TW201814040A - Hpv專一性t細胞之產生技術 - Google Patents
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Abstract
本揭露內容的實施例係有關於供用於人類乳突病毒感染及其相關疾病的免疫療法之方法與組成物。在特定實施例中，該等方法係有關於產生靶向HPV16及/或HPV18的一或多種抗原之免疫細胞，及包括所具有的刺激步驟係採用IL-7與IL-15而非IL-6及/或IL-12之該等方法。其他的特定實施例係在特定細胞之存在下使用刺激作用，諸如共刺激細胞與特定的抗原呈現細胞之存在下。
Description
關於聯邦政府贊助的研究或開發之聲明 本發明係在美國國家癌症研究所院的P50 CA097007與PO1 CA94237項下的政府贊助下進行。美國政府對於本發明擁有一定的權利。
技術領域 本揭露內容係至少涉及免疫學、細胞生物學、分子生物學及包括癌症醫學在內的醫學領域。
背景 人類乳突病毒(HPV)係一種DNA病毒，其導致皮膚角質細胞或黏膜的增殖性感染。HPV的類型超過170種，HPV類型中的一子集係具致癌性，該等類型包括可發展成生殖器贅瘤之高風險的性傳染類型在內，該等生殖器贅瘤例如包括子宮頸上皮內贅瘤(CIN)、外陰上皮內贅瘤(VIN)、陰莖上皮內贅瘤(PIN)及/或肛門上皮內贅瘤(AIN)。當病毒序列被納入宿主細胞的細胞DNA時，則引發HPV誘發型癌症。部分的HPV“早期”基因諸如E6與E7係作用為致癌基因，而促進腫瘤生長與惡性轉化。
Ramos等人(於2013年期刊“JImmunother”第36卷第66-76頁乙文)述及供用於刺激末梢血液單核細胞而產生HPV16 E6與E7專一性T細胞之一種方法。簡言之，該方法係包含用樹突細胞刺激末梢血液單核細胞，其中該等細胞係在具有或不具有細胞介素IL-6、IL-7、IL-12及IL-15的組合物之CTL培養基中培養；第二刺激作用係在共培養中增補IL-2，及在IL-15存在下，每星期用加載肽混物(pepmix)的輔助性抗原呈現細胞(如B芽母細胞(B-blasts))進行刺激。根據該參考文獻之教導，為使得T細胞反應可供檢測，從病患樣本增生HPV專一性T細胞時需要細胞介素IL-6、IL-7、IL-12及IL-15的組合物。
本揭露內容紓解了HPV相關疾病治療領域中長期以來的需求，該等疾病至少包括例如該等HPV16與HPV18相關疾病。
發明概要 本揭露內容係有關於涉及免疫系統細胞之方法與組成物，該等免疫系統細胞係經改造而在免疫性上辨識特定標的。在一些實施例中，本揭露內容係有關免疫細胞(包括胞毒型T淋巴細胞(CTL及亦稱作胞毒型T細胞))之研發，該等免疫細胞係靶向在一個體中引發免疫反應之一生物部分。在特定實施例中，本揭露內容係有關研發靶向一種HPV抗原之胞毒型T細胞，及包括人類乳突病毒疾病相關抗原在內。在一些情況下，所產生的是胞毒型T細胞混合物，而該混合物係靶向一種以上的HPV抗原，及在一些情況包括一種以上的人類乳突病毒類型之一種以上的抗原在內。
本揭露內容的實施例係有關於對於感染HPV或罹患HPV相關疾病的個體提供治療之方法與組成物，HPV相關疾病例如包括癌症在內。“HPV相關疾病”可為HPV感染所引起或加劇之一疾病；HPV感染係其風險因子之一疾病及/或HPV感染與疾病發病、發展、進程或嚴重性呈現正相關之一疾病。HPV相關疾病可為本發明的方法與組成物對其提供治療效果(如抑制疾病的發展/進程、延遲/阻止疾病的發病、減輕疾病症狀的嚴重性、逆轉疾病症狀及/或提高存活率)之一疾病。本技術領域的嫻熟技術人員將明白本發明的方法與組成物之治療效用實質上擴及因感染HPV的細胞數目減少而獲益的任何疾病/病況。在特定實施例中，該揭露內容係有關於供用於過繼性細胞免疫治療(adoptive cellular immunotherapy)之方法與組成物，該細胞免疫療法可靶向HPV相關醫學病況(包括癌症在內)，如HPV16及/或HPV18相關醫學病況(包括癌症在內)，並且對其具有治療性。
就特定方面而言，本揭露內容係有關研發靶向來自人類乳突病毒如HPV16及/或HPV18的抗原之多種T細胞。本揭露內容係在用於產生具有對抗人類乳突病毒如HPV16及/或HPV18抗原的專一性之T細胞株之方法上，提供了顯著且並非平淡無奇之增進。
在本揭露內容的一些實施例中，一個體係需要本揭露內容的方法及/或組成物。在特定實施例中，一個體已暴露於人類乳突病毒如HPV16及/或HPV18(該個體可能察覺或未察覺其存在)；或者該個體疑似已暴露於人類乳突病毒如HPV16及/或HPV18，或具有暴露之風險。在特定實施例中，該個體已罹患或疑似罹患HPV相關疾病，或具有罹患之風險，如包括癌症在內之HPV16相關疾病及/或HPV18相關疾病。
在該方法的一部分之特定實施例中，特定人類乳突病毒如HPV16及/或HPV18的抗原係以跨越特定抗原的一部分或全部之一或多種肽的形式呈現於抗原呈現細胞。可按可稱作肽混物(pepmix)之肽混合物庫的形式，將抗原肽提供予抗原呈現細胞。就揭露內容的特定方面而言，將各種肽混物匯集，以供暴露於抗原呈現細胞。表現該等抗原的抗原呈現細胞可在特定條件下暴露於末梢血液T細胞，而導致對於特定HPV抗原專一性T細胞之刺激作用。
本揭露內容的一些方面與實施例係涉及產生及/或增生HPV專一性T細胞。
就第一方面而言，本揭露內容提供用於刺激末梢血液細胞及較佳末梢血液T細胞之一種方法，其中該方法係包括在介白素(IL)-7與IL-15存在下，及至少在一些情況下，在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。根據本申請案所揭露的各方面，當在一特定細胞介素“存在下”進行刺激/培養時，在該刺激作用/培養物中可能已添加該相關細胞介素(如重組型及/或外源性細胞介素)。當在一特定細胞介素“不存在下”進行刺激/培養時，則尚未在該刺激作用/培養物中添加該相關細胞介素(如重組型及/或外源性細胞介素)。
在一些實施例中，所提供之一種方法係產生供用於人類乳突病毒(HPV)相關疾病的治療性T細胞，該方法係包括在介白素IL-7與IL-15中的一或多者存在下，及至少在一些情況下，在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液T細胞之步驟，其中該刺激作用產生對於HPV相關疾病具治療性之T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
在一些實施例中，所進行刺激的末梢血液T細胞係從先前的末梢血液細胞刺激作用中獲得。先前的刺激作用可包括在IL-7與IL-15存在下，及至少在一些情況下，在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
因此，在刺激末梢血液T細胞之前，該等方法可進一步包括在IL-7與IL-15存在下，及至少在一些情況下，在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液細胞，以產生末梢血液T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
在一些實施例中，一或多種肽所包含的序列係對應於下列各者的至少部分序列：一或多種HPV16蛋白；一或多種HPV18蛋白；或者一或多種HPV16蛋白連同一或多種HPV18蛋白。在一些實施例中，一或多種肽所包含的序列係對應於蛋白E5、E6、E7、L1及L2中的一或多者。在一些實施例中，一或多種肽可為一肽庫，及包括E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及/或L2肽。
在一些實施例中，該方法可產生對於HPV或對於一種HPV抗原具專一性之免疫細胞，諸如T細胞。在一些實施例中，該方法可增生存在於末梢血液T細胞中之對於HPV或對於至少一種HPV抗原具專一性的T細胞群體。藉由本揭露內容的方法可產生之T細胞以外的免疫細胞，係包括自然殺手細胞與自然殺手T細胞。
在一些實施例中，抗原呈現細胞例如為活化型T細胞、樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或PBMC。
在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之末梢血液T細胞的刺激作用，係在至少IL-2不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之末梢血液T細胞的刺激作用，係在至少IL-4不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之末梢血液T細胞的刺激作用，係在至少IL-6不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之末梢血液T細胞的刺激作用，係在至少IL-12不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之末梢血液T細胞的刺激作用，係在至少IL-21不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之末梢血液T細胞的刺激作用，係在IL-6與IL-12不存在下進行。
在一些特定的實施例中，在本發明第一方面的方法中之細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。
在一些實施例中，末梢血液T細胞可存在於末梢血液單核細胞(PBMC)群體中，或從其中獲得或分離出來。群體中的PBMC可為非附著型PBMC。抗原呈現細胞例如可為活化型T細胞、樹突細胞、B芽母細胞或PBMC。
就第二方面而言，本揭露內容所提供之一種方法係用於刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞，其中該方法係包括在IL-7與IL-15存在下，及可選擇性地在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
在一些實施例中，所提供之一種方法係產生供用於人類乳突病毒(HPV)相關疾病的治療性T細胞，該方法包括在介白素IL-7與IL-15中的一或多者存在下，及可選擇性地在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞之步驟；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中該刺激作用所產生之T細胞係對於一或多種HPV相關疾病具治療性。
在一些實施例中，抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或末梢血液單核細胞(PBMC)。在特定實施例中，抗原呈現細胞係活化型T細胞。
在一些實施例中，共刺激細胞係選自由下列所組成之群組之一或多種細胞類型：CD80+細胞、CD86+細胞、CD83+細胞、4-1BBL+細胞、CD40+細胞、OX40+細胞及其組合。共刺激細胞可為CD80+/CD86+/CD83+/ 4-1BBL+細胞。
在一些實施例中，HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞之刺激作用並非第一刺激步驟。受刺激的T細胞可能是先前刺激作用的產物，先前刺激作用例如使用本揭露內容第一方面之方法。
在一些實施例中，一或多種肽所包含的序列係對應於下列各者的至少部分序列：一或多種HPV16蛋白；一或多種HPV18蛋白；或一或多種HPV16蛋白與一或多種HPV18蛋白。在一些實施例中，一或多種肽所包含的序列係對應於蛋白E5、E6、E7、L1及L2中的一或多者。在一些實施例中，一或多種肽可為一肽庫，及包括E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及/或L2肽。
在一些實施例中，該方法可產生HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞。在一些實施例中，該方法可增生HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞之群體。
在特定實施例中，HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞之刺激作用係包括在IL-7、IL-15存在下，及在一或多種類型的共刺激細胞之存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞。
在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之T細胞刺激作用係在IL-2不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之T細胞刺激作用係在IL-4不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之T細胞刺激作用係在IL-6不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之T細胞刺激作用係在IL-7不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之T細胞刺激作用係在IL-12不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之T細胞刺激作用係在IL-21不存在下進行。在一些實施例中，在本發明第一方面的方法中之T細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。
