KR20220136261A

KR20220136261A - 상온 혼성화 연쇄 반응 기반 핵산 검출 플랫폼

Info

Publication number: KR20220136261A
Application number: KR1020220039850A
Authority: KR
Inventors: 함승주; 김은정; 기지선; 이효; 이소정; 박채원
Original assignee: 연세대학교 산학협력단; 인천대학교 산학협력단
Priority date: 2021-03-31
Filing date: 2022-03-30
Publication date: 2022-10-07

Abstract

본 발명은 타겟 핵산 검출용 키트에 관한 것이며, 상기 키트를 이용하여 시료에 존재하는 타겟 핵산 존재 여부를 확인 및 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 유전체 기반이므로 선택도가 높고 온도 조절 장비 및 효소 없이 신호를 증폭할 수 있으므로 현장진단(point-of-care-testing, POCT)에 적합하다.

Description

상온 혼성화 연쇄 반응 기반 핵산 검출 플랫폼{Target nucleic acid detection platform based on hybridization chain reaction}

본 발명은 상온 혼성화 연쇄 반응 기반 타겟 핵산 검출 플랫폼에 관한 것으로, 상온 혼성화 연쇄 반응 기반 타겟 핵산 검출용 키트 및 상기 키트를 이용하여 시료에 존재하는 타겟 핵산 존재 여부를 확인 및 검출하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 유전체 기반이므로 선택도가 높고 온도 조절 장비 및 효소 없이 신호를 증폭할 수 있으므로 현장진단(point-of-care-testing, POCT)에 적합하다.

지금까지 유전자를 검출하는 기술은 PCR(polymerase chain reaction)을 기초로 하는 방법들이 주를 이루었다. PCR은 정성적(qualitative)와 정량적(quantitative) 방법으로 나눌 수 있다. 정석적 방법으로는 PCR, 네스티드 PCR, RT-PCR 및 멀티플렉스 PCR이며 정량적 방법은 cPCR 및 실시간 PCR이 해당된다. 이러한 PCR의 원리는 두 가닥의 DNA를 주형으로 특정 영역을 사이 두고 프라이머라는 짧은 DNA를 각 상보가닥에 결합하여 기질이 되는 4종류의 dNTP의 존재하에 DNA 중합효소의 작용으로 주형의 염기배열에 따라 새로운 DNA가 형성되는 과정이다. 원리는 크게 3단계 과정으로 DNA의 해리(denaturation), 프라이머와 주형 DNA의 결합(annealing) 및 신장(extension) 과정 등으로 구성되며 이러한 과정을 반복함으로써 목적하는 DNA 단편을 대량으로 얻을 수 있다. 1회의 DNA 중합효소 반응으로 DNA가 2배로 되며 n회의 반응을 반복하면 이론적으로 2n 분자수의 DNA를 증폭할 수 있음이 PCR의 원리이다(비특허문헌 1). PCR 증폭에 영향을 미치는 인자로는 PCR 과정의 각 단계별 반응 온도와 시간, PCR 반응 용액 내의 구성성분의 조성 상태(주형 DNA의 순도, dNTP 농도, 마그네슘 농도, DNA 중합효소의 종류 및 농도, Mg 이온의 농도), PCR 주기의 수, 고안한 프라이머 상태 등에 따라 달라진다(비특허문헌 2).

즉, PCR은 채취한 시료로부터 핵산을 추출하고 검출하고자 하는 타겟 핵산을 프라이머를 이용해 증폭시키는 일련의 과정이다. 이러한 PCR은 일반적인 PCR은 반응 온도를 수십 회 이상 조절함으로써 표적 유전물질을 증폭하고 검출하기 때문에 thermocycler(온도조절장치/유전자증폭기)가 필요한데, 이 장비는 고온과 저온 사이의 온도 전환을 수십 초 내에 안정적으로 구현해야 한다. 또한 신속한 진단에 대한 요구로 개발된 실시간 검출 모니터링이 가능한 실시간 PCR(Real-time PCR)은 더 고도의 기술을 요구하기 때문에 경제적인 부담이 크고, 고감염성 병원성 미생물에 의해 발병하는 질병의 경우 현장 진단이 어려우며, 진단이 가능한 곳으로 이동이 필요하기 때문에 감염 위험이 높아지는 단점을 갖는다. 그렇기 때문에 이 기술들에 대한 대안으로 떠오른 것이 등온 증폭법이다.

또한, 증폭된 PCR 결과물을 확인하는 기술로 상기와 같이 PCR 기기 외에도 고가의 효소가 필요한 문제가 있다.

본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자, 유전자 기반이므로 선택도가 매우 높고, 온도 조절 장비 및 효소 없이 신호를 증폭시킬 수 있는 현장 진단에 적합한 상온 혼성화 연쇄 반응 기반 타겟 핵산 검출용 키트 및 검출 방법을 도출하였다.

중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 연구 기법, 차대룡, 대한신장학회지 2000; 19: S28-S40. 호흡기 바이러스 중합효소연쇄반응, 보건복지가족부, 신의료기술평가보고서, HTA-2008-006, 2008.

이에, 본 발명자들은 세균, 바이러스 및 진균 등의 미생물의 존재 여부를 현장에서 신속히 육안으로 확인할 수 있는 방법을 찾고자 노력한 결과, 바이오틴이 결합되고 헤어핀 구조인 타겟 핵산 탐지 프로브, 헤어핀 구조인 2개의 제 1 증폭제 및 제 2 증폭제, 및 아비딘이 수식된 자성 나노입자를 포함하는 타겟 핵산 검출 키트를 이용하여 세균, 바이러스 및 진균 등의 타겟 핵산을 선택도가 매우 높게 확인할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 상온 혼성화 연쇄 반응(Hybridization Chain Reaction, HCR) 기반 타겟 핵산 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 키트를 이용한 상온 혼성화 연쇄 반응 기반 타겟 핵산 검출방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아비딘이 수식된 자성 나노 입자;

타겟 핵산의 전부 또는 일부 서열과 상보적으로 결합하는 부위를 포함하며, 말단에 바이오틴이 수식된 헤어핀 구조의 타겟 핵산 탐지 프로브;

헤어핀 구조 올리고머의 제 1 증폭제(helper 1) 및

헤어핀 구조 올리고머의 제 2 증폭제(helper 2)

을 포함하는 상온 혼성화 연쇄 반응 기반 타겟 핵산 검출 키트를 제공한다.

본 발명에서 용어 "자성 나노입자"는 자성을 갖는 나노 크기의 입자 형태의 물질로, 평소에는 자성을 갖고 있지 않지만, 외부 자기장에 의해 순간적으로 자화되어 자성을 갖게 되는 물질이다.

상기 자성 나노입자는 자성을 띄는 금속 물질, 자성 물질 또는 자성 합금으로 이루어진 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다.

상기 자성 나노입자는 철 산화물, 코발트 산화물, 니켈 산화물, 및 전이금속이 도핑된 철 산화물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 예를 들어, 상기 금속 물질은 Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 자성 물질은 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'₂O₄, 및 MpOq (M 및 M'은 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd 또는 Cr을 나타내고, p 및 q는 각각 식 0 < p ≤ 3 및 0 < q ≤ 5 이다.)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 자성 합금은 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe, NiFeCo 및 MnFe₂O₄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 목적에 따라 달라질 수 있는 것으로서, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서는 상기 자성 나노입자의 제조 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 공침법, 졸-겔법, 열분해법 또는 에멀젼법 등을 제한 없이 사용하여 제조할 수 있으나, 바람직하게는 열분해법을 사용할 수 있다. 상기 열분해법은 공침법에 비해 자성 나노입자의 크기 조절이 용이하고, 분산성, 결정성 및 상자성이 우수한 나노입자를 제조할 수 있다. 또한 상기 자성 나노입자의 성장은 시드 성장법(Seed mediated growth method)을 재차 적용하여 원하는 크기로 제조할 수 있다. 바람직한 자성 나노입자(개질 후 입자 크기 포함)의 평균 입자 크기는 300 내지 500 nm일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 자성 나노입자를 실리카 코팅 후, 작용기(예, 카르복실기)로 개질하여 아비딘(스트렙트아비딘 포함)을 고정화시켜 사용한다. 상기 자성 나노입자를 실리카 코팅하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 나노에멜전법을 이용할 수 있다. 실리카 코팅된 자성 나노입자는 실리카 층의 두께가 1 내지 100 nm, 바람직하게 5 내지 50 nm일 수 있으며, 실리카를 코팅함으로써 친수성이 부여되고 여러 작용기로의 개질 용이성을 가질 수 있다.

