CN109722468A - 检测bcma嵌合抗原受体基因的pcr引物组合及应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种检测BCMA嵌合抗原受体基因的PCR引物组合及应用。所述引物组合包括特异检测BCMA嵌合抗原受体基因的引物对，其序列如SEQ ID No.1—2所示。本申请提供的引物对具有特异性好、灵敏度高和准确性高的优点，可广泛应用于BCMA嵌合抗原受体基因的定性和定量检测，在BCMA CAR‑T细胞的质量控制、临床病人使用BCMA CAR‑T治疗过程中血液中BCMA CAR‑T的伴随诊断和检测等T细胞免疫疗法领域具有重要应用价值。

Description

检测BCMA嵌合抗原受体基因的PCR引物组合及应用

技术领域

本发明涉及T细胞免疫疗法领域，具体涉及一种检测BCMA嵌合抗原受体基因的PCR引物组合及应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)细胞，是一种嵌合抗原受体的T细胞，通过基因修饰使T淋巴细胞表达特定的CAR，CAR主要由细胞膜外抗原结合区和细胞内信号转导区通过铰链区及跨膜区构成。

B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)，又称CD269，是由184个氨基酸残基组成的Ⅲ型跨膜蛋白，它属于TNF受体家族成员,与其配体B细胞激活因子BAFF(Bcell activating factor belonging to the TNF family)或增殖诱导配体APRIL(aproliferation-inducing ligand)结合可刺激B细胞增生。BCMA的胞内区含80个氨基酸残基，胞外区序列很短，只有一个糖类识别结构域为B细胞表面分子。BCMA属于缺少信号肽的I型跨膜信号蛋白，是肿瘤坏死因子受体家族(TNFR)一员，它可分别与B细胞激活因子BAFF或增殖诱导配体(APRIL)两种配体相结合。在正常组织中，BCMA表达于成熟B细胞和浆细胞表面，BCMA基因剔除小鼠免疫系统表现正常，有正常的脾结构，B淋巴细胞的发育正常，但浆细胞数量明显减少，证明BCMA在维持浆细胞的存活中起了重要的作用，其机制主要包括BCMA与BAFF蛋白结合，并上调抗凋亡基因Bcl-2，Mcl-1及Bclw等，维持细胞生长。同样地，该机制也在骨髓瘤细胞中发挥了功能，对骨髓瘤细胞的恶性增生起了重要的促进作用。研究表明，BCMA普遍表达于多发性骨髓瘤细胞系，在多发性骨髓瘤患者中的检测也得到了一致性的结果。Kochenderfer等在已有报道的基础上，又联合应用Q-PCR、Flow Cytometry和免疫组化方法深入研究了BCMA的表达特征，确认BCMA在成熟B细胞、浆细胞之外的正常人体组织无表达，且在CD34+造血细胞中也无表达。BCMA作为CAR-T细胞的靶点之一用于多发性骨髓瘤的细胞免疫治疗已经用于多个临床实验。

常见的对于CAR-T(BCMA)细胞进行检测的方法为检测CAR蛋白阳性T细胞。对于检测CAR蛋白阳性T细胞而言，现有的检测试剂包括抗FITC-Labeled Human BCMA/TNFRSF17Protein,Fc Tag等。然而，现有的检测试剂仍具有一些缺点，检测结果难以令人满意。检测试剂价格较高，灵敏度不高。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种检测BCMA嵌合抗原受体基因的PCR引物组合及其应用，所述引物组合且具有特异性好和灵敏度高的优点，可广泛应用于临床离体细胞中BCMA嵌合抗原受体基因的检测，在T细胞免疫疗法领域具有重要应用价值。

一方面，本发明提供了一种用于检测BCMA(B细胞成熟抗原)嵌合抗原受体基因的PCR引物组合，所述引物组合包括特异检测BCMA嵌合抗原受体基因的引物对；

所述特异检测BCMA嵌合抗原受体基因的引物对的上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示；该引物对的PCR扩增产物序列或靶序列如SEQ ID No.7的第3位至第177位所示。

上述引物组合可用于基于PCR反应原理的检测中，其中，在一种实施方式中，为了进行相对定量检测，所述引物组合还包括特异检测内参基因Actin的引物对；

优选的，所述特异检测内参基因的引物对的上游引物如SEQ ID No.4所示，下游引物如SEQ ID No.5所示，该引物对的PCR扩增产物序列或靶序列如SEQ ID No.8的第3位至第151位所示。

