その物質の分解およびアガロース/TAE電気泳動ゲルの高分子量範囲におけるオートラジオグラフィーシグナルの損失をもたらすであろう。これらの実験を行う時、反応生成物はS1ヌクレアーゼによる処理単独の生成物から区別できないで現れる。しかしながら、RNaseＨおよびS1ヌクレアーゼ処理で行われる実験は、生体内のcDNA生成物中のヘテロニ本鎖を除くために反復されるであろう。 IX．インビボで合成されたcDNA生成物のクローニング上記の反応からの二本鎖cDNA生成物を、認められたクローニング技術を使用してベクターにクローン化する。簡単に言えば、細胞を改変tRNAプライマー、逆転写酵素、および［α-³²P］dCTP（とり込みを追跡するため）を用いてエレクトロポレーションにかける。エレクトロポレーション及びとり込みの後に、細胞を上記の第Ｖ、VIおよびVII節に記載されたようにして処理する。最終ペレットを70％のエタノールですすぎ、乾燥させる。セレンコフ・カウントを乾燥ペレットに関して得、ペレットを再度懸濁させ、そしてアリコートをシンチラントでカウントする。放射能標識した分子量標準物質を用いて生成物をアガロース/TAEゲルで電気泳動にかける。ゲルをEtBrで染色し（図５、７、および９を参照のこと）、乾燥し、そしてオートラジオグラフィーにより調べる（図６、８、および10を参照のこと）。このインビボでのcDNA合成反応で生じる第二鎖cDNA合成は、いずれも第一鎖cD NA生成物の3'末端により開始されることが可能である。RNase活性はRNA鋳型分解中に作用して第一鎖cDNA生成物の3'末端を遊離し、隣接配列をこの3'末端によりアニーリングを受け易くなるようにする。これがこの酵素によるインビトロでの cDNA合成に共通の機構である（Okayama，H．ら，Recombinant DNA Methodology ， Academic Press，Inc.，235-260頁（1989））。cDNA生成物の末端がクローニングを受け易くすることを確実にするために、インビボのcDNA反応生成物をS1ヌクレアーゼで処理し、そしてアダプター分子またはリンカー分子の添加の前に、 T4 DNAポリメラーゼおよび高濃度のdNTPでブラント末端にする。S1ヌクレアーゼは使用直前に希釈されること、そして使用される濃度はスケールアップ反応の前にcDNA生成物の小部分を用いて測定することが重要である。RNaseＡ処理、抽出および沈殿後に、cDNAをS1ヌクレアーゼ緩衝液：200 mMのNaCl、50mMのNaOAc（p H4.5）、１mMの ZnSO₄、0.5％のグリセロール中で再度懸濁し、そして37 ℃で30分間にわたってcDNA１μｇ当たり約100単位の希釈S1ヌクレアーゼで処理する（Kimmel，A.R.,およびS.L.Berger，Guide to Molecular Cloning Techniqu es，Academic Press，328-329（1987））。EDTAを20mMまで添加して反応を停止する。生成物を緩衝されたフェノール／クロロホルムで２回抽出し、次にクロロホルムで１回抽出する。水相を含むチューブに、１/10容積の酢酸ナトリウムおよび２容積のエタノールを添加し、その反応混合物を-70℃で30分間放置する。チューブを低温マイクロフュージ中で15分間にわたって遠心分離し、上澄みを捨てる。ペレットを80％のエタノールで注意してすすぎ、スピードバック（Savant ）中で乾燥させる。その生成物を高レベルのdNTPの存在下でT4 DNAポリメラーゼで処理して末端をブラントにすることを確実にする。cDNA生成物をT4 DNAポリメラーゼ緩衝液（50 mMのトリス-HCl（pH8.3）、50mMのNaCl、10mMのMgCl₂、10mMのDTT）中で懸濁させる。それぞれのデオキシヌクレオチドトリホスフェートを含む原液を添加して 500μMの最終濃度を得る。次に10単位のT4 DNAポリメラーゼを50μｌの最終濃度まで添加し、その反応を37℃で30分間インキュベートする。その反応を20mMまでのEDTAの添加により停止する。もう一度、生成物を抽出し、沈殿させ、そしてペレットを第Ｖ節に記載されたようにしてすすぎ、乾燥させる。それから、アダプターまたはリンカーをcDNA生成物に添加することができる。アニールしたヘミホスホリル化アダプター（プロメガ：アダプターの5'ブラント末端のみがホスホリル化される）は、それが、リンカーコンカテマーを除去するためのcDNAインサートの消化をしないで、アダプターの結合および過剰の未結合のアダプターの排除後にcDNA生成物のクローニングを可能にする点で有利と考えられる。加えて、 “リンカーライブラリー”構築物を排除するのに必要な過剰のアダプターを除去する工程が、ベクターへの結合の前にcDNAをサイジング（sizing）するのに同様に利用し得る。また、アニールした、ホスホリル化されていないリンカー（ベーリンガー・マンハイム）を使用することができ、そして過剰の未結合のリンカーを、その結合生成物を60℃〜70℃の範囲で短時間加熱することにより簡単に除去することができる。これは結合されていない付着末端を溶融し、そして連結したリンカー付きのcDNA生成物をカラムクロマトグラフィーまたはゲル電気泳動により分離することができる。 cDNAの末端およびアダプターのモル当量の濃度を計算し、そして約20倍過剰のアダプターまたはリンカーを結合反応に使用する（Wu，R．ら，Meth．Enzymol． 152:343-349（1987））。その結合反応を、以下のようにして行う。チューブに、合計容積20μｌ中、２μｌの10X連結緩衝液（666mMのトリス-HCI（pH7.6）、1 00 mMのMgCl_2、100 mMのDTT、３mMのATP、10mMのスペルミジン-HCl、10mMのヘキサミンコバルトクロリド、２mg/mlのウシ血清アルブミン）、ヘミホスホリル化アダプター、二本鎖ブラントcDNA、および５単位のT4 DNAリガーゼを添加する。その混合物を15℃で一夜インキュベートする。ブラント末端の結合をPEG8000の添加により増進することができる。しかしながら、ポリエチレングリコールはファージパッケージング反応を抑制し、このためこれらの反応の前に完全に除去すべきである。次にその結合反応液を１mlの床容積のセファクリルS400スピンカラム（プロメガ）に装填し、これを800xgで遠心分離して過剰のアダプターおよびアダプター二量体を除去する。cDNA生成物の更に正確なサイズ選択を可能にする別の技術は、アガロースゲル電気泳動、続いて陽イオンニトロセルロース（例えば、DEAEニトロセルロース）からの捕捉および溶離、または低融点のアガロースの回収部分から直接回収することを含む。シンチレーションを使用してcDNAを定量し、そのモル末端を計算する（量および平均サイズを基準とした）。今、cDNAインサートが選択されるベクターへの連結に供される（インサートのサイズおよび付着末端の適合性により若干拘束される）。もう一度、連結を上記のようにして行う。ヘミホスホリル化アダプターまたはホスホリル化されていないアダプターの使用により、多重インサートクローニングが起こりそうにない。何となれば、ベクターのみが接近可能なホスホリル化末端を有するからである。次にその結合反応をファージパッケージングに使用し、または化学変換もしくはエレクトロポレーションのために希釈する。現れるコロニーまたはファージを最初に豊富な遺伝子につき青色／白色の色選別（α相補性）、またはプローブでスクリーニングする。加えて、ランダムコロニーまたはプラークを、クローニング部位に隣接するプライマーによるPCRを使用して、または制限消化分析によりインサートサイズにつき調べる。これらの一般的な技術を使用して、インビボでのcDNA合成方法を使用してCHO 細胞からつくられたcDNAからライブラリーを構築する。ライブラリーの一つをCHO細胞からのtRNA_wtで開始された生体内のcDNA生成物（約1.9kb）からつくり（図８、レーン４および８を参照のこと）、これをクローニングの前にDEAEニトロセルロース（NA45、Ｓ＆Ｓ）捕捉／溶離操作を使用してアガロースゲルでサイズ選別する。別のライブラリーをCHO細胞からのtRN A_polyU開始されたインビボでのcDNA生成物からつくり、これをアガロースゲル電気泳動を使用して4-10 kbの間でcDNAにつきサイズ選別する。 tRNA_wtプライマーによりCHO細胞中に現れるcDNA生成物（約1.9kb）は、試験した全てのCHO細胞系（Anderson，K.P．