JP4183256B2

JP4183256B2 - 核酸増幅反応産物の鎖分離方法、核酸増幅反応産物の検出方法

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Description

本発明は核酸増幅反応産物の鎖分離方法、核酸増幅反応産物の検出方法に関する。

プライマーを用いた核酸増幅、いわゆるPCR（ポリメレースチェインリアクション）は核酸試料の量が微量である場合にも、目的とする塩基配列を有する核酸断片を増幅して、その後の精製や検出に十分な量を確保するために有用な方法として、生体からの核酸の分離精製、各種核酸試料中における標的核酸の検出、遺伝子検査などにおいて利用されている。

ＰＣＲでは核酸は２本鎖として増幅され、増幅産物の用途によっては、これを一本鎖に解離させてその両方または一方が使用される。

ＰＣＲを利用した標的核酸の分離精製や検出における精度を更に向上させるために、ＰＣＲでの増幅反応効率を上げるための種々の提案がなされている。例えば、特開２０００−１０２４００号公報には、プライマーの一部に磁気微粒子を結合しておき、増幅反応時に反応溶液に磁界を作用させて磁気微粒子を動かすことにより、結果として反応溶液を攪拌し反応の効率を上げる方法が開示されている。また、特開２００４−０６５１９９号公報にも微粒子にプライマーを結合して増幅反応を行う方法が開示されている。
特開2000-102400号公報特開2004-065199号公報

PCRによる増幅反応後の核酸は場合により検出を目的とする核酸（標的核酸）の塩基配列の特定の部分に相補的な塩基配列を有するプローブ核酸とハイブリッドを形成する反応（ハイブリダイゼーション）を用いて検出されるが、一般的に増幅反応後の核酸が相補的な二本の核酸である。ところが、この二本鎖として増幅された核酸が得られることがその後の工程の効率を低下させてしまう場合がある。例えば、増幅後の標的核酸を含む二本鎖核酸を一本鎖化し、プローブとともにハイブリダイゼーション条件におくと、プローブと標的核酸のハイブリッド形成と、増幅後の二本の核酸同士のハイブリッド形成が競争的に起こり、プローブと標的核酸のハイブリッド形成が阻害されて所望の検出が効率よく行われない場合があることである。このような場合、PCRを例にあげて説明すると、例えば、二種のプライマーの片方にビオチンを結合しておき、PCR後にアビジンカラムを通すことによって鎖分離を行う方法が知られているが、操作が面倒であったり、カラムから溶出した（一本鎖）標的核酸を濃縮する必要がある場合がある等の課題があり、より効率的な鎖分離方法が求められていた。

また、標的核酸は、増幅反応時に蛍光物質で標識された蛍光標識プライマー、あるいは、蛍光標識ヌクレオチドモノマーを用いて蛍光標識され、DNAマイクロアレイなどの固相ハイブリダイゼーション反応と蛍光法によって検出されるのが一般的である。蛍光法は比較的簡便な方法であり、且つ感度も実用上十分なほど高いといえるが、例えば、1分子の標的核酸を検出しようとすると特殊な検出装置が必要であり、その意味では、より簡易に感度よくハイブリダイゼーションを検出する手段も求められていた。

本発明の目的のひとつは、核酸増幅反応後の二本鎖核酸を構成する各鎖の鎖分離を容易とし、ＰＣＲを利用する標的核酸の取得、標的核酸の検出などを更に効率良く行なうことを可能とする増幅産物としての二本鎖核酸の鎖分離方法を提供することにある。また、本発明の他の目的は増幅された標的核酸の簡便、且つ、高感度に検出することにある。

本発明は上記従来技術の有する問題点に鑑み為されたものであり、以下の各方法を含む。

本発明の標的核酸の検出方法は、複数種の核酸プローブを基板表面に固定した固定化核酸プローブを用いて標的一本鎖核酸を検出する標的核酸の検出方法において、
第１のプライマーと第２のプライマーからなり、該第１のプライマーに捕獲用の微粒子
が結合している増幅用のプライマーのセットを用意する工程と、
標的一本鎖核酸を含む試料に対して前記プライマーのセットを用いて増幅反応を行い、
増幅反応産物を得る工程と、
前記増幅反応産物としての二本鎖核酸を構成する鎖の一方である第１のプライマーを有
する一本鎖核酸と他の一本鎖核酸とを熱変性させ、該第１のプライマーの有する微粒子を捕獲することで分離する鎖分離を行う工程と、
前記微粒子の粒径が0.1〜30ｎｍであり、該微粒子が結合した第１のプライマーを有する標的一本鎖核酸を、複数種の核酸プローブを基板表面に固定した固定化核酸プローブと反応させ、前記微粒子を用いてハイブリッド体を検出する工程と、を有することを特徴とする標的核酸の検出方法である。

（鎖分離方法）
本発明にかかる鎖分離方法では、増幅された二本鎖核酸（一回伸長のみの場合を含む）のそれぞれの鎖を精度良く分離して、これらのうちの所望とする一本鎖核酸を効率良く分離回収するために、増幅された二本鎖核酸の一方の鎖にその分離に利用し得る捕獲用の微粒子が導入されるように微粒子を結合したプライマーを用いる。なお、粒子にプライマーを結合して増幅反応を行うに関しては、特開2000-102400号公報に記載があるが、これはプライマーの一部に磁気微粒子を結合し、増幅反応時に反応溶液に磁界を作用させて磁気微粒子を動かすことにより、結果として反応溶液を攪拌し反応の効率を上げるというもので、本発明のようにプライマーの一方に微粒子を結合して鎖分離する方法については開示されていない。また、特開2004-065199号公報には、反応効率をあげ、また、操作が簡単で実用性の高い検出のために微粒子にプライマーを結合して増幅反応を行う方法が示されている。同公開公報においては一方のプライマーに微粒子を結合する場合についても記載があるが、本発明の一要件である鎖分離については述べられていない。