실리카로 코팅되고 또는 작용기로 개질된 자성 나노입자의 입자 평균 크기는 300 ~ 600 nm이며, COOH로 개질된 자정 나노입자는 아비딘을 수식하여 “아비딘이 수식된 자성나노 입자”, 일명 자성 아비딘 복합체를 제조할 수 있다.

본 발명에서 용어 “타겟 핵산”은 공지 또는 추정 유전자 산물을 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 타겟 핵산은 동물, 식물, 세균, 바이러스 및 진균으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 존재하거나 이로부터 유래되는 유전자, 또는 유전 질환에 수반되는 돌연변이된 유전자 등일 수 있다. 본 발명에서 타겟 유전자는 예컨대 핵산 서열 또는 분자는 단일 또는 이중 가닥일 수 있고 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 따라서 핵산 서열은 dsDNA, ssDNA, 혼합 ssDNA, 혼합 dsDNA, ssDNA(예컨대, 융해, 변성, 헬리케이즈 등에 의해)로 만들어진 dsDNA, A-, B- 또는 Z-DNA, 삼중-가닥 DNA, RNA, ssRNA, dsRNA, 섞인 ssRNA 및 dsRNA, ssRNA(예컨대, 융해, 변성, 헬리케이즈 등을 통해)로 만들어진 dsRNA, 메신저 RNA(mRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 전달 RNA(tRNA), 촉매 RNA, snRNA, 마이크로RNA, 또는 펩타이드핵산(peptide nucleic acid, PNA)일 수 있다.

본 발명에서 용어 “상보적으로 결합하는”은 뉴클레오티드 서열 간에 상보적 염기쌍을 형성하는 것을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브(probe)"는 타깃 핵산서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 단일쇄 핵산 분자이며, 탐침이라고도 불린다.

본 명세서 용어 “혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 상온 혼성화 연쇄 반응 기반 타겟 핵산 검출용 키트는 1개의 자성 아비딘 복합체, 1개의 타겟 핵산 탐지 프로브와 2개의 헤어핀 구조 특이적 올리고머인 "증폭제"를 포함할 수 있다.

상기 2개의 증폭제는 제1 증폭제 및 제 2 증폭제를 의미하며, 제 1 증폭제는 상기 2개의 헤어핀 구조 올리고머 중 하나를 의미하며, 제 2 증폭제는 상기 헤어핀 구조 올리고머인 제 1 증폭제를 제외한 다른 하나를 의미한다.

본 발명에서 용어 “증폭제”는 토홀드(toehold)서열, 핵산서열1, 루프서열, 핵산서열2를 포함하며, 핵산서열1 및 핵산서열2는 서로 결합 가능한 상보적인 서열로 구성되어 상기 루프서열을 사이에 두고 결합하여 헤어핀과 유사한 모양을 형성하는 핵산 올리고머를 의미하고, 상기 서열의 염기개수는 핵산 올리고머 제조를 위해 적절히 조절될 수 있으며, 바람직하게는 30 내지 70개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 40 내지 60개의 뉴클레오타이드로 구성된다.

본 발명에서 용어 “토홀드서열”은 상기 핵산서열 말단에 위치하며, 각 올리고머간 결합 확률을 높여주는 구조이다. 이를 포함하는 헤어핀 구조 서열에 상보적인 서열이 존재하지 않아, 헤어핀 구조를 형성할 때 단일가닥으로 존재하는 서열을 의미하고, 토홀드서열의 염기개수는 바람직하게는 10 내지 20개로 임의로 조절될 수 있다.

본 발명에서 용어 “핵산서열”은 타겟 검출 및 증폭제간 결합 등 목적에 맞게 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 의미하며 서열의 염기개수는 핵산 서열 제조를 위해 적절히 조절될 수 있다.

본 발명에서 용어 “루프서열”은 서열 내에 상보적인 서열이 존재하지 않도록 설계되어, 상기 루프서열 양 쪽 말단의 핵산서열이 결합할 때 고리모양의 구조를 형성하는 서열을 의미하고, 루프서열의 염기개수는 고리모양의 루프를 형성하기 위해 적절히 조절될 수 있다.

본 발명에서 용어 "시료"는 검출하고자 하는 타겟 병원체를 함유할 수 있는 한, 특정 종류 또는 형태로 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 시료는 생물학적 시료, 예를 들면 생물학적 유체(fluid) 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 유체의 예로서, 뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 객담, 비말, 비액, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수 등을 들 수 있다. 생물학적 조직은 세포의 집합으로서, 대체적으로 인간, 동물, 식물, 세균, 진균 또는 바이러스 구조물의 구조적 물질의 하나를 형성하는 세포 내 물질들과 특정 종류의 집합으로서 연결 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직 등이 이에 해당될 수 있다. 또한, 생물학적 조직의 예에는 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 개별적인 세포(들)도 포함될 수 있다. 이외에도, 시료는 바이오물질을 저농도로 함유하는 환경 시료(environmental sample)를 포함할 수 있으며, 예를 들면 식수, 음식물 등과 같이 다양한 형태 및 종류를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 “검출”, “탐지” 또는 “진단”이란 타겟 핵산의 존재 유무, 이에 따른 병리 상태의 존재 또는 특징에 대한 확인을 지칭한다.

본 발명에서 용어 "클릭 화학 반응"은 검출부 내 하이드로 겔과 자성 핵산 증폭체에 수식된 아비딘의 결합일 수 있다. 즉, 수식된 하이드로 겔의 NHS와 아비딘이 수식된 자성 핵산 증폭체의 아비딘의 NH₂가 클릭 화학 반응으로 결합된다.

본 발명에 따른 상기 키트는 상기 혼성화 연쇄 반응에 이용되는 반응 완충용액, 안정화제, 타겟 검출용 핵산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 상온 혼성화 연쇄 반응 기반 타겟 핵산 검출 키트를 이용한 상온 혼성화 연쇄 반응 기반 타겟 핵산 검출방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 시료 용액에 아비딘이 수식된 자성 나노 입자; 타겟 핵산의 전부 또는 일부 서열과 상보적으로 결합하는 양 쪽 말단 부위를 포함하며, 말단에 바이오틴이 결합된 헤어핀 구조의 타겟 핵산 탐지 프로브를 첨가하여 자성 아비딘 복합체-프로브가 결합된 자성 탐침 복합체를 형성하고 타겟을 자성 분리하는 단계;

상기 타겟이 결합된 자성 탐침 복합체에 증폭제 1과 증폭제 2를 첨가하여 상온 혼성화 연쇄 반응(Hybridization Chain Reaction)으로 증폭시키는 단계; 및

상기 증폭된 타겟 핵산 용액의 바이러스 감염을 판별하는 단계

를 포함하는 상온 혼성화 연쇄 반응 기반 타겟 핵산 검출방법을 포함한다.

상기 시료(샘플)은 검출하고자 하는 타겟 핵산이 존재할 수도 존재하지 않을 수 있으며, 대상체로부터 채취된 혈액, 혈장, 뇨, 타액, 객담, 비말, 비액 등 대상체로부터 얻어진 각종 검체 시료 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 대상체는 소, 돼지, 말, 양, 염소, 닭, 오리, 칠면조 등의 가금류, 동물 또는 인간을 의미한다.

상기 검출하고자 하는 타겟 핵산은 예를 들어, 병원균 유전자일 수 있다. 또한, 상기 타겟 핵산은 핵산 서열을 아는 모든 병원균을 대상으로 할 수 있다. 예컨대, 상기 병원균은 아프리카 돼지 열병 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, C형 간염 바이러스, 구제역 바이러스, 중동호흡기증후군 코로나바이러스, 중증급성소흡기증후군 코로나바이러스, 신종코로나바이러스(코로나 19), 파라믹소 바이러스 및 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 목적하는 개체로부터 수득한 시료(샘플 용액)에 타겟 핵산이 존재할 때 아비딘이 수식된 자성나노입자에 바이오틴 개질된 탐침이 부착된 자성 탐침 복합체의 탐지 프로브와 타겟이 결합하면서 헤어핀 형태의 구조가 선형화 되며 증폭이 일어날 수 있는 상태로 변화하며, 타겟 핵산이 없을 때에는 헤어핀 구조가 변하지 않는다.