在另一种实施方式中，为了进行如实时荧光定量PCR或数字PCR等需要通过检测信号大小的方法检测靶基因数量时，所述引物组合还包括特异检测BCMA嵌合抗原受体基因的探针；优选的，所述特异检测BCMA嵌合抗原受体基因的探针的序列为SEQ ID No.3或其互补序列；

和/或，所述引物组合还包括特异检测内参基因Actin的探针；优选的，所述特异检测内参基因Actin的探针的序列为SEQ ID No.6或其互补序列；

优选的，所述探针为Taqman探针；

更优选的，所述探针的5’端使用报告荧光基团FAM、HEX、Texas Red或CY5进行修饰，所述探针的3’端使用淬灭基团BHQ1、BHQ2、BHQ3、或TAMRA进行修饰。

另一方面，本发明还提供了所述引物组合在检测BCMA嵌合抗原受体基因中的应用，或者在制备用于检测BCMA嵌合抗原受体基因的试剂、组合物或试剂盒中的应用；在一个实施方式中，所述引物组合物可以检测细胞中BCMA嵌合抗原受体是否表达，在其他的实施方式中，所述引物组合还可以检测细胞中BCMA嵌合抗原受体基因的表达量或拷贝数。

另一方面，本发明还提供了所述的引物组合在检测表达BCMA嵌合抗原受体的细胞中的应用，或者在制备检测表达BCMA嵌合抗原受体的细胞的试剂、组合物或试剂盒中的应用；所述表达BCMA嵌合抗原受体的细胞为靶向BCMA的CAR-T细胞。

另一方面，本发明的引物组合还可以用于细胞免疫疗法中。

在一个实施方式中，本发明的引物组合可以用于基于BCMA靶点的细胞免疫疗法中，可以制备成为相关的产品，比如，试剂、组合物或试剂盒。在该实施方式中，所述产品可以检测表达BCMA嵌合抗原受体的细胞或者筛选BCMA嵌合抗原受体阳性的细胞，从而便于细胞免疫疗法中随时检测CAR-T细胞是否正常表达及表达量，为细胞免疫疗法的治疗方法提供指导；优选的，所述细胞为靶向BCMA的CAR-T细胞。在优选的实施方式中，所述细胞免疫疗法为CAR-T细胞免疫疗法，所述CAR-T细胞免疫疗法包括抗-BCMA的嵌合抗原受体。

另一方面，本发明还提供了一种基于靶点BCMA的CAR-T细胞免疫治疗方法，所述方法包括检测BCMA嵌合抗原受体阳性细胞的步骤，所述检测BCMA嵌合抗原受体阳性细胞为利用本发明的引物组合检测BCMA嵌合抗原受体阳性细胞，优选的，检测BCMA嵌合抗原受体阳性细胞中BCMA嵌合抗原受体基因的表达量或拷贝数。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测BCMA嵌合抗原受体的荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包括以上任一所述引物组合；优选的，所述试剂盒中还包括用于绘制标准曲线的系列标准品溶液、二甲基亚砜、含dNTP或含Mg²⁺的PCR反应预混液和DNA聚合酶。

本发明还提供了一种检测离体细胞中BCMA嵌合抗原受体拷贝数的方法，包括如下步骤：

1)提取离体细胞中的DNA或RNA，获得DNA或所述RNA的cDNA模板；

2)使用上述任一所述的引物组合或上述任一所述试剂盒，以步骤1)获得的所述DNA或cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，获得BCMA嵌合抗原受体的CT值；