本発明による鎖分離方法によって、効率的なハイブリダイゼーションが可能となるが、この場合、ひとつの反応場に複数セットのプライマーを用いてもよく、検出対象の核酸、もしくは、酸部位も複数でもよい。

本発明の鎖分離方法によれば、増幅産物の片方の鎖に微粒子が結合しているので、例えば、遠心分離によって鎖分離を行うことが可能であるし、微粒子が磁性微粒子であれば、磁力によっても鎖分離が可能であり、簡便で操作が容易な鎖分離が可能となる。

具体的には、本発明にかかる鎖分離方法は、以下の工程を含む。
（ａ）第１のプライマーと第２のプライマーからなり、該第１のプライマーに捕獲用の微粒子が結合している増幅用のプライマーのセットを用意する工程と、
（ｂ）前記プライマーのセットを用いて二本鎖核酸の増幅反応産物を得る工程と、
（ｃ）前記増幅反応産物としての二本鎖核酸を構成する一方の鎖である第１のプライマーを有する一本鎖核酸と、他方の鎖である第２のプライマーを有する一本鎖核酸とを、該第１のプライマーの有する微粒子を捕獲することで分離する鎖分離を行う工程と
を有する。

ここで、二本鎖核酸の増幅反応産物を得るためのＰＣＲの増幅対象としての核酸試料は、増幅対象として塩基配列を有する一本鎖核酸や、かかる一本鎖核酸とその相補配列により形成された二本鎖核酸の形態として本発明の鎖分離方法に利用することができる。

また、試料中に標的核酸とそれ以外の核酸（一本鎖でも二本鎖でもよい）が混在しており、そのままＰＣＲでの増幅を行なうと反応効率が向上しない場合などには、以下の各工程：
（ａ）標的一本鎖核酸を含む試料を用意する工程と、
（ｂ）第１のプライマーと第２のプライマーとからなり、該第１のプライマーに捕獲用の微粒子が結合しているプライマーのセットを用意する工程と、
（ｃ）前記第１のプラーマーを前記試料中の標的一本鎖核酸とハイブリダイズさせてハイブリッド体を得る工程と、
（ｄ）前記ハイブリッド体を該ハイブリッド体が有する微粒子を用いて捕獲する工程と、
（ｅ）前記捕獲されたハイブリッド体と前記第２のプライマーとを用いて増幅反応を行い、増幅反応産物を得る工程と、
（ｆ）前記増幅反応産物としての二本鎖核酸を構成する一方の鎖である第１のプライマーを有する一本鎖核酸を、他方の鎖である第２のプライマーを有する標的一本鎖核酸と分離する鎖分離を行う工程
を有する鎖分離方法が好適に利用できる。

この方法では、試料中から標的核酸を微粒子を結合したプライマーを用いて、増幅対象の核酸を夾雑核酸などと効率よく分離してから増幅反応に用いることができ、更に増幅産物としての二本鎖核酸の各鎖（一本鎖）を再度微粒子を用いて効率良く分離することができる。この場合、標的一本鎖核酸は一本鎖の状態で試料中に含まれてもよいし、二本鎖核酸の状態で試料中に含まれてもよい。また、上記（ｅ）の増幅反応時に微粒子を有する第１のプライマーを添加してもよい。すなわち、微粒子を利用して試料中の夾雑核酸などと分離した増幅対象の核酸に対して第１及び第２のプライマーを用いた増幅反応を行って、増幅された二本鎖核酸から微粒子を利用して所望の鎖を分離回収することができる。第１及び第２のプライマーの添加時期及びその量はこの方法によって目的とされる鎖分離が達成できる範囲で種々選択できる。更に、ハイブリダイゼーションによる試料中からの標的一本鎖核酸の分離時におけるプライマーに結合させた微粒子と増幅反応時のプラーマーに結合させる微粒子の分離特性を異ならせてもよい。

（標的核酸の検出方法）
本発明にかかる標的核酸の第１の態様は、複数種の核酸プローブを基板表面に固定した固定化核酸プローブを用いて標的一本鎖核酸を検出する標的核酸の検出方法において、
第１のプライマーと第２のプライマーからなり、少なくとも一方のプライマーに微粒子が結合している増幅用のプライマーのセットを用意する工程と、
標的核酸を含む核酸群に対して前記プライマーのセットを用いて増幅反応を行い、増幅反応産物を得る工程と、
前記増幅反応産物としての二本鎖核酸を構成する一方の鎖である前記第１のプライマーを有する一本鎖核酸と、他方の鎖である前記第２のプライマーを有する一本鎖核酸の少なくとも一方を、複数種の核酸プローブを基板表面に固定した固定化核酸プローブを用いて検出する工程と、
を有することを特徴とする標的核酸の検出方法である。

この方法では、増幅された二本鎖核酸の鎖分離をせずにプローブでの検出を行なうことができ、この検出に必要に応じて微粒子を利用することができる。

本発明の標的核酸の検出方法の第２の態様は、上記鎖分離方法を利用して分離された（一本鎖の）核酸を、複数の核酸プローブが表面に結合されている、いわゆる核酸プローブチップを用いて検出する方法であって、標的核酸を含む核酸群を二種のプライマーを用いて増幅反応を行うにあたり、一方のプライマーに微粒子を結合して、増幅反応後の二本鎖増幅反応産物を前記微粒子を用いて一本鎖に分離し、分離された一本鎖の標的核酸を前記核酸プローブチップによるハイブリダイゼーションを用いて検出することを特徴とする。

