JP3247001B2 - ピリリウム化合物を用いた２本鎖核酸の検出方法、ピリリウム化合物を含有するプローブ及びそれを用いた標的核酸の検出方法、新規ピリリウム化合物 - Google Patents

ピリリウム化合物を用いた２本鎖核酸の検出方法、ピリリウム化合物を含有するプローブ及びそれを用いた標的核酸の検出方法、新規ピリリウム化合物

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    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/173—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties staining/intercalating agent, e.g. ethidium bromide

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸の光学的手段を用
いた検出に有用な新規なピリリウム塩に関する。本発明
は更に核酸の光学的手段を用いた検出に用いるピリリウ
ム塩を含む染色剤及び該染色剤を用いた核酸の検出方法
に関する。更に核酸レベルでの変異の有無の検出のため
のプローブを用いたハイブリダイゼーション法における
ハイブリッド体の検出に有用なピリリウム塩を含む核酸
染色剤及び該染色剤を用いたハイブリダイゼーション法
による核酸の検出方法に関する。
【０００２】また、本発明は、生物試料、例えば、細
菌、酵母、かび、藻類、原生動物等の微生物、動植物の
細胞、組織、及び染色体の染色方法及び観察法に関す
る。更に、該生物試料中の核酸の特定配列の検出や同定
にピリリウム塩を標識剤として含むプローブを用いたｉ
ｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる核酸の検出
方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】物質がＤＮＡの二重らせんと相互作用し
得る形式としては、インターカレーターのように核酸塩
基対の間に入り込む場合と、二重らせんの溝に埋め込ま
れる場合、更に、二重らせんに寄り添う形で入り込む場
合が知られている。
【０００４】その中で、インターカレーターは、一般に
は電子の広がりを持つ平面状の化合物で、核酸塩基対の
積み重なりの延長線上、すなわち二重らせんの軸上に核
酸塩基対間の距離と同じような距離で、核酸塩基対と平
行な位置に配向する。そして、ＤＮＡ中にインターカレ
ートしたときに光学的な吸収スペクトルが長波長側にシ
フトしたり、吸収強度が減少したり、あるいは蛍光強度
が増大するという特徴がある。例えば、遊離状態等のＤ
ＮＡと相互作用を生じていない場合よりも、ＤＮＡと相
互作用を生じている場合（インターカレートしている場
合）の方が蛍光強度が増大する色素は、その性質を利用
して、アガロースゲル電気泳動を始めとする各種核酸の
検出操作に用いられている。
【０００５】よく知られたインターカレーターとして
は、アクリジンオレンジ、プロフラビン、エチジウムブ
ロマイド、ドーノマイシン、アクチノマイシン等が挙げ
られる。特に、エチジウムブロマイドとアクリジンオレ
ンジは有名である。
【０００６】しかし、これらの色素の大部分は励起波長
が紫外領域であるため、強力な紫外線ランプを使わざる
を得ないため、人体に有害とならないような特別な配慮
が必要である。例えば、ＤＮＡ検出時には、作業者は眼
や皮膚を紫外線から守るための装備が必要であり、その
ための装置も市販されている。また、ＤＮＡの泳動パタ
ーンの写真を撮るためには通常トランスイルミネーター
のような装置が使われているが、その場合のカメラの露
出調整は直接目で見て行なうことができないので試行錯
誤による煩雑な作業である。また、アガロースゲルから
ＤＮＡを切り出す場合に直接目で見る場合には、保護具
等を使用しても紫外線の照射から完全には逃れることが
できない。更に、紫外線で励起される色素を利用する溶
液系のＤＮＡ検出では、常に強力な紫外線を照射し続け
ることになり、有害なオゾン等の発生も生じる。また、
紫外線照射によってＤＮＡそのものがダメージを受ける
場合もある。さらに、生きている細胞中でのハイブリダ
イゼーションを行って、生細胞の検出を行うin situ hy
bridizationが注目されつつあるが、標識として紫外線
で励起する色素を用いた場合には検出に用いる紫外線に
よって細胞自体がダメージを受ける場合もある。
【０００７】一方、医学、生物学等の分野では、微生
物、ヒト細胞あるいは動物細胞などの生物標本を顕微
鏡、もしくは、その他の手段で観察し、研究、診断等を
行うために染色することは広く一般に行われている。こ
のような用途に利用される染色法は、一般に２種類に大
別される。第一は、生物標本中に存在する観察すべき部
分の染色に利用できる特定成分を色素で着色する方法で
ある。染色原理としては、色素そのもので対象を染色す
る場合と様々な化学反応を通して特定成分の存在部位に
着色成分を沈着させる場合がある。これらは、病理検査
などで頻用される方法で、様々な対象成分に対して様々
な染色法が考案されている。これらの染色法は、主とし
て特定成分もしくは特定形態、あるいは特定領域の可視
化を目的とし、組織等の比較的マクロな対象の観察に用
いられることが多い。
【０００８】これに対して、第二の染色法は、蛍光染色
法と呼ばれる方法である。蛍光染色法の基本操作におい
ては、まず、染色すべき特定成分の存在部位に蛍光性色
素が導入される。導入法としては、色素自体の対象特異
的親和性を利用する場合（エチジウムブロマイドによる
核酸染色など）や、色素に抗体等の対象特異性をもった
物質を結合させ、その特異的親和性を利用して染色対象
に導入する場合などが挙げられる。これらの蛍光染色法
は、生物学などの研究的分野で頻用されている。観察対
象が蛍光である蛍光染色法は、信号の検出感度が高く、
先に述べた着色による染色法に対して、より精密で、ミ
クロな対象を取り扱うことが可能となり、通常、特定成
分の検出を主目的にする場合が多い。
【０００９】通常の染色法、蛍光染色法いずれの方法で
も、細胞等の染色の対象となる標本は、染色以前にアル
デヒド類などを用いた固定を行うのが一般的である。こ
れは、染色に用いる色素、その他試薬の標本中への透過
性を向上させると共に、染色にともなう様々な操作中に
標本が破壊されることを防ぐ効果を持つ。また、固定操
作と同様に直接の染色操作の他に余剰の色素、試薬等を
除く洗浄操作等も必要である。これは、染色の際のバッ
クグランドを下げ、安定した結果を得るために欠かせな
い。
【００１０】一方、近年、発癌機構、癌の転移機構が明
かにされるにつれ、染色体の転座及び染色体欠失がこれ
らの機構と深くかかわっていることが知られるようにな
った。つまり、細胞癌遺伝子として挙げられているもの
は正常細胞では増殖シグナルの受容、伝達あるいは転写
の調節などに携わっているものであり、この遺伝子の突
然変異や異常な増幅、または盛んに転写されている遺伝
子近傍へのこの遺伝子の転座、他の遺伝子との結合など
によってこれらが癌遺伝子として活性化されることが明
らかにされてきている。また、癌抑制遺伝子が染色体か
ら欠失することも癌化の機構と絡んでいるものと考えら
れている。更に、各種遺伝子病においても、遺伝子欠
損、転座が明かにされている。このように染色体レベル
での遺伝子の異常の検出による診断が可能であれば、正
常染色体を異常に移入して造腫瘍性を抑制したり、遺伝
子欠損を補うことによる癌や遺伝子病の治療の可能性も
拡大される。
【００１１】染色体異常を知るための方法としては、Ｆ
ＩＳＨ（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＩｎ Ｓｉｔｕ Ｈ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）がある。この方法は、調べ
たい遺伝子に対応するプローブを作製し、それと染色体
上の遺伝子とのハイブリッド形成能をみるもので、現状
において最も正確な方法とされている。この方法では、
用いるプローブによって検出対象の遺伝子は限定される
ので、検出対象が明かな場合はこの方法を直接利用でき
るが、染色体全体についてスクリーニングする場合には
必ずしも適当な方法とはいえない。そこで、染色体全体
について検索し、その中から形状異常から転座が疑われ
るものや、長さが異常で欠損が疑われるものなどの異常
が起きていいる部位のスクリーニングを行ってから、異
常部にターゲットを絞ってＦＩＳＨを行うことで、より
広範で、精度の高い遺伝子診断が可能となると考えられ
る。
【００１２】このようなスクリーニングを行うには染色
体を識別、同定しておく必要がある。染色体の識別、同
定法としては、染色体の分染による方法が利用されてい
る。この分染による染色体の識別は、様々な前処理の後
に特殊な染料や蛍光色素を用いて染色体上に縞（バン
ド）を染め出し、その分布と濃淡の関係が、染色体ごと
に一定しており、また個々の染色体において特徴的であ
ることを利用するものであり、染色体の識別や異常の検
出に利用されている。
【００１３】一般的な染色体の分染法としては、例え
ば、ギムザ染色（Ｇバンド）、キナクリン染色（Ｑバン
ド）及びＲバンド染色などが知られている。ギムザ染色
では、トリプシン処理により生じた染色体の高次構造上
のひずみが染色体の粗密の状態として分染、観察され
る。また、蛍光色素であるキナクリンによる染色は、染
色体がその縦軸に沿って濃淡の縞模様に染め分けられる
もので、これを蛍光顕微鏡によって観察することができ
る。その蛍光パターンは個々の染色体に固有であるの
で、これにより染色体の識別と同定を行うことが可能と
なる。キナクリンによって分染される部分は、Ａ−Ｔ対
の豊富なところとされており、先に挙げたギザム染色と
は染色状態が異る。Ｒバンド染色は、蛍光色素であるｃ
ｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎ Ａ3をＧ−Ｃ対に結合させた
後、Ａ−Ｔ対に特異的な非蛍光色素であるｄｉｓｔａｍ
ｙｃｉｎ Ａでの処理を行うもので、Ｇ−Ｃ対の豊富な
ところのみがＲバンドとして染め出され、Ｑバンド染色
やＧバンド染色とは逆の濃淡で染色されるのが特徴であ
る。これらの分染方法の中では、着色法によるＧバンド
染色法に比べて、Ｑバンド、Ｒバンド染色法は信号の検
出感度が高く、より精密なミクロな対象を取り扱う上で
有効である。
【００１４】この染色体の分染において、染色体の部位
に特異的な染色剤の種類を増やすことによって、より高
精度での染色体の識別、同定が可能となるので、既にあ
る分染用の試薬（染色剤）に加えて、これらとは異る部
位を特異的に分染する染色剤を開発することは、染色体
の識別、同定をより精度良く行う上で重要となってきて
いる。
【００１５】一方、ピリリウム環またはチオピリリウム
環の２、４及び６位が置換もしくは未置換のフェニル基
で置換されたピリリウムまたはチオピリリウム化合物の
塩はこれまで数多く報告されている。その多くは、記録
材料用としてのものであり、例えば米国特許第4,341,89
4号明細書ではそれらは増感剤として電気光導電性組成
物に有用であることが記載されている。生物学的領域で
は、特開昭５９−１３３４６０号公報に生物学的試料中
の細胞を染色する染色剤として、２，４，６−トリフェ
ニルピリリウムまたはチオピリリウム化合物、これら化
合物のピリリウム環またはチオピリリウム環に置換され
たフェニル基の一つを置換スチリル基で置換した化合物
等を用いることが記載されている。また、特開平１−１
５３６８３号公報では、これらのフェニル置換基の少な
くとも２個がアミノ基を有する時、ガンの治療において
良好な効能を有することが記載されている。
【００１６】核酸の検出に、励起波長が紫外領域である
色素を用いると、上述したような問題が起るため、それ
を回避する手段として、可視光で励起可能な色素を用い
ることが考えられているが、現在核酸の染色に利用され
ている可視光励起型の色素はストークスシフトが２０〜
３０ｎｍと小幅な場合が多く、検出の際のＳ／Ｎ比が悪
いという欠点を有する。
【００１７】また、アガロースゲル電気泳動等におい
て、核酸と相互作用したときの蛍光強度の増加の程度
が、二本鎖核酸と相互作用していない時に比べてより大
きい程、検出時のＳ／Ｎ比が良くなり検出感度を高める
ことが可能となるが、可視光励起型のものでは十分な蛍
光強度の増加を示すものは知られていないのが現状であ
る。
【００１８】以上のように、紫外線励起型の色素の有す
る問題を解消する上で、ストークスシフトが大きく、核
酸との相互作用時の蛍光強度が相互作用していない状態
でのものに比べて充分に大きな可視光励起型色素に対す
る要望が高まっている。
【００１９】また、従来の細胞などの生物試料の染色法
では、ホルムアルデヒド等を用いた試料の固定や、余分
な色素の洗浄除去などの操作が再現性のある安定した結
果を得るためには不可決である。
【００２０】例えば、試料の固定操作は、色素等の試薬
の透過性を良好なものとするために、あるいは標本とし
た際の形態保持のために重要である。また、通常、染色
用の色素や他の試薬等は、標本に対して大過剰に使用さ
れる。これは、操作（染色）時間の短縮等の効果を持つ
が、同時に高いバックグランドの原因にもなる。このた
め、各操作間の洗浄操作は、観察や測定時のバックグラ
ンドを低くしてより正確な判定を得る上で重要なもので
あり、入念に行われる。しかしながら、これらの操作は
時間を要する繁雑な操作であり、大量の試料を処理する
場合には、より迅速な処理操作を行う上での障害となっ
ていた。従って、煩雑で長時間を要する試料の固定や洗
浄などの操作の省略や簡便化が強く望まれている。
【００２１】さらに、従来使用されてきた蛍光色素は、
フェード現象の強いものがほとんどで、励起光照射後、
速やかに蛍光が消失してしまう。このため、通常の染色
とは異なり、蛍光像の長時間観察は困難で、蛍光染色に
よる永久標本作製もほとんど不可能であった。このた
め、長期間保存が可能な蛍光染色標本作製法の開発は、
大きな課題であった。
【００２２】また、染色体の分染の分野においては、上
述のように、従来の染色剤とは異る染色パターンを得る
ことができる染色剤に対する要望が高まっている。更
に、上記の生物試料の染色の場合と同様に、染色体の分
染においても、試料のアルデヒドなどによる固定や、余
分な染色剤の洗浄などの操作は時間と労力を要するもの
であり、マススクリーニング等のための試料の大量の処
理を、より迅速に行う上で障害となっていた。
【００２３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、２本
鎖核酸を効率的に検出することのできる方法を提供する
ことにある。また、本発明の目的は、所定の塩基配列を
有する１本鎖標的核酸を、簡単な工程によって検出する
ことのできる標的核酸の検出方法及びそれに用いるプロ
ーブ核酸を提供することにある。
【００２４】本発明の他の目的は、２本鎖核酸の検出に
特に有効に用い得る新規ピリリウム化合物を提供するこ
とにある。本発明の他の目的は、効率的な検出の可能な
２本鎖核酸を提供することにある。本発明の他の目的
は、２本鎖核酸の存在を容易に検出可能な生物試料を提
供することにある。
【００２５】
【課題を解決するための手段】本発明の一態様としての
２本鎖核酸の検出方法は、２本鎖核酸を検出する方法で
あって、後述の一般式［Ｉ］で示されるピリリウム化合
物を２本鎖核酸を含む生物試料と混合し、該ピリリウム
化合物をインターカレーターとして該２本鎖核酸に取り
込ませる工程； 該ピリリウム化合物がインターカレーターとして取り込
まれた該２本鎖核酸に、該２本鎖核酸に取り込まれた状
態の該ピリリウム化合物が十分な吸収を示し、かつ十分
励起可能な波長の光を含む光を照射して該２本鎖核酸に
取り込まれた該ピリリウム化合物を励起させる工程；及
び該２本鎖核酸中にインターカレートし、かつ前記光の
照射で励起された状態にあるピリリウム化合物から発せ
られる蛍光を検出する工程； を有することを特徴とする。本発明の一態様としてのプ
ローブは、試料中の、所定の塩基配列を有する１本鎖標
的核酸の検出に用いるプローブであって、該塩基配列に
対して相補的な塩基配列を有する核酸と、該核酸に結合
する後述の一般式［Ｉ］で示されるピリリウム化合物と
を有することを特徴とする。
【００２６】本発明の一態様としての１本鎖標的核酸の
検出方法は、生物試料中の、所定の塩基配列を有する１
本鎖標的核酸を検出する方法であって、該塩基配列に対
して相補的な塩基配列を有する１本鎖核酸と、後述の一
般式［Ｉ］で示される、該１本鎖核酸に結合しているピ
リリウム化合物とを有するプローブを用意する工程； 該プローブと該１本鎖標的核酸を含む試料とを混合し、
該プローブと該１本鎖標的核酸を結合させて、該ピリリ
ウム化合物がインターカレーターとして取り込まれた２
本鎖ハイブリッドを形成する工程；及び該ピリリウム化
合物がインターカレーターとして取り込まれた該２本鎖
ハイブリッドに、該２本鎖ハイブリッドに取り込まれた
状態の該ピリリウム化合物が十分な吸収を示し、かつ十
分励起可能な波長の光を含む光を照射して該２本鎖ハイ
ブリッドに取り込まれた該ピリリウム化合物を励起させ
る工程；及び該２本鎖ハイブリッド中にインターカレー
トし、かつ前記光の照射で励起された状態にあるピリリ
ウム化合物から発せられる蛍光を検出する工程； を有することを特徴とする。本発明の一態様としての新
規ピリリウム化合物は以下の構造を有する。
【化９２】 （上記一般式［ＶＩＩ］中、ＸはＯまたはＳを表し、Ｙ
-はアニオンを表す。）本発明の一態様としての新規ピ
リリウム化合物は以下の構造を有する。
【化９３】 （上記一般式［ＩＸ］中、ＸはＯまたはＳを表し、Ｙ-
はアニオンを表す。）
【００２７】本発明の一態様としての２本鎖核酸は、上
記式［VII］または式［IX］で示されるピリリウム化合
物がインターカレーターとして取り込まれていることを
特徴とする。
【００２８】本発明の一態様としての生物試料は、２本
鎖核酸を含む生物試料であって、該２本鎖核酸が上記の
式［VII］または式［IX］で示されるピリリウム化合物
をインターカレーターとして取り込んでいることを特徴
とする。
【００２９】本発明において好適に用いられるピリリウ
ム化合物は下記一般式［Ｉ］で示される構造を有するも