먼저, 목적하는 개체로부터 수득한 시료에 아비딘이 수식된 자성 나노 입자에 탐침 프로브가 결합된 자성 탐침 복합체를 넣고 타겟 핵산 존재 시 자성 탐침 복합체-타겟 핵산 순으로 결합한 뒤 외부 자기력을 가하여 이를 분리한다. 이러한 자성 분리를 통해 타겟 핵산에 대한 결합 특이도를 높여 비특이적 혼성화에 의한 위양성 신호를 줄일 수 있다. 이러한 자성 분리 후, 제 1 증폭제와 제 2 증폭제를 분리해둔 자성 탐침 복합체에 넣어 HCR 반응을 통해 상온에서 증폭시킨다. 증폭시킨 반응물은 육안, 형광 표지, 흡광 표지 후 세파로스 겔 크로마토그래피를 통해 타겟 핵산 존재 여부를 판별한다.

현장에서 타겟 핵산을 검출하기 위해서는 경제적인 측면에서 부담이 없으면서 누구나 사용할 수 있는 간편한 실험 과정이 요구된다.

본 발명은 고가의 효소나 장비 없이 혼합 및 자성분리 만으로 검출에서 확인까지 가능하므로 현장 검출용 키트로 활용하기에 매우 바람직하다. 상기 키트의 분석능을 향상시키기 위해 리포터 프로브를 추가로 사용할 수 있으며, 상기 리포터 프로브는 타겟 핵산이 존재할 때 타겟 핵산의 정량 및 정성 분석을 위한 시스템을 제공한다. 따라서, 상기 리포터 프로브는 타겟 핵산의 존재 유무를 알 수 있는 물질이 결합된 것이라면 그 종류에 크게 제한되지 않으나, 바람직하게는 형광염료나 흡광염료가 결합되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 목적하는 대상체로부터 수득한 검체 시료의 타겟 핵산을 상기 타겟 핵산 검출용 키트를 사용하여 혼성화 연쇄 반응으로 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 타겟 핵산 용액의 바이러스 감염을 판별하는 단계를 포함하는 혼성화 연쇄 반응(Hybridization Chain Reaction) 기반 타겟 핵산 검출방법을 제공한다.

구체적으로 목적하는 대상체로부터 수득한 검체 시료에 스트렙트아비딘 또는 아비딘이 수식된 자성나노 입자에 바이오틴이 결합된 프로브가 결합된 복합체 (이하, 자성 탐침 복합체)를 넣고 타겟 핵산 존재 시 자성 나노 입자에 스트렙트아비딘-탐지 프로브-타겟 핵산 순으로 결합하여 이를 외부 자기력을 가하여 분리한다.

그런 다음 제 1 증폭제와 제 2 증폭제를 분리해둔 타겟이 결합된 자성 탐침 복합체에 넣어 HCR 상온에서 증폭시킨다.

증폭시킨 반응물은 육안, 형광 표지, 흡광 표지 후 세파로스 겔 크로마토그래피를 통해 타겟 핵산 존재 여부를 판별한다.

일 구현예로, 하이드로겔 비드 크로마토그래피로 판별하는 경우 가장 바람직하게는 테플론 컬럼 내에서 자성 핵산 증폭체-세파로스 겔 간 화학적인 인력에 의해 타겟을 분리하는 것으로, 타겟 핵산 존재 시 컬럼 주입부(도 1, step 2의 in 부분)에서 자성 핵산 증폭체(HCR 반응 후의 자성 복합체, HCR-AMNC)를 확인할 수 있으며, 타겟 핵산 부재 시에는 컬럼 배출부(도 1, step 2의 out 부분)에서 자성 핵산 증폭체를 확인할 수 있다. 보다 명확한 신호 확인을 위해 음성대조군(negative), 양성대조군(blank), 시험군(control line)에 대해서 동시에 크로마토그래피를 진행하며 이를 위해 3개 이상의 마이크로 튜브 및 테플론 컬럼을 거치하고 동시에 크로마토그래피를 수행할 수 있는 컬럼 연결장치(커넥터)를 이용한다(step2의 우측 도면 참조). 해당 기구를 이용해 시험군의 밴드 위치를 상대적으로 비교하여 타겟 핵산 존재 여부를 확인한다. (도 1, 도 7 참조).

본 발명에서 용어 "바이러스 감염 판별" 은 육안, 형광 표지, 친화도 크로마토그래피(예, 세파로스 겔 크로마토그래피 등), 면역 크로마토그래피 등으로 가능하다.

본 발명의 일 구현예로, 현장용 핵산진단 플랫폼으로 목적에 부합하게끔 이동 가능한 펌프 하버드 펌프(syringe pump) 혹은 주사기를 통해 수동으로 음압을 가하여 작동 가능하도록 한다. 반응물을 컬럼에 옮겨주는 과정을 생략 가능하기 때문에 보다 적은 절차로 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 예를 들면, 현장에서 바로 검출하기 위하여 10ml 용량 주사기를 하버드 펌프(syringe pump)에 연결하여 약 80Kpa 압력을 5분간 가해준다. 펌프 없이 수동으로 작동할 수 있으며 수동으로 압력을 가하는 경우 1ml 용량 주사기를 100ul/s의 동일한 속도로 10초간 끝까지 당기면 펌프를 작동하는 것과 동일한 결과를 얻을 수 있다. 수동으로 작동하는 경우에도 펌프를 사용한 예시인 도 7과 같이 시험군 컬럼을 지나는 자성 나노입자에 의한 검은색 밴드가 컬럼의 절반 지점을 통과하면 양성으로 판별하며 밴드가 이동하지 않거나 절반 이하로 움직이는 경우 음성으로 판별할 수 있다.

첨부도면 도 2에 해당하는 혼성화 연쇄 반응 기반 타겟 핵산 검출 방법은 다음과 같다.

1. 분리/정제 : 스트렙트아비딘이 수식된 자성 나노 입자에 탐침 프로브가 결합한 자성 탐침 복합체를 이용하여 검체로부터 채취한 시료 용액에서 타겟 물질만을 분리, 농축한다. 탐침 프로브 가닥(probe strand) 말단에는 바이오틴이 달려 있으며 스트렙트아비딘-바이오틴 결합에 의해 자성 아비딘 복합체와 결합한다. 타겟 존재 시 헤어핀 구조가 열리면서 프로브와 타겟 핵산이 결합한다. 이와 같이 타겟이 결합된 자성 탐침 복합체를 자성분리를 통해 검체 샘플로부터 분리한다.

2. 증폭 : 앞서 분리한 타겟이 부착된 자성 탐침 복합체에 두 종류의 DNA 증폭제(Helper 1,2)를 첨가해주면 상온 조건(20 내지 30 도)에서 10-25분 내로 검체를 기점으로 HCR(hybridized chain reaction)이 발생하여 염기 서열의 증폭이 일어난다.

예를 들어, 해당 서열은 타겟 바이러스에 따라 달라질 수 있으며 타겟 검출 부위의 염기 서열에 따라 도 8의 초록색 표시한 부분을 변동하고 다른 부분은 변동하지 않는 모듈형 플랫폼이다. 예시로 ASFV의 경우 VP72 gene을 COVID 바이러스의 경우 e gene을 타겟 검출부위로 삼는다.

3. 검출: HCR 반응이 완료된 용액(자성 핵산 증폭체)을 NHS로 표면이 개질된 세파로스 컬럼에 넣고 유압을 이용한 크로마토그래피를 5~10분 정도 진행한다. 혼성화 반응이 일어난 경우(타겟 존재 시) 자성 핵산 증폭체와 세파로스 컬럼과의 인력이 약해 컬럼 주입부 밴드가 형성되고 타겟 부재 시 컬럼 배출부에 밴드가 형성된다. 이와 같이 밴드 형성 위치를 통해 육안으로도 타겟 DNA가 존재하는지 확인이 가능하다.