この場合も上述の通り、複数のプライマーセットを用いることが可能で、プローブチップを用いれば、複数の増幅産物を同時に検出できるので、より好適といえる。

プローブチップを用いて増幅産物を検出するには二つの方法が可能である。第一の方法は、二種のプライマーのうち、標的配列を有する鎖の伸長用プライマーに微粒子が結合されており、ハイブリダイゼーションの検出を上記微粒子を検出することによって行う方法であり、第二の方法は、二種のプライマーのうち、標的配列を有していない鎖の伸長用プライマーに微粒子が結合され、標的配列を有している鎖の伸長用プライマーに他の標識物質が結合され、ハイブリダイゼーションの検出を上記他の標識物質を検出することによって行う方法である。第一の方法によれば、後述するように、より高感度な検出が可能である。第二の方法では従来から用いられている標識方法をそのまま用いることが出来る。その場合、感度的には従来と同様であるが、鎖分離が簡便であるという利点がある。

さて、ここまでは核酸増幅後の鎖分離、および鎖分離された核酸の検出について説明してきたが、この場合の核酸増幅は、ごく一般的な増幅、例えば二種のプライマーを用いて増幅サイクルを20〜30回行うようなPCRを念頭に説明してきたが、場合によっては、標的核酸を含む核酸群を一種のプライマーを用いて（リニア）増幅反応を行うにあたり、該プライマーに微粒子を結合して、増幅反応後の一本鎖の標的核酸を前記核酸プローブチップによるハイブリダイゼーションを用いて検出してもよく、また、二種のプライマーを使用する場合を含めて、検出の感度が高い場合などには増幅サイクルが1回〜数回でもよい。

本発明の検出方法においても前述のように、微粒子とし磁性微粒子を用いて、簡単に鎖分離を行うことが出来得るに加えて、ハイブリダイゼーション反応時に、外部から磁界を加えることによって、反応溶液を攪拌したり、あるいは、標的核酸を核酸プローブに近接させて反応を促進することも可能である。

本発明の固定化核酸プローブ（核酸プローブチップ）を用いて微粒子を結合した標的核酸を検出する場合の検出方法における微粒子は標識としての機能も有しているので、微粒子を標識として利用する場合は、検出対象を検出する手段としては、微粒子を検出可能な手段であれば如何なる手段であっても利用可能である。また、微粒子が結合していない一本鎖核酸を検出する場合は、必要に応じて用いた標識を利用してこれを検出すればよく、検出手段も標識の種類に応じて適宜選択できる。

本発明の各方法において用いる微粒子の形状、サイズは特に限定されるべきものではなく、微粒子の材料、組成、作製方法、プライマーの結合方法、増幅反応、ハイブリダイゼーション反応の速度、１微粒子あたりのプライマー結合数、検出方法、検出感度等によって適宜選択されるが、上記各要件を勘案すると、非定型微粒子、定型微粒子の場合で、その粒径相当のサイズが0.1〜1000 nmの微粒子、また、棒状、針状、片々状等の微粒子の場合は、縦、横、高さの少なくとも2方向のサイズが0.1〜1000 nmである微粒子を好適に用いることが出来る。

このようなサイズの微粒子を検出する手段としては、限定的ではないが、光学顕微鏡、電子顕微鏡、いずれも二次元イメージングが可能な飛行時間型二次イオン質量分析法（TOF-SIMS）、X線光電子分光法（XPS）、オージェ電子分光（AES）等の表面分析法、さらには三次元形状が比較的簡便に且つ高感度に検出可能な、各種走査型プローブ顕微鏡（SPM）を用いることが出来る。特に微粒子が磁気微粒子の場合はSPMの一種である磁気力顕微鏡（MFM）を用いると、形状情報とともに磁気情報が得られるので、場合によっては非コンタクトモードで測定可能でもあるので、迅速で、場合によっては正確で信頼性の高い検出が可能となる。なお、磁気粒子の場合には、PCRを行い際に反応液に磁界をかけて反応液を撹拌したり、増幅対象の核酸とプライマーとの接触機会数を増加させてより効率良い増幅反応を可能とすることができる。

特に上述のような高感度な検出方法を用いる場合には、増幅産物の濃度が低くても、良好に検出される場合があり、そのような場合には、特に鎖分離を行う必要がない場合がある。本発明では鎖分離を行わずに粒子で標識された増幅産物をSPM、MFM等で検出する方法も一形態である。

本発明に用いる微粒子の作製方法、また、核酸プライマーの結合方法は、本発明の機能を果たすものであれば、いかなる方法でも構わなく、例えば、前記特許公開公報に記載の方法が利用可能である。

以下に、本発明の実施形態について、磁気微粒子を用いる場合を中心に、さらに詳細を説明する。なお、磁気粒子及び核酸プライマー、磁気粒子とプライマーの結合方法、ハイブリダイゼーションの反応方法及び核酸プローブチップは以下のようなものが挙げられる。しかし、ここで挙げたものにだけ限るものではない。

本発明で述べている磁気粒子とは、磁性微粒子、磁性ナノ粒子及び磁性物質を被覆した微粒子などからなる群より選択された少なくとも一種であればいかようなものでもよい。

磁性粒子の材料は特に限定はされず、例えばニッケル粒子や鉄粒子、Ｆｅ₃Ｏ₄、γ-Ｆｅ₂Ｏ₃、Ｃｏ-γ-Ｆｅ₂Ｏ₃、（ＮｉＣｕＺｎ）Ｏ・（ＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆｅ₂Ｏ₃、（ＭｎＺｎ）Ｏ・Ｆｅ₂Ｏ₃、（ＮｉＺｎ）Ｏ・Ｆｅ₂Ｏ₃、ＳｒＯ・６Ｆｅ₂Ｏ₃、ＢａＯ・６Ｆｅ₂Ｏ₃、ＳｉＯ₂で被覆したＦｅ₃Ｏ₄（粒径２００Å）[ＥｍｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂ.Ｔｅｃｈｎｏｌ.,ｖｏｌ.２，ｐ２-１０（１９８０）参照]等の各種フェライトと各種の高分子材料（ナイロン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン）との複合粒子を用いることが可能である。

