CN108285920A

CN108285920A - 一种体内检测cart细胞表达的技术及其用途

Info

Publication number: CN108285920A
Application number: CN201710012270.8A
Authority: CN
Inventors: 黄飞; 金涛; 王海鹰; 何凤; 史子啸
Original assignee: Shanghai Hrain Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Hrain Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-01-09
Filing date: 2017-01-09
Publication date: 2018-07-17

Abstract

本发明公开了一种CART细胞体内表达效率的检测方法，包括如下步骤：将表达CD19CAR的质粒加入未转染PBMC中提取基因组作为标准品一、将已知表达效率的CART细胞加入未转染PBMC中提取基因组作为标准品二、将梯度稀释PBMC细胞基因组，测内参CDKN1A作为标准品三，三种标准品联合应用做标准曲线，待呈线性关系后，运用荧光定量PCR技术检测CART细胞整合到全基因组DNA中的病毒拷贝数和CART细胞的占PBMC中的百分含量。本发明可计算CART细胞的体内表达情况，计算方法简便，且精确度高，便于实际操作。

Description

一种体内检测CART细胞表达的技术及其用途

技术领域

本发明属于嵌合抗原受体领域，具体用荧光定量PCR和流式细胞仪方法检测体内CART细胞表达。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CART)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CART细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CART细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。

嵌合抗原受体(CAR)是CART的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。

随着嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CART)技术的不断发展，目前CART主要可划分为四代。

第一代CART细胞由胞外结合区-单链抗体(single chain fragment variable，scFV)、跨膜区(transmembrane region，TM)和胞内信号区-免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine based activation motif，ITAM)组成，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD3ζ。第一代CAR虽然能够看到一些特异性的细胞毒性，但2006年对其进行临床试验总结的时候却发现疗效差强人意。究其原因是因为第一代CART细胞在病人体内很快就会耗竭，其持久性很差，以至于CART细胞还没有来得及接触到大量的肿瘤细胞时就已经凋亡了该种CART细胞可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，但其在体内的存活期较短不能激发持久的抗肿瘤效应〔，Cancer Res.2007，67(22)：11029-11036〕。

第二代CART细胞优化CAR设计中T细胞活化信号区仍然是研究的热点。T细胞的完全活化有赖于双信号和细胞因子的作用。其中第一信号为特异性信号，由TCR识别抗原递呈细胞表面的抗原肽-MHC复合物所启动；第二信号为协同刺激信号。早在1998年就出现了第二代CAR(J Immunol.1998；161(6)：2791-7)。第2代CAR在胞内信号肽区添加了一个协同刺激分子，即把协同刺激信号组装到CAR里面，能够更好的为CART细胞提供活化信号，这样CAR识别肿瘤细胞后能够同时活化协同刺激分子和胞内信号，实现双重活化，能明显提高T细胞增殖分泌能力和抗肿瘤效应。第一个被详细研究的T细胞共刺激信号受体是CD28，它能够与靶细胞表面的B7家族成员结合。CD28的共刺激能够促进T细胞的增殖，IL-2的合成和表达以及增强T细胞抵抗凋亡的能力。随后又出现了CD134(OX40)和41BB(4-1BB)等共刺激分子，以提高T细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T细胞应答，延长T细胞存活时间等。这样的第二代CAR在随后的临床试验中产生了意想不到的效果，从2010年起基于第二代CAR的临床报道屡次引发震动，特别是对于复发性、难治性的ALL病人，其完全缓解率高达90％以上。

第三代CAR信号肽区整合2个以上的协同刺激分子，可使T细胞持续活化增殖，细胞因子持续分泌，T细胞杀伤肿瘤细胞的能力更加显著，即新一代的CAR可获得更强的抗肿瘤应答(Mol Ther.2005，12(5)：933-941)。最典型的就是U Pen Carl June在CD28刺激因子的作用下又加了一个41BB的刺激因子。

第四代的CART细胞则加入了细胞因子或共刺激配体，例如四代CAR可以产生IL-12，其能够调节免疫微环境-增加T细胞的激活，同时激活固有免疫细胞使其发挥作用来清除靶抗原阴性的癌细胞，从而达到双向调节的作用〔Expert Opin Biol Ther.2015；15(8)：1145-54〕。

