CN107354199A - 一种检测靶向cd30的cart细胞中car表达的荧光定量试剂盒 - Google Patents

一种检测靶向cd30的cart细胞中car表达的荧光定量试剂盒 Download PDF

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CN107354199A CN201710538822.9A CN201710538822A CN107354199A CN 107354199 A CN107354199 A CN 107354199A CN 201710538822 A CN201710538822 A CN 201710538822A CN 107354199 A CN107354199 A CN 107354199A
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Abstract

本发明涉及一种检测靶向CD30的CAR T细胞中CAR表达的荧光定量试剂盒，包括第一引物探针组和第二引物探针组，所述第一引物探针组中包括SEQ ID NO:1所示的探针1以及SEQ ID NO:2所示的引物1F和SEQ ID NO:3所示的引物1R，所述第二引物探针组中包括SEQ ID NO:4所示的探针2以及SEQ ID NO:5所示的引物2F和SEQ ID NO:6所示的引物2R，所述探针1和探针2都为TaqMan探针，所述CAR T细胞中转染了带有编码CD30 SCFV的CAR核酸片段的表达载体质粒，并且所述编码CAR核酸的序列如SEQ ID NO:7所示。通过本发明的试剂盒及检测方法，可精确检测CAR在CAR T细胞中的表达情况，并根据检测结果选择CAR表达量最高的CAR T细胞回输至人体内。