ら，Virol.181:305-311（1991））に見られる保存された適度に反復性のＣ型配列および細胞質内Ａ型粒子（IAP）配列からの配列特異性プライミングおよび合成を代表し得る。これらの種はマウス白血病ウイルスのゲノムに対し広範な相同性を有する。実施例２Ｉ．インビボでのcDNA合成に関するプライマーの適性を評価するための一般的な方法改変リボヌクレオチド塩基（図2Bを参照のこと）を含む細胞の逆転写酵素同族 tRNA分子は、ウイルス複製中にレトロウイルスのcDNA合成を開始する。これらの分子は、本発明により実証され、またインビトロで先に行われた研究（Barat，C .ら，Nucleic Acids Res．19:751-757（1991）;Weiss，S．ら，Gene 111:183-19 7（1992）；Kohlstaedt，L.A.およびT.A．Steitz，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 89 :9652-9656（1992））から推定されるように、インビボでのcDNA合成を全く開始することができない。実際に、塩基改変を欠いている合成tRNA分子のフラグメントはインビトロでRNA鋳型にアニールでき、そしてこれらの鋳型からインビトロでのcDNA合成を誘導することができる（Weiss，S.ら，Gene 111:183-197（1992 ））。ショウジョウバエ属において、コピアレトロウイルス様粒子中の逆転写はショウジョウバエtRNA_i ^Met分子からの開裂および開始から起こる（Kikuchi，Y.ら，P roc.Natl.Acad.Sci．USA 87:8105-8109（1990））。それ故、逆転写酵素の同族t RNAプライマー分子の、先端を切ったアナローグである合成ポリヌクレオチドは本発明のプライマーとして同様に機能し得ることが明らかである。インビボでのcDNA合成反応に関するポリヌクレオチドプライマーの適性の測定は直接的である。前記のように、プライマーは二つの重要な基準を満足できるであろう。（ａ）インビボでRNA鋳型分子に結合でき、かつ（ｂ）そのRNA鋳型分子に相補的なDNAの合成が起こるように少なくとも一つの逆転写酵素のプライマーとして作用できるあらゆるオリゴヌクレオチドが、本発明のインビボでのcDNA合成の真正プライマーである。有望なプライマーの適性を定性的かつ定量的に評価する実験が、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を使用して行い得る（上記の実施例１を参照のこと）。インビボアッセイは、エレクトロポレーションによる細胞への［α-³²P］dCTP 、推定プライマー、およびMolonyマウス白血病ウイルス逆転写酵素の導入からなる。インビボでのcDNA合成のプライマーの適性を評価するための対照として、下記の陰性対照が挙げられる。１）［α-³²P］dCTP単独のエレクトロポレーション２）逆転写酵素と共に［α-³²P］dCTPのエレクトロポレーション実際のプライマー試験反応は、３）“候補”ポリヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素と共に［α-³²P］ dCTPのエレクトロポレーションからなることができる。陽性対照反応は、４）改変tRNA_polyUプライマーおよび逆転写酵素と共に［α-³²P］dCTPのエレクトロポレーションからなることができる。ハムスターCHO細胞系をATCCから入手し、実施例１に記載されたようにして維持する。エレクトロポレーションの前に、トリプシン／EDTA溶液を使用してCHO 細胞を単層培養から回収する。はがした細胞をカウントし、PBS中ですすぎ、そして1x10⁸細胞／mlでPBS中で再度懸濁する。反応成分はDTT（10mM）を含む逆転写緩衝液（BRL）中で50μｌの合計容積で混合された逆転写酵素（1000単位）、t RNAプライマー（５μg；またはモル当量の候補プライマー）、および［α-³²P］ dCTP（50μCi）を含み、室温で10分間インキュベートする。プレインキュベーション後に、CHO細胞0.5mlをその混合物に添加し、細胞を混合し、直ちにエレクトロポレーションキュベットに移す。エレクトロポレーションを下記の条件下で行う：330V、1000μFおよび無限抵抗。エレクトロポレーション後に、温めたCO₂平衡ハム培地（ギブコ）１mlをキュベットに添加し、その混合物をプラスチックチューブ（ファルコン#2059）に移し、次にその混合物を37℃で１時間インキュベートする。そのインキュベーション期間後に、細胞をエッペンドルフ型式5415Cマイクロフュージ（または均等物）中でセッティング５で５分間の遠心分離によりペレットにし、実施例１、第VI節に記載されたようにして抽出プロトコルにかけ、そしてセレンコフ・カウントを乾燥ペレットに関して得る。ペレットを再度懸濁し、アリコートをシンチラントでカウントする。放射標識した分子量標準物質を用いて、生成物をアガロース/TAEゲルで電気泳動にかける。次にゲルを臭化エチジウムで染色し、乾燥させ、オートラジオグラフィーにより調べる。結果の解釈候補ポリヌクレオチドプライマーを用いる実験からの最終ペレットへの標識デオキシリボヌクレオチドのとり込みのセレンコフ・カウントの結果が陰性対照で見られたとり込みを越え、また陽性対照で見られたとり込みが陰性対照で見られたレベルより約10倍高い場合、その試験プライマーはcDNA合成を開始しているかもしれない。しかしながら、cDNA生成物の性質が非常に重要であり、調べるべきである。それ故、第二の基準は生成物の定性評価であり、最初にアガロース/TAEゲルで、放射標識した分子量標準物質と並行して実験された10のアリコートから得られたオートラジオグラフィーシグナルのパターンおよび密度から測定される。ポリヌクレオチドプライマーが異なるサイズのRNA鋳型、またはRNA鋳型分子の5'からの異なる距離にある結合部位にアニールするように設計される場合、cDNA生成物の異種集団が予想される。しかしながら、プライマーが特定の同種RNA鋳型にアニールするように設計される場合、特定のcDNA生成物が生成されるべきである（例えば、図８、レーン４および５、並びにレーン８および９を比較のこと）。それ故、定性パラメーターおよび定量パラメーターの両方を調べて有望なプライマーの効力を測定すべきである。実施例３Ｉ．配列特異的インビボcDNA合成プライマーの発生また、本発明は、適合性逆転写酵素および、所望により、改変デオキシヌクレオチドトリホスフェートまたはデオキシヌクレオチドトリホスフェートアナローグと組み合わせて細胞に導入される配列特異的プロモーターを使用する配列特異的インビボcDNA合成反応を提供する。これらの配列特異的プライマーは、DNA鋳型から調製される転写産物として、または化学手段（例えば、固相担体による）により合成し得る。 II．固相担体を使用する化学合成改変されていないオリゴヌクレオチド、および２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドを固相で高収率で化学合成できることは、本発明を分取用、分析用および治療用に容易に採用されることを可能にする。改変オリゴリボヌクレオチド生成に有益な合成技術および試薬（例えば、本明細書に参考として含まれるSpro ut,.S.ら，Nucleic Acids Res．17:3373-3386（1989））は、RNAプライマーがDN A鋳型からインビトロで生成される場合に行い得なかった幾つかの実施態様を与える。例えば、２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドはRNase活性に耐性であることが知られている（Sprout，B.S.ら，（1989）；Inoue，H．ら，FEBS Let t．215:327-330（1987））。それ故、オリゴリボヌクレオチドに代えて、インビボでのcDNA合成反応のプライマーとしてのこれらの改変RNA分子の使用は、初期のcDNA合成プライマーのRNase H触媒除去（あらゆる既存の改変を含む）に対する耐性をもたらす。次にこれらのプライマーはビオチニル化でき、³²Ｐ標識でき、または初期の鋳型の塩基触媒加水分解後の第二鎖cDNA合成中に占有され、とり込まれる制限部位の如き配列要素を含むことができる（２’−Ｏ−メチルプライマーは初期のRNA鋳型のアニールした相補部分をも同様に保護するであろう）。