本発明で用いることが可能なプローブチップの基板材料としては、ガラス、プラスティック、シリカ、金属が挙げられるが、これらの材料は、プローブチップと磁気微粒子結合標的核酸のハイブリダイゼーション反応の際に、磁界をかけた時に磁化されない素材を選ぶことが重要である。

本発明において（磁気）微粒子とプライマーとの結合は、プライマーの末端に第一の官能基を導入し、該第一の官能基に結合することのできる第二の官能基を微粒子に導入し、両者を結合することにより得ることができる。微粒子とプライマーの結合方法には、物理吸着法やイオン結合法、共有結合法が挙げられる。物理吸着法は、微粒子とプライマーとの間に働く疎水性相互作用により固定化する方法であり、微粒子はプライマー溶液に浸漬するだけでプライマーと吸着する。イオン結合法は、陽イオンと陰イオンが静電力によって引き合ってできる結合である。物理吸着法やイオン結合法は、可逆的な結合法のため、本発明ではあまり好ましくない。それに対し共有結合法は、微粒子とプライマーの両者に互いに共有結合が可能な官能基を導入し、両者を反応させることで他の結合法に較べて強い結合を得ることが出来る。

より具体的な組み合わせとしては、微粒子へ導入する第二の官能基として、イソシアネート基、エポキシ基、ホルミル基、メルカプト基等が挙げられ、プライマーへ導入する第一の官能基としては、アミノ基が挙げられる。また、微粒子へ導入する第二の官能基とプライマーへ導入する第一の官能基が逆でもよい。

更に、微粒子へ導入する第二の官能基として、マレイミジル基、α，β-不飽和カルボニル基、α-ハロカルボニル基、ハロゲン化アルキル基、アジリジン基及びジスルフィド基等が挙げられ、プライマーへ導入する第一の官能基としては、チオール基が挙げられる。また、磁気粒子へ導入する第二の官能基とプライマーへ導入する第一の官能基が逆であってもよい。

また、官能基が導入されている市販の微粒子を使用してもよい。

また、微粒子上へのプライマーの結合方法としては、微粒子上への逐次伸長合成によりプライマーを微粒子上へ固定することができる。

本発明に用いる核酸プローブチップはいかようなものでも構わないが、以下に核酸プローブ溶液を基板上にスポッティングして作製する一例を示す。

基板へのプローブのスポッティングに用いるスポッティング溶液としては、例えば、グリセリン７．５質量％、尿素７．５質量％、チオジグリコール７．５質量％、及びアセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１質量％を含む水溶液を用意し、一本鎖ＤＮＡを含む溶液（一本鎖ＤＮＡ濃度が約４００ｍｇ／ｍｌであるＴＥ溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１ｍＭＥＤＴＡ水溶液））に加え、一本鎖ＤＮＡの最終濃度が８μＭとなるように調整したものが挙げられる。このプローブ溶液の表面張力は２０〜５０ｄｙｎｅ／ｃｍの範囲内であり、また粘度は１．２〜２．０ｃｐｓ（Ｅ型粘度計：東京計器（株）社製）である。

これらのプローブを含むスポッティング溶液を基板上へスポッティングする方法は、ピン法、インクジェット法などが挙げられるが、これらの形式に限定されるわけではなく、プローブを含むスポッティング溶液を担体上へスポットすることが可能である方法であれば種類は問わない。なお、インクジェット法の場合はサーマルジェット方式及びピエゾ方式による液体吐出装置のいずれも用いることができる。

複数種類の一本鎖或いは二本鎖核酸が混在する混合溶液に対して、所望の核酸のみを分離増幅した二本鎖増幅反応産物の鎖分離方法であって、増幅を行う二種のプライマーの内、一方のプライマーに微粒子を結合し、前記した混合溶液に該微粒子を加え、所望の核酸と微粒子に結合したプライマーと結合させ、微粒子をトラップしながら微粒子と混合溶液を分離し、該微粒子に増幅溶液を混合させて増幅反応を行い、増幅反応（一回伸長のみの場合を含む）後の二本鎖核酸増幅反応産物を、前記微粒子を用いて（二本の）一本鎖核酸に分離にすることを特長とする所望の核酸のみを分離増幅した二本鎖増幅反応産物の鎖分離方法。

特に所望のDNAの抽出分離から増幅及び検出までを同一の磁性プライマーを用いて行う一貫システムの提供が可能となる。

以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する。
（実施例１）大腸菌ゲノムDNAの検出
（１）大腸菌ゲノムＤＮＡの抽出
まず、大腸菌標準株を定法に従って培養した。微生物培養液を1.5 ml容量のマイクロチューブに1.0 ml(OD₆₀₀=0.7)採取し、遠心分離で菌体を回収した(8500rpm、５分間、４℃)。上精を捨てた後、Enzyme Buffer(50mM Tris-HCl：p.H. 8.0、25mM EDTA) 300μlを加え、ミキサーを用いて再縣濁した。再縣濁した菌液は再度遠心分離で菌体を回収した（8500rpm、５分間、4℃）。上精を捨てた後回収された菌体に以下の酵素溶液を加えミキサーを用いて再縣濁した：
Lysozyme：50 μl （20 mg/ml in Enzyme Buffer）
N-Acetylmuramidase SG：50 μl （0.2 mg/ml in Enzyme Buffer）
次に、酵素溶液を加え再縣濁した菌液を、37℃のインキュベーター内で30分間静置し、細胞壁の溶解処理を行った。次いで、核酸精製キット(MagExtractor-Genome-：TOYOBO社製)を用いてゲノムＤＮＡの抽出を行った。