3)根据BCMA嵌合抗原受体的CT值计算所述模板所在反应体系中BCMA嵌合抗原受体的起始拷贝数，并进一步计算得出离体细胞中BCMA嵌合抗原受体拷贝数。

本发明的有益效果如下：

本发明所述引物组合用于实时荧光定量PCR使用，可以快速准确的检测样本中的BCMA嵌合抗原受体基因拷贝数和内参基因(Actin)拷贝数，根据两种基因拷贝数快速的计算出细胞中BCMA嵌合抗原受体的平均拷贝数，所述引物组合还具有特异性好、灵敏度高和准确性高的优点，可广泛应用于BCMA嵌合抗原受体基因的定性和定量检测，在BCMA CAR-T细胞的质量控制、含有BCMA嵌合抗原受体基因的质粒等相关产品检测、临床离体细胞、全血中BCMA嵌合抗原受体基因拷贝数检测等T细胞免疫疗法领域具有重要应用价值。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR检测BCMA嵌合抗原受体标准品的扩增结果，从左到右的曲线表示不同标准品含有BCMA嵌合抗原受体基因质粒的浓度分别为：5×10⁶copies/μl、5×10⁵copies/μl、5×10⁴copies/μl、5×10³copies/μl、5×10²copies/μl、5×10copies/μl。

图2为实时荧光定量PCR检测内参基因(Actin)标准曲线的扩增结果，从左到右的曲线表示不同标准品含有内参基因(Actin)质粒的不同浓度，5×10⁶copies/μl、5×10⁵copies/μl、5×10⁴copies/μl、5×10³copies/μl、5×10²copies/μl、5×10copies/μl。

图3为实时荧光定量PCR检测BCMA嵌合抗原受体的标准曲线。

图4为实时荧光定量PCR检测Actin的标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、实时荧光定量PCR检测细胞中BCMA嵌合抗原受体基因的平均拷贝数

1、荧光定量PCR引物及探针设计

根据制作CAR-T细胞使用的BCMA嵌合抗原受体基因序列，同时检索内参基因Actin序列，经过生物信息学比对分析，各找到一段高度保守、特异的区域，序列如下：

BCMA嵌合抗原受体基因特异性序列(5’-3’)：

GGCTCCCAAACTCCTCATCTATTATGATGATCTGCTGCCCTCAGGGGTCTCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTTGGGTGTTCGGCG(SEQ ID No.7)；

内参基因Actin特异性序列(5’-3’)：

GCACTCTTCCAGCCTTCCTTCCTGGGCATGGAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTACCTTCAACTCCATCATGAAGTGTGACGTGGACATCCGCAAAGACCTGTACGCCAACACAGTGCTGTCTGGCGGCACCACCATGTACCCTGGCATTGCC(SEQ ID No.8)；

根据上述基因的特异性序列分别设计实时荧光定量PCR扩增特异引物和结合探针，探针的两端分别采用报告荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1或TAMRA标记。如表1所示。

表1、引物及探针设计

2、样品DNA的提取

1)取1×10⁶细胞样品1ml，加入1μl，同时检索的核酸酶，37℃孵育30min以消化样品所在培养基中可能存在的DNA基因组或者质粒；

1000rpm离心5min，弃上清，加入1ml PBS清洗，然后离心弃上清，重复此过程两遍。

2)向清洗后的样品中加入200μl PBS吹打混匀，然后加入20μl的蛋白酶K和RNaseA混匀，孵育2min。

3)使用DNA提取试剂盒(购自Invitrogen公司)进行DNA提取，获得样品DNA溶液，并用微量紫外分光光度计(NanoPhotometer NP80touch，德国IMPLEN公司)检测溶液中的DNA浓度。

3、标准品质粒的稀释

使用微量紫外分光光度计检测含有BCMA嵌合抗原受体基因的质粒A和含有内参基因(Actin)的质粒B的浓度，通过如下公式计算拷贝数：

拷贝数(copy/μl)＝(6.02×10²³copies/mol)×(浓度g/μl)/(MW g/mol)；

其中，含有BCMA嵌合抗原受体基因的质粒A的平均分子量MW为6060120g/mol，含有内参基因(Actin)基因的质粒B的平均分子量MW为5762817g/mol。

使用RNase-free Water分别稀释质粒A和质粒B至1×10¹⁰copies/μl，并逐级稀释成5×10⁹copies/μl、5×10⁸copies/μl、5×10⁷copies/μl、5×10⁶copies/μl、5×10⁵copies/μl、5×10⁴copies/μl、5×10³copies/μl、5×10²copies/μl、5×10¹copies/μl。