当CART细胞输注体内之后，CAR基因能否表达、CAR表达效率的高低、CART细胞的活性和纯度以及CART细胞在体内存活的长短都会直接影响CART细胞对癌细胞的清除效率。临床研究证明，CART细胞回输后在患者外周血中的增殖能力和其在外周血存续的时间与疗效具有很强的相关性(Science Translational Medicine.2015；7:303)。

目前，主流的临床试验采用单一的实时荧光定量PCR的方法检测外周血基因组中的CAR含量，进而间接估算CART细胞数量。但是，CAR在基因组中的拷贝数与载体特征、病毒滴度、细胞状态等都有关系，会进一步导致通过检测外周血基因组中的CAR含量估算CART细胞的误差。因此，准确、快速的检测CAR含量对于该疗法的实施、监测以及预后具有关键意义。

本发明的亮点是既利用表达CAR的质粒做标准品1、同时也利用流式检测出的已知表达量的CART细胞做为标准品2、同时也引入了内参标准品3；3种标准品的同时引入，增加了测量的准确度。只有在CAR的质粒做标准品与CART细胞做为标准品做梯度稀释后呈现线性关系，才可用此标准曲线。我们根据血液中用real-time PCR检测CAR的拷贝数来计算CART细胞此时在PBMC中的百分含量，以此来推断CART细胞输注后在各个时间点的表达量和在体内存续的时间。

发明内容

本发明采用的技术方案是：运用real-time PCR方法和流式两种实验方法联合检测体内CART细胞的表达情况，本发明运用了三种标准品，提高了检测的准确性。

本发明所述CD19-scFv氨基酸序列如序列表中SEQUNCE ID NO.1所示。

本发明所述CD19-scFv核酸序列如序列表中SEQUNCE ID NO.2所示。

本发明所述嵌合抗原受体以人的CD8α铰链区、人的CD28α跨膜区、人的CD28胞内的共刺激元件和人的CD3ζ胞内区串联成的结构为信号转导结构域，其氨基酸序列如SEQUNCEID NO.3所示。

本发明所述嵌合抗原受体以人的CD8α铰链区、人的CD28α跨膜区、人的CD28胞内的共刺激元件和人的CD3ζ胞内区串联成的结构为信号转导结构域，其核酸序列如SEQUNCE IDNO.4所示。

本发明的有益效果是：本发明采用CD19scFv基因序列，并从NCBI GenBank数据库中搜索到人的CD8α铰链区、人的CD28跨膜区、人的CD28胞内区和人的CD3ζ胞内区基因序列信息，全基因合成嵌合抗原受体CD19scFv-CD8H&CD28TM-CD28-CD3ζ的基因片段即编码CAR的核酸序列。本发明的亮点是既利用表达CAR的质粒做标准品1、同时也利用流式检测出的已知表达量的CART细胞做为标准品2、同时也引进了内参标准品3；3种标准品的同时引入，增加了测量的准确度。只有在CAR质粒做标准品与CART细胞做为标准品做梯度稀释后呈现线性关系后，才可用此标准曲线。本发明专利所制的标准曲线R²值为0.998,其中拷贝数的检测下限为107，CART细胞中CAR阳性的检测下限为0.06％。

附图说明

图1流式检测CD19CART细胞中CAR感染率情况图

图2 Real-time PCR方法检测梯度稀释已知CAR阳性浓度的CART细胞的拷贝数量直方图

图3 CART细胞拷贝数与CAR阳性感染率的线性图

图4 CART细胞样品拷贝数和CAR阳性感染率检测下限表

具体实施方式

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

实施例1外周血单核细胞(PBMC)基因组DNA提取

1.处理材料

细胞应先处理为细胞悬液，然后10,000rpm(～11,200×g)离心1min，倒尽上清，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮；

2.加入20μl Proteinase K(天根)溶液，混匀。

3.加入200μl缓冲液GB(天根)，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4.加人200μl无水乙醇(国药集团)，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)(天根)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6.向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(天根)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7.向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)(天根)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8.重复操作步骤7。