具体的には、まず、前処理した微生物縣濁液に溶解・吸着液750μlと磁性ビーズ40μlを加え、チューブミキサーを用いて10分間激しく攪拌した(ステップ１)。分離用スタンド(Magical Trapper)にそのマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま上精を捨てた(ステップ２)。次に洗浄液900μlを加えミキサーで５秒間程度攪拌して再縣濁を行った(ステップ３)。次に、分離用スタンド(Magical Trapper)にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま上精を捨てた(ステップ４)。ステップ３、４を繰り返して２度目の洗浄(ステップ５)を行った後、70％エタノール900μlを加え、ミキサーで５秒間程度攪拌して再縣濁した(ステップ６)。次に、分離用スタンド(Magical Trapper)にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた(ステップ７)。ステップ６、７を繰り返して70％エタノールによる２度目の洗浄(ステップ８)を行った後、回収された磁性粒子に純水100μlを加え、チューブミキサーで10分間攪拌を行った。次に、分離用スタンド(Magical Trapper)にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブ壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま上精を新しいチューブに回収した。回収された大腸菌のゲノムＤＮＡは、定法に従って、アガロース電気泳動と260／280ｎｍの吸光度測定を行い、その品質(低分子核酸の混入量、分解の程度)と回収量を検定した。本実施例では約９μｇのゲノムＤＮＡが回収され、ゲノムＤＮＡのデグラデーションやｒＲＮＡの混入は認められなかった。回収したゲノムＤＮＡは、最終濃度5 ng/μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解し、以下の実施例に使用した。

（２）PCRプライマーの準備
（１）で準備した大腸菌ゲノムの16S rRNA遺伝子領域をPCR増幅するためのプライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを用意した。
フォーワードプライマー：５’GCGGCAGGCCTAACACATGCAAG３’
リバースプライマー：５’ATCCAACCGCAGGTTCCCCTAC３’
リバースプライマーには磁気微粒子との結合を図るために５’末端にヘキサメチレンリンカーを介してアミノ基を結合した。オリゴヌクレオチドの合成はいずれも株式会社ベックスに依頼して行った。

（３）核酸プローブチップの作製
上記大腸菌ゲノムのPCR増幅産物（のリバースプライマー側の鎖）を検出するためのプローブ、および、ネガティブコントロールプローブとして、それぞれ以下の１及び２のオリゴヌクレオチドを合成した。それぞれのオリゴヌクレオチドの５'末端にはヘキサメチレンリンカーを介してチオール基を結合した。
１：５’CGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGT３’
２：５’CGTACGATCGATGTAGCTAGCATGC３’
核酸プローブアレイの基板として、合成石英基板(サイズ：25mm×75mm×１mm、飯山特殊ガラス社製)を耐熱、耐アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、20分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で20分超音波洗浄を行った。次に80℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に10分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、プローブアレイ用の石英ガラス基板を用意した。

シランカップリング剤KBM-603(信越シリコーン社製)を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、20分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を120℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のN-マレイミドカプロイロキシスクシイミド(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido)(以下EMCSと略す)を、ジメチルスルホキシドとエタノールの1:1混合溶媒中に最終濃度が0.3mg/mlとなるように溶解しEMCS溶液を用意した。ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したEMCS溶液中に室温で２時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とEMCSのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。EMCS溶液から引き上げたガラス基板を、先述のEMCSを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。

上述のプローブをそれぞれ純水に溶解し、最終濃度(後記溶解時)10μMとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。次に、グリセリン7.5wt%、チオジグリコール7.5wt%、尿素7.5wt%、アセチレノールEH(川研ファインケミカル社製)1.0wt%を含む水溶液（混合溶媒）を用意した。続いて、先に用意した2種のプローブを上記混合溶媒に10μMの濃度となるようにそれぞれ溶解した。得られたＤＮＡ溶液をバブルジェットプリンター(商品名：BJF-850 キヤノン(株)製)用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。

なお、ここで用いたバブルジェットプリンターは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約１０ピコリットルのＤＮＡ溶液を約120マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。

続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、１枚のガラス基板に対して、印字操作を行い、ＤＮＡチップを作製した。印字が確実に行われていることを確認した後、30分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プライマー末端のチオール基とを反応させ、30分間後に、100mMのNaClを含む10mMのリン酸緩衝液(pH 7.0)により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖ＤＮＡが固定したＤＮＡチップを得た。なお、スポッティング数は、大腸菌ゲノム用プローブ、ネガティブコントロールプローブとも1000個とした。

（４）磁気微粒子とプライマーの結合
イソシアネート基を有するシラン化合物（３−イソシアネートプロピルトリエトキシシラン）を含むシランカップリング剤（商品名：ＫＢＥ−９００７；信越化学工業（株）社製）の１wt%エタノール溶液中にＦｅ粒子（直径数ｎｍ〜３０ｎｍ）を入れ、室温下で２時間撹拌して反応させた。反応後、Ｆｅ粒子を磁石で反応溶液の下部に集結させ、エタノールを入れ替えしながら３回Ｆｅ粒子を洗浄し、１２０度に加熱したオーブン中で１０分間ベークすることで、磁気粒子にイソシアネート基を導入した。

次に、リバース側のプライマーとしてのオリゴヌクレオチド（１０nm）とシランカップリング剤処理した磁気微粒子の一部を200μｌの10mMのリン酸緩衝液(pH 7.0)中で室温下２時間反応し、その後、ブルカー・ダルトニクス社製のgenopure（磁気微粒子を用いる核酸精製キット）に付属しているマイクロチューブ用磁石ブロックを用いて、上記磁気微粒子を結合したプライマーを集め、純水で洗浄する操作を3回繰り返したのち、核酸として１０μMとなるように純水に溶解（微粒子的には分散）した。