如本揭露內容第一與第二方面之方法可為產生供用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法。細胞刺激作用可產生對於HPV相關疾病具治療性之T細胞。
就第三方面而言，可將第一與第二方面的方法合併，而提供一種產生用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包括： 刺激末梢血液細胞及其較佳為末梢血液T細胞，其中該方法係包括在介白素(IL)-7與IL-15存在下，及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列； 在介白素(IL)-7與IL-15存在下，及可選擇性地在一或多種類型的共刺激細胞之存在下，用抗原呈現細胞刺激從(i)所獲得的T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
在一些實施例中，在步驟(ii)之前，從(i)所獲得的T細胞可在IL-7與IL-15存在下但並非在共刺激細胞存在下，及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，再度進行刺激。該再刺激作用可根據需要進行一、二、三、四、五或更多回合。
在一些實施例中，(i)中所用的抗原呈現細胞係樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或末梢血液單核細胞(PBMC)。在一些實施例中，(ii)中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或末梢血液單核細胞(PBMC)。在一些實施例中，(i)中所用的抗原呈現細胞係不同於(ii)中所用的抗原呈現細胞，雖然在特定情況下其等可能相同。在特定實施例中，(ii)中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞。
在一些實施例中，共刺激細胞係選自由下列所組成之群組之一或多種細胞類型：CD80+細胞、CD86+細胞、CD83+細胞、4-1BBL+細胞、CD40+細胞、OX40+細胞及其組合。共刺激細胞可為CD80+/CD86+/CD83+/ 4-1BBL+細胞。
在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-2不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-4不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-6不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-12不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-21不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。
在一些較佳實施例中，步驟(i)中的細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。
在一些實施例中，步驟(ii)中的細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。
因此，在一些實施例中，提供一種產生用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包括： (i)刺激末梢血液細胞，其中該方法係包括在介白素(IL)-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列； (ii)在介白素(IL)-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激從(i)所獲得的T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中可選擇性地重複進行(ii)一或多次；及 (iii)在IL-7與IL-15存在下，及可選擇性地在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激從(ii)所獲得的T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中可選擇性地重複進行(iii)一或多次。
在一些實施例中，(i)與(ii)中所用的抗原呈現細胞係樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或末梢血液單核細胞(PBMC)。在一些實施例中，(iii)中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或末梢血液單核細胞(PBMC)。在一些實施例中，(iii)中所用的抗原呈現細胞係不同於(i)及/或(ii)中所用的抗原呈現細胞。在較佳實施例中，(iii)中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞。
在較佳實施例中，(iii)中的刺激作用係在共刺激細胞存在下進行。在一些實施例中，共刺激細胞係選自由下列所組成之群組之一或多種細胞類型：CD80+細胞、CD86+細胞、CD83+細胞、4-1BBL+細胞、CD40+細胞、OX40+細胞及其組合。共刺激細胞可為CD80+/ CD86+/CD83+/4-1BBL+細胞。
在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-2不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-4不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-6不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-12不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-21不存在下進行。在一些實施例中，在IL-7與IL-15存在下之細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。
在一些實施例中，步驟(i)中的細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。在其他一些實施例中，步驟(i)中的細胞刺激作用係在IL-6與IL-12存在下進行。
在一些特定的實施例中，步驟(ii)中的細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。在一些特定的實施例中，步驟(iii)中的細胞刺激作用係在IL-6與IL-12不存在下進行。
在一些特定的實施例中，本揭露內容的方法係用於產生HPV16專一性及/或HPV18專一性T細胞。在一些特定的實施例中，本發明的方法係用於產生HPV16相關疾病專一性及/或HPV18相關疾病專一性T細胞。
在一些實施例中，可自一個體獲得末梢血液T細胞，該個體係已知感染或疑似感染HPV、感染HPV16或HPV18或者感染HPV16與HPV18二者。
在一些實施例中，可自一個體獲得抗原呈現細胞，該個體係已知感染或疑似感染HPV、感染HPV16或HPV18或者感染HPV16與HPV18二者。
在一些實施例中，可在不將該方法所產生的T細胞暴露於活化型B細胞之情況下，進行該方法，該活化型B細胞係先前已暴露於一肽庫。
在一些實施例中，就意欲用所獲得的治療性T細胞進行治療之一個體而言，抗原呈現細胞可為自體同源性或同種異體性。
在一些實施例中，一或多種肽所包含的序列係對應於下列各者的至少部分序列：一或多種HPV16蛋白；一或多種HPV18蛋白；或一或多種HPV16蛋白與一或多種HPV18蛋白。在一些實施例中，一或多種肽所包含的序列係對應於來自HPV16、HPV18或HPV16與HPV18的蛋白E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及/或L2中之 一或多者 。
在本揭露內容的實施例中，該等肽所包含的序列可對應於HPV蛋白E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及/或L2中的一或多者。在一些實施例中，該等肽所包含的序列可對應於一或多種HPV蛋白，如在原病毒嵌入後，在感染HPV的一細胞中所表現者(如E1、E2、E3、E4、E5、E6及/或E7)。在一些實施例中，該等肽所包含的序列可對應於一或多種轉形HPV蛋白(如E6及/或E7)。該等肽可對應於該HPV蛋白內所存在的一鄰接胺基酸序列。肽的長度可為至少或不超過8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸之長度，或為具有15個胺基酸之長度。該等肽的集合可形成一庫，及該庫中的肽可與其他肽在序列上有適當量的重疊，例如重疊3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個胺基酸。該等肽所包含的序列可對應於：a)HPV18E6蛋白及/或HPV18E7蛋白，及/或b)HPV16 E6蛋白及/或HPV16 E7蛋白。
在本揭露內容的實施例中，HPV可為HPV16或HPV18，或為二者。在涉及治療HPV相關疾病之實施例中，該疾病可為癌症，而該等肽所包含的一序列可對應於E6與E7中的一或二者。當該HPV相關疾病係一種癌前病灶時，該等肽所包含的序列可對應於E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及L2中的一者、多者或所有者。
可分離及/或純化藉由本揭露內容的方法所產生之T細胞，如從其他細胞中分離/純化出來。
在一些實施例中，對於已暴露於HPV或罹患HPV相關疾病的一個體，提供藉由本揭露內容的方法所產生之一治療有效量的T細胞。就一相關方面而言，藉由本揭露內容的方法所產生之T細胞係供用於治療HPV相關疾病。就另一相關方面而言，藉由本揭露內容之方法所產生的T細胞之用途，係供用於製造HPV相關疾病用的一治療藥物。
就本發明的一方面而言，所提供之T細胞係用於過繼性細胞免疫治療的一種方法，其中該等T細胞係藉由本申請案中所述之一種用於刺激末梢血液或T細胞的方法或一種產生治療性T細胞的方法獲得，或為藉由該方法可獲得者，或為該方法的產物；過繼性細胞免疫治療之方法係包括對於該個體投予T細胞。
就本發明的一方面而言，所提供的T細胞之用途係製造用於過繼性細胞免疫治療的一種方法之一藥物，該過繼性細胞免疫治療之方法係包括對於該個體投予T細胞，其中該等T細胞係藉由本申請案中所述之一種用於刺激末梢血液或T細胞的方法或一種產生治療性T細胞的方法獲得，或為藉由該等方法可獲得者，或為該等方法的產物。
就本發明的一方面而言，提供製備一藥學組成物、藥物或疫苗之一種方法，該方法係包括依據本申請案中所述的一種方法刺激末梢血液或T細胞，或者依據本申請案中所述的一種方法產生治療性T細胞，及將所得的細胞與一種藥學上可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑混合。
待治療的疾病可為贅生物(neoplasm)。該贅生物可為癌症。該癌症可為一種HPV陽性癌症，如一種HPV16陽性癌症及/或HPV18陽性癌症。
待治療的該個體可為人類。該個體可為一病患。該個體可能已經暴露於HPV，諸如HPV16、HPV18或HPV16與HPV18二者，或者罹患一種HPV、HPV16及/或HPV18相關疾病。該HPV、HPV16及/或HPV18相關疾病可為贅生物。該贅生物可為癌症。
癌症可為任何一種癌症。在一些實施例中，該癌症係子宮頸癌、肛門癌、陰門癌、陰道癌、陰莖癌或口咽癌。在一些實施例中，該癌症可為一種HPV相關癌症。“HPV相關癌症”可為HPV感染所引發或加劇之一癌症；HPV感染係其風險因子之一癌症；及/或HPV感染係與其發病、發展、進程、嚴重性或轉移正相關之一癌症。HPV相關癌症可為本發明的方法與組成物對其提供治療效果之一癌症(如抑制該癌症發展/進程、延遲/阻止該癌症發病、減少/延遲/阻止轉移、降低該癌症症狀的嚴重性、減少癌細胞的數目、縮小腫瘤尺寸及/或提高存活率)。在一些實施例中，該癌症係一種HPV相關的惡性腫瘤、HPV陽性口咽惡性腫瘤、HPV陽性子宮頸惡性腫瘤、HPV陽性肛門惡性腫瘤、HPV陽性陰門惡性腫瘤、鼻咽惡性腫瘤、HPV陽性陰莖惡性腫瘤、任一部位的HPV陽性發育異常或喉部乳突狀瘤病。
該個體或受試者可能已接受、正在接受或將接受一種附加的癌症療法。其他的癌症療法可為外科手術、放射線治療、荷爾蒙療法、化學療法、免疫療法或其組合。