9.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

11.分光光度计测定提取的基因组DNA的浓度和纯度(OD260/OD280比值在1.8左右)。

实施例2质粒和细胞标准品制备

1.提取CD19CAR-CD28质粒，并用分光光度计测定提取的质粒DNA的浓度和纯度(OD260/OD280比值在1.8左右)。

2.根据质粒拷贝数计算公式：(6.02×10²³)×(ng/ul×10^-9)/(DNA length×660)＝copies/ul.计算出相应质量的质粒DNA中有多少拷贝数。

标准品1：CD19CAR质粒从1X10⁶到320copies梯度稀释6个点，分别加入到40ngPBMC细胞基因组DNA中，QPCR检测CD19CAR。

组别

1

2

3

4

5

6

质粒

1.00E+06

2.00E+05

4.00E+04

8.00E+03

1.60E+03

3.20E+02

DNA

40ng

标准品2：已经流式测定CAR表达率的CD19CART细胞，1:4梯度稀释到未转染PBMC细胞中，提取基因组DNA，取40ng DNA QPCR检测CD19CAR(图1)。

标准品3：梯度稀释PBMC细胞基因组，测内参CDKN1A。

样品：外周血提基因组，测CD19CAR和CDKN1A。

实施例3 QPCR检测

1.引物设计：设计CD19CAR和内参校准基因CDKN1A QPCR引物如下：

类型	名称	序列
			上游引物序列	CD19CAR	GGGTTCCAAGCCGATTCAGT
下游引物序列	CD19CAR	CAAGTTGCTAATGGTCAGGGAATA
			上游引物序列	CDKN1A	GAAAGCTGACTGCCCCTATTTG
下游引物序列	CDKN1A	GAGAGGAAGTGCTGGGAACAAT

2.按下列组份配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)：

试剂	使用量
		PCR上游引物(10μM)	0.75μl
PCR下游引物(10μM)	0.75μl
		ROX Reference Dye II(50×)	0.25μl
DNA模板	2.0μl
		dH2O(灭菌蒸馏水)	21.175μl
Total	25.0μl

3.上机程序：

7500定量PCR仪绝对定量(ABI)实验扩增条件如下表

实施例4定量结果分析

1.根据3个标准品CT值，制作标准曲线，计算斜率、R²数值、扩增效率等，判断标准曲线是否在可信区间，并得出检测下限拷贝数。

2.根据标准品和样品内参校准基因CDKN1A CT值计算出校正系数CF＝检测到的ng/加入的ng。

3.每ug样品基因组DNA中含有的CD19CAR阳性拷贝数＝根据标准曲线计算出的拷贝数/加入的DNA(ng)X CF X 1000ng。

4.检测CART细胞中CAR的拷贝数，和流式检测已知的CART感染率分析线性相关性，确定拷贝数和感染率的关系。

本实施例结果显示在图2、图3，CD19CAR的拷贝数和CART细胞中CAR阳性细胞含量呈现线性关系，R²值为0.998。

根据公式计算样品拷贝数和感染率，确定检测下限。本实施例结果显示在图4，其中拷贝数的检测下限为107，CART细胞中CAR阳性的检测下限为0.06％。

序列表

<110> 上海恒润达生生物科技有限公司

<120> 一种体内检测CART细胞表达的技术及其用途

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 263

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys

210 215 220

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

260

<210> 2

<211> 789

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctgacattc agatgactca gaccacaagc agcctcagtg cgagcctggg ggacagggtg 120

actatcagct gccgggccag ccaggacatt tccaagtacc tgaattggta ccagcagaag 180

cccgatggta ctgtgaaact cctgatatat catacttcta ggctccattc cggggttcca 240

agccgattca gtggctccgg ttccggtaca gattattccc tgaccattag caacttggaa 300

caggaggaca ttgcaacgta tttctgtcag caaggcaaca cattgcccta cacattcggg 360

ggcgggacta aactcgaaat aactggcggc gggggttctg gtggcggcgg cagcggcggt 420

ggaggatcag aagtgaagct gcaggaaagt ggccccgggc tggtagcccc aagtcagtcc 480

ctgagtgtaa cctgtacagt gagtggagtg tctcttcctg actacggggt aagttggatt 540

cggcaacctc cacgcaaggg cctggagtgg ctcggcgtga tttggggatc tgagacaact 600

tactacaatt ccgccctgaa gagcaggctg accatcatta aggacaatag caagtcacag 660

gtgtttctga agatgaactc actgcagacc gacgacaccg ccatctatta ctgcgccaaa 720

cattattatt atggcgggag ttatgctatg gactactggg gccagggcac tagcgtcacc 780

gtcagcagt 789

<210> 3

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Phe

35 40 45

Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu

50 55 60

Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg

65 70 75 80

Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro

85 90 95

Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala

100 105 110

Tyr Arg Ser Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

115 120 125

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

130 135 140

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

145 150 155 160

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

165 170 175

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

180 185 190

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

210 215 220

Pro Arg

225

<210> 3

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actacaactc cagcacccag accccctaca cctgctccaa ctatcgcaag tcagcccctg 60

tcactgcgcc ctgaagcctg tcgccctgct gccgggggag ctgtgcatac tcggggactg 120

gactttgcct gtgatatcta cttctgggtg ctggtcgtgg tcggaggggt gctggcctgt 180

tatagcctgc tggtgactgt cgccttcatt atcttctggg tgcggagcaa gaggtctcgc 240

ggtgggcatt ccgactacat gaacatgacc cctagaaggc ctggcccaac cagaaagcac 300

taccagccat acgcccctcc cagagatttc gccgcttatc gaagcgtgaa gttctcccga 360

agcgcagatg ccccagccta tcagcaggga cagaatcagc tgtacaacga gctgaacctg 420

ggaagacggg aggaatacga tgtgctggac aaaaggcggg gcagagatcc tgagatgggc 480

ggcaaaccaa gacggaagaa cccccaggaa ggtctgtata atgagctgca gaaagacaag 540

atggctgagg cctactcaga aatcgggatg aagggcgaaa gaaggagagg aaaaggccac 600

gacggactgt accaggggct gagtacagca acaaaagaca cctatgacgc tctgcacatg 660

caggctctgc caccaaga 678

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物

<400> 5

gggttccaag ccgattcagt 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物

<400> 6

caagttgcta atggtcaggg aata 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物

<400> 7

gaaagctgac tgcccctatt tg 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物

<400> 8

gagaggaagt gctgggaaca at

Claims

1.一种用于检测CART转导效率的引物，其特征在于：包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为：GGGTTCCAAGCCGATTCAGT，即SEQ ID NO：5；所述下游引物的序列为：CAAGTTGCTAATGGTCAGGGAATA，即SEQ ID NO：6。

2.一种与权利要求1所述的引物配合内参序列，其特征在于：包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为：GAAAGCTGACTGCCCCTATTTG，即SEQ ID NO：7；所述下游引物的序列为：GAGAGGAAGTGCTGGGAACAAT，即SEQ ID NO：8。

3.一种用于外周血中检测CART表达效率的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)DNA模板的制作：无菌环境中，取培养后的CART细胞，提取DNA；

2)系列标准品的制作：使用CAR的质粒作为标准品，提取感染前T淋巴细胞DNA，用来稀释CAR的质粒，制成标准品1；使用已知表达量的CART细胞，提取感染前T淋巴细胞DNA，用来稀释已知表达量的CART细胞，制成标准品2；使用感染前T淋巴细胞DNA基因组，测内参CDKN1A，制成标准品3；

3)Real-Time PCR检测：配制反应体系，该反应体系包括权利要求1所述的引物以及，对DNA模板进行Real-Time PCR扩增反应，收集荧光信号，绘制标准曲线，得出CART基因拷贝数和CART转导效率。

4.根据权利要求3所述的体内检测CART表达的方法，其特征在于，在构建标准品过程中，CART细胞的靶点基因为CD19。

5.根据权利要求1所述的体内检测CART表达的方法，其特征在于，在待测样本处理过程中，样本包括患者的全血和/或骨髓和/或肿瘤组织。