（５）PCR反応と鎖分離
Premix PCR 試薬（TAKARA ExTaq）：25μl
Template 大腸菌ゲノム DNA：2μl(1 ng)
フォーワードプライマー：2μl(20 pmole)
リバースプライマー：2μl(20 pmole)
H₂0：19μl
（Total：50μl）
上記反応ミクスチャーを３セット用意しPCR装置（アプライドバイオシステム社製：GeneAmp PCR System 9700）を用いて、95℃：10min → 92℃：45sec → 65℃：45sec → 72℃：45sec → 72℃：10min → 4℃のサイクルで、上記３セットについて、それぞれ３、２０、３０回増幅反応を行った。次に、既に述べた磁石ブロックを用いて、上記増幅産物溶液を９０℃に加熱した後、速やかに磁性微粒子を集め、上清を取り除き、再度純水50μlに分散する操作を４回繰り返し、最終的にハイブリダイゼーション用の緩衝液（6 x SSPE ）１２０μｌに分散した。

（４）ハイブリダイゼーション
作製した核酸プローブチップ３枚について、上記３セットのハイブリダイゼーション溶液とハイブリダイゼーション装置（ジェノミックソルーション社製：GeneTAC）を用いてハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーションは45℃で４時間行い、次いで定法により洗浄を行い、最終的に冷純水で洗浄して乾燥した。

（５）MFMによる検出
ハイブリダイゼーション後の核酸プローブチップをMFM（エスアイアイ・ナノテクノロジー株式会社製：SPA-400）を用いて検出した。
結果：各プローブスポットにおいて検出された粒子数（個／μｍ：１スポットあたり10回の測定の平均値）：MFMは512スキャン／μｍ、コンタクトモード
（１）増幅サイクル３回：0.64
（２）増幅サイクル20回：11.3
（３）増幅サイクル30回：978
この結果は1個の粒子に結合している1〜数分子のターゲット核酸が検出されていることを意味しており、きわめて高感度な検出が可能であることを示すものである。

（実施例２）鎖分離しない場合の検出
実施例１と全く同じ方法で、片方のプライマーに磁気微粒子を結合してPCRを行い、その後鎖分離をすることなく検出を行ったところ、検出された平均粒子数は以下のようになった。
（１）増幅サイクル３回：0.65
（２）増幅サイクル20回：10.7
（３）増幅サイクル30回：798
この結果は、ハイブリダイゼーション時の二本鎖ターゲット濃度が高いほど相補鎖の存在によるハイブリッド形成阻害が起こっていること、また、実施例１とともにいえることであるが、使用したテンプレート濃度で、増幅サイクル数３回では、まだ、増幅がそれほど進んでいないことを示唆するものである。上記の結果から、鎖分離を行わない場合は、実用上問題のない検出を行なうには測定条件の選択が必要であることがわかる。

（実施例３）非磁性微粒子の場合の検出
実施例１と全く同じ方法で、非磁性微粒子を用いて、比較のためにあえてMFM（MFMモードにはならない）を用いて検出を行った。その結果、512回のスキャン（コンタクトモード）を行えば、実施例１とほぼ同じ結果が得られることがわかった。ただし、MFMの場合は、非コンタクトモードでラフなスキャン（例えば128回）をスキャンそのものの速度も高速に行うことが可能で、例えばラフなスキャンの後に、部分的に精密スキャンをする等の方法を採用できる利点がある。

（実施例４）ハイブリダイゼーション時の磁力による反応促進
図１に概略を示したハイブリダイゼーション装置（３は磁石）を用いて実施例１と全く同じ検出を行った。ハイブリダイゼーションの初期に約１０分間磁力をかけたところ、ハイブリダイゼーション時間が30分間で、実施例１とほぼ同様な検出結果が得られた。なお、実施例１と同じく磁界の印加を行わずに30分間のハイブリダイゼーションを行っただけでは実施例１の５〜15％程度の粒子数しか検出できなかった。磁界の印加の効果が確認できた。

（実施例５）複数種類の核酸から所望の核酸のみを分離増幅する場合に関して、
例えば血液中の大腸菌を検出する場合について詳細な説明を行う。血液中の大腸菌を抽出する装置及びキットとして一例としてキアゲンの核酸精製自動化システム(BioRobot EZ1 ワークステーション)及び試薬キットを利用する場合について説明する。

核酸精製自動化システムの装置にサンプルチューブ、溶出チューブ、フィルターチップ、プレパックEZ1試薬カートリッジをセットする。その後、精製されたＤＮＡを回収する。回収された核酸には、人ゲノムと菌のゲノムが混在した状態になっている。通常は、混在した核酸でそのままPCR増幅を行い、プライマ-セットにより所望の大腸菌のＤＮＡのみを増幅する。本実施例では、血液中の人のゲノムDNAを排除して大腸菌のDNAのみを増幅し、検出することを可能とするものである。

図２は、図３以降で説明での前提になるものの説明である。記号１１はキアゲンの核酸精製自動化システムで、記号１３は人ゲノムDNAで記号１４は菌DNAである。記号１１は、抽出精製物を表し、人ゲノムDNA１３、菌DNA１４が混在した状態になっている。記号１５はプライマーAを表し、記号１６はプライマーBを表している。プライマーA、Bは、所定の部分のDNAのみを増幅するために用いられる。記号１７は、磁性粒子にプライマーAが結合したもので、記号１８は、プライマーBに標識材が結合したものである。図３は、人ゲノムDNA１３と菌ＤＮＡ１４が混在した抽出精製物１２から磁性粒子プライマー１７を用いて、選択的に所望のＤＮＡを回収し、回収した所望のＤＮＡをＰＣＲ増幅するものである。図３（ｂ）では、図３（ａ）の人ゲノムDNA１３と菌ＤＮＡ１４が混在した抽出精製物１２に磁性粒子プライマー１７を加えて、ディネーチャ温度に加熱し、菌ＤＮＡ１４の２本鎖を一本鎖に分離し、十分な時間経過後、磁性粒子プライマー１７と菌ＤＮＡ１４（ａ）がハイブリダイズ行う温度に降下させ、十分な時間経過後、図３（ｃ）で示す様に、磁石１８による磁力で磁性粒子プライマー１７をトラップしながら溶液をチャンバより排出する。図３（ｄ）と図３（ｅ）に２つの場合があり、次に、図３（ｄ）を用いて第一の場合について説明する。図３（ｃ）にＰＣＲ溶液と磁性粒子プライマー１７とペアのプライマーＢ１６を加え、溶液回収してＰＣＲチャンバに供給し、ＰＣＲ増幅を行う。図３（ｅ）で示す場合は、図3（ｃ）にPCR溶液とプライマーセット（プライマーＡ１５，プライマーＢ１６）を加え、図3（ｃ）にて、ディネーチャ温度に加熱し、磁性粒子プライマー１７と菌DNA１４ａと鎖分離し、磁石１８で磁性粒子プライマー１７をトラップしながら、溶液を回収する。回収した溶液を図3（ｅ）で示すPCRチャンバに供給してPCR増幅を行う。

図２では、キアゲンの核酸精製自動化システムでの説明をおこなったが、核酸抽出試薬に血液検体を加えて、抽出された核酸に磁性粒子プライマー１７でハイブリダイズを行う図３（ｂ）から実施しても本発明の目的は達成できる。

抽出チャンバとＰＣＲチャンバの区分けは、機能でどの様に分けても本発明の目的は達成できる。図４は、人ゲノムＤＮＡと菌DNAの混在した混合物に、1回或いは複数回のプリPCR増幅を行い、磁性粒子プライマー１７にトラップした菌DNA１４ａのみを回収し、回収物を用いて本格的なPCR増幅を行う。図４（ａ）は、PCRチャンバの溶液内に人ゲノムＤＮＡ１３と菌DNA１４が混在した状態を表している。図4（ｂ）は、磁性粒子プライマー１７を加えて、ディネーチャ温度で１本鎖に分離し、その後アニーリング温度で菌ＤＮＡ１４ａと磁性粒子プライマー１７と結合させ、次にエクステンション温度で塩基を伸張させる。十分塩基が伸張する時間の後、図4（ｃ）で示すように磁石１９の磁力で磁性粒子プライマー１７をトラップしながら溶液を排出する。溶液を排出した後に残るものは、磁性粒子プライマー１７、磁性粒子プライマー１７に塩基伸張したもの、磁性粒子プライマー１７に菌DNA１４ａが結合したものである。次に図（ｄ）で示す様に複数回のPCRを行うためにPCR溶液とプライマーB１６を加えた後、公知のPCRを複数サイクル行う。図4（ｃ）から図4（ｄ）移行する時、図4（ｃ）でディネーチャ温度に加熱して、磁性粒子プライマー１７に結合した核酸も分離して、溶液排出することにより、図4（ｄ）に存在するDNAは、増幅生成された菌DNA２１ａのみとすることが可能となる。図4（ｅ）は、図4（ｃ）で溶液排出された状態に、PCR溶液を追加して、ディネーチャ温度に過熱し、磁性粒子プライマー１７に結合された２本鎖状態の菌DNA１４ａを１本鎖に分離し、磁石１９で磁性粒子プライマー１７をトラップしながらPCR溶液を回収する。回収された溶液は、磁性プライマー１７を排除したPCRチャンバに戻し、PCRを複数サイクル実施する。プライマーペア（プライマー１５、プライマー１６）は、ＰＣＲ増幅を行う前のどのタイミングで入れても本発明の目的は達成できる。図4（ｆ）は、図4（ａ）の人ゲノムＤＮＡ１３と菌DNA１４が混在した溶液にペアのプライマーである磁性粒子プライマー１７とプライマー１６を加えて、複数サイクルのPCRを行う。ある程度十分に菌DNAを増幅させ後に、上述した図４（ｃ）以降の動作と同様な動作を行う。

図５は、ＰＣＲ増幅のためのプライマーペアであるプライマー１６と磁性粒子プライマー１７とを用いて増幅した増幅生成物を用いて、増幅生成物の存在或いは分量を検出するための説明を行うための図である。図６は、磁性粒子プライマー１７で人ゲノムＤＮＡ１３と菌DNA１４を分離し、所望の菌DNA のPCR増幅を磁性プライマーではなく、通常のプライマーペアを用いて増幅した増幅生成物を用いて、増幅生成物の存在或いは分量を検出するための説明を行うための図である。