세파로스 겔 크로마토그래피[도 1]는 마이크로 튜브 거치대와 컬럼 거치대로 구성된 기구 및 마이크로 튜브와 마이크로 튜브와 동일한 수의 테플론 튜빙 컬럼으로 구성되어 있다. 기구에 거치되는 마이크로 튜브는 최소 3개 이상이며 컬럼과 항상 결합하는 자성입자 (negative, AMNC), 컬럼과 결합하지 않는 자성 입자 (blank, CMNC), 타겟 바이러스에 대한 검출 프로브(ha)가 달린 자성 탐침 복합체(시험군, HCR-AMNC)로 구성되어 있다. 테플론 튜빙은 한쪽 끝에서부터 일정 거리 지점을 탈지면으로 막은 뒤 작용기가 달린 하이드로젤 비드로 채운다. 하이드로젤 비드는 평균 입자는 균일한 크기의 60-120㎛이다. 하이드로겔 비드 표면에는 NHS 작용기가 부착되어 있거나 양이온 친화 작용기(SiO^-)가 부착되어 있다. 하이드로겔 비드 크로마토그래피의 경우 가장 바람직하게는 테플론 컬럼 내에서 자성 핵산 증폭체-세파로스 겔 간 화학적인 인력에 의해 타겟을 분리하는 것으로, 음성 대조군(negative, AMNC), 시험군 (HCR-AMNC), blank(CMNC)의 세 개의 컬럼으로 구성되어 있다. 첫 번째 컬럼은 음성 대조군(negative)으로 타겟 유무와 관계 없이 컬럼 주입부(도 1, step2 의 좌측 그림의 'in' 부분)에서 밴드를 확인할 수 있다. 두 번째 컬럼은 시험군으로, 타겟 핵산 존재 시 타겟 농도에 따라 저농도인 경우 컬럼 주입부 (도 1, step2 의 좌측 그림의 'in' 부분)에서 자성 핵산 앰플리콘을 확인할 수 있으며, 고농도인 경우 컬럼 배출부(도 1, step2의 좌측 그림의 'out' 부분)에서 밴드를 확인할 수 있다. 세 번째 컬럼은 blank로 타겟 유무와 관계 없이 컬럼 배출부(도 1, step2 의 좌측 그림의 'out' 부분)에서 검은색 밴드를 육안으로 확인할 수 있다(도 1, 도 7 참조).

본 발명에 따른 검출 방법은 자성 나노 입자를 이용하여 샘플로부터 타겟 정제 및 증폭반응까지 모두 가능하며, 효소 없이 혼성화 반응을 통해 타겟 농도에 따른 정량적인 차이를 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 피펫을 이용한 로딩 과정 없이 반응물을 컬럼과 바로 연결 가능하고, 주사기를 이용한 음압을 통하여 크로마토그래피를 위한 추진력을 확보할 수 있다. 또한, 별도의 라벨링이나 검출 기기 없이도 육안으로 확인 가능한 점에서 현장에서 신속히 타겟 핵산 검출이 가능하다.

본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 쓰이고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 쓰인다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 상온 혼성화 연쇄 반응(Hybridization Chain Reaction) 기반 타겟 핵산 검출용 키트 및 타겟 핵산 검출 방법은 유전체 기반이므로 선택도가 높고 온도 조절 장비 및 효소 없이 신호를 증폭할 수 있으며 빠른 시간 내에 검출 가능하므로 현장진단(point-of-care-testing, POCT)에 적합한 장점을 가진다.

또한, 본 발명은 자성적 분리를 통해 타겟 유전자에 대한 결합 특이도를 높여, 타겟의 비특이적 혼성화에 의한 위양성(false-positive) 신호를 줄일 수 있다. 또한, 본 발명을 고가의 효소나 첨단 장비가 사용되지 않기 때문에 가격적인 이점이 있으며 육안 검출이 가능하기 때문에 상용화 가능성이 높다.

특히, 본 발명에 따른 검출방법은 상온(20~30도)에서 20~30분 이내에 검출이 가능하다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정한 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명에 따른 혼성화 연쇄 반응 기반 크로마토그래피 진단 플랫폼의 전체 모식도를 나타낸 것이다 [핵산 검출과 친화도 크로마토그래피를 통한 가시적 진단의 2단계로 구성되어 있다. 타겟이 존재하는 경우 1단계(step1)에서 타켓 핵산과 탐지 프로브가 달린 자성 탐침 복합체가 특이적으로 결합하여 자성체 표면에 HCR 기점을 형성시키고, 2단계(step1)에서 HCR 생성물이 결합된 자성 핵산 증폭체가 세파로스 크로마토그래피를 통해 분리되는 것을 육안으로 확인한다. 2단계에서 타겟 핵산이 존재하지 않는 경우 컬럼의 주입부에 밴드가 형성되고 타겟 핵산이 존재하는 경우 배출부에 밴드가 형성되는 것을 확인할 수 있다. 보다 명확한 신호 확인을 위해 2단계에서는 음성대조군(negative), 시험군(control line), 양성대조군(blank)에 대해서 동시에 크로마토그래피를 진행하며(step 2의 우측 도면의 기구) 시험군의 밴드 위치를 상대적으로 비교함].
도 2는 본 발명에 따른 샘플로부터 핵산을 진단하는 과정에 대한 일련의 모식도이다. 별도의 기계장치나 효소 없이 친화도(세파로스 겔) 크로마토그래피를 통하여 가시적 진단을 수행할 수 있다.
도 3은 도 1의 1단계 HCR 반응의 쟁점인 타겟 특이도 확인 과정 모식도 (a) 및 이에 대한 전기영동을 통해 이를 확인한 실험 결과(b)이다[ta, ha, H1, H2의 구성 요소가 각 단계 (ⅰⅳ별로 특이적으로 반응함을 확인할 수 있다. HCR 반응을 단계(i ~ iv)별로 테스트하여 각 프로브가 비특이적으로 증폭되지 않는다는 것을 확인함. 기본 HCR 시스템의 원리. ASFV(African swine fever virus, 아프리카 돼지 열병 바이러스)의 탐지 프로브 (ha), 타겟 (ta) 및 증폭제 (H1, H2). 혼성화 반응은 ta + ha + H1로 개시 (ii), ta + ha + H1 + H2 (iii) 및 앰플리콘(amplicon) (iv)].
도 4는 전기영동을 통해 수용액 상에서 핵산 혼성화 반응에 대한 검출 한계 및 특이도를 확인한 결과로, 도 4a는 전기영동을 통한 혼성화 반응의 타겟 LOD 테스트로 혼성화 반응의 검출 한계(농도에 따른 검출성능)를, 도 4b는 전기영동을 통한 HCR 반응 특이도를 나타낸다.
도 5는 도 1의 내용 중 자성 나노입자의 개질 과정(ⅰ~ⅳ에 대한 일련의 모식도와 해당 과정에 대한 실험적 검증 결과이다. 상단 모식도는 ⅰ자성 입자, ⅱ실리카 껍질을 씌운 자성 입자, ⅲ카복실기가 수식된 자성 나노입자, 표는 크기 분포 분석을 이용한 MNC 개질 확인. 크기 분포는 TEM 이미지와 DLS로 측정되었다.; ⅳ스트렙트아비딘이 수식된 자성 나노입자, (a) 형광 스트렙트아비딘이 수식된 자성 나노입자의 형광 테스트. (b) AMNC의 단백질 정량 분석; BCA 분석].
도 6은 도 5의 스트렙트아비딘이 수식된 자성 나노입자에서 핵산 증폭반응을 수행하여 자성 복합체 형성을 확인한 실험 결과이다 [DNA 증폭은 피코그린 형광 분석을 사용하여 평가됨; (a) 최적 반응 시간, (b) 최적 반응 온도, (c) 반응 특이도: DNA 길이 및 표적 위치에 대한 HCR 제품의 형광 신호. 삽입의 빨간색 막대는 타겟 서열을 나타냄. (d) 반응 민감도: 0.1 ~ 10000 pM의 타겟 탐지 범위. 오차 막대는 전체 분석을 실행하는 서로 다른 샘플의 3번 복제의 표준 편차를 나타냄. POCT 적합성 검증을 위한 반응 최적 시간 및 온도 조건 확인(20도, 20분); 실제 타겟 검출 시 사용되는 '타겟 절편 모사 시퀀스'에 (100bp)에 대한 반응성 검증. 신속진단키트 (40pM) 대비 우수한 검출 한계 (10 pM)를 확인함].
도 7은 도 6의 자성 복합체를 세파로스 컬럼 크로마토그래피를 통해 확인한 결과이다. [(a) 실험 장치의 개략도 (좌) 타겟 핵산이 저농도일 때의 예상 결과 모식도(우); 타겟 핵산이 고농도일 때의 예상 결과 모식도.(b) HCR-AMNC는 일련의 목표 농도 (각각 0.1pM, 1pM, 10pM, 100pM, 1000pM 및 10000pM)에서 하이드로 겔 컬럼 및 피코그린(picogreen) 형광 신호를 통해 정량화되었다. (c) 각 농도별 HCR의 피코그린 신호 (d) 각 농도별 컬럼에서 HCR-AMNC의 상대 위치 확인; (c)-(d) 오차 막대는 전체 분석을 실행하는 서로 다른 샘플의 세 번 복제의 표준 편차를 나타냄].
도 8은 제조예 2에서 사용된 탐지 프로브, 증폭제, 타겟 서열을 나타낸 것이다.
도 9는 ASFV 시퀀스 정보 (B646L유전자, VP72 region) 해당 시퀀스를 plasmid 벡터에 삽입하였으며, 플라스미드 정보를 나타낸 것이다.
도 10은 도 9와 동일한 병원체인 ASFV 유전자에 존재하는 다른 타겟 서열 부위(a: B962L, b: C717R, c: D1133L, d: G1340L) 및 해당 타겟 서열을 검출하기 위한 탐침, 증폭제를 나타낸 것이다. 이를 통해 특정 바이러스에 대한 검출 정확도를 높이고자 하였다.
도 11의 (a)~(d) 는 도 10의 ASFV 유전인자 4종 (a: B962L, b: C717R, c: D1133L, d: G1340L)에 대한 형광정량 및 크로마토그래피 테스트 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