のである。
【００３０】
【化１１】 上記一般式［Ｉ］において、
【００３１】
【化１２】 は、複素環を示し、ＸはＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであ
る。該複素環としては、ピリリウム環もしくはピリリウ
ム類似環のような５員環及び６員環のものを挙げること
ができる。
【００３２】Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して水素原
子、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリ
ル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シ
アノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もし
くは未置換アリール基、置換もしくは未置換低級アルア
ルキル基または置換もしくは未置換シクロアルキル基を
示す。
【００３３】Ｒ3は、−Ａまたは−Ｌ−Ａである。Ｌ
は、−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ 4−Ｌ5−Ｌ6−で
あり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝ＣＨ）
−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される２価
の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または−Ｃ
Ｈ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基を有する環構造を示す）を表
わす。置換もしくは未置換アリール基から誘導される２
価の基としては、例えばフェニレン基等を挙げることが
でき、オルト、メタ、パラのいずれの位置で結合するも
のでもよい。低級アルキレン基としては、炭素数が１〜
４の直鎖状もしくは分岐状のアルキレン基を挙げること
ができ、その置換基としては、例えば−Ｌ−Ａで示され
る基を挙げることができる。オキソ基を有する環構造と
しては、複素環、芳香環、脂肪族環等で少なくともオキ
ソ基を有するものを挙げることができる。
【００３４】−Ｌ−としては、下記一般式［ＩＩ］、
［ＩＩＩ］、［ＩＶ］、［Ｖ］または［ＶＩ］で表わさ
れる基を好ましいものとして挙げることができる。
【００３５】
【化１３】 （上記一般式［ＩＩ］中、Ｚは水素原子または置換もし
くは未置換低級アルキル基を表し、ｎは０、１または２
である。）なお、Ｚがアルキル基である場合のその置換
基としては、例えば上述の−Ｌ−Ａで定義される基を挙
げることができる。
【００３６】
【化１４】 （上記一般式［ＩＩＩ］中、ｎは０、１または２であ
り、Φは置換もしくは未置換ｏ−、ｍ−またはｐ−フェ
ニレン基を表わす。）
【００３７】
【化１５】 （上記一般式［ＩＶ］中、Φは置換もしくは未置換ｏ
−、ｍ−またはｐ−フェニレン基を表わす。）
【００３８】
【化１６】
【００３９】
【化１７】 上記一般式中のフェニレン基の置換基としては先に例示
したものを挙げることができる。
【００４０】一般式［Ｉ］のＲ3におけるＡは、置換も
しくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ5（Ｒ5は、置換も
しくは未置換複素環、置換もしくは未置換のシクロアル
キル基または置換もしくは未置換芳香環を示す）を表わ
す。Ｒ5の複素環としては、
【００４１】
【化１８】 （Ｍ及びＮは、それぞれ独立して酸素原子、イオウ原子
または窒素原子を、Ｙ-はアニオンを表わす）等から誘
導された基を挙げることができ、その置換基としては、
例えば、置換もしくは未置換アリール基などを挙げるこ
とができる。また、置換もしくは未置換シクロアルキル
基とは、飽和のものでも、不飽和のものでもよく、例え
ば
【００４２】
【化１９】 等の共鳴系を構成し得るものから誘導された基を挙げる
ことができる。また、置換もしくは未置換芳香環として
はアズレン環を挙げることができる。これらの基の置換
基としては低級アルキル基、置換もしくは未置換アリー
ル基等を挙げることができる。
【００４３】Ｘを含むピリリウム環もしくはその類似環
のＲ1、Ｒ2、Ｒ3が結合していない炭素原子に結合して
いる水素原子は、ハロゲン原子、スルホネート基、アミ
ノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロシル基、カルボキ
シル基、シアノ基、置換もしくは未置換低級アルキル
基、置換もしくは未置換アリール基または置換もしくは
未置換低級アルアルキル基で置換されていても良い。
【００４４】Ｙ-はアニオンを示し、該アニオンとして
は、例えばＢＦ4 -、過塩素酸イオン、ＨＯ3ＳＣＨ2ＣＯ
Ｏ-、あるいは塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオ
ン、フッ素イオン等のハロゲンイオン、又は、脂肪族炭
化水素や芳香族スルホネート等のようなアニオン機能を
有する化合物、更には、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｃ
ｏ、Ｐｄ等の遷移金属の錯体イオンなどを挙げることが
できる。
【００４５】以上挙げた各種の置換基に更に置換される
基がハロゲン原子の場合には、該ハロゲン原子として
は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等を挙げることができる。また、低
級アルキル基は、直鎖状でも分岐状のものでもよく、そ
の炭素数としては１〜４程度のものが好ましい。アリー
ル基としては、例えば、フェニル基等を挙げることがで
きる。アリール基やフェニレン基の置換基としては、例
えば低級アルキル基で置換されたアミノ基（低級アルキ
ルアミノ基）等を挙げることができる。なお、この低級
アルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ基、ジエチ
ルアミノ基等がパラ位で置換しているものが好ましい。
低級アルアルキル基としては、上記の置換もしくは未置
換アリール基で置換された低級アルキル基を挙げること
ができる。
【００４６】一般式［Ｉ］の化合物の中では、Ｘを含む
複素環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上で置
換されたものが好ましい。例えばＸを含む複素環が６員
環の場合のそのような化合物としては、（１）Ｘを含む
６員環の２位と４位が置換もしくは未置換アリール基で
置換され、３位、５位及び６位のいずれかがＲ3で置換
されているもの、（２）該６員環の３位と５位が置換も
しくは未置換アリール基で置換され、２位、４位及６位
のいずれかがＲ3で置換されているもの、（３）該６員
環の２位と６位が置換もしくは未置換アリール基で置換
され、３位、４位及び５位のいずれかがＲ3で置換され
ているもの、などを挙げることができる。このような位
置に置換もしくは未置換アリール基を導入することは、
核酸塩基対へのインターカレーターとして良好な性質を
得る上で好ましい。更に、Ｘを含む複素環が、置換もし
くは未置換アリール基の２以上に、これらの置換位置が
隣合わないように置換されたものがより好ましい。
【００４７】一般式［Ｉ］の化合物の具体例としては、
例えば後述の表１に示すものを挙げることができる。更
に、特に好ましい化合物としては、下記一般式［ＶＩ
Ｉ］
【００４８】
【化２０】 （上記一般式［ＶＩＩ］中、ＸはＯまたはＳを表わし、
Ｙ-はアニオンを表わす）で表わされる化合物や、下記
一般式［ＶＩＩＩ］
【００４９】
【化２１】 （上記一般式［ＶＩＩＩ］中、ＸはＯまたはＳを表わ
し、Ｙ-はアニオンを表わす）で表わされる化合物を挙
げることができる。
【００５０】なお、上記一般式［ＶＩＩ］で表わされる
化合物、すなわち２−メチル−４，６−ビス−（４−
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム塩および
２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルア
ミノフェニル）チオピリリウム塩は新規化合物である。
【００５１】すなわち、これらのピリリウム塩は、２位
にメチル基を配したものであり、従来より記録材料の増
感剤等として知られているピリリウム環またはチオピリ
リウム環の２、４及び６位に置換もしくは未置換フェニ
ル基を有するものとは構造的に異なる。また、特開昭５
９−１３３４６０や特開平１−１５３６８３号公報に記
載のピリリウム環またはチオピリリウム環の２、４及び
６位が置換もしくは未置換フェニル基で置換されたもの
や、ピリリウム環またはチオピリリウム環の２、４及び
６位のうちの２つに置換もしくは未置換フェニル基が、
残りの１つに置換スチレン基が置換されたものとも構造
的に異なる。
【００５２】しかも、これらの公報には、本発明のピリ
リウム塩およびチオピリリウム塩の置換基の種類及び置
換位置が特定された構造、すなわちピリリウム環または
チオピリリウム環の４及び６位に、パラ位にジメチルア
ミノ基を有するフェニル基が置換され、かつ２位にメチ
ル基が導入された構造によって、二本鎖核酸に対する特
異的なインターカレーターとして作用して蛍光強度が増
大するという効果が得られることについての記載はな
い。しかも、本発明のピリリウム塩またはチオピリリウ
ム塩［ＶＩＩ］の二本鎖核酸に対するインターカレーシ
ョンにおける蛍光増大の程度は、これらの公報に開示の
４−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−２，６
−ジフェニルピリリウム塩または４−（４−Ｎ，Ｎ−ジ
メチルアミノフェニル）−２，６−ジフェニルチオピリ
リウム塩すなわち［ＶＩＩＩ］における蛍光増大の約５
倍〜約１０倍も大きく、しかもストークスシフトも約１
００ｎｍと大きいので、本発明のピリリウム塩またはチ
オピリリウム塩［ＶＩＩ］は二本鎖核酸検出用の色素と
して特に有用である。
【００５３】一般式［Ｉ］で表わされる化合物をそのま
ま用いて、あるいは適当な溶媒や分散剤に溶解または分
散させることで、本発明の核酸染色剤を得ることができ
る。この溶媒や分散剤としては、水、アセトニトリル、
ジメチルスルホキシド、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液等の
各種緩衝液などを用いることができる。その際の一般式
［Ｉ］で表わされる化合物の含有量はその用途及び測定
装置の感度などに応じて適宜選択すれば良く、例えば、
核酸水溶液中での二本鎖核酸の検出には、１×１０-6〜
１×１０-4Ｍ程度とすることができる。
【００５４】一般式［Ｉ］で表わされる化合物は、一本
鎖や二本鎖の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の染色に利用で
き、なかでもインターカレーターとしての機能を有する
ので二本鎖核酸を優先的に染色するという利点がある。
すなわち、この化合物が二重らせんにインターカレート
すると、その蛍光強度が遊離の状態に比べて大きくな
り、またストークスシフトの大きいものを選択すれば、
Ｓ／Ｎ比の良い分析が可能となる。更にこの化合物は、
二本鎖核酸に結合した時に安定で、蛍光色素に良く見ら
れるフェード現象はほとんど観察されないという特徴を
有する。
【００５５】また、この化合物の多くは励起波長を５５
０ｎｍ以上と長波長側に有するので、タングステンラン
プ等の可視光光源を用いて十分な励起状態を得ることが
できる。従って、紫外線を用いる場合の先に述べた問題
を回避できる。
【００５６】更に、生体由来の試料には、５５０ｎｍ以
下の波長領域に吸収、蛍光を持つ成分が含まれている場
合が多く、この波長領域の光を励起光として用いると、
この成分による測定バックグランドの上昇によるＳ／Ｎ
比の低下という問題がある。これに対して、一般式
［Ｉ］の化合物の多くの励起波長は５５０ｎｍ以上の長
波長側にあるので上述のバックグランドの上昇がなく、
結果的に高感度な測定が可能となる。このことは、試料
としての核酸の精製が不充分でも感度良い測定ができる
ことを示すものであり、特に、血液検査のような多検体
を処理する際に精製工程を省略できることは効率良い操
作を行う上で有効である。
【００５７】また、一般式［Ｉ］の化合物として近赤外
領域に吸収を持つものを利用すれば、励起用の光源とし
て小型で安価な半導体レーザーを利用できるという利点
がある。
【００５８】先に述べたように、一般式［Ｉ］の化合物
は、二重らせんにインターカレートすることで、遊離の
状態（二重らせんとの相互作用がない状態）に比べて蛍
光強度が著しく大きくなるものであるので、アガロース
ゲル電気泳動のようなＤＮＡの制限酵素による切断パタ
ーンを検出する際、バックグランドが低く抑えられ、相
対的にＤＮＡの検出感度を上昇させることが可能とな
る。また、ストークスシフトが１００ｎｍ程度であるの
で蛍光検出の際、励起光の影響を完全に差し引き、直接
目で見ることが可能となる。更に、本発明に係る一般式
［Ｉ］の化合物は、二本鎖核酸に結合した時に安定で、
蛍光色素に良く見られるフェード現象はほとんど観察さ
れない。この特徴はゲルを乾燥させた場合でも維持され
ることから、ゲルの長期保存も可能となる。
【００５９】更に、代表的な蛍光性インターカレーター
であるエチジウムブロマイドでは、ＤＮＡ非存在下にお
いても蛍光が観測されるが、一般式［Ｉ］の化合物では
ほとんど検出されない。又、ＤＮＡの濃度に依存した蛍
光強度の増大もエチジウムブロマイドに比べて、高濃度
のＤＮＡまで観測することができる。
【００６０】即ち、一般式［Ｉ］の化合物は、エチジウ
ムブロマイドよりも検出感度が高く、Ｓ／Ｎ比も良く、
幅広い濃度範囲のＤＮＡを検出することが可能となる。
【００６１】更に、溶液系のハイブリダイゼーション反
応による核酸の検出においても、ハイブリッド体の染色
（標識）に一般式［Ｉ］の化合物を用いれば、該化合物
の蛍光強度が、遊離の場合や一本鎖に結合している場合
よりも、二本鎖（二重らせん）にインターカレートした
状態の方が十分に高くなるので、プローブと標的核酸と
のハイブリッド体と、未反応のプローブとを分離するこ
となく、すなわちＢ／Ｆ分離なしに直接プローブと標的
核酸とのハイブリッド体を検出することができる。
【００６２】また、一般式［Ｉ］の化合物はインターカ
レーターとしての機能を有するので、標的核酸とプロー
ブとのハイブリッド体を安定化させるという点でも有利
であり、プローブに短いオリゴヌクレオチドを用いた場
合でも安定したハイブリッド体を形成でき、測定の安定
化が図れる。
【００６３】更に、上述したように、一般式［Ｉ］の化
合物としてストークスシフトが大きいものを選択すれ
ば、蛍光と励起光とを完全に分離でき、蛍光スペクトル
から励起光の影響を差し引く操作が不要となって、検出
の自動化にとって効果的であるばかりではなく、検出感
度も上昇するという利点がある。
【００６４】一般式［Ｉ］の化合物のこれらの特長は、
複素環とそれに結合させた特有な置換基に基づくもので
あり、複素環と置換基の部分がスタッキングしている核
酸塩基対部分にインターカレートして入り込み、両者と
相互作用して蛍光強度を増大させると考えられる。この
蛍光強度の増加効果は、置換基が、置換もしくは未置換
アリール基を有する時により大きく、置換もしくは未置
換アリール基の２以上が互いに隣合わないように置換さ
れている場合が更に大きい。また、上記一般式［Ｉ］の
化合物の構造を部分的にいろいろ変化させることによ
り、種々の吸収波長、励起波長、蛍光波長をもつ誘導体
が合成でき、例えば半導体レーザーを励起波長として利
用できるものを得ることができる。更に、置換基として
複素環や縮合環を導入した場合には、導入されたこれら
の環構造の性質を利用してインターカレーターと他の機
能を組合せた化学反応や生化学反応にも利用できる。
【００６５】さらに、一般式［Ｉ］の化合物の水溶性を
高めるために、例えば、アミノ基、ジメチルアミノ基、
スルホネート基等の親水性基を適当な部分に導入しても
よい。なお、核酸プローブの標識として用いる場合に
は、核酸と結合させた場合に十分な親水性が得られるな
らば親水性基の導入なしにそのまま利用してもよい。
【００６６】本発明の核酸染色剤は、核酸染色用とし
て、例えば、電気泳動で展開した核酸の検出に用いるこ
とができる。この検出は、基本的には、エチジウムブロ
マイド等のかわりとして本発明の核酸染色剤を用い、従
来法に従って行うことができる。つまり、通常の電気泳
動の後、ゲルを色素溶液に浸し、検出する。ただし、そ
の検出に紫外線ランプではなく可視光を用いることに伴
い、従来とは異なる検出系の構成が必要となる。つま
り、検出系として、光源の他に、励起フィルター、蛍光
フィルターが必要となる。
【００６７】光源としては、ハロゲンランプ、タングス
テンランプ、キセノンランプ及び半導体レーザー等が利
用できる。スライドプロジェクター（１００Ｖ、３００
Ｗ）程度の光量の可視光光源であれば十分エチジウムブ
ロマイド以上の感度で検出できる。カメラの撮影に用い
るストロボも写真を撮る上では有効である。更に、半導
体レーザーを用いれば励起光側のフィルターなしにフォ
トマルとの組合せによりデンシドメーターを構成するこ
とができる。
【００６８】また、励起光フィルター、検出用フィルタ
ーとして、それぞれの色素に応じたフィルターが必要と
なる。つまり、それぞれの色素の光学的吸収をカバー
し、しかも、蛍光領域はカットするようなフィルターを
励起光側に使い、検出側には、励起光の透過を防ぎ、蛍
光のみを取り出せるようなフィルターを用いる。
【００６９】たとえば、トランスイルミネーターにおけ
る紫外線ランプの代わりに可視光光源を取り付け、その
上に励起光フィルターのついた台を載せる。ゲルはその
台の上に置かれ、蛍光フィルターのついたスリットを通
して検出されるか、蛍光フィルターのついたカメラによ
り写真撮影が行われる。
【００７０】その結果、肉眼でもゲル中の泳動されたバ
ンドを保護具なしに見ることができ、ゲルからのバンド
の切り出しも容易となる。また、写真を撮る場合にもエ
チジウムブロマイドの場合のように紫外光を避けながら
トランスイルミネーターで試行錯誤により露出を選ぶの