該個體或受試者可能確定患有HPV相關癌症或HPV陽性癌症。該個體可能確定患有HPV16相關癌症或HPV16陽性癌症。該個體可能確定患有HPV18相關癌症或HPV18陽性癌症。該個體或受試者可為任何動物或人類。該個體或受試者較佳為哺乳類動物，更佳為人類。該個體或受試者可為人類以外的哺乳類動物，但更佳為人類。該個體或受試者可為雄性或雌性。該個體或受試者可為一病患。
如本揭露內容之涉及細胞刺激步驟的方法可在試管內或離體進行。“試管內”一詞係意欲涵蓋在實驗室條件或在培養中使用材料、生物物質、細胞及/或組織進行的研究。“離體”係指某事存在於或發生於一生物體之外，如在人體或動物身體之外，其可指在從該生物體所取出的組織(如整個器官)或細胞上。
在一實施例中，提供用於刺激末梢血液細胞之一種方法，該方法係包括在介白素(IL)-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種人類乳突病毒(HPV)蛋白的至少部分序列。可從末梢血液細胞的先前刺激作用獲得末梢血液T細胞，諸如其中末梢血液細胞的先前刺激作用係包括在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。在特定情況下，在刺激末梢血液T細胞之前，該方法進一步包括在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液細胞，以產生末梢血液T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
在一實施例中，提供一種產生用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包括下列步驟：在IL-7與IL-15中的一或多者存在下及在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液T細胞，其中該刺激作用產生對於HPV相關疾病具治療性之T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。可從末梢血液細胞的先前刺激作用獲得末梢血液T細胞，諸如其中末梢血液細胞的先前刺激作用係包括在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。在特定情況下，在刺激末梢血液T細胞之前，該方法進一步包括在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液細胞，以產生末梢血液T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
在本揭露內容所涵蓋方法的實施例中，抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞、B芽母細胞或末梢血液單核細胞。至少在一些情況下，末梢血液T細胞可存在於末梢血液單核細胞(PBMC)群體中，或從其中獲得或分離出來，而群體中的PBMC可為非附著型PBMC。當使用共刺激細胞時，該等共刺激細胞可為CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞或其組合。
在一特定實施例中，所提供之一種方法係用於刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞，該方法係包括在IL-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
在特定實施例中，所提供之一種方法係產生用於HPV相關疾病的治療性T細胞，該方法所包括之步驟係在IL-7與IL-15中的一或多者存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞，其中該刺激作用產生對於HPV相關疾病具治療性之T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
在一實施例中，提供一種產生用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包括：(i)刺激末梢血液細胞，其中該方法係包括在IL-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列；及(ii)在IL-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激從(i)所獲得的T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。在特定實施例中，在步驟(ii)之前，可在IL-7與IL-15存在下但並非在共刺激細胞存在下，再度刺激從(i)所獲得的T細胞。
在一實施例中，提供一種產生用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包括：(i)刺激末梢血液細胞，其中該方法係包括在介白素(IL)-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列；(ii)在介白素(IL)-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激從(i)所獲得的T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中可選擇性地重複進行(ii)一或多次；及(iii)在介白素(IL)-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激從(ii)所獲得的T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中可選擇性地重複進行(iii)一或多次。
在本揭露內容的任一方法中，HPV可為HPV16或HPV18。在本揭露內容的任一方法中，可使用之該等肽所包含的序列係對應於E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及L2中的一或多者。該等肽所包含的序列可對應於：a)HPV18E6蛋白及/或HPV18E7蛋白，及/或b)HPV16 E6蛋白及/或HPV16 E7蛋白。在一些情況下，對其提供如本申請案中所述之一有效量的細胞之一個體係罹患一種HPV相關疾病，諸如癌症，及該等肽所包含的序列係對應於E6與E7中的一或二者。就特定方面而言，該一或多種肽係包含長度至少或不超過8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸之肽，尤其該一或多種肽係包含長度為15個胺基酸之肽。在特定實施例中，一或多種肽形成一庫，及該庫中的該等肽與其他肽在序列上有11個胺基酸之重疊。
在特定實施例中，對於已暴露於HPV或患有HPV相關疾病的一個體，提供藉由該方法所產生之一治療有效量的T細胞。在特定實施例中，HPV相關疾病係包含贅生物。
對於已暴露於HPV16、HPV18或二者或患有HPV16相關疾病及/或HPV18相關疾病之一個體，提供藉由本揭露內容的一種方法所產生之一治療有效量的T細胞，該等相關疾病係包括贅生物，諸如癌症。
在特定實施例中，該癌症係子宮頸癌、肛門癌、陰門癌、陰道癌、陰莖癌、口咽癌、鼻咽惡性腫瘤、喉部乳突狀瘤病、喉癌、頭頸癌或其任何部位的發育異常。
在一些情況下，已接受及/或將接受本揭露內容的細胞之一個體，係已接受、正在接受或將接受一種附加的癌症療法，諸如外科手術、放射線治療、荷爾蒙療法、化學療法、免疫療法或其組合。
就特定方面而言，已接受及/或將接受本揭露內容的細胞之一個體係經測定患有HPV相關癌症，諸如HPV16相關癌症或HPV18相關癌症。
下列編號段落係包含本申請案所揭露之本發明技術特徵的廣泛組合之說明： 1.一種用於刺激末梢血液細胞之方法，該方法係包括在介白素(IL)-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種人類乳突病毒(HPV)蛋白的至少部分序列。 2. 一種產生供用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包括下列步驟： 在IL-7與IL-15中的一或多者存在下及在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列， 其中該刺激作用係產生對於HPV相關疾病具治療性之T細胞。 3. 如段落1或2之方法，其中係從末梢血液細胞的先前刺激作用，獲得該末梢血液T細胞。 4.如段落3之方法，其中末梢血液細胞的先前刺激作用係包括在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。 5.如段落1或2之方法，其中在刺激該末梢血液T細胞之前，該方法進一步包括在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液細胞，以產生末梢血液T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。 6.如段落1至7中任一段落之方法，其中該等抗原呈現細胞係樹突細胞、B芽母細胞或末梢血液單核細胞。 7.如段落1至6中任一段落之方法，其中該等末梢血液T細胞係存在於末梢血液單核細胞(PBMC)群體中，或從其中獲得或分離出來。 8.如段落7之方法，其中該群體中的PBMC係非附著型PBMC。 9.一種用於刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞之方法，該方法係包括在IL-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。 10.一種產生供用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法所包括之步驟係在IL-7與IL-15中的一或多者存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞，其中該刺激作用產生對於HPV相關疾病具治療性之T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。 11.如段落9或10之方法，其中該等抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞、B芽母細胞或末梢血液單核細胞。 12.如段落9至11中任一段落之方法，其中該等共刺激細胞係CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞或其組合。 13.一種產生供用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包括： (i)刺激末梢血液細胞，其中該方法係包括在IL-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列；及 (ii)在IL-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激從(i)所獲得的T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。 14.如段落13之方法，其中在步驟(ii)之前，可在IL-7與IL-15存在下但並非在共刺激細胞存在下，再度刺激從(i)所獲得的T細胞。 15.如段落13或14之方法，其中(i)中所用的抗原呈現細胞係樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或末梢血液單核細胞(PBMC)。 16.如段落13至15中任一段落之方法，其中(ii)中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞(DC)或B芽母細胞(BB)。 17.如段落13至16中任一段落之方法，其中該等共刺激細胞係CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞或其組合。 18.提供一種產生用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包括： (i)刺激末梢血液細胞，其中該方法係包括在介白素(IL)-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列； (ii)在介白素(IL)-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激從(i)所獲得的T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中可選擇性地重複進行(ii)一或多次；及 (iii)在介白素(IL)-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激從(ii)所獲得的T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中可選擇性地重複進行(iii)一或多次。 19.如段落18之方法，其中(i)與(ii)中所用的抗原呈現細胞係DC、BB或PBMC。 20.如段落18或19之方法，其中(iii)中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞、DC、BB或PBMC。 