CN104204224B - 用于诊断人免疫缺陷病毒感染的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种在样品中鉴定人免疫缺陷病毒(HIV)的方法。本发明涉及使用多个荧光标记的寡核苷酸探针和流式细胞术检测来自粘膜表面的巨噬细胞中存在或不存在HIV。本发明对于检测血清转化前的HIV感染特别有用。
Description
本申请要求2011年11月23日提交的美国临时申请号61/563,216的优先权，其公开内容通过引用并入本申请。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明在美国国立卫生研究院提供的合同号为HL100928的政府支持下进行。政府享有本发明的某些权利。
发明领域
本发明基本涉及人免疫缺陷病毒感染的检测和诊断，特别是在急性期早期阶段对人免疫缺陷病毒(HIV)感染的检测。
背景技术
急性HIV(AHI)感染是在血清转化之前的感染阶段并且对这一阶段HIV感染的正确诊断目前尚未解决，这会严重影响公众健康——AHI与在感染过程中最高速度的继发性HIV传播具有相关性。
血清转化历来被认为出现在感染后21天左右并且在大多数情况下在感染3至8周内完成，处于AHI阶段的患者采用常规方法如ELISA或Western印迹进行检测时结果将为阴性。并且尽管在临床上可以对AHI进行诊断，但是其症状是不明显的且仅存在于半数感染的个体中。
在AHI期间HIV传播风险的升高，因为事实上AHI的特征为在感染的患者出现获得性免疫缺陷症状(AIDS)之前其具有最高水平的病毒血症，在感染后约21天达到峰值。然后由于出现免疫应答和血清转化导致其急剧下降。事实上，在病毒载量和HIV传播速度之间存在较强的正相关–病毒载量每增加一个对数则传播风险相应增加2.45倍。行为因素也极大促进了在AHI期间HIV传播速度的加快–感染个体在AHI期间很少意识到其感染状态并且可能持续进行导致其感染的活动，这使得未感染的群体处于风险中。因此，对于能够正确诊断AHI存在较大的需求。本发明满足了这种需求。
发明概述
本发明提供了用于检测HIV的工具和方法。所述方法是专门用于检测来自粘膜表面的巨噬细胞中的HIV的。特别地，本发明能够检测在个体中血清转化前巨噬细胞的HIV感染。所述方法包括提供从粘膜表面获得的样品，其中所述样品包含巨噬细胞。将所述巨噬细胞与同HIV mRNA互补的多个荧光标记的寡核苷酸探针接触。所述探针均具有独特的序列并且其同靶标HIV mRNA的互补性是互不重叠的。在特定实施方式中，所述多个探针与HIV GagmRNA或HIV gp120mRNA互补。在某些实施方式中，所述多个探针能够包含多达并包括48个的探针。
一旦将所述荧光标记的探针引入巨噬细胞，则使用荧光原位杂交(FISH)联合流式细胞术根据所述巨噬细胞发出荧光信号将巨噬细胞鉴定为已感染HIV，或者根据巨噬细胞中不发出或发出不同的荧光信号将巨噬细胞鉴定为未感染HIV。根据样品中存在或不存在HIV的鉴定结果，可以将样品来源的个体分别诊断为HIV阳性或HIV阴性。
在通常情况下，所述方法用于测定来自尚未血清转化出抗-HIV抗体的个体的样品中的HIV感染。在某些方面，所述方法包括通过从粘膜表面分离样品以鉴定HIV感染，所述样品包含巨噬细胞，其中在获得和/或检测样品前，样品中的至少一些巨噬细胞已经在体内被感染了一段时间，如感染16周以内至1天以内。
本发明还提供了包括多个探针的试剂盒，其用于实施本发明的方法。
附图简述
图1A：使用HIV感染来源于PBMC的巨噬细胞并孵育6天以建立感染。然后，将这些巨噬细胞加入DQ BSA小珠并且孵育180分钟以促进荧光报告底物的蛋白水解过程。孵育结束后收集细胞、固定并使用偶联了PE的针对HIV p24蛋白的抗体标记。通过FISH联合细胞分选对所有样品进行分析并与未经处理的DQ BSA颗粒、内化180分钟作为对照的BSA颗粒、未经感染的来源于PBMC的巨噬细胞进行比较(其还使用抗-p25抗体作为探针并且测定为HIV阴性)。图1B。加入PBMC的IgG包被的乳胶小珠(箭头)(120分钟)的电子显微镜照片。乳胶小珠吞噬体不与参与病毒出芽的细胞(箭头位置)相交。在这些区域能够看见小囊泡。