ではなく、目で見て判断し、適当な露出を選ぶことがで
きる。もちろん、フォトマルを搭載したようなデンシド
メーターも利用できる。更に、ストロボを光源として用
い、カメラと連動して作動するような検出キットを用い
れば、乾電池等の電源で簡便に、しかも熱の発生による
影響を受けることなく核酸を検出できる。
【００７１】更に、本発明の核酸染色剤は、プローブを
用いたハイブリダイゼーション法による検出対象として
の標的核酸の検出に用いることができる。例えば、標的
核酸を試料と反応させた後、形成された二本鎖核酸を本
発明の染色剤で染色することでこれを光学的に検出する
ことができる。この際、該染色剤に含まれている一般式
［Ｉ］の化合物は、二本鎖の２重らせんとの相互作用に
より蛍光強度の増大を生じるものであるので、Ｂ／Ｆ分
離することなく検出が可能である。しかも、この相互作
用はミスマッチを起している二本鎖核酸では起きにくい
ので、ミスマッチしている二本鎖核酸による測定値への
影響を排除できる。この本発明の染色剤を用いた染色
は、プローブあるいは試料を固定して用いる方法、溶液
中でプローブと試料を反応させる方法、生検、あるいは
細胞や生体にプローブを取込ませるin situ hybridizat
ion法に利用でき、例えば、試料とプローブとを反応さ
せた後に、本発明の染色剤をこれに加えて目的とするハ
イブリッド体を染色して検出する。また、顕微鏡等を用
いれば、細胞内でのプローブがハイブリッドしている位
置を調べることもできる。
【００７２】更に、ＰＣＲ等で増幅した核酸の検出にも
勿論用いることができ、ひとつひとつ定量しなくても増
幅されたか否かを瞬時に判定できる。この時、ＰＣＲの
反応をマイクロプレート上で行なわせれば、一度に多検
体を調べることができる。
【００７３】また、一般式［Ｉ］の化合物をプローブに
標識として結合させて用いることで、該化合物の特長を
さらに有効に利用することができる。例えば、溶液中で
行うハイブリダイゼーション反応において、分析対象と
しての標的核酸に一本鎖のものばかりでなく二本鎖のも
のも利用できるようになり、しかも、該化合物は核酸塩
基対に対するインターカレーターとしての機能を有する
ので、標識化合物による標的核酸とプローブとのハイブ
リッド体における立体障害を避けることができるばかり
ではなく、該ハイブリッド体をスタッキングにより安定
化できるという効果も得られる。一般式［Ｉ］の化合物
をプローブに結合する方法としては公知の各種方法が利
用できる。
【００７４】又、後述するように本発明に係る一般式
［Ｉ］の化合物は、細胞、細菌、組織、及び染色体等の
生物試料に対して高い透過性を示すので、該化合物を標
識させたプローブを細胞や生体に取り込ませるのが容易
であり、ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
法に適している。更に、後述するように低濃度でも十
分使用でき、また低滞留性であることから、生体をプロ
ーブと反応させ観測した後も培養を継続することも可能
である。
【００７５】このように、本発明に係る一般式［Ｉ］で
表わされる化合物は様々な検出法に適用でき、しかも非
常に簡便に核酸を検出できるので、そのままで、または
ＤＮＡプローブとして一般式［Ｉ］で表わされる化合物
を含む様々な核酸検出用キットを提供することもでき
る。
【００７６】更に、本発明に係る一般式［Ｉ］の化合物
を含む染色剤と生物試料を接触させて染色、または分染
することができる。
【００７７】本発明の方法によって染色される生物試料
としては、微生物、ヒト細胞、動物細胞、生物（ヒト、
動物または植物）の組織もしくはその切片、及び染色体
などを挙げることができる。染色体を試料とする場合
は、染色体を鮮明に分染することができる。
【００７８】本発明においては、上記一般式［Ｉ］の化
合物の１種以上を、適当な溶媒、例えば水、生理食塩
水、水とエタノール等のアルコールとの混合溶剤などに
溶解して、生物試料の蛍光染色に用いる。また、生物試
料が生きた状態の細胞や微生物等の場合には、これらの
生存を維持できる各種の溶液やこれらの増殖のための培
養液に一般式［Ｉ］の化合物を加えて、染色液としても
良い。染色液中の一般式［Ｉ］の化合物の濃度としては
数十ｎｇ〜数μｇ／ｍｌ程度が適当である。
【００７９】本発明においては、染色や分染のための色
素として、一般式［Ｉ］の化合物を用いたことで、再現
性良く、バラツキのない安定した染色を行うことがで
き、しかも従来の方法で必須であった試料の固定や余分
な色素の洗浄等の操作を省略して処理操作の単純化を図
ることができ、より迅速な試料の大量処理が可能とな
る。
【００８０】また、染色体の分染法においても、一般式
［Ｉ］の化合物を用いたことで、既知の染色剤と分染パ
ターンを得るとができ、染色体の識別、同定の高精度化
が図れる。更に、保存用標本を作製する際にも、染色部
位の退色や色の消失のない標本を作製することができ
る。特に、本発明において用いられる一般式［Ｉ］の化
合物は、試料内への透過性に非常に優れており、この化
合物を生物試料内に供給するための操作、例えば試料の
固定やそれに続く洗浄操作等を省略できるという利点が
ある。また、固定操作を省略した場合には、試料を非固
定の自由な状態、すなわち自然の生態のまま、あるいは
それに近い状態で染色に利用でき、例えば生きている状
態での染色が可能となる。また、染色体の分染において
も、通常行われているカルノア固定液による固定操作、
それに続く洗浄操作及び乾燥工程を省略することができ
る。
【００８１】また、上述してきたように、一般式［Ｉ］
の化合物は、溶液中にフリーの状態、すなわち核酸の非
存在下では、励起光を照射してもほとんど蛍光を発しな
いが、２本鎖核酸が存在し、これと相互作用した場合に
は蛍光を放出する。これは、バックグランドが極めて低
いということを意味しており、より精度の高い染色が可
能となる。更に、この低バックグランド特性により、一
般式［Ｉ］の化合物を極めて広範囲の濃度で利用するこ
とが可能となる。
【００８２】例えば、細胞や微生物の培養液に２−メチ
ル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェ
ニル）ピリリウム アイオダイド（化合物１）を直接添
加し、染色液の共存する状態で通常の落射蛍光顕微鏡を
用いて観察した場合、染色液中の色素濃度は、数十ｎｇ
／ｍｌ〜数μｇ／ｍｌの範囲で、バックグランドを全く
気にすることなく使用でき、従来必要であった染色操作
後の洗浄を完全に省略、もしくは簡略化することができ
る。また、動物やヒトの組織またはその切片の染色にお
いて、数十μｇ／ｍｌ程度の高濃度の染色液を用いても
従来必要であった染色操作後の洗浄を完全に省略もしく
は簡素化することができる。
【００８３】一方、染色像に関していえば、一般式
［Ｉ］の化合物によれば細胞の核を鮮明に染色でき、培
養細胞、培養菌あるいは各種組織などの生細胞染色では
分裂中の細胞の染色体を明瞭に認めることができる。こ
れは、一般式［Ｉ］の化合物が核酸（即ち、ＤＮＡ等の
二本鎖核酸、もしくはＲＮＡ等の一本鎖核酸の分子内二
本鎖部分等）に強い親和性を持つことによるが、この特
徴を利用することにより、ＦＣＭ（フローサイトメータ
ー）による細胞の計数や、細胞の分裂周期段階における
分類等が可能である。
【００８４】生物試料の染色を行う場合、染色剤の水溶
性が大きな問題となる。生物試料は、通常、水系の環境
で扱われることが多い。これに対して、色素は有機溶媒
系で扱われることが多く、生物試料を取り扱う分野にお
いては、水系で使用可能な色素の要望は高く、その利用
可能範囲も広い。一般式［Ｉ］の化合物は、適当なカウ
ンターイオン（例えば、ヨウ素）を選択することにより
水溶性も高めることができる点でも非常に有用である。
【００８５】さらに、本発明における一般式［Ｉ］の化
合物は、細胞中での滞留性が低く、滞留することで生細
胞に悪影響を与えることがないので、染色対象が培養細
胞や微生物のような場合、未固定での染色及び染色状態
の観察を行なう際に、他の微生物の混入による汚染や温
度制御等に若干の注意を払うだけで、観察後継続してこ
れらの培養を行うことも可能である。すなわち、同一試
料の経時的な蛍光染色観察が可能となる。
【００８６】本発明に係る一般式［Ｉ］の化合物は、上
述したように、通常蛍光色素でみられる蛍光のフェード
現象が非常に少ないことも特徴としてあげられる。そこ
で、一般式［Ｉ］の化合物の低バックグランド、低フェ
ード現象の両特徴を併用することで、蛍光染色の長期保
存標本の作製ができる。つまり、標本を保存用溶液とと
もに容器内に封入する際に、保存用溶液内に一般式
［Ｉ］の化合物を追加しておくことで、たとえ多少のフ
ェード現象が起こっても保存標本中で色素の更新が行わ
れ、観察像の変化は長期間にわたって抑制できる。
【００８７】本発明の染色法を利用した保存標本の作製
は、生物試料を一般式［Ｉ］の化合物で染色して適当な
容器内に密封して行うことができる。容器としては、試
料を密封できるものであれば目的に応じて種々の形状や
大きさのものが利用でき、またスライドガラス上に載せ
たカバーガラスの周縁を樹脂等の封入材で密封するもの
もこの容器に含まれる。
【００８８】染色された生物試料は、必要に応じてアジ
化ナトリウム等の防腐剤を含む液媒体とともに容器に封
入される。また、容器内で生物試料と染色液とを混合、
封入してもよい。液媒体としては、染色溶媒として利用
できるものならよい。また、液媒体中に蛍光性色素が含
有された状態で生物試料が封入されるようにすれば、上
記のように長期保存においても染色状態を安定に維持す
ることができる。
【００８９】
【実施例】以下実施例により本発明をさらに詳しく説明
する。 実施例１ 無水酢酸１００ｍｌと濃硫酸３０ｍｌとを冷却しながら
混合し、得られた混合液をウォーターバスで８０℃に保
ちながら３時間加温した。そこに無水酢酸２０ｍｌ、ｐ
−ジメチルアミノアセトフェノン３０ｍｌを室温下で加
え、その後４５℃に温度を上昇させて２４時間攪拌し反
応させた。この反応液に等量のエタノールを加え、冷却
し、更にヨウ化カリウム水溶液を加えると粗結晶が析出
した。この粗結晶を濾過により回収し、エタノール／エ
ーテルの混合系（容量比、１：４）で再結晶させて、２
−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ
ノフェニル）ピリリウム アイオダイド（表１の化合物
１（ただしＹはＩである））の緑色の結晶を得た。 得られた化合物１（Ｙ：Ｉ）の分析結果 融点：２５４〜２５７℃ ＵＶ／可視（ＣＨ3ＣＮ ε×１０-4）λmax ：４４４
ｎｍ（２．４３）、５５０ｎｍ（８．２４） ＮＭＲ（1Ｈ、DMSO）δｐｐｍ：８．３７３７（１Ｈ、
ｓ）、８．２７２９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、
８．１７９５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、７．８８
６４（１Ｈ、ｓ）、６．９１１７（４Ｈ、ｔ、ＪAB＝Ｊ
BC＝９．７７）、３．１８２９（６Ｈ、ｓ）、３．１３
４０（６Ｈ、ｓ）、２．６８０９（３Ｈ、ｓ） ＦＡＢ ｍａｓｓ ｍ／ｚ ３３３ ＩＲ（ＫＢｒ）νｃｍ-1：１６４５、１６１０（ｓ
ｈ）、１５８０（ｓ）、１４９０（ｓ）、１２７０、１
２００、１１６０ 更に、ヨウ化カリウム水溶液の代わりに過塩素酸水溶液
を用いる以外は上記と同様にして２−メチル−４，６−
ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリ
ウムの過塩素酸塩（化合物１（Ｙ：ＣＩＯ4））を得
た。
【００９０】実施例２ 硫化ナトリウム９水和物２０ｇをイオン交換水に溶解さ
せ全量を５０ｍｌとした。この溶液に炭酸水素ナトリウ
ム７ｇを加え溶解させた後、氷冷下、５０ｍｌのエタノ
ールを更に加えてから、室温で３０分間攪拌した。析出
した炭酸ナトリウムを濾別し、２５ｍｌのエタノールで
洗浄し、濾液と洗液を合わせ、約１２５ｍｌの水硫化ナ
トリウムの水・エタノール溶液を得た。
【００９１】次に、実施例１で得た２−メチル−４，６
−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリ
リウム アイオダイドの０．９２ｇを２０ｍｌのＤＭＳ
Ｏに溶解させ、得られた溶液に先に調製した水硫化ナト
リウムの水・エタノール溶液の５ｍｌを加え、室温下で
５分間攪拌した。攪拌後、ヨウ化水素酸０．７５ｍｌを
加え、更に５分間攪拌した。以下、常法に従って、ジク
ロロメタン抽出、シリカゲルカラム精製を行った後、エ
タノール／エーテル混合液（容量比、１：４）で再結晶
させて、０．７ｇの２−メチル−４，６−ビス−（４−
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チオピリリウム ア
イオダイドの結晶（表１の化合物２（ただし、ＹはＩで
ある））を得た。 得られた化合物２（Ｙ：Ｉ）の分析結果 融点：２４６〜２４８℃ ＵＶ／可視（ＣＨ3ＣＮ ε×１０-4）λmax ：４９５
ｎｍ（２．５０）、５８７ｎｍ（４．９５） ＮＭＲ（1Ｈ、DMSO）δｐｐｍ：８．５６７９（１Ｈ、
ｓ）、８．４３２３（１Ｈ、ｓ）、８．２４３６（２
Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２７Ｈｚ）、７．９７８６（２Ｈ、
ｄ、Ｊ＝９．２８）、６．８９５９（４Ｈ、ｔ、ＪAB＝
ＪBC＝９．２８）、３．１７５６（６Ｈ、ｓ）、３．１
１５７（６Ｈ、ｓ）、２．８３２３（３Ｈ、ｓ） ＦＡＢ ｍａｓｓ ｍ／ｚ ３４９ ＩＲ（ＫＢｒ）νｃｍ-1：１６００（ｓ）、１５６０
（ｓ）、１４６０（ｓ）、１４３０（ｓ）、１３７０
（ｓ）、１２６０（ｓ）、１１６０（ｓ） 更に、ヨウ化水素酸の代わりに過塩素酸水溶液を用いる
以外は上記と同様にして２−メチル−４，６−ビス−
（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チオピリリウ
ムの過塩素酸塩（化合物２（Ｙ：ＣＩＯ4））を得た。 参考例１ 表１に示す化合物３〜５５をそれぞれ用意した。表１に
おいて、Φはｐ−フェニレン基：
【００９２】
【化２２】 またはフェニル基を表わす。
【００９３】
【表１】
【００９４】
【表２】
【００９５】
【表３】
【００９６】
【表４】
【００９７】
【表５】
【００９８】
【表６】
【００９９】
【表７】
【０１００】
【表８】
【０１０１】
【表９】
【０１０２】
【表１０】
【０１０３】
【表１１】
【０１０４】
【表１２】
【０１０５】
【表１３】
【０１０６】
【表１４】
【０１０７】
【表１５】
【０１０８】
【表１６】
【０１０９】
【表１７】
【０１１０】
【表１８】
【０１１１】
【表１９】 なお、これらの化合物は以下の公知の方法により合成し
た。なお、具体的な反応操作は常法に従った。
【０１１２】化合物７は、W.Foerstらの「New Methods
of Preparative Organic Chemistry」、Acad. Press（1
964）に記載の方法に従って、化合物［ｉ］
【０１１３】
【化２３】 を合成した後、これと
【０１１４】
【化２４】 （ｐ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンズアルデヒド）とを
反応させて得られた化合物に更に所望のアニオンを反応
させて得た。化合物１７は、化合物［ｉ］と
【０１１５】
【化２５】 （ｐ−ジエチルアミノスチリルベンツアルデヒド）とを
反応させて得られた化合物に更に所望のアニオンを反応
させて得た。また、化合物［ｉ］を水硫化ナトリウムと
反応させることにより化合物［ｉｉ］
【０１１６】
【化２６】 を得た後、この化合物［ｉｉ］を化合物７、１７と同様
にして化合物８、１８を合成した。
【０１１７】R. WizingerらのHelv. chim. Acta、39、2
17 (1956)に記載の方法に従い、アセトフェノンとアセ
トアルデヒドから以下に示すルート
【０１１８】
【化２７】 を経て、化合物［ｉｉｉ］
【０１１９】
【化２８】 を合成した。この化合物［ｉｉｉ］を原料として、ｐ−
ジメチルアミノベンズアルデヒドとの反応から得られた
化合物に更に所望のアニオンを反応させて化合物５を、
ｐ−ジエチルアミノスチリルアルデヒドとの反応から同
様にして化合物１５を、ｐ−ジメチルアミノ桂皮アルデ
ヒドとの反応から同様にして化合物９を、
【０１２０】
【化２９】 との反応から同様にして化合物１１をそれぞれ得た。ま
た、化合物［ｉｉｉ］を水硫化ナトリウムと反応させる
ことにより化合物［ｉｖ］
【０１２１】
【化３０】 を得た後、化合物［ｉｉｉ］に代えて化合物［ｉｖ］を
用いる以外は、化合物５、１５、９及び１１の合成の場
合と同様の方法で、化合物６、１６、１０及び１２をそ
れぞれ得た。
【０１２２】更に、原料のアセトアルデヒドをｐ−ジメ
チルアミノベンズアルデヒドに代える以外は、化合物
［ｉｉｉ］の合成の場合と同様にして、化合物３のカチ
オン部分を得た後、これに硫化ナトリウムを反応させて
得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させ、化合
物４を得た。また、同様にしてｐ−メチルベンズアルデ
ヒとアセトフェノンから化合物［ｖ］
【０１２３】
【化３１】 を得た後、それを水硫化ナトリウムと反応させて化合物
［ｖｉ］
【０１２４】
【化３２】 を得た。更に、化合物［ｖ］及び［ｖｉ］をそれぞれｐ
−ジメチルアミノベンズアルデヒドと反応させ、得られ
た化合物に更に所望のアニオンを反応させて化合物１３
及び１４を得た。
【０１２５】化合物１９、２０及び２１は、化合物
［ｉ］または［ｉｉ］と、化合物１または２のカチオン
部分とを
【０１２６】
【化３３】 と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反
応させて得た。化合物２２、２３及び２４は、化合物
［ｉ］または［ｉｉ］と化合物１または２のカチオン部
分とを、
【０１２７】
【化３４】 と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反
応させて得た。化合物２５及び２６は、化合物［ｉ］ま
たは［ｉｉ］を
【０１２８】