21.如段落18至20中任一段落之方法，其中該等共刺激細胞係CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞或其組合。 22.如段落1至21中任一段落之方法，其中該HPV係HPV16或HPV18。 23.如段落1至22中任一段落之方法，其中該等肽所包含的序列係對應於E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及L2中的一或多者。 24.如段落1至23中任一段落之方法，其中該HPV相關疾病係癌症，及該等肽所包含的序列係對應於E6與E7中的一或二者。 25.如段落1至25中任一段落之方法，其中該等肽所包含的序列係對應於： a)HPV18 E6蛋白及/或HPV18 E7蛋白，及/或 b)HPV16 E6蛋白及/或HPV16 E7蛋白。 26.如段落1至25中任一段落之方法，其中該一或多種肽係包含長度至少或不超過8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸之肽。 27.如段落1至26中任一段落之方法，其中該一或多種肽係包含長度為15個胺基酸之肽。 28.如段落1至27中任一段落之方法，其中一或多種肽形成一庫，及該庫中的該等肽與其他肽在序列上有11個胺基酸之重疊。 29.如段落1至28中任一段落之方法，其中對於已暴露於HPV或患有HPV相關疾病的一個體，提供藉由該方法所產生之一治療有效量的T細胞。 30.如段落29之方法，其中該HPV相關疾病係包含贅生物。 31.如段落1至30中任一段落之方法，其中對於已暴露於HPV16、HPV18或二者或患有HPV16相關疾病及/或HPV18相關疾病之一個體，提供藉由該方法所產生之一治療有效量的T細胞。 32.如段落31之方法，其中該HPV16相關疾病及/或HPV18相關疾病係包括贅生物。 33.如段落31或32之方法，其中該贅生物係癌症。 34.如段落33之方法，其中該癌症係子宮頸癌、肛門癌、陰門癌、陰道癌、陰莖癌、口咽癌、鼻咽惡性腫瘤、喉部乳突狀瘤病、喉癌、頭頸癌或其任何部位的發育異常。 35.如段落33或34之方法，其中該個體已接受、正在接受或將接受一種附加的癌症療法。 36.如段落35之方法，其中該附加的癌症療法係外科手術、放射線治療、荷爾蒙療法、化學療法、免疫療法或其組合。 37.如段落33至36中任一段落之方法，其中該個體係經測定患有HPV相關癌症。 38.如段落33至37中任一段落之方法，其中該個體係經測定患有HPV16相關癌症。 39.如段落33至38中任一段落之方法，其中該個體係經測定患有HPV18相關癌症。 40.供用於過繼性細胞免疫治療的一種方法之T細胞，其中該等T細胞係藉由如段落1至39中任一段落之一種用於刺激末梢血液或T細胞的方法或一種產生治療性T細胞的方法獲得，或為藉由該方法可獲得者，或為該方法的產物；其中過繼性細胞免疫治療之該方法係包括對於該個體投予T細胞。 41.T細胞在製造用於過繼性細胞免疫治療的一種方法之一藥物之用途，該過繼性細胞免疫治療之方法係包括對於該個體投予T細胞，其中該等T細胞係藉由如請求項1至39中任一項之一種用於刺激末梢血液或T細胞的方法或一種產生治療性T細胞的方法獲得，或為藉由該方法可獲得者，或為該方法的產物。 42.一種製備一藥學組成物、藥物或疫苗之方法，該方法包括如請求項1至39中任一項之刺激末梢血液或T細胞或者產生治療性T細胞，及將所得的細胞與一種藥學上可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑混合。 43.一種治療一個體的一癌症之方法，該方法包括： (1)從一個體分離出T細胞； (2)藉由一種方法產生或增生人類乳突病毒(HPV)專一性T細胞之群體，該方法包括：在介白素(IL)-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列；及 (3)對於一個體投予所產生或所增生之T細胞群體。 44.如段落43之方法，其中在(2)中所刺激的T細胞係從末梢血液細胞或T細胞的先前刺激作用獲得。 45.如段落43之方法，其中在刺激該等T細胞之前，該方法係包括在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液細胞或T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。 46.如段落43之方法，其中在(2)之後及在(3)之前，該方法係包括在IL-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激從(2)所獲得的T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。 47.如段落46之方法，其中該等共刺激細胞係CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞或其組合。 48.如段落43之方法，其中在(2)之後及在(3)之前，該方法係包括(i)在IL-7與IL-15存在下但並非在共刺激細胞存在下，再刺激從(2)所獲得的T細胞，及(ii)在IL-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激在(i)之後所獲得的T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。 49.如段落43之方法，其中該等抗原呈現細胞係樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或末梢血液單核細胞(PBMC)。 50.如段落43之方法，其中在(1)中係從末梢血液單核細胞(PBMC)群體中分離出T細胞。 51.如段落43之方法，其中該癌症係子宮頸癌、肛門癌、陰門癌、陰道癌、陰莖癌、口咽癌、鼻咽惡性腫瘤、喉部乳突狀瘤病、喉癌、頭頸癌或其任何部位的發育異常。 52.如段落43之方法，其中該癌症係HPV陽性。 53.如段落43之方法，其中該個體係經測定患有HPV相關癌症。 54.一種治療一個體的一癌症之方法，該方法包括： (1)從一個體分離出T細胞； (2)藉由一種方法產生或增生人類乳突病毒(HPV)專一性T細胞之群體，該方法包括： (i)在介白素(IL)-7與IL-15存在下，用抗原呈現細胞刺激T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列； (ii)在介白素(IL)-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激從(i)所獲得的T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中可選擇性地重複進行(ii)一或多次；及 (iii)在介白素(IL)-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激從(ii)所獲得的T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中可選擇性地重複進行(iii)一或多次。 (3)對於一個體投予所產生或所增生之T細胞群體。 55.如段落54之方法，其中(i)中的T細胞刺激作用係在IL-6及/或IL-12存在下進行。 56.如段落54之方法，其中(i)與(ii)中所用的抗原呈現細胞係樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或末梢血液單核細胞(PBMC)。 57.如段落54之方法，其中(iii)中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或末梢血液單核細胞(PBMC)。 58.如段落54之方法，其中該等共刺激細胞係CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞或其組合。 59.一種治療一個體的一癌症之方法，該方法包括： (1)從一個體分離出T細胞； (2)藉由一種方法產生或增生人類乳突病毒(HPV)專一性T細胞之群體，該方法包括：在IL-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列；及 (3)對於一個體投予所產生或所增生之T細胞群體。 60.如段落59之方法，其中該等抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或末梢血液單核細胞(PBMC)。 61.如段落59之方法，其中該等共刺激細胞係CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞或其組合。
上述內容已相當廣泛地概述了本發明的特徵與技術優點，以利於更加理解本發明的下列詳細描述。下文將說明本發明的其他特徵與優點，其等構成本發明的申請專利範圍之主體。本技術領域的嫻熟技術人員應理解，即可採用所揭露的概念與特定實施例作為基礎，供修改或設計用於實現本發明的相同目的之其他結構。本技術領域的嫻熟技術人員亦應理解，該等等效結構不偏離如所附申請專利範圍中所闡述之本發明的精神與範圍。當連同考量所附圖式時，從下列說明中將更加理解新穎特徵以及其他目的與優點；就本發明的組織與操作方法而言，據信該等新穎特徵即為本發明的特徵。然而，應當明確地理解，各圖式之提供僅為了說明與敘述之目的，而非意欲界定本發明之限制。
本發明包括所述各方面與較佳特性之組合，除非該組合係顯然不容許或明確表示需避免者。
本申請案中所用各節標題僅為了組織編排之目的，而不應解釋為限制所述主題。
現在將藉由實例及參照所附圖式說明本發明的各方面與各實施例。其他方面與實施例將為本技術領域的嫻熟技術人員所顯而易見。內文中所提及的所有文獻皆在此併入本案以為參考資料。
在本說明書及包括其後的申請專利範圍在內，除非上下文另有要求，否則應理解“包含(comprise)”一詞及其變體諸如“包含(comprises)”與“包含(comprising)”係意味著包括一所述整數或步驟或者多個整數或步驟之群組，但不排除其他任一整數或步驟或者其他多個整數或步驟之群組。
詳細說明 本申請案的範圍並非意欲受限於說明書中所述的過程、機器、生產、物質組成物、方式、方法及步驟的特定實施例。
根據長久以來的專利法慣例，本說明書及包括申請專利範圍中所用之“一(a)”與“一(an)”等詞當與“包含”一詞組合時，係表示“一或多個”。本發明的一些實施例可由本發明的一或多種元件、方法步驟及/或方法所組成，或實質上由本發明的一或多種元件、方法步驟及/或方法所組成。相對於本申請案中所述之其他任何方法或組成物而言，預期本申請案中所述之任一方法或組成物皆可實施。
本揭露內容係有關產生治療性T細胞及供用於需要HPV專一性T細胞如HPV16及/或HPV18專一性T細胞之個體，包括用於治療HPV感染與HPV相關醫學病況。在特定實施例中，該方法與組成物係適用於治療與HPV感染間接或直接相關之贅生物，及該等贅生物可為良性或惡性。經特徵分析已知賦予高致癌風險之介於13至18種HPV病毒株當中，有12種病毒株係屬於HPV物種7(HPV-18、HPV-39、HPV-45、HPV-59、HPV-68)與物種9(HPV-16、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-52、HPV-58、HPV-67)。HPV第6型與第11型係引發喉部乳頭狀瘤病。
I.HPV抗原與肽混物(pepmix)之產生
本揭露內容的方法係使用對於T細胞呈現肽混合物之抗原呈現細胞。該等“加載型”抗原呈現細胞之產生係在暴露於末梢血液T細胞以供刺激末梢血液T細胞之前，及該等加載型抗原呈現細胞可由或不由進行末梢血液T細胞的刺激步驟之該個體或實體來產生。因而，在一些實施例中，對於抗原呈現細胞提供一有效量的肽庫，作為最終產生治療性胞毒型T淋巴細胞之方法的一部分。在本揭露內容的方法中，在一刺激步驟之前，抗原呈現細胞係暴露於一足量的肽庫。在特定情況下，該庫係包含跨越該同一抗原的一部分或全部之肽的混合物(“肽混物(pepmix)”)；雖然在一些情況下，該庫係包含跨越一或多種抗原的一部分或全部之肽混物，而該一或多種抗原可能來自或並非來自同一HPV。在特定實施例中，用於抗原呈現細胞的肽並非天然的，及其等可能藉由或並非藉由化學方式合成或藉由重組方式產生。
當所使用之庫係來自一或多種HPV抗原的肽混合物時，該等不同的肽可來自一特定蛋白的任一部分，但在特定情況下，該等肽集體跨越該蛋白的大部分或全部長度，其中該等肽的序列係至少部分重疊，以利於覆蓋該特定抗原的整個所欲區域。在一些情況下，該等肽係跨越該等肽所對應個別抗原的一或多種已知抗原決定位或域之長度。特定區域可由跨越該區域長度的該等肽所覆蓋，該區域例如包括諸如一個N端域、C端域、細胞外域或細胞內域之一區域。
