CN111936619A - Hpv特异性t细胞的产生 - Google Patents
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Abstract
本公开内容的实施方案涉及用于人乳头瘤病毒感染及其相关疾病的免疫疗法的方法和组合物。在特定的实施方案中，方法涉及靶向HPV16和/或HPV18的一种或多种抗原的免疫细胞的产生，包括采用IL‑7和IL‑15而非IL‑6和/或IL‑12的刺激步骤的方法。其他特定实施方案中，在某些细胞(例如共刺激细胞和某些抗原呈递细胞)存在下通过刺激产生。
Description
相关申请
本申请是2017年9月15日提交的国际申请序列号PCT/EP2017/073274的部分继续申请。国际申请序列号PCT/EP2017/073274要求2016年9月16日提交的美国临时专利申请序列号62/395,440和2016年10月21日提交的美国实用新型申请序列号15/331,659的优先权。美国实用新型申请序列号15/331,659也要求美国临时专利申请序列号62/395,440的优先权。本申请还要求2017年9月13日提交的国际申请序列号PCT/US17/51284的优先权。国际申请序列号PCT/US17/51284要求2016年9月16日提交的美国临时专利申请序列号62/95,438的优先权。所有参考申请通过引用并入本文。
关于联邦政府赞助的研究或开发的声明
该发明是在国家癌症研究所授予的P50 CA097007和PO1 CA94237在政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本公开至少涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学和医学，包括癌症医学的领域。
背景
人类乳头瘤病毒(HPV)是一种DNA病毒，可在皮肤或粘膜的角质形成细胞中产生生产性感染。HPV有170多种类型，其中某些HPV亚型是致癌的，包括可以发展为生殖器瘤的高危性传播类型，包括比如，宫颈上皮内瘤变(CIN)、外阴上皮内瘤变(VIN)、阴茎上皮内瘤变(PIN)和/或肛门上皮内瘤变(AIN)。当病毒序列整合到宿主细胞的细胞DNA中时，HPV诱导的癌症就会出现。一些HPV“早期”基因，例如E6和E7，充当促进肿瘤生长和恶性转化的癌基因。
Ramos等人(J Immunother 2013；36：66-76)描述了一种刺激外周血单核细胞产生对HPV16 E6和E7特异的T细胞的方法。简而言之，该方法包括用树突状细胞刺激外周血单核细胞，其中在有或没有细胞因子IL-6、IL-7、IL-12和IL-15组合的情况下，在CTL培养基中培养细胞，另一种刺激是在共培养物中补充IL-2，并在存在IL-15的情况下每周用载有pepmix的辅助抗原呈递细胞(例如B原始细胞)刺激。该参考文献讲授了细胞因子IL-6、IL-7、IL-12和IL-15的组合对于从患者样品中扩增HPV特异性T细胞而言是必需的，以用于可检测的T细胞应答。
本公开缓解了本领域中长期以来对治疗HPV相关疾病的需求，例如至少包括与HPV16和HPV18相关的疾病。
概述
本公开内容涉及免疫系统细胞的方法和组合物，其被修饰以免疫原性地识别特定靶标。在一些实施方式中，本发明涉及靶向在个体中引起免疫应答的生物学部分的免疫细胞(包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL，也称为细胞毒性T细胞))的开发。在特定实施方式中，本发明涉及靶向于HPV抗原，包括HPV疾病相关抗原的细胞毒性T细胞的开发。在一些情况下，一种细胞毒性T细胞的混合物被生产，并且在某些情况下，该混合物靶向一种以上的HPV抗原，包括一种以上的HPV类型的一种以上的抗原。
本公开的实施方案涉及用于向感染HPV或患有HPV相关疾病(包括癌症)的个体提供治疗的方法和组合物。“HPV相关疾病”可以是由HPV感染引起或加重的疾病，以HPV感染为危险因素的疾病和/或HPV感染与疾病的发作、发展、进展或严重性呈正相关的疾病。与HPV相关的疾病可以是其中本发明的方法和组合物提供治疗效果的疾病(例如，抑制疾病的发展/进程，疾病的延迟/预防，疾病症状的严重程度降低，疾病症状的逆转和/或生存率的提高)。本领域技术人员将清楚本发明的方法和组合物的治疗效用，本发明基本上扩展到将从HPV感染的细胞数量减少中受益的实质上的任何疾病/病症。在特定的实施方式中，本公开内容涉及可靶向HPV相关的，例如HPV16相关的、HPV18相关的、HPV1相关的、HPV2相关的和/或HPV3相关的医学病症(包括癌症)的过继细胞免疫疗法的方法和组合物，因此具有治疗作用。
在某些方面，本发明涉及靶向来自HPV的抗原例如HPV16、HPV18、HPV1、HPV2和/或HPV3的多个T细胞的开发。本公开提供了对方法进行显著且非显而易见的改进，用于产生对HPV(例如HPV16、HPV18、HPV1、HPV2和/或HPV3抗原)具有特异性的T细胞系。
在本公开的一些实施方式中，个体需要本公开的方法和/或组合物。在某些实施方式中，个体已经暴露于HPV，例如HPV16、HPV18、HPV1、HPV2和/或HPV3(个体可能知道或可能不知道其存在)，或怀疑该个体患已暴露于HPV或有暴露于HPV的风险，例如HPV16、HPV18、HPV1、HPV2和/或HPV3。在某些实施方式中，个体患有或被怀疑患有HPV相关疾病，或具有罹患HPV相关疾病的风险，例如HPV16相关，HPV18相关，HPV1相关，HPV2相关和/或HPV3相关的疾病，包括癌症。
在该方法的一部分的特定实施方式中，某些HPV(例如HPV16、HPV18、HPV1、HPV2和/或HPV3)，抗原以一种或多种肽的形式呈递给抗原呈递细胞(APC)，跨越某些抗原的部分或全部。在肽混合物的文库中，抗原性肽可以被提供给抗原呈递细胞，所述肽混合物可以称为pepmix。在本公开的某些方面，汇集了各种pepmix以暴露于抗原呈递细胞(APC)。表达抗原的抗原呈递细胞可以在某些条件下暴露于外周血T细胞，以刺激对某些HPV抗原具有特异性的T细胞。
本公开的某些方面和实施方式涉及HPV特异性T细胞的产生和/或扩增。
在本公开的第一方面，提供了一种刺激外周血细胞，优选外周血T细胞的方法，其中该方法包括在白介素(IL)-7和IL-15存在下以及至少在某些情况下在没有IL-6和/或IL-12的情况下用抗原呈递细胞刺激外周血T细胞，所述抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与HPV的一种或多种蛋白序列的至少一部分相对应的序列。根据本文公开的各个方面，在“存在”给定细胞因子的情况下进行刺激/培养，可以将相关细胞因子(例如重组和/或外源细胞因子)添加到刺激/培养中。在没有特定细胞因子进行刺激/培养，相关细胞因子(例如重组和/或外源细胞因子)将不会添加到刺激/培养中。
在一些实施方式中，提供了一种生产针对人乳头瘤病毒(HPV)相关疾病的治疗性T细胞的方法，该方法包括以下步骤：在存在以下一种或多种情况下，用抗原呈递细胞刺激外周血T细胞：白介素IL-7和IL-15，至少在某些情况下，在没有IL-6和/或IL-12的情况下，其中抗原呈递细胞事先已暴露于一种或多种肽，其中这些肽包含对应于HPV的一种或多种蛋白的序列的至少一部分的序列，其中所述刺激产生治疗HPV相关疾病的T细胞。
在某些实施方式中，被刺激的外周血T细胞是从预先刺激的外周血细胞获得的。预先的刺激可包括在IL-7和IL-15存在下，并且至少在某些情况下在IL-6和/或IL-12存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血细胞，其中所述抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白序列的至少一部分相对应的序列。
因此，在刺激外周血T细胞之前，该方法可以进一步包括在IL-7和IL-15存在下，并且至少在某些情况下在IL-6和/或IL-12存在的情况下，用抗原呈递细胞刺激外周血细胞。其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白的序列的至少一部分相对应的序列，以产生外周血T细胞。
在一些实施方式中，一种或多种肽包含对应于HPV16或HPV18的一种或多种蛋白质序列的至少一部分的序列；或HPV16和HPV18两者的一种或多种蛋白序列的至少一部分的序列。在一些实施方式中，一种或多种肽包含与HPV1的一种或多种蛋白；一种或多种HPV2蛋白；HPV3的一种或多种蛋白质；或HPV1，HPV2和/或HPV3的一种或多种蛋白质的序列的至少一部分相对应的序列。在一些实施方式中，一个或多个肽包含与蛋白质E5、E6、E7、L1和L2中的一个或多个相对应的序列。在一些实施方式中，一个或多个肽可以是肽文库，包括E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1和/或L2肽。
在一些实施方式中，所述方法可以产生对HPV或对HPV抗原具有特异性的免疫细胞，例如T细胞。在一些实施方式中，所述方法可以扩增存在于外周血T细胞中的对HPV或至少一种HPV抗原具有特异性的T细胞群。可以通过本公开的方法生产除T细胞以外的免疫细胞包括NK细胞和NKT细胞。
在一些实施方式中，抗原呈递细胞是例如，活化的T细胞，树突状细胞(DC)，B淋巴细胞(BB)或外周血单核细胞(PBMC)。
在一些实施方式中，在存在IL-7和IL-15的情况下刺激外周血T细胞，在至少不存在IL-2的情况下发生。在一些实施方式中，在存在IL-7和IL-15的情况下刺激外周血T细胞，在至少不存在IL-4的情况下发生。在一些实施方式中，在存在IL-7和IL-15的情况下刺激外周血T细胞，在至少不存在IL-6的情况下发生。在一些实施方式中，在存在IL-7和IL-15的情况下刺激外周血T细胞，在至少不存在IL-12的情况下发生。在一些实施方式中，在存在IL-7和IL-15的情况下刺激外周血T细胞，在至少不存在IL-21的情况下发生。在一些实施方式中，在存在IL-7和IL-15的情况下刺激外周血T细胞，在不存在IL-6和IL-12的情况下发生。
在一些特定实施方式中，本发明的第一方面的方法中，刺激细胞，在不存在IL-6和IL-12的情况下发生。
在一些实施方式中，外周血T细胞可存在于外周血单核细胞(PBMC)群体中或从中获得或分离。群体中的外周血单核细胞可能是非粘附性外周血单核细胞。抗原呈递细胞可以是例如活化的T细胞、树突状细胞、B原始细胞或外周血单核细胞。
在本公开的第二方面，提供了一种刺激对HPV或对HPV抗原特异的T细胞的方法，其中该方法包括在IL-7和IL-15存在下，以及任选的在共刺激细胞的存在下，用抗原呈递细胞刺激对HPV或对HPV抗原特异的T细胞，其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含对应于一种或多种HPV蛋白序列的至少一部分序列。
在一些实施方式中，提供了一种产生用于人乳头瘤病毒(HPV)相关疾病的治疗性T细胞的方法，该方法包括以下步骤：在存在白介素IL-7和IL-15中的一个或多个的情况下，以及任选地在共刺激细胞的存在下，用抗原呈递细胞刺激特异于HPV或HPV抗原的T细胞。其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含对应于一种或多种HPV蛋白的至少一部分序列，其中所述刺激产生治疗一种或多种HPV相关疾病的T细胞。
在一些实施方式中，抗原呈递细胞是活化的T细胞，树突状细胞(DC)，B原始细胞(BB)或外周单核细胞。在特定的实施方式中，抗原呈递细胞是活化的T细胞。
在一些实施方式中，共刺激细胞是一种或多种细胞类型，选自CD80+细胞，CD86+细胞，CD83+细胞，4-1BBL+细胞，CD40+细胞，OX40+细胞及其组合。共刺激细胞可以是CD80+/CD86+/CD83+/4-1BBL+细胞。
在一些实施方式中，对HPV或对HPV抗原特异的T细胞的刺激不是第一步刺激。被刺激的T细胞可能是预先刺激的产物，例如使用本公开的第一方面的方法。
在一些实施方式中，一种或多种肽包含对应于HPV16的一种或多种蛋白质；或HPV18的一种或多种蛋白质；或HPV16的一种或多种蛋白和HPV18的一种或多种蛋白的序列的至少一部分的序列。在一些实施方式中，一种或多种肽包含与HPV1的一种或多种蛋白；一种或多种HPV2蛋白；HPV3的一种或多种蛋白质；或HPV1、HPV2和/或HPV3的一种或多种蛋白质的序列的至少一部分相对应的序列。在一些实施方式中一个或多个肽包含与蛋白质E5、E6、E7、L1和L2中的一个或多个相对应的序列。在一些实施方式中，一个或多个肽可以是肽文库，包括E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1和/或L2肽。
在一些实施方式中，该方法可以产生对HPV或对HPV抗原具有特异性的T细胞。在一些实施方式中，该方法可以扩增对HPV或对HPV抗原具有特异性的T细胞群。
在一些实施方式中，对HPV或对HPV抗原特异的T细胞的刺激包括在IL-7、IL-15和一种或多种类型的共刺激细胞存在的情况下，用抗原呈递细胞刺激对HPV或对HPV抗原特异的T细胞。
在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下刺激T细胞是在IL-2不存在下进行的。在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下刺激T细胞是在IL-4不存在下进行的。在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下刺激T细胞是在IL-6不存在下进行的。在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下刺激T细胞是在IL-7不存在下进行的。
在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下刺激T细胞是在IL-12不存在下进行的。在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下刺激T细胞是在IL-21不存在下进行的。在一些实施方式中，在本发明的第一方面的方法中对T细胞的刺激是在不存在IL-6和IL-12的情况下的。
根据本公开的第一方面和第二方面的方法，可以是产生用于HPV相关疾病的治疗性T细胞的方法。细胞的刺激可以产生治疗HPV相关疾病的T细胞。
在第三方面，可以将第一方面和第二方面的方法结合起来，以提供一种生产针对HPV相关疾病的治疗性T细胞的方法，该方法包括：
刺激外周血细胞，优选外周血T细胞，其中所述方法包括在白介素(IL)-7和IL-15存在下，任选地在不存在IL-6和/或IL-12的情况下，用抗原呈递细胞刺激外周血T细胞，其中抗原呈递细胞先前已暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与HPV的一种或多种蛋白的序列的至少一部分相对应的序列；
在存在白介素(IL)-7和IL-15的情况下，可选地在一种或多种共刺激细胞的存在下，用抗原呈递细胞刺激从(i)获得的T细胞，其中抗原呈递细胞先前暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与HPV的一种或多种蛋白的序列的至少一部分相对应的序列。
在步骤(ii)之前的某些实施方式中，可以在存在IL-7和IL-15的情况下而不是在存在共刺激细胞的情况下，任选地在不存在IL-6和/或IL-12的情况下再刺激从(i)获得的T细胞。根据需要，这种再刺激可以进行一、二、三、四、五或更多轮。
在一些实施方式中，在(i)中使用的抗原呈递细胞是树突状细胞(DC)，B原始细胞(BB)或外周单核细胞。在一些实施方式中，(ii)中使用的抗原呈递细胞是活化的T细胞，树突状细胞(DC)，B原始细胞(BB)或外周单核细胞。在一些实施方式中，(i)中使用的抗原呈递细胞与(ii)中使用的抗原呈递细胞不同，尽管它们在某些情况下可以相同。在特定实施方式中，(ii)中使用的抗原呈递细胞是活化的T细胞。
在一些实施方式中，共刺激细胞是一种或多种细胞类型，选自CD80+细胞，CD86+细胞，CD83+细胞，4-1BBL+细胞，CD40+细胞，OX40+细胞及其组合。共刺激细胞可以是CD80+/CD86+/CD83+/4-1BBL+细胞。
在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下刺激细胞是在IL-2不存在下进行的。在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下刺激细胞是在IL-4不存在下进行的。在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下刺激细胞是在IL-6不存在下进行的。在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下刺激细胞是在IL-12不存在下进行的。在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下刺激细胞是在IL-21不存在下进行的。在一些实施方式中，在IL-7和IL-15的情况下刺激细胞是在IL-6和IL-12不存在下进行的。
在一些优选的实施方式中，步骤(i)中的细胞刺激是在不存在IL-6和IL-12的情况下进行的。
在一些实施方式中，步骤(ii)中的细胞刺激是在不存在IL-6和IL-12的情况下进行的。
相应地，在一些实施方式中，提供了一种生产针对HPV相关疾病的治疗性T细胞的方法，该方法包括：
(i)刺激外周血细胞，其中所述方法包括在白介素(IL)-7和IL-15存在下和任选地在不存在IL-6和/或IL-12的情况下用抗原呈递细胞刺激外周血T细胞，其中所述抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与HPV的一种或多种蛋白的序列的至少一部分相对应的序列；
(ii)在存在白介素(IL)-7和IL-15的情况下和可选地在没有IL-6和/或IL-12的情况下，用抗原呈递细胞刺激从(i)获得的T细胞，其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白的序列的至少一部分相对应的序列，其中(ii)任选地重复一次或多次；和(ii i)在存在IL-7和IL-15的情况下，以及可选地在共刺激细胞的存在下，用抗原呈递细胞刺激从(ii)获得的T细胞，其中抗原呈递细胞先前已暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含对应于HPV的一种或多种蛋白的序列的至少一部分的序列，其中(iii)任选地重复一次或多次。
在一些实施方式中，(i)和(ii)中使用的抗原呈递细胞是树突状细胞(DC)，B原始细胞(BB)或外周单核细胞。在一些实施方式中，(iii)中使用的抗原呈递细胞是活化的T细胞，树突状细胞(DC)，B原始细胞(BB)或外周单核细胞。在一些实施方式中，(iii)中使用的抗原呈递细胞不同于(i)和/或(ii)中使用的抗原呈递细胞。在优选的实施方式中，(iii)中使用的抗原呈递细胞是活化的T细胞。
在优选的实施方式中，(iii)中的刺激是在共刺激细胞的存在下进行的。在一些实施方式中，共刺激细胞是一种或多种选自下组的细胞类型，包括：CD80+细胞，CD86+细胞，CD83+细胞，4-1BBL+细胞，CD40+细胞，OX40+细胞及其组合。共刺激细胞可以是CD80+/CD86+/CD83+/4-1BBL+细胞。
在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下刺激细胞是在IL-2不存在下进行的。在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下刺激细胞是在IL-4不存在下进行的。在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下刺激细胞是在IL-6不存在下进行的。在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下刺激细胞是在IL-12不存在下进行的。在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下刺激细胞是在IL-21不存在下进行的。在一些实施方式中，在IL-7和IL-15的情况下刺激细胞是在IL-6和IL-12不存在下进行的。
在一些实施方式中，步骤(i)中的细胞刺激是在不存在IL-6和IL-12下进行的。在一些其他实施方式中，步骤(i)中的细胞刺激是在IL-6和IL-12存在下进行的。
在一些特定实施方式中，步骤(ii)中的细胞刺激是在不存在IL-6和IL-12的情况下进行的。在一些特定实施方式中，步骤(iii)中的细胞刺激是在不存在IL-6和IL-12的情况下进行的。
在一些特定实施方式中，本公开的方法用于产生对于HPV16和/或HPV18特异的T细胞。在一些特定实施方式中，本发明的方法用于产生对HPV16相关的疾病和/或HPV18相关的疾病特异的T细胞。