【化３５】 と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反
応させて得た。化合物２７、２８及び２９は、化合物
［ｉ］または［ｉｉ］と化合物１または２のカチオン部
分とを、トリエトキシメタン［ＨＣ（ＯＣ2Ｈ5）3］と
反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応
させることにより合成した。化合物３０、３１及び３２
は化合物［ｉｉｉ］または［ｉｖ］と、［ｉｉｉ］と
［ｉｖ］と同様の方法によりｐ−ジメチルアミノアセト
フェノンから合成した化合物［ｉｉｉ］と［ｉｖ］のジ
メチルアミノ誘導体と、トリエトキシメタンとを反応さ
せ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させる
ことにより合成した。
【０１２９】化合物３３〜５５は以下の各反応によりそ
れぞれ合成した。化合物３３の合成
【０１３０】
【化３６】 化合物３４の合成
【０１３１】
【化３７】 化合物３５の合成
【０１３２】
【化３８】 化合物３６の合成
【０１３３】
【化３９】 化合物３７の合成
【０１３４】
【化４０】 化合物３８の合成
【０１３５】
【化４１】 化合物３９の合成
【０１３６】
【化４２】 化合物４０は、化合物３６の合成で原料を
【０１３７】
【化４３】 から
【０１３８】
【化４４】 に変更して合成した。
【０１３９】化合物４１は、化合物３７の合成で原料を
【０１４０】
【化４５】 から
【０１４１】
【化４６】 に変更して合成した。
【０１４２】化合物４２は、化合物３８の合成で原料を
【０１４３】
【化４７】 から
【０１４４】
【化４８】 に変更して合成した。
【０１４５】化合物４３は、化合物３９の合成で原料を
【０１４６】
【化４９】 から
【０１４７】
【化５０】 に変更して合成した。化合物４４の合成
【０１４８】
【化５１】 化合物４５の合成
【０１４９】
【化５２】 化合物４６の合成
【０１５０】
【化５３】 化合物４７の合成
【０１５１】
【化５４】 化合物４８は、化合物４４の合成で原料を
【０１５２】
【化５５】 から
【０１５３】
【化５６】 に変更して合成した。
【０１５４】化合物４９は、化合物４５の合成で原料を
【０１５５】
【化５７】 から
【０１５６】
【化５８】 に変更して合成した。
【０１５７】化合物５０は、化合物４６の合成で原料を
【０１５８】
【化５９】 から
【０１５９】
【化６０】 に変更して合成した。
【０１６０】化合物５１は、化合物４７の合成で原料を
【０１６１】
【化６１】 から
【０１６２】
【化６２】 に変更して合成した。化合物５２の合成
【０１６３】
【化６３】 化合物５３の合成
【０１６４】
【化６４】 化合物５４の合成
【０１６５】
【化６５】 化合物５５の合成
【０１６６】
【化６６】 実施例３ 実施例１で得た化合物１を１０％アセトニトリルを含む
１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、化合物１の最終濃度が
３×１０-5Ｍになるように調整してサンプルＩとした。
このサンプルＩの一部を用いてその吸収スペクトルを分
光光度計を用いて常法により測定したところ図１のＡに
示す結果が得られた。
【０１６７】次に、Salmon sparm DNA （Sigma社製）を
ＴＥ緩衝液（10mM Tris-1mM EDTA）に溶解し、フェノー
ル抽出により精製した。取扱を容易にするために、この
精製物を更に制限酵素ＥｃｏＲＩで消化処理し、得られ
た処理液をＤＮＡ溶液とした。このＤＮＡ溶液の一部と
サンプルＩの一部とを混合して、ＤＮＡの最終濃度が５
０μｇ／ｍｌとなるように調整し、更に、化合物１の最
終濃度が３×１０-5Ｍになるように調整して、サンプル
ＩＩとした。このサンプルＩＩの一部を用いてその吸収
スペクトルを常法により測定したところ、図１のＢで示
す結果が得られた。すなわち、該化合物の吸収のピーク
は、ＤＮＡとの相互作用により長波長側に２０〜３０ｎ
ｍシフトした。これは、典型的なインターカレーターの
性質である。
【０１６８】サンプルＩの一部を用いてその蛍光スペク
トルを常法により測定したところ、ＤＮＡ非存在下では
５５０ｎｍで励起した場合、６５０ｎｍ付近に弱いピー
クが検出された（図２のＡ参照）。次にサンプルＩＩの
一部を用いて同様にして蛍光スペクトルを測定したとこ
ろ、サンプルＩＩ中では、同じ波長での励起で、ＤＮＡ
非存在下における場合の約１００倍の蛍光強度のピーク
が６５０ｎｍ付近に検出された（図２のＢ参照）。以上
の結果は、化合物１が強力なインターカレーターである
ことを示している。
【０１６９】次に、先に調製したＤＮＡ溶液と、化合物
１と、１０％アセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸緩衝
液を用いて、化合物１を５×１０-6Ｍの濃度で含み、か
つＤＮＡ濃度が異なる溶液を調製した。得られた各溶液
の蛍光強度を常法により測定して、ＤＮＡ濃度に対する
蛍光強度の変化を求めた。得られた結果を図３、４に示
す。蛍光強度はＤＮＡ濃度が増加するに従って増大し、
最大で、ＤＮＡ非存在下の時の蛍光強度の約４００倍増
大した。なお、励起光としては、Ｘｅランプを光源とし
４８０ｎｍのローカットフィルターにより紫外光を除去
したものを用いた。
【０１７０】比較例１ インターカレーターとして知られているエチジウムブロ
マイド（ＥＢ）を用いて、実施例３と同様にしてＤＮＡ
濃度に対する蛍光強度の変化を求めた。結果を図３、４
に示す。
【０１７１】図３の結果から明らかなように、ＤＮＡ非
存在下において、化合物１の蛍光強度はＤＮＡ非存在下
ではほぼ０であるのに対し、ＥＢでは高い。更に、例え
ば４μＭのＤＮＡ濃度においては、化合物１の蛍光増大
は約１７倍であり、これに対してＥＢの蛍光増大は約４
倍である。従って、ＤＮＡ添加時のＳ／ＮはＥＢに比べ
て化合物１の方が圧倒的に良く、化合物１を核酸染色剤
として用いることで非常に低いバックグランドでの核酸
の感度良い検出が可能となり、しかもＤＮＡの低濃度領
域においても感度良い検出が可能である。
【０１７２】また、図４の結果から明らかなように、励
起光に可視光を用いる限りにおいては、化合物１はＥＢ
の４倍以上の蛍光強度を得ることができ、化合物１を用
いることでより高い感度での核酸の検出が可能となる。
【０１７３】実施例４ ＤＮＡサイズマーカー λ／ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｉｇｅ
ｓｔ−ΦＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（ＴＯ
ＹＯＢＯ社製）を全量として１００ｎｇから０．１ｎｇ
まで各種濃度に調製し、０．８％アガロースゲル電気泳
動により分離した。次に化合物１のアセトニトリル溶液
を、色素の最終濃度が１×１０ー6Ｍ、アセトニトリル濃
度が１０％になるように蒸留水に溶解し、泳動後のゲル
をこの溶液に約２分間浸した。
【０１７４】トランスイルミネーター状の箱の一面を４
８０から５９０ｎｍのバンドパスフィルターで覆い、染
色後のゲルをフィルターの上に載せ、その上に蛍光検出
用のフィルター（６２０から７１０ｎｍのバンドパスフ
ィルター）を重ね、ハロゲンランプで照射したところ、
ＤＮＡの展開パターンが直接目で確認でき、０．０５ｎ
ｇのＤＮＡが存在していると思われるバンドの染色が目
で直接確認された。さらに、ポラロイドカメラでの写真
も良好であった。この感度は、従来用いられているエチ
ジウムブロマイドで染色したゲルを紫外線で励起した場
合（トランスイルミネーター使用）よりも一桁以上感度
の良いものであった。
【０１７５】実施例５ 実施例４と同様にしてＤＮＡサイズマーカーを各種濃度
に調製し、小型電気泳動装置により１％アガロースゲル
（５×６ｃｍ）を用いてＤＮＡ断片を分離した。次に化
合物１を実施例４と同様にして溶解し、泳動後のゲルを
浸した。ストロボを励起光源とし、実施例４と同様なバ
ンドパスフィルターをストロボの表面のガラスと置き換
えてセットした。染色後のゲルをその上に載せ、蛍光検
出用のバンドパスフィルターをセットしたポラロイドカ
メラにより、ストロボと連動させて写真を撮影した。シ
ャッタースピード１秒、絞り１／１６程度が良好であっ
た。検出感度は実施例４と同様であった。
【０１７６】実施例６ ＤＮＡサイズマーカーとしてΦＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ
ｄｉｇｅｓｔ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用い、実施例４
と同様にその各種濃度溶液を調製し、８％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により分離した。次に、化合物１０
を実施例４と同様にして溶解し、泳動後のゲルを浸し
た。半導体レーザー（６８０ｎｍ；日立製作所製）を励
起光源とし、また、フォトマルの前に蛍光検出用のバン
ドパスフィルター（７００から８００ｎｍの波長領域）
をセットし、ゲル上をスキャンさせて蛍光強度を定量し
た。それぞれのバンドの強度はサイズマーカーのＤＮＡ
断片の長さに比例し、最も濃度の高い１．３ｋｂ（２５
ｎｇ）まで定量的に取り扱うことができた。
【０１７７】実施例７ 標的核酸のモデルとしてＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡを
用い、該標的核酸の有する塩基配列と相補的な下記の配
列を有する２０量体オリゴヌクレオチドをＡＢＩ社製３
８１Ａ ＤＮＡ合成機を用いて合成し、プローブＩとし
た。 ５’ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’ また、対照試験用としてＴのみからなる２０量体を同様
に合成し、プローブＩＩとした。
【０１７８】１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）／１４
５ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＫＣｌ中に、プローブＩと
Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡをそれぞれ最終濃度が１０
μｇ／ｍｌとなるように加え、これらを反応させ試料Ｉ
を得た。また、プローブＩの代わりにプローブＩＩを用
いて同様の反応を行い、試料ＩＩを得た。
【０１７９】次に、試料Ｉ及びＩＩに、化合物１のアセ
トニトリル溶液を、最終濃度が３×１０-5Ｍとなるよう
に加え、タングステンランプでの光照射を行ったとこ
ろ、試料Ｉの場合は赤い発光が観察されたが、試料ＩＩ
の場合は透明のままであった。この結果は、溶液系での
プローブと標的核酸とのハイブリッド体の検出をＢ／Ｆ
分離なしに行えることを示している。
【０１８０】実施例８ 化合物１２について実施例３と同様な実験を行った。つ
まり、化合物１２を１０％アセトニトリルを含む１００
ｍＭ酢酸緩衝液に適当量溶解し、最大吸収極大が約０．
４になるように調製した。なお、図５に示すようにＤＮ
Ａ非存在下では化合物１２は６２５ｎｍに吸収極大を持
つ。
【０１８１】実施例３で調製したＤＮＡ溶液を最終濃度
５０μｇ／ｍｌになるように化合物１２の溶液に加える
と、吸収は長波長側に３５ｎｍシフトし、６６０ｎｍに
吸収極大を持つようになった。また、その吸光度は減少
し淡色効果を示し、典型的なインターカレーターの性質
を示した。
【０１８２】実施例３と同様にしてＤＮＡ存在下と非存
在下での蛍光スペクトルを測定したところ図６に示す結
果が得られた。図６に示すように、ＤＮＡ非存在下では
キセノンランプで励起した場合６９０ｎｍ付近に弱い蛍
光が観測され、これにＤＮＡを最終濃度５０μｇ／ｍｌ
の濃度で加えると、蛍光の波長は７３５ｎｍになり、そ
の蛍光強度はＤＮＡ非存在下の約１０倍増大した。すな
わち、化合物１２がインターカレーターであることが確
かめられた。この化合物１２を用いることで実施例４、
７におけるＤＮＡの検出を行うことができた。
【０１８３】実施例９ 化合物６について実施例３と同様な実験を行った。つま
り、化合物６を１０％ジメチルスルホキシド水溶液に適
当量溶解し、最大吸収極大が約０．４になるように調製
した。なお、図７に示すようにＤＮＡ非存在下では化合
物６は６６０ｎｍに吸収極大を持つ。
【０１８４】実施例３で調製したＤＮＡ溶液を最終濃度
５０μｇ／ｍｌになるように化合物６の溶液に加える
と、吸収は長波長側に３０ｎｍシフトし、６９０ｎｍに
吸収極大を持つようになった。また、その吸光度は減少
し淡色効果を示し、典型的なインターカレーターの性質
を示した。
【０１８５】実施例３と同様にしてＤＮＡ存在下と非存
在下での蛍光スペクトルを測定したところ図８に示す結
果が得られた。図８に示すように、ＤＮＡ非存在下では
キセノンランプで励起した場合７３５ｎｍ付近に弱い蛍
光が観測され、これにＤＮＡを最終濃度５０μｇ／ｍｌ
の濃度で加えると、蛍光の波長は８００ｎｍになり、そ
の蛍光強度はＤＮＡ非存在下の約７倍増大した。すなわ
ち、化合物６がインターカレーターであることが確かめ
られた。この化合物６を用いることで実施例４、７にお
けるＤＮＡの検出を行うことができた。
【０１８６】実施例１０ 化合物２を１０％アセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸
緩衝液に溶解し、最終濃度５×１０-5Ｍになるように調
製した。図９に示すようにＤＮＡ非存在下では化合物２
は５２０ｎｍから６６０ｎｍに吸収を持ち、その吸収極
大は５８０ｎｍであった。
【０１８７】実施例３と同様にして調製したＤＮＡ溶液
を最終濃度５０μｇ／ｍｌになるように化合物２の溶液
に加えると、吸収は長波長に３０〜４０ｎｍシフトし、
典型的なインターカレーターの性質を示した。蛍光スペ
クトルを同様にして測定したところ、図１０に示す結果
が得られた。図１０に示すように、ＤＮＡ存在下ではキ
セノンランプで励起した場合、７００ｎｍにピークを持
つ。
【０１８８】次に、化合物２を１０％アセトニトリルを
含む１０ｍＭリン酸緩衝液に最終濃度５×１０ー6Ｍにな
るように含み、かつＤＮＡ濃度が異る溶液を調製した。
得られた各溶液の蛍光強度を常法により測定して、ＤＮ
Ａ濃度に対する蛍光強度の変化を調べたのが図１１であ
る。蛍光強度はＤＮＡ濃度が増加するに従って増大し、
最大で、ＤＮＡ非存在下の時の蛍光強度の約１００倍増
大した。
【０１８９】以上の結果から、化合物２が強力なインタ
ーカレーターであることが確かめられた。
【０１９０】実施例１１ 表１に示すその他の化合物におけるＤＮＡ存在下での吸
収極大のシフト及び蛍光強度の増大について実施例３、
８及び９と同様にして測定した。得られた結果の代表例
について表２に示す。なお、増大の程度はいずれもＤＮ
Ａの最終濃度が５０μｇ／ｍｌの時の値である。
【０１９１】
【表２０】 実施例１２ （培養細胞の生細胞染色）培養細胞は、Ｌ細胞（NCTC c
lone 929,ATCC No.CCL1,Sanford,K.K.,Earle,W.R.,Like
ly,G.D.:J.Natl.Cancer Inst.,9.229-246,1948）を使用
し、培養法は定法に従い、培養液は、イーグルのＭＥＭ
（日水製）＋１０％ＦＣＳを使用した。
【０１９２】３７℃のＣＯ2 インキュベーター内で培養
を行い、細胞密度が１．２×１０6Ｃｅｌｌ／ｃｍ2 程
度になったものを染色に使用した。
【０１９３】２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ
−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム アイオダイド
（化合物１（ＹはＩ））を、エタノール（蛍光分析用）
に２００μｇ／ｍｌの濃度に溶解した。これを、ポアサ
イズ０．２２μｍのフィルターを通して、滅菌、除粒子
して、本発明の染色液のストック溶液とした。
【０１９４】細胞の染色は、未固定の生細胞を用いた。
つまり、通常の培養操作に準じて、無菌的に上記のスト
ック溶液を培養細胞の培養液に直接添加した。本実験で
は、化合物１の最終濃度を１００ｎｇ／ｍｌとなるよう
に調整した（最終エタノール濃度；０．５％）。
【０１９５】これを、ＣＯ2 インキュベーター内で、５
分間静置した後、蛍光観察を行った。蛍光観察は、化合
物１を含んだままの培養液、すなわち、細胞が染色液中
にある状態で行った。蛍光観察は、倒立型落射蛍光顕微
鏡（オリンパス社製、ＩＭＴ−２）で行った。その結
果、核が明瞭に染色され、明るい蛍光を発している蛍光
像が観察された。また、蛍光のフェード現象は、観察さ
れず、バックグランドとなる染色液の蛍光も、ほとんど
観察されなかった。
【０１９６】なお、観察後、染色液を通常の培養液に交
換して培養を継続した。細胞は、正常に増殖し、継代培
養した後、再度の染色、蛍光観察が可能であった。
【０１９７】本実施例で使用した色素である化合物１
は、励起光、蛍光共に比較的長波長であるため、同視野
での長時間の蛍光観察は、発熱等、細胞に対する悪影響
が予想されるが、濃度が非常に低いこと、蛍光量が多い
ため励起光を抑えることができることなどにより、特に
影響はなかった。
【０１９８】比較例２ （エチジウムブロマイド（ＥＢ）による培養細胞の生細
胞染色）染色対象である細胞は、実施例１２と同様に準
備した。色素（ＥＢ）は、通常、水溶液として使用する
が、本実験では、実施例１２との整合をとるため、エタ
ノール溶液とした。色素溶液の濃度は、実施例１２同様
に２００μｇ／ｍｌとした。これを、ポアサイズ０．２
２μｍのフィルターを通して、滅菌、除粒子を行い、比
較用の染色液のストック溶液とした。
【０１９９】染色も、実施例１２同様に、培養液にスト
ック色素液を直接添加して行った。
【０２００】色素添加後静置、５分、１５分、１時間、
１．５時間と４種類の染色時間経過の異なるものを、観
察した。観察装置は、実施例１２と同様である。
【０２０１】結果は以下のとおりであった。 （１）ＥＢのバックグランドが非常に強いため、細胞が
確認、観察できず、染色液のままの観察は染色時間に関
わらず、困難であった。 （２）染色液を、培養液、または、生理食塩水に交換し
た後、観察すると染色時間を１．５時間以上としたとこ
ろで細胞核が弱く染色された。