衍生出該等肽之抗原可為任一HPV類型的抗原，但在特定實施例中，該等抗原係得以促成將胞毒型T細胞導向與HPV感染相關聯的贅生物，包括癌症在內。在特定實施例中，該等肽係衍生自包括HPV16及/或HPV18在內的至少一種HPV類型之一或多種抗原的至少一部份，或者具有與其對應之序列。例如，在晚期子宮頸癌中，HPV病毒嵌入腫瘤細胞基因體中及失去E6與E7以外的其他所有基因，因此在一些情況係靶向該等抗原。在治療諸如在病毒嵌入前的早期階段癌症之實施例中，所使用的肽可來自E6與E7以外的抗原，例如包括E5及L1與L2。然而，鑑於高風險HPV類型的二種主要致癌蛋白係E6與E7，在特定實施例中，該等肽的序列係從來自任何HPV的E6及/或E7獲得，尤其來自HPV16及/或HPV18。在本揭露內容的方法中，可使用來自抗原E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及/或L2中的任一者之肽。
在一些情況下，肽混物(pepmix)庫所包括的肽係對應於來自單一HPV病毒類型之一或多種抗原，而該等肽的序列可能覆蓋或不覆蓋所論及的整個抗原。在其他情況下，肽混物庫所包括的肽係對應於來自一種以上的HPV病毒之一或多種抗原，而該等肽的序列可能覆蓋或不覆蓋所論及的整個抗原。肽混物可富集或不富集對應於一或多種特定抗原的一或多種特定區域之肽，或者可富集或不富集對應於一或多種特定抗原的整體之肽。
本揭露內容中所採用的肽混物(pepmix)例如可來自市售的肽庫，或者可合成產生。可用的庫之實例係包括該等來自JPT技術公司(美國維吉尼亞州史普林菲爾德(Springfield))或美天旎生物科技(Miltenyi Biotec)公司(美國加州奧本(Auburn))者。基於例如HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6及HPV18E7的已知序列，本技術領域的嫻熟技術人員將具有充分資訊而能產生對應於其等個別例示性序列之肽。可在美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)之GenBank®資料庫，按GenBank®登錄序號AIQ82776.1 GI:688010703取得HPV16 E6蛋白序列之一實例。按GenBank®登錄序號AIQ82814.1 GI:688010789取得HPV16 E7蛋白序列之一實例。按GenBank®登錄序號AGU90423.1 GI:537801975取得HPV18 E6蛋白序列之一實例。按GenBank®登錄序號AGU90424.1 GI:537801976取得HPV18 E7蛋白序列之一實例。
在特定實施例中，一庫係由對應於其等個別抗原之特定長度的肽所組成，雖然在一些情況下，一庫係由具有二或多種不同長度的肽混合物所組成。該等肽可具有一特定長度及其等的序列可有一特定量的重疊，雖然在一些庫中的重疊長度可能有所變化。在特定實施例中，該等肽的長度係例如至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個或更多個胺基酸。在特定實施例中，該等肽之間的重疊長度係例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34個胺基酸。在特定實施例中，該等肽的長度係15個胺基酸，而彼此間的重疊為11個胺基酸。由不同肽組成的混合物可按任何比例包括不同的肽，儘管在一些實施例中，混合物中所存在的各特定肽之數目係實質上彼此相同。雖然該等肽在序列上對於一抗原的覆蓋範圍可能是隨機及實質上甚至覆蓋一抗原的一特定區域，在一些實施例中，可富集一庫中的一或多種特定肽，例如諸如已知編碼一抗原決定位或其一部分之一或多種肽。
在特定實施例中，用於一特定抗原蛋白之肽混物(pepmix)係例如包含長度為8至10個胺基酸之所有可能的HLA第I類抗原決定位。在特定實施例中，使用更長的肽，以覆蓋一特定肽之所有第II類抗原決定位。就特定方面而言，該等肽的長度最多為30個胺基酸，及重疊為25個胺基酸。
II.產生與使用治療性T細胞之方法 A.產生治療性T細胞
就特定方面而言，本揭露內容係有關研發靶向來自至少一種HPV病毒的一或多種抗原之免疫細胞，諸如胞毒型T細胞。
本申請案中所揭露之方法可涉及刺激及/或增生免疫細胞。該等方法可涉及刺激及/或增生末梢血液細胞，諸如末梢血液單核細胞。該等方法可涉及從免疫細胞(如PBMC)的一群體內增生一免疫細胞群體(如T細胞群體)。例如，可藉由刺激PBMC群體內的T細胞，而從一PBMC群體內增生T細胞群體。因此，在本申請案所揭露方法之實施例中，T細胞的刺激及/或增生作用可涉及刺激一PBMC群體。在一些實施例中，可藉由刺激腫瘤浸潤型淋巴細胞群體內的T細胞，而從一腫瘤浸潤型淋巴細胞群體內增生T細胞群體。因此，在本申請案所揭露方法之實施例中，T細胞的刺激及/或增生作用可涉及刺激一腫瘤浸潤型淋巴細胞群體。在一些實施例中，可從自一血液樣本、一PBMC群體或從一腫瘤浸潤型淋巴細胞群體所獲得之T細胞群體(如具有異質專一性的T細胞群體)內，增生T細胞群體。該刺激/增生作用可能導致HPV專一性免疫細胞(如HPV專一性T細胞及諸如HPV專一性胞毒型T淋巴細胞)數目之增加，及/或在刺激/增生作用結束時導致該等細胞在細胞群體中的比例增加。該等方法可涉及T細胞之刺激及/或增生。可能從待治療的病患(亦即自體同源細胞)或從另一個體(亦即同種異體細胞)獲得該等細胞。在特定實施例中，該等方法係涉及所分離的免疫細胞之刺激及/或增生。亦即，可在實質上不含有非免疫細胞諸如紅血球之一細胞群體上進行特定方法。在一些情況下，該等免疫細胞係所分離的PBMC或所分離的T細胞。可從一血液樣本中獲得該等細胞，諸如從該病患或個體所取得的一血液樣本。可從組織樣本或生物檢體取得該等細胞。可從一腫瘤獲得該等細胞(如腫瘤浸潤型淋巴細胞)。本申請案中所揭露的特定方法係涉及從該病患所取得的一樣本獲得PBMC及/或T細胞之一步驟。該等方法的特定實施例並未涉及從該病患或個體取得一血液樣本或細胞之步驟，而是在先前已取得的一樣本或細胞上進行。該方法可涉及樣本之處理，諸如富集該樣本中的免疫細胞，諸如PBMC及/或T細胞。該等方法可涉及移除或實質上減少一樣本中之紅血球、血小板、血清及/或血漿的量。其可產生實質上不含有其他細胞諸如紅血球之一免疫細胞群體。本申請案中所揭露之方法可在分離的免疫細胞上進行，或在除了其他細胞之外尚含有免疫細胞的一樣本上進行。
在產生T細胞之方法中，起初可用抗原呈現細胞刺激末梢血液T細胞，該等抗原呈現細胞已暴露於跨越至少一種HPV抗原的一部分或全部之一或多種肽。可對於抗原呈現細胞提供位於一庫的肽混合物中之抗原肽，及可對於相同的抗原呈現細胞集合提供多種肽混物(pepmix)庫。在一些實施例中，該集合係同時包括免疫顯性與亞顯性抗原。
在本揭露內容的實施例中，產生治療性T細胞及提供予一個體，該個體係感染HPV或具有罹患HPV相關醫學病況之風險，而該HPV相關醫學病況係間接或直接由HPV感染引起。在產生治療性T細胞之方法中，末梢血液T細胞係在特定條件下與抗原呈現細胞混合，該等抗原呈現細胞係加載跨越一或多種抗原的一部分或全部之一肽庫，一或多種抗原例如包括HPV16及/或HPV18抗原的一部分或全部，包括E6及/或E7。在特定實施例中，就刺激步驟而言，該等T細胞係位於一PBMC群體內。
在一些實施例中，在特定步驟中所用的抗原呈現細胞可為樹突細胞(DC)。用於產生樹突細胞之方法係技術領域中眾所周知，如見上文所提及之Ramos等人乙文。可藉由CD14篩選作用及培養於DC培養基與2 mM丙胺醯基-麩醯胺酸以及800單位/毫升的顆粒性白血球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及1000單位/毫升的介白素4(IL-4)中達5天，而從PBMC分離出單核細胞。可在第3天補充GM-CSF與IL-4。在第5天，樹突細胞係在具有10奈克/毫升的介白素-1β(IL-1β)、100奈克/毫升的介白素6(IL-6)、10奈克/毫升的前列腺素E2、800單位/毫升的GM-CSF及1000單位/毫升的IL-4之DC培養基中成熟。可藉由流動式細胞測量術檢測CD80、CD83、CD86及HLA-DR的上調作用，而評估樹突細胞的成熟程度。
在一些實施例中，在特定步驟中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞。活化型T細胞可為多株T細胞(T-APC)，其係使用從靜脈切開放血術所得血液所分離出之一部分的自體同源PBMC而產生。可藉由在塗覆抗CD3與抗CD28抗體的細胞培養皿中培養，而活化該等細胞。然後在IL-2存在下培養2星期，而增生該等細胞。可將所增生的T-APC冷凍保存以備後用。在使用T-APC進行刺激作用(如進行第三循環的刺激作用及可選擇性地進行後續刺激作用)之2至3天前，將冷凍保存的細胞解凍，及在經抗CD3與抗CD28抗體塗覆的細胞培養皿中再度進行刺激作用。在進行刺激作用當天，採集T-APC細胞及用HPV E6/E7肽進行脈衝，接著按1:1的比例添加至持續培養中之經HPV刺激的T細胞。
在一些實施例中，在特定步驟及/或方法中所用的抗原呈現細胞係B芽母細胞(BB)。B芽母細胞例如可從病患的自體同源PBMC產生。藉由與經輻射照射之同種異體的CD40L表現型MRC5上皮細胞株共同培養，而活化PBMC當中的B淋巴細胞，及在含有100單位/毫升的IL-4與1微克/毫升的環孢素A之培養基中進行增生。
在一些實施例中提供產生T細胞一種方法，該T細胞係靶向來自HPV16與HPV18中之一或二者的至少一抗原，及其一般藉由用多種抗原呈現細胞接觸多種PBMC而進行，該等抗原呈現細胞係加載來自對應於一或多種特定HPV16及/或HPV18病毒抗原的一肽庫之肽。在特定實施例中，藉由該二細胞群體之接觸而得以增生T細胞。在特定實施例中，該刺激步驟係在一或多種特定的細胞介素存在下進行，該等細胞介素可為哺乳類動物(如鼠類、人類)或人類細胞介素。在特定實施例中，該一或多種細胞介素係IL-7與IL-15；雖然在任擇的實施例中，細胞介素係選自由IL-15、IL-7、IL-21、IL-12、IL-6、IL-4及其組合所組成之群組。在特定實施例中，該等方法的一或多個步驟並非在IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12及/或IL-21存在下進行，雖然任擇地可使用IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12及/或IL-21。當提及存在一細胞介素時，係指存在所添加的外源性細胞介素，亦即排除存在於細胞培養物中或由所培養細胞分泌的任何細胞介素。在一些實施例中，該等肽係進一步界定為在序列中重疊而跨越一種HPV抗原的一部分或全部之該等肽。例如，就特定方面而言，該等肽係重疊至少10個胺基酸，及特別是重疊11個胺基酸；及在一些實施例中，該等肽的長度係至少12個胺基酸或更長，及特別是15個胺基酸之長度。
納入細胞培養中之一特定細胞介素的一適當量或適當濃度之選擇，係位於本領域人員或普通技術人員的能力範圍內。舉例而言，下列係特定介白素之清單及可使用的適當濃度之實例：
介白素6(IL-6)：50至150奈克/毫升，約50奈克/毫升、60奈克/毫升、70奈克/毫升、80奈克/毫升、90奈克/毫升、100奈克/毫升、110奈克/毫升、120奈克/毫升、130奈克/毫升、140奈克/毫升或150奈克/毫升中之一者；
介白素7(IL-7)：5至15奈克/毫升，約5奈克/毫升、6奈克/毫升、7奈克/毫升、8奈克/毫升、9奈克/毫升、10奈克/毫升、11奈克/毫升、12奈克/毫升、13奈克/毫升、14奈克/毫升或15奈克/毫升中之一者；
介白素12(IL-12)：5至15奈克/毫升，約5奈克/毫升、6奈克/毫升、7奈克/毫升、8奈克/毫升、9奈克/毫升、10奈克/毫升、11奈克/毫升、12奈克/毫升、13奈克/毫升、14奈克/毫升或15奈克/毫升中之一者；
介白素15(IL-15)：5至15奈克/毫升，約5奈克/毫升、6奈克/毫升、7奈克/毫升、8奈克/毫升、9奈克/毫升、10奈克/毫升、11奈克/毫升、12奈克/毫升、13奈克/毫升、14奈克/毫升或15奈克/毫升中之一者。
下列之表1係提供本揭露內容的特定方法實施例之實例。
表1：一方法之元件實例
因而，在特定實施例中，T細胞群體(其中該群體所包含者可實質上皆為T細胞或其中T細胞群體係位於另一細胞群體當中，諸如位於PBMC當中)係暴露於一抗原呈現細胞群體，以產生具特定特徵之T細胞株，該等特徵係至少包括：a)靶向HPV16 E6及/或E7之有效性及/或靶向HPV18 E6及/或E7之有效性；b)多株性；c)TH1型偏移；或d)其等之組合。所生成的T細胞株可進行生產，使其有效靶向HPV物種7(HPV-18、HPV-39、HPV-45、HPV-59、HPV-68)與物種9(HPV-16、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-52、HPV-58、HPV-67)，及第6與第11類型，而這可為導向下列抗原中的任一或多者之肽混物(pepmix)之結果：E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及/或L2。
在一些情況下，可進行一次以上的T細胞刺激，而該細胞群體在不同的刺激步驟中所暴露之條件可能相同或不同。在特定實施例中，第一刺激作用的條件係不同於包括第二刺激作用及/或第三刺激作用在內的後續刺激作用。在特定實施例中，該方法的第一刺激步驟所使用的抗原呈現細胞係加載肽混物(pepmix)的樹突細胞或加載肽混物的末梢血液單核細胞，及使用IL-7與IL-15。該刺激步驟可選擇性地重複進行一或多次。
在該等方法的特定實施例中，在末梢血液T細胞(或PBMC)最初暴露於肽混物(pepmix)或抗原呈現細胞之後的第8天至第10天之間，可在第8天、第9天或第10天但不得更遲，進行PBMC的再刺激作用，而後續的再刺激作用可在第15天、第16天或第17天進行。
在第一刺激步驟(包括可選擇性地重複進行第一刺激步驟在內)之後的一個刺激步驟中，在第一刺激作用後獲得之所生成的T細胞(及其等可能位於一異質的細胞群體當中)，係暴露於加載肽混物(pepmix)的樹突細胞或加載肽混物的末梢血液單核細胞及/或自體同源性活化型T細胞。在第一與第二刺激步驟之後的一刺激作用中，在第二刺激作用或後續刺激作用之後所獲得的T細胞(及其等可能位於一異質的細胞群體當中)係暴露於肽混物(pepmix)-自體同源性活化型T細胞。可用於任一刺激步驟中之共刺激細胞係至少包括表現CD86、4-1BB、CD83、CD40、OX40及/或CD80之細胞。在特定情況下，共刺激細胞可為K562細胞。
在一些實施例中，在該方法的步驟期間將培養中的細胞予以改造。在特定實施例中，細胞經改造而含有表現一基因產物之多核苷酸，該基因產物使得細胞在一特定目的或功能上具有效用或更有效用，例如諸如有效或更有效靶向一特定標的及/或提高T細胞媒介型細胞毒性之功能，及/或經改造而對抗腫瘤抗原專一性細胞之免疫性。
在一些實施例中，該等細胞經改造而表現一特定的非天然受體，使T細胞得以有效或更有效地靶向所欲的一標的細胞，諸如表現一特定抗原者。該等細胞可經改造而表現一嵌合抗原受體(CAR)、一αßT細胞受體等等。在該方法期間的特定時間點，該等細胞可經改造而表現一表現載體(可為病毒型(包括逆轉錄病毒型、慢病毒型、腺病毒型、腺相關病毒型等等)或非病毒型)，諸如例如在培養第2天與第5天之間將載體導入。在一些實施例中，該等細胞係在各次刺激作用後的約3天之內，暴露於表現載體，但在該等情況下，改造作用係發生在分化程度較高且長期潛力較低的T細胞(就特定情況而言，其係合乎需求的)。
在特定實施例中，該等細胞係經改造而表現靶向一癌症抗原之嵌合抗原受體，諸如EphA2、HER2、GD2、第3型磷脂肌醇蛋白聚醣、5T4、8H9、αv
β6
整合蛋白(integrin)、B細胞成熟抗原(BCMA)B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、κ輕鏈、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胎兒AchR、葉酸鹽受體α、GD2、GD3、HLA-AIMAGEA1、HLA-A2、IL11Ra、IL13Ra2、KDR、Lambda、路易士(Lewis)-Y、MCSP、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配位體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSC1、PSMA、ROR1、Sp17、SURVIVIN、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、胚性癌抗原、HMW-MAA、VEGF受體，及/或存在於腫瘤的細胞外基質之其他例示性抗原，諸如纖連蛋白的癌胚胎變異體、細胞黏合素(tenascin)或腫瘤的壞死區域與其他腫瘤相關抗原，或者例如經由腫瘤的基因體分析及/或差異表現研究所辨識出之可靶向的突變作用。
在一些實施例中，該等細胞係經改造而對抗腫瘤抗原專一性細胞之免疫性，如藉由轉形生長因子β (TGF-β)所媒介者。例如，該等細胞可經改造而表現TGF-β的一顯性陰性受體(DNRII)，如Foster等人所述(於2008年期刊“J Immunother.”第31卷第500-505頁之“用一顯性陰性TGF-β受體轉導的EBV專一性T淋巴細胞之抗腫瘤活性”乙文，其在此併入本案以為參考資料)。其可包括使用編碼一顯性陰性TGF-β類型II受體(DNRII)的一種逆轉錄病毒表現載體來轉染該等細胞，其中該顯性陰性TGF-β類型II受體係藉由移除免疫生成性血球凝集素標籤而進行改造。在分泌TGF-β的腫瘤存在下，已顯示該等經改造的T細胞具有優於未經改造的T細胞之功能優點，包括增強的抗腫瘤活性(上文中之Foster等人乙文)。
相較於先前技術之方法，如本發明的方法可增進病毒專一性T細胞群體之增生率。可藉由嫻熟技術人員眾所周知的方法，分析T細胞群體之增生率。該等方法係包括在一或多個時間點測量T細胞數目。例如，可在如本發明的一種方法進行之後，測量T細胞數目及與該方法開始時的T細胞數目相比較；然後可計算T細胞數目的增生倍數。
可藉由分析T細胞在一段時間內的細胞分裂，而測定增生率。如Fulcher與Wong於1999年期刊“Immunol Cell Biol”第77(6)卷第559-564頁乙文所述，例如可藉由試管內分析3
氫-胸腺嘧啶核苷之納入或藉由CFSE稀釋測定法，分析一特定的T細胞群體之細胞分裂，該文獻在此完整地併入本案以為參考資料。
可藉由進行如本發明的一種方法，及將該方法中的T細胞增生與一種可相比的對照方法相比較，而測定如本發明的方法在增生率上之提高，如按照Ramos等人之方法(於2013年期刊“J Immunother”第36卷第66-76頁乙文)。
在一些實施例中，如本發明的一種方法中之T細胞群體的增生率係下列之至少一者：一種可相比的對照方法之增生率的1.001倍、1.002倍、1.003倍、1.004倍、1.005倍、1.006倍、1.007倍、1.008倍、1.009倍、1.01倍、1.02倍、1.03倍、1.04倍、1.05倍、1.06倍、1.07倍、1.08倍、1.09倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或2倍。
該增生率可為病毒專一性T細胞群體的增生率，或為總T細胞群體的增生率。
如本發明的方法所產生/所增生之病毒專一性T細胞，至少可保有與先前技術的方法所產生/所增生之病毒專一性T細胞相同的功能特性。亦即，加速的增生率並未對於所增生的T細胞之功能特性產生負面影響。
例如，在產生/增生病毒專一性T細胞的一群體之該等方法的實施例中，該等T細胞對於受感染或包含/表現一病毒肽的細胞所展現之細胞毒性，係與依據先前技術方法所增生的病毒專一性T細胞相近。
例如可在T細胞係對於該病毒肽具專一性之不同的效應因子(亦即T細胞)相對於標的(亦即抗原呈現細胞)之比例，藉由將所增生的T細胞群體與呈現一病毒肽的抗原呈現細胞一起培養，及測量該等抗原呈現細胞的專一性裂解作用，而分析所增生的T細胞之細胞毒性。例如，可在效應因子相對於標的之不同比例，藉由測量HPV轉形的LCL細胞之專一性裂解作用，而分析HPV專一性CTL群體的細胞毒性。 B.使用治療性T細胞
在特定實施例中，對於有需要的一個體提供藉由本揭露內容的方法所產生之細胞，以治療一醫學病況，其中該醫學病況係包括藉由病毒感染所引起者；或在一醫學病況尚無可檢測或已顯出的症狀時靶向一病毒感染。如本申請案中所用之“治療(treatment)”或“治療(treating)”係包括對於一疾病或病理狀況的症狀或病理之任何有益或所欲的效應，及可包括在所治療的疾病或病況如癌症之一或多種可測量的標記之甚至最微小的下降。治療可選擇性地涉及減輕或改善該疾病或病況的症狀，或延遲該疾病或病況的進程。“治療”不一定表示完全根除或治癒該疾病或病況或其相關症狀。
在揭露內容所涵蓋的方法中，使用治療性T細胞來治療由單一非HPV病毒所直接或間接引發的病毒相關疾病，或者在其他情況下提供予對於單一非HPV病毒呈現血清反應陽性之一個體。在其他情況下，使用治療性T細胞來治療由一種以上的病毒所直接或間接引發的病毒相關疾病，或者在其他情況下提供予對於一種以上的病毒呈現血清反應陽性之一個體。在治療性T細胞的集合中，各T細胞及其子代僅對於來自一病毒的一抗原上之一肽具專一性，而在產生治療性T細胞的集合之際，即增生了集體具有多重專一性之T細胞殖株群體，例如諸如對於各病毒抗原中的多個抗原決定位具有專一性。
在本揭露內容的至少一些方法中，對於一個體，例如已知罹患或疑似罹患或易於罹患HPV16及/或HPV18相關疾病之一個體，投予一治療有效量之所產生的胞毒型T淋巴細胞。在特定實施例中，該等細胞例如藉由注射投予，諸如靜脈內、肌內、皮內、皮下、腹膜內注射等等。在一些實施例中，將胞毒型T淋巴細胞進一步界定為多株CD4+與CD8+胞毒型T淋巴細胞。對於該個體而言，末梢血液單核細胞(PBMC)可為同種異體性或為自體同源性。
在特定情況下，本揭露內容的細胞係用於治療贅生物，而該贅生物可為良性、惡性，或為一種可轉成癌症的癌前病灶。因而，可用本揭露內容的方法所產生之細胞治療之一個體可能處於癌前病灶期，及/或處於該病灶轉為惡性之後。該個體可能患有早期或晚期癌症，而嫻熟技術人員明瞭，可針對癌症的不同期程，諸如藉由使用來自早期癌症相對於晚期癌症相關抗原之抗原呈現細胞的肽，來量身訂製產生細胞的方法。在特定實施例中，該癌症可為原發性、轉移性、復發性、難治性癌症等。
在特定情況下，藉由本揭露內容的方法所產生之細胞係用於治療可轉為癌症的癌前病灶，例如諸如子宮頸、陰門、陰道、陰莖、喉、口咽、肛門及其他上呼吸消化道區之癌前病灶。因而，可用本揭露內容的方法所產生之細胞治療之一個體，可能處於癌前病灶期及/或處於該病灶轉為惡性之後。可用藉由本揭露內容的方法所產生之細胞治療之HPV相關醫學病況，係至少包括生殖器區的發育異常、子宮頸上皮內贅瘤、外陰上皮內贅瘤、陰莖上皮內贅瘤、肛門上皮內贅瘤、子宮頸癌、肛門癌、陰門癌、陰道癌、陰莖癌、生殖器癌、口咽癌、鼻咽惡性腫瘤、口腔乳突狀瘤病及其他上呼吸消化道病灶。
在一些情況下，在投予該等細胞之前，可確定與一癌症相關聯的血清型；雖然在一些情況下，並未確定血清型。在特定實施例中，HPV16專一性或HPV18專一性細胞係分別對於HPV16陽性或HPV18陽性腫瘤具有活性；雖然在一些情況下，不同的HPV血清型之間具有交叉反應性。可能得知或不得知交叉反應的能力，及在特定情況下，例如對於感染HPV16或患有HPV16相關醫學病況的一個體投予HPV18專一性T細胞，反之亦然。在該等情況下，可能在未知該個體是否具一特定血清型時，即用該血清型專一性細胞治療該個體，並且因為交叉反應性之故，該等細胞仍為治療上有效的。
在該方法的刺激步驟中之抗原呈現細胞係同時加載HPV16與HPV18肽混物(pepmix)之情況下，當投予經由該等抗原呈現細胞所增生的T細胞時，其結果係取決於該個體是否曾經暴露於所探討的病毒。例如，若一個體感染HPV18而非HPV16，則僅HPV18專一性T細胞會發生反應，這是因為感染作用最初曾刺激T細胞對於HPV 18產生反應之故。該等T細胞將在該個體中增生，然後成為記憶T細胞，及其數目將高於例如未曾被活化的HPV16專一性T細胞。
所治療的該個體可能已知患有癌症、疑似患有癌症或具有罹患癌症之風險(諸如個人或家族病史；性行為活躍，包括性行為雜亂；及/或在遺傳上具有易罹病傾向，包括具有一或多種專一性標記)。所治療的一個體體內可能已有HPV病毒存在，但尚未出現HPV相關醫學病況的任何不良症狀。該個體可能具有一良性或惡性贅生物。該個體可能患有早期或晚期癌症，而嫻熟技術人員明瞭，可針對癌症的不同期程，諸如藉由使用來自早期癌症相對於晚期癌症相關抗原之抗原呈現細胞的肽，來量身訂製產生細胞的方法。在特定實施例中，HPV相關疾病係口腔或生殖器區的惡性癌症。在特定實施例中，該癌症可為原發性、轉移性、復發性、難治性癌症等。該個體可能由於任何種類的性行為或任何種類的親密肢體接觸，而感染HPV16及/或HPV18。
本揭露內容所涵蓋的細胞可用於治療任一期程的HPV感染。使用本揭露內容的方法所治療之確定患有HPV相關癌症的個體，係包括患有原位(第0期)、第I期、第II期、第III期或第IV期惡性腫瘤(其可藉由MRI、CT掃描、PET掃描等確定)的個體。此外，亦可治療具有癌前病灶(發育異常)之個體。
在一些實施例中，對於有需要的一個體投予藉由本揭露內容的方法所產生之細胞一或多次。不同的投予作用之間的時間長度可為任何適宜的期間，包括1至7天、1至4星期、1至12個月或1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更多年。在一些情況下，可在約一年的期間內進行多次輸注。在對於該個體進行一次以上的細胞投予之情況下，該等細胞所靶向的抗原，可能與先前投予作用中所用細胞所靶向之抗原相同或不同。例如，在首次投予細胞時，該等細胞可靶向HPV18 E6，而在另一次投予細胞時，該等細胞則靶向HPV18 E7，或反之亦然。例如，當癌症變成難治性癌症時，可能需要附加的投予作用。附加的刺激作用可能與一或多種其他類型的癌症治療合併使用。
在一些情況下，藉由技術領域中的任何適宜方式，可選擇性地檢測一個體是否感染HPV。因為無法在細胞培養中培養HPV，故可採用HPV感染診斷方法，諸如使用PCR進行DNA測試、南方印漬雜合法及/或原位雜合法，及該等方法例如可與或不與陰道鏡檢查、醋酸檢測、生物檢體、身體檢查及/或抹片檢查合併使用。
在特定實施例中，對於一名男性個體提供一有效量之藉由本揭露內容的方法所產生之細胞，以靶向其所感染的HPV，及在該情況下，降低該個體日後經由性行為傳染他人諸如傳染一女性個體之機率。該男性個體在暴露於本揭露內容的方法之細胞前，可能已確定或未確定感染HPV。在一些情況下，若顯示一個體已感染致癌性HPV，則值得用該等細胞進行治療，以消弭其風險。若該等細胞具有效用，其等亦降低這名個體將病毒傳染給伴侶之機率。