图2：对来自HIV血清阴性(HIV-)和HIV血清阳性(HIV+)个体的肺泡巨噬细胞进行基于FISH的流式细胞术分析的典型图。
图3A：对来自HIV血清阴性但对直接针对HIV Gag mRNA的FISH探针为阳性反应的个体的肺泡巨噬细胞进行基于FISH的流式细胞术分析的典型图。阳性巨噬细胞的数量变化很大并且多达巨噬细胞总数的60％。图3B：图中显示了在8个使用本发明的方法进行肺泡巨噬细胞分析后出现血清转化的个体中，肺泡巨噬细胞的阳性％与距血清转化的时间呈现负相关。
图4：来自个体的血浆样品的env基因的聚合酶链式反应(PCR)扩增子的电泳分离典型照片，其中5个个体为肺泡巨噬细胞HIV+ve，而血清-ve，但是随后出现血清转化，两个个体AM为HIV+ve，但是未出现血清转化，三个长期HIV感染的个体以及两个未感染HIV的个体。
发明详述
本发明提供了用于测定HIV感染的方法和组合物并且其特别适于在个体发生血清转化前进行该检测。因此，在本发明的不同实施方式中提供了对AHI的诊断，并且还包括确定不存在AHI。
在不同的方面，本发明有助于鉴定巨噬细胞是否被HIV感染。本发明提供了用于在HIV感染后某些时间点鉴定巨噬细胞中HIV感染的组合物和方法。
本发明部分基于我们在HIV感染的个体的肺泡巨噬细胞中令人惊奇的发现，所述个体HIV血清阴性，并且经若干其他检测确定HIV感染为阴性，下文将对此进行进一步的描述。就此而言，确定HIV感染后早期事件的顺序是具有挑战性和关键性的研究领域。多项研究表明在早期感染存在“隐蔽”期在此阶段在血液中无法检测到病毒。然而，对初始被感染的细胞类型的鉴定，以及随后病毒扩增的机制和位点还有待阐明。在综述中被多次重申的，较为公认的观点是在被树突状细胞摄取跨过粘膜后，病毒被递呈至CD4细胞。作为结果的病毒扩增导致粘膜淋巴细胞的耗竭，并且在淋巴结建立最初的感染病灶。其对限制性免疫应答发生以前病毒向外周的扩张负责。然而，与主流理论不同的是，本发明发现了在HIV血清-ve个体的肺泡巨噬细胞中HIV的扩张，所述个体随后血清转化为HIV血清+ve。这些个体缺乏可检测的外周病毒血症，并且其距血清转化的时间与在其肺泡巨噬细胞中的病毒负荷成反比。这些发现表明在急性期感染阶段存在病毒扩增的替代方案并且本发明充分利用了这一发现以提供改进的HIV诊断。
在通常情况下，本发明涉及使用多个靶向HIV mRNA的寡核苷酸探针以鉴定已被HIV感染的巨噬细胞。所述探针包括可检测的标记，其在具有特定波长的光的激发下发射荧光信号。所述探针适用于FISH分析，可以凭借流式细胞术程序对荧光信号进行检测，其与荧光活化细胞分选(FACS)类似但没有分选步骤。可以使用荧光信号鉴定巨噬细胞是HIV阳性或HIV阴性。因此本发明包括基于FISH和流式细胞术组合的对HIV感染的分析。
与探针连接的可检测标记可以包括大量不同的荧光团中的任意荧光团，其有时在本领域中指“荧光染料”。因此，将本申请中的可检测的标记认为是“荧光标记”并且将包括荧光标记的寡核苷酸探针认为是“荧光标记的”。
能够用于基于核酸的荧光显微成像和/或FISH，和/或FISH/流式细胞术的任意荧光标记均能够用于制备本发明中使用的荧光标记的探针。如有必要，基于FISH的流式细胞术可以包括将细胞分选至不同容器中。适宜的荧光标记是本领域公知的和可购买得到的。一些非限制性的例子包括例如以商标名销售的的荧光染料如Quasar570、Quasar670和Quasar705，其发射光最大值分别为570、670和705nm。其他适宜的荧光标记包括但不限于以商标名Alexa销售的那些，以及二乙基氨基香豆素(DEAC)、青色素3(Cy3)、青色素5(Cy5)、荧光素(FITC)、丽丝胺、R110、R6G、四甲基罗丹明(TAMRA)和德克萨斯红。在某些实施方式中，所述荧光标记物在670nm发出荧光，随后在647nm激发。在某些实施方式中，荧光标记的探针能够购买得到。例如，在本发明的一个实施方式中，由加州诺瓦托的生物检索技术公司以商标名在售的荧光标记探针可用于本发明。