【０２０２】実施例１３ （染色細胞の長期保存標本の作製）細胞は、基本的に
は、実施例１２同様に準備した。ただし、培養する際、
培養皿の中に、滅菌したスライドグラス（蛍光観察用）
を沈め、スライドグラス上に細胞を増殖させた。細胞が
増殖したスライドグラスを培養皿から取り出し、以下の
操作を無菌的に行って細胞を染色した。
【０２０３】まず、取り出したスライドグラスを、４％
ホルムアルデヒド水溶液に３０分間浸して固定した。蒸
留水に通して簡単に洗浄した後、本発明のストック溶液
で調製した染色液（１μｇ／ｍｌ、０．５％エタノール
溶液、フィルター滅菌）を適当量滴下した。次に、蛍光
観察用のカバーグラスを標本上に乗せ、余分の染色液を
除去した。封入用の樹脂を用いて、カバーグラスを固定
して、保存標本とした。観察を、実施例１２と同様の方
法で行ったところ、実施例１２と同様に、細胞核が明瞭
に蛍光を発する染色像が観察された。
【０２０４】この標本を、−２０℃、４℃、室温（いず
れも、アルミ箔で包み、遮光した）でそれぞれ保存し、
３カ月後に再度蛍光観察を行った。標本を水系の溶媒中
に密封したので、−２０℃保存の標本では細胞形態の部
分的破壊が起こったが、他の標本は、良好な保存状態を
保っていた。また、保存後においても蛍光が充分に発せ
られ、染色状態も良好であった。
【０２０５】実施例１４ （血球細胞の生細胞染色）血液培養法（「染色法のすべ
て」 医歯薬出版株式会社 ｐ３６６）により得た血球
細胞を未固定の生細胞の状態で染色した。
【０２０６】つまり、まず、採血した５ｍｌの抹消血液
を滅菌スピッツ管に入れ、立てた状態で放置し、血球を
分離した。次に、細胞培養液（ＲＰＭＩ１６４０、ＧＩ
ＢＣＯ社製）５ｍｌに、０．５ｍｌの牛血清と０．１ｍ
ｌのＰＨＡＭ（ＧＩＢＣＯ社製）を加えたものを培養皿
に用意し、上記、分離血液の上清、つまり、白血球に富
む血漿分を、約０．５ｍｌ加えて、３７℃のＣＯ2 イン
キュベーター内にて、３日間、培養した。
【０２０７】培養した細胞の分散液の一部に、実施例１
２と同様に作製した染色液（濃度；２００μｇ／ｍｌ、
エタノール溶液）を加え、化合物１の最終濃度１００ｎ
ｇ／ｍｌ、最終エタノール濃度０．５％になるように調
整し、血球細胞を染色した。
【０２０８】蛍光観察には、化合物１を含む培養液をそ
のまま使用し、倒立型落射蛍光顕微鏡（オリンパス社
製、ＩＭＴ−２）を用いた。蛍光観察像は、実施例１２
と同様、核が明瞭に染色され、明るい蛍光を発するもの
であった。観察中の蛍光のフェード現象は、ほとんど見
られなかった。
【０２０９】実施例１５ （培養大腸菌の染色）大腸菌として、遺伝子組換えの宿
主として一般に利用されているＪＭ−１０９株を使用し
た。
【０２１０】以下の組成のＭ−９培地（ｐＨ７．０）に
１％程度のアガロースを加え、オートクレーブでアガロ
ースの溶解、滅菌を行い、培養皿に流し込みプレートを
作製した。 Ｍ−９培地組成（１リットル中）： Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ ・・・・１２．８ｇ ＫＨ2ＰＯ4 ・・・・ ３ｇ ＮａＣｌ ・・・・ ０．５ｇ ＮＨ4Ｃｌ ・・・・ １ｇ ＭｇＳＯ4 ・・・・ １ｍＭ グルコース ・・・・ ０．２％ ＣａＣｌ2 ・・・・ ０．１ｍＭ 残り 水 このＭ−９プレートにＪＭ−１０９株のストック（宝酒
造）より菌を接種し、３７℃の恒温器中で一晩インキュ
ベートし、菌を増殖させてプレート上にコロニーを得
た。コロニーの一つを、滅菌した白金耳でピックアップ
し、培養容器中の１００ｍｌの下記組成の２×ＹＴ培
地； ２×ＹＴ培地（１リットリ中） バクト−トリプトン ・・・・１６ｇ バクト−イーストエキストラクト・・・・１０ｇ ＮａＣｌ ・・・・ ５ｇ 残り水 （ｐＨ７） に接種し、これをシェーカー付きの恒温水槽にセットし
て、３７℃で約１０時間振盪培養した。培養終了後、培
養菌体を遠心分離によって培地から集菌し、これを菌濃
度が約１０8個／ｍｌになるように生理食塩水に再分散
し、得られた分散液を２つに分け、以下の固定菌を用い
た場合と未固定菌を用いた場合の比較試験に用いた。 （１）固定菌の蛍光染色 上記の操作で得たＪＭ−１０９株の再分散液の一方に、
等量の４％ホルムアルデヒド液（ｐＨ７．０）を加え、
よく攪拌した後、室温で３０分間放置して菌を固定し
た。固定操作の終った菌を遠心分離により回収し、生理
食塩水に再分散した。この再分散の際の菌濃度は、１０
7〜１０8個／ｍｌ程度とし、蛍光顕微鏡で観察する際に
適当である濃度とした。
【０２１１】染色液として、化合物１（Ｙは（Ｉ））を
エタノールに２００μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解
し、フィルターを用いて、滅菌、除粒子を行って調製し
たものを用いた。
【０２１２】この染色液を先に調製した固定菌の分散液
に最終濃度が０．２μｇ／ｍｌ、エタノール濃度が０．
５％となるように添加し、室温で１０分間静置して染色
を行い、固定菌が分散したこの状態のまま、すなわち分
散溶媒中の色素である化合物１を除く操作は行わずに蛍
光観察に供した。 （２）生菌（未固定菌）の蛍光染色 菌のホルムアルデヒドによる固定を行わない以外は上記
の（１）と同様の操作を行い、染色された生菌の分散液
を得た。この場合も、分散溶媒中の色素である化合物１
を除く操作は行わずに蛍光観察に供した。
【０２１３】上記（１）及び（２）の操作で得られた各
菌分散液を別々にスライドガラス上に滴下し、カバーガ
ラスを載せて、余分な液を除去した後、これを封入用の
樹脂を用いて封入した。こうして得られた標本の蛍光観
察を、落射蛍光顕微鏡（オリンパス社製 ＩＭＴ−２）
を用いて行った。その結果、原核微生物である大腸菌
は、菌全体が染色されたように観察された。菌の固定、
未固定による染色性の違いは観察されず、いずれの場合
においても非常に明るい赤色の蛍光を発する蛍光像が観
察された。また、蛍光のフェード現象も観察されなかっ
た。
【０２１４】なお、観察後、未固定菌の染色液を培養液
に交換して培養を行ったところ、大腸菌は正常に増殖
し、これを継代培養して得られた菌体においては、再度
の染色及び蛍光観察が可能であった。
【０２１５】ここでも、同視野での長時間の蛍光観察か
らの発熱等による大腸菌に対する悪影響はみられなかっ
た。
【０２１６】比較例３ （エチジウムブロマイド（ＥＢ）による大腸菌の生菌染
色）染色対象である大腸菌は実施例１５と同様に用意し
た。色素（ＥＢ）は、通常水溶液として使用されるが、
本実験では実施例１５との整合をとるため、エタノール
溶液とした。色素溶液の濃度は実施例１５同様に２００
μｇ／ｍｌとした。これを、ポアサイズ０．２２μｍの
フィルターを通して滅菌及び除粒子を行った。
【０２１７】この色素（ＥＢ）溶液を用いて実施例１５
と同様に大腸菌の染色を行った。染色状態の観察は、色
素溶液添加後静置し、５分、３０分、１時間、１．５時
間経過時にそれぞれ行い、以下のような結果が得られ
た。 （１）菌分散液に色素溶液を加えた状態でそのまま観察
したところ、液媒体が非常に強く発光を発し、すなわち
バックグランドが非常に強く、菌の着色状態の判定の障
害となった。 （２）観察時に菌体を液媒体から分離、洗浄し、これを
培養液や生理食塩水に再懸濁して観察したところ、固定
菌では３０分間程度の静置（染色）時間で染色され、未
固定菌では１時間程度で染色されることがわかった。し
かしながら、未固定菌の場合、固定菌に比べて弱く染色
され、染色にもむらが観察された。
【０２１８】実施例１６ （染色菌の長期保存標本の作製）染色液に最終濃度が
０．０５％程度となるように防腐剤としてのアジ化ナト
リウムを添加する以外は、実施例１５の（１）と同様に
して固定菌の蛍光染色を行った後その染色状態を観察し
たところ、実施例１５と同様に菌体全体が明瞭に蛍光を
発しているのが観察された。
【０２１９】このサンプルを容器内に密封した標本を多
数用意し、それぞれアルミ箔で包んで遮光してから、−
２０℃、４℃、室温下で保存した。３カ月経過後標本の
蛍光観察を再度行った。その結果、−２０℃で保存した
標本は菌の分散媒体が水系のため凍結によって菌の形態
の部分的破壊が起ったが、他の保存温度での標本は良好
な保存状態を保っていた。また、蛍光も充分に発せら
れ、染色状態も良好であった。
【０２２０】実施例１７ （組織切片の染色）常法により作製したマウス肝臓のス
ライドガラス貼付パラフィン薄切切片を、以下のように
して、化合物１により染色した。ただし、蛍光による観
察を行うので、スライドガラス及び各種溶媒、溶液は無
蛍光のものを使用した。
【０２２１】まず、２−メチル−４，６−ビス−（４−
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム アイオ
ダイド（化合物１）の適当量をエタノールに溶解し、生
理食塩水でこれを希釈して最終色素濃度が１μｇ／ｍ
ｌ、エタノール濃度０．５％となるように調整した。こ
の色素溶液を、ポアサイズ０．２２μｍのフィルターに
通して、除菌、除粒子し、染色液とした。
【０２２２】標本は水系の染色液の浸透性をよくするた
めに、パラフィン切片のパラフィン分を除去して使用し
た。つまり、標本をキシロール溶液に３〜５分間浸し、
パラフィンを溶解し、脱パラフィンを行った。キシロー
ル溶液を交換して、再度、脱パラフィンを行った後、純
エタノールに浸して、キシロールを除いた。エタノール
を新しいものと交換して、キシロールを完全に除いた
後、７０％エタノール溶液に浸した。さらに、水洗を行
い、脱パラフィン操作を完了し、同時に標本の溶媒の環
境を水系に変更した。
【０２２３】次に、この脱パラフィンを終了したスライ
ドグラス標本を適当量の染色液に５分間浸して染色を行
った。染色後、スライドガラス上の切片の上に、これを
洗浄せずに薄手の蛍光観察用カバーガラスを載せ、周縁
を封入剤で封じた。このように色素を含有する溶液を洗
浄除去せずに、試料とともに封入しておくことで、標本
の着色状態を維持することができる。
【０２２４】蛍光観察には、倒立型落射蛍光顕微鏡（オ
リンパス社製、ＩＭＴ−２）を使用した。透過位相差像
により視野を設定し、組織標本に励起光を照射した。染
色像は核が明瞭に染色されたものであり、明るい蛍光を
発した。観察中、バックグランドはほとんど観察されな
かった。このことは、染色後の余分な色素の洗浄除去が
不要であり、また染色操作において色素濃度に気を配る
必要がほとんどなくなることを意味している。また、フ
ェード現象もなく、視野の選定、写真撮影などの操作を
励起光を照射したままで余裕をもって行うことができ
た。
【０２２５】なお、染色後の封入の際に、防腐剤として
最終濃度０．０５％程度のアジ化ナトリウムを染色液に
加え、封入した標本は、３か月以上の保存においても蛍
光染色像に変化はなく、観察可能であった。
【０２２６】比較例４ （エチジウムブロマイド（ＥＢ）による組織切片染色）
色素（ＥＢ）は通常水溶液として使用するが、本実験で
は、実施例１７との整合性をとるためエタノール溶液と
した。色素溶液の濃度は実施例１７同様最終濃度１μｇ
／ｍｌとした（最終エタノール濃度は０．５％とし
た）。これを、ポアサイズ０．２２μｍのフィルターを
通して、除菌、除粒子を行い、染色液とした。染色も実
施例１７と同様にして行った。なお、染色液添加後、５
分、１５分、１時間、１．５時間経過したものについて
染色状態を観察した。観察装置も実施例１７と同じもの
を使用した。以下の結果が得られた。 （１）ＥＢではバックグランドが非常に強いため、組織
全体が染色されたように観察され、コントラストない観
察像となった。核のみの観察は困難であった。 （２）１．５時間の染色後、蒸留水で洗浄を行い、これ
を封入した標本では、核が弱く染色されているのが観察
された。
【０２２７】実施例１８ （染色体の染色） （１）染色体標本の作製 健康な成人より採血した５ｍｌの抹消血液を無菌スピッ
ツに立てて３時間以上室温で放置し、血球を分離した。
ＲＰＭＩ１６４０培地５ｍｌに０．５ｍｌのウシ血清と
０．５ｍｌのＰＨＡＭ（以上いずれもＧＩＢＣＯ社製）
を加えたものを培養皿に用意し、スピッツ上部の血漿と
白血球層０．５ｍｌを入れて、３７℃の炭酸ガス恒温器
内にて３日間培養した。次に、培養液にコルセミドを最
終濃度０．２〜０．５μｇ／ｍｌになるように加え、さ
らに２〜３時間放置した。培養を停止し、１０００ｒｐ
ｍで５分間遠沈して細胞を集め、それに３ｍｌの０．０
７５ＭのＫＣｌ溶液を加え軽く攪拌後、７分間放置し
た。遠沈により細胞を集め上清を除いた後カルノア固定
液（純メタノール：氷酢酸＝３：１）を加えて１時間放
置して固定した。固定液を２〜３回交換し、最後に少量
の固定液の中に細胞を浮遊させた。この溶液中に２−メ
チル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフ
ェニル）チオピリリウム アイオダイド（化合物２）の
エタノール溶液を最終濃度５００ｎｇ／ｍｌ、エタノー
ル濃度にして１％以下となるように染色液を調整し加え
た。なお、染色液は予めポアサイズ０．０２μｍのフィ
ルターを通して、滅菌、除粒子してある。この細胞浮遊
液に染色液を加えたものを、冷却した無蛍光スライド上
にパスツールピペットにて１〜２滴を滴下し、空気中で
自然乾燥させた。 （２）染色体の観察 上記（１）で得たスライド上の試料を封入用樹脂で封入
し、高感度ＣＣＤカメラ（浜松フォトニクス社製）を接
続させた落射蛍光顕微鏡（ニコン社製）に載せ、染色体
の蛍光パターンを分析した。染色体はきれに分染され、
そのパターンはキナクリンでの分染パターンとは異るも
のであった。この分染パターンにより染色体を分類する
ことができた。
【０２２８】実施例１９ まず、実施例１８と同様にして細胞を培養し、遠沈によ
り細胞を集めた。カルノア液による固定操作を行わず
に、集められた細胞に、２−メチル−４，６−ビス−
（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム
アイオダイド（化合物１）を最終濃度５００ｎｇ／ｍ
ｌ、エタノール濃度にして１％以下となるように加えた
０．０７５ＭのＫＣｌ溶液（３ｍｌ）を加え、蒸気乾燥
法（「染色法のすべて」医歯薬出版株式会社、ｐ３６
６）の要領で染色体を拡散させ、特に乾燥せずに余分な
水滴をふき取った後、これにカバーガラスを載せて周縁
を封入剤で封じて、これを実施例１８と同様にして観察
した。その結果、固定操作なしでも染色体はきれいに分
染され、実施例１８と同様な結果が得られた。この蛍光
はその後ほとんど退色しなかった。この標本を１か月
後、再度観察したところ、作製時と同様な蛍光を再び得
ることができた。
【０２２９】実施例２０ （ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる検出） （１）ＤＮＡプローブの調製 カルボキシベンツアルデヒド及び化合物１（Ｙ＝Ｉ）か
ら、２−（４−カルボキシスチリル）−４，６−ビス−
（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム アイ
オダイド（化合物４８）（Ｘ＝Ｏ、Ｙ＝Ｉ）を合成し
た。次に、この合成した化合物４８の１７０ｍｇを５ｍ
ｌの乾燥ＤＭＦに溶解し、乾燥ピリジン５０μｌ、ＤＳ
Ｃ（ジスクシイミジルカーボネート）１２８ｍｇを加
え、暗所、室温で２０時間攪拌した。反応混液にジエチ
ルエーテル１５０ｍｌを加え、析出した沈澱を集めジエ
チルエーテルで洗った後乾燥した。得られた活性エステ
ル体を核酸との反応に用いた。
【０２３０】マウス イムノグロブリンｋ（カッパ）鎖
のｍＲＮＡの塩基配列の一部に相補的な以下に示す塩基
配列を有し、５’末端にアミノリンカーを結合した３０
量体オリゴヌクレオチドをＡＢＩ社製３８１Ａ ＤＮＡ
自動合成機を用いて合成した。 ５’ＣＴＣＡＣＡＧＧＴＡＴＡＧＣＴＧＴＴＡＴＧＴＣ
ＧＴＴＣＡＴＡ３’ ＣＰＧサポートからの切り出し、脱保護、高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）による精製は定法により行
った。
【０２３１】次に、上記オリゴヌクレオチド２００μ
ｇ、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１００μｌ、水５００
μｌを混合溶解した後、あらかじめ４００μｌのＤＭＦ
に溶解した上記活性エステル体２ｍｇを攪拌下ゆっくり
と添加した。４０℃で２４時間反応させた後、ファルマ
シア社製ゲル濾過カラムＮＡＰ−５０で粗精製し、さら
にＨＰＬＣで精製した。約１５０μｇの本発明の化合物
を標識した以下の構造のＤＮＡプローブを得た。
【０２３２】
【化６７】 （２）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション マウス ミエローマ細胞 Ｐ３ Ｘ ６３ Ａｇ８Ｕ．
１をＤＭＥＭ培地に懸濁後、２．５×１０5個／ｍｌと
なるようにディッシュに蒔いた。３７℃で３６時間培養
した後、（１）で調製したプローブを１０ｎＭの濃度で
含むＤＭＥＭ培地に交換して、引き続き１時間培養し
た。次に、プローブを含まない培地に交換して３０分間
培養する操作を２回繰り返した後、蛍光顕微鏡観察を行
った。蛍光顕微鏡観察はプローブの吸収波長、蛍光波長
に適合したフィルターを用いて行ない、超高感度のＣＣ
Ｄカメラで検出した。その結果細胞質に蛍光が観察され
た。
【０２３３】一方、比較として上記細胞内の核酸に対し
てホモロジーの低い塩基配列を有するヌクレオチドでプ
ローブを合成して同様の観察を行った結果蛍光は観察さ
れなかった。
【０２３４】実施例２１ 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の１６Ｓ
ｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ（以下１６ＳｒＲＮＡと略
記）をターゲットとしたＰＣＲを行い、その増幅産物を
化合物１を用いて検出した。
【０２３５】まず、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株の全Ｄ
ＮＡを以下のようにして調製した。２×ＹＴ培地で終夜
培養した菌体２ｍｌを遠心分離により集菌し、０．１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍｌに懸
濁した。この懸濁液に１０％ＳＤＳ溶液０．０５ｍｌを