これらの改変はタンパク質と会合するプライマーの能力を損なわないようであり（Sprout，B.S.ら，（1989））、そして改変オリゴリボヌクレオチドは予想された特異性でアニールする。２’−ＯＨ基の脱離はRNAプライマーを隣接３’，５’−ホスホジエステル結合に対する塩基触媒（求核性）攻撃に対し更に耐性にし、またそれは種々の汎存RNaseに耐性である。 III．配列特異的DNA鋳型からの転写所望の配列特異的tRNAプライマーを生成できる一つの実施態様は、一般に下記のように、DNA鋳型からのインビトロ転写からなる。配列特異的tRNAプライマーをコードする発現カセットの生成のための初期の鋳型は、pUC18-T7tRNA_wtベクター構築物であり得る。この構築物はtRNA_wt分子をコードする（図2Bおよび3Aを参照のこと）。２種のプライマーのうちの第一プライマーは、pUC18ベクター中の5'からT7プロモーター配列に向けて存在し（図４を参照のこと）、T7プロモーター配列に向かって3'方向に延びる配列にアニールする。市販のプライマーをこのようにしてpUC18-T7tRNA_polyU発現カセットの増幅に使用した。第二プライマーは、インビボcDNA合成反応のRNA鋳型（例えば、既知の配列のR NA鋳型）中の配列に相補的であるが、初期のDNA鋳型の配列に相補的ではないプライマーの5'末端にある塩基を含むことが望ましいであろう（図４を参照のこと）。プライマー中の残りの塩基は、pUC18-T7tRNA_wtDNAベクター中のコードされたtRNA鋳型の正確な3'末端から同様の距離にあり、そしてT7プロモーター配列に向かって3'方向に延びるDNA鋳型中の塩基に相補性であろう（即ち、この第二プライマーの5'末端にある20の塩基はインビボcDNA合成のRNA標的に相補的であり、次に残りの塩基はその3'末端から20の塩基で開始するコードされたT7tRNA_wtDNA中の塩基に相補的であろう）。この状況が図４に表される。 PCRにおいてこれらの２種のプライマーを使用して、増幅されたDNA T7発現カセット中にコードされたtRNAプライマーを、初期のtRNA_wt鋳型から増幅プロセス中に所望のtRNA_specific鋳型に改変する（図４を参照のこと）。同時に、第二プライマーの5'塩基が、得られたtRNA_specificをコードするカセットの3'境界を形成する。このカセットは、第二PCRプライマー中にコードされた5'配列、およびインビボcDNA合成反応についてのRNA標的の両方に相補的である3'末端を有するt RNA_specific分子を生じる（図４を参照のこと）。そのPCRを20μｌの容積で下記の条件に従って行う：PCR緩衝液：67mMのトリス（pH9.2、25℃）、16.6mMの（NH₄）₂SO₄、1.5mMのMgCl₂；50ngのそれぞれのプライマー、約1x10⁸分子のpUC18-T7tRNA_wt構築物、および250μＭ濃度のそれぞれのデオキシヌクレオチドトリホスフェート。その反応混合物を100℃で３分間加熱し、次に15℃に冷却する。チューブを短時間遠心分離して内容物を回収し、次に１単位のTaqポリメラーゼおよび１滴の鉱油をそれぞれ20μｌの反応液に添加する。その反応を下記のレジメで40サイクルで行う：94℃で１分間；次に55℃で１分間。生成物を５つの反応からプールし、クレノーフラグメントでブラント末端にし、抽出してタンパク質および痕跡の鉱油を除去し、そして通常のプロトコルを使用してEtOH沈殿させる。フラグメントを１mMのトリス−クロリド（pH8.0）、0.1mMのEDTA中で再度懸濁し、そしてアリコートを既知のサイズの標準物質で２％のアガロース／TAEゲルで調べてサイズを確かめ、定量する。典型的な収量はそれぞれの20μ ｌの反応につき約500ng〜１μｇであると予想される。次にtRNA_specific分子を上記のtRNA_polyUの生成に使用されたインビトロでの転写反応と同様の転写反応で生成する。簡単に言えば、RNaseを含まないエッペンドルフチューブに、下記の成分を25℃で添加する：80mMのHepes-KOH（pH7.5）、12mMのMgCl₂、20mMのDTT、５mMのdNTP、２mMのスペルミジン；RNaseを含まないdH₂O；50-100μｇ/mlの鋳型DNAおよび５μｌの［α-³²P］ATP（30μCi;3000Ci /ミリモル；生成物を調べ、定量するために添加した）。反応成分を混合し、次にその反応をT7 RNAポリメラーゼ酵素反応ミックス（1200-1800U/mlの最終濃度まで）の添加で開始する。次にチューブを37℃で４時間インキュベートする。次にRNaseを含まないDNaseを反応に添加し、そして鋳型DNAの消化を15〜30分間進行させる。この時点で、とり込みの効率を測定するために、反応混合物の少量のアリコートを除去することができる。（これは、過剰のRNaseを含まないキャリヤーDNAの存在下で反応混合物のアリコートの低温トリクロロ酢酸沈殿により行うことができる。この測定、合計カウントの対照は、同反応混合物から沈殿されなかった物質で行う。）次に反応混合物のそれぞれに、150μｌのRNaseを含まないdH₂Oおよび20μｌの3MのNaOAcを添加し、その混合物を等容積のフェノール／C HCl₃（pH6.5）、続いてCHCl₃により抽出する。生成物を２−プロパノールで沈殿させ、ペレットをすすぎ、沈殿を乾燥させる。プライマー生成物をRNaseを含まないdH₂O中で再度懸濁し、そして既知のサイズの標準物質で行われるポリアクリルアミド／尿素ゲルのオートラジオグラフィー露出を使用してアリコートをサイズにつきチェックする。細胞への導入の前に、プライマーを精製し、定量する。このアプローチは、MoMuLV逆転写酵素と共に使用するための配列特異的tRNAプライマーのインビトロでの生成に使用されるDNAカセットの直接の増幅を可能にする。その技術は単一の配列特異的DNAプライマー、5'ユニバーサルプライマーおよびカセット増幅のためのtRNA_wtDNA鋳型を使用する。実施例４Ｉ．細胞中のスプライス変異体の比を測定するための配列特異的プライマーの使用インビボcDNA反応に使用するために配列特異的プライマーを生成できることは、研究者らが標的細胞または組織中に存在する転写パターンの実時間“スナップショット”をとることを可能にする。インビボcDNA合成技術の、この分析用標的細胞の調製に際する注意は、おそらく簡単な分取用（例えば、cDNAライブラリー構築物）よりも更に重要であり、そしてRNAプライマーの型の実際の評価、プライマー−逆転写酵素（および、おそらく改変デオキシヌクレオチドトリホスフェート、またはアナローグ）および送出の方式が慎重に考慮されるべきである。プライマー／酵素複合体を送出するための多くの別法が存在し、そして代表的な選択が先に概説された。配列特異的プライマーのインビトロでの生成を可能にするDNAカセットの製造のための一つの技術が上記の実施例３に概説される。このような合成後に、プライマー生成物をRNaseを含まないdH₂O中で再度懸濁し、そして既知のサイズの標準物質で行われるポリアクリルアミド／尿素ゲルのオートラジオグラフィー露出を使用してアリコートをサイズにつきチェックする。細胞への導入の前に、プライマーを精製し、定量する。別のそして更に直接のアプローチは、実施例３、第II節に一般に記載されるように、固相担体上でRNAプライマーを化学合成することである。このアプローチは配列特異的プライマーの直接合成を可能にするだけでなく、cDNA生成物の検出、精製および／または改変（例えば、それぞれ、³²P−標識、ビオチニル化、および／または配列とり込み）に有益であるような改変された安定なリボ核酸アナローグをとり込む機会を与える。細胞を、所望の条件に対する最小の変動を可能にする方法で調製し、そして反応成分の送出の速度を最大にし、かつ細胞または組織へのストレスを最小にするのに最良であると評価される送出系を使用する。一つのこのような実施態様において、配列特異的プライマー、逆転写酵素、および［α-³²P］dCTPを、細胞または組織への添加の前に、インビトロで一緒に短時間インキュベートする（上記の実施例１に記載されたようにして）。細胞または組織への導入後に、細胞または組織を特異的RNA鋳型に相補的であるDNA分子の合成を可能にする条件下でインキュベートする。この反応の対照は、下記のものを含む。