在一些实施方式中，外周血T细胞可获自已知感染或怀疑感染HPV的个体；例如，HPV16或HPV18；HPV16和HPV18；HPV1，HPV2和/或HPV3。
在一些实施方式中，抗原呈递细胞可以获自已知感染或怀疑被HPV感染的个体；例如，HPV16或HPV18；HPV16和HPV18；HPV1，HPV2和/或HPV3。
在一些实施方式中，该方法可以在不存在将该方法产生的T细胞暴露于由事先暴露于肽文库的活化B细胞的情况下发生。
在一些实施方式中，抗原呈递细胞对于打算用获得的治疗性T细胞进行治疗的个体可以是自体的或同种异体的。
在一些实施方式中，一种或多种肽包含与HPV16的一种或多种蛋白；HPV18的一种或多种蛋白质；或HPV16和HPV18的一种或多种蛋白质的序列至少一部分相对应的序列。在一些实施方式中，一种或多种肽包含与HPV1的一种或多种蛋白；一种或多种HPV2蛋白；HPV3的一种或多种蛋白质；或HPV1、HPV2和/或HPV3的一种或多种蛋白质的序列的至少一部分相对应的序列。在一些实施方式中，一个或多个肽包含与来自HPV16，HPV18或HPV16和HPV18的蛋白质E1，E2，E3，E4，E5，E6，E7，L1和/或L2中的一个或多个相对应的序列。
在本公开的实施方式中，肽可包含与HPV蛋白E1，E2，E3，E4，E5，E6，E7，L1和/或L2中的一个或多个相对应的序列。在一些实施方式中，肽可包含对应于感染HPV细胞中在原病毒整合后表达的一种或多种HPV蛋白的序列(例如E1，E2，E3，E4，E5，E6和/或E7)。在一些实施方式中，肽可以包含对应于一种或多种转化HPV蛋白(例如E6和/或E7)的序列。所述肽可以对应于所述HPV蛋白内存在的连续氨基酸序列。肽的长度可以为至少或不大于8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸，或15个氨基酸的长度。肽的集合可以形成文库，并且该文库中的肽可以与其他肽在序列上重叠任何适当的量，包括例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14氨基酸。所述肽可包含对应于以下序列：a)HPV18 E6蛋白和/或HPV18E7蛋白，和/或b)HPV16 E6蛋白和/或HPV16 E7蛋白。
在本公开的实施方式中，HPV可以是HPV16或HPV18，或两者。在与HPV相关疾病的治疗有关的实施方式中，所述疾病可以是癌症，并且所述肽可以包含对应于E6和E7之一或两者的序列。当HPV相关疾病是癌前病变时，所述肽可包含对应于E1，E2，E3，E4，E5，E6，E7，L1和L2中的一个，一些或全部的序列。
通过本公开的方法产生的T细胞可以被分离和/或纯化，例如从其他细胞中分离/纯化。
在一些实施方式中，通过本公开的方法产生的治疗有效量的T细胞被提供给已经暴露于HPV或患有HPV相关疾病的个体。在一相关方面，通过本发明方法产生的T细胞被提供用于HPV相关疾病的治疗。在另一个相关方面，提供了通过本发明的方法产生的T细胞在制备用于治疗HPV相关疾病的药物中的用途。
在本发明的一个方面，提供了一种用于过继细胞免疫疗法的方法中的T细胞，其中所述T细胞是通过本文所述的刺激外周血或T细胞的方法或产生治疗性T细胞的方法而获得的，可获得的，或是其产物，过继细胞免疫疗法的方法包括将T细胞施用于受试者。
在本发明的一个方面，提供了T细胞在药物制备中的用途，所述药物用于过继细胞免疫疗法的方法，所述方法包括对受试者施用T细胞，其中所述T细胞是通过本文所述的刺激外周血或T细胞的方法或产生治疗性T细胞的方法而获得的，可获得的，或是其产物。
在本发明的一个方面，提供了一种制备药物组合物，药物或疫苗的方法，该方法包括根据本文所述的方法刺激外周血或T细胞，或根据本文所述的方法产生治疗性T细胞，并将获得的细胞与药学上可接受的运载体，佐剂，稀释剂或赋形剂混合。
待治疗的疾病可以是肿瘤。所述肿瘤可以是癌症。所述癌症可以是HPV阳性癌症，例如HPV16阳性癌症和/或HPV18阳性癌症。
待治疗的个体可以是人类。所述个体可以是患者。所述个体可能已经暴露于HPV，例如HPV16、HPV18或HPV16和HPV18两者，或患有HPV、HPV16和/或HPV18相关疾病。所述HPV、HPV16和/或HPV18相关疾病可以是肿瘤。所述肿瘤可以是癌症。
所述癌症可以是任何类型。在一些实施方式中，所述癌症是宫颈癌、肛门癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌或口咽癌。在一些实施方式中，所述癌症可以是与HPV相关的癌症。所述“与HPV相关的癌症”可能是由HPV感染引起或加重的癌症，所述HPV感染的癌症是危险因素和/或HPV感染的癌症与发病、发展、进展、严重程度或转移成正相关。HPV相关的癌症可以是其中本发明的方法和组合物提供治疗效果的癌症(例如，抑制癌症的发展/进展，癌症的延迟/预防，转移的减少/延迟/预防，减少癌症症状的严重程度，癌细胞数量减少，肿瘤大小减少和/或存活率增加)。在一些实施方式中，癌症是HPV相关癌、HPV阳性口咽癌、HPV阳性宫颈癌、HPV阳性肛门癌、HPV阳性外阴癌、鼻咽癌、HPV阳性阴茎癌、HPV阳性的任何部位地异型增生或喉头乳头状瘤病。
所述个人或受试者可能已经接受，正在接受或即将接受额外的癌症治疗。额外的癌症治疗可以是手术、放射线、激素疗法、化学疗法、免疫疗法或其组合。
所述个体或受试者可以确定为患有HPV相关癌症或HPV阳性癌症。该个体可以确定患有HPV16相关的癌症或HPV16阳性的癌症。该个体可以确定患有HPV18相关的癌症或HPV18阳性的癌症。所述个体或受试者可以是任何动物或人类。所述个体或受试者优选是哺乳动物，更优选是人类。所述个体或受试者可以是非人类哺乳动物，但更优选是人类。所述个体或受试者可以是男性或女性。所述个体或受试者可以是患者。
涉及细胞刺激的步骤根据本发明的方法可以体外或离体实行。术语“体外”是旨在实验室条件下或在培养物中涉及对材料，生物物质，细胞和/或组织的研究。“离体”是指在有机体外部存在或发生的事物，例如在人体或动物体外，可能在从生物体获取的组织(例如，整个器官)或细胞上。
在一个实施方式中，存在一种刺激外周血细胞的方法，该方法包括在存在白介素(IL)-7和IL-15且不存在IL-6和/或IL-12的情况下，用抗原呈递细胞刺激外周血T细胞。其中所述抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与人乳头瘤病毒(HPV)的一种或多种蛋白质的序列的至少一部分相对应的序列。外周血T细胞可以从预先刺激的外周血细胞获得，例如其中外周血细胞的预先刺激包括在IL-7和IL-15存在下，在IL-6和/或IL-12存在下用抗原呈递细胞刺激外周血细胞，其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白的序列的至少一部分相对应的序列。在特定情况下，在刺激外周血T细胞之前，该方法进一步包括在IL-7和IL-15存在下，在IL-6和/或IL-12存在下用抗原呈递细胞刺激外周血细胞。其中所述抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与HPV的一种或多种蛋白的序列的至少一部分相对应的序列，以产生外周血T细胞。
在一实施方式中，存在一种生产针对HPV相关疾病的治疗性T细胞的方法，该方法包括以下步骤：在一种或多种IL-7和IL-15的存在下，并且在不存在IL-6和/或IL-12的情况下用抗原呈递细胞刺激外周血T细胞，其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含对应于一种或多种HPV蛋白质序列的至少一部分序列，刺激产生治疗HPV相关疾病的T细胞。外周血T细胞可获自预先刺激的外周血细胞，例如其中外周血细胞的预先刺激包括在IL-7和IL-15存在下，以及在IL-6和/或IL-12存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血细胞，其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含对应于一种或多种HPV蛋白序列的至少一部分的序列。在特定情况下，在刺激外周血T细胞之前，该方法进一步包括在IL-7和IL-15存在下，在IL-6和/或IL-12存在下用抗原呈递细胞刺激外周血细胞。其中所述抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与HPV的一种或多种蛋白的序列的至少一部分相对应的序列，以产生外周血T细胞。
在本公开内容涵盖的方法的实施方式中，抗原呈递细胞是活化的T细胞，树突状细胞，B原始细胞或外周单核细胞。至少在某些情况下，外周血T细胞可能存在于外周血单核细胞(PBMC)群中，或从中获得或分离出来，并且该群体中的外周血单核细胞可能是非粘附性的外周血单核细胞。当应用时，共刺激细胞可以是CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+细胞、OX40+细胞或其组合。
在一特定实施方式中，存在一种刺激HPV或HPV抗原特异的T细胞的方法，该方法包括在IL-7和IL-15存在下，和在共刺激细胞的存在下，用抗原呈递细胞刺激HPV或HPV抗原特异的T细胞。其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白序列的至少一部分相对应的序列。
在某些实施方式中，存在一种生产针对HPV相关疾病的治疗性T细胞的方法，该方法包括以下步骤：在存在以下一种或多种IL-7和IL-15，并且在存在共刺激细胞的情况下，用抗原呈递细胞刺激对HPV或对HPV抗原特异的T细胞。其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白质的至少一部分序列相对应的序列，刺激产生治疗HPV相关疾病的T细胞。
在一实施方式中，存在一种生产针对HPV相关疾病的治疗性T细胞的方法，该方法包括：(i)刺激外周血细胞，其中所述方法包括在IL-7和IL-15存在下和任选地在IL-6和/或IL-12不存在下用抗原呈递细胞刺激外周血T细胞，其中所述抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白序列的至少一部分相对应的序列；(ii)在存在IL-7和IL-15的情况下以及在共刺激细胞的存在下，用抗原呈递细胞刺激从(i)中获得的T细胞，其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白质序列的至少一部分相对应的序列。在特定实施方式中，在步骤(ii)之前，可以在IL-7和IL-15存在下而不在共刺激细胞存在下再次刺激从(i)获得的T细胞。
在一实施方式中，提供了一种生产用于HPV相关疾病的治疗性T细胞的方法，该方法包括：(i)刺激外周血细胞，其中所述方法包括在白介素(IL)-7和IL-15存在下并且任选地在IL-6和/或IL-12不存在下用抗原呈递细胞刺激外周血T细胞，其中所述抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白序列的至少一部分相对应的序列；(ii)在存在白介素(IL)-7和IL-15的情况下以及任选地在不存在IL-6和/或IL-12的情况下用抗原呈递细胞刺激从(i)获得的T细胞细胞，抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白的序列的至少一部分相对应的序列，其中步骤(ii)可选地重复一次或多次；(iii)在白介素(IL)-7和IL-15的存在下以及在共刺激细胞的存在下，用抗原呈递细胞刺激从(ii)获得的T细胞，其中所述抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含对应于一种或多种HPV蛋白序列的至少一部分的序列，其中步骤(iii)可选地重复一次或多次。
在本公开的任何方法中，HPV可以是HPV16，HPV18，HPV1，HPV2和HPV3。包含对应于E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1和L2中一个或多个的序列的肽可以用于本公开的任何方法中。所述肽可包含对应于以下序列：a)HPV18 E6蛋白和/或HPV18 E7蛋白，和/或b)HPV16 E6蛋白和/或HPV16 E7蛋白。在一些情况下，被提供有有效量的如本文所述的细胞的个体患有HPV相关疾病，例如癌症，并且所述肽包含对应于E6和E7之一或两者的序列。在特定方面，一种或多种肽包括长度至少或不超过8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的肽，和特别地，一种或多种肽包含长度为15个氨基酸的肽。在特定实施方式中，一种或多种肽形成文库，并且该文库中的肽与其他肽在序列上重叠11个氨基酸。
在特定实施方式中，将通过所述方法产生的治疗有效量的T细胞提供给已暴露于HPV或患有HPV相关疾病的个体。在特定实施方式中，HPV相关疾病包括肿瘤。
通过本公开内容的方法产生的治疗有效量的T细胞可以提供给已暴露于HPV16，HPV18或两者，或患有HPV16相关和/或HPV18相关疾病(包括肿瘤)的个体例如癌症。
在特定实施方式中，所述癌症是宫颈癌、肛门癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、口咽癌、鼻咽癌、喉乳头状瘤病、喉癌、头颈癌或其任何部位的异型增生。
在某些情况下，已接受和/或将接受本发明细胞的个体也已接受，正在接受或将要接受其他癌症治疗，例如手术、放疗、激素治疗、化学疗法、免疫疗法或其组合。
在某些方面，已经接受和/或将接受本公开内容的细胞的个体被确定为患有HPV相关的癌症，例如HPV16相关的癌症或HPV18相关的癌症。
以下编号的段落包含此处公开的发明技术特征的广泛组合的陈述：
1.一种刺激外周血细胞的方法，该方法包括在白介素(IL)-7和IL-15存在且IL-6和/或IL-12不存在的情况下，用抗原呈递细胞刺激外周血T细胞，其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种人乳头瘤病毒(HPV)蛋白质序列的至少一部分相对应的序列。
2.一种生产用于HPV相关疾病的治疗性T细胞的方法，该方法包括以下步骤：
在存在IL-7和IL-15中的一种或多种以及不存在IL-6和/或IL-12的情况下，用抗原呈递细胞刺激外周血T细胞，其中抗原呈递细胞预先已暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV的蛋白序列的至少一部分相对应的序列，
其中所述刺激产生治疗HPV相关疾病的T细胞。
3.如段落1或2的方法，其中所述外周血T细胞获自预先刺激的外周血细胞。
4.如段落3的方法，其中预先刺激外周血细胞包括在IL-7和IL-15存在，IL-6和/或IL-12存在的情况下，用抗原呈递细胞刺激外周血细胞，其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与HPV的一种或多种蛋白的序列的至少一部分相对应的序列。
5.如段落1或2的方法，其中在刺激所述外周血T细胞之前，所述方法进一步包括在IL-7和IL-15存在下以及在IL-6和/或IL-12存在下用抗原呈递细胞刺激外周血细胞，其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白的序列的至少一部分相对应的序列，以产生外周血T细胞。
6.如段落1-7中任一段的方法，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞，B原始细胞或外周血单核细胞。
7.如段落1-6中任一段的方法，其中所述外周血T细胞存在于外周血单核细胞(PBMC)群中或从中获得或分离。
8.如段落7的方法，其中群体中的外周血单核细胞是非粘附性外周血单核细胞。
9.一种刺激特异性针对HPV或HPV抗原的T细胞的方法，该方法包括在存在IL-7和IL-15以及存在共刺激细胞的情况下，用抗原呈递细胞刺激特异性针对HPV或HPV抗原的T细胞，抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与HPV的一种或多种蛋白的序列的至少一部分相对应的序列。
10.一种产生针对HPV相关疾病的治疗性T细胞的方法，该方法包括以下步骤：在存在IL-7和IL-15中的一种或多种，以及在存在共刺激细胞的情况下，用抗原呈递细胞刺激对HPV或对HPV抗原具有特异性的T细胞，其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与HPV的一种或多种蛋白的序列的至少一部分相对应的序列，其中所述刺激产生治疗HPV相关疾病的T细胞。
11.如段落9或10的方法，其中所述抗原呈递细胞是活化的T细胞，树突状细胞，B原始细胞或外周血单核细胞。
12.如段落9至11中任一段的方法，其中所述共刺激细胞是CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+细胞、OX40+细胞或其组合。
13.一种产生用于HPV相关疾病的治疗性T细胞的方法，该方法包括：
(i)刺激外周血细胞，其中所述方法包括在IL-7和IL-15存在下和任选在不存在IL-6和/或IL-12的情况下用抗原呈递细胞刺激外周血T细胞，抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白的序列的至少一部分相对应的序列；和
(ii)在存在IL-7和IL-15以及存在共刺激细胞的情况下，用抗原呈递细胞刺激从(i)获得的T细胞，其中所述抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与HPV的一种或多种蛋白的序列的至少一部分相对应的序列。
14.如段落13的方法，其中在步骤(ii)之前，可以在IL-7和IL-15存在下而不在共刺激细胞存在下再次刺激从(i)获得的T细胞。
15.如段落13或14的方法，其中(i)中使用的抗原呈递细胞是树突状细胞(DC)，B原始细胞(BB)或外周血单核细胞。
16.如段落13至15中任一段的方法，其中(ii)中使用的抗原呈递细胞是活化的T细胞，树突状细胞(DC)或B原始细胞(BB)。
17.如段落13至16中任一段的方法，其中所述共刺激细胞是CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+细胞、OX40+细胞或其组合。
18.提供了一种生产针对HPV相关疾病的治疗性T细胞的方法，该方法包括：
(i)刺激外周血细胞，其中所述方法包括在白介素(IL)-7和IL-15存在下和任选地在不存在IL-6和/或IL-12的情况下用抗原呈递细胞刺激外周血T细胞，其中所述抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与HPV的一种或多种蛋白的序列的至少一部分相对应的序列；
(ii)在存在白介素(IL)-7和IL-15的情况下和任选地在不存在IL-6和/或IL-12的情况下，用抗原呈递细胞刺激从(i)获得的T细胞，其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白的序列的至少一部分相对应的序列，其中步骤(ii)任选地重复一次或多次；和
(iii)在白介素(IL)-7和IL-15存在下以及在共刺激细胞存在下用抗原呈递细胞刺激从(ii)获得的T细胞，其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与HPV的一种或多种蛋白的序列的至少一部分相对应的序列，其中步骤(iii)任选地重复一次或多次。
19.如段落18的方法，其中在(i)和(ii)中使用的抗原呈递细胞是树突状细胞，B原始细胞或外周血单核细胞。
20.如段落18或19的方法，其中(iii)中使用的抗原呈递细胞是活化的T细胞，树突状细胞，B原始细胞或外周血单核细胞。
21.如段落18至20中任一段的方法，其中所述共刺激细胞是CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+细胞、OX40+细胞或其组合。
22.如段落1-21中的任一段的方法，其中，HPV是HPV16或HPV18。
23.如段落1-22中任一段的方法，其中所述肽包含对应于E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1和L2中的一个或多个的序列。
24.如段落1-23中任一段的方法，其中所述HPV相关疾病是癌症，并且所述肽包含对应于E6和E7之一或两者的序列。
25.如段落1-25中任一段的方法，其中所述肽包含对应以下序列：
a)HPV18 E6蛋白和/或HPV18 E7蛋白；和/或
b)HPV16 E6蛋白和/或HPV16 E7蛋白。
26.如段落1-25中任一段的方法，其中所述一种或多种肽包括至少为或不超过8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，或20个氨基酸的肽。
27.如段落1-26中任一段的方法，其中所述一种或多种肽包括长度为15个氨基酸的肽。
28.如段落1-27中任一段的方法，其中一种或多种肽形成文库，并且该文库中的肽与其他肽在序列上重叠11个氨基酸。