加え、十分に混合の後、７０℃で１時間保温した。この
懸濁液をボルテックスミキサーで攪拌し、菌体を十分に
完全に溶菌した。この溶菌液に等量のフェノール／クロ
ロホルムを加え、混合、遠心分離の後、上層を分取し、
２倍量のエタノールを加えＤＮＡを沈澱物として回収し
た。これを１００μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶
解し、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。ＰＣＲ用プライマー
としては以下に示す２本のプライマーを用いた。 プライマー１ ５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣ
ＴＣＡＧ３’ プライマー２ ５’ＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＣＡＣＧ
ＡＣＡＣ３’ これらのプライマーは、ＡＢＩ社製のＤＮＡ ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｚｅｒ ３８１Ａを用いて合成した。合成に必
要な試薬、手法などはＡＢＩ社のプロトコルに拠った。
【０２３６】ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
【０２３７】反応溶液組成（容量３０μｌ） ３μｌ １０×ｂｕｆｆｅｒ／１μｌ ｄＮＴＰｓ／プ
ライマー１および２それぞれ１０ｐｍｏｌｓ／Ｔａｑ
ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒ ０．５ｕｎｉｔｓ／鋳型ＤＮ
Ａ １００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇ、１０
ｆｇ（これに滅菌水を加え全容量を３０μｌとした。） ここで、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは宝酒
造（株）より購入した。また、１０×ｂｕｆｆｅｒ、ｄ
ＮＴＰｓは酵素に添付のものをそのまま使用した。反応
サイクルは以下のとおりである。 反応サイクル ９２℃ ５分間のプレインキュベーション ９２℃ ４５秒／６０℃ ６０秒／７２℃ ９０秒を３
０サイクル 最後に７２℃ ５分間のインキュベーション ここで、ＰＣＲ装置は、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｉｎ
ｃ．のＭｏｄｅｌ ＰＴＣ−１００−９６を用い、反応
容器として９６ウエル・マイクロタイタープレート（Ｂ
ｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製 Ｆａｌｃｏｎア
セイプレート３９１１（Ｕ底））を使用した。
【０２３８】上記、反応条件でＰＣＲを行い、増幅産物
の検出に供した。検出は以下のように行った。反応が終
了した各ウエルに５μｇ／ｍｌの化合物１（アセトニト
リル溶液）を１μｌ加え、ピペッティングにより十分に
混合し、５分間室温に放置した。処理後のサンプルをプ
レートごと５８０ｎｍの光を照射できるトランスイルミ
ネーター上に置き、蛍光の有無で増幅産物の有無を調べ
た。さらに、ウエル中の反応液より１０μｌを分取し、
アガロースゲル電気泳動も併せて行った。結果を表３に
示す。
【０２３９】
【表２１】 ○：ＰＣＲ増幅産物検出 ×：ＰＣＲ増幅産物非検出 比較例５ （エチジウムブロマイド（ＥＢ）を用いたＰＣＲ増幅産
物の検出）１６ＳｒＲＮＡをターゲットとしたＰＣＲを
行い、その増幅産物をＥＢを用いて検出した。鋳型ＤＮ
Ａは実施例２１で調製したものを利用した。また、プラ
イマー、反応溶液組成、反応サイクル、鋳型ＤＮＡの量
などは実施例２１と全く同じ条件とし、検出に用いる化
合物のみを変更した。
【０２４０】検出は以下のように行った。反応が終了し
た各ウエルに５μｇ／ｍｌのＥＢを１μｌ加え、ピペッ
ティングにより十分に混合し、５分間室温に放置した。
処理後のサンプルをプレートごとトランスイルミネータ
ー（ＵＶＰ，ＩＮＣ．ＭＯＤＥＬ ＴＭ−１０）上に置
き、蛍光の有無で増幅産物の有無を調べた。さらに、ウ
エル中の反応液より１０μｌを分取し、アガロースゲル
電気泳動も併せて行った。結果を表４に示す。
【０２４１】
【表２２】 ○：ＰＣＲ増幅産物検出 ×：ＰＣＲ増幅産物非検出 表３、４から本発明によれば従来技術に比べ２桁（１０
０倍）高感度にＰＣＲ産物の検出を行うことが可能とな
ったことが判る。
【０２４２】
【発明の効果】本発明の着色剤の有効成分である一般式
［Ｉ］の化合物の多くは、励起波長が５５０ｎｍ以上と
長波長側にあり、例えばキセノンランプやタングステン
ランプで励起させることができ、有害な紫外線の使用を
回避できる。また、長波長側の励起光を利用するので、
生体由来の試料の検出におけるバックグランドの上昇を
抑えて、高感度分析が可能となる。例えば、生体由来の
試料では、紫外線により励起して蛍光を生じる物質が混
入している場合が多く、紫外線を励起光として用いる場
合には、試料をある程度まで精製する必要がある。これ
に対して、本発明の着色剤を用いれば、このような物質
による蛍光が生じないので、試料に高い精製度が要求さ
れず、例えば、粗抽出液程度のものでも直接試料として
利用でき、感度よい検出を行うことができる。
【０２４３】さらに、一般式［Ｉ］の化合物として近赤
外領域に吸収をもつものを選択して用いることにより、
励起用の光源として小型で安価な半導体レーザーを用い
ることが可能となり、測定コストの低減化が図れる。
【０２４４】また、一般式［Ｉ］の化合物のストークス
シフトが１００ｎｍ以上あり、励起光と蛍光とを完全に
分離でき、Ｓ／Ｎ比の大きな高感度検出が可能であり、
測定の自動化を進める上で特に効果的である。
【０２４５】更に、電気泳動により展開したゲル中の核
酸及び核酸断片の検出をタングステンランプ等の光源で
十分行うことができ、人体に有害である紫外線を浴びる
ことなく感度良くＤＮＡの検出をすることができる。そ
の際、エチジウムブロマイドよりも一桁以上検出感度が
高く、Ｓ／Ｎ比も良く、また、ＤＮＡの濃度に依存した
蛍光強度の増大が広い領域で得られ、広い濃度領域の検
出が行える。
【０２４６】更に、溶液系のハイブリダイゼーション反
応において、プローブと標的核酸のハイブリッド体の検
出に本発明の染色剤を用いると、一般式［Ｉ］の化合物
が核酸塩基対のインターカレーターとして機能して、二
本鎖核酸にインターカレートすると二本酸核酸との相互
作用により蛍光強度が遊離の状態に比べて例えば化合物
１では最大４００倍増大するのでＢ／Ｆ分離を行うこと
なくハイブリッド体の検出を行うことができ、ＰＣＲの
増幅産物の検出等が非常に簡便にできる。またハイブリ
ッド体を安定化できるので安定した分析が可能となる。
【０２４７】更に、生物試料染色用色素として、本発明
に係る一般式［Ｉ］の化合物を用いると、従来法に比べ
て、固定、洗浄操作が省略または大幅に簡略化された生
物試料の大量処理に好適な蛍光染色法を提供することが
可能となった。さらに、本発明では、生物試料の固定操
作を省略できるので、生きた状態やより自然な形態での
蛍光観察が可能となり、また同一試料の培養における経
時的な蛍光観察も可能となった。更に、蛍光染色による
長期保存標本の作製が達成された。また、染色体の分染
においては、これまでの色素と分染パターンが異る蛍光
色素による分染方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３における吸収ピークの移動を示す図で
あり、ＡはＤＮＡの非存在下での吸収スペクトルを、Ｂ
はＤＮＡの存在下（５０μｇ／ｍｌ）での吸収スペクト
ルを示す。
【図２】実施例３で得られた蛍光スペクトルを示す図で
あり、ＡはＤＮＡ非存在下、ＢはＤＮＡの存在下（５０
μｇ／ｍｌ）における蛍光スペクトルを示す。
【図３】実施例３及び比較例１で得られたＤＮＡ濃度に
対する蛍光強度の変化を示すグラフである。
【図４】実施例３及び比較例１で得られたＤＮＡ濃度に
対する蛍光強度の変化を示すグラフである。
【図５】実施例８における吸収ピークの移動を示す図で
あり、ＡはＤＮＡの非存在下での吸収スペクトルを、Ｂ
はＤＮＡの存在下（５０μｇ／ｍｌ）での吸収スペクト
ルを示す。
【図６】実施例８で得られた蛍光スペクトルを示す図で
あり、ＡはＤＮＡ非存在下、ＢはＤＮＡの存在下（５０
μｇ／ｍｌ）における蛍光スペクトルを示す。
【図７】実施例９における吸収ピークの移動を示す図で
あり、ＡはＤＮＡの非存在下での吸収スペクトルを、Ｂ
はＤＮＡの存在下（５０μｇ／ｍｌ）での吸収スペクト
ルを示す。
【図８】実施例９で得られた蛍光スペクトルを示す図で
あり、ＡはＤＮＡ非存在下、ＢはＤＮＡの存在下（５０
μｇ／ｍｌ）における蛍光スペクトルを示す。
【図９】実施例１０における吸収ピークの移動を示す図
であり、ＡはＤＮＡの非存在下での吸収スペクトルを、
ＢはＤＮＡの存在下（５０μｇ／ｍｌ）での吸収スペク
トルを示す。
【図１０】実施例１０で得られた蛍光スペクトルを示す
図であり、ＡはＤＮＡの非存在下、ＢはＤＮＡの存在下
（１０μｇ／ｍｌ）、ＣはＤＮＡ存在下（５μｇ／ｍ
ｌ）における蛍光スペクトルを示す。
【図１１】実施例１０で得られたＤＮＡ濃度に対する蛍
光強度の変化を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 335/02 Ｃ０７Ｄ 335/02 345/00 345/00 (31)優先権主張番号 特願平5−266866 (32)優先日 平成５年10月26日(1993．10．26) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (72)発明者 富田 佳紀 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キ ヤノン株式会社内 (72)発明者 宮崎 健 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キ ヤノン株式会社内 (56)参考文献 特開 昭59−133460（ＪＰ，Ａ) ＣＹＴＯＭＥＴＲＹ，ＶＯＬ．５，Ｎ Ｏ．４，（1984），ｐ．339−347，2001 年９月15日 ＢＥＲ．ＢＵＮＳＥＮＧＥＳ．ＰＨＹ Ｓ．ＣＨＥＭ．，ＶＯＬ．96．ＮＯ. ７，（1992），ｐ．８，2001年９月15日 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/50 C09B 57/00 C12Q 1/68 G01N 33/48 C07D 309/34 C07D 335/02 C07D 345/00

Claims (45)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ２本鎖核酸を検出する方法であって、 下記一般式［Ｉ］で示されるピリリウム化合物を２本鎖
    核酸を含む生物試料と混合し、該ピリリウム化合物をイ
    ンターカレーターとして該２本鎖核酸に取り込ませる工
    程； 該ピリリウム化合物がインターカレーターとして取り込
    まれた該２本鎖核酸に、該２本鎖核酸に取り込まれた状
    態の該ピリリウム化合物が十分な吸収を示し、 かつ十分励起可能な波長の光を含む 光を照射して該２本
    鎖核酸に取り込まれた該ピリリウム化合物を励起させる
    工程；及び該２本鎖核酸中にインターカレートし、かつ
    前記光の照射で励起された状態にあるピリリウム化合物
    から発せられる蛍光を検出する工程； を有することを特徴とする２本鎖核酸の検出方法。 【化１】 （上記一般式［Ｉ］において、 【化２】 は、複素環を示し、ＸはＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであ
    り、ピリリウム環もしくはピリリウム類似環を示し、 Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原
    子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ
    基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換
    もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換ア
    リール基、置換もしくは未置換低級アルアルキル基また
    は置換もしくは未置換シクロアルキル基を示し、 Ｒ3は、−Ａまたは−Ｌ−Ａであり、 Ｌは、−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ4−Ｌ5−Ｌ6−
    であり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝Ｃ
    Ｈ）−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される
    ２価の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または
    −ＣＨ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基を有する環構造を示す）
    を表わし、 Ａは、置換もしくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ
    5（Ｒ5は、置換もしくは未置換複素環、置換もしくは未
    置換シクロアルキル基または置換もしくは未置換芳香環
    を示す）を表わし、 Ｘを含むピリリウム環もしくはその類似環のＲ1、Ｒ2、
    Ｒ3が結合していない炭素原子に結合している水素原子
    は、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリ
    ル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シ
    アノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もし
    くは未置換アリール基または置換もしくは未置換低級ア
    ルアルキル基で置換されていても良く、 Ｙ-はアニオンを示す。）
  2. 【請求項２】 Ｒ1、Ｒ2及びＲ3から選ばれる２つの置
    換基が、置換もしくは未置換のアリール基である請求項
    １に記載の２本鎖核酸の検出方法。
  3. 【請求項３】 該一般式［Ｉ］においてＸを含む複素環
    が６員環である請求項１に記載の２本鎖核酸の検出方
    法。
  4. 【請求項４】 該６員環において２位と４位が置換もし
    くは未置換のアリール基で置換され、３位、５位及び６
    位のいずれかがＲ3で置換されている請求項３の２本鎖
    核酸の検出方法。
  5. 【請求項５】 該６員環において３位と５位が置換もし
    くは未置換のアリール基で置換され、２位、４位及６位
    のいずれかがＲ3で置換されている請求項３の２本鎖核
    酸の検出方法。
  6. 【請求項６】 該６員環において２位と６位が置換もし
    くは未置換のアリール基で置換され、３位、４位及び５
    位のいずれかがＲ3で置換されている請求項３の２本鎖
    核酸の検出方法。
  7. 【請求項７】 −Ｌ−が、下記一般式［ＩＩ］、［ＩＩ
    Ｉ］、［ＩＶ］、［Ｖ］または［ＶＩ］で表わされる基
    である請求項１に記載の２本鎖核酸の検出方法。 【化３】 （上記一般式［ＩＩ］中、Ｚは水素原子または置換もし
    くは未置換低級アルキル基を表し、ｎは０、１または２
    である。） 【化４】 （上記一般式［ＩＩＩ］中、ｎは０、１または２であ
    り、Φは置換もしくは未置換ｏ−、ｍ−またはｐ−フェ
    ニレン基を表わす。） 【化５】 （上記一般式［ＩＶ］中、Φは置換もしくは未置換ｏ
    −、ｍ−またはｐ−フェニレン基を表わす。） 【化６】 【化７】
  8. 【請求項８】 該ピリリウム化合物が下記式で示される
    構造を有する請求項１に記載の２本鎖核酸の検出方法。 【化８】 （上記式中ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ又はＴｅであって、Ｒ1、
    Ｒ2及びＲ3から選ばれる２つの置換基は置換もしくは未
    置換のアリール基であり、残りの置換基は、水素原子、
    ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル
    基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シア
    ノ基、置換もしくは未置換のアルキル基、または置換も
    しくは未置換のシクロアルキル基、または−Ａまたは−
    Ｌ−Ａであり、 Ｌは、−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ4−Ｌ5−Ｌ6−
    であり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝Ｃ
    Ｈ）−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される
    ２価の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または
    −ＣＨ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基を有する環構造を示す）
    を表わし、 Ａは、置換もしくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ
    5（Ｒ5は、置換もしくは未置換複素環、置換もしくは未
    置換シクロアルキル基または置換もしくは未置換芳香環
    を示す）を表わし、 Ｙ-はアニオンを示す。）
  9. 【請求項９】 該ピリリウム化合物が下記の構造を有す
    る請求項８の２本鎖核酸の検出方法。 【化９】 （上記一般式中、ＸはＯまたはＳを表し、Ｙ-はアニオ
    ンを表す。）
  10. 【請求項１０】 該ピリリウム化合物が下記の構造を有