4、实时荧光定量RCR检测

反应体系：以步骤2提取的样品DNA溶液或各浓度的标准品质粒溶液为模板，使用表1中对应的引物和探针，二甲基亚砜(购自宝日医生物技术有限公司)，Premix Ex Taq(probe qPCR)(2×)(购自宝日医生物技术有限公司)配制实时荧光定量PCR反应体系(20μl)，其中，100μmol/L的上游引物和100μmol/L的下游引物各0.5μl(即反应体系中上游引物和下游引物的浓度分别为2.5μmol/L)，100μmol/L的探针0.8μl(即反应体系中探针浓度为4μmol/L)，Premix Ex Taq(probe qPCR)(2×)反应液10μl，二甲基亚砜0.6μl，样品DNA模板10ng或者各浓度的标准品质粒溶液2μl，加RNase-free Water补足20μl体系。

实时荧光定量RCR：将反应体系装到八连管中，混匀，放置在PharmaceuticalAnalytics QuantStudio^TM 3Real-Time PCR System(Thermo Fisher scientific公司)进行扩增反应。反应程序为95℃，45s；(95℃，5s；60℃，34s)40个循环；扩增过程中在60℃时收集荧光信号，选择收集荧光信号通道为FAM。设置ddH₂O做阴性对照。每个样品每种反应设三个重复。

5、双标准曲线绘制

根据步骤4的检测，得出各浓度标准品质粒的CT值，如图1和图2所示，以各浓度标准品质粒拷贝数的对数值为横坐标(X)，以各重复的平均CT值为纵坐标(Y)，建立标准曲线，结果如图3和图4所示。

结果显示，阴性对照均无明显的扩增曲线，按照上述的反应条件进行扩增，BCMA嵌合抗原受体基因和内参基因的扩增标准曲线，相关系数R²＞0.99，曲线具有良好的线性关系；且扩增效率均在90％以上。

6、样品检测结果

根据步骤4的检测，得出样品的CT值，代入步骤5中对应的标准曲线中，得出样品中目的基因和内参基因的起始拷贝数量，结果如表2所示。

表2、实时荧光定量RCR检测结果

7、根据基因拷贝数计算BCMA嵌合抗原受体基因拷贝数/细胞如下：

BCMA嵌合抗原受体基因拷贝数/细胞

＝(目的基因拷贝数×每个细胞中内参基因拷贝数)/内参基因拷贝数

＝(2233+1959+1896)×2/(32767+28683+32888)

≈0.13拷贝数/细胞

实施例2、实时荧光定量PCR检测BCMA嵌合抗原受体基因拷贝数的性能

一、特异性检测

按照实施例1的方法，使用表1所示的两组引物和探针，分别对表3所示DNA样本进行扩增，结果如表3所示。结果显示，表1所示的各引物-探针仅对含BCMA嵌合抗原受体基因的模板有特异性扩增，表明所设计的引物及探针具有良好的特异性。

表3、特异性检测结果

二、灵敏度检测

使用实施例1表1中BCMA嵌合抗原受体基因的引物和探针，分别以实施例1步骤3中标准品质粒A(含BCMA嵌合抗原受体基因)的不同浓度稀释液(浓度分别为50copies/μL、40copies/μL、30copies/μL、25copies/μL、20copies/μL、15copies/μL、10copies/μL、5copies/μL)作为模板，按照实施例1步骤4的方法进行荧光定量PCR检测；同时设对比试验(表4)：模板相同，引物和探针分别为BCMA-CK1、BCMA-CK2和BCMA-CK3，对比不同引物和探针对BCMA嵌合抗原受体基因的检测灵敏度，结果如表5所示。

使用实施例1表1中Actin的引物和探针，分别以实施例1步骤3中标准品质粒B(含Actin基因)的不同浓度稀释液(浓度分别为50copies/μL、40copies/μL、30copies/μL、25copies/μL、20copies/μL、15copies/μL、10copies/μL、5copies/μL)作为模板，按照实施例1步骤4的方法进行荧光定量PCR检测；同时对检测Actin的引物和探针设对比试验，引物和探针如表4所示，分别为Actin-CK1、Actin-CK2、Actin-CK3)，对比不同引物和探针对Actin的检测灵敏度。

表4、对比引物探针序列

表5、检测结果

实验结果显示，实施例1中表1中BCMA嵌合抗原受体基因和内参基因Actin的引物和探针在检测低拷贝样本(10copies，即标准品溶液浓度为5copies/μL)时，阳性检测结果明显高于对照，即实施例1中表1中的引物和探针的灵敏度为5copies/μL。