29.如段落1-28中任一段的方法，其中将通过该方法产生的治疗有效量的T细胞提供给已经暴露于HPV或患有HPV相关疾病的个体。
30.如段落29的方法，其中HPV相关疾病包括肿瘤。
31.如段落1至30中任一段的方法，其中将通过该方法产生的治疗有效量的T细胞提供给已经暴露于HPV16，HPV18或两者，或具有HPV16相关和/或HPV18相关疾病的个体。
32.如段落31的方法，其中与HPV16相关的疾病和/或与HPV18相关的疾病包括肿瘤。
33.如段落31或32的方法，其中所述肿瘤是癌症。
34.如段落33的方法，其中所述癌症是子宫颈癌，肛门癌，外阴癌，阴道癌，阴茎癌，口咽癌，鼻咽癌，喉乳头状瘤病，喉癌，头颈癌或其任何部位的异常增生。
35.如段落33或34的方法，其中所述个体已经接受，正在接受或将接受其他的癌症治疗。
36.如段落35的方法，其中，所述其他的癌症治疗是手术，放射线，激素疗法，化学疗法，免疫疗法或其组合。
37.如段落33至36中的任一段所述的方法，其中，所述个体被确定为患有HPV相关的癌症。
38.如段落33至37中任一段的方法，其中所述个体被确定为患有HPV16相关的癌症。
39.如段落33至38中任一段所述的方法，其中所述个体被确定为患有HPV18相关的癌症。
40.T细胞在过继细胞免疫疗法的方法中的用途，其中T细胞是根据段落1-39中任一项的用于刺激外周血或T细胞的方法或生产治疗性T细胞的方法获得的，可获得的或是其产物，其中过继细胞免疫疗法的方法包括将T细胞施用于受试者。
41.T细胞在用于过继细胞免疫疗法的方法中的药物制备中的用途，所述方法包括将T细胞施用于受试者，其中所述T细胞是通过根据权利要求1至39中任一项所述的用于刺激外周血或T细胞的方法，或制备治疗性T细胞的方法获得的，可获得的或是其产物。
42.一种制备药物组合物、药物或疫苗的方法，该方法包括刺激根据权利要求1至39中任一项所述的外周血或T细胞或产生治疗性T细胞，并将获得的细胞与药学上可接受的运载体、佐剂、稀释剂或赋形剂混合。
43.一种治疗受试者癌症的方法，该方法包括：
(1)从受试者分离T细胞；
(2)通过以下方法产生或扩增特异性针对人乳头瘤病毒(HPV)的T细胞群体：在白介素(IL)-7和IL-15存在且不存在IL-6和/或IL-12的情况下，用抗原呈递细胞刺激T细胞，其中所述抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白的序列的至少一部分相对应的序列；和
(3)将产生或扩增的T细胞群施用给受试者。
44.如段落43的方法，其中在(2)中刺激的T细胞获自预先刺激的外周血细胞或T细胞。
45.如段落43的方法，其中在刺激所述T细胞之前，所述方法包括在IL-7和IL-15存在下以及在IL-6和/或IL-12存在下用抗原呈递细胞刺激外周血细胞或T细胞，其中所述抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白的序列的至少一部分相对应的序列。
46.如段落43的方法，其中在(2)之后和(3)之前，该方法包括在IL-7和IL-15存在下以及在共刺激细胞存在下用抗原呈递细胞刺激从(2)获得的T细胞，其中所述抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白的序列的至少一部分相对应的序列。
47.如段落46的方法，其中所述共刺激细胞是CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+细胞、OX40+细胞或其组合。
48.如段落43的方法，其中在(2)之后和(3)之前，该方法包括(i)在存在IL-7和IL-15但不存在共刺激细胞的情况下重新刺激从(2)获得的T细胞；(ii)在存在IL-7和IL-15的情况下以及在存在共刺激细胞的情况下，用抗原呈递细胞刺激(i)之后获得的T细胞，其中所述抗原呈递细胞先前暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与HPV的一种或多种蛋白的序列的至少一部分相对应的序列。
49.如段落43的方法，其中抗原呈递细胞是树突状细胞(DC)、B原始细胞(BB)或外周血单核细胞(PBMC)。
50.如段落43的方法，其中在(1)中，T细胞是从一群外周血单核细胞(PBMC)中分离的。
51.如段落43的方法，其中所述癌症是子宫颈癌、肛门癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、口咽癌、鼻咽癌、喉乳头状瘤病、喉癌、头颈癌或其中任何部位的异常增生。
52.如段落43的方法，其中所述癌症是HPV阳性的。
53.如段落43的方法，其中所述受试者被确定为患有HPV相关的癌症。
54.一种治疗受试者癌症的方法，该方法包括：
(1)从受试者分离T细胞；
(2)通过以下方法产生或扩增特异性针对于人乳头状瘤病毒(HPV)的T细胞群：
(i)在白介素(IL)-7和IL-15的存在下用抗原呈递细胞刺激T细胞，其中抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与至少一部分肽相对应的序列HPV的一种或多种蛋白质的序列；
(ii)在存在白介素(IL)-7和IL-15且不存在IL-6和/或IL-12的情况下，用抗原呈递细胞刺激从(i)获得的T细胞，其中抗原呈递细胞预先已暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白的序列的至少一部分相对应的序列，其中(ii)任选地重复一次或多次；和
(iii)在白介素(IL)-7和IL-15存在下以及在共刺激细胞存在下用抗原呈递细胞刺激从(ii)获得的T细胞，其中抗原呈递细胞预先已暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与HPV的一种或多种蛋白的序列的至少一部分相对应的序列，其中步骤(iii)任选地重复一次或多次。
(3)将产生或扩增的T细胞群施用给受试者。
55.如段落54的方法，其中在(i)中T细胞的刺激是在IL-6和/或IL-12的存在下进行的。
56.如段落54的方法，其中在(i)和(ii)中使用的抗原呈递细胞是树突细胞(DC)、B原始细胞(BB)或外周血单核细胞(PBMC)。
57.如段落54的方法，其中(iii)中使用的抗原呈递细胞是活化的T细胞、树突细胞(DC)、B原始细胞(BB)或外周血单核细胞(PBMC)。
58.如段落54的方法，其中所述共刺激细胞是CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+细胞、OX40+细胞或其组合。
59.一种治疗受试者癌症的方法，该方法包括：
(1)从受试者分离T细胞；
(2)通过以下方法产生或扩增特异性针对于人乳头瘤病毒(HPV)的T细胞群：在IL-7和IL-15存在以及共刺激细胞存在的情况下，用抗原呈递细胞刺激对HPV或对HPV抗原特异的T细胞，其中所述抗原呈递细胞预先暴露于一种或多种肽，其中所述肽包含与一种或多种HPV蛋白的序列的至少一部分相对应的序列；和
(3)将产生或扩增的T细胞群施用给受试者。
60.如段落59的方法，其中所述抗原呈递细胞是活化的T细胞、树突状细胞(DC)、B原始细胞(BB)或外周血单核细胞(PBMC)。
61.如段落59的方法，其中所述共刺激细胞是CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+细胞、OX40+细胞或其组合。
前面已经相当广泛地概述了本发明的特征和技术优势，以便下述本发明的详述可以被更好地理解。在下文中将描述构成本发明权利要求主题的本发明的附加特征和优点。本领域技术人员应该理解，所公开的概念和特定实施方式可以容易地用作修改或设计用于实现本发明相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员还应该认识到，这样的等同构造不脱离所附权利要求书中阐述的本发明的精神和范围。当结合附图考虑时，从以下描述中可以更好地理解被认为是本发明的特点的新特征，包括其组织和操作方法，以及进一步的目的和优点。然而，应该明确地理解，提供的每个附图仅是出于说明和描述的目的，并且不旨在作为对本发明的限制的定义。
本发明包括所述方面和优选特征的组合，除非明确不允许或明确避免这种组合。
此处使用的章节标题仅出于组织目的，不应解释为限制所描述的主题。
现在将通过示例并参考附图来说明本发明的方面和实施方式。对于本领域技术人员而言，其他方面和实施方式将是显而易见的。本文中提及的所有文件均通过引用并入本文。
在整个说明书中，包括所附的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“含有”和“包含”之类的变体将被理解为意味着包含一个指定的整数或步数或一组整数或步数，但不排除任何其他整数或步数或一组整数或步数。
附图说明
图1A展示了本领域的一种方法，该方法利用某些条件生产HPV16特异性T细胞。图1A是条形图，显示了刺激来自三名HPV相关癌症患者(鉴定为OCV，HND和HNC)的PBMC时产生斑点形成菌落(SFC)的情况，这些患者自体DC不含pepmix(Neg)，HPV16 E6 pepmix(HPV16E6)或HPV16 E7 pepmix(HPV16 E7)。对于OCV患者，这三个条形从左到右依次是Neg、HPV16E6和HPV16 E7。对于HND和HNC患者，从左到右显示的两个条形是HPV16 E6和HPV16 E7。
图1B展示了本公开内容利用的一种方法，在某些新条件下，在IL-7和IL-15存在下以及在不存在IL-6和IL-12的条件下刺激T细胞来产生对HPV16或HPV18特异的T细胞混合物。图1B是条形图，显示了在刺激来自三名与HPV相关的癌症患者(确定为OCV，PCV和HND)的PBMC时斑点形成菌落(SFC)的产生。对于OCV患者，从左到右从左到右的五个条形是无pepmix(Neg)、HPV16 E6 pepmix(HPV16 E6)、HPV16 E7 pepmix(HPV16 E7)、HPV18 E6pepmix(HPV18 E6)和HPV18 E7 pepmix(HPV18 E7)。对于PCD患者，从左到右显示的两个条形是HPV16 E6和HPV16 E7。对于HND患者，从左到右显示的四个条形是HPV16 E6、HPV16 E7、HPV18 E6和HPV18 E7。
图2是一个图表，显示了在输注后的时间点，患者#1中用TGF-β显性负性受体(DNRII)转导的输注的HPV刺激T细胞的体内扩增和持续性。
图3是一个图表，显示了在输注后的时间点，患者#2中用TGF-β显性负性受体(DNRII)转导的输注的HPV刺激T细胞的体内扩增和持续性。
图4显示了患者#2的PET扫描(左和中)和体格检查照片(右)。第一行：预处理；底行：用根据本发明产生的HPV刺激的T细胞治疗后6周。
图5A和5B是散点图，显示了根据实验条件1，2、3、4、5、6、7、8、9、10或11(参阅表4)培养后，来自供体1CD14+外周血单核细胞的单核细胞衍生DC细胞的CD83和CD80表面表达(图5A)，以及CCR7和PD-L1的表达(图5B)。
图6A和6B是散点图，显示了CCR7和CD45RO在CD4+T细胞(图6A)和CD8+T细胞(图6B)的表面表达，这些细胞是根据实验条件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11(参阅表4)，用EBV肽致敏培养的成熟树突细胞刺激源自供体1的自体CD14-外周血单核细胞9天后获得的。
图7是一个条形图，显示了根据实验条件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11(参见表4)培养的EBV肽致敏成熟树突细胞刺激源自供体1的自体CD14-外周血单核细胞9天后获得的病毒特异性T细胞总数。
图8的条形图显示了根据实验条件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11(参见表4)培养的EBV肽致敏成熟树突细胞刺激源自供体1的自体CD14-外周血单核细胞9天后获得的IFN+CD8+ CTL细胞和IFN+CD4+ Th细胞的比例(去除背景)。
图9是一个条形图，显示了根据实验条件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11(参见表4)培养的EBV肽致敏成熟树突细胞刺激源自供体1的自体CD14-外周血单核细胞9天后获得的EBV抗原反应性IFNγ+CD8+ CTL细胞和IFNγ+CD4+ Th细胞(去除背景)的比例。
图10显示了病毒特异性T细胞总数相对于在不同实验条件(参见表4)下培养的EBV肽致敏成熟树突细胞刺激源自供体1的自体CD14-外周血单核细胞9天后获得的IFN+CD8+CTL细胞比例。
图11A和11B是散点图，显示了根据实验条件1，2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20(参见表4)培养源自供体2 CD14+外周血单核细胞的单核细胞衍生树突细胞的CD83和CD80(图11A)的表面表达，以及CCR7和PD-L1(图11B)的表达。
图12A和12B是散点图，显示了CBR7和CD45RO在CD4+ T细胞(图12A)和CD8+ T细胞(图12B)的表面表达，这些细胞是根据实验条件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20(参见表4)培养的EBV肽致敏成熟树突细胞刺激源自供体2的自体CD14-外周血单核细胞9天后获得的。
图13是一个条形图，显示了根据实验条件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20(参见表4)培养的EBV肽致敏成熟树突细胞刺激源自供体2的自体CD14-外周血单核细胞9天后获得的病毒特异性T细胞总数。
图14是一个条形图，显示了根据实验条件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20(参见表4)培养的EBV肽致敏成熟树突细胞刺激源自供体2的自体CD14-外周血单核细胞9天后获得的IFNγ+CD8+ CTL细胞和IFNγ+CD4+ Th细胞的比例(去除背景)。
图15是一个条形图，显示了根据实验条件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20(参见表4)培养的EBV肽致敏成熟树突细胞刺激源自供体2的自体CD14-外周血单核细胞9天后获得的EBV抗原反应性IFNγ+CD8+ CTL细胞和IFNγ+CD4+ Th细胞(去除背景)的比例。
图16显示了病毒特异性T细胞总数相对于在不同实验条件下(请参见表4)培养的EBV肽致敏成熟树突细胞刺激源自供体2的自体CD14-外周血单核细胞9天后获得的IFN+CD8+ CTL细胞的比例。
图17A，17B，17C，17D和17E是散点图和条形图，显示了根据实验条件1、2、5、18、19和20(参见表4)培养的源自三个不同供体的单核细胞衍生树突细胞的CD80和CD83(图17A)以及CCR7和PD-L1(图17B)表面表达。图17C显示了CD80+CD83-细胞的比例，图17D显示了CD80+CD83+细胞的比例，图17E显示了PD-L1+细胞的比例。
图18是一个条形图，显示了用根据实验条件2、5、18、19和20(参见表4)培养的EBV肽致敏成熟DC刺激源自三个不同供体的自体CD14-外周血单核细胞9天后获得的病毒特异性T细胞总数。
图19是一个条形图，显示了根据实验条件2、5、18、19和20(参见表4)培养的EBV肽致敏成熟树突细胞刺激源自不同供体的CD14-外周血单核细胞9天后获得的IFNγ+CD8+CTL细胞和IFNγ+CD4+ Th细胞的比例(去除背景)。
图20显示了根据实验条件2、5、18、19和20(参见表4)培养的EBV肽致敏成熟树突细胞刺激来自不同供体的自体CD14-外周血单核细胞9天后获得的EBV抗原反应性IFNγ+CD8+CTL细胞和IFNγ+CD4+ Th细胞(去除背景)的比例。
图21显示了用在不同实验条件下(参见表4)培养的EBV肽致敏成熟树突细胞刺激来自三个供体的自体CD14-外周血单核细胞9天后获得的病毒特异性T细胞的总数比例和IFNγ+ T细胞的频率比例。
图22A和22B显示了两次独立实验的结果图，该实验研究了与ULCL克隆#5和#13相比，使用K562-cs细胞作为共刺激细胞刺激后细胞的总体扩增倍数。
图23A和23B显示了两次独立实验的结果图，该实验研究了与ULCL克隆#5和#13相比，使用K562-cs细胞作为共刺激细胞刺激后，病毒特异性T细胞的总体扩增倍数，通过ELISPOT分析确定产生IFNγ的细胞数目。
图24A，24B和24C提供了来自代表性供体(n＝7)的散点图，显示了(图24A)CD3-CD56+ NK细胞，(图24B)CD4+ T细胞和CD8+ T细胞以及(图24C)伽玛δT细胞和αβT细胞使用K562-cs细胞或ULCL克隆#5和#13作为共刺激细胞在细胞群中扩增的比例。
图25提供的直方图显示了使用ULCL克隆#5和#13与K562cs细胞相比，γ-δTCR表达的代表性表征结果。
图26A和26B是两个不同供体的条形图，显示了使用K562-cs细胞或ULCL克隆#5和#13作为共刺激细胞在指定的刺激次数后，扩增的细胞群中病毒特异性T细胞的频率，通过ELISPOT分析确定产生IFNγ的细胞数量。
图27A，27B，27C和27D是四个不同供体的条形图，显示了使用K562cs细胞(K)，ULCL克隆#5(5)或LCL(L)为共刺激细胞进行指定次数的刺激后，对指定EBV抗原具有特异性的T细胞的频率，通过ELISPOT分析确定产生IFNγ的细胞数量。
图28A，28B，28C和28D是条形图和曲线图，显示了在K562-cs细胞或ULCL克隆#4，#5和#13作为共刺激细胞进行指定次数的刺激后，扩增的细胞群中病毒特异性T细胞的频率和扩增倍数，通过ELISPOT分析确定产生IFNγ的细胞数量。
图29A和29B是条形图，显示了通过ULCL克隆#4或亲代ULCL细胞作为共刺激细胞在指定的刺激次数后，扩增的细胞群中病毒特异性T细胞的频率，产生IFNγ的细胞数通过ELISPOT分析确定。
图30A和30B是两个不同供体的条形图，显示了通过ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在指定次数的刺激后，扩增的细胞群中病毒特异性T细胞的频率，通过ELISPOT分析确定产生IFNγ的细胞数量。
图31A和31B是两个不同供体的条形图，显示了使用ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在指定次数的刺激后，扩增的细胞群中病毒特异性T细胞的扩增倍数，通过ELISPOT分析确定产生IFNγ的细胞数量。
图32提供了散点图，显示了对于供体PB，使用ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在指定数目的刺激后扩增的细胞表面CD3和CD56的表达，通过流式细胞仪测定。
图33提供了散点图，显示了对于供体KP，使用ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在指定数目的刺激后扩增的细胞表面CD3和CD56的表达，通过流式细胞术测定。
图34提供了散点图，显示了对于供体PB，使用ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在指定数目的刺激后扩增的细胞表面CD45RO和CCR7的表达，通过流式细胞仪测定。
图35提供了散点图，显示了对于供体KP，使用ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在指定数目的刺激后扩增的细胞表面CD45RO和CCR7的表达，通过流式细胞仪测定。
图36A和36B是两个不同供体的条形图，显示了使用ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在指定次数的刺激后，扩增的细胞群中病毒特异性T细胞的频率，通过ELISPOT分析确定产生IFNγ的细胞数量。
图37A和37B是两个不同供体的条形图，显示了使用ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在指定次数的刺激后，扩增的细胞群中病毒特异性T细胞的扩增倍数，通过ELISPOT分析确定产生IFNγ的细胞数量。
图38提供的散点图，显示了对于一个供体，使用ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在指定数目的刺激后，扩增的细胞表面CD3和CD56的表达，通过流式细胞仪测定。
图39提供的散点图，显示了对于另一供体，使用ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在指定数目的刺激后，扩增的细胞表面CD3和CD56的表达，通过流式细胞仪测定。
图40提供的散点图，显示了对于一个供体，使用ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在指定数目的刺激后，扩增的细胞表面CD45RO和CCR7的表达，通过流式细胞仪测定。