제조예 1: 자성 나노입자 제조 및 수식

1-1. 자성 나노입자의 제조 (도 5의 i)

150 ml 비커에 에틸렌글리콜 용매와 디에틸렌글리콜 용매 부피 비가 1:3인 용매(총 부피 20 ml)에 Iron　trichloride　(Iron(III) chloride,　FeCl₃)　260　mg, 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone, PVP) 2 g, 아세트산 나트륨 1.5 g을 넣고 초음파처리 (sonication) 1시간 한 뒤, 테플렌 보틀에 옮겨 담아 200 ℃에서 12 시간 가온하였다.

테플렌　보틀의　상층액을　모두　따라낸　뒤　70　ml　vial에　남아있는　하층　물질(합성된　자성 나노입자)을　옮겨　담았다.　여기에　20　ml　무수　에틸　알코올을　넣고　70　watt의　sonication　5분　동안　가하였다.　70　ml　vial　측면에　자석을　갖다　대어　초상자성입자만　얻어내고　상층액은　따라　버렸다.　이　과정을　워싱 과정이라 하며, 이를 3회 반복하였다. 마지막에　20　ml　vial에　합성된　입자만　옮겨 담고　무수　에틸　알코올을　15　ml　처리하여　마지막으로　잘　분산시킨　뒤　상온에　보관하였다.

1-2. 자성 나노 입자에 실리카 코팅 (도 5의 ii)

150 ml 비커에 초상자성 나노입자 (Fe₃O₄) 50 mg, 에틸 알코올 40 ml, 증류수 10 ml를 처리하고 초음파 처리(bath sonicator, 70 watt)를 5분 수행하였다. 암모니아수 2 ml와 테트라에틸 규산염 광물(Tetraethylorthosilicate, TEOS) 200 ul를 순서대로 처리하고 초음파 처리(70 watt) 3시간 수행하였다. 그 다음 자석을 이용하여 상층액만을 버렸다. 무수 에틸 알코올을 이용하여 3회 워싱해준 뒤 마지막에 알코올에 분산하여 초상자성입자 표면에 실리카를 코팅하였다.

150 ml 비커에 남아있는 자성 나노입자는 실리카 쉘로 코팅이 되어 있다. 미반응된 실리카 물질을 제거하기 위하여 무수 에틸 알코올을 20 ml 넣고 초음파(70 watt)를 5분 가해 주었다. 마찬가지로 자석을 갖다 대어 실리카 코팅된 자성 입자만을 분리하고 상층액을 따라 버렸다. 이 과정을 3회 반복하고 마지막으로 코팅된 자성 나노입자만을 20ml vial에 옮겨 담고 무수에틸알코올을 15 ml 주입하여 잘 분산시킨 뒤 보관하였다.

1-3. 자성 나노입자 표면에 작용기로의 개질 (도 5의 iii)

20 ml 바이알에 실리카 코팅된 자성 나노입자 SiMNP 10 mg, pegylation solution (EtOH 95 %, DW 5 %) 9.5 ml를 첨가하였다. 여기서 구체적으로 EtOH 9.025 ml, DW 0.475 ml가 첨가되었다. 초음파 처리 5분 하여 PEGylation solution에 잘 분산시켜 주었다. 이 후 상기 20 ml vial에 silane PEG solution 0.5 ml를 처리하였다. (silane PEG solution은 다음과 같이 제조되었다. 1.5 ml EP tube에 PEGylation solution 0.5 ml, mPEG-Silane powder 23.75 mg, COOHPEG-Silane powder 1.25 mg을 첨가하고 pipetting 20회하여 분산시켜 준다.) SiMNP의 표면을 COOH 작용기로 고르게 코팅하기 위해 20 ml vial에 전부 혼합된 위의 용액을 shaker에 고정시킨 뒤 30분 동안 3의 세기로 섞어 주었다. 반응이 모두 종료된 뒤 자석을 이용하여 CMNP만 수득하고 상층액을 버렸다. DW 10 ml를 주입하고 초음파 처리 3분 해준 뒤 다시 자석을 대어 워싱된 CMNP만 수득하였다. 이 과정을 3회 반복하였다. 마지막으로 20 ml vial에 수득된 CMNP에 무수 에틸 알코올 15 ml을 주입하여 잘 분산시킨 뒤 보관하였다 (CMNP 제조).

1-4. 아비딘 수식된 자성 나노입자 제조 (도 5의 iv)

상기 제조예 1-3에서 제조된 표면에 COOH를 가진 자성 나노입자 CMNP를 PBS 버퍼에 분산시킨 뒤, 1 mg/ml 농도의 EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide·HCl)와 1mg/ml 농도의 NHS (Nhydroxysuccinimide)와 1mg/ml 농도의 제 Avidin 혹은 Strptavidin를 함께 처리하였다. 이때, CMNP: EDC : NHS: Avidin은 1:10:10:1의 부피 비율로 혼합하였다. 강한 stirring과 함께 2 시간 반응시킨 뒤 자석을 이용하여 PBS 버퍼로 워싱하였다.

제조예 2: 프로브 및 올리고뉴클레오타이드 준비

ASFV 바이러스 1종에 대해 VP72 region과 아형 판별용 검출 부위를 설정하고 파이썬 (v 3.9.2) 코딩 알고리즘을 이용하여 혼성화 반응에 대한 에너지 계산 및 반응 확률 계산 오픈 소스 프로그램 (NUPACK, http://www.nupack.org/)과 바이러스 샘플 내 적합 검출부위 검색용 오픈 소스 프로그램 (BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 병합하여 10000BP 길이의 타겟 시퀀스에 대해 HCR 반응에 가장 적합한 타겟 부위를 선정하였다. 이와 같이 선정한 타겟 검출부 및 프로브와 증폭제를 모듈화하였다. 시뮬레이션을 통해 선정한 프로브 시퀀스를 업체(바이오니아, IDT, gene link)를 통하여 주문 제작하였다. 주문 제작한 시퀀스는 Tris-NaCl, (NaCl 300mM, MgCl₂ 20mM, TRIS 10mM) buffer에 10uM (100pmole /λ농도가 되게끔 희석시킨 후 nanodrop을 이용해 농도를 확인한 뒤 분주하여 영하 20도에서 냉동 보관하였다.

분주한 ta, ha, H1, H2[도 8]를 동일한 농도(1nM)로 1.5ml ep 튜브에 혼합하여 상온에서 3분 간 반응한 뒤 12% PAAm gel 을 이용하여 전기영동을 수행함으로써 시뮬레이션 결과의 유효성을 확인하였다(도 3).

실시예 1: 타겟 핵산 검출 키트 제작

타겟 핵산 검출용 키트는 핵산 증폭제 (H1, H2), 바이오틴 수식 프로브(ha), 아비딘이 수식된 자성 나노입자, 세파로스 겔이 충진되어 있는 테플론 튜브(이하 세파로즈 컬럼), 홀더, 커넥터, 주사기 그리고 음압장치(펌프 혹은 인력)로 구성되어 있다. 시료 샘플 전처리를 마친 후 자성 탐침 복합체를 제작하기 위하여 자성 아비딘 복합체와 프로브(ha)를 반응시켜서 자성 탐침 복합체를 제작하였다. 타겟이 있는 경우에는 자성 탐침 복합체의 프로브(ha)와 반응하여 프로브의 헤어핀 구조가 변형되어 HCR 반응이 개시되었다.