Description

一种检测靶向CD30的CART细胞中CAR表达的荧光定量试剂盒
技术领域
本发明涉及细胞免疫治疗领域，更特别地，涉及一种一种检测靶向CD30 的CAR T细胞中CAR表达的荧光定量试剂盒以及检测方法。
背景技术
CD30是霍奇金淋巴瘤和一些非霍奇金淋巴瘤的恶性细胞常常表达的细胞表面抗原，因此，在治疗这类疾病时，最好能够使用可靶向CD30的药物或疫苗。
细胞免疫治疗是一种正在兴起的肿瘤治疗方法，其通过分子生物学技术构建嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的表达载体，并将该表达载体导入到从人体分离的有核细胞中，诱导其表达CAR并且分化成T 细胞后，将其回输至人体。表达CAR的T细胞能够特异性识别靶细胞，并对其进行杀伤。
在这种治疗方法中，CAR的作用至关重要。嵌合抗原受体包括单链抗体结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域。其中，单链抗体结构域将T细胞靶向目标细胞，胞内信号结构域释放胞内信号，启动T细胞的杀伤活性。
此外，在将CAR表达载体导入T细胞中后，需要高效和准确的方法来检测所得到的CAR T细胞中CAR是否被有效表达。
荧光定量PCR是一种精确检测目的基因表达情况的技术。根据化学原理的不同，荧光定量PCR可分为探针法和染料法。其中Taqman荧光定量技术以Taqman荧光探针为基础。Taqman荧光探针，也称为水解探针，为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，荧光监测系统就可以接收到荧光信号。具体地，当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭；在进行延伸反应时，Taq聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。一分子产物生成伴随一分子荧光信号产生，随着扩增产物的增加，荧光增强。
Taqman水解探针由于其特异性较高而广范地应用于荧光定量PCR实验。一般情况下，为了保证理想的扩增效率(90-110％)，要求荧光定量PCR实验的扩增产物长度不宜超过400bp，更理想的最好能在50-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。由于Taqman探针的苛刻要求，导致探针和扩增引物的位置都不容易选取。此外，还需考虑到在CAR表达载体构建过程中或表达载体在CAR T细胞内的复制过程中发生突变的情况，如果突变位置正好出现在探针或扩增引物的范围内，则有可能因为错配而影响检测结果。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种检测靶向CD30的CAR T细胞中CAR 表达的荧光定量试剂盒，所述CAR T细胞中转染了带有编码CD30 SCFV的CAR 核酸片段的表达载体质粒，并且所述编码CAR核酸的序列如SEQ ID NO:7所示，所述荧光定量试剂盒包括第一引物探针组和第二引物探针组，所述第一引物探针组中包括SEQ ID NO:1所示的探针1以及SEQID NO:2所示的引物 1F和SEQ ID NO:3所示的引物1R，所述第二引物探针组中包括SEQ IDNO:4 所示的探针2以及SEQ ID NO:5所示的引物2F和SEQ ID NO:6所示的引物 2R，所述探针1和探针2都为TaqMan探针，所述CAR T细胞中转染了带有编码CD30 SCFV的CAR核酸片段的表达载体质粒，并且所述编码CAR核酸的序列如SEQ ID NO:7所示。
优选地，所述探针1和探针2的5’端均带有荧光基团5-FAM，3’端均带有淬灭基团6-TAMRA。
优选地，所述荧光定量试剂盒还包括标准品、阳性对照样品和阴性对照样品，其中所述标准品为包含定量所述表达载体质粒的样品，所述阳性对照样品为含有SEQ ID NO:7所示序列的DNA样品，所述阴性对照样品为不含SEQ ID NO:7所示序列的DNA样品。
本发明还提供了一种检测靶向CD30的CAR T细胞中CAR表达的方法，其包括以下步骤：
S1：从CAR T细胞提取RNA并反转录成cDNA；
S2：将所述cDNA分别与所述第一引物探针组和第二引物探针组加上荧光定量PCR试剂构成第一荧光定量PCR体系和第二荧光定量PCR反应体系；
S3：进行荧光定量PCR反应，并通过所述荧光定量PCR反应的数据确定 CAR T细胞中的CAR表达量。
优选地，在S2前进行步骤S4：使用梯度稀释的所述标准品制作标准曲线。
优选地，在S2中还分别使用所述阳性对照和阴性对照样品配制了阳性对照PCR体系和阴性对照PCR体系，并且所述阳性对照PCR体系和阴性对照 PCR体系在S3中与所述第一荧光定量PCR体系和第二荧光定量PCR反应体系在同一荧光定量PCR仪中进行荧光定量PCR反应。
通过本发明的试剂盒及检测方法，可精确检测CAR在CAR T细胞中的表达情况，并根据检测结果选择CAR表达量最高的CAR T细胞回输至人体内，以达到最佳的抗肿瘤治疗效果。
附图说明
图1为实施例中编码CD30嵌合抗原受体的DNA片段的示意图；
图2为荧光定量标准曲线；
图3为经检测得到的样品1-4的模板拷贝数；
图4为样品1-4的CAR T细胞对CD30阳性细胞的杀伤活性；
图5为样品1-4的CAR T细胞对不表达CD30的细胞的杀伤活性；。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.CD30 SCFV嵌合抗原受体表达质粒的构建
通过人工合成SEQ ID NO:7所示的长度为1623bp的DNA片段，其中，第1-819位的核苷酸编码CD30 SCFV，第820-954位的核苷酸编码CD8铰链区，第955-1158位的核苷酸编码CD28，第1159-1284位的核苷酸编码41BB，第1285-1623位的核苷酸编码CD3(图1)。后面三个区域构成胞内信号区。
将上述DNA片段插入慢病毒表达载体pLVX-IRES-puro的CMV启动子下游，得到CD30SCFV嵌合抗原受体表达质粒。
2.CD30 SCFV嵌合抗原受体表达质粒转染T细胞
1)慢病毒的包装制备
将CD30 SCFV嵌合抗原受体表达质粒和辅助质粒psPAX2、pMD2.G以 4:3:1的比例用lipo2000转染试剂(Invitroge)转染，具体方法见lipo2000 转染试剂说明书。转染48小时后，将含有病毒的细胞培养上清吸入EP管中， 4℃ 2000g离心10min，转移上清至新EP管中，4.5μm滤器过滤后-80℃保存。
2)T细胞的制备
取10ml健康人的新鲜血液，用淋巴细胞分离液(Mediatech)分离外周血单核细胞，具体方法见说明书。用含有300IU/ml的IL-2、50ng/ml 的OKT-3和5％人AB血清(Invitrogen)的AIM-V培养基(Invitrogen)诱导培养48h，得到T细胞。
3)慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的扩增培养
从-80℃取出2ml病毒液，加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺(购自Sigma 公司)，用该病毒液重悬1×106个上述诱导培养的T细胞。将细胞悬液加入 24孔板的1个孔中，1000g，32℃，离心1h。37℃，5％CO2培养箱内培养8 h后，1000g，32℃，再次离心1h。吸弃1.4ml培养上清，加入1.4ml新鲜的含有300IU/ml的IL-2、50ng/ml的OKT-3和5％人AB血清的AIM-V 培养基，继续培养。每2-3天检测一次细胞浓度，当细胞浓度达到2×106个/ml时，1000g，32℃，离心1h。吸取1ml细胞悬液，加入另一个孔中，分别向两个孔中加入1ml新鲜的含有300IU/ml的IL-2和5％人AB血清的 AIM-V培养基，继续扩大培养。如此反复，直至细胞扩增至足够的用量。
3.检测CAR T细胞中CAR的表达情况
1)使用的探针和扩增引物
在检测过程中使用两组探针和引物分别进行检测。
探针引物组1包括以下成分：
探针1：5’-agcctacatg caactgaaca gcctga-3’(SEQ ID NO:1)；
引物1F：5’-actgcagaca agtcctccaa ca-3’(SEQ ID NO:2)；
引物1R：5’-tagtccgctc ttcttgcaca gt-3’(SEQ ID NO:3)；
探针引物组2：包括以下成分：
探针2：5’-cacctccgcc tgaaccgcct ccacc-3’(SEQ ID NO:4)；
引物2F：5’-catgcaactg aacagcctga catc-3’(SEQ ID NO:5)；
引物2R：5’-gatccgccac cgccagag-3’(SEQ ID NO:6)；