图41提供的散点图，显示了对于另一供体，使用ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在指定数目的刺激后，扩增的细胞表面CD45RO和CCR7的表达，通过流式细胞仪测定。
图42是一个条形图，显示了使用ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在含有所示的细胞因子的刺激中以及指定的刺激次数后，扩增的细胞群中HPV特异性T细胞的频率，通过ELISPOT分析确定产生IFNγ的细胞数。
图43显示了使用ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在含有所示的细胞因子的刺激中以及指定刺激次数后，扩增细胞群中细胞的扩增倍数。
图44提供的散点图，显示了使用ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在包含所示的细胞因子的刺激中以及在指定刺激次数后，通过流式细胞术测定的扩增细胞的CD3和CD56的表面表达。
图45提供的散点图，显示了使用ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在包含指定细胞因子的刺激中以及在指定刺激次数后，通过流式细胞术测定的扩增细胞的CD4和CD8的表面表达。
图46提供的散点图，显示了由ULCL克隆#5或K562cs细胞作为共刺激细胞在包含所示细胞因子的刺激中以及在指定刺激次数后，通过流式细胞仪测定的扩增的细胞的CD45RO和CCR7的表面表达。
图47是本公开内容的病毒特异性T细胞(VST)生成方法的一般实施方式的示意图。
图48提供的条形图，显示了与采用IL-4和IL-7的已知方法相比，在本发明中采用IL-7和IL-15提高了方法的特异性。
图49是一个条形图，显示了在IL-7和IL-15的存在下进行刺激而获得的淋巴瘤患者EBVST，其EBV抗原特异性提高，通过ELISPOT法测定。
图50是一个条形图，表明在高剂量IL-15的刺激下会增加VST的频率。
图51是一个条形图，显示了在高剂量IL-15存在下进行刺激会增加中枢记忆EBVST的比例。
图52提供的条形图显示了某些患者的EBVST中过多的NK细胞过度增生。
图53是从CD45RA+细胞耗尽的外周血单核细胞中产生pepmix激活的EBVST的示意图。
图54是一个条形图，显示CD45RA消耗减少了从健康供体扩增而来的EBVST中CD3-CD56+ NK细胞的频率。
图55是一个条形图，显示了去除CD45RA+细胞会增加EBVST的增殖。
图56表明CD45RA耗尽增强EBVST的扩增倍数。
图57是一个条形图，显示在第二次刺激结束时(第16天)，CD45RA耗尽增强EBVST的抗原特异性。
图58是一个条形图，表明CD45RA耗尽增强EBVST的抗原特异性。
图59是一个柱状图，显示了三次刺激后，CD45RA耗尽的EBVST的抗原特异性增加。
图60是一个条形图，表明CD45RA耗尽减少了淋巴瘤患者EBVST中NK细胞群体的过度生长。
图61是一个条形图，显示CD45RA耗尽增加淋巴瘤患者EBVST中抗原特异性T细胞的频率。
图62是一个条形图，表明CD45RA耗尽增加了淋巴瘤患者EBVST中的抗原特异性。
图63是一个条形图，显示了CD45RA耗尽对淋巴瘤患者EBVST增殖的影响。
图64是一个图表，表明CD45RA耗尽可增强针对添加pepmix的自体活化T细胞(aATC)的溶细胞活性。
详述
本申请的范围并不旨在限于本说明书中描述的过程、机械、产品、物质组成、装置，方法和步骤的特定实施方式。
与长期的专利法惯例一致，在本说明书中使用的“一个”和“一种”一词与包括权利要求在内的包括“一个或多个”在内的词相一致。本发明的一些实施方式可以由一个或多个本发明的要素，方法步骤和/或方法组成，或基本上由其组成。预期，本发明中所述的任何方法或组合均可与本发明中所述的任何其他方法或组合一起实施。
本公开涉及用于需要HPV特异性T细胞的个体，例如HPV16和/或HPV18特异性T细胞的治疗性T细胞的生产和使用，包括用于治疗HPV感染和HPV相关的医疗症状。在特定的实施方式中，所述方法和组合物可用于治疗与HPV感染间接或直接相关的肿瘤，并且这些肿瘤可以是良性或恶性的。已有13至18株HPV毒株被表征为具有高致癌风险，其中12株属于HPV种7(HPV-18、-39、-45、-59、-68)和种9(HPV-16、-31、-33、-35、-52、-58、-67)。HPV 6型和11型引起喉乳头状瘤。
I.HPV抗原和Pepmixes的产生
公开的方法利用抗原呈递细胞，该抗原呈递细胞将肽的混合物呈递给T细胞。这种“装载”的APC是在暴露于外周血T细胞之前产生的，用于刺激外周血T细胞，并且装载的APC的生成可能会也可能不会由对外周血T细胞实施刺激步骤的个体或实体完成。因此，在一些实施方式中，将有效量的肽文库提供给APC，作为最终产生治疗性CTL的方法的一部分。在本公开的方法中，在刺激步骤之前，将APC暴露于足够量的肽文库中。在特定情况下，文库包含肽的混合物(“pepmixes”)，其跨越部分或全部相同的抗原，尽管在某些情况下，文库包含跨越一种或多种抗原的部分或全部抗原的pepmixs，以及一种或多种更多的抗原，可能是也可能不是来自同一HPV。在特定的实施方式中，用于APC的肽是是非天然的，并且它们可以通过也可以不通过重组方法化学合成或生产。
在利用一种或多种HPV抗原的肽混合物库中，各种肽可能来自给定蛋白质的任何部分，但在特定情况下，这些肽共同跨越了大部分或全部蛋白质的长度，其中肽序列的至少一部分重叠以促进特定抗原的整个所需区域的覆盖。在某些情况下，所述肽跨越所述肽所对应的相应抗原的一个或多个已知表位或结构域的长度。某些区域可以被跨越该区域的长度的肽覆盖，例如包括诸如N-末端结构域，C-末端结构域，细胞外结构域或细胞内结构域的区域。
衍生自肽的抗原可能是针对HPV的抗原，可以是任何种类，但在特定的实施方案中，抗原是这样的一类抗原，其允许将细胞毒性T细胞导向与HPV感染相关的肿瘤，包括癌症。在特定的实施方式中，所述肽衍生自或具有对应于至少一种HPV类型的一种或多种抗原的至少一部分的序列，所述抗原包括HPV16和/或HPV18。例如，在晚期宫颈癌中，HPV病毒整合到肿瘤细胞基因组中，并且失去了除E6和E7之外的所有其他基因，因此在某些情况下，这些抗原是靶向性的。在实施方式中，其中在治疗癌症的早期阶段，例如在病毒整合之前，可以利用来自除E6和E7以外的抗原的肽，例如包括E5、L1和L2。然而，考虑到高风险HPV类型的两个主要癌蛋白是E6和E7，在特定的实施方式中，肽的序列是从任一HPV，特别是从HPV16和/或HPV18的E6和/或E7获得的。来自任一抗原E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1和/或L2的肽可以用于本发明的方法中。
在某些情况下，pepmix文库包含对应于来自单一类型HPV病毒的一种或多种抗原的肽，这些肽可能会也可能不会在整个涉及的抗原中提供序列覆盖。在其他情况下，pepmix文库包含与来自一种以上HPV病毒的一种或多种抗原相对应的肽，这些肽可能会也可能不会在整个涉及的抗原中提供序列覆盖。pepmix可以富集或不富集对应于一种或多种某些抗原的一个或多个特定区域或对应于一种或多种某些抗原的整体的肽。
例如，本公开中使用的Pepmixes可以来自可商购的肽文库，也可以是合成产生的。可用文库的示例包括来自JPT技术(弗吉尼亚州的斯普林菲尔德)或Miltenyi生物技术(加利福尼亚州的奥本)的文库。例如，基于HPV16 E6，HPV16E7，HPV18 E6和HPV18 E7的已知序列，技术人员将具有足够的信息以能够产生对应于其示例性的相应序列的肽。HPV16 E6蛋白的序列示例可从国家生物技术信息中心的
数据库获得，
登录号为No.AIQ82776.1GI:688010703。HPV16 E7蛋白的序列示例是
登录号为No.AIQ82814.1GI:688010789。HPV18 E6蛋白的序列示例是
登录号为No.AGU90423.1GI:537801975。HPV18 E7蛋白的序列示例是
登录号为No.AGU90424.1GI:537801976。
在特定实施方式中，文库由对应于其各自抗原的一定长度的肽组成，尽管在某些情况下，文库由具有两种或更多种不同长度的肽的混合物组成。所述肽可以具有一定的长度，并且它们可以有一定量的序列重叠，尽管某些文库中重叠的长度可能会有所不同。在特定实施方式中，所述肽在长度上为至少为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个或更多个氨基酸。在特定实施方式中，所述肽的重叠在长度上至少为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸。在具体的实施方式中，肽长15个氨基酸，并且彼此重叠11个氨基酸。不同肽的混合物可以包括任何比例的不同肽，尽管在一些实施方案中，每种特定肽在混合物中以与另一特定肽基本相同的数量存在。尽管针对肽的抗原序列覆盖可能是随机的，并且基本上甚至覆盖抗原的给定区域，但是在一些实施方式中，一个文库可以富集一种或多种特定肽，例如已知编码一个表位或其一部分的一种或多种肽的文库。
在特定的实施方式中，特定抗原蛋白的pepmix包含所有可能的8至10个氨基酸长的HLA I类表位。在特定的实施方式中，更长的肽被用于覆盖特定肽的所有II类表位。在某些方面，所述肽的最大长度为30个氨基酸，其中25个氨基酸重叠。
II.产生和使用治疗性T细胞的方法
A.产生治疗性T细胞
在某些方面，本发明涉及靶向至少一种HPV病毒的一种或多种抗原的免疫细胞(例如细胞毒性T细胞)的开发。
本文公开的方法可能涉及免疫细胞的刺激和/或扩增。所述方法可涉及刺激和/或扩增外周血细胞，例如外周血单核细胞。所述方法可涉及从一群免疫细胞(例如外周血单核细胞)内扩增免疫细胞群(例如T细胞群)。例如，可以通过刺激外周血单核细胞群内的T细胞，从外周血单核细胞群内扩增T细胞群。因此，在本文公开的方法的实施方式中，T细胞的刺激和/或扩增可以涉及外周血单核细胞群的刺激。在一些实施方式中，可通过刺激肿瘤浸润淋巴细胞群内的T细胞，从肿瘤浸润淋巴细胞群内扩增T细胞群。因此，在本文公开的方法的实施方式中，T细胞的刺激和/或扩增可涉及肿瘤浸润淋巴细胞群的刺激。在一些实施方式中，T细胞群可以从T细胞群(例如，异质特异性的T细胞群)内扩增，其可以是从血液样品，外周血单核细胞群或肿瘤浸润淋巴细胞群中所获得的。刺激/扩增可导致增加HPV特异性免疫细胞(例如HPV特异性T细胞，如HPV特异性CTL)的数量，和/或导致在刺激扩张的最终，此类细胞在细胞群中的比例增加。该方法可以涉及T细胞的刺激和/或扩增。所述细胞可以从待治疗的患者(即自体细胞)获得，或从另一个体的细胞(即同种异体细胞)获得。
在某些实施方式中，该方法涉及刺激和/或扩增分离的免疫细胞。也就是说，可以对基本上不包含非免疫细胞(例如红细胞)的细胞群施行特定的方法。在某些情况下，免疫细胞是分离的外周血单核细胞或分离的T细胞。所述细胞可以是从血液样品获得，例如从患者或个体获得的血液样品。所述细胞可以是从组织样本或活检中获得。所述细胞可以是从肿瘤中获得的(例如肿瘤浸润淋巴细胞)。本文公开的某些方法涉及从获自患者的样品中获得外周血单核细胞和/或T细胞的步骤。所述方法的某些实施方式不涉及从患者或个体获得血液或细胞样品的步骤，而是在先前已获得的样品或细胞上进行。该方法可以涉及处理样品，例如富集样品中的免疫细胞，例如PBMC和/或T细胞。此方法可以涉及去除或大幅度减少样品中的红细胞、血小板、血清和/或血浆的量。这可能导致免疫细胞群基本不包含其他细胞，例如红细胞。本文公开的方法可以在分离的免疫细胞或除其他细胞之外还包含免疫细胞的样品上进行。
在生产T细胞的方法中，最初可以用暴露于一种或多种跨越至少一种HPV抗原中某些或全部肽段的抗原呈递细胞刺激外周血T细胞。可以在肽混合物的文库中将抗原性肽提供给抗原呈递细胞，并且可以将pepmix的多个文库提供给抗原呈递细胞的相同集合。在某些实施方式中，集合物包括免疫显性和亚显性抗原。
在本公开的实施方式中，产生治疗性T细胞，并且可以将其提供给患有HPV感染或具有因HPV感染而间接或直接导致的与HPV相关的医学病症的风险的个体。在生产治疗性T细胞的方法中，在某些条件下，将外周血T细胞与抗原呈递细胞混合，这些抗原呈递细胞上载有跨越一种或多种抗原(包括部分或全部HPV16和/或部分或全部或HPV18抗原，例如包括E6和/或E7)的肽文库。在特定的实施方式中，对于刺激步骤，T细胞位于外周血单核细胞群内。
在某些实施方式中，某些步骤中使用的抗原呈递细胞可以是树突状细胞(DC)。产生树突状细胞的方法在本领域中是众所周知的。参见拉莫斯(Ramos)等人，同上。可以通过分选CD14从PBMC中分离单核细胞，并在DC培养基和2mM丙氨酰谷氨酰胺中加入800U/ml的粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和1000U/ml的白细胞介素4(IL-4)培养5天。GM-CSF和IL-4可以在第3天补充。在第5天，树突状细胞在含有10ng/ml白介素-1b(IL-1β)、100ng/ml白介素6(IL-6)、10ng/ml前列腺素E2、800U/ml GM-CSF和1000U/ml IL-4的DC培养基中成熟。树突状细胞的成熟可通过流式细胞术检测CD80、CD83、CD86和HLA-DR的上调来评估。
在某些实施方式中，某些步骤中使用的抗原呈递细胞是活化的T细胞。
活化的T细胞可以是使用从经静脉抽取的血液中分离的一部分自体外周血单核细胞产生的多克隆T细胞(T-APC)。所述细胞可以通过在抗CD3和抗CD28抗体包被的细胞培养板上培养来激活。之后在IL-2存在下培养细胞使其扩增2周。可以将扩增的T-APC冷冻保存以备后用。在使用T-APC进行刺激(例如，对于第三个刺激周期和任选的后续刺激)之前2-3天，将冻存的细胞融化并在抗CD3和抗CD28抗体包被的细胞培养板中重新刺激。在刺激的当天，收获T-APC细胞并加入HPV E6/E7肽，然后以1：1的比例添加到正在进行HPV刺激的T细胞培养物中。
在某些实施方式中，在某些步骤和/或方法中使用的抗原呈递细胞可能是B原始细胞(BB)。例如，可以从患者的自体外周血单核细胞中产生B原始细胞。外周血单核细胞中的B淋巴细胞通过与表达同种异体CD40L的MRC5上皮细胞系共培养而被激活，并在含有100U/mlIL-4和1微克/ml环孢菌素A的培养基中扩增。
在某些实施方式中，存在一种从HPV16和HPV18之一或二者中产生靶向至少一种抗原的T细胞的方法，通常是通过使多个PBMC与多个装载了来自对应于一种或多种特定HPV16和/或HPV18病毒抗原的肽文库中的肽的APC接触来实现的。在特定实施方式中，两个细胞群的暴露允许T细胞的扩增。在特定实施方式中，刺激步骤在一种或多种特定细胞因子的存在下发生，所述细胞因子可以是哺乳动物(例如鼠，人)或人细胞因子。在某些实施方式中，一种或多种细胞因子是IL-7和IL-15，尽管在替代实施方式中，细胞因子选自IL-15，IL-7，IL-21，IL-12，IL-6，IL-4及其组合。在特定实施方式中，所述方法的一个或多个步骤在存在IL-2，IL-4，IL-6，IL-7，IL-12和/或IL-21的情况下不会发生，尽管可以替代性地利用IL-2，IL-4，IL-6，IL-7，IL-12和/或IL-21。提及的细胞因子的存在是指外源添加的细胞因子的存在，即排除细胞培养物中存在或分泌的任何细胞因子。在某些实施方式中，肽被进一步地定义为在序列上重叠以覆盖部分或全部HPV抗原的肽。例如，在某些方面，肽重叠至少10个氨基酸，特别地是11个氨基酸，并且在某些实施方式中，肽的长度是至少12个或更多个氨基酸，特别地是15个氨基酸。
选择合适量或浓度的给定细胞因子以包含在细胞培养物中是在本领域技术人员的能力或普通技能范围内的。举例来说，以下列出了一些白介素和适当的可使用的浓度：
白介素6(IL-6)：50至150ng/ml，约50ng/ml，60ng/ml，70ng/ml，80ng/ml，90ng/ml，100ng/ml，110ng/ml，120ng/ml，130ng/ml，140ng/ml或150ng/ml中的一种；
白介素7(IL-7)：5至15ng/ml，约5ng/ml，6ng/ml，7ng/ml，8ng/ml，9ng/ml，10ng/ml，11ng/ml，12ng/ml，13ng/ml，14ng/ml或15ng/ml中的一种；
白介素12(IL-12)：5至15ng/ml，约5ng/ml，6ng/ml，7ng/ml，8ng/ml，9ng/ml，10ng/ml，11ng/ml，12ng/ml，13ng/ml，14ng/ml或15ng/ml中的一种；
白介素15(IL-15)：5至15ng/ml，约5ng/ml，6ng/ml，7ng/ml，8ng/ml，9ng/ml，10ng/ml，11ng/ml，12ng/ml，13ng/ml，14ng/ml或15ng/ml中的一种。
下表1提供了本公开的方法的某些实施方式的示例。
表1：方法要素示例
因此，在特定实施方式中，将T细胞群(其中该群可以基本上包含所有T细胞，或者其中T细胞群在另一细胞群内，例如在外周血单核细胞内)暴露于抗原呈递细胞群产生具有特定特征的T细胞系，至少包括：a)靶向HPV16 E6和/或E7的效力和/或靶向HPV18 E6和/或E7的效力；b)多克隆性；c)TH1偏差；或d)其组合。产生的T细胞系可以有效靶向HPV种7(HPV-18、-39、-45、-59、-68)和种9(HPV-16、-31、-33、-35、-52、-58、-67)以及6和11型，这可能是针对以下一种或多种抗原的pepmix的结果：E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1和/或L2。
在某些情况下，会对T细胞进行多次刺激，并且不同的刺激步骤可能会或可能不会使细胞群体暴露于相同条件下。在特定实施方式中，第一次刺激具有与随后的刺激不同的条件，包括第二次刺激和/或第三次刺激。在具体的实施方式中，该方法的第次一刺激步骤使用载有pepmix的树突状细胞或载有pepmix的外周血单核细胞的抗原呈递细胞，并使用IL-7和IL-15。该刺激步骤可以可选地重复一次或多次。
在所述方法的某些实施方式中，在外周血T细胞(或外周血单核细胞)最初暴露于pepmix或APC之后的第8天至第10天之间，在第8天，第9天或第10天(但不晚于)重新刺激外周血单核细胞，然后可能在第15天，第16天或第17天进行随后的重新刺激。
在第一个刺激步骤之后的刺激步骤(包括第一个刺激步骤的可选重复步骤)中，第一次刺激后获得的所得T细胞(可能在异质细胞群中)暴露于载有pepmix的树突状细胞或载有pepmix的外周血单核细胞和/或自体活化的T细胞。在第一刺激步骤和第二刺激步骤之后的刺激中，第二次或更晚刺激后获得的T细胞(可能驻留在异质细胞群中)暴露于pepmix自体活化T细胞。可在任何刺激步骤中使用的共刺激细胞至少包括表达CD86、4-1BB、CD83、CD40、OX40和/或CD80的细胞。在特定情况下，共刺激细胞可以是K562细胞。
在某些实施方式中，在该方法的步骤中，对培养的细胞进行了修饰。在特定的实施方式中，修饰细胞以携带表达基因产物的多核苷酸，该基因产物使细胞对于特定目的或功能有效或更有效，例如对于靶向特定靶标有效和/或更有效，和/或增强针对特定目的的功能。T细胞介导的细胞毒性，和/或经过修饰可抵抗肿瘤抗原特异性细胞免疫。
在某些实施方式中，修饰细胞以表达某种非天然受体，该受体可以使T细胞有效或更有效地靶向所需的靶细胞，例如表达某种抗原的靶细胞。可以修饰细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)，αβT细胞受体等。可以修饰细胞以在方法中在特定时间点表达表达载体(可以是病毒的(包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒等)或非病毒的)，例如在培养的第二天到第五天之间引入载体。在某些实施方式中，将细胞在每次刺激后约3天内暴露于表达载体，但是在这种情况下，修饰发生在具有更长期潜能的分化程度更高的T细胞中(在特定情况下是需要的)。
在特定的实施方式中，对细胞进行修饰以表达靶向肿瘤抗原的CAR，例如EphA2、HER2、GD2、Glypican-3、5T4、8H9、αvβ6整合素、B细胞成熟抗原(BCMA)B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、κ轻链、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胎儿AchR、叶酸受体α、GD2、GD3、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2、IU 1Ra、IL13Ra2、KDR、Lambda、Lewis-Y、MCSP、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSC1、PSMA、ROR1、Sp17、SURVIVIN、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、癌胚抗原、HMW-MAA、VEGF受体和/或其他存在于肿瘤细胞外基质中的示例性抗原，例如纤连蛋白的癌胚变体，腱生蛋白或肿瘤坏死区域和其他与肿瘤相关的抗原，或可通过基因组分析和/或差异表达研究确定的可操作突变。