１）［α-³²P］dCTP単独の送出２）逆転写酵素と共に［α-³²P］dCTPの送出３）インビトロで転写された“野生型”プライマーおよび適当な逆転写酵素と共に［α-³²P］dCTPの送出上記のような抽出および精製後に、cDNA生成物を適当な放射標識サイズ標準物質を用いて行われるゲルのオートラジオグラフィー分析により定性的に調べることができる。加えて、特定の生成物を分析電気泳動ゲルの走査オートラジオグラフィーまたは分取電気泳動ゲルから切除されたバンドの液体シンチレーションカウンティングにより定量することができる。PCRを使用して処理されていないRNA 鋳型から生成されるcDNAを検出することができる。実施例５Ｉ．細胞中の遺伝子転写産物の比を測定するための多重配列特異的プライマーの使用インビボcDNA反応に使用するために配列特異的プライマーを生成できることは、標的細胞転写パターンの実時間“スナップショット”を使用して特異な転写パターンおよび転写レベル（これらは多数の病気の症状と関連している）を検出することをまた可能にする。内部対照転写産物（例えば、“ハウスキーピング遺伝子”）のレベルに対して、種々のオンコジーン転写産物のレベルを同定することは、診断および研究の予想の両方から望ましい。PCRがこの目的のために過去に使用されていたが、増幅中に起こる問題のため、よくても信頼性がなく、かたよっている（Gilliland，Gら，（1990））。このような本発明の使用、および配列特異的プライマーのインビトロでの生成を可能にするDNAカセットの製造技術に関する考察を上記の実施例３および４に概説する。この実施態様における望ましいアプローチは、実施例３、第II節に一般に記載されたようにして、固相担体上でRNAプライマーを化学合成することである。このアプローチは異なる配列特異的プライマーの直接合成を可能にし、そしてcDNA生成物の差別的検出、精製および／または改変（例えば、それぞれ、³²P−標識、ビオチニル化、および／または配列とり込み）に有益であるような異なる改変されたリボ核酸アナローグをそれぞれのプライマーにとり込む機会を与える。このような合成後に、異なるプローブおよび対照プライマー生成物をRNaseを含まないdH₂O中で再度懸濁し、そして既知のサイズの標準物質で行われるポリアクリルアミド／尿素ゲルのオートラジオグラフィー露出を使用してアリコートをサイズにつきチェックする。標的細胞または組織への同時導入の前に、プライマーを精製し、定量する。細胞を、所望の条件に対する最小の変動を可能にする方法で調製し、そして反応成分の送出の速度を最大にし、かつ細胞または組織へのストレスを最小にするのに最良であると評価される送出系を使用する。一つのこのような実施態様において、オンコジーン配列特異的プライマーおよびアクチン配列特異的プライマーをそれぞれプローブプライマーおよび対照として使用する。これらの異なるプライマー、逆転写酵素、および［α-³²P］dCTPを、細胞または組織への添加の前に、インビトロで一緒に短時間インキュベートする（上記の実施例１に記載されたようにして）。導入後に、細胞または組織を特異的RNA鋳型に相補性であるDNA分子の合成を可能にする条件下でインキュベートする。この反応の対照は、下記のものを含む。１）［α−³²P］dCTP単独の送出２）逆転写酵素と共に［α-³²P］dCTPの送出３）所望のRNA鋳型の一つのプライマーおよび適当な逆転写酵素と共に［α-³² P］dCTPの送出４）それぞれの付加的な所望のRNA鋳型のプライマーおよび適当な逆転写酵素と共に［α-³²P］dCTPの送出上記のような抽出および精製後に、cDNA生成物を適当な放射能標識サイズ標準物質を用いて行われるゲルのオートラジオグラフィー分析により定性的に調べることができる。加えて、特定の生成物の同一性を、例えば、ビオチニル化された分子量標準物質を使用して確かめることができ、そしてゲルを移し、サザンブロットをストレプトアビジン／アルカリ性ホスファターゼ接合系（例えば、ブルジーン（BluGENE）系、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリィズ、ガイザースブルグ、MD）を使用して調べることができる。実施例６Ｉ．特定の遺伝子ファミリーのメンバーをクローン化するための配列特異的プライマーの使用インビボcDNA反応に使用するために配列特異的プライマーを生成できることは、研究者らが特定の配列を含むRNA鋳型からcDNAを選択的に生成することを可能にする。インビトロでの配列特異的プライマーの生成を可能にするDNA カセットの製造のための一つの技術が上記の実施例３に概説され、記載されたようにして使用し得る。細胞への導入の前に、プライマーを精製し、定量する。更に直接の別法は、実施例３に記載されたような固相化学合成技術を使用することである。細胞を、所望の条件に対する最小の変動を可能にする方法で調製し、そして反応成分の送出の速度を最大にし、かつ細胞または組織へのストレスを最小にするのに最良であると評価される送出系を使用する。これらの別法の幾つかが上記の発明の詳細な説明に概説される。最初に分析プロトコルに従う。予想されるサイズまたはサイズ分布の生成物が得られると、分取cDNA合成反応を行うことができる。プライマーおよび技術の分析評価につき、［α-³²P］dCTPを入れてインビボでのcDNA合成反応の結果を定量的かつ定性的の両方で迅速に研究することができる。一つの実験スキームにおいて、配列特異的プライマー、逆転写酵素、および［ α-³²P］dCTPを、細胞または組織への添加の前に、上記の実施例１に記載されたようにして、インビトロで一緒に短時間インキュベートする。細胞または組織への導入後に、細胞または組織を特異的RNA鋳型に相補的であるDNA分子の合成を可能にする条件下でインキュベートする。この反応の対照は、下記のものを含み得る。１）［α-³²P］dCTP単独のエレクトロポレーション２）逆転写酵素と共に［α-³²P］dCTPのエレクトロポレーション３）インビトロで転写された“野生型”プライマーおよび適当な逆転写酵素と共に［α-³²P］dCTPのエレクトロポレーション上記の抽出および精製後に、cDNA生成物をエチジウム染色ゲル（図７、レーン４および８を参照のこと）、または適当な放射標識サイズ標準物質を用いて行われるゲルのオートラジオグラフィー分析（図８、レーン４および８を参照のこと）により定性的に調べることができる。加えて、とり込みのレベルをセレンコフ・カウントの測定により、または、再度の懸濁後に、アリコートの液体シンチレーションカウンティングにより測定することができる。分析試験後に、同様の反応を放射標識デオキシヌクレオチドトリホスフェートの不在下で（またはトレーサーとして減少された量を使用して）行うことができる。所望の生成物を得るのに必要とされる反応の数が先の分析反応により決められる。上記の反応からのcDNA生成物を、実施例１、第IX節に記載されたようにして、認められたクローニング技術を使用してベクターにクローン化する。実施例７Ｉ．インビボcDNA生成物の直接配列決定のための配列特異的プライマーおよび４種の蛍光ジデオキシヌクレオチドアナローグの使用別個の蛍光放出スペクトルを有し、かつ逆転写酵素によりDNAに容易にとり込まれる一連の蛍光ジデオキシヌクレオチドトリホスフェートアナローグが開発されていた（Prober，J.M.ら,（1987 ））。それぞれのアナローグは特定のジデオキシヌクレオチド鎖末端塩基を置換し、そして鋳型誘導様式でDNAにとり込まれる。配列特異的プライマーから誘導された、インビボで改変ジデオキシヌクレオチドアナローグをとり込む能力は、所望の3'配列を含み、かつ検出可能な量で存在するRNA鋳型の直接の配列決定を可能にする。典型的な真核細胞中にはおそらく約15,000の異なる転写産物がある（Sargent ，T.D．（1987））。配列特異的プライマーが3'末端付近でのポリウリジル酸伸長（RNA鋳型のポリアデニル化3'末端にプライマーを位置するように設計される）と、それに続く極限の3'末端での特定の８塩基配列でもって生成される場合、唯一のcDNA生成物がおそらく真核細胞中に存在するmRNA鋳型から生成される（0. 25⁸=1/65,536）。適合性逆転写酵素、bio-11-dUTPデオキシヌクレオチドアナローグ（プライマーがビオチニル化されていない場合；実施例３；下記の実施例８を参照のこと）、および４種の蛍光塩基特異的およびスペクトル特異的ジデオキシヌクレオチドトリホスフェートアナローグ（Prober，J.M.