JP4216267B2 - 環式置換−非対称シアニン染料 - Google Patents

Description

本発明は核酸用の蛍光染料に関するものである。特に本発明は、多様な媒質中の核酸を染色する、飽和または不飽和の環式置換基を有する非対称シアニン染料から誘導される染料に関するものである。

生物学、生物医学、遺伝、発酵、水産養殖、農業、法律および環境に関する研究を含めた生命科学研究の多くの分野で、単離されたものおよび細胞内のもの双方の核酸を、標準実験法のルーティンな構成要素として同定する必要がある。このような用途は細胞膜に結合している（または囲まれている）場合、たとえば生細胞ですら、核酸を検出しうる、迅速、高感度かつ選択的な方法を必要とする。さらに細胞または微生物の混合集団からの細胞を生存率および／またはグラム符号の双方に関して分析することは、標準実験法のルーティンな構成要素である。
核酸の遺伝的役割が確立される以前に特定の非対称シアニン染料がまず報告された（ブルッカー（Ｂｒｏｏｋｅｒ）ら，Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．６４，１９９（１９４２））が、現在では多様な非対称シアニン染料がＤＮＡおよびＲＮＡの蛍光染色に極めて有効であることが認められている。チアゾールオレンジとして市販されている化合物は、未成熟血球または網状赤血球の定量分析に際して（米国特許第４，８８３，８６７号明細書、リーら（１９８９））、または有核血球をほとんど染色せずに、血液由来の寄生体の核酸を優先的に染色する際に（米国特許第４，９３７，１９８号明細書、リーら（１９９０））、特に有利である。

チアゾールオレンジおよびこれに類するチオフラビン染料は多くの哺乳動物細胞に対して透過性であるが、ある種類の真核細胞に対しては不透過性である。

本発明によれば、以下が提供される：
（１）次式の化合物：

［式中：Ｒ^１はそれぞれＨであり；Ｒ^２は１−６個の炭素を有するアルキル基であり；ＸはＯまたはＳであり；ｎ＝０、１または２であり；Ｚ⁻は生物学的に適合性の対抗イオンであり；Ｑは式Ｑ１またはＱ２を有し：

これらの式中のＹは−ＣＲ^３＝ＣＲ^４−であり；ｐおよびｍ＝０または１であり、かつｐ＋ｍ＝１であり；Ｒ^５は１−６個の炭素を有するアルキル基であるか；またはＲ^５はＯＭＥＧＡであり；Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６およびＲ^７は同一でも異なってもよく、独立してＨ；または１−６個の炭素を有するアルキル基；またはハロゲン；または−ＯＳＯ_２Ｒ^１９（ここでＲ^１９は１−６個の炭素を有するアルキル、１−６個の炭素を有するペルフルオロアルキル、またはアリールである）；またはＯＭＥＧＡ；または−ＯＨ、−ＯＲ^８、−ＳＲ^８、−（ＮＲ^８Ｒ^９）（ここでＲ^８およびＲ^９は同一でも異なってもよく、独立してＨ；または１−６個の炭素を有するアルキル基；または１−２個の脂環、脂肪族複素環、芳香環もしくは芳香族複素環であり、これらは１−４個の異種原子を含み、これらの異種原子はＯ、ＮもしくはＳであり；あるいはＲ^８とＲ^９は合わせて−（ＣＨ_２）_２−Ｌ−（ＣＨ_２）_２−であり、ここでＬは単結合、−Ｏ−、−ＣＨ_２−または−ＮＲ^１０−であり、ここでＲ^１０はＨまたは１−６個の炭素を有するアルキル基である）であり；ｔ＝１−４であり；あるいはＲ^６とＲ^７は合わせて−（ＣＨ_２）_ｖ−（ここでｖ＝３または４である）であるか、またはＲ^６とＲ^７は式Ｑ２による縮合芳香環を形成し；Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３およびＲ^１４は同一でも異なってもよく、独立してＨ；または１−６個の炭素を有するアルキル基；またはハロゲン；またはＯＭＥＧＡ；または−ＯＨ、−ＯＲ^８、−ＳＲ^８、もしくは−（ＮＲ^８Ｒ^９）であり；ＯＭＥＧＡは、飽和または不飽和の、置換された、または置換されていない環式置換基であり、これは１−２個の脂環、脂肪族複素環、芳香環もしくは芳香族複素環（これらは１−４個の異種原子を含み、これらの異種原子はＯ、ＮまたはＳである）中に合計２−１６個の環炭素原子を有し、これは置換されていないか、または所望により独立してハロゲン、アルキル、ペルフルオロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシもしくはカルボキシアルキル（１−６個の炭素を有する）により１または２回以上置換されており、かつこれはＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３またはＲ^１４として単結合により結合しており；かつＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３およびＲ^１４のうち少なくとも１個はＯＭＥＧＡであり、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３およびＲ^１４のうち２個以上がＯＭＥＧＡである場合、それぞれのＯＭＥＧＡは所望により同一か、または異なる］。
（２）ｍ＝１であり、かつＲ^５がＯＭＥＧＡである、項目（１）に記載の化合物。
（３）Ｒ^４がＨであるか；またはＲ^４が１−６個の炭素を有するアルキル基；もしくはハロゲンであるか；またはＲ^４が−ＯＨ、−ＯＲ^８、−ＳＲ^８、−（ＮＲ^８Ｒ^９）であるか；またはＲ^４が−ＯＳＯ_２Ｒ^１９であるか；またはＲ^４がＯＭＥＧＡである、項目（２）に記載の化合物。
（４）ｎ＝０または１であり、かつＯＭＥＧＡがフェニルまたは置換フェニルである、項目（３）に記載の化合物。
（５）Ｒ^４がハロゲンまたは−ＯＳＯ_２Ｒ^１９である、項目（３）に記載の化合物。
（６）Ｒ^４が−ＳＲ^８または−（ＮＲ^８Ｒ^９）である、項目（３）に記載の化合物。
（７）置換されたベンゾチアゾリウム、ベンゾオキサゾリウム、ベンゾセレナゾリウム、ベンゾイミダゾリウムまたはジアルキルインドリニウムである第１複素環系を含み；この第１環系の２位において、モノメチン、トリメチンまたはペンタメチン架橋部分により、置換されたピリジニウムまたはキノリニウムである第２複素環系の２位または４位に結合しており、第２環系の１個または２個以上の置換基がＯＭＥＧＡであり、ＯＭＥＧＡが飽和または不飽和の、置換された、または置換されていない環式置換基であり、これは１−２個の脂環、脂肪族複素環、芳香環もしくは芳香族複素環（これらは１−４個の異種原子を含み、これらの異種原子はＯ、ＮもしくはＳである）中に合計２−１６個の環炭素原子を有する、環式置換−非対称シアニン染料。
（８）第１複素環系が置換されたベンゾチアゾリウムまたはベンゾオキサゾリウムであり、この第１環系がその芳香族窒素において低級アルキルにより置換されている、項目（７）に記載のシアニン染料。
（９）第２環系がさらに独立して水素、飽和もしくは不飽和の低級アルキル、ハロゲン、エーテル、チオエーテル、置換もしくは非置換アミノ、ＯＭＥＧＡ、またはスルホネートエステルにより置換されている、項目（７）または（８）に記載のシアニン染料。
（１０）第２環系が環窒素においてＯＭＥＧＡにより置換された４−キノリニウムである、項目（７）または（８）に記載のシアニン染料。
（１１）ＯＭＥＧＡが置換または非置換フェニルである、項目（７）または（８）に記載のシアニン染料。
（１２）ＯＭＥＧＡに隣接する置換基が水素；飽和もしくは不飽和アルキル；ハロゲン；エーテル；チオエーテル；置換もしくは非置換アミノ；またはスルホネートエステルである、項目（１０）に記載のシアニン染料。
（１３）ＯＭＥＧＡに隣接する置換基がハロゲンまたはスルホネートエステルである、項目（１２）に記載のシアニン染料。
（１４）ＯＭＥＧＡに隣接する置換基がチオエーテルまたは置換もしくは非置換アミノである、項目（１２）に記載のシアニン染料。
（１５）核酸および項目（１）−（１４）のいずれか１項に記載の染料化合物１分子または２分子以上を含む蛍光性コンプレックス。
（１６）試料中の核酸の染色法であって、ａ）核酸を含有する、または含有すると考えられる試料を項目（１）−（１４）のいずれか１項に記載の環式置換−非対称染料化合物と混和し；
ｂ）染料化合物が試料中の核酸と結合して、検出可能な蛍光信号を発する核酸−染料コンプレックスを形成するのに十分な期間、試料をインキュベートし；
ｃ）この核酸−染料コンプレックスの検出可能な蛍光信号を観察することを含む方法。
（１７）核酸が生物構造体に内包されている、項目（１６）に記載の試料中の核酸の染色方法。
（１８）核酸が溶液中にある、項目（１６）に記載の試料中の核酸の染色方法。
（１９）さらに核酸または核酸−染料コンプレックスを電気泳動により分離することを含む、項目（１６）または（１８）に記載の方法。
（２０）さらに、電気泳動の前または後に、項目（１）−（１４）に記載の染料化合物をゲルと混和することを含む、項目（１９）に記載の方法。
（２１）核酸が固体または半固体支持体に固定化されている、項目（１６）に記載の試料中の核酸の染色方法。
（２２）さらに、試料を１種または２種以上の単独または組み合わせた追加染料と混和することを含み；その際少なくとも１種の追加染料が細胞に対して透過性または不透過性である蛍光性の核酸用染料であり；他の追加染料がグラム陽性菌またはグラム陰性菌に対して選択的に透過性であり；かつその際、各追加染料が照明に対して他の染料のものと検出可能な程度に異なる蛍光応答を示す、項目（１７）に記載の方法。
（２３）核酸用染料が無傷の膜を有する細胞に対しては不透過性である、項目（２２）に記載の方法。
（２４）不透過性の核酸用染料がエチジウム、エチジウムダイマー、プロピジウムなどのフェナントリジウムモノマーもしくはダイマー誘導体であるか；またはＴＯＴＯ、ＹＯＹＯ、ＰＯＰＯ、ＢＯＢＯ、ＴＯ−ＰＲＯ、ＹＯ−ＰＲＯ、ＢＯ−ＰＲＯ、ＰＯ−ＰＲＯなどのベンザゾリウムモノマーもしくはダイマー誘導体である、項目（２３）に記載の方法。
（２５）核酸用染料が細胞に対して透過性であるか、またはグラム陽性菌に対して選択的に透過性であり、Ｃ_４−Ｃ_８アルキル置換−フェナントリジウムまたはヘキスト３３２５８もしくはヘキスト３３３４２、またはＤＡＰＩである、項目（２２）に記載の方法。
（２６）さらに、試料を１種または２種以上の単独または組み合わせた追加染料と混和することを含み；その際少なくとも１種の追加染料が、核酸ではないか、または酵素基質ではない細胞構造体を選択的に染色する分子量２０００未満の蛍光性染料であり；かつその際、各追加染料が照明に対して他の染料のものと検出可能な程度に異なる蛍光応答を示す、項目（１６）、（１７）または（２２）−（２５）のいずれか１項に記載の方法。
（２７）細胞構造体が細胞膜、蛋白質、液胞、ミトコンドリア、ゴルジ装置、小胞体、細胞質、リソソーム、または糖類もしくは多糖類である、項目（２６）に記載の方法。
（２８）さらに、試料を１種または２種以上の単独または組み合わせた追加染料と混和することを含み；その際少なくとも１種の追加染料が蛍光性ペプチドまたは蛋白質であり、その際蛋白質は抗体、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡまたはプロテインＧであり；かつその際、各追加染料が照明に対して他の染料のものと検出可能な程度に異なる蛍光応答を示す、項目（１６）、（１７）または（２２）−（２５）のいずれか１項に記載の方法。
（２９）さらに、試料を１種または２種以上の単独または組み合わせた追加染料と混和することを含み；その際少なくとも１種の追加染料が細胞内酵素に対する蛍光原基質であり；かつその際、該基質が酵素の作用後に照明に対して他の染料のものと検出可能な程度に異なる蛍光応答を示す、項目（１６）、（１７）または（２２）−（２５）のいずれか１項に記載の方法。
（３０）細胞内酵素が加水分解酵素、酸化酵素または還元酵素である、項目（２９）に記載の方法。
（３１）さらに、照明に対する染料の蛍光応答がフローサイトメーター、蛍光測定器もしくは蛍光プレート読取り装置、または蛍光顕微鏡を用いて検出される、項目（２２）−（２５）のいずれか１項に記載の方法。
（３２）次式の化合物：

［これらの式中：Ｒ^５はＯＭＥＧＡであり；Ｂはメチルであり；Ｒ^３、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３およびＲ^１４は独立してＨ、または１−６個の炭素を有するアルキル基であり；Ｒ^４はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉまたは−ＯＳＯ_２Ｒ^１９であり、ここでＲ^１９は１−６個の炭素を有するアルキル、または１−６個の炭素を有するペルフルオロアルキル、またはアリールである］。
（３３）次式の化合物：

または次式の化合物：

［これらの式中：Ｒ^５はＯＭＥＧＡであり；Ｂはメチルであり；Ｒ^３、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３およびＲ^１４は独立してＨ、または１−６個の炭素を有するアルキル基であり；Ｒ^４はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉまたは−ＯＳＯ_２Ｒ^１９であり、ここでＲ^１９は１−６個の炭素を有するアルキル、または１−６個の炭素を有するペルフルオロアルキル、またはアリールである］。

本発明者らは、母体である非対称シアニンに種々の環式構造を結合させると、一群の優れた核酸染料が得られることを見出した。意外にも、これらの新規染料はより嵩高であるが、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の双方、酵母、ならびに真核細胞および原核細胞を含めた、より多様な細胞タイプの細胞膜をより速やかに透過する。本発明の染料は、核酸の分離に用いられる電気泳動ゲルをも、より迅速に染色する。既知の染料、たとえばチアゾールオレンジとの細胞内取り込み速度の直接比較は、新規化合物の取り込みが向上していることを示す（表１）。細胞透過性が要因ではない用途においてすら、これらの染料の大部分の量子収量はチアゾールオレンジのものより予想外に、かつ著しく良好である（表２）。
さらに、簡単な合成変法により、大部分の可視および近赤外スペクトルを網羅する吸光および発光スペクトル特性を備えた一群の染料を製造することができる。本発明染料の向上した蛍光特性は、あらゆる分野の核酸研究において細胞性または非細胞性核酸の検出に著しい利点をもたらす。これらの染料は、たとえば細胞を識別し、および／または生存率を判定するために、他の染料と併用した場合に特に有用である。

装填時間は、最大蛍光の半分に達するのに要した時間（Ｔ_０．５）、および平衡状態で測定した蛍光の９５％に達するのに要した時間（Ｔ_０．９５）として表される。

１．５０μＭ ｂｐのＤＮＡ（ＲＮＡの塩基）−対−１μＭの染料（標準溶液）の標準比率で、トリス緩衝−生理的食塩水（１０ｍＭトリス塩基、１ｍＭＥＤＴＡおよび５０ｍＭ ＮａＣｌ）（ｐＨ７．４）中において、分光光度計（吸光）により、または蛍光測定器（発光）により、１０倍少ない量の染料および核酸を用いて得られたもの２．分配係数（Ｋ_ｐ）：サイトフルオル（ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ）ミクロタイタープレート蛍光読取り装置を用いて測定された、ＤＮＡ濃度の逆数に対する蛍光増大の逆数のプロットの線形調整により判定されたもの３．ＤＮＡ（ｐＨ１０に調整したトリス緩衝−生理的食塩水中の標準溶液）における染料の量子収量（ＱＹ）をフルオレセイン（フルオレセインは試験条件下で０．９２の量子収量をもつと推定される）と比較したもの４．光漂白（Ｐ．Ｂ．）：新規染料からの残留蛍光を等しい条件下でのフルオレセインの場合と比較したものとして表される。トリス緩衝−生理的食塩水中の０．０５ＯＤ標準溶液を４８５ｎｍ（ｅｘ．バンド幅２０ｎｍ）で照明し、０分および３０分の時点で蛍光を測定する。３０分後の新規染料のフラクションを等しい条件下でのフルオレセインのフラクションで割ったもの５．蛍光増大（Ｆ．Ｅ．）：標準溶液の蛍光を核酸の不在下での同一染料の蛍光で割ったもの。
本発明の環式置換−非対称シアニン染料は水溶液中に希釈した場合、実質的に非蛍光性である。しかし核酸ポリマー、たとえばＤＮＡおよびＲＮＡと結合すると、得られる染料−核酸コンプレックスは照明した際に著しい蛍光性となる。本発明の染料は透過性が高く、多様な固体または液体試料中、特に細胞およびゲル中の核酸を標識する。これらの染料は、細胞の種々の特性、たとえば生存率、グラム符号または抗体染色性を識別するために、所望により他の検出試薬と組み合わせて用いられる。

本発明の染料は３部分からなる：１）置換ベンザゾリウム環系である第１複素環系、２）連結メチン橋、および３）ピリジニウムまたはキノリニウム環系である第２複素環系であって、その１または２以上の位置が飽和または不飽和の、置換された、または置換されていない環式置換基で置換されているもの。これらの２環系は、所望によりさらに、独立して低級アルキル、エーテル、チオエーテル、置換もしくは非置換アミン、スルホネートエステル、ハロ、または環式置換基で置換されている。好ましくは第２複素環系の環窒素は環式置換基を含み、これに隣接して第２の非水素置換基がある。非水素置換基は、好ましくは他の環式置換基、あるいはハロ、エーテル、チオエーテル、置換もしくは非置換アミン、またはスルホネートエステルなどの置換基である。
本発明の染料の詳細な例は、次式により表される：

この式においては、左側の置換ベンザゾリウム環系がメチン橋により右側のピリジニウムまたはキノリニウム環系（その１または２以上の置換基がＯＭＥＧＡでなければならない）に結合している。
ＯＭＥＧＡは、飽和または不飽和の、置換された、または置換されていない環式置換基であり、これは１−２個の脂環、芳香環、または脂肪族複素環もしくは芳香族複素環（これらは１−４個の異種原子を含み、これらの異種原子はＯ、ＮまたはＳである）中に合計２−１６個の環炭素原子を有し、これはピリジニウムまたはキノリニウム環系に単結合により直接に結合している。ＯＭＥＧＡの例は、置換された、または置換されていないシクロヘキシル類、シクロヘキセニル類、モルホリノ類およびピペリジニル類である。芳香族であるＯＭＥＧＡの例には、置換された、または置換されていないナフチル類、フェニル類、チエニル類、ベンゾチアゾリル類、フラニル類、オキサゾリル類、ベンゾオキサゾリル類、およびピリジニル類が含まれる。ＯＭＥＧＡ上の置換基は、独立して水素、ハロゲン、アルキル、ペルフルオロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシまたはカルボキシアルキル（アルキルはそれぞれ１−６個の炭素を有する）である。ＯＭＥＧＡの好ましい形態は、置換された、または置換されていないナフチル、フェニル、チエニル、モルホリノおよびシクロヘキセニル、より好ましくは置換または非置換フェニルである。
ベンザゾリウム環系上のＲ^１は通常はＨであるが、得られる染料の吸光および発光スペクトルを微細に調節するために１個または２個以上の非水素置換基Ｒ^１の挿入を採用することができる。たとえばＲ^１がメトキシである場合（化合物７７０）、Ｒ^１がＨである匹敵する化合物（化合物６３）と比較してその吸光スペクトルは約１２ｎｍシフトし、その発光スペクトルは約１８ｎｍシフトする（表５）。このベンザゾールは２個以上の置換基Ｒ^１を含むことができ、それらは同一でも異なってもよい（ｔ＝１−４）。各Ｒ^１は所望により１−６個の炭素を有するアルキル基；またはトリフルオロメチル；またはハロゲン；または−ＯＲ^８、−ＳＲ^８、−（ＮＲ^８Ｒ^９）である。ここでＲ^８およびＲ^９は同一でも異なってもよく、独立してＨ；または１−６個の炭素を有するアルキル基；または合計３−１６個の環原子を有する１−２個の脂環、芳香環、もしくは脂肪族複素環もしくは芳香族複素環（これらにおいて異種原子はＯ、ＮまたはＳである）であるか；あるいはＲ^８とＲ^９は合わせて−（ＣＨ_２）_２−Ｌ−（ＣＨ_２）_２−であり、ここでＬは−Ｏ−、−ＮＲ^１０−、−ＣＨ_２−または単結合−であり、ここでＲ^１０はＨまたは１−６個の炭素を有するアルキル基である。一般に本化合物はＨではないＲ^１を２個以上含まない。
置換基Ｒ^２は１−６個の炭素を有するアルキル基、好ましくはメチルまたはエチル、より好ましくはメチルである。
対抗イオンＺ⁻は、安定であり、かつ合成に際し利用しうる、生物学的に適合性のイオンである。Ｚ⁻の例には、特にクロリド、ブロミド、ヨージド、スルフェート、アルカンスルホネート、アリールスルホネート、ホスフェート、ペルクロレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボライド、ナイトレート、および芳香族または脂肪族カルボン酸のアニオンが含まれる。好ましい対抗イオンＺ⁻はクロリド、ヨージド、ペルクロレート、および種々のスルホネートである。
ＸはＯ、Ｓ、ＳｅまたはＮＲ^１５であり、ここでＲ^１５はＨ、または１−６個の炭素を有するアルキル基である。あるいはＸはＣＲ^１６Ｒ^１７であり、ここでＲ^１６およびＲ^１７は同一でも異なってもよく、独立してＨ、もしくは１−６個の炭素を有するアルキル基であるか；またはＲ^１６とＲ^１７は合わせて５員もしくは６員の飽和環を完成する。一般にＲ^１６およびＲ^１７はメチルである。
上記の２個の複素環系は１、３または５個のメチン（−ＣＨ＝）基によって、広範な電子非局在化が可能な状態で結合している。ｎ＝０の場合、染料は非対称モノメチン染料であり；ｎ＝１の場合、染料はトリメチン染料であり；ｎ＝２の場合、染料はペンタメチン染料である。類似の化合物（グリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ），ＣＯＬＯＲ ＡＮＤ ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ，ｐ．２４１（１９７６））と同様に、複素環の間のメチン基の数は染料のスペクトル特性に影響を及ぼす（表３）。
Ｎ−結合置換基Ｒ^５は１−６個の炭素を有するアルキル、アルケニル、ポリアルケニル、アルキニルもしくはポリアルキニル基であるか；またはＲ^５はＯＭＥＧＡである。もっとも一般的にはＲ^５はＯＭＥＧＡである。
第２環系はフラグメントＹ、すなわち−ＣＲ^３＝ＣＲ^４−を含み、添え字ｐおよびｍは０または１であり、かつｐ＋ｍ＝１である。すべての形態につき、環は次式による６員のピリジニウム系複素環を含む：

または

本発明の好ましい形態においては、ｍ＝１およびｐ＝０である（４−ピリジニウム）。
第２複素環系上の置換基、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６およびＲ^７は同一でも異なってもよく、独立してＨ；または１−６個の炭素を有するアルキル、アルケニル、ポリアルケニル、アルキニルもしくはポリアルキニル基；またはハロゲン；または−ＯＨ、−ＯＲ^８、−ＳＲ^８、−（ＮＲ^８Ｒ^９）（前記に定めたもの）；または−ＯＳＯ_２Ｒ^１９（ここでＲ^１９は１−６個の炭素を有するアルキル、１−６個の炭素を有するペルフルオロアルキルまたはアリールである）；またはＯＭＥＧＡ（前記に定めたもの）であるか；あるいはＲ^６とＲ^７は合わせて−（ＣＨ_２）_ｖ−（ここでｖ＝３または４である）であり、縮合５員もしくは６員環を形成し、またはＲ^６とＲ^７は合わせて縮合６員芳香環を形成する。
Ｒ^６とＲ^７が合わせて縮合６員芳香環を形成する場合、本発明の形態は次式によるキノリニウム誘導体である：

この式において、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３およびＲ^１４は同一でも異なってもよく、独立してＨ；または１−６個の炭素を有するアルキル、アルケニル、ポリアルケニル、アルキニルもしくはポリアルキニル基；またはハロゲン；または−ＯＨ、−ＯＲ^８、−ＳＲ^８、もしくは−（ＮＲ^８Ｒ^９）（ここでＲ^８およびＲ^９は前記に定めたものである）；または−ＯＳＯ_２Ｒ^１９（ここでＲ^１９は１−６個の炭素を有するアルキル、１−６個の炭素を有するペルフルオロアルキル、またはアリールである）；またはＯＭＥＧＡである。本発明の好ましい形態は、ｍ＝１およびｐ＝０であるキノリニウム（４−キノリニウム）である。
本発明のすべての形態につき、ピリジニウムまたはキノリニウム環系上の１個または２個以上の置換基はＯＭＥＧＡである。好ましくは１個または２個の置換基がＯＭＥＧＡである。２個以上のＯＭＥＧＡが本発明化合物に結合している場合、これら２個以上のＯＭＥＧＡは同一でも異なってもよい。ピリジニウム環系を含む本発明の形態については、ＯＭＥＧＡは好ましくはＲ^５もしくはＲ^６、または両方である。４−キノリニウム環系を含む本発明の形態については、ＯＭＥＧＡは好ましくはＲ^４もしくはＲ^５、または両方である。２−キノリニウム環系を含む本発明の形態については、ＯＭＥＧＡは好ましくはＲ^５もしくはＲ^１１、または両方である。本発明のすべての形態につき、好ましくはＲ^５はＯＭＥＧＡである。
本発明の１形態は、第２複素環系上にちょうど２個の非水素置換基を含み、それらのうち１個はＯＭＥＧＡである。好ましい１形態においては、Ｒ^５はＯＭＥＧＡであり、Ｒ^５に隣接する置換基（ピリジニウムについてはＲ^６、４−キノリニウムについてはＲ^４、２−キノリニウムについてはＲ^１１）は非水素置換基である。１観点においては、Ｒ^５に隣接する置換基はハロゲンまたは−ＯＳＯ_２Ｒ^１９であり、より好ましくはハロゲンである。他の観点においては、Ｒ^５に隣接する置換基はＯＭＥＧＡである。他の好ましい形態においては、１個の非水素置換基は−ＯＲ^８、−ＳＲ^８または−ＮＲ^８Ｒ^９、好ましくは−ＮＲ^８Ｒ^９である。

合成一般にこれらの染料の合成には３種類の前駆物質が必要である：ベンザゾリウム塩、ピリジニウム（またはキノリニウム）塩（両方とも適宜な置換基を有する）、および（ｎ＝１または２の場合）メチンスペーサーの供給源。これらの化合物を核酸用染料として有用なものとなしうる組み合わせはこれまでに報告されていないが、本発明の誘導体を得るためにこれらの前駆物質を製造および結合するのに必要な化学は一般に当業者に周知である。
ベンザゾリウム部分この型の多様な誘導体が報告されている：ブルッカー（Ｂｒｏｏｋｅｒ）ら，Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．，６４，１９９（１９４２）、ならびにヘイマー（Ｈａｍｅｒ），″シアニン染料および関連化合物″，ＴＨＥ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＨＥＴＥＲＯＣＹＣＬＩＣ ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ，Ｖｏｌ．１８，ワイスバーガー（Ａ．Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇｅｒ）編，インターサイエンス，ニューヨーク（１９６４）。これらの前駆物質は下記の一般式を有する：

ＸはＯ（ベンゾオキサゾリウム）、Ｓ（ベンゾチアゾリウム）、Ｓｅ（ベンゾセレナゾリウム）、Ｎもしくはアルキル置換Ｎ（ベンゾイミダゾリウム）、または２個のアルキル基Ｒ^１６Ｒ^１７により置換された炭素（インドリニウム）（ここでＲ^１６およびＲ^１７は独立して１−６個の炭素を有するアルキル基であるか、またはＲ^１６とＲ^１７は合わせて５員もしくは６員の飽和環を完成する）である。
Ｒ^１は通常はアルキル化剤で四級化する前に母体ベンザゾール分子に取り込まれる。Ｒ^２は通常は母体複素環をＲ^２−Ｚでアルキル化することにより得られ、ここでＲ^２は１−６個の炭素を有するアルキル基であり、そしてＺは得られた染料上でしばしば対抗イオンとなる、負に帯電した基である。Ｚ⁻は生物学的に適合性の対抗イオンであり、さらにこれは安定であり、かつ合成に際し利用しうる。この対抗イオンは当技術分野で知られている方法、たとえばイオン交換樹脂を用いて、または沈殿法により、他の対抗イオンと交換することができる。好ましいＲ^２−Ｚは、Ｒ^２＝メチルを与える化合物、たとえばヨウ化メチルである。
Ａは、その性質がベンザゾリウム系前駆物質とピリジニウム系またはキノリニウム系前駆物質とを結合させるために採用した合成法により決定される置換基である。ｎ＝０である場合、Ａは通常はアルキルチオ、一般にメチルチオであるか、またはＡはクロロ、ブロモもしくはヨードである。ｎ＝１または２である場合、Ａはメチルである。
ピリジニウムまたはキノリニウム部分第２の複素環系前駆物質はピリジニウムまたはキノリニウム塩である。これらは時には対応するピリジンまたはキノリンから、適切なアルキル化剤Ｒ^５−Ｚを用いて窒素においてアルキル化することにより得られる。しかし２−および４−ピリドン類ならびに２−および４−キノロン類がはるかに多用な中間体であり、さらに容易に製造されるという利点を備えている（たとえばＨＥＴＥＲＯＣＹＣＬＩＣ ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ，Ｖｏｌ．４，エルダーフィールド（Ｒ．Ｃ．Ｅｌｄｅｒｆｉｅｌｄ）編，ジョン・ワイリイ・アンド・サンズ・インコーポレーテッド（１９５２），ｐ．１−３３１、またはワウゾネク（Ｗａｗｚｏｎｅｋ）ら，Ｊ．ＨＥＴＥＲＯＣＹＣＬＩＣ ＣＨＥＭ．，２５，３８１（１９８８））。
一般に、必要なピリジニウム塩系前駆物質は下記の構造を有し：

キノリニウム塩系前駆物質は下記の構造を有する：

すべての場合、環はカチオン性６員ピリジニウム系またはキノリニウム系複素環である。
ｎ＝０である場合、Ｂはメチルであるか、またはＢはクロロ、ブロモもしくはヨードである。ｎ＝１またはｎ＝２である場合、Ｂはメチルである。ｎ＝１またはｎ＝２である場合のみ、Ｂのいずれかの部分が最終化合物に取り込まれる。
Ｒ^５がＯＭＥＧＡまたはアルキルである場合、２−ピリドンもしくは４−ピリドンまたは２−キノロンもしくは４−キノロンを強力な求核試薬、たとえばグリニャール試薬もしくはアルキルリチウム試薬で（実施例１１）、または金属水素化物で（実施例１２）処理し、酸触媒により脱ヒドロキシしたのち、ピリジニウムまたはキノリニウム塩が得られる。
ピリドンまたはキノロンは、オキシ塩化リン、三臭化リン、三フッ化ジエチルアミノイオウ（実施例５）、または無水トリフルオロメタンスルホン酸などの試薬を用いて、ピリジニウムまたはキノリニウムに変換することもできる。得られた活性中間体を適宜なベンザゾリウム塩と縮合させて、染料を直接に製造することができ（実施例６）、または活性中間体をアルコール類、フェノール類もしくはアルコキシド類で処理してエーテル誘導体となし（実施例１０）、チオール類もしくはチオフェノール類で処理してチオエーテル誘導体となし（実施例８）、またはアンモニアもしくはアミンで処理して置換もしくは非置換アミノ誘導体となすことができる（実施例７）。
メチン橋メチン橋は、ベンザゾリウム環とピリジニウムまたはキノリニウム環とを広範な電子共役が可能な状態で架橋する、１、３または５個のメチン（−ＣＨ＝）基からなる。
モノメチン染料（ｎ＝０）の合成には一般に、メチン炭素がベンザゾリウム塩の２−位にあるＡ、またはピリジニウムもしくはキノリニウム塩の２−もしくは４−位にあるＢ−−メチルであり、ＡまたはＢの他方は反応性″脱離基″、すなわち一般にメチルチオまたはクロロである−−に由来する試薬の組み合わせを用いる（ブルッカー（Ｂｒｏｏｋｅｒ）ら，前掲）。
トリメチン染料（ｎ＝１）またはペンタメチン染料（ｎ＝２）を合成するためには、ＡおよびＢの両方がメチルである。これらの場合、他のメチン炭素は、たとえばＮ−メチルホルムアニリドもしくはエチルオルトホルメートなどの試薬により供給される（ＨＯＵＢＥＮ−ＷＥＹＬ，前掲）か、またはさらにトリメチンフラグメントがマロンアルデヒド均等物、たとえば１，１，３，３−テトラメトキシプロパン；１，１，３−トリメトキシプロペン；３−（Ｎ−メチルアニリノ）プロペナールもしくは１−アニリノ−３−フェニルイミノ−１−プロペン（スプラーグ（Ｓｐｒａｇｕｅ），前掲）により供給される。
後続の染料修飾前記のように、２−ハロゲン化ピリジニウムまたはキノリニウム中間体が反応性であることにより、２−位に種々の置換基を結合させる多用な合成法が提供される。しかし２−ハロ誘導体の反応性は、ベンザゾリウム系前駆物質と結合したのちですら保存され、これにより先にピリジニウムおよびキノリニウム前駆物質に関して記載したように、Ｒ^４がハロゲンである生成染料を適宜なエーテル、アミンおよびチオエーテル類似体に変換することができる（実施例７、８および１０）。
使用法本発明の使用は、核酸を含有する、または含有すると考えられる試料と本発明の染料を混和し、検出可能な蛍光応答を得るのに十分な期間、試料をインキュベートし、そしてこの蛍光応答を観察することよりなる。試料は所望により、本発明染料のものと検出可能な程度に異なる応答を示す１種または２種以上の追加染料（好ましくは蛍光染料）と混和される。
一般に本発明染料は染色液として存在し、それは染料を試料と生物学的に適合性の水溶液に添加することにより調製される。染色液は染料を水性溶剤、たとえば水、緩衝液、たとえば緩衝化された生理食塩水（好ましくは非リン酸）、または水混和性の有機溶剤、たとえばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、または低級アルコール、たとえばメタノールもしくはエタノール、またはアセトニトリルに直接に溶解することにより調製される。一般に染料を予め有機溶剤（好ましくは１００％ＤＭＳＯ）に、染色液に用いるものの約１００倍を越える濃度で溶解し、次いで水性溶剤、たとえば水または緩衝液により、染料が有効で存在するように１回または２回以上希釈する。染料の有効量は、核酸の存在下で検出可能な蛍光応答を示すのに十分な量である。一般に細胞性試料の染色液は、約０．１ｎＭ以上、約１００μＭ以下、より一般的には約１ｎＭ以上の染料濃度をもつ。電気泳動ゲルの染色液は、一般に約１μＭ以上、約１０μＭ以下、より一般的には約４−５μＭ以上の染料濃度をもつ。溶液中の遊離核酸の検出のための染色液は、一般に１０ｎＭ−１μＭの濃度をもつ。染色液の個々の濃度は、試料の物理的性質、および実施される分析の性質により決定され、標準法、たとえば実施例１６の細胞試料につき記載したものに従って最適化することができる。
核酸を含有する試料と染料を混和する。試料中の核酸はＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらの混合物であってもよい。ＤＮＡは所望により一本鎖、二本鎖、三本鎖または四本鎖ＤＮＡのいずれであってもよい。核酸は天然（生物に由来するもの）または合成（人工的に調製されたもの）のいずれであってもよい。核酸は核酸フラグメント、オリゴヌクレオチド、または核酸ポリマーとして存在してもよく、非天然塩基を含有することもできる。核酸は濃縮相、たとえば染色体中に存在してもよい。試料中に核酸が存在するのは実験法の成功もしくは失敗、望ましくない汚染、または疾病状態によるものであってもよい。核酸は試料のすべて、または一部のみに存在してもよく、核酸の存在を個々の試料の識別のために、または単一試料内の部分もしくは領域を区別するために利用することができる。
核酸は生物構造体に内包されていてもよく、たとえばウイルス粒子、細胞小器官、または細胞内に含まれていてもよい。細胞のタイプには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：真核細胞、たとえば有核の植物および動物細胞、ならびに原核細胞、たとえば細菌（グラム陰性菌およびグラム陽性菌の双方、たとえば下記のものを含む：セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、スポロゲネス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、乾燥症菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏｓｉｓ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）、ミコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｈｌｅｉ）、プロピオンバクテリウム・フロインデライチ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｎｄｅｒｒｅｉｃｈｉｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アシドフィルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、サイトファーガ・サイクロフィラ（Ｃｙｔｏｐｈａｇｅ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム・メニンゴセプチクム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ナイセリア・サブフラバ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｕｂｆｌａｖａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リゾビウム・トリフォリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、サルモネラ・オラニエンバーグ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｏｒａｎｉｅｎｂｕｒｇ）、ゾンネ菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）またはそれらの組み合わせ）、ならびに酵母および他の菌類、ミコバクテリアおよびマイコプラズマ。生物構造体に内包された核酸は多様な供給源から得られ、これには下記のものが含まれる：濾過されていない、もしくは分離された生物学的流体（たとえば尿、脳脊髄液、血液、リンパ液、組織ホモジェネート、粘液、唾液、便、または生理的分泌液もしくはこれに類する他の流体）；環境試料、たとえば土壌、水および空気、発酵培地、たとえば生物反応器もしくは食品発酵プロセス、たとえば醸造からのもの；または材料（たとえば食品）の表面洗液、もしくは少量の固体、たとえば貯留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）、切屑およびスミア；または培養のために細胞が導入されていた増殖培養液。細胞は所望により分離した個々の細胞であり、これには微生物が含まれ、または他の細胞と２次元もしくは３次元の層状に結合した多数の細胞であり、これには多細胞生物、胚、組織、生検試料、フィラメント、生体膜などが含まれる。核酸は内在性のものであってもよく、または異物として、たとえば感染もしくはトランスフェクションにより導入されたものであってもよい。細胞は生細胞もしくは死細胞またはそれらの混合物であってもよい。本発明染料のほぼ普遍的な透過性、それらの向上した取り込み速度、および生体系に対するこれらの染料の低い毒性によって、染料自体により引き起こされる混乱がほとんど、または全くなしに、生存試料中の核酸を検査することができる。これらの染料は、通常の組織化学的または細胞化学的方法で固定および処理された細胞または細胞群中の核酸を染色するためにも使用しうる。
あるいは核酸は、従来報告されたいずれの形態においても、生物構造体に内包されておらず、試料溶液として存在する。試料溶液は、上記の供給源より精製されたオリゴヌクレオチドまたは核酸の溶液から、粗製混合物、たとえば細胞抽出液、生物学的流体、および環境試料にまで及ぶことができる。場合により、染料と混和する前に生体分子の混合物または溶液状の流体から核酸を分離することが望ましい。他の蛋白質または他の生体分子との一般的に粗製の混合物から核酸を分離および精製するためには、多数の方法がある。これらには、多様な支持体を用いる電気泳動法およびクロマトグラフィー法などの手段が含まれる。電気泳動ゲルを後染色するために用いる場合、本発明染料の高い感度によって、従来は測定不可能であった量の核酸を脱色の必要なしに検出することができる。本発明の１形態によれば、紫外線透視装置と併用した場合、バンド当たり２０ピコグラム程度の少量の二本鎖ＤＮＡを検出することができる。
試料は染料と核酸の接触を促進するいかなる手段によっても染色液と混和することができる。接触は、たとえば試料が溶液である場合には簡単な混合により行われる。染料は核酸溶液に直接に添加するか、あるいは単に核酸の存在を単純に見える状態で提示することが目的である場合には不活性マトリックス、たとえばブロットもしくはゲル、試験片、または他のいずれかの固体もしくは半固体の表面で溶液を接触させてもよい。試料を分離するために用いた不活性マトリックスをいずれも、その不活性マトリックス上で蛍光応答を観察することにより核酸の存在を検出するのに使用しうる。本発明染料は染料溶液を添加した際に迅速かつ完全に細胞膜を透過しうることが示されたが、細胞の生存性および細胞膜の完全性の崩壊を最小限に抑えた状態で細胞膜を通して染料を輸送するのに適した他のいかなる方法も、試料を本発明染料と混和するのに有効な方法である。適切な方法には、化学物質、たとえば界面活性剤、酵素もしくはアデノシントリホスフェートの作用；レセプターもしくは輸送蛋白質により仲介された取り込み；ポア形成性蛋白質；マイクロインジェクション；電気穿孔法；低浸透圧ショック法；または最小の物理的破壊、たとえば染料と共に、もしくは染料の存在下での固体粒子の引掻き装填（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）もしくは衝撃が含まれる。
試料を染料の存在下で、蛍光性の核酸−染料コンプレックスの形成に十分な期間インキュベートする。核酸の溶液における検出可能な蛍光は、本質的に即座に発せられる。細胞膜における検出可能な蛍光は、染料が細胞内へ透過することを必要とする。好ましくは染料の操作パラメーター内での細胞の正常な活動に最適な温度（約５−約５０℃）で染料を添加する；一般にこれは室温（２３℃）である。５−４５℃の温度で、試料と混和して約１５−２０分以内、一般に約５分以内に、視覚的に検出可能な蛍光が得られる。好ましい形態によれば、細胞内において約２分以下で、検出可能な蛍光が得られる。５μＭの染料溶液を装填したリンパ球は５秒以下で、検出可能な蛍光を発する。これは通常の蛍光測定法で測定するのには早すぎる。この特性は核の構造および再構成、たとえば有糸分裂またはアポプトシスに際して起こるものを観察するために有用である。すべての形態において透過および蛍光発光は迅速であるが、最適な染料透過または核酸コンプレックス形成は、個々の試料および試料媒質の物理的および化学的性質に依存し、たとえば実施例１７に記載の標準法により判定することができる。
本発明染料は核酸と非共有結合して増強された蛍光を発し、増強の水準は全般的に約１００−１０００倍、一般に約３００倍を越える（表２）。これらの染料は一般に、核酸に結合するとチアゾールオレンジと比較して改善された量子収量を示す。これはそのまま核酸検出に際しての感度の改善と言い換えられる。必ずしもすべての染料が改善された量子収量を示すわけではないが、本発明染料の他の特性は、向上した透過性、向上した透過速度、ならびに／あるいは個々の計測器に適した励起および発光バンドの選択性を含めた、著しい改善を示す。
核酸−染料コンプレックスの検出を促進するために、この蛍光性コンプレックスの励起または発光特性を利用する。たとえば蛍光性コンプレックスの最大吸収波長またはその付近の光を発しうる光源により試料を励起する。これはたとえば紫外線もしくは可視光線ランプ、アーク灯、レーザーであるか、または太陽光線ですら可能である。好ましくは蛍光性コンプレックスを約３００ｎｍ以上、より好ましくは約３４０ｎｍ以上の波長で励起する。試料を２５４ｎｍ付近、３００−３１０ｎｍ、および３６５ｎｍ付近で励起するために一般に利用される装置はいずれも、本発明の染料を励起するために使用しうる。核酸−染料コンプレックスの最大吸収バンドにとってより適切な光源、たとえばアルゴンレーザーの４８８ｎｍのバンドは、さらに高い感度を与える。幾つかの例では６００ｎｍを越える波長での励起が可能である。
コンプレックスの蛍光は、得られる約４００ｎｍ以上、好ましくは約４８０ｎｍ以上、より好ましくは約５００ｎｍ以上の波長の発光を検出することにより、定性的または定量的に検出される。発光は視覚的検査、写真フィルム、または現在の計測器、たとえば蛍光測定器、量子計数器、プレート読取り装置、エピ蛍光顕微鏡（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）およびフローサイトメーターの使用を含む手段により、または信号を増幅するための手段、たとえば増倍型光電管により検出される。核酸−染料コンプレックスの蛍光は濃度に直線的に依存するので、試料中の核酸濃度を定量することもできる（実施例２２−２３）。
染料の励起および発光バンドの波長は染料組成に応じて変化し、広範な照明および検出バンドを包含する（たとえば表３）。このため特定の励起光源または検出フィルターにつき使用する個々の染料を選択することができる。特にそれらの励起バンドが一般に使用されているアルゴンレーザーと一致する染料、または発光バンドが既存のフィルター、たとえば代表的なフルオレセイン励起および発光バンドを含むフルオレセイン−ロングパスセットもしくはマルチバンドセットと一致する染料を選ぶことができる。
さらに、本発明染料と併用したい他の染料のものと異なる検出応答を示すように染料を選ぶことができる。これ、またはこれらの追加染料は蛍光性であって、これに関して照明に対する応答が本発明の環式置換−非対称シアニン染料のものと検出可能な程度に異なることが好ましい。染料間のスペクトル特性の相異を検出するためには、いかなる蛍光検出システムをも利用しうる。これらの染料は同一または重複した励起スペクトルをもち、ただし視覚的に異なる発光スペクトルを示し、一般に＞１０ｎｍ、好ましくは＞２０ｎｍ、より好ましくは＞５０ｎｍ分離した発光極大をもつことが好ましい。
追加染料は核酸を含有する細胞試料または無細胞試料を、サイズ、形状、代謝状態、生理的条件、遺伝子型、もしくは他の生物学的パラメーター、またはそれらの組み合わせに従って区別するために、所望により用いられる。本発明の１観点においては、追加染料は特定の細胞内では細胞内代謝されて蛍光性産物を生じるが、他の細胞内では代謝されず、従って本発明の環式置換−非対称シアニン染料の蛍光応答はこのような代謝過程が起こらない場合にのみ優位になる。あるいは追加染料は細胞のある外部構成要素、たとえば細胞表面の蛋白質またはレセプターに対して特異的である。さらに他の本発明の１観点においては、追加染料は能動的または受動的に細胞膜を通過し、細胞膜の完全性または機能性を指示するために用いられる。
追加染料は、有効量で存在するように被分析試料に添加され、染料の最適濃度は前記のように細胞密度に従って決定される。一般に各染料の濃度は約０．０１−約１００μＭ、より一般的には０．１−約１０μＭである。各染料は所望により別個の溶液中に調製され、または１溶液中で混和される。一般に染料は染色液中に約５倍モルの範囲で存在するが、試料中のある染料と他の染料とのモル比は約１：１−約１：１００に及ぶことができ、これは試料に染料が同時に添加されるか、または順次添加されるかに応じて異なる。染色された細胞を前記のように適切な波長で照明したのち、細胞を照明に対するそれらの蛍光応答に従って分析する。さらに、細胞または核酸をその後の分析または実験のために選別する基礎として、蛍光応答の差を利用することができる。たとえば特定の処理を″生き残った″細胞を選別し、または試料中の特定のタイプの細胞をすべて選別する。細胞は手動で、または自動化された技術、たとえばフローサイトメトリーを用いて、当技術分野で、たとえば米国特許第４，６６５，０２４号明細書（マンスールら，１９８７）中において知られている方法に従って選別することができる。
本発明の１形態においては、生存細胞を死細胞と区別するために被験染料を第２の蛍光染料（染料ＩＩ）と併用し、その際染料ＩＩは生存細胞と死細胞のいずれかに対して選択的である。本発明の１形態においては、染料ＩＩは生存細胞のみにおいて検出可能な蛍光応答を生じる−−たとえば生存細胞を選択的に染色するホーグランド（Ｈａｕｇｌａｎｄ），ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（１９９２−９４）に記載の蛍光性酵素基質および試薬。これにはハロアルキルエステラーゼ基質およびカルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）ＡＭが含まれる。あるいは染料ＩＩは死細胞のみにおいて検出可能な蛍光応答を生じる−−たとえば細胞膜を通過して、ある細胞内構成要素、たとえば細胞内蛋白質または核酸と結合した時点でのみ蛍光性となる不透過性染料。無傷の細胞膜と″生存率″（技術的には細胞がその存在を維持する能力）という語の間には厳密な均等性はないが、細胞膜が不可逆的に破壊された細胞を″死″細胞または″非生存性″細胞と呼ぶのが一般的である。適切な染料には、細胞内核酸と結合した場合に増強された蛍光を発する不透過性のフェナントリジウムまたはベンザゾリウム誘導体（それらのモノマーまたはダイマーを含む）、たとえばエチジウムホモダイマー、エチジウムブロミド、ピリジニウムヨージド、ＴＯＴＯ、ＢＯＢＯ、ＰＯＰＯ、ＹＯＹＯ、ＴＯ−ＰＲＯ、ＢＯ−ＰＲＯ、ＰＯ−ＰＲＯおよびＹＯ−ＰＲＯ（モレキュラープローブ）が含まれる。他の適切な染料には、細胞透過性の核酸用染料、たとえばヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２、またはＤＡＰＩが含まれる。不透過性染料ＩＩ、たとえばフェナントリジウムまたはベンザゾリウム染料の装填時間は、一般に前記で述べたものと同じである。生存細胞につき選択的である細胞透過性染料ＩＩは、それらの染料が蛍光を発するために細胞内活性を必要とする場合は特に、一般により長い装填時間を必要とする。
染料ＩＩがそれにつき選択的である細胞内には両方の染料が存在する。本発明染料は染料ＩＩがそれにつき選択的である細胞を含めてすべての細胞を染色するからである。染料ＩＩがそれにつき選択的である（かつ両方の染料が存在する）細胞においては、染料ＩＩの細胞内蛍光応答は所望により染料ＩＩ単独の蛍光応答と同じである（たとえば染料ＩＩが本発明染料と核酸結合に対して効果的に競合する場合）か、または両方の染料の存在を示す応答である（競合結合の効果がより低い場合、または染料ＩＩが核酸用染料ではない場合）。本発明染料のみの蛍光応答は、染料ＩＩがそれにつき選択的ではない細胞であって、場合により生存または非生存細胞を示す。染料ＩＩがそれにつき選択的である細胞は、所望により上記に従って選別または計数される。
本発明の他の形態においては、同定および所望により生存率の判定のために試料を複数の蛍光染料と混和する。追加の蛍光染料は細胞表面の構成要素と選択的に結合し、または特定の細胞タイプに選択的に透過し、または細胞の内容物もしくは分泌物と優先的に反応し、または特定の細胞小器官を選択的に染色し、かつ生存率をも示すために染料ＩＩと併用しうるものである。外部のみを染色する表面標識は、細胞内染色する染料と区別することができる。表面染料を１または２以上の細胞内染料、たとえば核酸用染料と併用すると、″的（ｂｕｌｌｓｅｙｅ）″パターンの染色−−すなわち外側の環状染色内の鮮明に染色された内部−−が見られる。表面標識も使用された他の染料のものと検出可能な程度に異なる発光スペクトルを示すことが好ましい。それぞれの染料または染料−核酸コンプレックスの励起スペクトルは他の染料の励起スペクトルと重複することが好ましい。より好ましくは、核酸とコンプレックス形成した各染料は約４８０−５１０ｎｍの励起極大をもつ。極めて好ましくはそれぞれの染料または染料−核酸コンプレックスは約３００−３６５ｎｍのＵＶにおいても励起される。
本発明の他の観点においては、追加の蛍光染料は２０００未満の分子量をもち、核酸でない細胞構造体を選択的に染色し、かつそれ自体は酵素基質ではない。追加の蛍光染料により染色される適切な細胞構造体には、細胞膜、蛋白質、液胞、ミトコンドリア、ゴルジ装置、小胞体、細胞質、リソソーム、または糖類もしくは多糖類が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の１観点においては、追加の蛍光染料は蛍光性ペプチドまたは蛋白質であり、その際蛋白質は抗体、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡまたはプロテインＧであり；これらの追加染料は照明に対して、それぞれ他の染料のものと検出可能な程度に異なる蛍光応答を示す。本発明の他の観点においては、追加の蛍光染料は蛍光原基質であり、その際この基質に対する酵素が細胞内に存在し、基質に対するこの酵素の作用により蛍光性化合物が生成する。一般に細胞内酵素は加水分解酵素、酸化酵素または還元酵素である。
本発明の１観点においては、追加の蛍光染料はグラム陽性菌またはグラム陰性菌に対して選択的に透過性である。この場合、染色された細菌の出現は試料中の細菌のグラム反応を示し、かつ所望により試料中に存在するＧ^＋またはＧ⁻細菌が生存しているか否かを示す。グラム陽性（Ｇ^＋）菌は陽性のグラム染色を示すものであり、特に桿菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、球菌属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、およびミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が含まれるが、これらに限定されない。グラム陰性（Ｇ⁻）菌はグラム染色に対して陰性のものであり、特にエシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、プソイドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、カンフィロバクター属（Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）およびエルジニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）が含まれるが、これらに限定されない。
好ましくは（細胞内核酸と結合して）緑色または黄緑色の蛍光を発する環式置換−非対称シアニン染料を、下記の染料１種類または２種類以上と併用する：ａ）Ｃ_４−Ｃ_８アルキル置換フェナントリジウム（好ましくはヘキシジウムまたはＣ_６−置換フェナントリジウム、ワトキンス（Ｗａｔｋｉｎｓ），Ｊ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．３０５９（１９５２））、これはＧ^＋生菌およびすべての死細菌を選択的に橙赤色の蛍光信号に染色し、これは環式置換−非対称シアニン染料の信号を一部または完全に置き換える；ならびに／あるいはｂ）ａ）のフェナントリジウム系染料のものおよび環式置換−非対称シアニン染料のものと異なる蛍光信号を示す発蛍光団に共有結合した蛋白質、好ましくはＡＭＣＡまたはカスケードブルー染料（モレキュラープローブ）で標識された小麦胚芽凝集素などのレクチン、これはＧ^＋生菌または死菌の表面に対して選択的である；ならびに所望によりｃ）前記の染料ＩＩに従う膜不透過性のベンザソリウム系核酸用染料、これは使用される多の染料のものと異なる蛍光応答を示す、好ましくはＴＯＴＯ、ＢＯＢＯ、ＰＯＰＯ、ＹＯＹＯ、ＴＯ−ＰＲＯ、ＢＯ−ＰＲＯ、ＰＯ−ＰＲＯおよびＹＯ−ＰＲＯ（モレキュラープローブ）の名称で市販されているもの。
表５にスペクトル応答をまとめる。表中の環式置換−非対称シアニン染料（Ｉ）は５００−５３５ｎｍに発光極大を示し（たとえば染料６２４）；フェナントリジウム染料（ＩＩ）は５８０−６５０ｎｍに発光極大を示し（たとえばヘキシジウム）；膜不透過性ベンザゾリウム（ＩＩＩ）−核酸コンプレックスは５３０−５９０ｎｍに発光極大を示し（たとえばＴＯＴＯ、ＹＯＹＯ、ＴＯ−ＰＲＯ、またはＹＯ−ＰＲＯ）；および標識蛋白質（ＩＶ）は４１０−４８０ｎｍに発光極大を示す（たとえばＡＭＣＡ標識−またはカスケードブルー標識された小麦胚芽凝集素）。同等な選択的透過性、励起／発光スペクトル、および核酸に対する優先的な結合アフィニティーを備えた他の蛍光性染料を慎重に選ぶことにより、多数の異なる生物（生きているものまたは死んだもの）を識別することができる。

以下の実施例は本発明の実施を説明するために提示される。それらは本発明の範囲全体を制限または規定するためのものではない。下記の構造式において置換基フェニルは当技術分野で一般に採用され、かつ理解されているように、記号φで表される。

実施例１：１，２−ジヒドロ−４−メチル−１−フェニル−２−キノロン（１）の製造）下記の化合物を製造した：

合成前駆物質（１）は文献法（ワウゾネク（Ｗａｗｚｏｎｅｋ）ら，前掲）に従ったウルマンカップリングによって、または対応するジアリールアミンとジケテンを反応させたのち、酸により環化することによって（エルダーフィールド（Ｅｒｄｅｒｆｉｅｌｄ），前掲）製造された。すなわち１０．０ｇ（６２．９ｍｍｏｌ）の２−ヒドロキシ−４−メチルキノリンを、２４．０ｇ（３７７ｍｍｏｌ）の銅粉末、８．６８ｇ（６２．９ｍｍｏｌ）の炭酸カリウム、および１９．２ｇ（９４ｍｍｏｌ）のヨードベンゼンと共に４８時間、加熱還流した。反応物を室温に冷却し、水と酢酸エチルの間で分配し、濾過し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。粗生成物をシリカゲルカラム上で、１：１の酢酸エチル／ヘキサンで溶離することにより精製して、８．１ｇの目的生成物を得た。

実施例２：１，２−ジヒドロ−４−メチル−１−フェニル−２−ピリドン（２）の製造下記の化合物を製造した：

合成前駆物質２は実施例１に従って４０％の収率で製造された。ただし出発原料は１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−ピリドンであった。

実施例３：１，２−ジヒドロ−１，４−ジメチル−２−キノロン（３）の製造下記の化合物を製造した：

合成前駆物質３は、まずＮ−メチルアニリンをジケテンと結合させ、次いでこのアミド中間体を酸により環化することによって製造された。すなわち１０．０ｇ（０．１２ｍｏｌ）のジケテンを１０．７ｇ（０．１ｍｏｌ）Ｎ−メチルアニリンに滴加し、反応物をさらに３０分間、１００℃に加熱した。得られた混合物に３０ｍＬの酢酸および３０ｍＬの硫酸を添加し、混合物を５０℃に一夜加熱した。反応物を水および酢酸エチルで処理し、シリカゲルカラム上で精製して、９．５ｇの目的生成物を得た。
Ｎ−メチル−２−フェニルアニリン（２−フェニルアニリンをＫ_２ＣＯ_３およびＣＨ_３Ｉでメチル化することにより製造）を用いて合成を行うと、得られた生成物は１，２−ジヒドロ−１，４−ジメチル−８−フェニル−２−キノロンであった。

実施例４：１，２−ジヒドロ−７−メトキシ−４−メチル−１−フェニル−２−キノロンの製造下記の化合物を製造した：

Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）−Ｎ−フェニルアミンをアセトン中で炭酸カリウムおよびヨウ化メチルにより、３９％の収率でＯ−メチル化した。次いで得られたＮ−（３−メトキシフェニル）−Ｎ−フェニルアミンをジケテンと反応させて、対応するアセトアセトアミド製造し、これを精製せずに実施例３に従って酢酸／硫酸中で環化して、目的とするキノロンを４１％の収率で製造した。

実施例５：２−クロロ−４−メチル−１−フェニルキノリニウムクロリド（４）の製造下記の化合物を製造した：

２０ｍＬの塩化メチレン中の２．８ｇ（１１．９ｍｍｏｌ）の１に１．８５ｇのＰＯＣｌ_３および触媒量のジメチルホルムアミドを添加した（マーソン（Ｍａｒｓｏｎ），ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ，４８，３６５９（１９９２））。得られた混合物を２４時間加熱還流した。生成物を冷却したのちカラムクロマトグラフィーにより精製した。
対応するブロミドはＰＯＣｌ_３ではなくＰＢｒ_３を用いて製造された。
対応するフルオリドはＰＯＣｌ_３ではなく三フッ化ジエチルアミノイオウを用いて製造された。

実施例６：２−クロロ−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリーデン］−１−フェニルキノリニウムヨージド（染料５９１）の製造下記の化合物を製造した：

室温の４（１１．９ｍｍｏｌ）の溶液を調製し、３．５ｇ（９．６ｍｍｏｌ）のＮ−メチル−２−メチルチオベンゾチアゾリウム・トシレート（５）（ライ（Ｒｙｅ）ら，ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．，２０，２８０３（１９９２））を添加したのち、１．３ｍＬ（９．４ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを添加した。混合物をさらに６時間撹拌した。粗生成物をシリカゲル上で、溶離剤としての酢酸エチル：クロロホルム：メタノール、３：３：１を用いて精製した。次いで生成物をメタノール／クロロホルム／酢酸エチルから再結晶した。
対応するブロミド（染料７７４）は、４の代わりに２−ブロモ−４−メチル−１−フェニルキノリニウムブロミドを用いて同様に製造された。
対応するフルオリド（染料８３４）は、４の代わりに２−フルオロ−４−メチル−１−フェニルキノリニウムフルオリドを用いて同様に製造された。
メトキシキノリニウム類似体（染料５１０３）は同様にして、ただし１，２−ジヒドロ−７−メトキシ−３−メチル−１−フェニル−２−キノロンを用いて製造された。
ピリジニウム類似体（染料６７８）は同様にして、ただし４のピリジニウム類似体を用いて製造された。
トリメチン染料類似体（染料８２３）は同様にして、ただし５の代わりに２−（２−アニリノビニル）−３−メチルベンゾチアゾリウム・トシレートを用いて製造された。
染料５９１に至る他の合成経路は、４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリーデン］−１，２−ジヒドロ−１−フェニル−２−キノロン（６）を使用し、これは１および５から製造された。すなわち１のリチウムエノレート（上記キノロンを２．７当量のリチウムジイソプロピルアミドで処理することにより製造）、または１のシリルエノレート（（１）およびトリメチルシリル−トリフルオロメタンスルホネートおよびジイソプロピルエチルアミンから）を５と共に撹拌した。目的の中間体（４）をカラムクロマトグラフィーにより単離した。次いでこのキノロン（６）をＰＯＣｌ_３で処理して、染料５９１を製造した。

実施例７：２−ジエチルアミノ−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリーデン］−１−フェニルキノリニウムヨージド（染料６１９）の製造下記の化合物を製造した：

染料６１９は染料５９１（２６ｍｇ）を０．５ｍＬのジエチルアミンと共に１．５ｍＬのＤＭＦ中で５５℃に一夜加熱することにより製造された。目的生成物は簡単な濾過により単離された。
染料７５２は同様にして、ただしジエチルアミンの代わりにモルホリンを用いてＤＭＦ中で５０℃において製造された。
染料８５６は同様にして、ただしジエチルアミンの代わりにＮ−メチルピペラジンを用いて製造された。
染料１３０は同様にして、ただしジエチルアミンの代わりにアニリンを用いて製造された。
２−（Ｎ−３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−プロピルアミノ−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリーデン］−１−フェニルキノリニウムヨージド（染料１０３７）は同様にして、ただしジエチルアミンの代わりにＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−プロピルアミンを用いて製造された。

実施例８：４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリーデン］−１−フェニル−２−（２−ピリジルチオ）−キノリニウムヨージド（染料８５３）の製造下記の化合物を製造した：

２−メルカプトピリジン（６．３ｍｇ）を塩化メチレン２ｍＬ中の２５ｍｇの染料５９１に添加し、次いで１３μＬのトリエチルアミンを添加し、得られた混合物を室温で１．５時間撹拌した。溶剤の容量を減圧下で約０．５ｍＬに減少させ、生成物を濾過により単離した。
２−（２−ジメチルアミノエチルチオ）−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリーデン］−１−フェニルキノリニウムヨージド（染料１００４）は同様にして、ただし染料５９１の代わりに染料６３３を用い、かつ２−メルカプトピリジンの代わりに２−ジメチルアミノエタンチオールを用いて製造された。

実施例９：２−クロロ−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリーデン］−１−シクロヘキシルキノリニウム・トシレート（染料７８０（Ｃｌ））の製造下記の化合物を製造した：

Ｎ−シクロヘキシルアニリンを出発原料として用いて、１−シクロヘキシル−１，２−ジヒドロ−４−メチル−２−キノロンを製造した。このキノロン（０．４８２ｇ，２ｍｍｏｌ）を実施例５と同様な方法で２−クロロ−１−シクロヘキシルキノリニウムクロリドに変換し、次いで５（０．７４ｇ，２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．２８ｍＬ，２ｍｍｏｌ）と反応させて、生成物を得た。

実施例１０：２−メトキシ−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリーデン］−１−フェニルキノリニウムヨージド（染料６２８）の製造下記の化合物を製造した：

染料５９１（４．３ｍｍｏｌ）およびメタノール（１０ｍＬ）を２時間、加熱還流した。減圧下でメタノールを除去し、１０ｍＬの塩化メチレンを添加し、次いで１．５６ｇ（４．３ｍｍｏｌ）の５および１．５ｍＬのトリエチルアミンを添加した。得られた混合物を室温で３日間撹拌した。粗製物質をシリカゲルカラム上で５：５：１の酢酸エチル：クロロホルム：メタノールにより溶離することによって精製した。。
対応するオキシド（染料７１５）は、メタノールではなくエタノールを用いて同様に製造された。

実施例１１：２−ブチル−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリーデン］−１−フェニルキノリニウムヨージド（染料６１）の製造下記の化合物を製造した：

０．２３５ｇ（１ｍｍｏｌ）の１に１０ｍＬのＴＨＦ中で−７８℃において窒素下に、１．２当量のｎ−ブチルリチウムを装入した。反応物を−７８℃で１５分間撹拌し、次いで温度を０℃にさらに３０分間高め、次いで酢酸により反応を停止し、溶剤を蒸発させた。残渣を５ｍＬの塩化メチレンに溶解し、０．３６７ｇ（１ｍｍｏｌ）の５を添加し、次いで０．２８ｍＬ（２ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを添加した。反応混合物を室温で２０分間撹拌し、塩交換後に粗生成物をヨウ素塩として単離した。この粗製ヨウ素塩をメタノールから再結晶した。

染料６２４は同様にして、ただし５の代わりに３−メチル−２−メチルチオベンゾオキサゾリウム・トシレート（７）（ライ（Ｒｙｅ）ら，前掲）を合成に用いて製造された。

染料６１０４は同様にして、ただしブチルリチウムの代わりにシクロヘキシルマグネシウムブロミドを用いて製造された。
対応するトリメチン染料（染料６２１）は同様にして、ただし５の代わりに２−（２−アニリノビニル）−３−メチルベンゾチアゾリウム・トシレートを用いて製造された。
対応するペンタメチン染料（染料１００）は同様にして、ただし５の代わりに２−（４−アニリノ）−１，３−ブタジエニル−ベンゾチアゾリウムヨージドを用いて製造された。２−（４−アニリノ）−１，３−ブタジエニル−ベンゾチアゾリウムヨージドは当技術分野で既知の方法（米国特許第２，２６９，２３４号明細書，スプラーク（１９４２）；およびＨＯＵＢＥＮ−ＷＥＩＬ ＭＥＴＨＯＤＥＮ ＤＥＲ ＯＲＧＡＮＩＳＣＨＥＮ ＣＨＥＭＩＥ，Ｖ／１ｄ巻，２３１−２９９（１９７２））により、１，３−ジメチル−ベンゾチアゾリウムヨージドおよび１−アニリノ−３−フェニルイミノ−１−プロペン塩酸塩から製造された。

実施例１２：４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリーデン］−１−フェニルピリジニウムヨージド（染料６４０）の製造下記の化合物を製造した：

塩化メチレン１０ｍＬ中の１，２−ジヒドロ−１−フェニル−２−ピリドン０．３７ｇ（２ｍｍｏｌ）に０℃において、２．２ｍＬの１．０Ｍ ＤＩＢＡＬ（シクロヘキサン中）を添加し、得られた混合物を低温で２時間撹拌した。酢酸（０．３ｍＬ）を添加し、揮発性成分を蒸発させた。残渣を乾燥させ、次いで１５ｍＬの塩化メチレンに再溶解した。０．７４ｇ（２ｍｍｏｌ）の５を添加し、次いで０．２８ｍＬ（２ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、粗生成物をシリカゲルカラムに装填し、３：３：１の酢酸エチル／クロロホルム／メタノールで溶離した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させ、５ｍＬのＤＭＦに再溶解し、水７５ｍＬ中の５ｇのヨウ化ナトリウムに添加した。沈殿を濾過し、メタノールから再結晶した。
上記ピリドンの代わりに１，２−ジヒドロ−１，４−ジメチル−８−フェニル−２−キノロンを用いると、反応生成物は染料７２である。

実施例１３：４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリーデン］−１−シクロヘキシルキノリニウムヨージド（染料７３）の製造下記の化合物を製造した：

１．４３ｇ（１０ｍｍｏｌ）のレピジンおよび２．１ｇ（１０ｍｍｏｌ）のシクロヘキシルヨージドの混合物を１３０℃に２時間加熱した。酢酸エチル（２０ｍＬ）を添加し、濾過したのち、１．３６ｇの固体を得た。この固体を５０ｍＬの塩化メチレン中で１．４１ｇの５および１．１２ｍＬのトリエチルアミンと共に数時間撹拌した。粗生成物をヨウ素塩に変換し、メタノールから再結晶して純粋な生成物を得た。

実施例１４：２−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリーデン］−１−フェニルキノリニウムヨージド（染料６４）の製造下記の化合物を製造した：

中間体Ｎ−フェニル−２−クロロキノリニウムクロリドをマーソン（Ｍａｒｓｏｎ），ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ，４８，３６５９（１９９２）に従って製造した。すなわち１．０６ｇ（５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジフェニルアセトアミドを１．６９ｇ（１１ｍｍｏｌ）のＰＯＣｌ_３および０．４４ｇ（６ｍｍｏｌ）のＤＭＦと共に１２０℃に２時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、１５ｍＬの塩化メチレンを添加して残渣を溶解した。この溶液に１．６８ｇ（５ｍｍｏｌ）の２，３−ジメチル−ベンゾチアゾリウム・トシレートおよび１．４６ｇ（１２ｍｍｏｌ）の４−ジメチルアミノピリジンを添加し、反応物を一夜撹拌した（エルダーフィールド（Ｅｒｄｅｒｆｉｅｌｄ），前掲）。粗生成物をまずシリカゲルカラム上で、２：２：１の酢酸エチル／クロロホルム／メタノールで溶離することにより精製し、次いで複分解してヨウ素塩となし、メタノールから再結晶して純粋な生成物を得た。

実施例１５：４−［２，３−ジヒドロ−４−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチリーデン］−１−フェニル−２−トリフルオロメタンスルホニルオキシキノリニウムヨージド（染料８５４）の製造下記の化合物を製造した：

無水トリフルオロメタンスルホン酸（６６μＬ）を１，２−ジクロロエタン５ｍＬ中の０．１ｇの６に添加し、この溶液を８０℃に３時間加熱した。反応物を水およびクロロホルムで処理し、得られた生成物をシリカゲル上でのクロマトグラフィーにより精製した。

実施例１６：染料装填量の最適化細胞密度を計数または下記の外挿法により測定した。細胞培養物を遠心分離により洗浄し、水に再懸濁してそのもとの容量にした。平底９６ウェル−ミクロタイタープレートを用いて、ウェル当たり１５０μＬ容量の懸濁液を装填した。無菌水のウェル１個をバックグラウンド基準のウェルとした。４１０ｎｍのフィルターを備えたダイナテックＭＲ６００ミクロタイタープレート読取り装置を用いて、初期容量の懸濁液につき吸光度を測定した。懸濁液を水中に７回、１０倍系列希釈により希釈し、ウェル当たり１５０μＬの懸濁液を装填し、各希釈液につき吸光度を測定した。吸光度測定後に、ウェルに装填された希釈液をそれぞれさらに１：１０に希釈し、栄養増殖寒天にダブルで接種した。コロニーを計数し、コロニー形成単位／ｍＬ（ｃｆｕ／ｍＬ）で表示した。ミクロタイタープレート中の希釈液の濁度を利用して、懸濁液を約１×１０^９ｃｆｕ／ｍＬの密度に希釈した。
既知の密度に調整された細胞懸濁液を水中に７回、１０倍系列希釈により希釈し、ウェル当たり１５０μＬの懸濁液を装填した。染料の３倍系列希釈液を使用した（３０−０．０４μＭ）；４×最終濃度の染料５０μＬ。９６ウェル−平底ミクロタイタープレートを用いて、細胞濃度がプレートの横方向に低下し、かつ染料濃度がプレートの縦方向に低下するようにマトリックスを設定し、ウェル当たりの最終容量を２００μＬとした。最上列および第１カラムを対照の無菌水用に残した。プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、次いでサイトフルオル（商標）２３５０蛍光ミクロプレート読取り装置で、４８５＋／−１０ｎｍの一定の励起、および３種類それぞれの発光波長、５３０＋／−１２、６２０＋／−２０、または６４５＋／−２０ｎｍにおいて読取った。これらの結果により、最適な染料装填のための最良の染料範囲（３０−１μＭ）および最良の細胞範囲（最初の３回の１０倍希釈では濃厚）が判定された。これらの結果から次の染色最適化アッセイが導かれた。４種類の染料希釈液および４種類の細胞希釈液を用いて、多数の培養物および染料を迅速にアッセイすることができる。採集したデータにより細胞当たり最大の蛍光強度を得るのに必要な染料および細胞の最適濃度を判定することができる。

実施例１７：染料装填速度染料の装填のための最小時間は下記により得られた：細胞を栄養ブロス中で対数増殖期になるまで増殖させ、遠心分離により洗浄し、最大蛍光／細胞となる染料装填量が得られることが上記で示された密度になるように、水中に再懸濁した。細胞懸濁液を装入した蛍光測定キュベットを、温度調節式キュベットホルダーおよび磁気撹拌機を備えた蛍光スペクトル測定器に挿入した。懸濁液は染料添加の前に適切な温度にされた。ＤＭＳＯ中のミリモル濃度の染料原液を、各染料のピーク発光波長において達成しうる最大蛍光／細胞となるのに適した濃度で添加した。懸濁液の蛍光強度は、その染料のピークの励起および発光波長またはその付近で測定された（たとえば表３参照）。蛍光信号が安定化するまで蛍光のサンプリングを行った。５℃、２３℃および３７℃での装填時間の比較により、懸濁液を適宜な温度で平衡化したのち染料を上記に従って添加すると、温度の上昇に伴って装填速度が著しく増大することが示された。

実施例１８：運動性細胞の染色凍結したヤギ精子懸濁液を融解し、３２℃に保持した。最終濃度０．５μＭの染料を得るのに十分な１０ｍＭ染料原液（染料６２８、６２４、８３５または５９１）を精子懸濁液に添加した。精子は染料溶液中で１０分間のインキュベーションにより標識された。精子細胞はこれらすべての染料で染色され、明度の順序は６２８＞６２４＞＞８３５＞５９１であった。運動性は０．５μＭでは維持されたが、５μＭの染料では若干の精子において失われた。

実施例１９：組織の染色アオキ（Ａｕｃｕｂａ ｓｐｐ．）の葉をカミソリの刃で横に切断し、３５ｍｍのガラス皿に入れたＥ−純水中の染料６２４の１０μＭ溶液０．５ｍＬに浸漬した。組織を室温で暗所において３０分間染色した。組織標本を染料の存在下にカバーガラスとスライドの間に固定した。葉の表皮層は大量の黄色の自己蛍光により縁取りされていたが、染料６２４を装填した細胞においては、維管束および細胞核の双方とも鮮明な緑色に染色されていた。

実施例２０：コンパートメント化された核酸の染色染料６１３の１０ｍＭ原液を、１３５ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２，２０ｍＭ Ｎａ−ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４（ＨＢＳＳ＋）中の感染性肝臓壊死ウイルスの懸濁液に添加して、４０μＭ染料溶液を得た。１５℃で１０分間インキュベートしたのち、エピ蛍光顕微鏡により１００倍の対物レンズを用いてウイルスを観察した。ウイルス粒子（約３０×１６０ｎｍ）は可視光線を用いる顕微鏡の解像限界より小さい。ウイルスＲＮＡに染料６１３を取り込ませると、標準フルオレセイン−ロングパスフィルターセットを用いて観察した際に鮮明な緑色の光の点として見るのに十分な濃度の染料が粒子に取り込まれた。

実施例２１：細胞小器官の核酸の染色３Ｔ３マウス繊維芽細胞をカバーガラス上で、ウシ血清を補充したダルベッコの改良イーグル培地中において増殖させた。カバーガラス上の細胞をＨＢＳＳ＋で洗浄し、次いで室温で３０分間、ＨＢＳＳ＋中に２μＭまたは０．２μＭの最終濃度に調製された染料８３５の溶液中でインキュベートした。次いで細胞をＨＢＳＳ＋で洗浄し、エピ蛍光顕微鏡によりロングパス−フルオレセインフィルターセットを用いて観察した。ロングパス−フルオレセインフィルターセットを通して観察した場合、３０分後にすべての細胞が核および細胞質の双方とも緑色に、ただし異なる強度に染色された。０．２μＭの染料を装填した細胞が明瞭なミトコンドリア染色を示し、一方２μＭの染料と共にインキュベートした細胞においては細胞質の蛍光の中断がより少ないように思われた。核の染色はかなり均一であり、核小体領域に濃縮されてはいなかった。対比染料であるエチジウムホモダイマーを用いて測定された細胞生存率は、全体を通じて維持された。

実施例２２：無細胞核酸の染色溶液中のＤＮＡまたはＲＮＡの量を定量するために、染料６１をＤＭＳＯ中の１０ｍＭ原液として調製し、次いでＴＥＮ緩衝液（２Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭトリス，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４に調整）中に２μＭに希釈した。１−４０μｇ／ｍＬのウシ胸腺ＤＮＡまたは酵母リボソームＲＮＡの溶液をＴＥＮ緩衝液中に調製し、希釈された染料と１：１で混合した。１００μＬの試料の蛍光をサイトフルオル蛍光ミクロプレート読取り装置で測定した。ＤＮＡまたはＲＮＡ濃度の増大に伴って直線的な蛍光増大が得られた。

実施例２３：蛍光測定器を用いた定量分析３０μＭの染料６２４を装入したキュベットに、最終密度１０^５−１０^８細菌／ｍＬとなすのに十分な細胞を添加し、５分間インキュベートすることにより、大腸菌懸濁液の密度が示された。この懸濁液を４８０ｎｍで励起し、懸濁液の蛍光発光スペクトルを蛍光測定器により測定した。細菌懸濁液の緑色の蛍光が、細菌密度の１桁毎の変化に伴って増大した。

実施例２４：視覚による観察を用いた生存率分析標準的なフィコール密度勾配法を用いて、ヤギ全血から末梢血リンパ球を単離した。細胞接着剤で被覆したカバーガラスを用いて、細胞を緩衝生理食塩水中でインキュベートした。細胞はカバーガラスに付着したのち、下記のいずれかによりインキュベートされた：ａ）１μＭの染料６３７と共に３０分間、次いで洗浄したのち１μＭのカルセインＡＭと共に３０分間インキュベート、またはｂ）上記と同様であるが、ただしまずカルセインＡＭで標識したのち染料６３７で染色。
生理食塩水で洗浄したのち、カルセインの蛍光を見るためにロングパス−フルオレセインフィルターセットを通して、かつ染料６３７の発光を見るためにロングパス−テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ，登録商標）フィルターセットを通して、染色された細胞を観察した。大部分の細胞が赤および緑両方のフィルターを用いて見ることができた。ただし死んだ細胞は染料６３７によってのみ染色され、染色のオーダーに関係なく、緑色の蛍光を示さなかった。

実施例２５：フローサイトメトリーを用いた生存率分析大腸菌または黄色ブドウ球菌の培養物を３０ｍＬの栄養ブロス中で、対数増殖後期まで増殖させた。培養物の懸濁液２５ｍＬを１０，０００ｒｐｍで１０−１５分間遠心分離することにより濃縮した。上清を廃棄し、ペレットを２ｍＬの濾過された無菌水中で摩砕することにより再懸濁した。それぞれ２０ｍＬの無菌水（生菌標準品用）、および２０ｍＬの７０％イソプロピルアルコール（死菌標準品用）を入れた２本の３０−４０ｍＬ遠心管を用意した。それぞれの遠心管に１ｍＬの再懸濁細菌試料を添加した。次いで両方の遠心管を室温で１時間、１５分毎に混合しながらインキュベートした。次いで両方の試料を上記に従って遠心分離し、洗浄した。次いでペレットを別個の試験管中で各試験管中の１０ｍＬの無菌水により再懸濁した。次いで各懸濁液の光学濃度を６７０ｎｍで測定した。次いで懸濁液の光学濃度を大腸菌については１×１０^８細菌／ｍＬ（０．０３ ＯＤ_６７０）に、黄色ブドウ球菌については１×１０^７細菌／ｍＬ（０．１４９ ＯＤ_６７０）に調整した。次いで１×１０^８細菌／ｍＬ（０．０３ ＯＤ_６７０）懸濁液を無菌水中に１：１００に希釈して、両方の細菌試料につき最終細菌密度１×１０^６細菌／ｍＬを得た。１０％の増分で０−１００％の生菌：死菌の比率を得るために、１１種類の異なる割合の大腸菌を調製した。各細菌試料の容量は２ｍＬであった。
染料６２４においては１．６７ｍＭ、ヨウ化プロピジウムにおいては１０ｍＭの染色液を調製した。１１試料のそれぞれを６μＬの染色液で染色し、十分に混合した。試料を暗所で１５分間インキュベートした。
アルゴンレーザー（４８８ｎｍで励起）、２個の光増倍管（ＰＭＴ）、および７６μｍのフローティップ（ｆｌｏｗ ｔｉｐ）を備えたフローサイトメーター（クールター・エレクトロニクス、フロリダ州ハイアリーア）により、細菌試料を分析した。発光光路には５１５ｎｍの遮蔽フィルター、グリーンＰＭＴ前に５９０ｎｍの二色性フィルター、レッドＰＭＴ前に６１０ｎｍの吸光フィルターが収容されている。生菌および死菌は共に測定可能な緑色信号を示すので、蛍光捕捉は対数積分緑色蛍光（ＬＩＧＦＬ）上でゲートされ、ＬＩＧＦＬ上に１５％の水準で識別された。細菌集団はＬＩＲＦＬ対ＬＩＧＦＬの比率により識別され、これらの領域内で見られる細菌の個数を用いてその集団内の生存生物の％を判定した。

実施例２６：ミクロプレート読取り装置を用いた生存率分析大腸菌または黄色ブドウ球菌の生菌および死菌の懸濁液を実施例２５に従って調製し、ただし黄色ブドウ球菌の懸濁液は５×１０^６細菌／ｍＬ（０．０７４ＯＤ_６７０）の光学濃度に調整され、生菌および死菌の漸増混合物を同様に調製した。無菌濾過した水を試薬ブランクとして用いた。
染料６２４においては１．６７ｍＭ、ヨウ化プロピジウムにおいては１０ｍＭの染色液を調製した。６．６ｍＬの無菌水に４０μＬの染色液を添加し、この新たな溶液を十分に混合した。
９６ウェルの平底ミクロプレートの各試験ウェルに１００μＬの混合生菌／死菌懸濁液をピペットで添加した。各列につき新たなピペット口を用いて、その列の適切なウェルに１００μＬの希釈染料溶液をピペットで添加した。次いでプレートを暗所で１５分間インキュベートした。適切な増量設定およびフィルターをその蛍光ミクロプレート読取り装置に設定した。励起フィルターを４８５±２０ｎｍ（青色）に設定し、発光フィルターを５３０±２５ｎｍ（１）に設定した。プレート全体の蛍光発光強度を測定し、データを保存した。青色の励起を維持した状態で発光フィルターを６２０±４０ｎｍ（２）に設定した。プレート全体の蛍光発光強度を測定し、データを保存した。各フィルター組み合わせにつき、水中の試薬溶液の蛍光を染色された細胞の蛍光から差し引き、そして補正された蛍光発光１を蛍光発光２で割ることにより、蛍光データを分析した。補正された比率を生菌懸濁液％に対してプロットし、細菌試料における生菌／死菌の比率を判定するための検量曲線として用いた。

実施例２７：フローサイトメトリーを用いた細胞識別Ｋ_３ＥＤＴＡを装入した試験管に血液を無菌的に採取し、室温に保持した。５μＬの全血を、１３５ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌおよび２０ｍＭ Ｎａ−ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４（ＨＢＳＳ−）中の染料６２８または５９１の３０−９０ｎＭ溶液１ｍＬに添加した。懸濁液を室温で１０分ないし３時間インキュベートした。赤血球集団にゲートすることにより細胞をフローサイトメーターで分析した。蛍光を４８８ｎｍで励起し、５２０−５５０ｎｍで発光を測定した。染料を含まない赤血球集団の自己蛍光を上回る蛍光を示す細胞を網状赤血球として計数した。患者の血液試料の網状赤血球染色を、網状赤血球標準品（レティック・チェック、ストレック）の染色と比較した。市販の網状赤血球標準品、ならびに正常血液中および溶血性貧血を伴う患者からの血液中の網状赤血球集団の測定の両方によれば、染料５９１および６２８は網状赤血球の染色に有効な染料である。

実施例２８：複数の染料を用いた細胞識別水中の黄色ブドウ球菌（５×１０^５／ｍＬ）および大腸菌（１×１０^６／ｍＬ）の混合細菌懸濁液のグラム反応および生存率が、１μＭのＴＯＴＯ−１染料（モレキュラープローブ）を５μＭの６２４および１μＭのヘキシジウムブロミド染料（Ｃ_６アルキル置換フェナントリジウム、ワトキンス（Ｗａｔｋｉｎｓ），Ｊ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．３０５９（１９５２））と共に細菌に装填することにより、自動蛍光顕微鏡測定によって測定された。染料はすべて１ｍＭ ＤＭＳＯ原液を水に希釈することにより調製された。死菌はすべて著しく鮮明な蛍光性黄緑色に見えたが、黄色ブドウ球菌の生菌は橙赤色に見え、大腸菌の生菌は緑色に見えた（図１および表５）。核酸を伴わない細胞フラグメントは染色されなかった。４８８ｎｍアルゴンレーザーを備えたフローサイトメーターを用いて、２倍低い濃度の同一染料で染色された細胞を分析した。細胞を赤／緑比に基づいて選別および計数した。３集団が区別された。

実施例２８：細菌性汚染の検出ＨＢＳＳ−で５０：５０に希釈された血液３０μＬを用いてヤギ全血スミアを調製した。血液１００μＬ当たり５μＬのミコバクテリウム・フレイ（１％ＴＸ−１００中）を含む、または含まない血液をスミアに用いた。スミアを風乾し、５０℃で２時間、熱固定した。スミアに水中５μＭの染色６２８を１５μＬ添加した。カバーガラスを染料液滴に乗せ、シールした。細菌は３０秒以内に見えた。ミコバクテリアを添加した血液中には多数の著しく鮮明な細菌が見えた。ミコバクテリアを添加しない血液中には数個の微小な明るい点とは別に、低いバックグラウンド蛍光が観察された。これらの点はエピ蛍光顕微鏡検査により４０倍または１００倍の対物レンズを用いて観察した場合、細菌よりはるかに小さく、それほど明るくはなかった。
以上、本発明を図面および例によって詳細に記述したが、以下の請求の範囲に記載された本発明の精神および範囲から逸脱することなく多数の修飾、置換および変更が可能である。

番号を付けた各パネル（１−１５）は、表５に示した染料の組み合わせにそのまま対応する。

Claims (2)

1. 次式の化合物：
   ［これらの式中：Ｒ^５はシクロヘキシル、シクロヘキセニル、モルホリノ、ピペリジニル、ナフチル、フェニル、チエニル、ベンゾチアゾリル、フラニル、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、およびピリジニルからなる群から選択され、これは置換されていないか、または所望により独立してハロゲン、アルキル、ペルフルオロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシもしくはカルボキシアルキル（１−６個の炭素を有する）により１または２回以上置換された置換基であり；Ｂはメチルであり；Ｒ^３、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３およびＲ^１４は独立してＨ、または１−６個の炭素を有するアルキル基であり；Ｒ^４はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉまたは−ＯＳＯ_２Ｒ^１９であり、ここでＲ^１９は１−６個の炭素を有するアルキル、または１−６個の炭素を有するペルフルオロアルキル、またはアリールである］。
2. 次式の化合物：
   または次式の化合物：
   ［これらの式中：Ｒ^５はシクロヘキシル、シクロヘキセニル、モルホリノ、ピペリジニル、ナフチル、フェニル、チエニル、ベンゾチアゾリル、フラニル、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、およびピリジニルからなる群から選択され、これは置換されていないか、または所望により独立してハロゲン、アルキル、ペルフルオロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシもしくはカルボキシアルキル（１−６個の炭素を有する）により１または２回以上置換された置換基であり；Ｂはメチルであり；Ｒ^３、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３およびＲ^１４は独立してＨ、または１−６個の炭素を有するアルキル基であり；Ｒ^４はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉまたは−ＯＳＯ_２Ｒ^１９であり、ここでＲ^１９は１−６個の炭素を有するアルキル、または１−６個の炭素を有するペルフルオロアルキル、またはアリールである］。