図５（ａ）から図５（ｂ）は、磁石１９の磁力で磁性粒子プライマー１７をトラップしながらPCR溶液を排出する。図５（ｂ）で示す様に、溶液排出後の残留物は、磁性粒子プライマー１７と菌DNAの増幅生成物２１ａ，２１ｂと、未反応の磁性粒子プライマー１７の混合物である。図５（ｃ）にハイブリ溶液を供給し、ディネーチャ温度に過熱し、増幅生成物２１ａ，２１ｂを１本鎖に分離し、磁石１９の磁力で磁性粒子プライマー１７をトラップしながら溶液を回収する。回収された溶液には菌DNA１４の増幅生成物２１ｂのみが存在する。この溶液を用いて、マイクロアレイ３１とハイブリさせて標識材を検出することにより菌の存在及び量を測定することができる。プライマーＢ１６とプライマーＢ１８の違いは、プライマーＢ１６に標識材を付加したものである。抽出および増幅に関して標識材の存在は差が生じないので、検出時に標識材が必要な場合、プライマーＢ１６の変わりにプライマーＢ１８に置き換えて説明を行っているが、本発明の目的効果を損なうものではない。図５（ｅ）では、所望のＤＮＡを分離するために、図５（ａ）で示している人ゲノムＤＮＡ１３ａ，１３ｂ、菌DNA１４ａ，１４ｂＡ、菌DNAの増幅生成物２１ａ，２１ｂ、及びプライマー１６，１７が混合されたPCR溶液を、ＤＮＡの２本鎖を１本鎖に分離するためのディネーチャ温度で加熱している。１本鎖に分離するのに十分な時間経過後、磁石１９の磁力で磁性粒子１７をトラップしながらＰＣＲ溶液を排出する。その結果、図５（ｆ）で示す様に、PCRチャンバには、磁性粒子プライマー１７伸張生成物及２１ａ及び未反応磁性粒子プライマー１７のみが残る。次にPCR精製カラム３２を用いて磁性粒子プライマー伸張物２１ａと未反応磁性粒子プライマー１７の分離の説明する。PCRからのDNAのクリーンアップの一例としてキアゲンのQIAquick PCR Purification Kitを用いた場合について説明する。QIAquick Kitでは、高塩濃度バッファーによりDNAを結合し、低塩濃度バッファーあるいは水によりDNAを溶出するシリカゲルメンブレンを利用している。この精製法でDNAサンプルからプライマー、ヌクレオチド、酵素、ミネラルオイル、塩、アガロース、臭化エチジウム、およびその他の夾雑物が除去できる。QIAquickシリカメンブレンテクノロジーにより樹脂漏れ、および懸濁液関連の問題や不便さは解消される。具体的な用途に応じて至適化された結合バッファーにより、種々の大きさのDNAフラグメントを選択的に吸着可能である。磁性粒子の粒子径は小径にすることによりその影響を排除することができる。例えばナノ磁性粒子になると影響度は著しく小さくなる。図5（ｇ）で高塩濃度バッファにより磁性粒子プライマー伸張物２１ａをフィルタ３３にトラップし、その他不要物は排出する。次に、図５（ｈ）で示す様に、低塩濃度バッファ或いは水で溶出し、ハイブリチャンバに供給し、マイクロアレイ３１のプローブとハイブリし、磁性粒子プライマー１７に付加した標識材或いは核酸の伸張時に取込んだ標識材により検出を行う。検出手段としては、上述した実施例の方法に当然適用可能である。図5（ｊ）で示す様に、図５（ｆ）の磁性粒子プライマー伸張物２１ａと未反応磁性粒子プライマー１７の混合物をハイブリチャンバに供給し、マイクロアレイ３１のプローブとハイブリさせることも可能である。プローブアレイ３１とハイブリさせた後、ハイブリ液を排出し、洗浄することにより、ハイブリされていない磁性粒子プライマー１７を除去することができる。

図６（ａ）は、ＰＣＲ後のＰＣＲ溶液で、溶液中には、菌DNA１４の増幅生成物２１ａ，２１ｂとプライマーA１５，プライマーB１６とのプライマーペアなどの混合物が含まれている。図６（ｂ）, 図６（ｃ）は, 図５（ｇ）, 図５（ｈ）で示したものと同一部材で同一作用効果を示しものである。図６（ａ）の溶液を、フィルタ３３に通過させることにより、増幅生成物２１ａ，２１ｂをフィルタにトラップし、溶出液によりフィルタ３３にトラップしている増幅生成物２１ａ，２１ｂ回収し、ハイブリ溶液とともにハイブリチャンバに供給する。図６(ｄ)には、増幅生成物２１ａ，２１ｂの2本鎖のペアで存在するので、ディネーチャ温度により２本鎖を１本鎖に分離し、十分なディネーチャ時間後、ハイブリ溶液をハイブリ温度とし、マイクロアレイ３１のプローブＤＮＡとハイブリダイズする。ハイブリ後、洗浄液により不要物を洗い流すことにより、増幅生成物２１ｂとプローブアレイのみが結合した状態となる。図６（ｄ）で示すプライマー１６を標識材が付いたプライマー１８に変更し、標識材を検出することにより菌ＤＮＡの存在或いは存在量を検出することが可能となる。プライマー１６を標識材付きプライマー１８に変更しても、抽出及びＰＣＲ増幅に何ら影響を与えるものではなく、上述した動作の説明と同様な作用効果で何ら問題は生じない。

本発明により簡便で高感度な核酸検出が可能となり、すなわち遺伝子診断等へ新しい道を拓く可能性をあきらかにした。

磁力印加が可能なハイブリダイゼーション装置の概略を示す図である。試料とプライマーとの関係の一例を示す図である。鎖分離方法の一例の概要を示す図である。鎖分離方法の一例の概要を示す図である。鎖分離方法の一例の概要を示す図である。鎖分離方法の一例の概要を示す図である。

符号の説明

１温度コントローラー
２核酸プローブチップ
３磁石
４核酸プローブ
５磁気微粒子結合PCR増幅産物（一本鎖）

Claims

複数種の核酸プローブを基板表面に固定した固定化核酸プローブを用いて標的一本鎖核酸を検出する標的核酸の検出方法において、
第１のプライマーと第２のプライマーからなり、該第１のプライマーに捕獲用の微粒子
が結合している増幅用のプライマーのセットを用意する工程と、
標的一本鎖核酸を含む試料に対して前記プライマーのセットを用いて増幅反応を行い、
増幅反応産物を得る工程と、
前記増幅反応産物としての二本鎖核酸を構成する鎖の一方である第１のプライマーを有
する一本鎖核酸と他の一本鎖核酸とを熱変性させ、該第１のプライマーの有する微粒子を捕獲することで分離する鎖分離を行う工程と、
前記微粒子の粒径が0.1〜30ｎｍであり、該微粒子が結合した第１のプライマーを有する標的一本鎖核酸を、複数種の核酸プローブを基板表面に固定した固定化核酸プローブと反応させ、前記微粒子を用いてハイブリッド体を検出する工程と、を有することを特徴とする標的核酸の検出方法。
前記微粒子が磁性微粒子であり、前記鎖分離を磁力によって行う請求項１に記載の検出方法。
ハイブリダイゼーションを行うに際し、外部から磁場を加えることにより、ハイブリダイゼーションを促進することを特徴とする請求項２に記載の検出方法。