可以使用任意适宜的技术将荧光标记整合入寡核苷酸探针中。在一些非限制性例子中，将荧光标记与经修饰的核苷酸化学连接以提供例如存在于寡核苷酸探针中的荧光团偶联的核苷酸。
在一个方面，本发明包括检测样品中的HIV，其中所述样品包含来自粘膜表面的巨噬细胞。所述的粘膜表面可以是任意粘膜表面包括但不一定限于肺泡粘膜、颊粘膜、食道粘膜、胃粘膜、肠粘膜、鼻粘膜、口腔粘膜、支气管粘膜、子宫粘膜、阴茎粘膜、阴道粘膜、肛门粘膜和子宫内膜粘膜。在一个实施方式中，来自粘膜表面的样品包括个体经口或鼻途径排出的粘液样品。可以使用任意适宜的技术获得包括或预计包括巨噬细胞的粘膜样品。在某些实施方式中，所述样品可以由从粘膜表面擦拭、刮擦或活检获得。在一个实施方式中，所述样品包括肺泡粘膜。在某些方法中，所述包括肺泡粘膜的样品通过支气管肺泡灌洗获得。
本发明预计用于检测任意HIV类型、组和亚型。在通常情况下，本发明将用于检测HIV-1，并且通常地用于HIV-1M组。预计目前已知的M组亚型(或分化体)A、B、C、D、F、G、H、J和K中的任意一个将易于通过实施本发明被检测，这在某些实施方式中可能需要调整探针序列以使其与这些亚型中存在的Gag和gp120基因的任意差异互补。
可以采用本领域技术人员公知的细胞表面标记物(如CD14、CD40、CD11b、EMR1(人)、溶菌酶M、MAC-1/MAC-3和CD68)对通过本发明方法检测的巨噬细胞进行鉴定。在某些实施方式中，被检测的样品不包括循环细胞如循环单核细胞。在某些实施方式中，所述样品不包括外周血单核细胞(PBMC)。在某些实施方式中，实施所述方法分析的唯一细胞类型是巨噬细胞。
一旦获得了包括巨噬细胞的样品就将其与多种具有独特序列的荧光标记的寡核苷酸探针接触，其中所述探针与HIV mRNA互补。在某些实施方式中，所述探针与HIV GagmRNA、或与HIV gp120mRNA或者与其组合互补。这些HIV mRNA的序列是本领域公知的。
本发明利用了多种荧光标记的探针，其能够以一个或多个探针集合的形式提供。在不同实施方式中，多个荧光标记的探针包括第一探针集合，第一探针集合均包括与HIVGag mRNA互补的序列，或者第二探针集合，第二探针集合均包括与HIV gp120mRNA互补的序列，或者第一探针集合和第二探针集合的组合。
在各探针集合中的各探针均包括或由已知长度的独特的、确定的核苷酸序列组成。例如，第一探针集合将含有多个成员，其均与例如HIV Gag mRNA互补。各探针均包括或由相对于该集合中的其他探针不同的且非重叠的序列组成，也就是说所述探针不与同其互补的信息序列重叠。各探针的全部核苷酸序列可以与特定的HIV mRNA序列互补。类似地，可以提供第二探针集合，其中其各成员可以与不同于HIV Gag mRNA的HIV mRNA互补，如HIVgp120mRNA。与第一探针集合相同，第二集合中的各探针均包括或由相对于该集合中的其他探针不同的且非重叠的序列组成。
各探针集合均可以包括长度为7-40个核苷酸的探针，并且包括其间的所有整数值以及整数值之间的所有范围。在不同实施方式中，所述探针的长度为15-30个核苷酸。在一个实施方式中，所述探针的长度为20个核苷酸。所述探针可以包括经修饰的核苷酸，除了对核苷酸进行修饰以包括可检测的标记以外，其还可以包括改善探针的稳定性或结合亲和性的修饰。这种修饰的例子以及制备其的方法均是本领域公知的。此外，所述核苷酸可以通过磷酸二酯键以外的键连接。核苷间键的例子包括但不限于p磷酸烷基酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸酯、硫代烷基磷酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、吗啉代、乙酰胺、羧甲基酯或其组合。
