CN117024605A - 嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及其应用 - Google Patents

嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及应用。本发明所提供的嵌合抗原受体，包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域；其中：所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原双唾液酸神经节苷脂的单链抗体；所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域；所述共刺激信号传导结构域为CD86信号传导结构域和FcγR1信号传导结构域的组合。本发明所提供的表达针对GD2抗原的嵌合抗原受体小胶质细胞(CAR‑GD2小胶质细胞)，其可精准地杀伤肿瘤细胞，并长期存活，希望可用于治疗表达GD2抗原的肿瘤，缓解病人痛苦。

Description

嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及其应用
技术领域
本发明涉及嵌合抗原受体，特别地涉及嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)是由识别肿瘤特异性抗原的抗体的抗原结合部与跨膜结构域和胞内结构域构成的嵌合受体。CAR主要由三个功能域构成，分别是胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域由负责识别并结合抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)及一段起连接作用的铰链区(Hinge)构成。胞内结构域由共刺激结构域和信号转导结构域构成。
通过基因转导的方法将CAR基因序列转染免疫细胞，如T细胞，NK细胞，使其表达CAR，从而增强患者免疫细胞的功能，能够生成大量肿瘤抗原特异性的CAR细胞。这种CAR免疫细胞输注到患者体内，嵌合抗原受体可以特异性地追踪和识别并引导免疫细胞杀伤肿瘤细胞。CAR-免疫细胞疗法，作为近年来一种较为新型的细胞治疗方案，在癌症治疗领域取得了许多突破性进展，尤其是嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫疗法在B细胞等血液系统肿瘤中治疗效果显著，能够特异、高效及持续的攻击肿瘤细胞，但该疗法受到肿瘤微环境和T细胞耗竭等因素影响，CAR-T疗法在实体瘤领域的应用仍在探索之中，在实体瘤中的应用和发展是其瓶颈。
脑胶质瘤是起源于脑神经胶质细胞的实体肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤，5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌。脑胶质瘤发病机制尚不明了，治疗手段仍依赖于手术，放疗和化疗。小胶质细胞是定植在中枢神经系统中的免疫细胞，是神经胶质瘤相关的巨噬细胞，在神经系统发育和疾病发展过程中发挥重要功能。如果能通过改造加强小胶质细胞的功能，使小胶质细胞特异性杀伤肿瘤细胞，改善肿瘤微环境，降低细胞因子风暴的副作用，将为胶质瘤患者造福。
双唾液酸神经节苷脂GD2是一种主要表达在胶质瘤(脑瘤，视网膜母细胞瘤等中枢神经母细胞瘤、黑色素瘤等肿瘤)上的抗原，在正常组织中表达量低且局限，是神经胶质瘤免疫治疗理想的肿瘤抗原，目前已有针对GD2的特异性抗体用于神经母细胞瘤的免疫治疗，但是由于抗体治疗主要存在于外周血中难以精准进入肿瘤组织或肿瘤微小残留部位，且抗体易降解无法长期存在体内，增加了治疗的困难性。此前CN 106536563A和CN 108948211A公开了GD2结合的嵌合抗原受体均在T细胞上通过转基因技术构建针对GD2的CAR T，虽然在癌症治疗中有一定作用，但是正常中枢神经系统和视网膜中T细胞含量少，即使疾病状态下T细胞从外周血中转移到中枢神经系统和视网膜的T细胞也很难进入实体瘤，难以发挥治疗作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及其应用。
本发明所提供的嵌合抗原受体，为基于双唾液酸神经节苷脂的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域；其中：
所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原双唾液酸神经节苷脂的单链抗体；
所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域；
所述共刺激信号传导结构域为CD86信号传导结构域和FcγR1信号传导结构域的组合。
可选地，所述针对肿瘤表面抗原双唾液酸神经节苷脂的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述CD8α跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述共刺激信号传导结构域为CD86信号传导结构域和FcγR1信号传导结构域的顺序组合，所述共刺激信号传导结构域的的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
可选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽；所述信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
可选地，所述嵌合抗原受体还包括铰链区，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
可选地，所述嵌合抗原受体由信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、2A序列和绿色荧光蛋白序列串联而成，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
本发明还提供一种含有嵌合抗原受体的慢病毒。
本发明所提供的的含有嵌合抗原受体的慢病毒，包括所述的嵌合抗原受体。
表达嵌合抗原受体的小胶质细胞的制备方法也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞的制备方法，包括如下步骤：将小胶质细胞培养后，感染所述含有嵌合抗原受体的慢病毒，通过绿色荧光观察转染效率再通过嘌呤霉素进行阳性克隆筛选，最后挑选阳性克隆细胞进行培养鉴定，即得到表达嵌合抗原受体的小胶质细胞。
可选地，所述进行阳性克隆筛选是通过绿色荧光观察转染效率再通过嘌呤霉素进行阳性克隆筛选。
可选地，所述小胶质细胞为小胶质细胞系HMC3；所述表达嵌合抗原受体的小胶质细胞为CAR-GD2小胶质细胞。
所述的方法制备得到的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞也属于本发明的保护范围。
表达嵌合抗原受体的小胶质细胞在制备治疗表达双唾液酸神经节苷脂抗原的肿瘤的药物中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的表达针对基于双唾液酸神经节苷脂的嵌合抗原受体(即针对GD2抗原的嵌合抗原受体)小胶质细胞(即CAR-GD2小胶质细胞)，其可精准地识别肿瘤细胞，并长期存活，可用于治疗表达GD2抗原的肿瘤，缓解病人痛苦。
与CAR-T和CAR-NK相比，CAR-小胶质细胞作为一种全新的细胞免疫疗法相比于CAR-T和CAR-NK疗法，其具有浸润肿瘤能力强、促进抗原提呈能力和增强杀伤功能、非肿瘤靶向毒性较小等独特的优势。希望随着研究的深入，CAR-小胶质细胞在患者身上显示出疗效、并在临床中得到应用，为胶质瘤患者造福。
附图说明
为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：
图1为嵌合抗原受体的构建图；
图2为表达嵌合抗原受体的载体pCDH CAR-GD2的构建图；
图3为表达嵌合抗原受体的载体pCDH CAR-CD19的构建图；
图4为HMC3表达小胶质细胞标志分子IBA1和CD68；标尺20μm；
图5为流式细胞术检测肿瘤细胞Y79表达GD2，不表达CD19；小胶质细胞不表达GD2和CD19的结果图；
图6为CAR-GD2小胶质细胞和CAR-CD19小胶质细胞PCR产物电泳鉴定结果；
图7为CAR-GD2小胶质细胞测序结果；
图8为CAR-CD19小胶质细胞测序结果；
图9为流式细胞术检测CAR-CD19小胶质细胞和CAR-GD2小胶质细胞表达CAR分子中linker G4S的结果图。
图10为免疫荧光检测小胶质细胞HMC3不表达GD2，肿瘤细胞系表达GD2；标尺20μm。
图11为活细胞成像检测CAR-GD2小胶质细胞对肿瘤细胞的靶向性结果；标尺100μm。
图12为CAR-GD2和CAR-GD19小胶质细胞对肿瘤细胞的杀伤效果比较。
图13为CCK-8实验检测CAR-GD2小胶质细胞对Y79靶细胞的杀伤率结果。
图14为ELISA检测CAR-GD2小胶质细胞杀伤Y79后细胞因子分泌结果。
具体实施方式
以下对本发明的描述仅旨在说明本发明的各种实施例。因此，所讨论的具体修改不应被解释为对本发明范围的限制。对于所属领域的技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围的情况下可以作出各种等效物、改变和修改，并且应理解，此类等效实施例将包括在发明中。本发明引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均以全文引用的方式并入本发明中。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买获得的常规产品。
A.一般定义
如本文所用，术语“包含”在提及组合物、方法以及对所述方法或组合物来说必不可少的其相应组分时使用，但对于包括未指明的要素，无论是否必要，仍然是开放的。
术语“由……组成”是指如本文所描述的组合物、方法和其相应组分，其排除未在所述实施例的描述中叙述的任何要素。
术语“约”或“大致”意指给定值或范围的20％内，优选10％内，并且更优选5％内。
如本文所用的术语“细胞”是指单个细胞、细胞系或衍生自此类细胞的培养物。
实施例1、构建嵌合抗原受体
通过全基因合成信号肽序列、GD2抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、2A序列、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，构建嵌合抗原受体(CAR)，如图1所示，即信号肽(Signal peptide)-Anti-GD2scFv-CD8α跨膜区(CD8αTM)-CD86-FcγR1-T2A-EGFP，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
其中：
信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
针对肿瘤表面抗原GD2的单链抗体(Anti-GD2scFv)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：
linker序列为多个GGGGS(G4S)的重复序列，在重链可变区和轻链可变区中间加入3个GGGGS，起连接作用，具有灵活性，在组成CAR分子时使抗体容易接触抗原。
铰链区的功能是提供灵活性，以克服空间阻碍，并对CAR的长度有贡献，以便允许抗原结合结构域接触到靶表位。铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：
跨膜结构域为CD8α跨膜区(CD8αTM)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示：
共刺激信号传导结构域为CD86信号传导结构域和FcγR1信号传导结构域的组合，即CD86-FcγR1的顺序组合，CD86-FcγR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示：
T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示：
EGRGSLLTCGDVEENPGP。
增强型绿色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示：
鉴于胶质瘤不表达CD19抗原，本发明采用表达CD19的嵌合抗原受体包括抗CD19抗体scfv段，CD8α跨膜区和CD86胞内段小胶质细胞为对照组细胞。
对照组细胞CD19嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、2A序列串联而成，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体如下：
实施例2、嵌合抗原受体载体构建
本发明中用于构建嵌合抗原受体表达所选载体名称pCDH-EF1α-puro(购自宁波安诺柏德生物医药科技有限公司)，将全基因合成的嵌合抗原序列作为模板，设计引物进行扩增，上游引物(带EcoRI内切酶序列)序列为F：
GATTCGAATTCGCCGCCACCATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGC(SEQ ID NO.10)；下游引物序列(带XbaI内切酶序列)为R：GAATTTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGT(SEQ IDNO.11)，扩增后的PCR产物电泳后，切胶回收产物。将PCR回收产物用EcoRI和XbaI限制性内切酶进行酶切，同时将pCDH-EF1α-puro载体用EcoRI和XbaI限制性内切酶进行酶切，酶切反应条件为37℃，2小时。PCR产物和载体酶切后进行电泳，切胶回收酶切产物，进行连接反应。用T4连接酶将PCR酶切产物和载体酶切产物进行连接反应，16℃，12小时。连接产物进行转化，感受态菌株为Stbl3(购自天根生化科技(北京)有限公司)，转化步骤为：
1、将感受态放在冰上融化，将连接产物全部加入感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上放置30分钟。
2、42℃热激1min30s，迅速放冰上孵育2min。
3、加入不含抗生素的LB培养基500μl，37℃摇床摇30分钟。
4、离心后弃300μl上清，其余重悬后将菌液均匀涂到LB氨苄阳性的琼脂板上，37℃过夜培养。12h后观察菌生长情况，挑选单独的、大且饱满的菌到LB氨苄阳性的培养基中摇12h后，一部分菌液加20％甘油冻存，另一部分菌液送公司(北京擎科生物科技有限公司)进行测序，将鉴定正确的菌复苏小摇后进行大提标记为pCDH CAR-GD2和pCDH CAR-CD19。载体图谱如图2和3所示。
实施例2、慢病毒包装
本实施例使用HEK-293T细胞系来生产慢病毒。pCDH CAR-GD2和pCDH CAR-CD19分别是慢病毒载体，再加入慢病毒骨架质粒转染293T细胞后可以包装成慢病毒，该慢病毒就含有CAR。(参考文献Gene Ther.2011Jun；18(6):531-8.)。
(1)将生长状态良好的HEK293T细胞(记载过明HEK293T细胞的非专利文献是：GeneTher.2011Jun；18(6):531-8.)用0.25％的胰酶消化2分钟，加入含有10％FBS的DMEM培养基(购自赛默飞世尔科技公司)终止消化，并将培养皿底细胞吹打成单细胞，计数1×107接种到10cm皿中，12h后进行转染包装病毒。为了多收集慢病毒，根据实际情况，可以多培养几皿细胞
(2)制备转染试剂和质粒的复合物
a.将待转染的病毒质粒35μg(10μg pCDH CAR DNA载体质粒，10μg pMD2.G(购自武汉枢密脑科学技术有限公司)和15μg psPAX2(购自武汉枢密脑科学技术有限公司))溶于Opti-MEM培养基(购自赛默飞世尔科技公司)，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min，得到含有质粒的混合液。
b.取脂质体转染试剂lipofectamin2000(购自赛默飞世尔科技公司)中的转染试剂100μl和增强试剂200μl溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min。
c.将含有质粒的混合液加入含有转染试剂的混合液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。
(3)取出培养皿，将以上配好的DNA转染试剂混合物加入步骤(1)的HEK293T细胞中。
(4)转染后换液：6h后吸去培养基，用PBS洗一次，加入10ml新鲜含有10％FBS的DMEM培养基，放入37℃5％ CO2培养箱中培养。
实施例3、慢病毒的提取和浓缩
慢病毒提取：
1)收集转染后48h、72h(转染时为0小时)的HEK293T细胞上清液，分装入50ml离心管中。3500rpm室温离心10min，除去细胞和大的碎片。
2)以0.45μm滤膜过滤上清液于超速离心管中。
超速离心浓缩病毒：
3)30,000rpm，4℃离心2h，可观察到管壁一侧有白色的病毒沉淀。
4)弃上清，离心管倒扣在灭菌过的吸水纸上，去除未弃干净的上清。每管根据沉淀量添加磷酸盐缓冲液(DPBS)，80μl～120μl/管，用封口膜封住管口，4℃溶解沉淀过夜。
5)按要求分装病毒，-80℃冰箱保存。
实施例4、慢病毒滴度测定
采用定量PCR的方法测定细胞中的整合的病毒基因组的拷贝数，根据病毒加入的体积，感染时的细胞量从而推断原初的病毒滴度。采用载体上的WPRE序列检测病毒基因组，在HEK293T细胞中不存在WPRE序列。
1)感染前一天，按每孔1×105个细胞接种24孔板。
2)分别取病毒10μl，1μl，0.1μl加入到各一个细胞培养孔中，随后加聚凝胺(Polybrene)(购自默克公司)。病毒可以先稀释，再加入。
3)感染24小时后，换液继续培养。
4)感染48h后弃细胞上清。将细胞收集下来，抽提293T细胞基因组；
5)以得到的基因组为模板，定量其中的内参基因和病毒序列WPRE，通过相对定量的方法用2-ΔΔCt法计算病毒基因组数和细胞基因组数的比例。
结果：本发明中使用的慢病毒滴度为1×108TU/ml，含有CAR的慢病毒分别命名为lenti CAR-GD2和lenti CAR-CD19。
实施例5、CAR-小胶质细胞的制备
将小胶质细胞HMC3(购自武汉普诺赛生命科技有限公司)加入含有10％FBS的DMEM培养基(购自赛默飞世尔科技公司)，接种于6孔板中，每孔5×105个细胞，培养24h后分别感染lenti-CAR GD2和lenti-CAR CD19(20μl/孔)，随即加入聚凝胺(10ug/ml)，轻轻摇晃六孔板使其混合均匀。
小胶质细胞表型鉴定如图4所示，HMC3表达小胶质细胞标志分子IBA1和CD68。小胶质细胞不表达CD19和GD2如图5所示，HMC3细胞中均没有GD2和CD19阳性细胞群。(参考文献JNeuroimmunol.2017Aug 15；309:12-22)。
病毒感染6h后去掉病毒上清液，更换新鲜含有10％FBS的DMEM培养基(购自赛默飞世尔科技公司)。慢病毒载体有绿色荧光蛋白GFP和嘌呤霉素抗性，细胞培养48h后，观察感染慢病毒细胞中有表达绿色荧光的细胞，随即对感染慢病毒细胞孔和未感染慢病毒细胞孔加入嘌呤霉素进行筛选，加入嘌呤霉素第一天可以看到一些细胞死亡，待未感染慢病毒细胞孔细胞均死亡时停止筛选，培养基改为完全培养基继续培养，待感染慢病毒细胞孔可以挑克隆时，挑选单克隆细胞进行培养，待单克隆细胞可以传代时，收集细胞提取DNA，进行PCR产物鉴定，测序。PCR鉴定引物为F：TTCTCAAGCCTCAGACAGTGGT(SEQ ID NO.12)；
R：AGCGCATGCTCCAGACTGCCTT(SEQ ID NO.13)，将PCR产物电泳，电泳图见图6，测序结果比对如图7和图8。如此获得CAR-GD2(图7)和对照组CAR-CD19小胶质细胞(图8)。
将带有CAR基因测序正确的克隆细胞扩增部分冻存，另一部分扩增进行后续实验，小胶质细胞表达CAR分子如图9所示，G4S为CAR分子重链可变区和轻链可变区的linker，通过标记识别G4S的荧光素抗体，可以看出阳性细胞群比例很高(>80％)代表小胶质细胞表达CAR分子。
实施例6、CAR-GD2小胶质细胞的体外杀伤实验
通过流式细胞术和免疫荧光检测视网膜母细胞瘤Y79(购自丰晖生物公司)表达GD2，不表达CD19(如图5和图10所示)(J Immunother Cancer.2022Sep；10(9):e005187.)，将CAR-GD2小胶质细胞，CAR-CD19小胶质细胞分别与Y79细胞进行共培养通过活细胞成像观察CAR-小胶质细胞对肿瘤细胞Y79的靶向性，如图11所示，CAR-小胶质细胞有绿色荧光，Y79染色CellTrace violet表达蓝色荧光，图11左侧图片表示CAR-小胶质细胞与Y79共培养时的图片，可以看出细胞均匀分布，图11右侧图片为CAR-小胶质细胞与Y79共培养3小时的结果，可以看出CAR-GD2小胶质细胞明显靶向Y79细胞，并且对Y79细胞进行包围；随后通过流式分析CAR-小胶质细胞对肿瘤细胞Y79的杀伤作用，如图12所示，可以看出CAR-GD2小胶质细胞与Y79细胞共培养后，Y79细胞死亡明显增多，表现出CAR-GD2小胶质细胞对Y79的特异性杀伤作用。
通过CCK-8检测靶细胞杀伤实验：
将CAR-小胶质细胞消化成单个细胞随后用完全培养基重悬后计数，以1×104个/孔铺96孔板，根据实验设计，每组实验设置5个复孔，视网膜母细胞瘤Y79以1×104个/孔或5×104个/孔，共培养12h后，加入CCK-8溶液20μl/孔，在细胞培养箱内继续孵育0.5-4h，本发明中细胞继续孵育2h后再450nm测定吸光度，测量后通过OD值计算细胞杀伤比，如图13所示，CAR-GD2显著杀伤视网膜母细胞瘤Y79细胞。
实施例7、CAR-小胶质细胞细胞因子释放检测
CAR基因编辑细胞最强的副作用包括细胞因子释放过多，引起对正常组织的毒性。CAR-小胶质细胞与肿瘤细胞共培养后细胞因子释放水平通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。使用ELISA试剂盒(Biolegend)定量培养上清中人IL-6和TNF-α的浓度。将标准品和培养上清加入相应孔中，标准品和细胞培养上清中的IL-6或TNF-α。结合到固定的捕获抗体上。然后加入生物素化的单克隆抗人IL-6或TNF-α定检测抗体，形成抗体-抗原-抗体“三明治”。随后加入Avidin-HRP试剂，然后加入TMB底物。最后，在孔中加入停止液终止反应。利用微孔板读取器在450nm处测量每孔的吸光度。如图14所示，ELISA检测CAR-GD2小胶质细胞与视网膜母细胞瘤Y79共培养后细胞因子分泌与对照组相当，产生细胞因子毒性的风险低，副作用小。
上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体为基于双唾液酸神经节苷脂的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域；其中：
所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原双唾液酸神经节苷脂的单链抗体；
所述跨膜结构域为CD8α跨膜结构域；
所述共刺激信号传导结构域为CD86信号传导结构域和FcγR1信号传导结构域的组合。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：
所述针对肿瘤表面抗原双唾液酸神经节苷脂的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述CD8α跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述共刺激信号传导结构域为CD86信号传导结构域和FcγR1信号传导结构域的顺序组合，所述共刺激信号传导结构域的的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体还包括信号肽；所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体还包括铰链区，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求1至4中任一所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体由信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、2A序列和绿色荧光蛋白序列串联而成，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.一种含有嵌合抗原受体的慢病毒，其特征在于：包括权利要求1至5中任一项所述的嵌合抗原受体。
7.表达嵌合抗原受体的小胶质细胞的制备方法，所述表达嵌合抗原受体的小胶质细胞为表达权利要求1至5中任一所述的嵌合抗原受体的小胶质细胞，其特征在于：包括如下步骤：将小胶质细胞培养后，感染权利要求6所述的慢病毒，进行阳性克隆筛选，挑选阳性克隆细胞进行培养鉴定，即得到表达嵌合抗原受体的小胶质细胞。
8.根据权利要求7所述的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞的制备方法，其特征在于：所述小胶质细胞为小胶质细胞系HMC3；所述表达嵌合抗原受体的小胶质细胞为CAR-GD2小胶质细胞。
9.权利要求7或8所述的方法制备得到的表达嵌合抗原受体的小胶质细胞。
10.表达嵌合抗原受体的小胶质细胞在制备治疗表达双唾液酸神经节苷脂抗原的肿瘤的药物中的应用。
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