实施例3、实时荧光定量PCR检测不同样本

使用实施例1中表1的引物和探针检测不同的样本，并将扩增结果进行凝胶电泳分离并测序，将测序结果进行检索，结果表6所示。

表6、检测不同样本的结果

表6的结果表明，实施例1表1中的引物和探针能准确的检测到BCMA嵌合抗原受体基因的序列。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海邦耀生物科技有限公司

<120> 检测BCMA嵌合抗原受体基因的PCR引物组合及应用

<130> JH-SHBY-PI-20180288

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctcccaaact cctcatctat ta 22

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgaacaccc aaccatt 17

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggctccaag tctggcacct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actcttccag ccttccttcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caatgccagg gtacatggtg 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgccgccaga cagcactgtg t 21

<210> 7

<211> 179

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggctcccaaa ctcctcatct attatgatga tctgctgccc tcaggggtct ctgaccgatt 60

ctctggctcc aagtctggca cctcagcctc cctggccatc agtgggctcc agtctgagga 120

tgaggctgat tattactgtg cagcatggga tgacagcctg aatggttggg tgttcggcg 179

<210> 8

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcactcttcc agccttcctt cctgggcatg gagtcctgtg gcatccacga aactaccttc 60

aactccatca tgaagtgtga cgtggacatc cgcaaagacc tgtacgccaa cacagtgctg 120

tctggcggca ccaccatgta ccctggcatt gcc 153

Claims (10)

1.一种用于检测BCMA(B细胞成熟抗原)嵌合抗原受体基因的PCR的引物组合，其特征在于：所述引物组合包括特异检测BCMA嵌合抗原受体基因的引物对；

所述特异检测BCMA嵌合抗原受体基因的引物对的上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于：所述引物组合还包括特异检测内参基因Actin的引物对；

更优选的，所述特异检测内参基因的引物对的上游引物如SEQ ID No.4所示，下游引物如SEQ ID No.5所示。

3.如权利要求1或2所述的引物组合，其特征在于：所述引物组合还包括特异检测BCMA嵌合抗原受体基因的探针；优选的，所述特异检测BCMA嵌合抗原受体基因的探针的序列为SEQ ID No.3或其互补序列；

和/或，所述引物组合还包括特异检测内参基因Actin的探针；优选的，所述特异检测内参基因Actin的探针的序列为SEQ ID No.6或其互补序列；

优选的，所述探针为Taqman探针；

更优选的，所述探针的5’端使用报告荧光基团FAM、HEX、Texas Red或CY5进行修饰，所述探针的3’端使用淬灭基团BHQ1、BHQ2、BHQ3、或TAMRA进行修饰。

4.权利要求1—3中任一所述的引物组合在检测BCMA嵌合抗原受体基因中的应用，优选的，所述应用为检测细胞中BCMA嵌合抗原受体基因的表达量或拷贝数。

5.权利要求1—3中任一所述的引物组合在检测表达BCMA嵌合抗原受体的细胞中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述表达BCMA嵌合抗原受体的细胞为靶向BCMA的CAR-T细胞。

7.权利要求1—3中任一所述的引物组合在制备基于BCMA靶点的细胞免疫疗法的产品中的用途，其特征在于：所述产品用于检测细胞中BCMA嵌合抗原受体的表达量或筛选BCMA嵌合抗原受体阳性的细胞。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述细胞免疫疗法为CAR-T细胞免疫疗法。

9.一种用于检测BCMA嵌合抗原受体的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1—3中任一所述引物组合；优选的，所述试剂盒中还包括用于绘制标准曲线的系列标准品溶液、二甲基亚砜、含dNTP或含Mg²⁺的PCR反应预混液和DNA聚合酶。

10.一种检测离体细胞中BCMA嵌合抗原受体拷贝数的方法，包括如下步骤：

1)提取离体细胞中的DNA或RNA，获得DNA或所述RNA的cDNA；

2)使用权利要求1—3中任一所述的引物组合或权利要求9所述试剂盒，以步骤1)获得的所述DNA或cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，获得BCMA嵌合抗原受体的CT值；

3)根据BCMA嵌合抗原受体的CT值计算所述模板所在反应体系中BCMA嵌合抗原受体的起始拷贝数，并进一步计算得出离体细胞中BCMA嵌合抗原受体拷贝数。