所述探针能够与在AHI期间在感染的巨噬细胞中表达或存在的任意HIV mRNA互补。如上文所讨论的，在特定实施方式中，所述探针与HIV Gag mRNA或与HIV gp120mRNA互补。
所述探针集合能够含有可变数量的探针。在一个实施方式中，所述集合包括至少20个探针。在特定实施方式中，所述集合包括24个探针至50个探针。在一个实施方式中，所述集合包括至少一个第一探针集合，其包括靶向一个HIV mRNA的48个探针。
在一个实施方式中，第一探针集合由48个靶向HIV Gag mRNA的探针组成。在一个实施方式中，所述靶向HIV Gag mRNA的48个探针具有如表1所示的SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:48的序列。
表1
在另一个实施方式中，第二探针集合由靶向HIV gp120mRNA的48个探针组成。在一个实施方式中，所述靶向HIV gp120mRNA的48个探针具有如表2所示的SEQ ID NO:49至SEQID NO:96的序列。
表2
在不同实施方式中，所述方法包括使用包含或由表1所示的序列组成的荧光标记的探针，或包含或由表2所示的序列组成的荧光标记的探针，或者表1和表2中的探针的组合。本发明包括使用表1探针、表2探针以及表1和表2探针的混合物的全部组合和部分组合。在某些实施方式中，本发明使用的唯一的探针是表1中探针的组合(其中在这种实施方式中包括表1中全部探针的组合)，或者表2中探针的组合(其中在这种实施方式中包括表2中全部探针的组合)。
在通常情况下，可以使用公知的技术将本发明荧光标记的探针引入样品中的巨噬细胞以便对HIV进行检测。这些技术通常涉及使细胞透化以及在溶液如缓冲液中将细胞与探针的组合孵育，允许经过一段时间以供探针杂交，随后将过量的/未结合的探针除去。因此，在一个实施方式中，本发明提供了制备包括分离的巨噬细胞的组合物，其中所述巨噬细胞来自粘膜表面，并且其中所述巨噬细胞包括与HIV mRNA互补的探针集合。在某些实施方式中，所述组合物包括巨噬细胞，所述巨噬细胞反而包括多个与HIV mRNA杂交的探针。在某些实施方式中，在引入探针的一定时间段内，所述巨噬细胞被HIV感染。在某些实施方式中，本发明的方法在从HIV血清阴性个体中获得样品后的一定时间段内实施。
一旦将探针引入巨噬细胞，则使用流式细胞仪对所述巨噬细胞进行检测。任意种类的流式细胞仪均是市售的并且能够用于检测根据本发明的样品。在通常情况下，所述流式细胞仪适于将单个细胞暴露于特定激发波长的光下，并且用于检测由巨噬细胞发射的特定波长的荧光，其是由所连接的探针上的荧光染料被激发而产生的。能够对荧光的存在或不存在以及荧光的强度进行测定和定量以分别鉴定HIV阳性和HIV阴性细胞，并且如有必要可以对各类型(感染的和非感染的)的各细胞进行计数。而且，可以测定HIV阳性与HIV阴性细胞的比率、百分率等并且用于评估获得巨噬细胞的个体HIV感染的阶段或严重程度。如有必要，可以将HIV阳性和HIV阴性细胞分选至单独的容器，以便将基于FISH的流式细胞术方法转变为FACS方法。
在某些实施方式中，还可以通过巨噬细胞标记物(如指示巨噬细胞细胞类型的细胞表面标记物)对本发明中经流式细胞术分析的巨噬细胞进行表征。例如，可以使用针对巨噬细胞CD45、CD206、HLA-DR或其组合的可检测标记的抗体在流式细胞术分析期间对巨噬细胞进行鉴定。所述可检测的标记可以是上文所述类型的荧光标记，并且在流式细胞术分析期间可以通过同检测来自荧光标记的寡核苷酸探针的荧光信号相同的方法对来自抗体的荧光信号进行检测。在这方面，我们对HIV感染的肺泡巨噬细胞的表型表征确证了其一致性并且结果显示其为HLA-DR(CD74)和甘露糖受体(CD206)的弱表达子。在来自慢性HIV+ve个体的HIV感染的AM中对HLA-DR和CD206的表达进行了类似的重新比对，在其中我们也观察到CD45具有恒定水平的表达，这表明在表面蛋白表达的下调中存在一定程度的选择性。