    する請求項８の２本鎖核酸の検出方法。 【化１０】 （上記一般式中、ＸはＯまたはＳを表し、Ｙ-はアニオ
    ンを表す。）
  11. 【請求項１１】 該生物試料がアガロースゲル電気泳動
    またはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離さ
    れた２本鎖核酸または２本鎖核酸断片である請求項１に
    記載の２本鎖核酸の検出方法。
  12. 【請求項１２】 該生物試料がプローブと標的核酸が相
    補的に結合したハイブリッド体を含む請求項１に記載の
    ２本鎖核酸の検出方法。
  13. 【請求項１３】 該生物試料がポリメラーゼチェイン反
    応（ＰＣＲ）によって増幅された２本鎖核酸を含む請求
    項１に記載の２本鎖核酸の検出方法。
  14. 【請求項１４】 該生物試料が微生物、生物組織、生物
    組織断片、ヒト細胞、動物細胞または染色体である請求
    項１に記載の２本鎖核酸の検出方法。
  15. 【請求項１５】 該ピリリウム化合物が生理食塩水に溶
    解されている請求項１に記載の２本鎖核酸の検出方法。
  16. 【請求項１６】 該生物試料が固定されていない請求項
    １に記載の２本鎖核酸の検出方法。
  17. 【請求項１７】 該固定されていない生物試料が、生き
    ている状態の微生物、生きている状態のヒト細胞または
    生きている状態の動物細胞である請求項１６に記載の２
    本鎖核酸の検出方法。
  18. 【請求項１８】 該ピリリウム化合物が培養液に加えら
    れている請求項１に記載の２本鎖核酸の検出方法。
  19. 【請求項１９】 前記ピリリウム化合物が下記式： 【化９４】 （上記各式において、ＹはＣＩＯ4またはＩを示し、Ｘ
    はＳまたはＯを示す。）で表わされる化合物の少なくと
    も１つである請求項１に記載の２本鎖核酸の検出方法。
  20. 【請求項２０】 試料中の、所定の塩基配列を有する１
    本鎖標的核酸の検出に用いるプローブであって、該塩基
    配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸と、該核酸
    に共有結合する下記一般式［Ｉ］で示されるピリリウム
    化合物とを有することを特徴とするプローブ。 【化６８】 （上記一般式［Ｉ］において、 【化６９】 は、複素環を示し、ＸはＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであ
    り、ピリリウム環もしくはピリリウム類似環を示し、 Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原
    子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ
    基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換
    もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換ア
    リール基、置換もしくは未置換低級アルアルキル基また
    は置換もしくは未置換シクロアルキル基を示し、 Ｒ3は、−Ａまたは−Ｌ−Ａであり、 Ｌは、−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ4−Ｌ5−Ｌ6−
    であり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝Ｃ
    Ｈ）−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される
    ２価の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または
    −ＣＨ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基を有する環構造を示す）
    を表わし、 Ａは、置換もしくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ
    5（Ｒ5は、置換もしくは未置換複素環、置換もしくは未
    置換シクロアルキル基または置換もしくは未置換芳香環
    を示す）を表わし、 Ｘを含むピリリウム環もしくはその類似環のＲ1、Ｒ2、
    Ｒ3が結合していない炭素原子に結合している水素原子
    は、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリ
    ル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シ
    アノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もし
    くは未置換アリール基または置換もしくは未置換低級ア
    ルアルキル基で置換されていても良く、 Ｙ-はアニオンを示す。）
  21. 【請求項２１】 該ピリリウム化合物が下記一般式で示
    される構造を有する請求項２０に記載のプローブ。 【化７０】 （上記式中ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ又はＴｅであって、Ｒ1、
    Ｒ2及びＲ3から選ばれる２つの置換基は置換もしくは未
    置換のアリール基であり、残りの置換基は、水素原子、
    ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル
    基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シア
    ノ基、置換もしくは未置換のアルキル基、または置換も
    しくは未置換のシクロアルキル基、または−Ａまたは−
    Ｌ−Ａであり、 Ｌは、−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ4−Ｌ5−Ｌ6−
    であり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝Ｃ
    Ｈ）−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される
    ２価の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または
    −ＣＨ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基を有する環構造を示す）
    を表わし、 Ａは、置換もしくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ
    5（Ｒ5は、置換もしくは未置換複素環、置換もしくは未
    置換シクロアルキル基または置換もしくは未置換芳香環
    を示す）を表わし、 Ｙ-はアニオンを示す。）
  22. 【請求項２２】 該ピリリウム化合物が下記の構造を有
    する請求項２１に記載のプローブ。 【化７１】 （上記一般式中、ＸはＯまたはＳを表し、Ｙ-はアニオ
    ンを表す。）
  23. 【請求項２３】 該ピリリウム化合物が下記の構造を有
    する請求項２１に記載のプローブ。 【化７２】 （上記一般式中、ＸはＯまたはＳを表し、Ｙ-はアニオ
    ンを表す。）
  24. 【請求項２４】 生物試料中の、所定の塩基配列を有す
    る１本鎖標的核酸を検出する方法であって、 該塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する１本鎖核
    酸と、下記一般式［Ｉ］で示される、該１本鎖核酸に結
    合しているピリリウム化合物とを有するプローブを用意
    する工程； 該プローブと該１本鎖標的核酸を含む試料とを混合し、
    該プローブと該１本鎖標的核酸を結合させて、該ピリリ
    ウム化合物がインターカレーターとして取り込まれた２
    本鎖ハイブリッドを形成する工程；及び該ピリリウム化
    合物がインターカレーターとして取り込まれた該２本鎖
    ハイブリッドに、該２本鎖ハイブリッドに取り込まれた
    状態の該ピリリウム化合物が十分な吸収を示し、かつ十
    分励起可能な波長の光を含む光を照射して該２本鎖ハイ
    ブリッドに取り込まれた該ピリリウム化合物を励起させ
    る工程；及び該２本鎖ハイブリッド中にインターカレー
    トし、かつ前記光の照射で励起された状態にあるピリリ
    ウム化合物から発せられる蛍光を検出する工程； を有することを特徴とする１本鎖標的核酸の検出方法。 【化７３】 （上記一般式［Ｉ］において、 【化７４】 は、複素環を示し、ＸはＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであ
    り、ピリリウム環もしくはピリリウム類似環を示し、 Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原
    子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ
    基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換
    もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換ア
    リール基、置換もしくは未置換低級アルアルキル基また
    は置換もしくは未置換シクロアルキル基を示し、 Ｒ3は、−Ａまたは−Ｌ−Ａであり、 Ｌは、−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ4−Ｌ5−Ｌ6−
    であり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝Ｃ
    Ｈ）−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される
    ２価の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または
    −ＣＨ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基を有する環構造を示す）
    を表わし、 Ａは、置換もしくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ
    5（Ｒ5は、置換もしくは未置換複素環、置換もしくは未
    置換シクロアルキル基または置換もしくは未置換芳香環
    を示す）を表わし、 Ｘを含むピリリウム環もしくはその類似環のＲ1、Ｒ2、
    Ｒ3が結合していない炭素原子に結合している水素原子
    は、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリ
    ル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シ
    アノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もし
    くは未置換アリール基または置換もしくは未置換低級ア
    ルアルキル基で置換されていても良く、 Ｙ-はアニオンを示す。）
  25. 【請求項２５】 該ピリリウム化合物が下記一般式で示
    される構造を有する請求項２４に記載の１本鎖標的核酸
    の検出方法。 【化７５】 （上記式中ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ又はＴｅであって、Ｒ1、
    Ｒ2及びＲ3から選ばれる２つの置換基は置換もしくは未
    置換のアリール基であり、残りの置換基は、水素原子、
    ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル
    基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シア
    ノ基、置換もしくは未置換のアルキル基、または置換も
    しくは未置換のシクロアルキル基、または−Ａまたは−
    Ｌ−Ａであり、 Ｌは、−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ4−Ｌ5−Ｌ6−
    であり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝Ｃ
    Ｈ）−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される
    ２価の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または
    −ＣＨ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基を有する環構造を示す）
    を表わし、 Ａは、置換もしくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ
    5（Ｒ5は、置換もしくは未置換複素環、置換もしくは未
    置換シクロアルキル基または置換もしくは未置換芳香環
    を示す）を表わし、 Ｙ-はアニオンを示す。）
  26. 【請求項２６】 該ピリリウム化合物が下記の構造を有
    する請求項２５に記載の１本鎖標的核酸の検出方法。 【化７６】 （上記一般式中、ＸはＯまたはＳを表し、Ｙ-はアニオ
    ンを表す。）
  27. 【請求項２７】 該ピリリウム化合物が下記の構造を有
    する請求項２５に記載の１本鎖標的核酸の検出方法。 【化７７】 （上記一般式中、ＸはＯまたはＳを表し、Ｙ-はアニオ
    ンを表す。）
  28. 【請求項２８】 該試料が微生物、生物組織、生物組織
    断片、ヒト細胞、動物細胞または染色体である請求項２
    ４に記載の１本鎖標的核酸の検出方法。
  29. 【請求項２９】 該試料が固定されていない生物試料で
    ある請求項２４に記載の１本鎖標的核酸の検出方法。
  30. 【請求項３０】 該生物試料が生きた状態にある請求項
    ２９に記載の１本鎖標的核酸の検出方法。
  31. 【請求項３１】 該生きた状態にある生物試料が、生き
    た状態にある生物、生きた状態にある細胞、または生き
    た状態にあるバクテリアである請求項３０に記載の１本
    鎖標的核酸の検出方法。
  32. 【請求項３２】 前記ピリリウム化合物が下記式： 【化９５】 （上記各式において、ＹはＣＩＯ4またはＩを示し、Ｘ
    はＳまたはＯを示す。）で表わされる化合物の少なくと
    も１つである請求項２４に記載の１本鎖標的核酸の検出
    方法。
  33. 【請求項３３】 下記式で表される構造を有することを
    特徴とするピリリウム化合物。 【化７８】 （上記式中、ＸはＯまたはＳを表し、Ｙ-はアニオンを
    表す。）
  34. 【請求項３４】 下記式で表される構造を有することを
    特徴とするピリリウム化合物。 【化７９】 （上記式中、ＸはＯまたはＳを表し、Ｙ-はアニオンを
    表す。）
  35. 【請求項３５】 下記の構造を有するピリリウム化合物
    がインターカレーターとして取り込まれていることを特
    徴とする２本鎖核酸。 【化８２】 （上記一般式中、ＸはＯまたはＳを表し、Ｙ-はアニオ
    ンを表す。）
  36. 【請求項３６】 下記の構造を有するピリリウム化合物
    がインターカレーターとして取り込まれていることを特
    徴とする２本鎖核酸。 【化８３】 （上記一般式中、ＸはＯまたはＳを表し、Ｙ-はアニオ
    ンを表す。）
  37. 【請求項３７】 該核酸が生物試料に含まれている請求
    項３５または３６に記載の２本鎖核酸。
  38. 【請求項３８】 該生物試料が微生物、生物組織、生物
    組織断片、ヒト細胞、動物細胞または染色体である請求
    項３７に記載の２本鎖核酸。
  39. 【請求項３９】 該生物試料が固定されていない請求項
    ３７に記載の２本鎖核酸。
  40. 【請求項４０】 該固定されていない生物試料が、生き
    ている状態にある微生物、生きている状態にあるヒト細
    胞または生きている状態にある動物細胞である請求項３
    ９に記載の２本鎖核酸。
  41. 【請求項４１】 ２本鎖核酸を含む生物試料であって、
    該２本核酸が下記構造式で示されるピリリウム化合物を
    インターカレーターとして取り込んでいることを特徴と
    する生物試料。 【化８６】 （上記一般式中、ＸはＯまたはＳを表し、Ｙ-はアニオ
    ンを表す。）
  42. 【請求項４２】 ２本鎖核酸を含む生物試料であって、
    該２本核酸が下記構造式で示されるピリリウム化合物を
    インターカレーターとして取り込んでいることを特徴と
    する生物試料。 【化８７】 （上記一般式中、ＸはＯまたはＳを表し、Ｙ-はアニオ
    ンを表す。）
  43. 【請求項４３】 該生物試料が微生物、生物組織、生物
    組織断片、ヒト細胞、動物細胞または染色体である請求
    項４１または４２に記載の生物試料。
  44. 【請求項４４】 該生物試料が固定されていない請求項
    ４１または４２に記載の生物試料。
  45. 【請求項４５】 該固定されていない生物試料が、生き
    ている状態にある微生物、生きている状態にあるヒト細
    胞または生きている状態にある動物細胞である請求項４
    ４に記載の生物試料。
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EP93120508A EP0603783B1 (en) 1992-12-21 1993-12-20 Fluorescent stain containing pyrylium salt or its similar salt, detection method of nucleic acid by use of it
EP00112804A EP1052291B1 (en) 1992-12-21 1993-12-20 Fluorescent stain containing pyrylium salt or its similar salt, detection method of nucleic acid by use of it
DE69330818T DE69330818T2 (de) 1992-12-21 1993-12-20 Fluoreszenzfarbstoff, Pyryliumsalze oder ähnhliche Salze enthaltend, Nachweisverfahren von Nukleinsäure durch Verwendung desselben
US08/170,689 US5624798A (en) 1992-12-21 1993-12-21 Detection method of nucleic acid by use of fluorescent pyrylium stain in intercalation into nucleic acids
US08/782,798 US6022961A (en) 1992-12-21 1997-01-13 Fluorescent stain containing pyrylium salt and fluorescent staining method of biological sample

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Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6197556B1 (en) 1991-12-20 2001-03-06 The University Of Chicago Nucleic acid amplification using modular branched primers
JP3247001B2 (ja) * 1992-12-21 2002-01-15 キヤノン株式会社 ピリリウム化合物を用いた２本鎖核酸の検出方法、ピリリウム化合物を含有するプローブ及びそれを用いた標的核酸の検出方法、新規ピリリウム化合物
DE69428855T2 (de) * 1993-09-13 2002-05-02 Canon Kk Bestimmung von Nukleinsäuren durch PCR, Messung der Anzahl von mikrobiellen Zellen, Genen oder Genkopien durch PCR und Kit zu ihrer Verwendung
JPH07233065A (ja) * 1993-12-27 1995-09-05 Canon Inc ピリリウム塩又はピリリウム類似塩を含む光化学治療薬
EP0684239B1 (en) * 1994-05-26 2003-12-10 Canon Kabushiki Kaisha A method for detecting a target substance in a sample, utilizing pyrylium compound
DE69718268D1 (de) * 1996-10-03 2003-02-13 Canon Kk Verfahren zur Detektion von Zielnukleinsäure, Verfahren zu ihrer Quantifizierung und Pyrylium-Verbindungen zur Chemilumineszenz-Analyse
DE69837839T2 (de) 1997-03-07 2007-12-13 Clare Chemical Research LLC, Denver Fluorometrischer Nachweis mit sichtbarem Light
US6914250B2 (en) 1997-03-07 2005-07-05 Clare Chemical Research, Inc. Fluorometric detection using visible light
WO1999044045A1 (en) * 1998-02-27 1999-09-02 Massachusetts Institute Of Technology Single molecule detection with surface-enhanced raman scattering and applications in dna or rna sequencing
DE60016323T2 (de) 1999-07-23 2005-11-24 Canon K.K. Neue Pyrylium Verbindung, Verfahren zu ihrer Herstellung, Nucleinsäure-Färbemittel und markierte Nucleinsäure
US6960432B2 (en) * 1999-07-26 2005-11-01 Canon Kabushiki Kaisha Detection/quantification of targeted nucleotide chains, and detection/quantification of multi-stranded nucleotide chains by fluorescence
US7897140B2 (en) * 1999-12-23 2011-03-01 Health Research, Inc. Multi DTPA conjugated tetrapyrollic compounds for phototherapeutic contrast agents
US6969587B2 (en) * 2000-04-04 2005-11-29 Taylor Paul D Detection of nucleic acid heteroduplex molecules by anion-exchange chromatography
US6458967B1 (en) * 2000-06-26 2002-10-01 The Research Foundation Of State University Of New York Method for preparation of an intermediate dye product
US7050087B2 (en) * 2000-12-06 2006-05-23 Bioview Ltd. Data acquisition and display system and method
AU2003248747A1 (en) 2002-06-27 2004-01-19 Health Research, Inc. Fluorinated chlorin and bacteriochlorin photosensitizers for photodynamic therapy
AU2003249742A1 (en) * 2002-07-02 2004-01-23 Health Research, Inc. Efficient synthesis of pyropheophorbide a and its derivatives
US6841270B2 (en) 2003-04-17 2005-01-11 Canon Kabushiki Kaisha Organic light-emitting device having pyrylium salt as charge transport material
WO2005003719A2 (en) * 2003-06-04 2005-01-13 American National Red Cross Decontamination of biological fluids using diphenylpyrilium compounds
US7332599B2 (en) * 2003-06-06 2008-02-19 North Carolina State University Methods and intermediates for the synthesis of dipyrrin-substituted porphyrinic macrocycles
US7057100B2 (en) * 2003-06-26 2006-06-06 The J.C. Robinson Seed Co. Inbred corn line W23129
JP4458327B2 (ja) * 2003-08-28 2010-04-28 キヤノン株式会社 標的物質の定量方法および該方法に用いるプローブ担体
US7419820B2 (en) * 2003-12-16 2008-09-02 Canon Kabushiki Kaisha Transfer sheet for transferring biologically active substance to culture plate
JP4632400B2 (ja) * 2003-12-16 2011-02-16 キヤノン株式会社 細胞培養用基板、その製造方法、それを用いた細胞スクリーニング法
JP4541731B2 (ja) * 2004-03-12 2010-09-08 キヤノン株式会社 核酸検出方法
JP4183256B2 (ja) * 2004-08-04 2008-11-19 キヤノン株式会社 核酸増幅反応産物の鎖分離方法、核酸増幅反応産物の検出方法
JP4147235B2 (ja) * 2004-09-27 2008-09-10 キヤノン株式会社 吐出用液体、吐出方法、液滴化方法、液体吐出カートリッジ及び吐出装置
JP2006094760A (ja) * 2004-09-29 2006-04-13 Canon Inc 細胞のスクリーニング方法および口腔癌細胞検出方法
US8535914B2 (en) * 2005-01-21 2013-09-17 Canon Kabushiki Kaisha Probe, probe set and information acquisition method using the same
JP4689340B2 (ja) * 2005-05-02 2011-05-25 キヤノン株式会社 吐出用液体医薬組成物
US7678538B2 (en) * 2005-05-13 2010-03-16 American National Red Cross Disinfection of biological fluids using asymmetric cyanine dyes
JP2007010413A (ja) * 2005-06-29 2007-01-18 Canon Inc 核酸ハイブリッドの融点測定方法及びそのための装置
US7642086B2 (en) * 2005-08-09 2010-01-05 Canon Kabushiki Kaisha Labeled probe bound object, method for producing the same and method for using the same
US20090011413A1 (en) * 2005-12-14 2009-01-08 Canon Kabushiki Kaisha Method for screening colon cancer cells and gene set used for examination of colon cancer
US8133668B2 (en) * 2006-03-31 2012-03-13 Canon Kabushiki Kaisha Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
WO2007114517A1 (en) * 2006-03-31 2007-10-11 Canon Kabushiki Kaisha Probe, probe set, probe-immobilized carrier, and genetic testing method
WO2009011674A1 (en) * 2007-07-13 2009-01-22 Western Michigan University Research Foundation Trans-1,2-diphenylethylene derivatives and nanosensors made therefrom
EP2370111B1 (en) 2008-12-25 2014-11-05 Canon Kabushiki Kaisha Probe for a biological specimen and labelling method and screening method using the probe
JP5733734B2 (ja) 2009-02-19 2015-06-10 国立大学法人 千葉大学 成長因子に誘発されるユークロマチン化（ｅｕｃｈｒｏｍａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ）に必要な、ＳＲＣ−ファミリーチロシンキナーゼの核局在
JP5729904B2 (ja) 2009-06-02 2015-06-03 キヤノン株式会社 細胞から蛋白質、ｄｎａ、ｒｎａを調製する方法
CN113072534B (zh) * 2021-04-02 2022-02-08 广西师范大学 一种rna荧光探针及其制备方法和应用
CN113281313B (zh) * 2021-04-16 2023-05-09 安徽大学 实时定量细胞核内rna输出的生物荧光探针及其制备方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3786369A (en) * 1972-12-27 1974-01-15 Eastman Kodak Co Laser dye composition
US4341894A (en) * 1978-03-13 1982-07-27 Eastman Kodak Company Sensitizers for photoconductive compositions
US4840784A (en) * 1982-12-22 1989-06-20 Eastman Kodak Company Use of pyrylium and thiapyrylium compounds as biological stains
US4555396A (en) * 1982-12-22 1985-11-26 Eastman Kodak Company Use of pyrylium and thiapyrylium compounds as biological stains
US4737454A (en) * 1983-07-14 1988-04-12 Molecular Diagnostics, Inc. Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays
US4820630A (en) * 1984-11-23 1989-04-11 Digene Diagnostics, Incorporated Assay for nucleic acid sequences, particularly genetic lesions, using interactive labels
US5011769A (en) * 1985-12-05 1991-04-30 Meiogenics U.S. Limited Partnership Methods for detecting nucleic acid sequences
CA1273552A (en) * 1985-12-23 1990-09-04 Michael J. Heller Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization assays
ATE88761T1 (de) * 1986-01-10 1993-05-15 Amoco Corp Kompetitiver homogener test.
JPH01153683A (ja) * 1987-11-06 1989-06-15 Eastman Kodak Co アミノ置換チオピリリウム化合物
AU622426B2 (en) * 1987-12-11 1992-04-09 Abbott Laboratories Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
US5229297A (en) * 1989-02-03 1993-07-20 Eastman Kodak Company Containment cuvette for PCR and method of use
WO1991009135A1 (en) * 1989-12-18 1991-06-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Tumor-specific, cell surface-binding monoclonal antibodies
CA2033692A1 (en) * 1990-01-25 1991-07-26 Wilhelm Bannwarth Energy transfer systems
US5102784A (en) * 1990-05-04 1992-04-07 Oncor, Inc. Restriction amplification assay
JP2985446B2 (ja) * 1990-10-31 1999-11-29 東ソー株式会社 核酸の検出及び測定方法
US5994056A (en) * 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
JP3247001B2 (ja) * 1992-12-21 2002-01-15 キヤノン株式会社 ピリリウム化合物を用いた２本鎖核酸の検出方法、ピリリウム化合物を含有するプローブ及びそれを用いた標的核酸の検出方法、新規ピリリウム化合物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＢＥＲ．ＢＵＮＳＥＮＧＥＳ．ＰＨＹＳ．ＣＨＥＭ．，ＶＯＬ．９６．ＮＯ．７，（１９９２），ｐ．８，２００１年９月１５日
ＣＹＴＯＭＥＴＲＹ，ＶＯＬ．５，ＮＯ．４，（１９８４），ｐ．３３９−３４７，２００１年９月１５日

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