ら,（1987））と共に、この改変tRN Aプライマー（実施例３に記載された技術と同様の方法で生成された）の導入は、一群のcDNA合成生成物をもたらし、これらを、例えば、アビジン被覆ポリスチレン（バクスター・ヘルスケアー、ムンデレイン、IL）またはストレプトアビジン結合ビードを使用して抽出し、濃縮し、ゲル装填緩衝液中で加熱することにより溶離し、そして分析用変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかける。そのゲル装置をレーザーを装備したスペクトル識別蛍光励起、検出装置に取り付ける。これは、先のクローニング、または更には配列の既存の知識を必要としないで、生物からの発現遺伝子の直接のDNA配列決定を可能にする。勿論、単一cDNA種がプライマーで生成されることを確かめるために、同様の予備実験（［α-³²P］dCTPのとり込み、およびジデオキシ鎖末端アナローグの不在を伴う）を行うことができる。これは、アガロース/TAE電気泳動ゲルでのオートラジオグラフィーによる抽出後に確認し得る。クローニングしないでインビボcDNA生成物から直接にDNA配列情報を得るための別の技術は、低融点のアガロース電気泳動ゲルで特定のcDNAバンドをゲル精製することである。これらの生成物は、ビオチニル化プライマーを使用する場合の固相配列決定を含む現在認められている配列決定技術（Syvanen,A-C．ら，FEBS Lett．258:71-74（1989））を使用して直接に配列決定し得る。cDNA合成に使用される配列特異的tRNAプライマー分子は、その反応に使用される配列決定プライマーを示唆する。更に別の有益なアプローチは、［α-³²P］dNTP、ビオチニル化された配列特異的tRNAプライマー、逆転写酵素、および４種のジデオキシヌクレオチドトリホスフェート鎖末端分子の一つを標的細胞に導入することである。このようにして、４つの別個の導入を行い、それぞれ異なる鎖末端ジデオキシヌクレオチド塩基を導入する。次に細胞を、とり込みを可能にする時間、および方法でインキュベートする。一群のcDNA生成物を、例えば、アビジン被覆ポリスチレン（バクスター・ヘルスケアー、ムンデレイン、IL）またはストレプトアビジン結合ビードを使用して抽出し、濃縮し、そして配列決定ゲルを装填する直前に配列決定ゲル装填緩衝液中で加熱することによりビードから溶離する。次に配列をオートラジオグラフィーにより決定することができる。加えて、これらの技術は、3'配列に関する情報が入手できる場合に、クローンの5'配列を決定する直接アプローチを可能にする。特定の18塩基プライマー配列の選択は、cDNA生成物をクローニングする時間および困難を生じないで、インビボの特異的配列決定を可能にするであろう。実施例８Ｉ．インビボcDNA合成反応中のビオチニル化dUTPのとり込みデオキシヌクレオチドアナローグをインビボcDNA生成物にとり込むことができることは、幾つかの重要な分野で有益であり得るビオチニル化cDNAの調製および回収を可能にする。特定のビオチニル化デオキシヌクレオチドアナローグが特定の実験に適しており、多くの候補基質が存在する（Klevan，L．およびGebeyehu ，G.，Meth．E-nzymol．154:561-577（1987））。下記の実施例は一つのアプローチを使用し、インビボcDNA生成物のビオチニル化の別の方法または技術を特定または限定するものと見なされるべきではない。別法、例えば、RNAプライマーのビオチニル化（実施例３を参照のこと）またはインビボcDNA合成反応中のdATP アナローグN⁶-（-アミノアルキル）dATPのとり込み、続いて、抽出そして精製後のアミン標識cDNAとリポーター分子、ビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルの反応が、有益なアプローチである。ハムスターCHO細胞系をATCCから入手し、推奨されるように管理する。エレクトロポレーションの前に、トリプシン/EDTA溶液を使用してCHO細胞を単層培養から除去する。脱着細胞をカウントし、食塩加リン酸緩衝液中ですすぎ、そして1x 10⁸の細胞/mlで食塩加リン酸緩衝液中に再度懸濁させる。反応成分は、DTT（10m M）を含む逆転写緩衝液（BRL）中50μｌの合計容積で混合される逆転写酵素（10 00単位）、tRNAプライマー（5μg;配列特異性であってもよく、または一般のプライマー、例えば、tRNA_polyUであってもよい）、およびbio-11-dUTP（0.03 mM または0.3mM最終）であり、室温で10分間インキュベートされる。プレインキュベーション後に、CHO細胞0.5mlをその混合物に添加し、細胞を混合し、直ちに冷却した0.4cmのエレクトロポレーションキュベットに移す。エレクトロポレーションを下記の条件で行う：330ボルト（V）、1000マイクロファラッド（μF）および無限抵抗。エレクトロポレーション後に、温めたCO₂平衡ハム培地（ギブコ）１m lをキュベットに添加し、その混合物をプラスチック管（ファルコン#2059）に移し、次に混合物を37℃で１時間インキュベートする。そのインキュベーション期間後に、細胞をエッペンドルフ型式5415Cマイクロフュージ（またはその均等物）中でセッティング５で５分間の遠心分離によりペレットにし、cDNA生成物を実施例１に記載されたようにして回収する。そのビオチニル化cDNAペレットを再度懸濁させ、生成物をアガロース/TAEゲルで電気泳動にかける。これらのゲルをビオチニル化された分子量標準物質で実験することができ、そしてゲルを移し、ストレプトアビジン／アルカリ性ホスファターゼ接合系（例えば、BluGENE系、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリィズ、ガイザースブルグ、MD）を使用してサザンブロットを調べる。生成物は分取アガロースゲルから精製し、抽出することができ、そしてその生成物は電子顕微鏡のプローブ（ストレプトアビジン−金を使用する）、in situ ハイブリダイゼーション（ストレプトアビジン／アルカリ性ホスファターゼ検出系（Chanら（1985））、消去（subtractive）ライブラリー構築、並びにその他の分取目的、分析目的および治療目的に使用し得る。実施例９Ｉ．消去（subtractive）ライブラリー構築におけるビオチニル化インビボcDN Aの使用 cDNAライブラリーの構築そしてスクリーニングの前に誘発特異性メッセージ、または細胞もしくは組織特異性メッセージの相対頻度を増大できることは、大きな戦略上の利点であり、そして多くの場合低アバンダンスのmRNAにより提示される遺伝子の同定および回収の唯一の希望である（Hedrick，S.ら，Nature 308:14 9（1984））。既に知られている消去技術（subtraction techniques）は分離戦略を使用し、それにより一本鎖cDNA（所望の細胞、組織または条件から選択されたmRNAから生成される）を別の細胞、組織または条件から抽出された過剰のmRNA にアニールする。ヒドロキシルアパタイト、またはその他の選択的マトリックスを使用して、ヘテロ二本鎖分子を一本鎖cDNA（およびmRNA）から分離する。デオキシヌクレオチドアナローグをインビボcDNA生成物にとり込むことができることは、ビオチニル化cDNAの調製および回収を可能にする。このインビボのとり込みのビオチニル化cDNA生成物の使用の一つは、消去（su btractive）ライブラリー構築にある。ライブラリー構築のこの別の技術は、所望の鋳型、および消去（subtracting）鋳型分子の両方がcDNAであり、従来可能ではないハイブリダイゼーションおよび選択プロセス中の安定性を可能にする点で、従来技術より優れている。加えて、cDNA生成物が、インビトロで生成された生成物の性質を越え得る適合度およびプロセシビティで、初期の少数の細胞から生成される。とり込み反応を実施例３または８に記載されたようにして、または別の手段により行うことができる。ビオチニル化cDNAを、所望のcDNAライブラリーの条件以外の条件下で増殖される細胞または組織中で生成する。抽出され、単離されたビオチニル化cDNA生成物をS1ヌクレアーゼで処理して一つ以上のヘアピン構造（これは第二ストランド生成物から第一ストランド生成物を結合し得る）を開裂し、カラムクロマトグラフィーまたはゲル電気泳動により汚染している共有ゲノムDN Aから分離し、そして所望の細胞または組織、または別の所望の条件下で増殖された細胞または組織から生成された（そしてゲノムDNA汚染物質から同様に分離された）ビオチニル化されていないcDNA生成物の量の約1/30にアニールする。