在某些实施方式中，修饰细胞以抵抗肿瘤抗原特异性细胞免疫，例如通过转化生长因子β(TGF-β)介导。例如，可以修饰细胞以表达TGF-β(DNRII)的显性负受体，例如Foster等人所述(用显性负性TGF-β受体转导的EBV特异性T淋巴细胞的抗肿瘤活性，JImmunother.2008；31:500-505，通过引用并入本文)。包括用逆转录病毒表达载体转染细胞，所述逆转录病毒表达载体编码通过去除免疫原性血凝素标签而修饰的显性负性TGF-βII型受体(DNRII)。已经显示，在存在分泌TGF-β的肿瘤的情况下，此类修饰的、T细胞相对于未修饰的T细胞具有功能优势，包括增强的抗肿瘤活性(Foster等，同上)。
与现有技术方法相比，根据本发明的所述方法可以提高病毒特异性T细胞群的扩增速率。T细胞群的扩增速率可以通过技术人员熟知的方法来分析。所述方法包括在一个或多个时间点测量T细胞的数量。例如，可以在执行根据本发明的方法之后确定T细胞的数量，并将其与开始时的T细胞的数量进行比较；然后可以计算出T细胞数目的扩增倍数。
扩增速率还可以通过分析一段时间内T细胞的细胞分裂来确定。给定T细胞群的细胞分裂可以例如通过体外分析H-胸腺嘧啶核苷的掺入或通过CFSE稀释测定法来分析。如Fulcher和Wong，Immunol Cell Biol(1999)77(6):559-564中所述，在此全文引入作为参考。
通过执行根据本发明的方法，并将该方法中T细胞的扩增与可比较的对照方法，例如Ramos等所述的方法(J Immunother 2013；36：66-76)进行比较，可以确定通过本发明的方法实现的扩增速率的提高。
在某些实施方式中，根据本发明的方法中的T细胞群的扩增速率是可比对照方法中扩增速度的至少1.001倍、1.002倍、1.003倍、1.004倍、1.005倍、1.006倍、1.007倍、1.008倍、1.009倍、1.01倍、1.02倍、1.03倍、1.04倍、1.05倍、1.06倍、1.07倍、1.08倍、1.09倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或2倍之一。
扩增速率可以是病毒特异性T细胞群体或总T细胞群体的扩增速率。
根据本发明的方法产生/扩增的病毒特异性T细胞可以至少保留与根据现有技术的方法产生/扩增的病毒特异性T细胞相同的功能特性。也就是说，加速的扩展速率不会对扩展的T细胞的功能特性产生负面影响。
例如，在产生/扩增病毒特异性T细胞群体的实施方式中，随着病毒特异性T细胞的扩增，T细胞对感染或包含/表达病毒肽的细胞表现出与根据现有技术方法扩增的病毒特异性T细胞相似的细胞毒性。
扩增的T细胞的细胞毒性可以通过例如用APC培养扩增的T细胞群，所述APC呈现T细胞特异性的病毒肽，在不同效应子(即T细胞)与靶标(即APC)比率来分析，并测量抗原呈递细胞的特异性裂解。例如，可以通过以不同的效应子与靶标比率测量HPV转化的LCL细胞的特异性裂解来分析HPV特异性CTL群体的细胞毒性。
B.使用治疗性T细胞
在某些实施方式中，将通过本公开内容的方法产生的细胞提供给需要的个体以治疗医学病症，包括由病毒感染引起的疾病，或靶向无法检测到或显现医学病症症状的病毒感染。如本文所用,“治疗”包括对疾病的症状或病理，或病理症状的任何有益或期望的作用，并且可以包括所治疗的疾病或症状的一种或多种可测量标志物的最小减少，例如癌症。治疗可选地涉及减轻或改善疾病或病症的症状，或延迟疾病或病症的进展。“治疗”不一定表示已完全根除或治愈了该疾病或病症或其相关症状。
在本公开内容涵盖的方法中，治疗性T细胞用于治疗由单一非HPV病毒直接或间接引起的病毒相关疾病，或以其他方式提供给对单一非HPV病毒呈血清反应阳性的个体。在其他情况下，治疗性T细胞用于治疗由一种以上病毒直接或间接引起的病毒相关疾病，或以其他方式提供给对一种以上病毒呈血清反应阳性的个体。在治疗性T细胞的集合中，每个T细胞及其后代仅对一种病毒的一种抗原中的一种肽具有特异性，并且在产生治疗性T细胞的集合后，就会扩大T细胞克隆的数量，这些克隆组合在一起具有多特异性，例如针对每种病毒抗原中的多个表位。
在本公开的至少一些方法中，将由此产生的治疗有效量的CTL给予个体，例如，已知患有或怀疑患有HPV16和/或HPV18相关疾病的个体。在特定的实施方式中，细胞通过注射施用，例如静脉内、肌内、皮内、皮下、腹膜内注射等。在某些实施方式中，CTL被进一步定义为多克隆CD4+和CD8+ CTL。外周血单核细胞对于个体可以是同种异体的，或者对于个体可以是自体的。
在某些情况下，用本公开内容的细胞治疗肿瘤，并且该肿瘤可能是良性的，恶性的或能导致癌症的癌前病变。因此，可以在恶性病变前阶段和/或在病变变为恶性之后，个体可以通过本公开的方法产生的细胞进行治疗。个体可能患有早期或晚期的癌症，并且本领域技术人员了解可以针对癌症的这种不同阶段来定制产生细胞的方法，例如通过利用来自与早期和晚期癌症相关的抗原的APC的肽。在特定的实施方式中，癌症可以是原发性的、转移性的、复发性的和难治性的等。
在某些情况下，可以导致癌症的癌前病变，如宫颈、外阴、阴道、阴茎、喉部、口咽部、肛门和其他上消化道化区的癌前病变，用本发明公开的方法产生的细胞进行治疗。因此，可以在恶性病变前阶段和/或在病变变为恶性之后，个体可以通过本公开的方法产生的细胞进行治疗。可以用通过本公开的方法产生的细胞治疗的与HPV相关的医学病症至少包括生殖器区域的增生、宫颈上皮内瘤变、外阴上皮内瘤变、阴茎上皮内瘤变、肛门上皮内瘤变、宫颈癌、肛门癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、生殖器癌、口咽癌、鼻咽癌、口腔乳头状瘤和其他上消化道病变。
在某些情况下，可以在施用细胞之前确定与癌症相关的血清型，尽管在某些情况下无法确定血清型。在特定的实施方案中，HPV16特异性或HPV18特异性细胞分别对HPV16或HPV18阳性的肿瘤具有活性，尽管在某些情况下与不同的HPV血清型具有交叉反应性。交叉反应的能力可能已知也可能未知，在某些情况下，例如，对患有HPV16感染或与HPV16相关的医学症状的个体给予HPV18特异性T细胞，反之亦然。在这种情况下，可以用一种血清型特异的细胞治疗该个体，其中不知道该个体是否具有该血清型，但是由于交叉反应性，这些细胞仍然是治疗有效的。
在该方法的刺激步骤的APC上同时装载有HPV16和HPV18 pepmix的情况下，通过个体是否已暴露于所讨论的病毒来确定通过此类APC扩增的T细胞的给药结果。例如，如果某人感染了HPV18，而不感染HPV16，则只有HPV18特异性T细胞会做出反应，这是因为感染最初会刺激T细胞对HPV18做出反应。这些T细胞将在个体中扩展，然后成为记忆T细胞，其数量将比从未激活的HPV16特异的T细胞更高。
被治疗的个体可能已知患有癌症，怀疑患有癌症或有罹患癌症的风险(例如个人或家族史；性活跃(包括性交)；和/或具有遗传易感性，包括一种或多种具体标记)。被治疗的个体可能存在HPV病毒，但尚未出现与HPV相关医学病状的任何有害症状。所述个体可能患有良性或恶性肿瘤。所述个体可以患有早期或晚期癌症，并且本领域技术人员知道可以针对这种不同阶段的癌症调整产生细胞的方法，例如通过利用来自与早期相和晚期癌症相关的抗原的APC的肽。。在特定的实施方式中，与HPV相关的疾病是口腔或生殖器区域的恶性癌症。在特定的实施方式中，癌症可以是原发性的、转移性的、复发性的和难治性的等。个体可能由于任何形式的性行为或任何形式的亲密身体接触而感染HPV16和/或HPV18。
HPV感染的任何阶段都可以用本公开内容涵盖的细胞进行治疗。用本公开内容的方法治疗的已建立的与HPV相关的癌症的个体包括原位癌(0期)、I期、II期、III期或IV期(可通过MRI、CT扫描、PET扫描等等)。另外，还可以治疗患有癌前病变(异型增生)的个体。
在一些实施方式中，通过本公开的方法产生的细胞的一种或多种施用被提供给有此需要的个体。不同给药之间的时间长度可以是任何合适的持续时间，包括大约1-7天，1-4周，1-12个月或1、2、3、4、5、6、7、8，9、10或更长时间。在某些情况下，可以在一年左右的时间内多次输注。在向个体提供多于一次细胞施用的情况下，细胞所靶向的抗原可以是或可以不是与早期施用中所用细胞所靶向的抗原相同的抗原。例如，在第一次施用细胞中，细胞可以靶向HPV18 E6，而在另一次施用细胞中，细胞靶向HPV18 E7，反之亦然。例如，在难治性癌症中可能需要进行其他给药。可以结合一种或多种其他类型的癌症治疗来进行额外的刺激。
在某些情况下，可以通过本领域任何合适的方式确定是否感染了HPV。由于不能在细胞培养物中培养HPV，因此可以利用诊断HPV感染的方法，例如利用PCR的检测DNA，DNA印迹杂交和/或原位杂交，这些方法可能会或可能不会与阴道镜检查结合使用；醋酸实验；活检；体格检查；和/或子宫颈涂片检查。
在特定的实施方式中，向男性个体提供通过本发明的方法产生的有效量的细胞以靶向其被感染的HPV，并且在这种情况下，该个体其后感染另一种个体的机会降低，例如通过性行为感染女性个体。在暴露于本公开内容的方法中的细胞之前，男性个体可以被确定为或可以不被确定为HPV感染。在某些情况下，如果显示某个个体感染了致癌的HPV，则值得用细胞治疗该个体以消除其风险。如果这些细胞有效，它们也将减少他将病毒传播给其伴侣的机会。
在特定的实施方式中，所述个体免疫功能低下(例如，可以定义为其免疫系统抵抗传染病或癌症的能力受损或完全不存在的个体)。在特定的实施方式中，免疫受损的个体已经进行了干细胞移植(包括造血干细胞移植)，进行了器官移植和/或接受了一种或多种癌症治疗，例如包括化学疗法或放射疗法。在某些情况下，所述个体已获得或遗传了免疫缺陷病。在某些实施方式中，向那些因其疾病和/或其治疗而免疫功能受损的人提供了本发明的方法和/或组合物。
医疗方法可能涉及通过改善、治疗或预防人类受试者恶性肿瘤的方法来治疗癌症，其中该方法的步骤有助于或增强免疫系统消除癌细胞的能力。根据本发明，这些方法可包括施用本发明的细胞引起主动(或实现被动)免疫应答以破坏癌细胞。治疗方法可任选地包括生物佐剂(例如白介素，细胞因子，Comet-Guerin芽孢杆菌，单磷酰脂质A等)与常规疗法的联合给药，所述常规疗法用于治疗癌症，例如化学疗法，放射疗法或外科手术。治疗方法可包括施用根据本发明的组合物作为疫苗，该疫苗通过激活免疫系统来预防或破坏癌细胞生长而起作用。医学治疗的方法还可能涉及体内，离体和过继性免疫疗法，包括那些使用自体和/或异源细胞或永生化细胞系的疗法。
III.药物组合物
根据本公开，术语“药物组合物”涉及用于施用于个体的组合物。在一个具体的实施方式中，药物组合物包括包含用于胃肠外，经皮，腔内，动脉内，鞘内或静脉注射或直接注射到肿瘤(如癌症)的治疗性免疫细胞的组合物。特别设想将药物组合物通过输注或注射给予个体。合适的组合物的施用可以通过不同的方式进行，例如，通过静脉内、皮下、腹膜内、肌内、局部或皮内给药。
本公开的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的运载体。合适的药物运载体的实例是本领域众所周知的，包括磷酸盐缓冲盐溶液，水，乳剂如油/水乳剂，各种类型的润湿剂，无菌溶液等。包含此类运载体的组合物可以通过众所周知的常规方法进行配制。这些药物组合物可以合适的剂量施用于受试者。
剂量方案将由主治医师和临床因素决定。如医学领域所周知的，任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型，体表面积，年龄，要施用的特定化合物，性别，施用时间和途径，总体健康状况以及其他同时使用药物。特定的给药剂量范围是每m2体表面积2×107个细胞到每m2体表面积1×1010个细胞。可以通过定期评估来监控进度。
本公开的组合物可以局部或全身施用。在一个优选的实施方式中，药物组合物是皮下给药的，在一更优选的实施方式中是静脉内给药的。肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液，悬浮液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。水性载体包括水、酒精/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲液。胃肠外运载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内运载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。另外，本公开的药物组合物可包含蛋白质运载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选人源。据设想，公开的药物组合物除了本公开所述的细胞外，还可能进一步包括生物活性物质，这取决于药物组合物的预期用途。
IV.组合疗法
在涉及针对HPV抗原产生的CTL的公开的某些实施方式中，本公开在临床方面的方法与在治疗增生性疾病方面有效的其他药剂(如抗癌药剂)相结合。“抗癌”剂能够对受试者的癌症产生负面影响，通过例如杀死癌细胞，诱导癌细胞的凋亡，减缓癌细胞的生长速率，减少转移的发生率或数量，减小肿瘤大小，抑制肿瘤生长，减少向肿瘤或癌细胞的血液供应，促进针对癌细胞或肿瘤的免疫反应，预防或抑制癌症的进展或延长癌症患者的寿命。更一般地，这些其他组合物可能以有效地杀死或抑制细胞增殖的组合量提供。这可以通过使癌细胞与包含两种药剂的单一组合物或药理制剂接触，或通过使癌细胞与两种不同的组合物或制剂同时接触来实现，其中一种组合物包括表达构建体，而另一种包含第二种药剂。在其他情况下，细胞和第二组合物的施用可以是分开的，并且可以具有分开的施用途径和/或载体。
肿瘤细胞对化疗和放疗药物的耐药性是临床肿瘤学中的主要问题。当前癌症研究的一个目标是找到将化学疗法和/或放射疗法与其他疗法结合起来以提高其疗效的方法。在本公开的上下文中，考虑到细胞疗法可以类似地与例如化学疗法、放射疗法和/或免疫疗法干预结合使用。
或者，本发明的疗法可以在其他药剂治疗之前或之后，间隔从数分钟到数周，数月或数年不等。在将另一种药剂和本发明分别应用于个体的实施方案中，通常将确保在每次递送之间没有明显的时间间隔，使得药剂和本发明的疗法仍将能够发挥对细胞有利地组合作用。在这种情况下，可以设想用这两种方式在彼此约12-24小时内接触细胞，最好是在彼此约6-12小时内接触细胞。在某些情况下，可能需要显著延长治疗时间，但是，几天(2、3、4、5、6或7)到几周(1、2、3、4、5、6，7或8)耗费在每次治疗之间。
有望根据需要重复治疗周期。还预期可以将各种标准疗法以及外科手术干预与本发明的细胞疗法组合应用。
可以与从本公开内容的方法产生的细胞结合使用的与HPV相关的癌症治疗的示例(作为示例)至少包括以下内容：1)手术(肿瘤切除，颈部淋巴清扫，锥形切除术，子宫切除术等)；2)可能包括贝伐单抗(AvastinRo)、博来霉素(Bleomycin)、盐酸托泊替康(HycamtinoR)或其组合的药物治疗；3)放疗；4)除本公开内容之外的免疫疗法；5)激素疗法；或6)其组合。
V.本发明的试剂盒
试剂盒中可以包含本文所述的任何组合物。在非限制性示例中，试剂盒中可包含pepmix的文库，试剂盒中可提供的任何类型的细胞，和/或试剂盒中可提供用于操纵pepmix和/或细胞的试剂。试剂盒中可能包含细胞因子或产生它们的手段(例如编码它们的载体)。可以包括细胞培养试剂和/或装置。所述组分以适当的容器方式提供。
在一个实施方案中，试剂盒可包含一容器，该容器包含一定量的T细胞，该容器是通过本发明的方法制成的，该T细胞被配制用于向受试者(例如，通过与合适的运载体、赋形剂、稀释剂或佐剂混合)，优选通过输液，更优选通过自体过继细胞免疫疗法的方法输注给药。所述试剂盒可保持在预定温度，例如小于约4℃、小于约-2℃或小于约-50℃。试剂盒可进一步包括用于试剂盒的储存和/或运输和/或T细胞的施用的说明书。
所述试剂盒可包含本发明的适当等分的组合物。所述试剂盒的组分可以在水性介质中或以冻干形式包装。所述试剂盒的容器装置通常将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置，可以将组分放置在其中，并且优选适当地等分。如果试剂盒中有多个组件，则该试剂盒通常还将包含第二、第三或其他额外容器，可以将其他组件单独放入其中。然而，小瓶中可包含组分的各种组合。本发明的试剂盒通常还将包括一种用于密闭包装以用于商业销售的部件。这样的容器可以包括注射或吹塑的塑料容器，预期的小瓶保留在其中。
但是，试剂盒中的组件可能以干粉形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来复原。可以设想，溶剂也可以在另一个容器中提供。
在某些情况下，试剂盒中可能包含用于检测HPV感染的试剂和/或设备。示例包括拭子、刮刀、细胞刷、载玻片、盖玻片、细胞学样品收集容器等。试剂盒中可能还包含用于治疗HPV感染或癌症的其他药物，例如贝伐单抗、博来霉素、盐酸托泊替康或其组合。
VI.高IL-15
在本公开的方面的一些实施方式中，在IL-15的存在下进行刺激。在一些实施方式中，在IL-7和IL-15的存在下进行刺激。在一些实施方式中，仅在IL-7和IL-15的存在下进行刺激。在一些实施方式中，在IL-7和IL-15存在下且在IL-6和/或IL-12不存在下进行刺激。
在存在IL-15的情况下进行刺激的本公开的实施方式中，IL-15可能以大于15ng/ml的终浓度存在于培养物中。大于15ng/ml的最终IL-15浓度在本文中可被称为高IL-15。在一些实施方式中，IL-15可以20-1000ng/ml、20-900ng/ml、20-800ng/ml、20-700ng/ml、20-600ng/ml、20-500ng/ml、30-500ng/ml、40-500ng/ml、50-500ng/ml、50-400ng/ml、50-300ng/ml、50-200ng/ml、50-175ng/ml、50-150ng/ml、75-150ng/ml、75-125ng/ml、80-120ng/ml、90-110ng/ml或100ng/ml中的之一的终浓度存在于培养物中。特别是结合从CD45RA+细胞耗尽的细胞群(例如血细胞、免疫细胞或PBMC)内产生/扩增HPV特异性免疫细胞群的方法，考虑使用高IL-15的刺激。
使用高IL-15的刺激可提供有利的性能。例如，包括使用高IL-15刺激的方法可用于以提高的效率(例如在同一时间段内更大的倍数扩增)产生/扩增对HPV特异的免疫细胞群体。包括使用高IL-15进行刺激的方法可用于生成/扩增对HPV特异的免疫细胞群，其中包括数量/频率减少的不良免疫细胞亚群(例如NK细胞、调节性T细胞(Treg)和/或幼稚T细胞)，所需的免疫细胞亚群(例如CD8+ T细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞、CD4+ T细胞、CD4+ T辅助细胞、产生IFNγ的细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、抗原刺激过的T细胞、CD45RO+T细胞)的比例频率增加，和/或与根据现有技术方法产生/扩增的群体相比，在产生/扩增的群体中病毒和/或抗原特异性细胞的比例频率增加。
VII.HLA阴性LCL
在本公开的方面中，所述的刺激步骤中使用的共刺激细胞可以是缺乏I类MHC和/或II类MHC的基因和/或蛋白质表达的淋巴母细胞系(LCL)的细胞。在一些实施方式中，LCL可能缺乏I类MHC和II类MHC的表面表达；这样的LCL在本文中可以被称为“HLA阴性LCL”、“普通LCL”或“ULCL”。
可以通过B细胞的病毒转化来制备LCL。LCL通常通过用爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)转化B细胞来产生。LCL的生成和特征在例如Hui-Yuen等人，J Vis Exp(2011)57：3321，以及Hussain和Mulherkar，Int J Mol Cell Med(2012)1(2)：75-87中有详细描述，两者均通过引用整体并入本文。简而言之，在环孢菌素A存在下，用产生EBV的细胞(例如B95-8细胞)的浓缩培养上清液孵育PBMC可以产生LCL。
HLA阴性LCL可能缺少MHC I类多肽和MHC II类多肽的表面表达。“MHC I类多肽”是指MHC I类分子的组成多肽(即MHC I类链多肽和B2M多肽的多肽复合物)。“MHC II类多肽”是指MHC II类分子的组成多肽(即MHC II类α链多肽和MHC II类β链多肽的多肽复合物)。表面表达是指在细胞表面(即在细胞膜中或在细胞膜上)可检测到的相关多肽/多肽复合物的表达。例如，当多肽/多肽复合物在细胞表面表达时，可以在完整的细胞上使用针对该多肽/多肽复合物位于细胞外的某个区域的抗原结合分子来分析其表面表达。
在一些实施方式中，HLA阴性LCL基本上不显示I类MHC和II类MHC的基因/蛋白质表达，例如通过检测基因和/或蛋白质表达的合适方法所确定。在一些实施方式中，HLA阴性LCL基本上不显示I类MHC和II类MHC的表面表达，例如通过使用能够结合I类MHC的抗体和能够结合II类MHC的抗体通过流式细胞术分析所确定。在此类测定中，相关抗体对HLA阴性LCL的染色水平可能不会明显大于相同同型的适当阴性对照抗体对细胞的染色水平。