探针1和探针2的5’端均带有荧光基团5-FAM，3’端均带有淬灭基团 6-TAMRA。
2)标准曲线的制作
荧光定量PCR检测试剂于冰上融化。在无菌操作台中依次取荧光定量 PCR检测试剂24μl，加入标准品或阴性对照DNA 1μl于PCR反应管中充分混合，每个浓度的标准品进行三次重复。操作中避免直射光照射。把荧光定量PCR反应管置于荧光定量PCR仪上，设置反应条件为：95℃ 1min；95℃ 10sec，57℃ 15sec，72℃ 35sec，共40个循环；95℃ 15sec，60℃1min， 95℃ 30sec，60℃ 15sec。对图2所示的检测标准曲线进行分析可见，模板的5个稀释点均在同一条直线上，表明当基因拷贝数在1.0×108-1.0×104范围内时，检测域值与拷贝数之间均呈良好的线性关系；回归分析显示，R2＝ 0.9923；可见本发明设计的引物及荧光探针的特异且工作性能良好。
3)CAR T细胞中CAR表达量的检测
从上述得到多个CAR T细胞样品中取出来自四个不同的孔的CAR T细胞 (样品1-4)，采用Trizol法提取总RNA，用SuperScriptTM Preamplification System forFirstStrand cDNA Synthesis试剂盒 (Invitrogen)做反转录，制备cDNA。将四种来源的cDNA、阳性对照样品、阴性对照样品分别与第一探针引物组和第二探针引物组以及荧光定量PCR试剂混合分别得到各样品的荧光定量PCR反应体系，每个样品三个重复。
进行以下PCR反应：95℃ 1min；95℃ 10sec，57℃ 15sec，72℃ 35sec，共40个循环；95℃ 15sec，60℃ 1min，95℃ 30sec，60℃ 15sec。反应结束后，得到反应产物。
荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点；阴性对照无CT值并且无扩增曲线，阳性对照点位于标准曲线上，并且其CT 值＜32，说明该次反应数据是有效的。
通过计算，样品1-4的cDNA起始模板拷贝数如图3所示。
4)样品1-4的CAR T细胞对CD30阳性的恶性细胞的特异性杀伤活性
分别取5×104个霍奇金淋巴瘤细胞(高表达CD30)和人成纤维细胞BJ 接种于96孔板，过夜培养后，分别向两种细胞培养孔中按效应细胞(E)：靶细胞(T)＝10:1和3:1的比例加入CAR-T细胞、对照病毒修饰的T细胞 (GFP-T)和未加修饰的T细胞(T)。孵育5h后，按照LDH细胞毒性分析试剂盒(Cayman Chemical)说明书进行操作，检测CAR T细胞对霍奇金淋巴瘤细胞的特异杀伤活性。结果显示CAR T细胞组与GFP-T组和T细胞组相比，在效靶比为10:1和3:1的情况下，样品3和4对高表达CD30的霍奇金淋巴瘤细胞都具有更强的杀伤作用，而样品2的杀伤活性显著更弱(图4)；对不表达CD30的人成纤维细胞BJ的杀伤作用差异不大(图5)。因此CAR T 细胞对高表达CD30的肿瘤细胞具有特异杀伤活性。
由此可见，CAR表达量越高的CAR T细胞对CD30阳性细胞的杀伤性越大，可通过该方法筛选最高效地CAR T细胞回输至体内以达到最好的抗肿瘤效果。
序列表
<110> 武汉波睿达生物科技有限公司
<120> 一种检测靶向CD30的CAR T细胞中CAR表达的荧光定量试剂盒
<130> 1
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agcctacatg caactgaaca gcctga 26
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
actgcagaca agtcctccaa ca 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tagtccgctc ttcttgcaca gt 22
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cacctccgcc tgaaccgcct ccacc 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
catgcaactg aacagcctga catc 24
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gatccgccac cgccagag 18
<210> 7
<211> 1623
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtct 60
agaatggccc aggtgcaact gcagcagtca ggggctgagc tggctagacc tggggcttca 120
gtgaagatgt cctgcaaggc ttctggctac acctttacta cctacacaat acactgggta 180
agacagaggc ctggacacga tctggaatgg attggataca ttaatcctag cagtggatat 240
tctgactaca atcagaactt caagggcaag accacattga ctgcagacaa gtcctccaac 300
acagcctaca tgcaactgaa cagcctgaca tctgaggact ctgcggtcta ttactgtgca 360
agaagagcgg actatggtaa ctacgaatat acctggtttg cttactgggg ccaagggacc 420
acggtcaccg tctcctcagg tggaggcggt tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga 480
tcggacatcg agctcactca gtctccaaaa ttcatgtcca catcagtagg agacagggtc 540
aacgtcacct acaaggccag tcagaatgtg ggtactaatg tagcctggtt tcaacaaaaa 600
ccagggcaat ctcctaaagt tctgatttac tcggcatctt accgatacag tggagtccct 660
gatcgcttca caggcagtgg atctggaaca gatttcactc tcaccatcag caatgtgcag 720
tctgaagact tggcagagta tttctgtcag caatatcaca cctatcctct cacgttcgga 780
gggggcacca agctggaaat caaacgggcg gatcccgcca ccacgacgcc agcgccgcga 840
ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 900
cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatttttgg 960
gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct tgctatagct tgctagtaac agtggccttt 1020
attattttct gggtgaggag taagaggagc aggctcctgc acagtgacta catgaacatg 1080
actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc cctatgcccc accacgcgac 1140
ttcgcagcct atcgctccaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 1200
tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 1260
gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 1320
taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 1380
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 1440
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1500
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1560
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1620
taa 1623

Claims (6)

1.一种检测靶向CD30的CAR T细胞中CAR表达的荧光定量试剂盒，所述CAR T细胞中转染了带有编码CD30SCFV的CAR核酸片段的表达载体质粒，并且所述编码CAR核酸的序列如SEQ ID NO:7所示，其特征在于，包括第一引物探针组和第二引物探针组，所述第一引物探针组中包括SEQ ID NO:1所示的探针1以及SEQ ID NO:2所示的引物1F和SEQ ID NO:3所示的引物1R，所述第二引物探针组中包括SEQ ID NO:4所示的探针2以及SEQ ID NO:5所示的引物2F和SEQ ID NO:6所示的引物2R，所述探针1和探针2都为TaqMan探针。
2.根据权利要求1所述的荧光定量试剂盒，其特征在于，所述探针1和探针2的5’端均带有荧光基团5-FAM，3’端均带有淬灭基团6-TAMRA。
3.根据权利要求1或2所述的荧光定量试剂盒，其特征在于，还包括标准品、阳性对照样品和阴性对照样品，其中所述标准品为包含定量所述表达载体质粒的样品，所述阳性对照样品为含有SEQ ID NO:7所示序列的DNA样品，所述阴性对照样品为不含SEQ ID NO:7所示序列的DNA样品。
4.一种检测靶向CD30的CAR T细胞中CAR表达的方法，其特征在于，采用如权利要求3所述荧光定量试剂盒实现所述方法，包括以下步骤：
S1：从CAR T细胞提取RNA并反转录成cDNA；
S2：将所述cDNA分别与所述第一引物探针组和第二引物探针组加上荧光定量PCR试剂构成第一荧光定量PCR体系和第二荧光定量PCR反应体系；
S3：进行荧光定量PCR反应，并通过所述荧光定量PCR反应的数据确定CAR T细胞中的CAR表达量。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在S2前进行步骤S4：使用梯度稀释的所述标准品制作标准曲线。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在S2中还分别使用所述阳性对照和阴性对照样品配制了阳性对照PCR体系和阴性对照PCR体系，并且所述阳性对照PCR体系和阴性对照PCR体系在S3中与所述第一荧光定量PCR体系和第二荧光定量PCR反应体系在同一荧光定量PCR仪中进行荧光定量PCR反应。
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