ルーチンハイブリダイゼーション条件は、約5mg/mlの最終DNA濃度で120 mMのNaH₂P O₄（pH6.8）、820mMのNaCl、１mMのEDTA、0.1％のSDSである。その反応混合物を５分間にわたって90℃に加熱し、次に12〜18時間にわたって65℃に保つ。その反応液をリン酸緩衝液（120mMのNaH₂PO₄、pH6.8）で希釈し、そしてアニールされた共通のcDNA配列を含むビオチニル化cDNAをストレプトアビジンカラムで単離する。フロー−スルーcDNAフラクションをエタノール沈殿により濃縮し、そして許された方法および技術（Sambrook，（1989））を使用してクローン化する。実施例10 Ｉ．HIV感染CD4リンパ球を同定するための、HIV配列特異的プライマーから導かれるインビボcDNA合成の間の蛍光デオキシヌクレオチドアナローグの導入多くの蛍光デオキシヌクレオチドトリホスフェートアナローグが市販品として利用可能であり、これらは特有の蛍光発光スペクトルを有し、ポリメラーゼ酵素により容易にDNAに導入することができる。それぞれのアナローグは、鋳型により導かれる方法でDNAに導入される。配列特異的プライマーにより導かれる、これらの改変されたデオキシヌクレオチドアナローグをインビボで導入する能力により、フローサイトメトリーを使用したHIV-感染CD4リンパ球のスクリーニングのための迅速で直接的な方法が可能となる。このスクリーニングは分析的な目的に使用することができ、あるいは感染していないCD4リンパ球から感染したCD4リンパ球を分離するのに使用することができ、それによりHIV陽性の個体の治療方法が得られる。本発明のインビボcDNA合成において使用するためのヒト免疫不全ウィルスＩ型配列特異的プライマーは、適当なHIV特異的配列を使用して形成される。SK69プライマーの配列に基づいた１つのそのようなPCRプライマーが製造され（Ou，C-Y et al.，Science239:295-297（1988）;Zack，J.A．et al.，Cell 61:213-222（ 1990）、これは下記のHIVのenv領域：に対応し、これは実施例３に記載したPCRに使用してHIV-特異的tRNAプライマーの製造のためのDNAカセットを生成できる。あるいは、Watoson＆Wilburn（1992）のM666プライマーに基づいたPCRプライマーも可能であり、これは下記のLAV-1_BRUのU₃領域：に対応する。次に、精製され、試験され、定量されたプライマーを、適当な方法（特にエレクトロポレーション及びカチオン性脂質媒介導入）を使用して、MoMuLV逆転写酵素及び蛍光デオキシヌクレオチドトリホスフェートアナローグとともに、サイトカイン活性化（Poli，G．and A.S．Fauci，AIDS Res．Hum．Retroviruses 8:191 （1992））リンパ球（分画化されたものあるいは分画化されていないもの）に導入する。標的細胞中にあるHIV-特異的RNA鋳型の任意の存在するものに対してcDN Aを製造するのに必要な条件下にそれに必要な時間、細胞をインキュベートする。同様の非感染細胞集団について、対照の反応を行うことができる。細胞を洗浄し、次いで所望によりCD4分子に対する抗体（例えばATCCからのOKT 4）とともに氷上で30分間インキュベートし、洗浄し、そしてFITC-標識F(ab')₂ ヤギ抗マウスIgGとともにインキュベートする。さらに細胞を再び洗浄し、調製し、導入された蛍光標識を励起しスクリーニングするのに必要なパラメーター（例えば細胞サイズ、蛍光、及び閾値スペクトルについてのゲーティング（gating））を使用して蛍光活性化細胞ソーティング（Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS）によりスクリーニングする。適当なパラメーターは、陰性対照細胞集団を使用して決定できる。抗CD4抗体（適当な代わりの発光波長を有する）を含ませて実験を行った場合は、これらの方法によりHIV-感染リンパ球の定量及び分離の両方が可能となる。あるいは、インビボcDNA合成の後、試験の前に細胞を固定し透過性にすることができる。しかしこれは調製的なものではなく、主として分析的態様である。このように、本発明が有用なcDNA合成のための方法及び組成物を提供することが示された。（a）不均一なmRNA鋳型集団を使用したcDNA合成反応について予測されるような、種々のサイズのポリヌクレオチドフラクションへのデオキシヌクレオチドの導入（図６のレーン５、９、11、及び12、図８のレーン５及び９参照）、（b）反応が逆転写酵素及びプライマーの両方を含めることに依存すること（図６のレーン３及び５、レーン７及び９、図８のレーン３及び５、レーン７及び９を比較せよ）、（c）反応生成物がリボヌクレアーゼＡ処理に抵抗性を有すること（抽出物中に存在するリボソームRNAフラクションが完全に消化される場合でも）（図５及び６においてレーン５及び11、レーン９及び12を比較せよ）、及び（d）生成物の不均一な性質が、ポリアデニル化メッセンジャーRNAの不均一な細胞集団にアニールし開始させる（prime off）ように設計された改変tRNAプライマーを含めることに依存することと、特異的なプライマーを使用したときに単一の優勢なcDNA生成物が得られる反応（〜 1.9kb）の対比（図７及び８、レーン４及び５、及びレーン８及び９を比較せよ）により証拠付けられるように、インビボcDNA合成反応が効率的に進行することが示された。また、いくつかの関連のないタイプの細胞により（試みた全ての真核生物細胞、Sf9（昆虫細胞）、CHO細胞（ハムスター細胞）、ヒーラー細胞（ヒト細胞）において）、インビボcDNA合成反応がうまく起こったことが示された。さらに、（a）S1ヌクレーアーゼによる処理により反応生成物に有意な分解が起こらなかったこと（図10、レーン２及び３、レーン４及び５を比較せよ）、（ b）生成物をリボヌクレアーゼHにより処理し、次いでS1ヌクレアーゼにより処理した場合に反応生成物の識別できる分解は起こらなかったようであること、（c ）リボヌクレアーゼH活性を欠く逆転写酵素を使用した場合に、インビボcDNA合成反応は起こらないこと（インビボcDNA合成反応の成功は、当初のRNA鋳型を消化除去する逆転写酵素の能力にある程度依存しているようである。当初のRNA鋳型はインビトロ及びレトロウィルス複製の両方において第２の鎖の合成のブロックとなる（Tanese，N.，et al.，J．Virol．65:4387-4397（1991））、及び（d ）生成物は慣用のクローニング方法を用いてクローン化可能であることにより証拠付けられるように、インビボcDNA合成反応の生成物は二本鎖ポリヌクレオチド（二本鎖DNAである可能性が最も高い）であることが示された。本明細書中で引用した全ての刊行物及び特許出願については、それぞれ個々の刊行物及び特許出願について引用により本明細書の一部とすることを具体的に個々に明記したものとして、引用により本明細書の一部とする。上記の発明については明確さと理解のために例示及び実施例により詳細に記載したが、本発明の教示によれば、添付の請求の範囲の概念あるいは範囲を逸脱することなくそれらに対して一定の変更及び改変を加え得ることは当業者に明らかであろう。配列表（２）配列番号：１の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：67塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：不明（ii）配列の種類：cDNA （xi）配列；配列番号：１：（３）配列番号：２の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：66塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：不明（ii）配列の種類：cDNA （xi）配列；配列番号：２：（４）配列番号：３の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：68塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：不明（ii）配列の種類：cDNA （xi）配列；配列番号：３：（５）配列番号：４の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：64塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：不明（ii）配列の種類：cDNA （xi）配列；配列番号：４：（６）配列番号：５の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：29塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：不明（ii）配列の種類：cDNA （xi）配列；配列番号：５：（７）配列番号：６の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：59塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：不明（ii）配列の種類：cDNA （xi）配列；配列番号：６：（８）配列番号：７の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：76塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：不明（ii）配列の種類：RNA（genomic）（xi）配列；配列番号：７：（９）配列番号：８の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：76塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：不明（ii）配列の種類：cDNA （xi）配列；配列番号：８：（10）配列番号：９の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：43塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：不明（ii）配列の種類：cDNA （xi）配列；配列番号：９：（11）配列番号：１０の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：43塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：不明（ii）配列の種類：cDNA （xi）配列；配列番号：１０：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4ＢＧ０１Ｎ 33/543 ５４１Ａ 8310−2Ｊ【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．ＲＮＡ鋳型分子の相補的ＤＮＡ複製物を合成する方法であって：（ａ）天然に存在するプライマー結合部位以外の位置でＲＮＡ鋳型分子にインビボでアニールする少なくとも１種のポリヌクレオチド分子を供給し；（ｂ）該ポリヌクレオチド分子をプライマーとして用いてＤＮＡ合成を開始する少なくとも１種の逆転写酵素を供給し；（ｃ）該ポリヌクレオチド分子を生存可能な標的細胞内に逆転写酵素の存在下で導入し；そして（ｄ）該ＲＮＡ鋳型分子に相補的なＤＮＡ分子の合成を可能にする条件下で該標的細胞をインキュベートすることを含む方法。２．ＲＮＡ鋳型分子がメッセンジャーＲＮＡを含む、請求項１の方法。３．ポリヌクレオチド分子がリボ核酸を含む、請求項１の方法。４．リボ核酸が、改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子を含む、請求項３の方法。５．改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子が、メッセンジャーＲＮＡ分子の３’ポリアデニル酸尾部にアニーリングできるものである、請求項４の方法。６．改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子が、その３’末端においてポリリボウリジル酸配列で改変された改変プライマートランスファーＲＮＡ分子を含む、請求項５の方法。７．改変プライマートランスファーＲＮＡ分子が改変マウスｔＲＮＡ^ProＧＧＧ分子を含む請求項６の方法であって、逆転写酵素がMolonyマウス白血病ウィルス逆転写酵素である方法。８．逆転写酵素がMolonyマウス白血病ウィルス逆転写酵素であり、かつ改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子が、その３’末端においてポリリボウリジル酸配列で改変された改変マウスｔＲＮＡ^proＧＧＧ分子である、請求項６の方法。９．改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子が配列番号：７に示した配列を含む、請求項７の方法。 10．ポリヌクレオチド分子がエレクトロポレーションにより生存可能な標的細胞内に導入される、請求項１の方法。 11．逆転写酵素が生存可能な標的細胞内に導入される、請求項１の方法。 12．逆転写酵素が生存可能な標的細胞内で合成される、請求項１の方法。 13．逆転写酵素とポリヌクレオチド分子が別々に生存可能な標的細胞内に導入される、請求項１の方法。 14．逆転写酵素とポリヌクレオチド分子が同時に生存可能な標的細胞内に導入される、請求項１の方法。 15．逆転写酵素及びポリヌクレオチド分子を導入する工程がエレクトロポレーションにより行われる、請求項14の方法。 16．生存可能な標的細胞が真核細胞である、請求項１の方法。 17．天然に存在するプライマー結合部位以外の位置でＲＮＡ鋳型分子にインビボでアニーリングし、そして少なくとも１種の逆転写酵素のためのプライマー分子として機能するポリヌクレオチド分子。 18．ＲＮＡ鋳型分子がメッセンジャーＲＮＡを含む、請求項17のポリヌクレオチド分子。 19．改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子を含む、請求項17 のポリヌクレオチド分子。 20．上記分子がメッセンジャーＲＮＡ分子の３’ポリ（Ａ）尾部にインビボでアニーリングできる、請求項17のポリヌクレオチド分子。 21．請求項20のポリヌクレオチド分子であって、前記ＲＮＡ分子が、その３’末端においてポリリボウリジル酸分子で改変された改変プライマートランスファーＲＮＡ分子を含むポリヌクレオチド分子。 22．上記分子がその３’末端においてポリリボウリジル酸分子で改変された改変マウスｔＲＮＡ^proＧＧＧ分子を含む、請求項21のポリヌクレオチド分子。 23．請求項22のポリヌクレオチド分子であって、前記ＲＮＡ分子が配列番号：７に示した分子を含むポリヌクレオチド分子。 24．ＲＮＡ分子の相補的ＤＮＡ複製物をインビボで合成させるキットであって：（ａ）天然に存在するプライマー結合部位以外の位置でＲＮＡ鋳型分子にインビボでアニールし、そして少なくとも１種の逆転写酵素のためのプライマー分子として機能するポリヌクレオチド分子の製剤；及び（ｂ）前記ポリヌクレオチド分子からインビボで転写を開始しそして該ＲＮＡ鋳型分子の相補的ＤＮＡ複製物を合成する少なくとも１種の逆転写酵素の製剤を含むキット。 25．ＲＮＡ鋳型分子がメッセンジャーＲＮＡである、請求項24のキット。 26．前記ポリヌクレオチド分子が改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子である、請求項24のキット。 27．前記改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子が、その３’ 末端においてポリリボウリジル酸分子で改変された改変マウスｔＲＮＡ^proＧＧＧ分子を含む請求項26のキットであって、逆転写酵素がMo1onyマウス白血病ウィルス逆転写酵素であるキット。 28．改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子が配列番号：７に示した分子を含む、請求項27のキット。 29．キットが少なくとも１種の内生ＲＮＡ鋳型分子の少なくとも１種の相補的ＤＮＡ複製物の宿主細胞内での合成を完了させるのに十分なデオキシヌクレオチドトリホスフェートを更に含む、請求項24のキット。 30．キットが前記宿主細胞内で産生した相補的ＤＮＡ分子を検出できるようにするのに十分な量の少なくとも１種のデオキシヌクレオチドトリホスフェートアナローグを更に含む、請求項24のキット。 31．