HLA阴性LCL可以通过修饰(例如，通过插入、取代或缺失一个或多个核苷酸来修饰核酸)来减少/防止I类MHC的一种或多种多肽的基因和/或蛋白表达而获得分子和MHC I类分子(例如B2M多肽、MHC I类α链多肽(例如HLA-A、HLA-B或HLA-C)、MHC II类α链多肽(例如HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQA2或HLA-DRA)和/或MHC II类β链多肽(例如HLA-DPB1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4或HLA-DRB5))获得。在某些实施方式中，HLA阴性LCL包含与未修饰LCL的基因和/或蛋白质表达相比，减少/防止MHC I类多肽(例如B2M)的基因和/或蛋白质表达的修饰，以及减少/防止一种或多种MHC II类多肽的基因和/或蛋白质表达(例如HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP)修饰。
在一些实施方式中，HLA阴性LCL包含减少/阻止B2M、HLA-DRA、HLA-DQA1、HLA-DQA2和HLA-DP的基因和/或蛋白质表达的修饰。在某些实施方式中，可以通过靶向敲除编码B2M、HLA-DRA、HLA-DQA1、HLA-DQA2和HLA-DP的基因，例如使用序列特异性核酸酶(SSN)；例如在Eid和Mahfouz，Exp Mol Med，2016年10月；48(10)：e265中综述了使用SSN进行基因编辑的情况，其通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，减少/防止I类MHC多肽(例如B2M)的基因和/或蛋白质表达的修饰，和/或减少/防止一种或多种II类MHC多肽的基因和/或蛋白质表达(例如HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP)的修饰，通过使用包含编码相关多肽的crRNA靶向核酸的系统实现。在一些实施方式中，通过顺序敲除编码B2M、HLA-DRA、HLA-DQA1、HLA-DQA2和HLA-DP的基因，获得HLA阴性LCL。在一些实施方式中，HLA阴性LCL还包含对编码一种或多种EBV复制最小化必需多肽的核酸的修饰。包含减少/预防EBV复制性最小化修饰的LCL在本文中可被描述为EBV复制缺陷。因此，在一些实施方式中，HLA阴性LCL是EBV复制缺陷的。在一些实施方式中，HLA阴性LCL包含对核酸的修饰(例如，通过插入、取代或缺失一个或多个核苷酸)，所述核酸编码BFLF1、BFLF2、BFRF1、BFRF2和BFRF3中的一个或多个，例如使用SSN。在一些实施方式中，HLA阴性LCL包含对编码BFLF1的核酸和/或编码BFRF1的核酸的修饰。在一些实施方式中，使用包含编码相关多肽的crRNA靶向核酸的CRISPR/Cas-9系统实现所述修饰。在一些实施方式中，通过包括在抑制病毒复制的试剂(例如阿昔洛韦)存在下培养的方法获得HLA阴性LCL。在一些实施方式中，与现有技术中描述的PBMC与LCL共培养后PBMC群体中B细胞的增殖水平相比，EBV复制缺陷型HLA阴性LCL与PBMC共培养后刺激PBMC群体中的B细胞增殖较少。在一些实施方式中，在与PBMC的共培养中，EBV复制缺陷型HLA-阴性LCL缺乏促进B细胞向外生长的能力。与缺乏减少/阻止EBV复制所需的一种或多种多肽的基因和/或蛋白质表达的修饰的LCL相比，具有减少/预防EBV复制所必需的一种或多种多肽的基因和/或蛋白质表达修饰的HLA阴性LCL可能具有更好的安全性。
本公开内容的HLA阴性LCL以共刺激细胞的方式使用，其中共刺激细胞通常用于产生/扩增病毒特异性T细胞的方法中。例如，HLA阴性LCL可以作为受辐照的细胞群提供，并且与应答细胞和抗原呈递细胞(APC)以适当比例提供。在一些实施方式中，在用于刺激之前，通过辐照或用物质(例如丝裂霉素C)处理HLA阴性LCL以防止其增殖。根据本方法的LCL的辐照通常在6000至12000rads。在一些实施方式中，HLA阴性LCL存在于包含应答细胞，APC和HLA阴性LCL的刺激中：应答细胞：APC：HLA阴性LCL为1：1：1至1：1：10之一，例如约为1：1：5。
本文描述的HLA阴性LCL可能具有与作为协同刺激细胞用于产生/扩大HPV特异性免疫细胞群的方法相关的优势特性。例如，HLA阴性LCL可用于以提高的效率(例如，在同一时间段内更大的倍数扩增)产生/扩增对HPV具有特异性的免疫细胞群。HLA阴性LCL可用于产生/扩展对HPV特异性的免疫细胞群体的方法，包括数量减少/频率减少的不良免疫细胞亚群(例如NK细胞、调节性T细胞(Treg)和/或幼稚T细胞)，所需的免疫细胞亚群(例如CD8+T细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞、CD4+ T细胞、CD4+ T辅助细胞、产生IFNγ的细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、抗原刺激过的T细胞、CD45RO+T细胞)的比例频率增加，和/或与根据现有技术方法产生/扩增的群体相比，在产生/扩增的群体中病毒和/或抗原特异性细胞的比例频率增加。
与用于产生/扩增HPV特异性免疫细胞群体的现有技术方法相比，HLA-阴性LCL可用于产生/扩增具有降低的同种反应性的HPV特异性免疫细胞群体。因此，HLA阴性LCL可用于产生/扩增用于自体和同种异体应用的HPV特异性免疫细胞群。在一些实施方式中，与HLA阳性LCL(即现有技术中所述的LCL)相比，在包含HLA阴性LCL和从同种异体供体获得的PBMC的共培养物中，HLA阴性LCL刺激PBMC的较少增殖。在一些实施方式中，与HLA阳性LCL相比，在包含HLA阴性LCL和从HLA匹配供体获得的PBMC的共培养物中，HLA阴性LCL刺激PBMC的较少增殖。
VIII.树突状细胞
在本公开的方面，本文描述的刺激步骤中使用的树突状细胞可以源自从受试者的血细胞群中获得的细胞。在一些实施方式中，树突状细胞源自外周血单核细胞(PBMC)群内的细胞。在一些实施方式中，树突状细胞源自PBMC群体中的CD14+阳性细胞。在一些实施方式中，树突状细胞是源自单核细胞的树突状细胞(在本文中也称为moDCs)。
在一些实施方式中，树突状细胞是通过包括将CD14+细胞与其他细胞(即，CD14-细胞)分离的方法获得的，例如从一群PBMC内分离。分离可以通过适当的正向或负向选择来进行。在一些实施方式中，可使用包被有能够特异性结合CD14的抗体的珠子从细胞群中正向选择CD14+阳性细胞。例如，可以使用CD14MicroBeads(米尔泰尼生物)通过MACS细胞分离来分离CD14+细胞。
在一些实施方式中，通过包括在促进未成熟树突状细胞(在本文中也称为iDC)从CD14+细胞分化的因子存在下培养细胞的方法获得树突状细胞。在促进iDCs分化的因子存在下培养的细胞可以是例如PBMC，或从一群PBMC中分离出的CD14+细胞。可以以任何合适的密度培养细胞，如0.1×106至1×106个细胞/ml，0.2×106至0.9×106个细胞/ml，0.3×106至0.8×106个细胞/ml，0.4×106至0.7×106个细胞/ml或0.5×106个细胞/ml。促进未成熟树突状细胞分化的因素可能包括IL-4和/或GM-CSF。在一些实施方式中，培养物包含IL-4和GM-CSF。IL-4可以以50-1000IU/ml、100-800IU/ml、150-700IU/ml、200-600IU/ml、250-500Iu/ml、300-500IU/ml或400IU/ml的终浓度之一存在于培养物中。GM-CSF可以100-1500IU/ml、200-1400IU/ml、300-1300IU/ml、400-1200IU/ml、500-1100IU/ml、600-1000IU/ml、700-900IU/ml或800IU/ml之一的终浓度存在于培养物中。该培养可以持续任何合适的时间以分化未成熟的DC，例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天之一。
在一些实施方式中，本文所述的刺激步骤中使用的树突细胞是通过包括将细胞(即成熟树突状细胞的前体细胞，例如未成熟树突状细胞)培养至成熟树突状细胞的方法获得的。在一些实施方式中，该方法包括在促进成熟DCs(例如，moDCs)分化的因子存在下培养细胞。在促进成熟DCs分化的因子存在下培养的细胞可以是，例如，PBMC、从PBMC群体中分离(即分离和/或纯化)的CD14+细胞或未成熟树突状细胞(iDC)。可以以任何合适的密度培养细胞，如0.1×106至1×106个细胞/ml，0.2×106至0.9×106个细胞/ml，0.3×106至0.8×106个细胞/ml，0.4×106至0.7×106个细胞/ml或0.5×106个细胞/ml。促进未成熟树突状细胞向成熟DC分化的因子可能是GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1、CD40L、聚(I:C)、MPLA、瑞西莫德(Resiquimod)、IFNα、IFNγ或AmpB。在一些实施方式中，培养物包含IL-4和GM-CSF。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα和PGE-1。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1，IL-6和TNFα。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1和CD40L。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα和CD40L。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1和聚(I:C)。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1§、IL-6、TNFα和聚(I:C)。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1和MPLA。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα和MPLA。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1和瑞西莫德。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα和瑞西莫德。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1和IFNα。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα和IFNα。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1和IFNγ。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα和IFNγ。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1、IFNα和IFNγ。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、IFNα和IFNγ。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、PGE-1、聚(I:C)和MPLA。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα、聚(I:C)和MPLA。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、MPLA和IFNγ。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF和IFNα。在一些实施方式中，培养物包含GM-CSF、IL-4、IFNγ和AmpB。IL-4可能以50-1000IU/ml、100-800IU/ml、150-700IU/ml、200-600IU/ml、250-500IU/ml、300-500IU/ml或400IU/ml的终浓度之一存在于培养物中。GM-CSF可能以100-1500IU/ml、200-1400IU/ml、300-1300IU/ml、400-1200IU/ml、500-1100IU/ml、600-1000IU/ml、700-900IU/ml或800IU/ml中的终浓度之一存在于培养物中。IL-1β可能以1-100pg/ml、1-75pg/ml、5-50pg/ml、5-40pg/ml、5-30pg/ml、5-25pg/ml、5-20pg/ml、5-15pg/ml或10pg/ml的终浓度之一存在于培养物中。IL-6可能以10-1000pg/ml、10-750pg/ml、50-500pg/ml、50-400pg/ml、50-300pg/ml、50-250pg/ml、50-200pg/ml、50-150pg/ml或100pg/ml的终浓度之一存在于培养物中。TNFα可能以1-100pg/ml、1-75pg/ml、5-50pg/ml、5-40pg/ml、5-30pg/ml、5-25pg/ml、5-20pg/ml、5-15pg/ml或10pg/ml的终浓度之一存在于培养物中。PGE-1可能以0.1-10ng/ml、0.1-7.5ng/ml、0.5-5ng/ml、0.5-4ng/ml、0.5-3ng/ml、0.5-2.5ng/ml、0.5-2ng/ml、0.5-1.5ng/ml或1ng/ml的终浓度之一存在于培养物中。CD40L可能以10-1000pg/ml、10-750pg/ml、50-500pg/ml、50-400pg/ml、50-300pg/ml、50-250pg/ml、50-200pg/ml、50-150pg/ml或100pg/ml的终浓度之一存在于培养物中。聚(I:C)可能以0.1-10μg/ml、0.1-7.5μg/ml、0.5-5μg/ml、0.5-4μg/ml、0.5-3μg/ml、0.5-2.5μg/ml、0.5-2μg/ml、0.5-1.5μg/ml或1μg/ml的终浓度之一存在于培养物中。MPLA可能以0.1-10μg/ml、0.1-7.5μg/ml、0.5-5μg/ml、0.5-4μg/ml、0.5-3μg/ml、0.5-2.5μg/ml、0.5-2μg/ml、0.5-1.5μg/ml或1g/ml的终浓度之一存在于培养物中。瑞西莫德可能以0.1-10μg/ml、0.1-7.5μg/m、0.5-5μg/ml、0.5-4μg/ml、0.5-3μg/ml、0.5-2.5μg/ml、0.5-2μg/ml、0.5-1.5μg/ml或1g/ml的终浓度之一存在于培养物中。IFNα可能以10-1000ng/ml、10-750ng/ml、50-500ng/ml、50-400ng/ml、50-300ng/ml、50-250ng/ml、50-200ng/ml、50-150ng/ml或100ng/ml的终浓度之一存在于培养物中。IFNγ可能以10-1000ng/ml、10-750ng/ml、50-500ng/ml、50-400ng/ml、50-300ng/ml、50-250ng/ml、50-200ng/ml、50-150ng/ml或100ng/ml的终浓度之一存在于培养物中。AmpB可能以0.1-10μg/ml、0.1-7.5μg/ml、0.5-5μg/ml、0.5-4μg/ml、0.5-3μg/ml、0.5-2.5μg/ml、0.5-2μg/ml、0.5-1.5μg/ml或1μg/ml的终浓度之一存在于培养物中。培养可以进行任何合适的时间段，以分化成熟的DC，例如6小时至5天、12小时至4天、12小时至72小时、12小时至48小时、12小时至36小时或24小时之一。在一些实施方式中，用于刺激的树突状细胞通过包括在GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα和CD40L存在下培养未成熟DC的方法获得。在一些实施方式中，用于刺激的树突状细胞是通过包括在GM-CSF、IL-4、MPLA和IFNγ存在下培养未成熟DC的方法获得的。
与根据现有技术中公开的方法通过培养获得的树突状细胞相比，根据本文所述的方法通过培养获得的树突状细胞可以表现出更高的CD80和/或CD83表面表达。与根据现有技术中公开的方法通过培养获得的树突细胞群体相比，根据本文所述的方法通过培养获得的树突状细胞群体可以包含更高比例的显示CD80和/或CD83表面表达的细胞。
本文所述方法培养获得的树突状细胞可以提供与在扩增HPV特异性免疫细胞的方法中用作抗原呈递细胞(APC)有关的有利特性。例如，DC可用于以提高的效率(例如在同一时间段内更大的倍数扩增)产生/扩增对HPV特异的免疫细胞群。按照本文描述的方法培养获得的DC可用于产生/扩增对HPV具有特异性的免疫细胞群体的方法，所述免疫细胞包括数量/频率减少的不良免疫细胞亚群(例如NK细胞、调节性T细胞(Treg)和/或幼稚T细胞)，所需的免疫细胞亚群(例如CD8+ T细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞、CD4+ T细胞、CD4+ T辅助细胞、产生IFNγ的细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、抗原刺激过的T细胞、CD45RO+T细胞)的比例频率增加，和/或与根据现有技术方法产生/扩增的群体相比，在产生/扩增的群体中病毒和/或抗原特异性细胞的比例频率增加。
VIII.CD45RA+细胞耗竭
在本公开的各方面，HPV特异性免疫细胞群是从耗尽了CD45RA+细胞的细胞群体(例如血细胞、免疫细胞或PBMC)，即CD45RA-细胞群中产生/扩增的。在一些实施方式中，HPV特异性免疫细胞群是从耗尽了CD45RA+细胞的PBMC细胞群中产生/扩增的。在一些实施方式中，可以通过将CD45RA-细胞与其他细胞(即CD45RA+细胞)分离来实现CD45RA+细胞的消耗。分离可以通过适当的正向或负向选择来进行。在一些实施方式中，可使用包被有与CD45RA特异性结合能力的抗体珠子将CD45RA-细胞与CD45RA+细胞分离。例如，可以使用CD45RAMicroBeads(Miltenyi Biotec)通过MACS细胞分离将CD45RA-细胞与CD45RA+细胞分离。在一些实施方式中，细胞群可以另外消耗CD14+细胞。
CD45RA+细胞的耗尽可能会去除NK细胞、Treg和/或幼稚T细胞，从而防止了根据本发明在刺激过程中这些细胞类型的大量生长。CD45RA+细胞的耗竭也可以丰富CD45RO+细胞和/或抗原刺激过的T细胞的初始细胞群，从而促进根据本公开的刺激中这些所需细胞类型的优先扩增。
在一些实施方式中，尤其是在一种或多种刺激中使用IL-7和IL-15的方法中，尤其是在使用高浓度IL-15(即浓度大于15ng/ml，例如＝100ng/ml)的方法中，因为此类方法可能特别容易引起NK细胞生长问题。还特别考虑了在扩增中使用的起始细胞群中CD45RA+细胞的耗竭，特别是在用于产生/扩增HPV特异性免疫细胞群的方法中，采用K562cs共刺激细胞的方法中，和/或其中HPV特异性免疫细胞从患者获得的免疫细胞(例如PBMC)群体(例如患有HPV相关疾病的患者)中扩增而来的方法中。
从耗竭了CD45RA+细胞的细胞群(例如血细胞、免疫细胞或PBMC)中扩增HPV特异性免疫细胞群可能比现有技术产生/扩增HPV特异性免疫细胞群的优势更大。例如，耗尽CD45RA+细胞的免疫细胞群可用于以提高的效率(例如，在同一时间段内更大的倍数扩展)产生/扩增对HPV具有特异性的免疫细胞群。耗尽CD45RA+细胞的免疫细胞群(例如，耗尽CD45RA+细胞的PBMC)可用于生成/扩展对HPV特异的免疫细胞群的方法，该方法包括减少数量/频率的不良免疫细胞亚群(例如NK细胞、调节性T细胞(Tregs)和/或幼稚T细胞)，所需免疫细胞亚群(例如CD8+ T细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞、CD4+ T细胞、CD4+ T辅助细胞、产生IFNγ的细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、抗原刺激过的T细胞、CD45RO+T细胞)的比例频率增加，和/或与根据现有技术方法产生/扩增的群体相比，在产生/扩增的群体中病毒和/或抗原特异性细胞的比例频率增加。
IX.同种异体和自体应用
本文所公开的方法是在产生/扩增用于自体和异体应用的hpv特异性免疫细胞(例如细胞免疫疗法)的背景下所考虑的。根据本文公开的方法制备的对HPV具有特异性的免疫细胞群可以在其扩增后使用，或者可以冷冻以备之后使用。
在一些实施方式中，制备了对HPV具有特异性的免疫细胞产生/扩增细胞群以用于受试者，从该受试者中获得/衍生产生/扩增该免疫细胞群的初始群体。在一些实施方式中，制备针对HPV特异性的免疫细胞产生/扩增的细胞群，以用于任何受试者，例如，从该受试者获得/衍生产生/扩增的免疫细胞初始群的不同受试者。