在特定實施例中，該個體的免疫功能低下(其例如可定義為一個體的免疫系統抵抗感染性疾病或癌症之能力受損或完全缺乏)。在特定實施例中，該免疫功能低下的個體例如曾接受幹細胞移植(包括造血幹細胞移植在內)；或曾接受器官移植及/或曾進行一或多種癌症治療，包括化學療法或放射線治療在內。在一些情況下，該個體罹患或遺傳得到免疫不全症。在一些實施例中，對於因所罹患的疾病及/或因疾病的治療而免疫功能低下的該等個體，提供本揭露內容的方法及/或組成物。
醫療方法可涉及藉由一種在人類個體中改善、治療或預防一惡性腫瘤之方法而治療癌症，其中該方法的步驟係協助或促進免疫系統根除癌細胞。該等方法可包括投予如本發明的細胞，該等細胞係調用一種主動免疫反應(或達成一種被動免疫反應)，以毀滅癌細胞。治療方法可選擇性地包括共同投予生物性佐劑(如介白素、細胞介素、卡氏-介氏桿菌(Bacillus Comette-Guerin)、單磷醯脂A等)，及與用於治療癌症的習用療法諸如化學療法、放射線治療或外科手術組合使用。治療方法可涉及投予如本發明的一組成物作為疫苗，其藉由活化免疫系統來預防或破壞癌細胞生長而發揮效用。醫療方法亦可涉及活體內、離體及過繼性免疫療法，包括使用自體同源及/或異種細胞或無限增殖型細胞株之該等方法。
III.藥學組成物
如本揭露內容，“藥學組成物”一詞係有關於用於投予至一個體之一組成物。在一特定實施例中，該藥學組成物係包含一組成物，而該組成物所包含的治療性免疫細胞係供非經腸、經皮、血管腔內、動脈內、髓鞘內或靜脈內投予，或供直接注射至一贅生物諸如一癌症中。尤其設想該藥學組成物係經由輸注或注射而投予該個體。可藉由不同方式投予適宜的組成物，
如藉由靜脈內、皮下、腹膜內、肌內、局部或皮內方式投予。
本揭露內容的藥學組成物可進一步包括一種藥學上可接受的載劑。適宜的藥學載劑之實例係技術領域中眾所周知，及包括磷酸鹽緩衝型鹽水溶液、水、乳化液諸如油/水乳化液、各種類型的潤濕劑、無菌溶液等。可藉由熟知的習用方法調配包含該等載劑之組成物。該等藥學組成物可按適宜的劑量投予至該個體。
給藥方式將由主治醫師與臨床因素決定。如醫療領域眾所周知者，用於一病患之劑量將依眾多因素而定，包括病患體型、體表面積、年齡、所投予的特定化合物、性別、投藥時間與途徑、整體健康狀況及同時投予的其他藥物。所投予的一特定劑量可能位於每平方公尺體表面積為2x107
個細胞至每平方公尺體表面積為1x1010
個細胞之範圍內。可藉由定期評估來監測進展。
可按局部或全身方式投予本揭露內容的組成物。在一較佳實施例中，該藥學組成物係按皮下方式投予；而在一個甚至更佳的實施例中，係按靜脈內方式投予。供非經腸投藥之製劑係包括無菌的水溶液或非水溶液、懸浮液及乳化液。非水溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油之植物油及可注射性有機酯類諸如油酸乙酯。水性載劑係包括水、醇性/水性溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水與經緩衝的介質在內。非經腸載體係包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer)葡萄糖、葡萄糖與氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發性油。靜脈內載體係包括液體與營養素補給、電解質補充液(諸如該等以林格氏葡萄糖為基礎者)等。亦可存在例如諸如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體等之防腐劑及其他添加劑。此外，本揭露內容的藥學組成物可包含蛋白質載劑，如較佳來自人類之血清白蛋白或免疫球蛋白。依藥學組成物的預期用途而定，設想除了本揭露內容所述的細胞之外，本揭露內容的藥學組成物可進一步包含生物活性劑。
V.合併療法
在涉及所產生之抗HPV抗原的胞毒型T淋巴細胞之本揭露內容的特定實施例中，本揭露內容的方法在臨床方面係與有效治療過度增生性疾病的其他藥劑諸如抗癌劑併用。“抗癌”劑例如可藉由殺滅癌細胞而對於一個體的癌症產生負面影響，包括引發癌細胞凋亡、減緩癌細胞的生長速率、減少轉移的發生率或數量、縮小腫瘤尺寸、抑制腫瘤生長、減少對於腫瘤或癌細胞的血液供應、促進對癌細胞或腫瘤的免疫反應、預防或抑制癌症進程或延長罹癌個體的壽命。更普遍而言，可按有效殺滅細胞或抑制細胞增生之一合併量，提供該等其他組成物。這方面之達成係可藉由將癌細胞與包括該二藥劑的單一組成物或藥用調配物接觸；或藉由將癌細胞同時與二種不同的組成物或調配物接觸，其中一組成物係包括該表現建構物而另一組成物則包括第二藥劑。在其他情況下，該等細胞與第二組成物可能分開投予，及其可藉由不同的投藥途徑及/或載體投予。
腫瘤細胞對於化學療法及放射治療劑的抗性係臨床腫瘤學所面臨的主要問題。目前癌症研究的一目標係藉由與附加療法併用，而尋求增進化學及/或放射療法功效之方法。在本揭露內容的上下文中，預期細胞療法同樣地可與例如化學治療性、放射治療性及/或免疫治療性處置合併使用。
任擇地，本發明療法可在另一藥劑治療之前或之後進行，其間的間隔係從數分鐘至數星期、數個月或數年不等。在另一藥劑與本發明係分別施用至該個體之實施例中，通常要確保各次投予之間的時間並未過長，使得該藥劑與本發明療法仍能對於該細胞展現有利的合併效應。在該等情況下，預期可在彼此相距約12至24小時內，更佳在彼此相距約6至12小時內，將該細胞與該二方式接觸。然而，在一些情況下，當個別的投藥作用之間相隔數天(2、3、4、5、6或7天)至數星期(1、2、3、4、5、6、7或8個星期)時，可能需要顯著延長治療期間。
預期可視需要重複該等治療週期。亦預期各種標準療法以及外科手術處置可與本發明的細胞療法合併施用。
可與本揭露內容的方法所產生之細胞合併使用之HPV相關癌症治療實例(作為示例)，係包括至少下列各者：1)外科手術(腫瘤切除術、頸部廓清術、子宮頸錐形切除術、子宮切除術等等)；2)藥物療法，其可包括Avastin®(貝伐珠單株抗體(Bevacizumab))、硫酸博萊黴素(Blenoxane)(博萊黴素(Bleomycin))、Hycamtin®(鹽酸托泊替康(topotecan))或其等之組合；3)放射療法；4)本揭露內容以外的免疫療法；5)荷爾蒙療法；或6)其等之組合。
V.本揭露內容之套組
在一套組中可包含本申請案中所述之任一組成物。在一非限制性實例中，在一套組中可包含一肽混物(pepmix)庫，可在該套組中提供任何類型的細胞，及/或在該套組中提供用於操作肽混物及/或細胞之試劑。在該套組中可包括細胞介素或用於產生其等的構件(諸如其等的編碼載體)。可包括細胞培養試劑及/或器具。該等組分係在適宜的容器構件中提供。
在一實施例中，一套組所包括的一容器可包含藉由本發明的一種方法所獲得之一量的T細胞，該等T細胞係經調配而較佳藉由輸注投予至個體(如藉由與一適宜的載劑、賦形劑、稀釋劑或佐劑的摻合物形式)；更佳在一種自體同源的過繼性細胞免疫療法中，藉由輸注而投予。該套組可維持在一預定溫度，例如低於約4℃，低於約-2℃或低於約-50℃。該套組可進一步包括有關套組儲存及/或運送及/或有關投予T細胞之說明書。
該等套組可包含本發明之一適當等分的組成物。該等套組的組分可包裝在水性介質中，或以冷凍乾燥形式包裝。該等套組的容器構件通常包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器或其他容器構件，其中可放置組分，及較佳經適當地分裝成等分。當套組中具有一種以上的組分時，則該套件通常包含第二個、第三個或其他附加的容器，及可將附加組分分開放置其中。然而，可將各種的組分組合包含於一小瓶中。本發明的套組亦通常包括將組分緊密封閉之容器構件，以供商業銷售之用。該等容器可包括射出成型或吹氣成型的塑膠容器，並將所需的小瓶存放在其中。
然而，套組的組分可按乾燥粉末形式提供。當試劑及/或組分係以乾燥粉末形式提供時，可藉由添加一適宜溶劑而將該粉末重新組成。亦設想可在另一容器構件中提供該溶劑。
在一些情況下，可在該套組中包括用於檢測HPV感染之試劑及/或裝置。實例包括拭棉、刮勺、細胞採樣刷、載玻片、蓋玻片、細胞樣本收集容器等等。可在套組中包括用於HPV感染或癌症的其他藥物，諸如貝伐珠單株抗體(Bevacizumab)、博萊黴素(Bleomycin)、鹽酸托泊替康(topotecan)或其等之組合。 實例
呈現下列實例係為了更完整說明本發明的較佳實施例。然而，不應在任何方面將其等解釋為限制本發明的寬廣範圍。 例1 治療性T細胞之產生
在本揭露內容的一些實施例中，藉由所提供的一機制可迅速產生包括多株(例如CD4+與CD8+)胞毒型T淋巴細胞在內之T細胞的單一製劑，其對於衍生自一或多種證實可致死的人類乳突病毒之多種抗原持續具有專一性。本揭露內容即可適用於臨床應用，及可按“成品”抗HPV病毒劑形式使用。本方法與組成物即可適用於臨床應用，並且可用於個體作為一種安全有效的抗HPV病毒劑。
在特定實施例中，在特定的輔助性細胞介素存在或不存在下，使用單核細胞所衍生的樹突細胞及加載跨越E6/E7之肽混物(pepmix)[重疊11個胺基酸(aa)的15聚體之肽庫]，刺激末梢血液T細胞。所產生的T細胞株則用加載肽混物的活化型B芽母細胞進一步進行增生。已成功活化與增生(超過1200倍)來自8/16子宮頸病患與33/52口咽癌病患的E6專一性/E7專一性T細胞。
在該等方法的特定實施例中，介白素(IL)-6、IL-7、IL-12及IL-15等細胞介素之存在對於該方法係有幫助的。所產生的T細胞株具有下列所欲特性：多株性、多重T細胞子集呈現(包括記憶區劃)與TH1型偏移及消滅E6/E7標的。本揭露內容已表明可能從罹患HPV16相關癌症的病患有力地產生導向HPV16 E6/E7的T細胞株。因為該技術具有可擴展性並且符合優良製造規範，該等細胞株係適用於HPV16癌症病患的過繼性細胞免疫療法，也可能適用於HPV18癌症。
用於產生針對HPV16的T細胞之已知方法係示於圖1A中，其顯示3名HPV相關癌症病患的結果(在藉由僅加載HPV16-肽混物(pepmix)的樹突細胞(DC)刺激末梢血液單核細胞(PBMC)後所得的細胞株中進行γIFN ELISpot分析而得)。在圖1B中顯示亦示於圖1A中的二名病患之結果，再加上第三名個體之結果。圖1B顯示γIFN ELISpot分析之結果，該分析係在藉由加載HPV16-肽混物與HPV18-肽混物的樹突細胞刺激末梢血液單核細胞後所得的細胞株中進行。可檢測出同時對抗HPV16與HPV18抗原之反應性(並非所有病患具有對抗該二血清型之反應性)。
就該等方法的細節而言，在特定情況下，樹突細胞係加載HPV16-E6/E7與HPV18-E6/E7肽混物(pepmix)庫。在該等情況下，該等細胞株可同時辨識HPV16與HPV18 E6與E7抗原(而非例如僅辨識HPV16抗原)。至少在特定情況下，T細胞之增生係在IL-7與IL-15存在下進行，而非在IL-2存在下。在該方法的條件下，各刺激與增生步驟可能在或可能不在IL-7與IL-15之存在下進行。在一些實施例中，在用樹突細胞進行初始產生/增生後之HPV專一性T細胞的增生作用，並非在IL-15存在下用加載肽混物的自體同源B芽母細胞進行，而是在共刺激細胞(CD80/CD86/CD83/4-1BBL)及IL-7與IL-15存在下，採用加載肽混物之自體同源的多株活化型T細胞。當採用該等條件時，T細胞的增生速率更快，成功地證明在3回合的刺激作用後，該速率至少為已知方法的10倍並且不喪失專一性。
在表2中提供使用已知方法進行之三名HPV相關癌症病患的細胞增生倍數之摘要。
使用本揭露內容的一新穎方法進行之三名HPV相關癌症病患的細胞增生倍數之摘要係示於表3。在3回合的刺激作用後，增生倍數平均比使用已知方法時高約50倍。並且保有專一性(如＃1所示)。
例2 增生HPV T細胞之操作程序
經HPV刺激的T細胞(HPVST)係按10-20:1之末梢血液單核細胞：樹突細胞比例，首先藉由HPV E6/E7肽所脈衝的自體同源樹突細胞(DC)進行活化，及在含有IL-6(100奈克/毫升)、IL-7(10奈克/毫升)、IL-12(10奈克/毫升)、IL-15(10奈克/毫升)的培養基中培養8天(如按照Ramos等人(於2013年期刊“J Immunother”第36卷第66-76頁乙文)所述的第一刺激步驟)。
在第9天，在含有IL-7(10奈克/毫升)與IL-15(100奈克/毫升)的培養基中，按5-10:1之末梢血液單核細胞：樹突細胞比例，使用經肽脈衝的樹突細胞進行第二刺激步驟。
在含有IL-7(10奈克/毫升)與IL-15(100奈克/毫升)的培養基中，及在相等數目之經輻射照射的同種異體K562-cs共刺激細胞存在下，按1:1的比例使用經HPVE6/E7肽脈衝的自體同源T-APC，後續的刺激/增生步驟係每星期進行，以達到所欲的HPVST數目。使用從靜脈切開放血術所得血液中所分離出之一部分的自體同源末梢血液單核細胞，產生多株T細胞(T-APC)。藉由在塗覆抗CD3與抗CD28抗體的細胞培養皿中培養，而活化該等細胞。然後在IL-2存在下培養2星期，而增生該等細胞。可將所增生的T-APC冷凍保存以備後用。在使用T-APC進行HPVST再刺激作用(第三及後續回合的HPVST再刺激作用)的2至3天前，將冷凍保存的細胞解凍，及在經抗CD3與抗CD28抗體塗覆的細胞培養皿中再度進行刺激作用。在進行HPVST再刺激作用當天，採集T-APC細胞及用HPV E6/E7肽進行脈衝，接著按1:1的比例添加至持續培養中的HPVST。 例3 所輸注的HPVST在人類病患中的活體內增生作用與持久性