세파로스 겔은 친화도 크로마토그래피용 레진으로 Cytiva 사 제품(NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow, 17090604)을 사용하였다. 충진 시 15cm 길이로 자른 테플론 튜브의 말단으로부터 5cm 지점을 탈지면 혹은 필터로 막은 뒤, 레진 희석액 1ml (10mM HCl 용액으로 10배 희석)를 필터가 없는 반대편으로 주입하였다. 주입 시 1ml 주사기에 바늘(17Guage)을 필터에 가까운 쪽에 꼽고 그 반대편을 레진 희석액이 담긴 ep tube에 꽂은 뒤 음압을 가하여 용액을 빨아들이며 충진하였다. 피스톤 1ml를 약 10초에 걸쳐서 천천히 당겨야 하며 (100ul/s) 충진 과정에서 기포가 생기지 않도록 주의하여야 한다. 충진된 컬럼은 DW 혹은 10mM HCl 버퍼에 담아 냉장 조건(4℃에서 약 1~2주일 가량 보관 가능하다. 1회 검출 시 음성대조군(negative), 시험군(control), 양성대조군(positive) 자성 핵산 앰플리콘 각각 50g, 세파로스 컬럼 3개, ep tube(1.5ml)를 홀더에 거치한 뒤 테플론 튜브를 통해 커넥터에 연결한 상태에서 주사기를 통해 음압을 가함으로써 밴드를 이동시켜 감염 여부를 진단할 수 있다.

실시예 2: 타겟 핵산 검출 키트를 이용한 HCR 반응 확인 및 진단 검증

1) 타겟 분리 및 정제

시료 샘플은 타겟 부위를 삽입한 플라스미드 형태의 ASFV DNA 모사 샘플(pBHA, 1987BP)[도 9]을 DW 상에 분주하고 논타겟 시퀀스(gDNA ExiPrep™Tissue Genomic DNA Kit)가 혼합되어 있는 용액에 대하여 95도 조건에서 10분간 sonicaiton을 수행하여 용액 내 시퀀스를 50~200bp 길이로 분절화하였다. 해당 과정은 분절화되는 길이를 정확히 설정할 수 없기 때문에 정확한 타겟 길이 설정이 불가능하기 때문에 sonication을 수행하고 곧바로 icing하여 추가적인 분절화 현상이 발생하는 것을 막았다. 자성 탐침 복합체를 제작하기 위하여 binding buffer(1M NaCl, Tris 10mM, EDTA 10mM) 1ml에 바이오틴이 수식된 프로브(ha) 500pmole과 아비딘이 개질된 자성 아비딘 복합체 500ug을 용해시켜 30분간 거품이 발생하지 않게끔 혼합해준 뒤 자석을 이용해 반응하지 않은 프로브를 제거해 주면 아비딘-바이오틴 반응에 의하여 프로브가 개질된 자성 탐침 복합체를 얻을 수 있었다.

자성 탐침 복합체를 시료 샘플에 넣고 15분간 반응한 뒤 자석홀더(DynaMag-2 Magnet) 통해 자성 탐침 복합체 및 타겟을 시료샘플로부터 분리하였다. 분리 후 DW 1ml 로 1회 Tris-NaCl, (NaCl 300mM, MgCl₂ 20mM, TRIS 10mM 1ml로 2회 워싱하여 타겟 외 잔여 물질을 제거하였다. 워싱 시 ep 튜브를 홀더에서 분리하여 손가락으로 탭핑을 4~5회 수행하여 타겟이 결합된 자성 탐침 복합체가 용매에 잘 분산되게끔 하였다. 모든 워싱 과정이 끝난 샘플에 대하여 다음 무효소 핵산 증폭 반응을 수행하였다.

2) 무효소 핵산 증폭반응

무효소 핵산 증폭 반응은 앞서 분리한 타겟이 결합된 자성 탐침 복합체를 Tris-NaCl, (NaCl 300mM, MgCl₂ 20mM, TRIS 10mM) 혹은 Sodium Phosphate dibasic buffer (Na₂HPO₄ 1M, NaCl 500mM) 혹은 TMAC buffer([(CH₃)₄N]Cl, 50mM Tris-.HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, pH 8.0, 0.1% SDS)에 용해시킨 뒤 동일한 버퍼에 용해된 증폭제(H1,H2)를 ep tube에 혼합한 다음 약 10분간 헤어핀 구조의 혼성화 반응에 의하여 자발적으로 발생하도록 하였다.

3) 컬럼 연결 및 친화도 크로마토그래피 수행

세파로스 겔 크로마토그래피는 마이크로 튜브 거치대와 컬럼 거치대로 구성된 고정 기구(홀더) 및 마이크로 튜브와 마이크로 튜브와 동일한 수의 테플론 튜빙 컬럼으로 구성되었다. 홀더에 거치되는 마이크로 튜브는 최소 3개 이상으로, 컬럼과 항상 결합하는 자성 나노 입자 (negative, AMNC), 컬럼과 결합하지 않는 자성 입자 (positive, blank; CMNC), 타겟 바이러스에 대한 검출 프로브(ha)가 달려 있으며 HCR 반응이 발생하는 자성 핵산 앰플리콘 (시험군; HCR-AMNC)로 구성되도록 하였다. 테플론 튜빙은 약 8cm 길이의 튜빙의 한쪽 끝에서부터 2cm 지점을 탈지면으로 막은 뒤 작용기가 달린 하이드로젤 비드 100mg을 채웠다. 하이드로젤 비드는 평균 입자는 균일한 크기의 90㎛ 내외로 사용하였다. 하이드로겔 비드 표면에는 NHS 작용기가 부착되도록 하였다.

4) 주사기 이용 가시적 진단

펌프 없이 수동으로 압력 (80kPa)을 가하기 위해 1ml 용량 주사기를 100ul/s의 동일한 속도로 10초간 끝까지 당겼다. 실험 결과는 시험군 (도 1의 모식도) 컬럼에서 확인 가능하며 타겟 핵산이 시료 내 존재하지 않을 경우, 세파로스 겔 컬럼 내 하이드로겔 비드의 NHS와 자성 탐침 복합체 입자에 수식된 아비딘의 NH₂가 결합되어 겔 친화도가 높아져 컬럼과 결합하므로, 컬럼의 주입부 근처에 밴드가 형성된다. 타겟 핵산이 시료 내 존재할 경우, 아비딘이 수식된 자성 나노입자에 타겟 핵산 탐침 프로브와 증폭제, 타겟 핵산이 결합된 자성 핵산 증폭체를 형성하므로, 세파로스 겔 컬럼 내 하이드로겔 비드의 NHS와 아비딘의 NH₂가 결합하지 못하고, 겔 친화도가 낮아져 컬럼 배출부(outlet 도 1, 도 7 참조) 위에 밴드가 형성되었다.

실험예 1: 타겟 핵산 검출 키트를 이용한 HCR 반응 특이도 확인

(실시예 1~2의 타겟 서열, 프로브 서열, 증폭제 서열과 동일함)

도 3, 4는 전기영동을 통하여 혼성화 핵산 증폭반응을 확인한 결과이다. 도 3의 (a)는 혼성화 증폭반응의 순차적인 발생 단계(ⅰⅳ를 보여주는 모식도이다. (b)는 혼성화 반응이 발생하는 경우 각 단계 (ⅰⅳ에 해당하는 핵산 증폭체의 밴드를 보여주는 전기영동 결과이다. 각 조건에 대하여 ta, ha, H1, H2를 동일한 농도(1nM)로 30분 간 반응한 뒤 12% PAAm gel 을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 도 4는 전기영동 실험을 통하여 검출 민감도 (도 4a) 및 반응 특이도 (도 4b)를 확인한 결과이다. 도 4a는 HCR 반응의 민감도를 확인한 결과로, 도 4a 하단의 표에 기입되어 있는 ta 농도에 따른 HCR 증폭체(amplicon)를 전기영동을 통해 확인한 결과이다. 12% PAAm gel(도 4a, 좌측 도면) 전기영동을 통해서는 약 100nM 이상의 타겟에 대하여 앰플리콘 형성이 두드러지는 것을 확인하였으며 1% agarose gel (도 4a, 우측 도면)을 통해 과량의 타겟물질 (100 nM 이상)에 대해서 600 bp 가량의 포화 증폭체가 형성됨을 확인하였다.

도 4b는 도 3의 (b)와 동일하게 non target reaction이 발생하지 않음을 12% PAAm gel (도 4b, 좌측 도면) 확인한 결과로, 녹색 네모 구간을 통해 증폭제 (H1, H2)간 혼성화 반응이 발생하지 않았으며 노란색 네모 구간과 빨간색 네모 구간을 통해 특이적인 HCR 반응이 발생했음을 확인하였다. 또한, 1% agarose gel (도 4b, 우측 도면)을 이용하여 이를 재확인한 결과 HCR 반응의 조건을 모두 충족하는 경우 (ta, ha, H1, H2)에만 특이적으로 600BP 가량의 증폭체가 형성됨을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 자성 나노 입자 수식 단계별 입자 특성 확인

도 5는 자성 나노입자의 합성 단계에 따른 확인 과정을 나타낸다. ⅰⅲ은 각각 자성 나노입자, 실리카 박막이 수식된 자성 나노입자, 카르복실기(COOH)가 표면에 개질된 자성 나노입자에 대한 TEM 이미지를 우측 표는 DLS를 통한 사이즈 확인을 한 결과이다. TEM 이미지 및 DLS를 확인한 결과 각 단계별로 입자의 크기가 순차적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 최종 단계에서 카르복실기를 개질한 뒤(ⅲ489nm 가량의 크기를 갖는 것을 확인하였다.

ⅳ 단계는 입자 크기의 변화가 발생하지 않으므로 형광 및 흡광 신호를 통해 개질 여부를 확인하였다(a)는 카르복실기(COOH)에 형광물질 (AF488)이 표지된 스트렙트 아비딘을 개질한 후 개질 농도에 따른 형광 신호를 확인한 결과이다. 그래프를 통해 개질하는 단백질(avidin, streptavidin) 농도가 증가함(2x10^-5~ 2 nM)에 따라 개질 정도가 증가함을 확인할 수 있다. (b)는 개질한 아비딘의 농도에 따른 BCA 측정 결과를 나타낸다. BCA assay는 Pierce™BCA Protein Assay Kit를 이용하여 수행했으며 제조회사에서 제시한 프로토콜에 따라 검출 실험을 수행하였다. 개질 여부를 확인하기 위하여 단백질 질량 (0~80ug, 2x10^-5~2nM에 해당함)에 따라 590nm의 흡광 신호가 증가함을 확인하였다. (a)와 (b)를 통해 입자에 단백질이 성공적으로 개질됨을 확인하였다.

실험예 3: 현장 진단 적합성 검증을 위한 검출 한계 확인

도 6은 혼성화 연쇄 반응이 발생한 자성 핵산 증폭제 반응 조건에 대한 최적화 과정을 나타낸다. 혼성화 연쇄 반응은 온도, 시간, 타겟 시퀀스 내 검출 부위의 위치에 영향을 받으며 DNA 길이에 따라 형광 신호의 세기가 증가하는 형광 표지(picogreen labeling kit)를 이용하여 조건 변화에 따른 HCR 발현 정도를 마이크로 플레이트 리더기를 이용하여 정량적으로 확인하였다. (a)는 시간에 따른 HCR 발현 정도를 확인한 그래프로 자성 탐침 복합체 50ug에 증폭제(H1, H2 각각 200nM)에 타겟(ta 20nM)을 가한 뒤 5분 단위로 형광 세기를 측정한 결과이다. 이를 통해 혼성화 증폭반응을 위해 필요한 최소 시간은 20분임을 확인할 수 있다. (b)는 온도에 따른 혼성화 반응의 발생 정도를 확인한 그래프이다. 자성 탐침 복합체 50ug에 증폭제(H1, H2 각각 200nM)에 타겟(ta 20nM)을 가한 뒤 5~45 ℃ 구간에 대하여 10℃간격으로 조건을 설정한 뒤 20분간 반응시켰다. 해당 실험을 통해 상온(25 ℃) 조건에서 가장 반응성이 높은 것을 확인했으며 그 이상의 온도에 대해서는 증폭 신호가 포화되었다. (c)는 타겟 길이별 및 타겟 위치별 반응성을 확인한 실험 결과이다. 자성 탐침 복합체 50ug에 증폭제(H1, H2 각각 200nM)에 타겟 (ta 20nM)을 가한 뒤 상온에서 20분간 반응한 뒤 형광신호를 측정하였다. 해당 실험에는 프로브에 적합한 20 bp 길이의 시퀀스(ta, 시퀀스 정보 참조)와 보다 20 bp 의 타겟을 포함하는 50 bp 길이의 도 7의 C 를 통해 타겟 시퀀스(Long M 검출 부위가 시퀀스 중간에 위치하는 경우, Long R 검출 부위가 시퀀스 우측에 위치하는 경우), 그리고 임의의 genomic DNA (gDNA)에 대하여 특이도 테스트를 수행하였다. 실험 결과 타겟이 긴 시퀀스(50 bp) 우측 말단에 위치하는 경우 (Long R) 가장 반응성이 우수함을 확인하였다. (d)는 타겟 농도(0~1000nm)에 따른 민감도를 확인한 실험에 대한 그래프이다. 자성 탐침 복합체 50ug에 증폭제(H1, H2 각각 200nM)에 타겟 (ta 20 bp, 0~1000nM)을 가한 뒤 상온에서 20분간 반응한 뒤 형광신호를 측정하였다. 농도에 따른 형광 값을 근사 함수에 적용하고 결정계수(R^2)를 확인한 결과 0.9654의 높은 결정계수 값을 확인하였다.

실험예 4: 현장 진단용 크로마토그래피 결과 확인

도 7의 (a)는 진단용 크로마토그래피의 키트의 양성 음성 판단 기준에 대한 모식도이다. 도 7의 (b)는 타겟(ta) 존재 시 그 농도에 따른 밴드의 이동 정도를 나타내며 순차적으로 0.1pM, 1pM, 10pM, 100pM, 1000pM 그리고 10000pM 타겟에 대한 이동 정도를 나타낸다. 해당 실험은 아비딘 수식된 자성 나노입자 50ug, ha 50nM을 상온에서 1시간 반응하여 자성 탐침 복합체를 제작한 뒤, H1 200nM, H2 200nM과 ta 위에서 제시한 농도별로 혼합하여 혼성화 연쇄반응을 발생시킨 뒤 반응물을 도 1의 step 2의 시험군 컬럼과 연결된 마이크로 튜브에 주입하여 검은색 밴드의 이동 정도를 확인하는 실험이다. 이 실험을 통해 약 10pM 정도의 타겟 존재 시 밴드가 양성 대조군과 같은 지점에 형성되는 것을 확인하였다. (c)는 시험군의 검은색 밴드가 이동한 지점을 전체 컬럼 길이에 대하여 상대적인 비(주입부 기준, 0~1.0)를 통하여 표현한 것이다. 양성 대조군 컬럼과 동일한 지점까지 검은색 밴드가 이동한 경우 이 수치를 1.0으로 나타내었다. (d)는 도 6의 실험에서 이용한 형광 분석법을 이용하여 크로마토그래피 키트의 결과와 형광 정량 신호를 비교한 그래프이다. 해당 그래프를 통해 타겟 농도에 따라 형광 신호와 크로마토그래피의 밴드 이동 거리의 경향성이 일치하는 것을 확인할 수 있다.

실험예 5: ASFV 모사체를 이용한 현장 진단용 크로마토그래피 결과 확인

도 10은 ASFV (african swine fever virus) 전체 유전자 내 특이적 검출 부위(a: B962L, b: C717R, c: D1133L, d: G1340L) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) 및 해당 검출 부위에 대한 탐침 및 증폭제 염기 서열을 나타낸 것이다.

도 11의 (a)~(d)는 도 10의 ASFV 유전인자 4종 (a: B962L, b: C717R, c: D1133L, d:G1340L) 에 대한 형광정량 및 크로마토그래피 테스트 결과로, 도 10의 타겟 유전정보를 도 9의 플라스미드 벡터에 삽입하여 각 유전자에 적합하게끔 설계된 자성 탐침 복합체와 증폭제를 이용하여 도 7과 동일한 실험을 반복 수행한 결과이다.

실험 과정은 실험예 4와 동일하며 모든 그래프의 데이터는 6회 반복되어 측정되었다.

도 11에서 (i)은 피코그린 형광 분석을 통한 타겟 농도에 따른 앰플리콘의 상대적인 형광 신호를 나타낸 것이며, (ii) 컬럼 크로마토그래피를 통한 농도에 따른 검은색 밴드 형성 위치를 상대적으로 나타낸 결과이며, (iii) 은 0.1, 1, 10, 100, 1000, 그리고 10000 pM 농도의 플라스미드 타겟에 대한 크로마토그래피 컬럼 결과물의 실물 이미지를 나타낸다. 해당 결과를 통해 서로 다른 복수의 타겟 유전자에 대해 균일한 검출 성능을 나타냄을 확인할 수 있다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Target nucleic acid detection platform based on hybridization chain reaction <130> P22U16C0312 <150> KR 10-2021-0042310 <151> 2021-03-31 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ta <400> 1 cactgggttg gtattcctcc cgtgg 25 <210> 2 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ha <400> 2 aaaaaaaact cccgtggtaa acaagttggg tttcccttgt ttaccacggg aggaatacca 60 acccagtg 68 <210> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1 <400> 3 taaacaagtt gggtttccgg ttggaaaccc aacttgttta ccacgggag 49 <210> 4 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H2 <400> 4 aaccggaaac ccaacttgtt tactcccgtg gtaaacaagt tgggtttcc 49 <210> 5 <211> 250 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> African swine fever virus E75 complete genome, strain E75 <400> 5 gataccacaa gatcagccgt agtgatagac cccacgtaat ccgtgtccca actaatataa 60 aattctcttg ctctggatac gttaatatga ccactgggtt ggtattcctc ccgtggcttc 120 aaagcaaagg taatcatcat cgcacccgga tcatcggggg ttttaattgc attgcctccg 180 tagtggaagg gtatgtaaga gctgcagaac tttgatggaa acttatcgat aagattgata 240 ccatgagcag 250 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cloning Region of pBHA <400> 6 gaattcagcc agcaagacag cgatatcacc tgtaagtcgg ac 42 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBA_F <400> 7 attgtctcat gagcggatac 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBH_R <400> 8 gcgttatccc ctgattctg 19 <210> 9 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B962L Probe DNA (ha) <400> 9 aaaaaaaatt attggagtaa acaagttggg tttcccttgt ttactccaat aaagtcggtt 60 ttcccat 67 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B962L Target DNA <400> 10 atgggaaaac cgactttatt ggag 24 <210> 11 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B962L Helper DNA1 <400> 11 taaacaagtt gggtttccgg ttggaaaccc aacttgttta ctccaataa 49 <210> 12 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B962L Helper DNA2 <400> 12 aaccggaaac ccaacttgtt tattattgga gtaaacaagt tgggtttcc 49 <210> 13 <211> 272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of B962L gene inserted in the plasmid <400> 13 ccgggagctt tccaaagaga ttatcaaagg ccaaaaaaat ttaaatgaca aagagtttaa 60 aaagttaagc ctacaccaaa ttcagtatat ggaatccttt ctacttatgt cggatgttgc 120 cattatgatt accacagagt atgttggcta cactcttcaa tccttaccgg gtattatctc 180 gcgatccagc tacgtatccc ccatcgtgaa aaacattttg acggacgaag attcttttat 240 gtccctatta ttcgacctgt gctatggcgc ct 272 <210> 14 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C717R Probe DNA <400> 14 aaaaaaaaga atcttcgtaa acaagttggg tttcccttgt ttacgaagat tcttttatgt 60 ccctatt 67 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C717R Target DNA <400> 15 aatagggaca taaaagaatc ttcg 24 <210> 16 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C717R Helper DNA1 <400> 16 taaacaagtt gggtttccgg ttggaaaccc aacttgttta cgaagattc 49 <210> 17 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C717R Helper DNA2 <400> 17 aaccggaaac ccaacttgtt tagaatcttc gtaaacaagt tgggtttcc 49 <210> 18 <211> 282 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of C717R gene inserted in the plasmid <400> 18 gataccacaa gatcagccgt agtgatagac cccacgtaat ccgtgtccca actaatataa 60 aggagaaatt taaaaaggat tttattgccc gggagctttc caaagagatt atcaaaggcc 120 aaaaaaattt aaatgacaaa gagtttaaaa agttaagcct acaccaaatt cagtatatgg 180 aatcctttct acttatgtcg gatgttgcca ttatgattac cacagagtat gttggctaca 240 ctcttcaatc cttaccgggt attatctcgc gatccagcta cg 282 <210> 19 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D1133L Probe DNA <400> 19 aaaaaaaaga atcttcgtaa acaagttggg tttcccttgt ttacgaagat tcttttatgt 60 ccctatt 67 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D1133L Target DNA <400> 20 aatagggaca taaaagaatc ttcg 24 <210> 21 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D1133L Helper DNA1 <400> 21 taaacaagtt gggtttccgg ttggaaaccc aacttgttta cgaagattc 49 <210> 22 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D1133L Helper DNA2 <400> 22 aaccggaaac ccaacttgtt tagaatcttc gtaaacaagt tgggtttcc 49 <210> 23 <211> 250 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of D1133L gene inserted in the plasmid <400> 23 gataccacaa gatcagccgt agtgatagac cccacgtaat ccgtgtccca actaatataa 60 aattctcttg ctctggatac gttaatatga ccactgggtt ggtattcctc ccgtggcttc 120 aaagcaaagg taatcatcat cgcacccgga tcatcggggg ttttaattgc attgcctccg 180 tagtggaagg gtatgtaaga gctgcagaac tttgatggaa acttatcgat aagattgata 240 ccatgagcag 250 <210> 24 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G1340L Probe DNA <400> 24 aaaaaaaacc tactagataa acaagttggg tttcccttgt ttatctagta ggcttagatg 60 agggtag 67 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G1340L Target DNA <400> 25 ctaccctcat ctaagcctac taga 24 <210> 26 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G1340L Helper DNA1 <400> 26 taaacaagtt gggtttccgg ttggaaaccc aacttgttta tctagtagg 49 <210> 27 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G1340L Helper DNA2 <400> 27 aaccggaaac ccaacttgtt tacctactag ataaacaagt tgggtttcc 49 <210> 28 <211> 240 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of G1340L gene inserted in the plasmid <400> 28 aacgtgtgtt tagtgaggca ggtattatta atatagaacc gctttgtgcc tagcagggcc 60 ttcgtctttt ggcagcacgg cagacagtaa tttagggggt ggcggccttc tagtaggctt 120 agatgagggt agtcaggatg cgggcagcta tagtaggcag gtaccccctc cgtgaaattc 180 caatacttta ctagctcctt gcgtttggct ggcggcatgg atttcacctc ggcctctgag 240 240

Claims

아비딘이 수식된 자성 나노입자;
타겟 핵산의 전부 또는 일부 서열과 상보적으로 결합하는 부위를 포함하며, 말단에 바이오틴이 결합된 헤어핀 구조의 타겟 핵산 탐지 프로브;
헤어핀 구조 올리고머의 제 1 증폭제(helper 1) 및
헤어핀 구조 올리고머의 제 2 증폭제(helper 2)
을 포함하는 상온 혼성화 연쇄 반응 기반 타겟 핵산 검출 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 타겟 핵산은 동물, 식물, 세균, 바이러스 및 진균으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 존재하거나 이로부터 유래된 것인 상온 혼성화 연쇄 반응 기반 타겟 핵산 검출 키트.
시료에,
아비딘이 수식된 자성 나노 입자; 타겟 핵산의 전부 또는 일부 서열과 상보적으로 결합하는 부위를 포함하며, 말단에 바이오틴이 결합된 헤어핀 구조의 타겟 핵산 탐지 프로브를 첨가하여 자성 아비딘 복합체와 프로브가 결합된 자성 탐침 복합체를 형성하고 타겟이 결합된 자성 탐침 복합체를 분리하는 단계;
상기 타겟이 결합된 자성 탐침 복합체에 제 1 증폭제와 제 2 증폭제를 첨가하여 상온 혼성화 연쇄 반응(Hybridization Chain Reaction)으로 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭된 타겟 핵산 용액의 바이러스 감염을 판별하는 단계
를 포함하는 상온 혼성화 연쇄 반응 기반 타겟 핵산 검출방법.
제 3 항에 있어서,
시료는 혈액, 혈장, 뇨, 타액, 객담, 비말 또는 비액인 타겟 핵산 검출방법.
제 3 항에 있어서,
상기 바이러스는 아프리카 돼지 열병 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, C형 간염 바이러스, 구제역 바이러스, 중동호흡기증후군 코로나바이러스, 중증급성소흡기증후군 코로나바이러스, 신종코로나바이러스(코로나 19), 파라믹소 바이러스 및 이의 변이체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 바이러스인 상온 혼성화 연쇄 반응 기반 타겟 핵산 검출방법.