因此，在一些实施方式中，将所产生/扩增的对HPV特异性的免疫细胞群体过继转移至受试者，从中获得/衍生产生/扩增该群体的免疫细胞的初始群体。在一些实施方式中，对HPV具有特异性的所产生/扩增的免疫细胞群体被过继转移至与该受试者不同的受试者，从该受试者中获得/衍生了从其产生/扩增该群体的免疫细胞的初始群体。
实施例
提供以下示例，以更全面地说明本发明的优选实施方式。但是，它们不应被解释为限制本发明的广泛范围。
实施例1
治疗性T细胞的生产
在本公开的某些实施方式中，存在一种机制，通过该机制可以快速生成单一制备的T细胞，包括对源自一个或多个可能致命的人类乳头瘤病毒的多种抗原始终具有特异性的多克隆(例如CD4+和CD8+)CTL。本公开易于适应临床实施，并且可以用作“现成的”HPV抗病毒剂。所述方法和组合物易于适应临床实施，并且可用作个体的安全有效的HPV抗病毒剂。
在特定的实施方式中，在存在或不存在特定辅助细胞因子的情况下，外周血T细胞用单核细胞衍生的装载有跨越E6/E7的pepmixs[15-mers重叠11个氨基酸(aa)的15-mers肽库]的树突状细胞刺激。所得的T细胞系用载有pepmix的活化B细胞原始细胞进一步扩增。来自8/16宫颈癌和33/52口咽癌患者的E6特异性/E7特异性T细胞成功激活和扩增(大于1200倍)。
在所述方法的特定实施方式中，细胞因子白介素(IL)-6、IL-7、IL-12和IL-15的存在可用于该方法。产生的T细胞系具有多克隆性的理想特征，多个T细胞亚群表示(包括记忆区)和TH1型偏移，并消除了E6/E7靶标。本公开表明，有可能从患有HPV16相关癌症的患者中稳健地产生HPV16 E6/E7定向的T细胞系。因为该技术是可扩展的并且符合良好的生产程序，所以这些细胞系可用于HPV16癌症患者的过继细胞免疫治疗，也可应用于HPV18癌症。
已知的生产HPV16T细胞的方法在图1中进行了说明。图1A显示了3名与HPV相关的癌症患者的结果(在仅载有HPV16-pepmix的DC刺激PBMC后获得的细胞系中获得的γIFNELISpot测定)。在图1B中，显示了2名患者的结果，其结果也在图1A中得到证实。除了第三个个体之外，图1B显示了用载有HPV16-pepmix和HPV18-pepmix的DC刺激PBMC后获得的细胞系的γIFN ELISpot测定结果。可以检测到针对HPV16和HPV18抗原的反应性(并非所有患者都对两种血清型都有反应性)。
转向方法的特定内容，在某些情况下，DC会装载HPV16-E6/E7和HPV18-E6/E7pepmix文库。在这种情况下，细胞系能够识别HPV16和HPV18 E6和E7抗原(例如，而不是仅HPV16抗原)。在至少某些情况下，T细胞的扩增在存在IL-7和IL-15但不存在IL-2的情况下发生。在该方法的条件下，IL-7和IL-15的存在可能会也可能不会在刺激和扩增的每个步骤中出现。在一些实施方式中，HPV特异性T细胞在初始DC增殖后的扩增不是在IL-15的情况下用载有pepmix的自体B原始细胞发生的，而是利用载有pepmix的自体多克隆活化的T细胞，在共刺激细胞(CD80/CD86/CD83/4-1BBL)，以及IL-7和IL-15的存在下发生的。利用这些条件，T细胞的扩增以更快的速率发生，至少是通过已知方法获得的10倍，并且在3轮刺激后成功地进行了证明，并且没有丧失特异性。
表2提供了使用已知方法对3例与HPV相关的癌症患者进行的细胞扩增倍数的总结。
表3显示了使用本公开内容的新方法对3例HPV相关癌症患者进行的细胞扩增倍数的总结。3轮刺激后的扩增倍数比使用已知方法平均高出约50倍。并保持了特异性(在#1中说明)。
实施例2
HPV T细胞扩增方法
HPV刺激的T细胞(HPVST)首先由添加了HPV E6/E7肽的自体树突状细胞(DC)以PBMC：DC为10-20：1的比率激活，并在含有IL-6(100ng/ml)、IL-7(10ng/ml)、IL-12(10ng/ml)、IL-15(10ng/ml)的培养基中培养8天(例如，按照Ramos等人在(J Immunother 2013；36：66-76)中描述的第一个刺激步骤进行)。
在含有IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)的培养基中，使用添加了肽的DC细胞以5-10：1的PBMC：DC比率进行第9天的第二个刺激步骤。
然后，在同等数量的被辐照的同种异体K562-cs共同刺激细胞的存在下，使用添加了HPV E6/E7肽的自体T-APC以1：1的比例，以及含有IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)的培养基中进行随后的每周刺激/扩增步骤，以达到所需数量的HPVST。多克隆T细胞(T-APC)是使用从经静脉抽取的血液中分离的一部分自体PBMC产生的。通过在涂有抗CD3和抗CD28抗体的细胞培养板中培养来激活细胞。之后在IL-2存在下培养细胞使其扩增2周。可以将扩增的T-APC冷冻保存以备后用。在使用T-APC进行HPVST再刺激(HPVST再刺激的第三个周期及以后)的2-3天之前，将冻存的细胞融化并在抗CD3和抗CD28抗体包被的细胞培养板中再次刺激。在HPVST再刺激的那当天，收获T-APC细胞并用HPV E6/E7肽处理，然后以1：1的比例添加到正在进行的HPVST培养物中。
实施例3
人类患者输注HPVST的体内扩增和持久性
使用TGF-β的显性负性受体(DNRII)转导从实施例2获得的HPVST[参见Foster等人，用TGF-β显性负性受体转导的EBV特异性T淋巴细胞的抗肿瘤活性，J Immunother.，2008；31:500-505]。
HPVST被施用于两名人类患者，并进行了体内的扩增和持久性测试。1号患者患有广泛转移的口咽癌，并已停止先前的治疗。2号患者的口咽癌转移至颈部，正在接受伴随的纳武利尤(nivolumab)单抗治疗，而对单独使用纳武利尤单抗没有响应。
通过对从患者外周血分离的PBMC中进行的DNRII基因进行qPCR，评估了注入的HPVST在体内的扩展和持久性。图2和图3中的数据点代表了HPVST输注后的关键输注后间隔。
在1号患者中观察到了连续扩增(图2)。在2号患者中，尽管扩增受到限制(图3)，但在6周达到峰值与再次输注HPVST一致，但患者有部分临床反应。HPVST输注6周后，2患者患者通过PET扫描和体格检查显示与治疗前基线相比疾病负担下降(图4)。
实施例4
DC成熟的优化
血液样本是从肝素真空容器中的EBV反应性供体中收集的，PBMC通过Ficoll密度梯度离心从血液样本中分离出来。然后使用CD14MicroBeads(米尔泰尼生物)通过正向选择从PBMC中分离CD14+细胞。计算细胞数，并冷冻并保存CD14-细胞群。然后将CD14+细胞分化为未成熟的树突状细胞(iDC)。简而言之，将CD1+细胞以0.5×106个细胞/ml的浓度，在含有400IU/ml的IL-4和800IU/ml的GM-CSF的DC细胞培养基中，在24孔板的孔中培养5天。
然后根据下表4的1到20所示的条件之一，通过在DC细胞培养基中培养24小时使iDC成熟至成熟DC：
然后通过流式细胞术分析成熟的DC，以检测CD80、CD83、CCR7和PD-L1的表达。将先前冷冻的CD14-细胞部分解冻，并在细胞培养基中静置24小时。
然后将未成熟的DC和成熟的DC分别添加单个EBV抗原pepmixs(LMP1、LMP2、BRAF1或EBNA1)，然后用添加肽的DC通过在IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)存在下共培养9天来刺激自体CD14-细胞。然后通过流式细胞术分析扩增的T细胞群体的CCR7、CD45RO、EBV肽反应性表达和IFNγ的细胞内染色。
图5A和5B显示了根据实验条件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11(请参阅表4)培养后，来自供体1的CD14+PBMC的单核细胞衍生DC的CD83、CD80、CCR7和PD-L1表达。
图6A和6B显示了CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的CCR7和CD45RO表达，这些细胞是根据实验条件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11培养的EBV肽添加的成熟树突细胞刺激源自供体1的自体CD14-PBMC 9天后获得的。对于扩增的T细胞群体，未观察到T细胞记忆表型的主要差异。
图7显示了用根据实验条件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11培养的EBV肽添加的成熟DC刺激源自供体1衍生的自体CD14-PBMC 9天后获得的病毒特异性T细胞总数。
图8显示了用根据实验条件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11培养的EBV肽添加的成熟DC刺激源自供体1衍生的自体CD14-PBMC 9天后获得的IFNγ+CD8+ CTL和IFNγ+CD4+ Th细胞的比例，由ELISPOT分析确定。对于在没有EBV肽刺激的情况下在对照条件下获得的背景信号，要减去所示的频率。
图9显示了根据实验条件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11培养的EBV肽添加的成熟DC刺激来源自供体1的自体CD14-PBMC 9天后获得的EBV抗原反应性IFNγ+CD8+ CTL和IFNγ+CD4+ Th细胞的比例，由ELISPOT分析确定。对于在没有EBV肽刺激的情况下在对照条件下获得的背景信号，要减去所示的频率。供体1对LMP2强烈反应。
图10显示了在不同实验条件下培养的EBV肽添加的成熟DC刺激源自供体1衍生的自体CD14-PBMC 9天后获得的病毒特异性T细胞总数和IFNγ+CD8+ CTL的比例。条件编号5(“CD40L wo”)被确定为有望进行进一步评估的候选条件，因为它的表现优于条件2(“标准PGE”)。
图11A和11B显示了根据实验条件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20培养后，源自供体2的CD14+PBMC的单核细胞衍生DC的CD83、CD80、CCR7和PD-L1表达。
图12A和12B显示了CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的CCR7和CD45RO表达，这些细胞是根据实验条件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20培养的EBV肽添加的成熟树突细胞刺激源自供体2的自体CD14-PBMC 9天后获得的。对于扩增的T细胞群体，未观察到T细胞记忆表型的主要差异。
图13显示了用根据实验条件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20培养的EBV肽添加的成熟DC刺激源自供体2衍生的自体CD14-PBMC 9天后获得的病毒特异性T细胞总数。
图14显示了根据实验条件1、2、3、12、13、14、15、16、17、18、19或20培养的EBV肽添加的成熟DC刺激源自供体2衍生的自体CD14-PBMC 9天后获得的IFNγ+CD8+ CTL和IFNγ+CD4+ Th细胞的比例，由ELISPOT分析确定。对于在没有EBV肽刺激的情况下在对照条件下获得的背景信号，要减去所示频率。
图15显示了根据实验条件1、2、3、12、13、14、15、16、16、17、18、19或20培养的EBV肽添加的成熟DC刺激源自供体2的自体CD14-PBMC 9天后获得的EBV抗原反应性IFNγ+CD8+CTL和IFNγ+CD4+ Th细胞的比例，由ELISPOT分析确定。
对于在没有EBV肽刺激的情况下在对照条件下获得的背景信号，要减去所示频率。供体2对LMP2强烈反应。
图16显示了在不同实验条件下培养的EBV肽添加的成熟DC刺激源自供体2衍生的自体CD14-PBMC 9天后获得的病毒特异性T细胞总数和IFNγ+CD8+ CTL的比例。条件编号18、19和20(“PolyIC MPLA wo”，“PolyIC MPLA PGE”和“MPLA IFNγ”)被认为是有望进行进一步评估的候选条件，因为它们的表现优于条件2(“标准PGE”)。
然后，发明人对四种最有前途的DC成熟条件5、18、19和20(参见表4)进行了进一步的研究，将其表征扩展到了来自三个不同供体的细胞。
图17A和17B显示了根据实验条件1、2、5、18、19和20培养后，来自三个不同供体的单核细胞衍生DC的代表性CD83、CD80、CCR7和PD-L1表达。图17C显示了CD80+CD83-DC的比例，图17D显示了CD80+CD83+DC的比例，图17E显示了PD-L1+DC的比例。
图18显示了使用根据实验条件2、5、18、19和20培养的EBV肽添加的成熟DC刺激来自三个不同供体的自体CD14-PBMC 9天后获得的病毒特异性T细胞总数。在不同条件下扩增的成熟DC具有总体相似的扩增水平。
图19显示了使用根据实验条件2、5、18、19和20培养的EBV肽添加的成熟DC刺激来自不同供体的自体CD14-PBMC 9天后获得的IFNγ+CD8+ CTL和IFNγ+CD4+ Th细胞的比例，由ELISPOT分析确定。对于在没有EBV肽刺激的情况下在对照条件下获得的背景信号，要减去所示频率。
图20显示了使用根据实验条件2、5、18、19和20培养的EBV肽添加的成熟DC刺激源自不同供体的自体CD14-PBMC 9天后获得的EBV抗原反应性IFNγ+CD8+ CTL和IFNγ+CD4+Th细胞的比例，由ELISPOT分析确定。对于在没有EBV肽刺激的情况下在对照条件下获得的背景信号，要减去所示频率。
图21显示了在不同的实验条件下培养的EBV肽添加的成熟DC刺激来自三个不同供体的自体CD14-PBMC 9天后获得的病毒特异性T细胞的总数，和IFNγ+T细胞的频率。
总体而言，结果表明DC成熟的最佳条件是在GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα和CD40L的存在下进行培养。另一个好的条件是在GM-CSF、IL-4、MPLA和IFNγ存在下进行培养。
实施例5
DC成熟的进一步优化
血液样本是从肝素真空容器中的EBV反应性供体中收集的，PBMC通过Ficoll密度梯度离心从血液样本中分离出来。然后使用CD14+微珠通过正向选择从PBMC中分离CD14+细胞。计算细胞数，并冷冻并保存CD14-细胞群。
然后将CD14+细胞分化为未成熟的树突状细胞(iDC)。简而言之，将CD14+细胞以0.5×106个细胞/ml的浓度在含有400IU/ml IL-4和800IU/ml GM-CSF的DC细胞培养基中，在24孔板的孔中培养5天。
然后根据下表5中1、2、21或25中所示的条件，通过在DC细胞培养基中培养24小时使iDC成熟到成熟DC。
然后通过流式细胞仪分析成熟的DC，以检测CD80、CD83、CCR7和PD-L1的表达。将先前冷冻的CD14-细胞部分解冻并在细胞培养基中静置24小时。
然后将未成熟的DC和成熟的DC分别添加单个EBV抗原pepmixs(LMP1、LMP2、BRAF1或EBNA1)，然后用添加肽的DC通过在IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)存在下共培养3天或9天来刺激自体CD14-细胞。然后通过流式细胞术分析扩增的T细胞群的CCR7、CD45RO、EBV肽反应性表达和IFNγ的细胞内染色。
与根据条件2成熟的DC相比，根据条件21和22成熟的DC预计具有更优越的性能。
实施例6
存在不同共刺激细胞的存在下，通过刺激培养扩增的病毒特异性T细胞的特征
本发明人接下来研究了在产生/扩增病毒特异性T细胞群的方法中，在刺激中使用K562cs细胞和HLA阴性LCL(在本文中也称为通用LCL(ULCL))作为共刺激细胞。简而言之，收获PBMC，并在存在IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)的情况下，添加与EBV抗原(EBNA-1、LMP-1、LMP-2和BARF-1)相对应的EBV pepmixs刺激EBV特异性T细胞的扩增。在第9天，此后每隔7天，用以下任一步骤进行再刺激：(i)在IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)的存在下，用添加EBV pepmix并受辐照的自体ATC，和在存在受辐照的K562-cs共刺激细胞的情况下，响应细胞：ATCs：K562-cs的比例为1：1：5，或者(ii)在IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml)的存在下，添加EBV pepmix并辐照的自体ATC，以及在受辐照的ULCL存在下，响应细胞：ATCs：ULCL的比例为1：1：5。
通过靶向敲除编码HLA I类和HLA II类分子的基因，可以获得缺乏HLA I类和HLAII类表面表达的LCL(即HLA阴性LCL)。对HLA阴性LCL进行进一步修饰，以敲除EBV复制所必需的基因。分析了三个不同的ULCL克隆(#4，#5和#13)。
图22A和22B显示了两个单独实验的结果，表明与ULCL相比，使用K562-cs细胞作为共刺激细胞扩增的细胞，培养细胞的整体倍数更高。然而，如图23A和23B所示，通过ELISPOT分析产生IFNγ的细胞数目，发现ULCL克隆#5扩增了更多数目的病毒特异性T细胞。
接下来，发明人通过使用特异性针对细胞表面标志物抗体的流式细胞术，分析了在使用K562-cs或ULCL作为共刺激细胞，在指定次数的刺激后扩增的不同细胞类型的比例。图32A至32C显示了来自代表性供体的散点图(n＝7)，其显示了扩增细胞群中CD3-CD56+ NK细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、γ-δT细胞和α-βT细胞的比例。在扩增的细胞群中发现了相似比例的CD3-CD56+ NK细胞(图24A)，而通过使用K562cs细胞刺激获得的细胞群，CD4+ T细胞在扩增的群体中的比例趋于降低(图24B)；而使用ULCL刺激刺激的细胞群中，αβT细胞的比例往往增加(图24C)。图25显示了与K562cs细胞刺激的表达相比，ULCL克隆#5和#13刺激γ-δTCR表达的表征的代表性结果。
接下来，本发明人通过使用ULCL克隆#5或#13或K562cs细胞通过第二次和第三次刺激结束时IFNγ产生的ELISPOT分析，分析了通过刺激而扩增的细胞群中抗原特异性T细胞的频率。从两个不同的供体获得的结果显示在图26A和26B中。其中，使用ULCL细胞作为共刺激细胞通过刺激使细胞扩增检测到更多病毒特异性细胞。图27A至图27D显示了使用ELISPOT分析确定的使用K562cs细胞、ULCL克隆#5或LCL作为共刺激细胞在指定次数的刺激后，对于四个不同供体而言，对于所示的EBV抗原具有特异性的每100,000细胞中的细胞数。
发明人将病毒特异性T细胞扩增的分析扩展到四个刺激，发现与使用K562cs细胞进行刺激相比，使用ULCL作为共刺激细胞的刺激扩增了包含更高比例的病毒特异性细胞的细胞群(图28A至28D)。并且发现ULCL克隆#4细胞与亲本ULCL克隆的细胞在扩增产生IFNγ的病毒特异性T细胞的能力方面没有显著差异(图29A和29B)。
在使用从两个不同供体获得的PBMC进行的进一步实验中，使用ULCL克隆#5进行刺激产生的细胞群包含产生IFNγ的病毒特异性T细胞，其频率高于使用K562cs细胞在刺激下扩增的细胞群中的频率(图30A和30B)，但两者具有相似的扩增倍数(图31A和31B)。
图32和33显示，与使用K562cs细胞扩增的细胞群相比，使用ULCL克隆#5扩增的细胞群中CD3+和CD56+细胞的比例没有显著差异，图34和35显示使用K562cs细胞扩增的细胞群扩大了中央存储细胞的比例。
图36A和36B显示了使用从另外两个供体获得的PBMC获得的实验结果，表明使用ULCL克隆#5刺激产生的细胞群包含产生IFNγ的病毒特异性T细胞的频率高于使用K562cs细胞刺激扩增的频率。在这些实验中，当将K562cs细胞用于刺激时，总体扩增倍数更高(图37A和37B)。图38和39显示，与使用K562cs细胞扩增的细胞群相比，使用ULCL克隆#5扩增的细胞群中CD3+和CD56+细胞的比例没有显著差异，图40和41显示使用K562cs细胞扩增的细胞群扩大了中央存储细胞的比例。
实施例7
在存在不同细胞因子组合和不同共刺激细胞的存在下，通过刺激培养扩增的HPV特异性T细胞的进一步表征
HPV刺激的T细胞(HPVST)首先由添加HPV E6/E7肽的自体树突状细胞(DC)以PBMC：DC比率10-20：1激活，并在含有IL-6(100ng/ml)、IL-7(10ng/ml)、IL-12(10ng/ml)、IL-15(10ng/ml)的培养基中培养8天(例如，按照Ramos等人在(J Immunother 2013；36：66-76)中描述的第一个刺激步骤进行)。
然后，按表6所示执行随后的每周再刺激步骤，共四个刺激：