キットが両製剤を標的細胞内に導入するための試薬を更に含む、請求項24のキット。 32．天然に存在するプライマー結合部位以外の位置でＲＮＡ鋳型分子にインビボでアニーリングし、そして少なくとも１種の逆転写酵素のためのプライマー分子として機能するポリヌクレオチド分子をコードする第１ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子。 33．ＲＮＡ鋳型分子がメッセンジャーＲＮＡである、請求項32のＤＮＡ分子。 34．ポリヌクレオチド分子が改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子である、請求項32のＤＮＡ分子。 35．ＤＮＡ分子がその３’末端においてポリリボウリジル酸分子で改変された改変プライマートランスファーＲＮＡ分子をコードする第１ＤＮＡ配列を含む、請求項34のＤＮＡ分子。 36．ＤＮＡ分子が配列番号：８に示したヌクレオチド配列を含む、請求項35のＤＮＡ分子。 37．第１ＤＮＡ配列の５’末端に機能できるように結合したプロモーター配列を更に含む請求項32のＲＮＡ分子であって、前記プロモーター配列が該第１ＤＮＡ配列の転写を行わせることができるものであるＤＮＡ分子。 38．プロモーター配列が、ＲＮＡポリメラーゼがそこで転写を開始することができるプロモーター配列である、請求項37のＤＮＡ分子。 39．ＤＮＡ分子がその３’末端においてポリリボウリジル酸分子で改変された改変マウスｔＲＮＡ^proＧＧＧ分子をコードする、請求項37のＤＮＡ分子。 40．請求項38のＤＮＡ分子であって、ポリリボウリジル酸分子の３’に直接に接する部位において該ＤＮＡ分子を線状化するのに適する少なくとも１つの制限酵素認識部位を更に含むＤＮＡ分子。 41．天然に存在するプライマー結合部位以外の位置でＲＮＡ鋳型分子にインビボでアニーリングし、そして少なくとも１種の逆転写酵素のためのプライマー分子として機能するポリヌクレオチド分子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡベクター。 42．ＲＮＡ鋳型分子がメッセンジャーＲＮＡである、請求項41の組換えＤＮＡベクター。 43．ポリヌクレオチド分子が改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子である、請求項41の組換えＤＮＡベクター。 44．そのＤＮＡ配列が、その３’末端においてポリリボウリジル酸分子で改変された改変マウスｔＲＮＡ^proＧＧＧ分子をコードする、請求項43の組換えＤＮＡベクター。 45．宿主細胞の形質転換に適する組換えＤＮＡベクターであって、ＲＮＡ鋳型分子にインビボでアニーリングでき、更に逆転写酵素のためのプライマー分子として機能できる改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡベクター。 46．組換えベクターがその３’末端においてポリリボウリジル酸分子で改変された改変プライマートランスファーＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含む、請求項45の組換えＤＮＡベクター。 47．組換えベクターが配列番号：８に示したヌクレオチド配列を含む、請求項45 の組換えＤＮＡベクター。 48．請求項45のベクターを含有する形質転換宿主細胞。 49．宿主細胞が細菌細胞である、請求項48の形質転換宿主細胞。 50．天然に存在するプライマー結合部位以外の位置でＲＮＡ鋳型分子にインビボでアニーリングし、そして該ＲＮＡ鋳型分子に相補的なＤＮＡ分子の合成が起こり得るように、ＤＮＡポリメラーゼ酵素のためのプライマーとして機能する、合成ポリヌクレオチド分子。 51．請求項50の合成ポリヌクレオチド分子であって：（ａ）ＲＮＡ鋳型分子へのインビボでのアニーリング；及び（ｂ）該ＲＮＡ鋳型分子に相補的なＤＮＡ分子の合成が起こり得るように、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素のためのプライマーとして機能することができる合成ポリヌクレオチド分子。 52．少なくとも３’リボヌクレオシド塩基が、リボウリジル塩基で置換されている改変ｔＲＮＡ分子を含む組換えＲＮＡ分子であって、該分子がＲＮＡ鋳型分子上でインビボ逆転写酵素ポリメラーゼ活性を促進する活性を有する組換えＲＮＡ分子。 53．天然に存在するプライマー結合部位以外の位置でＲＮＡ鋳型分子にアニーリングすることにより該鋳型分子上でインビボ逆転写酵素ポリメラーゼ活性を促進する活性を有する組換えＲＮＡ分子。 54．少なくともその部分配列が分かっているＲＮＡ鋳型分子の相補的ＤＮＡ複製物をインビボで製造する方法であって：（ａ）天然に存在するプライマー結合部位以外の位置でＲＮＡ鋳型分子にインビボでアニーリングし、そして少なくとも１種の逆転写酵素のためのプライマーとして機能するポリヌクレオチド分子に機能できるように結合したプロモーター配列をコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子を供給し；（ｂ）該プロモーター配列の末端に対して５’に位置する配列と相同性の第１ヌクレオチドプライマーを供給し；（ｃ）該分かっているＲＮＡ鋳型分子配列の一部分に相補的である５’配列に繋がった工程（ａ）のポリヌクレオチド分子の３’領域に相補的である３’配列を含む第２ヌクレオチドプライマーを供給し；（ｄ）前記ＤＮＡ分子を前記第１及び第２プライマーに接触させ；（ｅ）工程（ｄ）の混合物を、前記クローン化ＤＮＡ分子の増幅を可能にする条件下及び試薬で処理し；（ｆ）工程（ｅ）で産生した少なくとも１種の増幅ＤＮＡ分子を、コードされるＲＮＡ分子の産生を可能にする条件下及び試薬で処理し；（ｇ）工程（ｆ）で産生したＲＮＡ分子を、前記ＲＮＡ分子をプライマーとして用いてＤＮＡ合成を開始する少なくとも１種の逆転写酵素の存在下で、生存可能な標的細胞内に導入し；そして（ｈ）少なくとも１種のＲＮＡ鋳型分子に相補的なＤＮＡ分子が産生される条件下で該標的細胞をインキュベートすることを含む方法。 55．ＲＮＡ鋳型分子がメッセンジャーＲＮＡを含む、請求項54の方法。 56．ポリヌクレオチド分子がリボ核酸を含む、請求項54の方法。 57．リボ核酸が、改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子を含む、請求項56の方法。 58．改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子が、メッセンジャーＲＮＡ分子の３’ポリアデニル酸尾部にアニーリングできるものである、請求項57の方法。 59．改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子が、その３’末端においてポリリボウリジル酸配列で改変された改変プライマートランスファーＲＮＡ分子を含む、請求項58の方法。 60．改変プライマートランスファーＲＮＡ分子が改変マウスｔＲＮＡ^proＧＧＧ分子を含む請求項59の方法であって、逆転写酵素がMolonyマウス白血病ウィルス逆転写酵素である方法。 61．逆転写酵素がMolonyマウス白血病ウィルス逆転写酵素であり、かつ改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子が、その３’末端においてポリリボウリジル酸配列で改変された改変マウスｔＲＮＡ^proＧＧＧ分子である、請求項60の方法。 62．改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子が配列番号：７に示した配列を含む、請求項61の方法。 63．改変逆転写酵素同族プライマートランスファーＲＮＡ分子がエレクトロポレーションにより生存可能な標的細胞内に導入される、請求項54の方法。 64．逆転写酵素が生存可能な標的細胞内に導入される、請求項54の方法。 65．逆転写酵素が生存可能な標的細胞内で合成される、請求項54 の方法。 66．逆転写酵素とポリヌクレオチド分子が別々に生存可能な標的細胞内に導入される、請求項54の方法。 67．逆転写酵素とポリヌクレオチド分子が同時に生存可能な標的細胞内に導入される、請求項54の方法。 68．逆転写酵素及びポリヌクレオチド分子を導入する工程がエレクトロポレーションにより行われる、請求項67の方法。 69．生存可能な標的細胞が真核細胞である、請求項54の方法。