用TGF-β的一顯性陰性受體(DNRII)將從例2所得的HPVST轉導[參見Foster等人於2008年期刊“J Immunother.”第31卷第500-505頁之“用一顯性陰性TGF-β受體轉導的EBV專一性T淋巴細胞之抗腫瘤活性”乙文。]
對二名人類病患投予HPVST，及測試活體內增生作用與持久性。1號患者所罹患的口咽癌已廣泛轉移，並已停止了先前的治療。2號病患的口咽癌已轉移到頸部，及正在接受合併投予的納武單株抗體(nivolumab)治療，其先前對於單獨投予的納武單株抗體並無反應。
在從該病患的末梢血液所分離出之末梢血液單核細胞中，藉由針對DNRII基因所進行的qPCR，評估所輸注的HPVST之活體內增生作用與持久性。圖2與圖3中的數據點係表示在輸注HPVST後之關鍵性輸注後間隔。
在1號病患中觀察到漸進性增生(圖2)。2號病患的增生雖然有限(圖3)，其在第6個星期的峰值係與再次輸注HPVST相符合，但是患者展現局部的臨床反應。相較於治療前基線，在輸注HPVST之6個星期後，藉由PET掃描與身體檢查之測量，顯示2號病患的疾病負擔減輕了(圖4)。
雖然已詳細說明了本發明及其優點，應理解可對本發明進行各種改變、取代及變更，而不偏離由所附申請專利範圍界定之本發明的精神與範圍。此外，本申請案的範圍並非意欲受限於說明書中所述的過程、機器、生產、物質組成物、方式、方法及步驟的特定實施例。如本技術領域的一般技術人員從本發明的揭露內容即可明瞭，若目前已有或日後研發出之過程、機器、生產、物質組成物、方式、方法或步驟所執行的功能或所達到的結果係與本申請案中所述對應實施例實質上相同，即可如本發明使用之。因此，所附申請專利範圍係意欲將該等過程、機器、生產、物質組成物、方式、方法或步驟包括在其等的範圍內。
(無)
圖1A係顯示本技術領域中的一種方法，其採用特定條件來產生HPV16專一性T細胞。圖1A係一條形圖，其顯示用未加載肽混物(pepmix)(Neg)、加載HPV16 E6肽混物(HPV16 E6)或加載HPV16 E7肽混物(HPV16 E7)的自體同源樹突細胞，在刺激來自三名HPV相關癌症病患(標示為OCV、HND及HNC)的末梢血液單核細胞時之斑點形成群落(SFC)之產生。就病患OCV而言，所存在的三個條狀從左到右分別為Neg、HPV16 E6及HPV16 E7。就病患HND與HNC而言，所存在的二個條狀從左到右分別為HPV16 E6與HPV16 E7。
圖1B係顯示本揭露內容的一種方法，其在特定的新穎條件下，藉由採用在IL-7與IL-15存在下及在IL-6與IL-12不存在下之T細胞刺激作用，產生HPV16或HPV18專一性T細胞之混合物。圖1B係一條形圖，其顯示在刺激來自三名HPV相關癌症病患(標示為OCV、PCV及HND)的末梢血液單核細胞時之斑點形成群落(SFC)之產生。就病患OCV而言，所存在的五個條狀從左到右分別為未加載肽混物(pepmix)(Neg)、加載HPV16 E6肽混物(HPV16 E6)、加載HPV16 E7肽混物(HPV16 E7)、加載HPV18E6肽混物(HPV18E6)及HPV18E7肽混物(HPV18E7)。就病患PCD而言，所存在的二個條狀從左到右分別為HPV16 E6與HPV16 E7。就病患HND而言，所存在的四個條狀從左到右分別為HPV16 E6、HPV16 E7、HPV18E6及HPV18E7。
圖2係一圖表，其顯示在病患#1中，所輸注之用TGF-β(DNRII)的一顯性陰性受體轉導且用HPV刺激的T細胞在輸注後的時間點之活體內增生作用與持久性。
圖3係一圖表，其顯示在病患#2中，所輸注之用TGF-β(DNRII)的一顯性陰性受體轉導且用HPV刺激的T細胞在輸注後的時間點之活體內增生作用與持久性。
圖4顯示病患#2的PET掃描(左側與中央)及身體檢查照片(右側)。上排：治療前。下排：用如本發明所產生之經HPV刺激的T細胞治療6星期後。
Claims (42)
- 一種用於刺激T細胞之方法，該方法係包括在介白素(IL)-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種人類乳突病毒(HPV)蛋白的至少部分序列。
- 一種產生供用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包括下列步驟： 在IL-7與IL-15中的一或多者存在下及在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列， 其中該刺激作用係產生對於HPV相關疾病具治療性之T細胞。
- 如請求項1或2之方法，其中該等T細胞係從T細胞的先前刺激作用獲得，可選擇性地從末梢血液單核細胞(PBMC)群體內獲得。
- 如請求項3之方法，其中T細胞的先前刺激作用係包括在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
- 如請求項1或2之方法，其中在刺激該等T細胞之前，該方法進一步包括在IL-7與IL-15存在下及在IL-6及/或IL-12存在下，用抗原呈現細胞刺激T細胞，以產生末梢血液T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
- 如請求項1至5中任一項之方法，其中該等抗原呈現細胞係樹突細胞、B芽母細胞(B-blasts)、或末梢血液單核細胞(PBMC)。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中該等T細胞係存在於末梢血液單核細胞(PBMC)群體中，或從其中獲得或分離出來。
- 如請求項7之方法，其中該群體中的PBMC係非附著型PBMC。
- 一種用於刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞之方法，該方法係包括在IL-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
- 一種產生供用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包括下述步驟：在IL-7與IL-15中的一或多者存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激HPV專一性或HPV抗原專一性T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列；其中該刺激作用產生對於HPV相關疾病具治療性之T細胞。
- 如請求項9或10之方法，其中該等抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞、B芽母細胞、或末梢血液單核細胞(PBMC)。
- 如請求項9至11中任一項之方法，其中該等共刺激細胞係CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞、或其組合。
- 一種產生供用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包括： (i)刺激末梢血液細胞，其中該方法係包括在IL-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列；及 (ii)在IL-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激從(i)所獲得的T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列。
- 如請求項13之方法，其中在步驟(ii)之前，可在IL-7與IL-15存在下但並非在共刺激細胞存在下，再度刺激從(i)所獲得的T細胞。
- 如請求項13或14之方法，其中(i)中所用的抗原呈現細胞係樹突細胞(DC)、B芽母細胞(BB)或末梢血液單核細胞(PBMC)。
- 如請求項13至15中任一項之方法，其中(ii)中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞、樹突細胞(DC)或B芽母細胞(BB)。
- 如請求項13至16中任一項之方法，其中該等共刺激細胞係CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞、或其組合。
- 提供一種產生供用於HPV相關疾病的治療性T細胞之方法，該方法包括： (i)刺激末梢血液細胞，其中該方法係包括在介白素(IL)-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激末梢血液T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列； (ii)在介白素(IL)-7與IL-15存在下及可選擇性地在IL-6及/或IL-12不存在下，用抗原呈現細胞刺激從(i)所獲得的T細胞；其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中(ii)可選擇性地重複一或多次；及 (iii)在介白素(IL)-7與IL-15存在下及在共刺激細胞存在下，用抗原呈現細胞刺激從(ii)所獲得的T細胞，其中該等抗原呈現細胞先前曾暴露於一或多種肽，其中該等肽所包含的序列係對應於一或多種HPV蛋白的至少部分序列，其中(iii)可選擇性地重複一或多次。
- 如請求項18之方法，其中(i)與(ii)中所用的抗原呈現細胞係DC、BB或PBMC。
- 如請求項18或19之方法，其中(iii)中所用的抗原呈現細胞係活化型T細胞、DC、BB或PBMC。
- 如請求項18至20中任一項之方法，其中該等共刺激細胞係CD80+、CD86+、CD83+、4-1BBL+、CD40+細胞、OX40+細胞、或其組合。
- 如請求項1至21中任一項之方法，其中該HPV係HPV16或HPV18。
- 如請求項1至22中任一項之方法，其中該等肽所包含的序列係對應於E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、L1及L2中的一或多者。
- 如請求項1至23中任一項之方法，其中該HPV相關疾病係癌症，及該等肽所包含的序列係對應於E6與E7中的一或二者。
- 如請求項1至25中任一項之方法，其中該等肽所包含的序列係對應於： a)HPV18 E6蛋白及/或HPV18 E7蛋白，及/或 b)HPV16 E6蛋白及/或HPV16 E7蛋白。
- 如請求項1至25中任一項之方法，其中該一或多種肽係包含長度至少或不超過8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸之肽。
- 如請求項1至26中任一項之方法，其中該一或多種肽係包含長度為15個胺基酸之肽。
- 如請求項1至27中任一項之方法，其中一或多種肽形成一庫(library)，且該庫中的該等肽與其他肽在序列上有11個胺基酸之重疊。
- 如請求項1至28中任一項之方法，其中提供一治療有效量之由該方法所產生的T細胞至一個體，該個體已暴露於HPV或患有HPV相關疾病。
- 如請求項29之方法，其中該HPV相關疾病係包含贅生物(neoplasm)。
- 如請求項1至30中任一項之方法，其中提供一治療有效量之由該方法所產生的T細胞至一個體，該個體已暴露於HPV16、HPV18或二者或患有HPV16相關疾病及/或HPV18相關疾病。
- 如請求項31之方法，其中該HPV16相關疾病及/或HPV18相關疾病係包括贅生物。
- 如請求項31或32之方法，其中該贅生物係癌症。
- 如請求項33之方法，其中該癌症係子宮頸癌、肛門癌、陰門癌、陰道癌、陰莖癌、口咽癌、鼻咽惡性腫瘤、喉部乳突狀瘤病、喉癌、頭頸癌或其任何部位的發育異常。
- 如請求項33或34之方法，其中該個體已接受、正在接受或將接受一種附加的癌症療法。
- 如請求項35之方法，其中該附加的癌症療法係外科手術、放射線治療、荷爾蒙療法、化學療法、免疫療法、或其組合。
- 如請求項33至36中任一項之方法，其中該個體係經測定患有HPV相關癌症。
- 如請求項33至37中任一項之方法，其中該個體係經測定患有HPV16相關癌症。
- 如請求項33至38中任一項之方法，其中該個體係經測定患有HPV18相關癌症。
- 一種供用於過繼性細胞免疫治療(adoptive cellular immunotherapy)方法之T細胞，其中該T細胞係藉由如請求項1至39中任一項之用於刺激末梢血液細胞或T細胞的方法或產生治療性T細胞的方法獲得，或為藉由該方法可獲得者，或為該方法的產物；其中該過繼性細胞免疫治療方法係包括投予該T細胞至該個體。
- 一種T細胞在製造用於過繼性細胞免疫治療方法之藥物的用途，該過繼性細胞免疫治療方法係包括投予該等T細胞至該個體，其中該等T細胞係藉由如請求項1至39中任一項之用於刺激末梢血液細胞或T細胞的方法或產生治療性T細胞的方法獲得，或為藉由該方法可獲得者，或為該方法的產物。
- 一種製備一藥學組成物、藥物或疫苗之方法，該方法包括如請求項1至39中任一項之刺激末梢血液細胞或T細胞或者產生治療性T細胞，及將所獲得的細胞與一種藥學上可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑混合。
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