在一个实施方式中，采用本发明的方法进行分析的包含巨噬细胞的样品来自于HIV血清阴性的个体。HIV血清阴性是本领域公知的并且其通常指在来自个体的生物样品中不存在可检测的抗-HIV抗体。因此，血清阴性的个体可以是未被HIV感染的，或者可以是已被HIV感染但尚未针对一种或多种HIV蛋白出现可检测的抗体。在不同实施方式中，来自血清阴性个体的生物样品不具有针对HIV蛋白gp160、gp120、p65、p55、gp41、p32、p24或p18或其组合的可检测的抗体。在一个实施方式中，血清阴性个体根据酶联免疫吸附试验(ELISA)(包括但不一定限于ELISA夹心检测的检测)不具有可检测的抗-HIV抗体。在另一个实施方式中，采用本发明方法分析的包含巨噬细胞的样品来自于在血液样品或者PBMC样品中未检测到HIV(已使用PCR对其进行了检测，PCR引物靶向HIV mRNA或整合的HIV原病毒)的个体的粘膜表面。在血清阴性个体的各个例子中，本发明包括检测已感染HIV的巨噬细胞。
为达成本发明，我们对一些个体进行了多次血清转化检测，针对HIV转化为sera+ve仍需要38周。我们的数据揭示了此前未被关注的异质性程度和由于感染“隐蔽”期而导致的血清转化出现的延迟。我们还记录了所有个体在血清转化过程中的CD4/CD8比率并且观察到了在出现体液免疫以前CD8细胞的经典扩增。我们证明了在出现血清转化时，CD8:CD4比率的反转是由于CD8+T细胞群的扩增和CD4+细胞数量的减少导致的。CD4+细胞的迅速减少与血清阳性的出现被观察到存在更加紧密的联系。这样，由于巨噬细胞代表了传染性病毒长期存活的来源，因此本发明为HIV感染的检测作出了重要的新贡献。
在不同实施方式中，本发明提供了对包括巨噬细胞的样品的检测，所述巨噬细胞在检测进行前的一定时间段内已在体内被感染。例如，可以在感染后24小时内，或者1天至38周内包括其间的各日间隔，或更长的时间段内，在作为巨噬细胞来源的个体HIV血清呈阴性的前提下，对已在体内感染并且来自粘膜表面的巨噬细胞进行检测。在一个实施方式中，所述个体在HIV感染后至少16周血清阴性。在通常情况下，应在从个体中获得巨噬细胞几小时或几天内对其进行检测。在某些实施方式中，如有需要，可在降低温度的条件下，在包括多聚甲醛或乙醇的溶液(如70％的乙醇)中将所述细胞贮存至少2周。
在一个实施方式中，本发明用于预测个体至血清转化的时间。在这个方面，我们发现了在来自粘膜表面的样品中的HIV+巨噬细胞百分率与至血清转化的剩余时间成负相关。换言之，与样品中的巨噬细胞总数相比，HIV+巨噬细胞的百分率越高，血清转化事件可能出现的越快。因此，在不同的方面，本发明可以包括确定巨噬细胞样品中HIV+巨噬细胞的百分率，以及可选地，基于该测定结果为个体设计预测和/或治疗方案。例如，通过使用顺序检测确定HIV+粘膜巨噬细胞的百分率随时间的变化情况，可以评估抗逆转录病毒疗法的疗效。对HIV+粘膜巨噬细胞百分率增加情况的观察为推荐和/或实施对抗逆转录病毒疗法类型、量和/或给药方案的调整提供机会。在某些实施方式中，本发明还包括，在确定样品中的HIV+粘膜巨噬细胞百分率后，给予作为样品来源的个体抗逆转录治疗剂。
在本发明的某些其他方面，还提供了用于鉴定HIV+粘膜巨噬细胞的试剂盒。所述试剂盒可以提供如本申请所述的荧光标记的寡核苷酸探针的任意组合。所述试剂盒可以相应地包括表1、表2或其组合所述的任意或全部的探针。可以将所述探针置于一个或多个密封的、无菌小瓶中。所述试剂盒还可以包括用于将所述探针引入来自粘膜表面的巨噬细胞的试剂、容器等。所述试剂盒可以进一步包括用于从个体的粘膜表面获得包括巨噬细胞的样品以及用于制备供使用本发明的方法分析的巨噬细胞的材料和说明书。
提供下述特定的实施例以解释本发明，但其并非旨在以任何方式进行限定。
实施例1
如图1所示，在HIV体外感染(BaL染色)的来源于人单核细胞的巨噬细胞中，通过使用抗-p24抗体染色的FISH和流式细胞术能够很容易地对感染进行检测。还可以使用电子显微镜对感染水平进行目测检测。然而，当使用抗-p24抗体作为来自HIV阳性(HIV+ve)患者的人肺泡巨噬细胞的探针时，病毒抗原的水平低于流式细胞术的检测下限。为增强信号使用了针对p24、p17、p120和Gag的混合抗体。但是在来自HIV+ve患者的细胞中仍无法检测到HIV。这些结果表明体内的病毒负荷显著低于体外的病毒负荷。
实施例2
由于在实施例1中没有得到阳性结果，因而我们修订了我们的方法即探索性地将FISH作为一项改进HIV检测的灵敏度的技术。我们采用这种方法的原因是在已发表的报告中描述使用这种方法成功地在来自HIV感染患者的淋巴细胞中检测到了HIV。我们首先尝试使用基于商品化流式细胞术的原位HIV-1mRNA对完整的人细胞进行检测。该检测是商品化的，其特征为能够用于任意适于流式细胞术或成像分析的单细胞悬液，并且其适用于细胞系、外周血、分离的组织和体液。其还能够检测无法检测到血浆中病毒负荷的个体中存在的持续HIV-1的复制。然而，我们使用该商品化的检测无法在患者的细胞中或使用缺乏Gag和Pol基因的假病毒感染的8Ef细胞中检测到病毒。然后，我们使用该假病毒作为模板产生单链DNA探针，其具有对应于病毒染色体上若干位点的引物。再一次的，我们未能成功地在患者的细胞或培养的感染细胞中检测到了病毒。
实施例3
为了持续尝试开发具有此前无法达到的灵敏度的检测，我们利用了具有表1和表2所示序列的两个不同的荧光标记探针的集合，其均由加州诺瓦托的生物检索技术公司制备。我们采用利用标记探针的流式细胞术成功检测了来源于HIV+ve患者的样品中人肺泡巨噬细胞中HIV的存在。
实施例4
上述研究和在慢性感染的、HIV血清+ve个体中进行的其他工作证实了在同一个体中对比未感染的肺泡巨噬细胞(AM)我们成功地检测了HIV感染的AM的功能性状态(如图2所示对“HIV-”和“HIV+”进行比较)。然而，然后我们出乎意料且非常惊奇地在来源于两个HIV-(HIV血清-ve)个体的AM中检测到了大量的病毒，最初仅计划将其作为阴性对照。在获得这一发现之后，我们使用本发明的方法在10个HIV血清-ve个体中检测到了HIV，其最显著的是，这些个体在随后均转化为了HIV血清+ve。针对这些个体中感染细胞数量的病毒负荷具有非常高的异质性，其范围为AM的几个百分比至高达60％(图3A)。值得注意的是通过我们的组合荧光探针/流式细胞术的方法在AM中检测到病毒距血清转化为HIV+ve之间的时间与感染的巨噬细胞％的变化趋势是相反的(见图3B)。这有力地表明在早期感染期间髓细胞中的病毒扩增对病毒扩增具有非常重要的意义。为支持这一观点，我们分析了血浆中病毒基因组的丰度，并且尝试从血浆样品中对env基因进行PCR扩增，所述样品来源于AM为HIV+ve而血清-ve但随后出现血清转化的5个个体、AM为HIV+ve但未出现血清转化的2个个体、3个慢性HIV感染的个体和在所有检测中均为HIV阴性的2个个体(见图4)。仅在那些慢性感染的个体中能够扩增出env基因，并且在所有其他组中外周病毒负荷均较低以至于无法检测。这表明在感染的这一早期阶段在循环中具有极低的病毒扩增且在此时检测外周中的病毒存在非常大的挑战。到目前为止，我们检测了来自17个个人的样品，其为HIV-血清-ve，但是在其肺泡巨噬细胞中通过FISH检测到了病毒信号。在AM中病毒感染的水平从约1-2％至高达60％，存在极大差异。在这17个个体中，有8个随后血清转化为HIV+ve。在从肺泡巨噬细胞中检测到HIV开始，至一些个体中出现血清转化时间分别为约6、8、10、12和17周。
因此，本发明提供了一种极其优秀的用于检测早期HIV感染的方法，特别是在血清转化之前的AHI期。
据我们所知，这是首次将基于荧光的流式细胞术用于在血清转化前患者的巨噬细胞中检测HIV。而且，我们在急性HIV感染期间的个体细胞(肺泡巨噬细胞)水平检测到了HIV。此外，我们还证明了在早期急性感染阶段HIV感染被限制在肺泡巨噬细胞，并且这是应被检测的储库以鉴别AHI。
尽管本发明已通过特定实施方式进行了描述，但是常规的修饰对本领域技术人员而言将是显而易见的，并且这种修饰将在本发明的范围内。
Claims (11)
1.一种多个具有荧光标记的寡核苷酸探针在制备检测存在于个体的肺部的粘膜表面人免疫缺陷病毒(HIV)的试剂中的用途，其中所述粘膜表面包含巨噬细胞，其中所述HIV的检测包括步骤：
i)将所述粘膜表面样品与多个具有不同序列的荧光标记的寡核苷酸探针接触，其中所述探针与HIV的mRNA互补；以及
ii)使用荧光原位杂交联合流式细胞术根据所述样品细胞发出荧光信号来鉴定样品细胞被HIV感染或者根据所述样品细胞不发出荧光信号来鉴定其未被HIV感染。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述HIV位于粘膜表面的巨噬细胞中。
3.根据权利要求2所述的用途，其中在所述检测中被HIV感染的巨噬细胞被鉴定出，并且其中在进行步骤i)和步骤ii)之前所述巨噬细胞在体内被HIV感染不超过8周。
4.根据权利要求3所述的用途，其中在进行步骤i)和步骤ii)之前所述巨噬细胞在体内被感染不超过4周。
5.根据权利要求4所述的用途，其中在进行步骤i)和步骤ii)之前所述巨噬细胞在体内被感染不超过1周。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述巨噬细胞被鉴定为未被HIV感染。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述粘膜表面存在于HIV血清反应阴性的个体。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述多个荧光标记的寡核苷酸探针包括至少40个不同的、无重叠的探针，其长度均为10-30个核苷酸。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述多个荧光标记的寡核苷酸探针包括48个不同的、无重叠的探针，其长度均为20个核苷酸。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述多个荧光标记的寡核苷酸探针包括至少40个不同的、无重叠的探针，其长度均为10-30个核苷酸并且与HIV gp120 mRNA互补。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述多个荧光标记的寡核苷酸探针包括48个不同的、无重叠的探针，其长度均为20个核苷酸并且与HIV gp120 mRNA互补。
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| Memory CD4_ T Cells Are the Earliest Detectable Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1)-Infected Cells in the Female Genital Mucosal Tissue during HIV-1 Transmission in an Organ Culture System;Phalguni Gupta等;《JOURNAL OF VIROLOGY》;20021031;第76卷(第19期);摘要，第9869页左栏第二段 * |
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