在每次刺激结束时，对细胞进行计数，并通过流式细胞仪进行分析，以确定扩增后的细胞群中不同细胞类型的比例，然后通过ELISPOT分析来确定扩增后的细胞群中产生IFNγ的病毒特异性细胞的频率。
图42显示，通过在IL-6、IL-7、IL-12和IL-15存在下进行刺激的方法扩增的细胞群中HPV特异性T细胞的出现频率比仅在IL-7和IL-15存在下的进行刺激更高。与使用K562cs细胞作为共刺激细胞的方法相比，通过使用ULCLs作为共刺激细胞的方法扩增的细胞群中，HPV特异性T细胞的出现频率更高。
图43显示了根据不同方案扩增的细胞的整体扩增倍数。与在IL-6、IL-7、IL-12和IL-15存在下进行刺激的方法相比，仅在IL-7和IL-15存在下进行刺激的方法被发现能扩增更多的HPV特异性T细胞。与包括使用K562cs细胞作为共刺激细胞进行刺激的方法相比，包括使用ULCL作为共刺激细胞的进行刺激的方法显示出更多的HPV特异性T细胞扩增。
图44显示了在指定次数的刺激后，根据不同方案刺激的细胞CD3和CD56的表达。与在IL-6、IL-7、IL-12和IL-15存在下通过刺激扩增的细胞相比，仅在IL-7和IL-15存在下通过刺激扩增的细胞显示出具有更大比例的CD3+CD56-细胞。与使用K562cs作为共刺激细胞刺激扩增的细胞相比，使用HLA阴性LCL作为共刺激细胞刺激扩增的细胞显示出更大比例的CD3+CD56-细胞。
图45显示了在指定次数的刺激后，根据不同方案刺激的细胞CD4和CD8的表达。与仅在IL-7和IL-15存在下通过刺激扩增的细胞相比，在IL-6、IL-7、IL-12和IL-15存在下通过刺激扩增的细胞显示出更大比例的CD8+细胞。
图46显示了在指定次数的刺激后，根据不同方案刺激的细胞CD45RO和CCR7的表达。与在IL-6、IL-7、IL-12和IL-15存在下通过刺激扩增的细胞相比，仅在IL-7和IL-15存在下通过刺激扩增的细胞显示出具有更大比例的中央记忆(即CD45RO+CCR7+)细胞。
实施例8
从耗尽CD45RA+细胞的PBMC中产生病毒特异性T细胞
发明人研究了对扩增病毒特异性T细胞的方法的修改，以增加病毒特异性抗原特异性T细胞的频率并减少扩增细胞群中NK细胞的频率。
图47提供了此示例中用于生成病毒特异性T细胞的方法步骤的示意图。简而言之，在第0天，在存在IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml或5ng/ml)，或存在IL-4和IL-7的情况下，用病毒肽对PBMC(已耗竭CD45RA+细胞或未耗竭CD45RA+细胞)进行处理。在第9天，在存在辐照的HLA阴性LCL作为共刺激细胞的情况下，以及在存在IL-7(10ng/ml)和IL-15(100ng/ml或5ng/ml)，或存在IL-4和IL-7的情况下，使用添加肽的辐照自体抗原呈递激活的T细胞(ATC)再次刺激细胞。在第16天，收获细胞并进行分析。
图48显示了ELISPOT分析的结果，该结果表明，与使用IL-4和IL-7进行刺激的方法相比，使用IL-7和IL-15进行刺激的方法扩增了更高的频率的病毒特异性T细胞。
发现在IL-7和IL-15存在下进行刺激的方法能够从来自淋巴瘤患者的PBMC中扩增病毒抗原特异性T细胞(图49)。发现使用IL-15代替IL-4可增加患者EBV特异性T细胞中抗原特异性T细胞的频率。
对刺激中使用的最佳IL-15浓度的研究表明，与标准剂量相比，较高剂量的IL-15(100ng/ml)最适合增加病毒特异性T细胞的频率(100ng/mL相比标准剂量5ng/mL)——见图50。图51证明高剂量的IL-15增加了扩增的细胞群中中央记忆EBV特异性T细胞的比例。
本发明人接下来研究了如何使健康供体和淋巴瘤患者PBMC产生的扩增细胞群中的NK细胞生长最小化。发现在刺激中使用IL-15的方法中NK细胞的优先生长更高(在用IL-15和IL-7刺激获得的细胞群中NK细胞的数量似乎更大)。为了解决这个问题，研发了避免NK细胞过度生长的条件。首先研究了刺激之前PBMC中CD45RA+细胞的耗竭情况。CD45RA是幼稚T细胞的标志物，也可以在天然T调节细胞和NK细胞上表达，因此有理由认为，耗竭CD45RA+细胞会从初始PBMC群体中去除NK细胞。CD45RA+细胞的耗竭还去除了可以抑制抗原特异性T细胞(特别是在癌症患者中)生长的T调节细胞，还去除了可以作为旁观者细胞生长并稀释抗原特异性T细胞的幼稚细胞。耗竭可以通过任何合适的方法来实现，例如使用磁性标记和分离(例如，使用MiltenyiOR Biotec色谱柱)。也可能使用抗体通过磁珠或纳米气泡来消耗细胞。
用于从CD45RA耗竭的PBMC中产生pepmix激活的EBV特异性T细胞的过程如图53所示。如图所示，总体PBMC细胞群中的CD45RA(或出于比较目的，为CD45RO)被耗尽，并且从第0天或第1天开始，在存在IL-7和IL-15的情况下，将第一次刺激(S1)的EBVpepmix加入到耗竭的细胞中以产生EBVST。在S1结束时和第二次刺激S2开始时(例如，在第8天到第10天之间)，将EBVSTs暴露于足量的EBV-Pepmix添加的ATC和足量的共刺激细胞(如K562cs细胞)中，在存在IL-7和IL-15的存在，但不存在IL-2的情况下，以产生所需的pepmix激活的EBVST。图54显示了以下结果：发现CD45RA耗竭(健康供体的CD45RA+PBMC使用MiltenyiOR柱和GMP级CD45RA共轭珠子被耗竭)降低了扩增细胞群中CD3-CD56+NK细胞的频率，这与EBVST的增殖增加有关(图55)。图56显示了在第二个刺激步骤结束时，健康供体的CD45RA耗竭后，EBVSTs的扩增倍数增强。此外，还发现CD45RA耗竭可在第二次刺激结束时(例如，第16天)增强EBVST的抗原特异性(参见图57和58，均显示了健康供体的数据)。发现在第三次刺激后，由CD45RA+细胞耗竭的PBMC扩增产生的EBVSTs抗原特异性提高(图59)。
CD45RA耗竭的影响通过从淋巴瘤患者的PBMC扩增而获得的病毒特异性T细胞中表征，选择这些细胞是由于其未经耗竭的EBVSTs表现出高频率的NK细胞，或者是因为它们无法生长或显示抗原特异性。图60显示了五名淋巴瘤患者在第二个刺激步骤结束时的总NK细胞数，表明CD45RA耗竭减少了淋巴瘤患者EBVST中NK细胞群的生长，并且这种耗竭增加了抗原特异性T细胞的频率(通过第二次刺激结束时的IFN-γ释放的ELIspot分析进行说明；图61)。该实验在没有树突状细胞的情况下进行第一次刺激(即，将CD45RA+细胞耗竭的PBMC直接与EBVPepmix接触)。与使用健康供体的PBMC的方法观察到的结果相似，发现CD45RA耗竭可增加淋巴瘤患者EBVST的抗原特异性(图62)。图63显示了淋巴瘤患者的EBVST的增殖。此外，CD45RA耗竭增强了对添加pepmix的自体活化T细胞(aATC)的细胞溶解活性；在效应子与靶标的比率为20：1时观察裂解百分数(图64)。
尽管已经详细描述了本发明及其优点，但是应该理解，可以在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围的情况下，在此进行各种改变、替换和变更。而且，本申请的范围不旨在限于说明书中描述的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法和步骤的特定实施方式。作为本领域的普通技术人员将容易地从本发明的公开中理解过程、机器、制造、物质的组成、手段、方法或步骤，根据本发明，可以利用目前存在的或以后将要开发的、执行与本文所述的相应实施方式基本相同的功能或实现基本相同的结果。因此，所附权利要求旨在将这样的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤包括在它们的范围内。
Claims (51)
1.一种产生或扩增对HPV具有特异性的免疫细胞群的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：通过在呈递HPV抗原肽的抗原呈递细胞(APC)的存在下以及在HLA阴性LCL存在的情况下培养，刺激免疫细胞群，任选的为外周血单核细胞(PBMC)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述HLA阴性LCL是EBV复制缺陷的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞是活化的T细胞(ATC)，树突状细胞(DC)或B原始细胞(BB)。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述树突状细胞衍生自从外周血单核细胞(PBMC)群中分离的CD14+细胞。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中，所述树突状细胞通过以下方法从CD14+细胞衍生：在IL-4和GM-CSF的存在下培养所述CD14+细胞以产生未成熟的树突状细胞(iDC)。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述树突状细胞从CD14+细胞衍生的方法进一步包括通过在以下条件下培养来培养所述iDC以产生成熟的树突状细胞：(a)GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα和CD40L；(b)GM-CSF、IL-4、MPLA和IFNγ；(c)GM-CSF、IFNα；或(d)GM-CSF、IL-4、AmpB和IFNγ。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述树突状细胞通过包括在以下条件下进行培养的方法从未成熟DC(iDC)获得：(a)GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα和CD40L；(b)GM-CSF、IL-4、MPLA和IFNγ；(c)GM-CSF、IFNα；或(d)GM-CSF、IL-4、AmpB和IFNγ。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述刺激的免疫细胞群中的CD45RA+细胞被耗尽。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述刺激是通过在IL-7和IL-15的存在下培养来进行的，任选地，其中IL-15以大于15ng/mL的终浓度存在于所述培养物中。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述刺激通过在IL-4，IL-6，IL-7和IL-15存在下的培养来进行。
11.一种产生或扩增对HPV具有特异性的免疫细胞群的方法，其特征在于，包括在存在呈递HPV抗原肽的树突状细胞(DC)的存在下通过培养来刺激免疫细胞群，其中DC来自CD14+细胞,分离自PBMC群。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述树突状细胞衍生自CD14+细胞,通过包括在IL-4和GM-CSF的存在下培养所述CD14+细胞的方法产生未成熟树突状细胞(iDCs)。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述树突状细胞从CD14+细胞衍生的方法进一步包括通过在以下条件下的培养来培养所述iDC以产生成熟的树突状细胞：(a)GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα和CD40L；(b)GM-CSF、IL-4、MPLA和IFNγ；(c)GM-CSF、IFNα；或(d)GM-CSF、IL-4、AmpB和IFNγ。
14.一种产生或扩增对HPV具有特异性的免疫细胞群的方法，其特征在于，包括在呈递HPV抗原肽的树突细胞(DC)存在下通过培养刺激免疫细胞群，其中DC来源于未成熟的DC(iDC)，通过以下方法进行，所述方法包括在以下条件下进行培养：(a)GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα和CD40L；(b)GM-CSF、IL-4、MPLA和IFNγ；(c)GM-CSF、IFNα；或(d)GM-CSF、IL-4、AmpB和IFNγ。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述刺激包括在HLA阴性LCL存在下进行培养，任选地，其中所述HLA阴性LCL为EBV复制缺陷的。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，其中，所述刺激的免疫细胞群中的CD45RA+细胞被耗尽。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的方法，其中所述刺激是通过在IL-7和IL-15的存在下培养来进行的，任选地，其中IL-15以大于15ng/mL的终浓度存在于所述培养物中。
18.根据权利要求11至16中任一项所述的方法，其中，所述刺激通过在IL-4、IL-6、IL-7和IL-15存在下的培养来进行。
19.一种产生或扩增对HPV特异的免疫细胞群的方法，其特征在于，包括通过在呈递HPV抗原肽的抗原呈递细胞(APC)的存在下培养，刺激耗尽CD45RA+细胞的免疫细胞群。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述刺激包括在HLA阴性LCL存在下培养，任选地，其中所述HLA阴性LCL是EBV复制缺陷的。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞是活化的T细胞(ATC)、树突状细胞(DC)或B原始细胞(BB)。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述树突状细胞衍生自从PBMC群中分离的CD14+细胞。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，其中，所述树突状细胞通过以下方法从CD14+细胞衍生：在IL-4和GM-CSF的存在下培养所述CD14+细胞以产生未成熟的树突状细胞(iDC)。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述树突状细胞从CD14+细胞衍生的方法进一步包括通过在以下条件下的培养来培养所述iDC以产生成熟的树突状细胞：(a)GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα和CD40L；(b)GM-CSF、IL-4、MPLA和IFNγ；(c)GM-CSF、IFNα；或(d)GM-CSF、IL-4、AmpB和IFNγ。
25.根据权利要求21所述的方法，其中，所述树突状细胞通过包括在以下条件下进行培养的方法从未成熟DC(iDC)获得：(a)GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα和CD40L；(b)GM-CSF、IL-4、MPLA和IFNγ；(c)GM-CSF、IFNα；或(d)GM-CSF、IL-4，AmpB和IFNγ。
26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述刺激是通过在IL-7和IL-15的存在下的培养来进行的，任选地，其中IL-15以大于15ng/mL的终浓度存在于所述培养物中。
27.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中，所述刺激通过在IL-4、IL-6、IL-7和IL-15存在下的培养来进行。
28.一种产生或扩增对HPV具有特异性的免疫细胞群的方法，其特征在于，包括以下步骤:通过在存在HPV抗原肽的抗原呈递细胞(APC)以及在IL-7和IL-15存在下培养,刺激免疫细胞群。
29.根据权利要求28的方法，其中IL-15以大于15ng/ml的终浓度存在于培养物中。
30.一种产生或扩增对HPV具有特异性的免疫细胞群的方法，其特征在于，包括以下步骤:通过在存在HPV抗原肽的抗原呈递细胞(APC)以及在IL-4、IL-6、IL-7和IL-15存在下培养,刺激免疫细胞群。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述刺激包括在HLA阴性LCL存在下进行培养，任选地，其中所述HLA阴性LCL为EBV复制缺陷的。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞是活化的T细胞(ATC)、树突状细胞(DC)或B原始细胞(BB)。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述树突状细胞衍生自从PBMC群体中分离的CD14+细胞。
34.根据权利要求32或权利要求33所述的方法，其中，所述树突状细胞通过以下方法从CD14+细胞衍生：在IL-4和GM-CSF的存在下培养所述CD14+细胞以产生未成熟的树突状细胞(iDC)。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述树突状细胞从CD14+细胞衍生的方法进一步包括通过在以下条件下的培养来培养所述iDC以产生成熟的树突状细胞：(a)GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα和CD40L；(b)GM-CSF、IL-4、MPLA和IFNγ；(c)GM-CSF、IFNα；或(d)GM-CSF、IL-4、AmpB和IFNγ。
36.根据权利要求32所述的方法，其中，所述树突状细胞通过包括在以下条件下进行培养的方法从未成熟DC(iDC)获得：(a)GM-CSF、IL-4、IL-1β、IL-6、TNFα和CD40L；(b)GM-CSF、IL-4、MPLA和IFNγ；(c)GM-CSF、IFNα；或(d)GM-CSF、IL-4、AmpB和IFNγ。
37.根据权利要求28至36中任一项所述的方法，其中，所述刺激的免疫细胞群中的CD45RA+细胞被耗尽。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞或树突状细胞加入的一种或多种肽对应于一种或多种HPV抗原。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述一种或多种HPV抗原选自E1、E2、E3、E4、E5、E6和E7。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其中，所述一种或多种HPV抗原是HPV16、HPV18、HPV1、HPV2和/或HPV3抗原。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中被刺激的免疫细胞群是在呈递HPV抗原肽的抗原呈递细胞存在的情况下通过培养对免疫细胞预先刺激而获得的，任选地，抗原呈递细胞来自于外周血单核细胞群。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括一个或多个其他步骤，所述步骤包括在存在呈递HPV抗原肽的抗原呈递细胞的存在下通过培养来刺激免疫细胞群。
43.一种对HPV特异的免疫细胞群，其中对HPV特异的免疫细胞群是根据权利要求1-42中任一项的方法获得的。
44.根据权利要求43的免疫细胞群在用于治疗或预防HPV相关疾病的方法中的用途。
45.根据权利要求43的免疫细胞群在制备用于治疗或预防HPV相关疾病的药物中的用途。
46.根据权利要求43或44所述的免疫细胞群的用途，或根据权利要求45所述的用途，其中所述治疗是通过过继细胞转移(ACT)治疗或预防HPV相关疾病的方法。
47.根据权利要求46所述的免疫细胞群的用途或所述的用途，其中通过ACT进行的治疗方法包括向受试者施用自体细胞或同种异体细胞。
48.一种在受试者中治疗或预防与HPV相关的疾病的方法，其特征在于，该方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的根据权利要求43所述的免疫细胞群。
49.一种在受试者中治疗或预防HPV相关疾病的方法，其特征在于，该方法包括：
(a)根据权利要求1-42中任一项的方法产生或扩增对HPV具有特异性的免疫细胞群，以及
(b)将治疗或预防有效量的在步骤(a)中获得的对HPV特异的免疫细胞群施用于受试者。
50.根据权利要求44至49中任一项所述的免疫细胞群的用途，用途或方法，其中与HPV相关的疾病是癌症。
51.根据权利要求50所述的免疫细胞群的用途，用途或方法，其中所述癌症选自子宫颈癌、肛门癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、口咽癌、鼻咽癌、喉乳头状瘤病、喉癌、头颈癌或任何部位的异型增生。
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| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20201113 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |