CN107636165A - 用于核酸文库质量控制和定量的方法、系统和其组合物 - Google Patents

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CN107636165A CN201680014521.XA CN201680014521A CN107636165A CN 107636165 A CN107636165 A CN 107636165A CN 201680014521 A CN201680014521 A CN 201680014521A CN 107636165 A CN107636165 A CN 107636165A
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Abstract

描述了在大规模平行测序之前用于双链核酸文库的核酸文库质量控制和定量的方法、系统、试剂盒和组合物。使用经可检测标记的单链大小确定梯在通道内的电泳分离可用于界定双链核酸的分子量范围和量。

Description

用于核酸文库质量控制和定量的方法、系统和其组合物
下一代测序(NGS)工作流程需要良好的文库构建，以便在大规模平行测序策略中提供成功的结果。对良好DNA文库的要求包括以下要求：在工作流程的预备步骤中产生的多个双链核酸具有预先选择的长度范围，包括引物和接头序列，并且必须经定量足以确定有效文库加载到测序步骤中，由此在NGS工作流程中生成良好的测序数据。需要改善的工作流程、更简单的仪器需求和增加的检测灵敏度。这里所描述的方法可以应用于从任何方法获得的任何多个双链核酸，需要了解所述多个双链核酸的长度范围和其中所含材料的量，并且绝不限于NGS文库。
发明内容
在第一方面，提供一种用于测定多个双链核酸的长度范围的方法，其包括以下步骤：使多个双链核酸与a)第一染料和b)经可检测标记的单链大小确定梯在第一染料被配置成标记双链核酸的条件下接触；产生包含多个经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链大小确定梯的混合物；使混合物在移动性依赖分离条件下迁移；分离多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个；以及测定多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间。在各种实施例中，所述方法可另外包括测定经可检测标记的单链大小确定梯的多个片段中每一个的迁移时间。所述方法可另外包括将多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间转换成长度。在一些实施例中，转换步骤可包括以下步骤：比较经第一染料标记的双链核酸的迁移时间与经可检测标记的单链大小确定梯的至少一个片段的迁移时间。在一些实施例中，比较经第一染料标记的双链核酸的迁移时间与经可检测标记的单链大小确定梯的至少一个片段的迁移时间可包括比较经第一染料标记的双链核酸迁移时间与经可检测标记的单链大小确定梯的多个片段迁移时间。在各种实施例中，转换多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间可另外包括基于分配给经可检测标记的单链大小确定梯的每个片段的相关性因数分配每个经第一染料标记的双链核酸的长度。
在所述方法的各种实施例中，多个双链核酸可以是具有至少一部分双链结构的核糖核酸。
在所述方法的各种实施例中，第一染料可被配置成标记多个双链核酸的至少一个可检测部分。在一些实施例中，第一染料可被配置成标记多个双链核酸的相当大一部分。在各种实施例中，第一染料可以非共价标记多个双链核酸。在一些实施例中，第一染料可以非共价标记多个双链核酸中的每一个。在各种实施例中，第一染料可以作为嵌入染料标记多个双链核酸中的每一个。
在所述方法的各种实施例中，第一染料可被配置成基本上不标记单链核酸。
在所述方法的各种实施例中，第一染料具有式I结构：
其中X是O、S、Se或C(CH3)；R1是C1-C6烷基；n＝0、1或2；Y是--CH2═CH2-，其中p和q等于0或1，使得p+q＝1；K1和K2是相同或不同的，并且独立地是氢、具有1-6个碳的烷基、或芳基；或K1和K2组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；LINK是含有4至19个亚甲基(--CH2--)的主链的脂肪族链，其任选地以一个或多个间隔穿插有杂原子，每个杂原子独立地是N、O或S，其中每个N杂原子另外经1-2个H或1-2个具有1至6个碳的烷基取代，所述烷基取代基可以是相同或不同的，限制条件是任何杂原子与另一杂原子分隔至少2个亚甲基，其中LINK的一个亚甲基端连接到吡啶鎓或喹啉鎓杂环的氮原子且LINK的另一个亚甲基端连接到A，除了在A是H或CH3的情况下，LINK必须含有至少一个N杂原子；A是H、CH3或具有式A结构：
其中W是O、S、Se或C(CH3)；R2是C1-C6烷基；m＝0、1或2；Y是--CH2═CH2--，其中下标r和s等于0或1，使得r+s＝1；K3和K4可以是相同或不同的，并且独立地是氢、具有1-6个碳的烷基、或芳基；或K3和K4组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；当A不是H或CH3时，m和n可以是相同或不同的；并且W和X可以是相同或不同的。在一些实施例中，第一染料可以是式I的花青染料，其中X是O；R1是甲基；次甲基桥键是单次甲基，其中n是0；Yp的p＝0并且Yq的q＝1；K1和K2组合在一起完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；LINK的主链具有9-12个亚甲基并以两个间隔穿插有氮原子，其中每个氮原子经C1-C6碳单取代或二取代，并且另外其中两个氮原子彼此分隔至少两个亚甲基；A具有式A结构：
其中W是O；R2是甲基；次甲基桥键是单次甲基，其中m＝0；Yr的r＝0并且Ys的s＝1；并且K3和K4组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统。
在所述方法的各种实施例中，移动性依赖分离可以在至少一种变性添加剂存在下进行。在一些实施例中，移动性依赖分离条件可被配置成维持标记多个双链核酸中的每一个的第一染料标记至少一个可检测的量。在各种实施例中，移动性依赖分离条件可包括被配置成维持经第一染料标记的双链核酸至少可检测的量的运行温度。在各种实施例中，运行温度可以是多个经第一染料标记的双链核酸保留第一染料标记的温度。在各种实施例中，移动性依赖分离条件可基本上维持多个经第一染料标记的双链核酸的标记至少第一部分的第一染料标记。在各种实施例中，维持在移动性依赖分离条件下的经第一染料标记的双链核酸中每一个的比例可以与迁移时间相关。在各种实施例中，移动性依赖分离条件可不包括变性添加剂。在各种实施例中，移动性依赖分离条件可被配置成基本上维持标记多个双链核酸中每一个的第一染料标记。
在所述方法的各种实施例中，经可检测标记的单链大小确定梯可以经第二染料共价标记。在各种实施例中，第二染料可以在光谱上与第一染料可分辨开。
在各种实施例中，所述方法可另外包括通过使多个经第一染料标记的双链核酸的至少第一多个检测到的峰的一个或多个曲线下面积与经可检测标记的大小确定梯片段的第二多个检测到的峰的至少一个或多个曲线下面积相关联而获得多个双链核酸的定量。在一些实施例中，多个经第一染料标记的双链核酸的至少第一多个检测到的峰可以是多个经第一染料标记的双链核酸的所有检测到的峰。
在各种实施例中，所述方法可另外包括将多个经第一染料标记的双链核酸的所有相关曲线下面积求和，由此提供多个双链核酸的定量。
在另一方面，提供一种定量多个双链核酸的量的方法，其包括：使多个双链核酸与a)第一染料和b)经可检测标记的单链大小确定梯在第一染料被配置成标记双链核酸的条件下接触；产生包含多个经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链大小确定梯的混合物；使混合物在移动性依赖分离条件下迁移；分离多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个；接收与多个第一染料双链核酸相关的荧光数据，其中荧光数据可包括随时间推移的强度值；鉴别荧光数据内的峰；测定峰的面积；并且将峰的面积数据归一化以生成经第一染料标记的双链核酸的相对浓度值。
在又一方面，提供一种生成校准曲线的方法，其包括：接收与以下各项相关的数据：a)使多个经第一染料标记的双链核酸在移动性依赖分离条件下迁移，其中每个双链核酸的大小是已知的，b)使多个经可检测标记的单链参考核酸在移动性依赖分离条件下迁移，其中每个经可检测标记的单链参考核酸的大小是已知的，c)分离多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个并测定多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间，以及d)分离经可检测标记的单链参考核酸中的每一个并测定经可检测标记的单链参考核酸中每一个的迁移时间；基于所测定的多个经第一染料标记的双链核酸的迁移时间和所测定的经可检测标记的单链参考核酸的迁移时间，内插单链参考核酸的相关大小；以及生成关于经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链参考核酸的校准曲线。在一些实施例中，校准曲线可用于确定经第一染料标记的未知双链核酸的大小。在各种实施例中，生成校准曲线的方法可另外包括将校准曲线存储在存储器中。
在另一方面，提供一种经通过处理器可执行的指令编码的计算机可读存储媒体，指令包括用于以下的指令：接收与以下各项相关的数据：a)使多个经第一染料标记的双链核酸在移动性依赖分离条件下迁移，其中每个双链核酸的大小是已知的，b)使多个经可检测标记的单链参考核酸在移动性依赖分离条件下迁移，其中每个经可检测标记的单链参考核酸的大小是已知的，c)分离多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个并测定多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间，以及d)分离经可检测标记的单链参考核酸中的每一个并测定经可检测标记的单链参考核酸中每一个的迁移时间；基于所测定的多个经第一染料标记的双链核酸的迁移时间和所测定的经可检测标记的单链参考核酸的迁移时间，内插单链参考核酸的相关大小；以及生成关于经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链参考核酸的校准曲线。
在又一方面，提供一种用于生成校准曲线的系统，所述系统包括：荧光检测器接口，被配置成接收与以下各项相关的数据：a)使多个经第一染料标记的双链核酸在移动性依赖分离条件下迁移，其中每个双链核酸的大小是已知的，b)使多个经可检测标记的单链参考核酸在移动性依赖分离条件下迁移，其中每个经可检测标记的单链参考核酸的大小是已知的，c)分离多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个，d)测定多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间，以及e)分离经可检测标记的单链参考核酸中的每一个并测定经可检测标记的单链参考核酸中每一个的迁移时间；迁移时间相关器，被配置成：a)基于所测定的多个经第一染料标记的双链核酸的迁移时间和所测定的经可检测标记的单链参考核酸的迁移时间，内插单链参考核酸的相关大小，以及b)生成关于经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链参考核酸的校准曲线；校准曲线数据库，被配置成存储校准曲线；以及显示器，被配置成向用户显示校准曲线。
在另一方面，提供一种用于生成校准曲线的系统，所述系统包括：处理器；和经通过处理器可执行的指令编码的存储器，指令用于接收与以下各项相关的数据：a)使多个经第一染料标记的双链核酸在移动性依赖分离条件下迁移，其中每个双链核酸的大小是已知的，b)使多个经可检测标记的单链参考核酸在移动性依赖分离条件下迁移，其中每个经可检测标记的单链参考核酸的大小是已知的，c)分离多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个并测定多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间，以及d)分离经可检测标记的单链参考核酸中的每一个并测定经可检测标记的单链参考核酸中每一个的迁移时间；基于所测定的多个经第一染料标记的双链核酸的迁移时间和所测定的经可检测标记的单链参考核酸的迁移时间，内插单链参考核酸的相关大小；以及生成关于经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链参考核酸的校准曲线。
在另一方面，提供一种测定相对浓度的方法，所述方法包括：接收与经第一染料标记的双链核酸相关的荧光数据，其中荧光数据包括随时间推移的强度值；鉴别荧光数据内的峰；测定峰的面积；以及将峰的面积数据归一化以生成经第一染料标记的双链核酸的相对浓度值。
在又一方面，提供一种经通过处理器可执行的指令编码的计算机可读存储媒体，指令包括用于以下的指令：接收与经第一染料标记的双链核酸相关的荧光数据，其中荧光数据包括随时间推移的强度值；鉴别荧光数据内的峰；测定峰的面积；以及将峰的面积数据归一化以生成经第一染料标记的双链核酸的相对浓度值。
在另一方面，提供一种用于测定相对浓度的系统，所述系统包括：荧光检测器接口，被配置成接收与经第一染料标记的双链核酸相关的荧光数据，其中荧光数据包括随时间推移的强度值；相对浓度计算器，被配置成：a)鉴别荧光数据内的峰，b)测定峰的面积，以及c)将峰的面积数据归一化以生成经第一染料标记的双链核酸的相对浓度值；相对浓度数据库，被配置成存储相对浓度值；以及显示器，用于向用户显示相对浓度值。
在另一方面，提供一种用于测定相对浓度的系统，所述系统包括：处理器；和经通过处理器可执行的指令编码的存储器，指令用于：a)接收与经第一染料标记的双链核酸相关的荧光数据，其中荧光数据包括随时间推移的强度值；b)鉴别荧光数据内的峰；c)测定峰的面积；以及d)将峰的面积数据归一化以生成经第一染料标记的双链核酸的相对浓度值。
在又一方面，提供一种用于测定多个双链核酸的长度范围的系统；包括：反应器容器，被配置用于a)使第一染料与多个双链核酸接触，其中第一染料可标记多个双链核酸中的每一个，和b)允许添加经可检测标记的单链大小确定梯；通道，被配置成使经可检测标记的单链大小确定梯和多个经第一染料标记的双链核酸的混合物迁移；可操作地连接到通道的阳极和阴极，被配置成向通道提供电场；以及检测器，被配置成检测第一染料和经可检测标记的单链大小确定梯的标记。在各种实施例中，检测器可检测紫外线吸光度、可见光吸光度、荧光或化学发光。在各种实施例中，所述系统可另外包括通道的温度可控环境。在各种实施例中，所述系统可另外包括反应器容器的温度可控环境。在各种实施例中，所述系统另外包括可操作地连接到检测器的数据处理器。
在所述系统的各种实施例中，通道可另外包括分离介质。在一些实施例中，分离介质可以是筛分介质。在一些实施例中，通道可另外包括变性添加剂。在各种实施例中，通道可以配置在微流体芯片内。在各种实施例中，通道可以是电泳毛细管。通道可以是多通道阵列的一部分。
在另一方面，提供一种用于测定多个双链核酸的长度范围的试剂盒；包括：被配置成标记双链核酸的第一染料；和经可检测标记的单链大小确定梯。在各种实施例中，第一染料可以非共价标记双链核酸。在一些实施例中，第一染料可以是嵌入剂。在所述试剂盒的各种实施例中，经可检测标记的单链大小确定梯可以被共价标记。在各种实施例中，经可检测标记的单链大小确定梯可以被荧光标记。在各种实施例中，经可检测标记的单链大小确定梯可以用芘、萘、氨基吡啶、氧杂蒽、花青、香豆素、硼聚吖吲得辛(borapolyazaindacine)、苯并呋喃或吲哚染料标记。
在所述试剂盒的各种实施例中，第一染料可以是花青染料、吖啶染料或菲啶染料。在各种实施例中，第一染料是花青染料并且可以是单次甲基花青染料。在各种实施例中，第一染料是花青染料并且可以是二聚花青染料。在所述试剂盒的各种实施例中，第一染料具有式I结构：
其中X是O、S、Se或C(CH3)；R1是C1-C6烷基；n＝0、1或2；Y是--CH2═CH2-，其中p和q等于0或1，使得p+q＝1；K1和K2是相同或不同的，并且独立地是氢、具有1-6个碳的烷基、或芳基；或K1和K2组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；LINK是含有4至19个亚甲基(--CH2--)的主链的脂肪族链，其任选地以一个或多个间隔穿插有杂原子，每个杂原子独立地是N、O或S，其中每个N杂原子另外经1-2个H或1-2个具有1至6个碳的烷基取代，所述烷基取代基可以是相同或不同的，限制条件是任何杂原子与另一杂原子分隔至少2个亚甲基，其中LINK的一个亚甲基端连接到吡啶鎓或喹啉鎓杂环的氮原子且LINK的另一个亚甲基端连接到A，除了在A是H或CH3的情况下，LINK必须含有至少一个N杂原子；A是H、CH3或具有式A结构：
其中W是O、S、Se或C(CH3)；R2是C1-C6烷基；m＝0、1或2；Y是--CH2═CH2--，其中下标r和s等于0或1，使得r+s＝1；K3和K4可以是相同或不同的，并且独立地是氢、具有1-6个碳的烷基、或芳基；或K3和K4组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；当A不是H或CH3时，m和n可以是相同或不同的；并且W和X可以是相同或不同的。
在一些实施例中，第一染料可以是式I的花青染料，其中X是O；R1是甲基；次甲基桥键是单次甲基，其中n是0；Yp的p＝0并且Yq的q＝1；K1和K2组合在一起完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；LINK的主链具有9-12个亚甲基并以两个间隔穿插有氮原子，其中每个氮原子经C1-C6碳单取代或二取代，并且另外其中两个氮原子彼此分隔至少两个亚甲基；A具有式A结构：
其中W是O；R2是甲基；次甲基桥键是单次甲基，其中m＝0；Yr的r＝0并且Ys的s＝1；并且K3和K4组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统。
在所述试剂盒的各种实施例中，第一染料可以在光谱上与标记经可检测标记的单链大小确定梯的第二染料可分辨开。
在所述试剂盒的各种实施例中，所述试剂盒可另外包括合并在微流体芯片中的通道。在所述试剂盒的各种实施例中，通道可包括分离介质。在各种实施例中，通道可包括变性添加剂。在所述试剂盒的各种实施例中，通道可包括缓冲溶液。
在另一方面，提供一种用于测定多个双链核酸的长度范围的组合物，包括：被配置成标记双链核酸的第一染料；多个双链核酸；以及经可检测标记的单链大小确定梯。在各种实施例中，多个双链核酸可以是具有至少一部分双链结构的核糖核酸。在其它实施例中，多个双链核酸可以是DNA。在各种实施例中，所述组合物可另外包括变性添加剂。在各种实施例中，第一染料可被配置成不标记单链核酸。在各种实施例中，第一染料可以非共价标记双链核酸。在各种实施例中，第一染料是嵌入染料。在各种实施例中，经可检测标记的单链大小确定梯可以被共价标记。在各种实施例中，经可检测标记的单链大小确定梯可以被荧光标记。在各种实施例中，经可检测标记的单链大小确定梯可以用芘、萘、氨基吡啶、氧杂蒽、花青、香豆素、硼聚吖吲得辛、苯并呋喃或吲哚染料标记。在各种实施例中，第一染料可以是花青染料、吖啶染料或菲啶染料。在各种实施例中，第一染料是花青染料并且可以选自单次甲基花青或二聚花青。
在所述组合物的各种实施例中，第一染料可具有式I结构：
其中X是O、S、Se或C(CH3)；R1是C1-C6烷基；n＝0、1或2；Y是--CH2═CH2-，其中p和q等于0或1，使得p+q＝1；K1和K2是相同或不同的，并且独立地是氢、具有1-6个碳的烷基、或芳基；或K1和K2组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；LINK是含有4至19个亚甲基(--CH2--)的主链的脂肪族链，其任选地以一个或多个间隔穿插有杂原子，每个杂原子独立地是N、O或S，其中每个N杂原子另外经1-2个H或1-2个具有1至6个碳的烷基取代，所述烷基取代基可以是相同或不同的，限制条件是任何杂原子与另一杂原子分隔至少2个亚甲基，其中LINK的一个亚甲基端连接到吡啶鎓或喹啉鎓杂环的氮原子且LINK的另一个亚甲基端连接到A，除了在A是H或CH3的情况下，LINK必须含有至少一个N杂原子；A是H、CH3或具有式A结构：
其中W是O、S、Se或C(CH3)；R2是C1-C6烷基；m＝0、1或2；Y是--CH2═CH2--，其中下标r和s等于0或1，使得r+s＝1；K3和K4可以是相同或不同的，并且独立地是氢、具有1-6个碳的烷基、或芳基；或K3和K4组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；当A不是H或CH3时，m和n可以是相同或不同的；并且W和X可以是相同或不同的。
在一些实施例中，第一染料可以是式I的花青染料，其中X是O；R1是甲基；次甲基桥键是单次甲基，其中n是0；Yp的p＝0并且Yq的q＝1；K1和K2组合在一起完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；LINK的主链具有9-12个亚甲基并以两个间隔穿插有氮原子，其中每个氮原子经C1-C6碳单取代或二取代，并且另外其中两个氮原子彼此分隔至少两个亚甲基；A具有式A结构：
其中W是O；R2是甲基；次甲基桥键是单次甲基，其中m＝0；Yr的r＝0并且Ys的s＝1；并且K3和K4组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统。
在各种实施例中，第一染料可以在光谱上与标记经可检测标记的单链大小确定梯的染料可分辨开。
本文中参考多种专利、专利申请和其它出版物，其全部都以全文引用的方式并入本文中。此外，以下标准参考著作以引用的方式并入本文中：《现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)》,约翰·威利父子出版公司(John Wiley&Sons),纽约,截至2007年10月的版本；Sambrook,Russell和Sambrook,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第3版,冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press),冷泉港,2001。在本说明书与以引用的方式并入的任何文件之间相矛盾的情况下，应以本说明书为准，应了解，判定是否存在矛盾或不一致属于本发明人的判断范围内并且可以在任何时间进行。
本发明教示的额外特征和优点将由以下说明显示，并且将部分由所述说明显而易见，或可通过实践本发明教示得知。应理解，先前概述和以下详细描述都仅是示例性和解释性的并且打算提供本发明教示的进一步说明而不限制本发明教示。
本文所用的章节标题仅用于组织目的并且不应解释为以任何方式限制所要主题。本说明书中引用的所有文献，包括(但不限于)专利、专利申请、文章、书籍以及论文，全都出于任何目的以全文引用的方式明确地并入本文中。在所并入的任何文献与本说明书中所定义的任何术语相矛盾的情况下，以本说明书为准。虽然结合各种实施例描述本发明教示，但是并不打算将本发明教示限制于这类实施例。相反，如所属领域的技术人员应了解，本发明教示涵盖各种替代方案、修改以及等效物。
附图说明
图1是根据本文所述的各种实施例使用校准曲线确定样品大小的示意图。
图2是根据本文所述的各种实施例生成的校准曲线的图形表示。
图3是根据本文所述的各种实施例的峰检测和归一化的图形表示。
图4示出了根据本文所述的各种实施例的峰归一化面积以确定样品的相对浓度。
图5是经共价标记的双链大小确定梯分离的电泳图的图形表示，所述经共价标记的双链大小确定梯是经染料标记的双链核酸文库的模型。分离是在完全变性条件(6-8M脲)下使用筛分介质(POP-赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))来进行。示出四个电泳图条带并且从所述图的顶部条带至底部第四条带，运行温度降低10℃，从60℃、50℃、40℃至30℃。
图6是与图5中相同模型的多个双链核酸分离的电泳图的图形表示，全都使用与图3相同的分离介质来进行，并且在40℃下运行。所示出的顶部、中间和底部电泳图条带中的每一个是不同的毛细管运行。
图7是与图5中相同模型的多个双链核酸分离的四个电泳图的图形表示，所述电泳图重叠以显示在这些条件下迁移的再现性。
图8是被配置用于方法和系统中的计算系统的示意图。
图9是被配置用于方法和系统中的典型互联网网络配置的示意图。
图10是说明根据本文所述的各种实施例的用于生成校准曲线的系统的框图。
图11是说明根据本文所述的各种实施例的用于生成校准曲线的方法的流程图。
图12是说明根据本文所述的各种实施例的用于测定相对样品浓度的系统的框图。
图13是说明根据本文所述的各种实施例的用于测定相对样品浓度的方法的流程图。
图14是大致179bp双链扩增子和设计成大小约200bp的双链核酸文库的电泳图的图形表示，每个双链核酸经第一染料标记，并且经光谱可分辨的第二染料可检测标记的单链大小确定梯具有至多1200bp的范围。
图15是设计成大小约200bp的双链核酸文库的电泳图的图形表示，每个双链核酸经第一染料标记，并且经光谱可分辨的第二染料可检测标记的单链大小确定梯具有至多1200bp的范围。
图16是大致197bp双链扩增子和设计成大小约400bp的双链核酸文库的电泳图的图形表示，每个双链核酸经第一染料标记，并且经光谱可分辨的第二染料可检测标记的单链大小确定梯具有至多1200bp的范围。
图17是设计成大小约400bp的双链核酸文库的电泳图的图形表示，每个双链核酸经第一染料标记，并且经光谱可分辨的第二染料可检测标记的单链大小确定梯具有至多1200bp的范围。
图18是大致172bp双链扩增子和设计成大小约200bp的双链核酸文库的电泳图的图形表示，每个双链核酸经第一染料标记，并且经光谱可分辨的第二染料可检测标记的单链大小确定梯具有至多1200bp的范围。
图19是设计成大小约200bp的双链核酸文库的电泳图的图形表示，每个双链核酸经第一染料标记，并且经光谱可分辨的第二染料可检测标记的单链大小确定梯具有至多1200bp的范围。
图20是大致197bp双链扩增子和设计成大小约400bp的双链核酸文库的电泳图的图形表示，每个双链核酸经第一染料标记，并且经光谱可分辨的第二染料可检测标记的单链大小确定梯具有至多1200bp的范围。
图21是设计成大小约400bp的双链核酸文库的电泳图的图形表示，每个双链核酸经第一染料标记，并且经光谱可分辨的第二染料可检测标记的单链大小确定梯具有至多1200bp的范围。
具体实施方式
如本文所用，“通道”和其衍生物是指能够支撑一定体积的分离介质(如本文所公开的用于分离经标记核酸的组合物)用于进行电泳的凹槽、管道或毛细管或其它结构。通道的几何结构可以差别很大并且包括(但不限于)具有环状、矩形或方形横截面的凹槽、毛细管或管道、凹槽等等，并且可以通过多种多样的技术制造。用于本发明的某些实施例的通道的一个特征是与一定体积的分离介质接触的表面的表面与体积比。此比率的值大通常允许在电泳期间从分离介质更好地热传递。
在某些实施例中，可以采用在约0.8至0.02m-1范围内的值。这些相当于具有内部直径在约5μm至约200μm范围内的环状横截面的管状通道的表面与体积比。术语“未涂布的通道”意思指在引入本发明的组合物之前未涂布(即在使用之前未涂布)的通道。在某些实施例中，用于本发明的通道是由硅石、熔融硅石、石英、基于硅酸酯的玻璃(如硼硅玻璃)、磷酸盐玻璃、含氧化铝的玻璃等等、或其它硅石样材料制成。在某些实施例中，使用塑料衬底中所形成的通道。塑料衬底可包含例如聚丙烯酸酯和聚烯烃，如(BASF，德国)、TPXTM(Matsui Plastics,Inc.，纽约州白原市(White Plains,NY))、(HoechstCelanese Corp.，新泽西州萨米特(Summit,N.J.))和(Zeon Chemicals，肯塔基州路易斯维尔(Louisville,Ky.))。塑料衬底的有关在这类衬底内形成的通道的描述，除了其它地方之外，可见于美国专利第5,750,015号中。通道可以是微流体结构的一部分。
如本文所用，“接触”和其衍生物，在关于两种或多于两种组分使用时，一般是指借以促进或实现所提及的组分的靠近、接近、混合或共混的任何工艺，并且可包括使含有所提及的组分中的任何一个或多个的溶液彼此混合。所提及的组分可以任何具体顺序或组合接触并且组分引述的具体顺序不具限制性。
如本文所用，“样品”和其衍生物是以其的意义使用并且包括疑似包括双链核酸的任何样本、培养物等等。包含至少一种双链核酸的样品可以从广泛多种来源获得，包括(但不限于)治疗性配制品和生物样品，其可包括(但不限于)细胞培养物、患者样品(包括组织、痰液、血液或尿液)或治疗剂的制造工艺。所述术语还包括任何经分离的核酸样品，如基因组DNA、新鲜冷冻或福尔马林(formalin)固定的石蜡包埋的核酸样本。
如本文所用，术语“移动性依赖分离”是指经标记的核酸由于与经标记的核酸相关联的电荷和大小而分离。
如本文所用，术语“荧光染料”是指吸收既定激发波长的光能并且发出不同波长的光能的部分。优选地，如果选择多个荧光染料用于一个实验，那么所述染料是光谱可分辨的。如本文所用，“光谱可分辨的”意思指染料可以在操作条件下基于其光谱特征(具体来说，荧光发射波长)而被区分。举例来说，一个或多个末端核苷酸的一致性可与最大发光强度的不同波长或可能不同波长处的强度比率相关。
如本文所用，术语“核苷酸”和其变异体是指(但不限于)任何天然存在的核苷酸或其类似物。虽然天然存在的核苷酸典型地包含碱基、糖和磷酸部分，但本发明的核苷酸可包括不具有这类部分中的任一个、一些或全部的化合物。在一些实施例中，核苷酸可以任选地包括包含三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个磷原子的磷原子链。在一些实施例中，磷链可以连接到糖环的任何碳，如5'碳。磷链可以用插入的O或S连接到糖。在一个实施例中，链中的一个或多个磷原子可以是具有P和O的磷酸基的一部分。在另一个实施例中，链中的磷原子可以用插入的O、NH、S、亚甲基、经取代的亚甲基、亚乙基、经取代的亚乙基、CNH2、C(O)、C(CH2)、CH2CH2或C(OH)CH2R(其中R可以是4-吡啶或1-咪唑)连接在一起。在一个实施例中，链中的磷原子可具有含O、BH3或S的侧基。在磷链中，具有除O以外的侧基的磷原子可以是经取代的磷酸基。在磷链中，具有除O以外的插入原子的磷原子可以是经取代的磷酸基。核苷酸类似物的一些实例描述于Xu的美国专利第7,405,281号中。在一些实施例中，核苷酸包含标记并且在本文中称为“经标记的核苷酸”；经标记的核苷酸的标记在本文中称为“核苷酸标记”。在一些实施例中，标记可呈连接到末端磷酸基(即距离糖最远的磷酸基)的荧光染料形式。可以用于所公开的方法和组合物中的核苷酸的一些实例包括(但不限于)核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸聚磷酸、脱氧核糖核苷酸聚磷酸、经修饰的核糖核苷酸聚磷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸聚磷酸、肽核苷酸、经修饰的肽核苷酸、金属核苷酸、膦酸核苷和经修饰的磷酸-糖主链核苷酸，前述化合物的类似物、衍生物或变异体等。在一些实施例中，核苷酸可包含非氧部分(例如硫基或硼烷部分)代替氧部分，桥连核苷酸的α磷酸与糖、或核苷酸的α与β磷酸、或核苷酸的β与γ磷酸、或核苷酸的任何其它两种磷酸之间、或其任何组合。“核苷酸5'-三磷酸”是指在5'位置具有三磷酸酯基的核苷酸，并且有时表示为“NTP”或“dNTP”和“ddNTP”以具体指出核糖的结构特征。三磷酸酯基可包括硫取代各种氧，例如α-硫基-核苷酸5'-三磷酸。关于核酸化学的综述，参见：Shabarova,Z.和Bogdanov,A.,《核酸的高级有机化学(AdvancedOrganic Chemistry of Nucleic Acids)》,VCH,纽约,1994。
如本文所用，术语“聚核苷酸”、“核酸”或“寡核苷酸”是指通过核苷间键接合的核苷(包括脱氧核糖核苷、核糖核苷或其类似物)的线性聚合物。每当聚核苷酸(如寡核苷酸)由一连串字母，如“ATGCCTG”表示时，应理解，除非另外指出，否则核苷酸按从左到右的5'→3'顺序并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，并且“T”表示脱氧胸苷。作为所属领域中的标准，字母A、C、G和T可用于指碱基本身、核苷或包含碱基的核苷酸。在天然存在的聚核苷酸中，核苷间键通常是磷酸二酯键，并且子单元称为“核苷酸”。在教示的某些实施例中，使用包含其它核苷间键(如硫代磷酸酯键)的寡核苷酸引物。聚核苷酸还可包括锁核酸(LNA)。应了解，与非磷酸二酯键一起构成这类寡核苷酸引物的子单元中的一个或多个可不包含磷酸基。这类核苷酸的类似物视为属于如本文所用的术语“核苷酸”的范围内并且包含一个或多个不是磷酸二酯键的核苷间键的核酸仍称为“聚核苷酸”、“寡核苷酸”等。
如本文所用，术语“硫代磷酸酯键”是指糖磷酸主链的磷酸酯键内包含代替非桥连氧原子的硫原子的核苷酸间键。术语硫代磷酸酯键是指硫代磷酸酯核苷酸间键和二硫代磷酸酯核苷酸间键。“末端3'端处的硫代磷酸酯键”是指3'端处的硫代磷酸酯键，也就是说，3'端处糖磷酸主链的最后一个磷酸酯键。
如本文所用，术语“磷酸二酯键”可以指键-PO4-，其用于连接核苷酸单体，如在天然存在的DNA中发现的核苷酸间键。此外，“磷酸二酯键”可以指本发明的化学增强型引物的NCM或NCM连接子的部分。
如本文所用，术语“核碱基”或“碱基”是指能够与互补核碱基或核碱基类似物(例如嘌呤、7-脱氮嘌呤或嘧啶)形成沃森-克里克(Watson-Crick)型氢键的含氮杂环部分。典型核碱基是天然存在的核碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5mC、尿嘧啶、胸腺嘧啶以及天然存在的核碱基的类似物，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、N6-Δ2异戊烯基-腺嘌呤(6iA)、N6-Δ2-异戊烯基-2-甲基硫腺嘌呤(2ms6iA)、N2-二甲基-鸟嘌呤(dmG)、7-甲基鸟嘌呤(7mG)、肌苷、水粉蕈素、硝基吡咯、硝基吲哚、2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基-嘌呤、次黄嘌呤、假尿苷、假胞苷、假异胞苷、5-丙炔基-胞苷、异胞苷、异鸟嘌呤、2-硫代嘧啶、6-硫鸟嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶、4-硫尿嘧啶、O6-甲基鸟嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶、5,6-二氢胸腺嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶、4-甲基吲哚、吡唑并[3,4-D]嘧啶(参见例如美国专利案第6,143,877号和第6,127,121号以及PCT公开申请WO 01/38584)和亚乙烯基腺嘌呤。核苷酸碱基的非限制性实例可见于例如Fasman,《生物化学和分子生物学实践手册(Practical Handbook of Biochemistry andMolecular Biology)》,第385-394页,CRC Press,佛罗里达州博卡拉顿(Boca Raton,Fla.)(1989)。
如本文所用，术语“端”和其变异体，在关于核酸分子使用时，可包括核酸分子的末端3个核苷酸、末端2个和甚至通常更多个末端核苷酸。由一连串连续核苷酸构成的线性核酸分子通常包括至少两端。在一些实施例中，核酸分子的一端可包括3'羟基或其等效物，并且可称为“3'端”和其衍生物。任选地，3'端包括未连接到单核苷酸戊糖环的5'磷酸基的3'羟基。
如本文所用，“5'端”和其衍生物一般是指核酸分子的一端，其在天然核酸中可包括游离5'磷酸基或其等效物。在一些实施例中，5'端包括5'磷酸基，其未连接到相邻单核苷酸戊糖环的3'羟基，但是任选地经由5'连接子连接到包括染料的可检测部分，所述染料可包括可见的荧光染料(包括聚合或能量转移染料)或化学发光染料。
可以显示具有形式电子电荷的所选化合物，而无适当生物相容性抗衡离子。这类抗衡离子用以平衡化合物上所存在的正电荷或负电荷。如本文所用，生物相容性物质在使用时无毒，并且对于生物分子基本上无有害作用。带负电荷抗衡离子的实例尤其包括氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、烷磺酸根、芳基磺酸根、磷酸根、高氯酸根、四氟硼酸根、四芳基硼化物、硝酸根以及芳香族或脂肪族羧酸的阴离子。优选的抗衡离子可包括氯离子、碘离子、高氯酸根和各种磺酸根。带正电荷抗衡离子的实例尤其包括碱金属或碱土金属离子、铵或烷基铵离子。
如本文所用，多个双链核酸(包括产生用于下一代测序的核酸文库)“确定大小(tosize/sizing)”是指测定核酸链中碱基对的数目。因为通常存在的天然核苷酸中每一个的分子量大致相等，所以测量大小也可以推断分子量。
如本文所用，术语“包含(comprises/comprising)”、“包括(includes/including)”、“具有(has/having)”或其任何其它变化形式打算涵盖非排它性的包括。举例来说，包含一列特征的工艺、方法、物件或设备不一定仅限于那些特征，而是可包括没有明确列出或这类工艺、方法、物件或设备所固有的其它特征。另外，除非明确相反地陈述，否则“或”是指包括性的或而不是排它性的或。举例来说，以下任一项符合条件A或B：A是真(或存在)且B是假(或不存在)，A是假(或不存在)且B是真(或存在)，以及A和B都是真(或存在)。
虽然下一代测序技术每次运行提供较高的基因组通量，但是这些平台(包括(但不限于)：例如Ion TorrentTM(赛默飞世尔科技公司)、(Illumina,Inc.)和454Flxand GS Junior+systems(Roche))中任一个的测序工作流程需要良好的文库构建和质量控制。由原始样品产生的核酸文库的片段大小需要在这些技术中的任一个中有效测序的预定范围内。此外，由包括片段化、扩增、连接和标记中的一个或多个的多种操作产生的核酸文库中所存在的扩增子的量必需在将文库的等分试样引入到测序反应条件之前定量。目前可用于进行此分析的方法通常需要又一仪器采集以表征文库池，和/或可能另外需要通过单独的qPCR方法单独定量。
此处提供了确定需要在进一步分析或加工之前表征的核酸文库或任何多个双链核酸的大小的电泳方法。在一些实施例中，电泳方法还包括在检查中定量多个双链核酸中所存在的核酸的量的方法。使用电泳方法和已在运行许多不同类型实验的实验室中仪器，可以使用分离介质和不需要冗长试剂切换和/或冲洗例程的条件进行表征。因此，QC和/或定量可以配备有许多实验室通常可获得的标准试剂和仪器。
已出人意料地发现确定双链核酸的大小可以在单链大小标准品(即大小确定梯)存在下在电泳分离中进行，以获得关于多个双链核酸的大小的有意义的信息。一般来说，所属领域的技术人员使用双链核酸大小确定梯确定双链核酸的大小并使用单链核酸大小确定梯确定单链核酸。如果有人要使用不同类型的核酸确定其它核酸的大小，那么单链核酸和双链核酸以不同方式迁移。已出人意料地发现，差异可以相互关联并建模以用于确定大小的应用。已另外出人意料地发现，这些差异依赖于分离条件，如(但不限于)温度、变性剂、筛分聚合物等等。
方法.此处描述一种用于测定多个双链核酸的长度范围的方法，其包括使多个双链核酸与第一染料和经可检测标记的单链大小确定梯在第一染料被配置成标记双链核酸的条件下接触；产生包括多个经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链大小确定大小确定梯的混合物；使混合物在移动性依赖分离条件下迁移；分离多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个以及
测定多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间。在一些实施例中，所述方法另外包括以下步骤：测定单链大小确定梯的多个片段中每一个的迁移时间。在一些实施例中，所述方法另外包括以下步骤：定量多个双链核酸的量。
多个双链核酸，包括(但不限于)由DNA或RNA制备的文库，可以在任何大规模平行方法步骤(其可包括扩增、连接、杂交或测序步骤)之前，对多个双链核酸中所存在的核酸长度范围进行表征。双链核酸可以与标记双链核酸的第一染料接触，产生多个经第一染料标记的双链核酸。第一染料可以非共价标记多个双链核酸。在一些实施例中，第一染料可被配置成标记多个双链核酸的至少一个可检测部分。或者，第一染料可被配置成标记多个双链核酸的相当大一部分。第一染料可被配置成标记双链核酸，但未被配置成标记单链核酸。仅当核酸以双链形式存在时，即当第一单链核酸链与其互补核酸链杂交时，第一染料可通过与核酸相互作用而标记双链核酸。在一些实施例中，多个双链核酸可以是RNA，其中RNA由于第一链的自我杂交而具有部分双链结构并且不需要与单独的第二互补链杂交。在这些实施例中，第一染料可标记具有双链结构的RNA部分。在其它实施例中，RNA，如病毒RNA，可以是具有两个互补链的双链RNA。在这些实施例中，第一染料可标记整个具有两个互补链的双链RNA。
在一些实施例中，第一染料可被配置成基本上不标记单链核酸。在各种实施例中，第一染料可以非共价标记多个双链核酸。在一些实施例中，第一染料可以作为嵌入染料标记多个双链核酸。当第一染料未被配置成标记单链核酸时，其无法标记单链大小确定梯。在一些实施例中，第一染料基本上不标记单链大小确定梯，而其确实基本上标记多个双链核酸。第一染料可以在经可检测标记的单链大小确定梯之前、之后或同时添加到多个双链核酸中以形成多个经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链大小确定梯的混合物。第一染料可以通过将混合物保持在预先选择的温度下一段时间来标记多个双链核酸或其至少一个可检测部分。在一些实施例中，预先选择的温度可以在室温下或在高温下。
第二染料可以共价标记经可检测标记的单链大小确定梯的片段。第二染料可以在光谱上与第一染料可分辨开。在一些实施例中，共价连接到单链大小确定梯的片段的第二染料可以在与第一染料相同的波长下观测到。
多个经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链大小确定梯的混合物可以经历移动性依赖分离条件。混合物可以注射到可支持移动性依赖分离的通道中并且可以在移动性依赖分离条件下迁移，所述分离条件可包括电场影响。经可检测标记的单链大小确定梯可以在与双链核酸相同的通道中迁移。在一些实施例中，当在相同通道中共同迁移时，经可检测标记的单链大小确定梯的第二染料在光谱上与经染料标记的多个双链核酸的第一染料可分辨开。在相同实验运行期间在相同通道中的迁移可提供大小确定梯与多个双链核酸的个别未知组分的已知迁移速度的最稳固比较。
移动性依赖分离包括电泳分离，其可取决于质荷比和任选地分析物的表观大小。移动性依赖分离条件可包括分离介质。在一些实施例中，分离介质包括筛分介质以有助于按大小分离。在一些实施例中，核酸移动性依赖分离条件可包括一种或多种变性剂。变性剂可用于分离缓冲液和/或分离介质中以破坏所研究核酸的任何二级或三级结构，所述二级或三级结构可影响核酸的移动性。可用于核酸分离的变性剂包括(但不限于)脲、甲酰胺、二甲亚砜(DMSO)和乙二醛中的一个或多个。对于双链核酸，一种或多种变性添加剂的变性作用可以通过其它反应条件(如运行温度选择、焦耳加热)或运行模块参数(如注入电压、运行电压和/或运行温度/电压斜变)来修改。
在一些实施例中，移动性依赖分离条件不包括变性添加剂。这些条件可包括使用相对于多个经染料标记的双链核酸的双链核酸对的Tm或单链大小确定梯可呈现一些二级结构的温度升高或降低的温度。
在各种实施例中，选择移动性依赖分离条件，使得多个经第一染料标记的双链核酸保持第一染料标记。在当移动性依赖分离条件是至少部分变性或完全变性时的实施例中，多个经第一染料标记的双链核酸的某一部分可能开始失去杂交，导致至少一些第一染料标记的损失。这可能对于暴露于至少部分变性条件较长时段的较大片段更为普遍。这可以通过选择低于典型变性电泳条件的运行温度来补偿，在典型变性电泳条件中可以采用大于约60℃的运行温度。此外，双链核酸的迁移可以在至少部分或完全变性条件下显著变化，并且修改运行温度可以提供更一致的迁移时间。在图5中，经共价标记的双链大小确定梯是作为经染料标记的双链核酸文库的模型在变性条件下运行。在不同温度下检查迁移时间。确定了40℃实现这种具有在50至500bp范围内的片段的梯子的最佳分离。图6示出了对于在如图5中所示的相同变性条件下在40℃下分离相同双链大小确定梯的多个单独毛细管，在数个毛细管中获得一致的迁移结果(示出了3个不同毛细管结果)。在图7中，示出了来自四个不同毛细管、来自如图5和6中经染料标记的核酸文库的经相同染料标记的双链模型在相同变性条件下并在40℃下运行的分离的电泳图重叠，以证明双链核酸迁移时间的再现性。在各种实施例中，移动性依赖分离条件可包括被配置成维持经第一染料标记的双链核酸至少可检测的量的运行温度。在一些实施例中，移动性依赖分离条件可基本上维持多个经第一染料标记的双链核酸的标记至少第一部分的第一染料标记。在一些实施例中，运行温度可以经选择以低于第一染料标记和/或双链从经第一染料标记的双链核酸解离的温度。在一些实施例中，运行温度低于第一染料标记和/或双链明显从经第一染料标记的双链核酸解离的温度，由此可以检测到至少可检测的量的经第一染料标记的双链核酸。在一些实施例中，移动性依赖分离条件被配置成维持标记多个双链核酸中每一个的第一染料标记至少可检测的量。虽然第一染料可以从经染料标记的双链核酸的某一部分解离，例如由于存在变性添加剂或运行温度选择，但是可检测的量的经第一染料标记的双链核酸可仍在移动性依赖分离条件下保持关联。在一些实施例中，每个经第一染料标记的双链核酸的一部分可以在移动性依赖分离条件下以可与每个经第一染料标记的双链核酸的迁移时间相关的方式得以维持。在一些实施例中，移动性依赖分离条件可被配置成基本上维持标记多个双链核酸中每一个的第一染料标记。
当多个经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链大小确定梯的混合物在移动性依赖分离条件下迁移时，可以分离多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个。迁移可以在系统的分辨率限度内将多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个分离成具有相同重量的条带或峰。在一些实施例中，限度可以是约一个核苷酸单元的重量，例如约100道尔顿(Da)。当分辨率限度是约一个核苷酸单元时，所检测到的每个条带或峰将与之前或之后的条带或峰相差约一个核苷酸差异。在其它实施例中，分辨率限度可以是约两个核苷酸(200Da)至约5个核苷酸(500Da)的重量。当分辨率限度是约两个核苷酸至约5个核苷酸时，所检测到的每个条带或峰与之前或之后的条带或峰相差约两个至约五个核苷酸。在分辨率限度内，具有相同重量的每个条带或峰可包括一个不同核酸，或其可包括一整套序列不同但是具有相同重量/长度的不同核酸，并因此在移动性依赖分离条件下的移动性相同。在一些实施例中，多个包括个别条带的分离可能不可见的足够大数量的双链核酸。在此实施例中，多个经第一染料标记的双链核酸可以被检测为跨越多个双链核酸中核酸的大小范围的宽条带。
经可检测标记的单链大小确定梯在移动性依赖分离条件下迁移，以提供大小确定梯的每个片段作为单一峰或条带。单链大小确定梯的片段的迁移时间可以基于已知片段大小预测或可以通过分别运行标准品迁移来建立。在任一情况下，单链大小确定梯的每个已知片段可以分配给电泳图中的峰。
一旦多个经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链大小确定梯的混合物被分离，可以测定多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间。在一些实施例中，多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间不同。在其它实施例中，多个的迁移时间可以被检测为含有大量经染料标记的双链核酸的加宽条带。可以测定经可检测标记的单链大小确定梯的每个片段的迁移时间。在一些实施例中，可以测定经可检测标记的单链大小确定梯的仅一小组片段。在一些实施例中，落在多个经第一染料标记的双链核酸所检测到的峰或条带范围外的片段可具有测定的迁移时间。
所述方法可另外包括将多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间转换成长度。关于此过程的一种方法的示意图显示在图1中。在一些实施例中，转换迁移时间的步骤包括以下步骤：比较经第一染料标记的双链核酸的迁移时间与经可检测标记的单链大小确定梯的至少一个片段的迁移时间(参见图2)。在一些实施例中，比较经第一染料标记的双链核酸的迁移时间与经可检测标记的单链大小确定梯的至少一个片段的迁移时间的步骤另外包括比较经第一染料标记的双链核酸迁移时间与经可检测标记的单链大小确定梯的多个片段迁移时间。
将多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间转换成长度的步骤可另外包括基于分配给经可检测标记的单链大小确定梯的每个片段的相关性因数分配每个经第一染料标记的双链核酸的长度。
所述方法可另外包括以下步骤：通过使多个经第一染料标记的双链核酸的至少第一多个检测到的峰的一个或多个曲线下面积与经可检测标记的大小确定梯片段的第二多个检测到的峰的至少一个或多个曲线下面积相关联而获得多个双链核酸的定量。在一些实施例中，多个经第一染料标记的双链核酸的至少第一多个检测到的峰可包括多个经第一染料标记的双链核酸的所有检测到的峰。定量方法可另外包括将多个经第一染料标记的双链核酸的所有相关曲线下面积求和，由此提供多个双链核酸的定量
通过使迁移时间相关联来确定大小的方法.图1是根据本文所述的各种实施例使用校准曲线确定样品大小的方法的示意图。确定样品大小的方法可以在具有处理器的示例性计算系统上实施，如图8中所示的计算系统。所述方法也可以在本地计算系统中或在网络配置内的服务器计算系统中实施，如图9中所示的配置。
参照图1，步骤102包括使用未知样品的电泳图数据和参考核酸的电泳图数据。在一个实施例中，参考核酸是经可检测标记的大小已知的单链参考核酸。电泳图数据可以例如包括在FSA文件中。
在步骤104中，分析参考核酸电泳图数据并根据相应迁移时间确定参考核酸的已知大小的强度峰。
在步骤106中，分析未知样品的电泳图数据以确定所述数据内具有峰活性的关注区。
在步骤108中，使用参考核酸的已知大小和迁移时间，依据参考核酸大小确定未知样品大小。
在步骤110中，通过使参考核酸大小和相应迁移时间与已知大小和相应迁移时间的双链核酸相关联来生成校准曲线。双链核酸的迁移时间可不与参考核酸的迁移时间进行1对1直接比较。在那种情况下，对应于迁移时间内插参考核酸的大小。示例性校准曲线显示在图2中。
在步骤112中，使用步骤110中生成的校准曲线和步骤108中生成的先前依据参考核酸大小计算所得的未知样品大小，计算出未知样品大小。
在步骤114中，未知样品大小计算任选地导出到例如CSV文件中。计算所得的未知样品大小也可以在图形用户界面(GUI)上显示给用户。
如参照图1的描述所提及，图2是根据本文所述的各种实施例生成的校准曲线的图形表示200。根据各种实施例，校准曲线是通过使大小已知的双链核酸的迁移时间与大小已知的参考单链核酸的迁移时间相关联而生成。在图形表示200中，x轴202示出了参考单链核酸的大小并且y轴204示出了已知双链核酸的大小。如果不存在迁移时间的直接1对1匹配，那么内插参考单链核酸的大小。在校准曲线的图形表示中所标绘的数据显示在表1中。
表1.
在此实例中，使用表1中所示的数据生成校准曲线。经由数据拟合线条。图2的曲线拟合方程式是y＝0.0078x2-0.2044x+155.1,R2＝0.9925。
使用校准曲线确定未知样品大小。相对于校准曲线依据参考核酸样品大小比较未知样品大小以确定双链核酸大小。
根据本文所述的各种实施例，下文参照图10和11进一步描述校准曲线生成方法和系统。
对多个双链核酸中的核酸进行定量的方法.图3是根据本文所述的各种实施例的峰检测和归一化的图形表示300。归一化值指示双链核酸样品的相对浓度。图形表示300可以显示在图形用户界面(GUI)上。
对于双链核酸，从电泳图确定峰。在图3中所示的实例中，检测到峰302和308。确定峰302的起始点304和结束点306。类似地，确定峰308的起始点310和结束点312。起始点和结束点可以由用户手动确定或由处理器自动确定。使用起始点和结束点，计算出峰302和308的面积。
计算所得的面积随后除以标准面积值以将值归一化。在一些实施例中，标准面积值可以是大小100的参考单链核酸的峰面积。然而，可使用其它归一化峰面积值将面积归一化。可使用由已知稳定大小参考单链核酸生成的峰将面积值归一化。
图4示出了与将双链核酸的峰面积归一化相关的数据。峰归一化面积指示根据本文所述的各种实施例的样品中双链核酸的相对浓度。
下文参照图12和13进一步描述对多个双链核酸中的核酸进行定量的方法和系统的各种实施例。
多个双链核酸.多个双链核酸可以通过多种方式获得。可使用针对一组预选序列的一组引物询问可能含有DNA或RNA的样品。引物组可以是一组高度多重的引物。引物组可以针对可能与特定研究相关所靶向的一组序列，如与一个或多个肿瘤靶标相关的探查序列。可以使引物延伸以提供双链核酸文库。延伸可发生在扩增方法中。或者，可以对含有DNA和/或RNA的样品进行全基因组、无PCR制备以提供双链核酸文库。可以对样品核酸进行片段化、用接头连接和扩增方法中的一个或多个，以提供多个双链核酸。举例来说，与IonTorrentTM测序平台一起使用的片段化DNA的文库制备涉及在连接到接头之前修复3'和5'端。在连接之后，将接头-DNA构建体纯化且进行大小选择，并经由聚合酶链反应(PCR)扩增。
大小确定梯.单链大小确定梯可包括多个经可检测标记的片段。片段可以具有预定长度。单链大小确定梯的经可检测标记的片段可以用第二染料共价标记。在一些实施例中，第二染料可被配置成在光谱上与第一染料可分辨开。第一染料可以基本上不标记单链大小确定梯的经可检测标记的片段。在一些实施例中，共价连接到单链大小确定梯的片段的第二染料可以在与第一染料相同的波长下观测到。单链大小确定梯可以不同方式构建。一种方法描述于美国专利第7,700,287号中，其以全文引用的方式并入本文中。
染料.染料可以是可见染料、荧光染料或化学发光染料。在各种实施例中，可用作标记多个双链核酸的第一染料或可用作标记大小确定梯的第二染料的荧光染料是芘染料、萘染料、氨基吡啶染料、氧杂蒽染料(它可以是荧光素、对甲氨基酚(rhodol)或罗丹明(rhodamine)染料)、花青染料、香豆素染料、硼聚吖吲得辛染料、苯并呋喃染料或吲哚染料。在其它实施例中，荧光染料是荧光素染料或罗丹明染料。
在一些实施例中，可用作标记多个双链核酸的第一染料或可用于标记单链大小确定梯的氧杂蒽染料是具有式X结构的氧杂蒽染料：
或其互变异构体或盐；
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自由以下组成的群组：H、烷基、经取代的烷基、烷氧基、经取代的烷氧基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、经取代的氨基、氨基羰基、氨基硫羰基、氨基羰基氨基、氨基硫羰基-氨基、氨基羰基氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰氧基、氨基磺酰氨基、脒基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、氰基、卤基、羟基、硝基、磺基、磺酰基、经取代的磺酰基、磺酰氧基、硫酰基、硫醇、烷硫基、经取代的烷硫基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基、环烷基、经取代的环烷基、杂环基和经取代的杂环基；或R1和R2、R2和R3、R3和R4、R5和R6、R6和R7或R7和R8中的一个或多个连在一起形成未经取代的稠合芳基、经取代的稠合芳基、未经取代的稠合杂芳基、经取代的稠合杂芳基、未经取代的不饱和杂环基、经取代的不饱和杂环基、未经取代的饱和杂环基或经取代的饱和杂环基环；以及
当氧杂蒽染料被共价连接时，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9中的一个可以是经由共价键、-烷基-、-经取代的烷基-、-烯基-、-经取代的烯基-、-甲酰胺基-、经取代的甲酰胺基-、-杂环基-、-经取代的杂环基-、-芳基-、-经取代的芳基-、-杂芳基-、-经取代的杂芳基-、-环烷基-、-经取代的环烷基-、-羰基-、-经取代的羰基-、-烷氧基-、-经取代的烷氧基-、-磺酰胺基-、-经取代的磺酰胺基-、-硫基-、-氨基-或-经取代的氨基-与第一连接基团的连接点。当第一连接基团将染料连接到单链大小确定梯时，举例来说，第一连接基团可以是共价键或还可以包括1-100个非氢原子，包括呈任何排列和氧化状态的碳、氮、氧、硫和磷原子。第一连接基团可以是直链或支链的，并且可包括环状部分，包括碳环、杂环、芳基或杂芳基环。氧杂蒽染料，如果作为能量转移染料的一部分，可以经由第一连接基团连接到第二染料，从而形成能量转移对中的另一搭配物，其中第二染料是经由第二连接基团连接到大小确定梯的部分，第二连接基团与第一连接基团可以相同或可以不同。第二连接基团可具有如上文关于第一连接基团所定义的任何结构。
在一些实施例中，R9可以是经取代的芳基。在其它实施例中，经取代的芳基R9经两个卤基取代基取代，所述卤基取代基可以是相同或不同的卤化物。在其它实施例中，两个卤基取代基各自是氯。在其它实施例中，经取代的芳基R9具有两个卤基取代基并且第三取代基是经由共价键、-烷基-、-经取代的烷基-、-烯基-、-经取代的烯基-、-甲酰胺基-、经取代的甲酰胺基-、-杂环基-、-经取代的杂环基-、-芳基-、-经取代的芳基-、-杂芳基-、-经取代的杂芳基-、-环烷基-、-经取代的环烷基-、-羰基-、-经取代的羰基-、-烷氧基-、-经取代的烷氧基-、-磺酰胺基-、-经取代的磺酰胺基-、-硫基-、-氨基-或-经取代的氨基-与L1的连接点。在一些实施例中，至少一个R9取代基是共价键、-烷基-、-经取代的烷基-、-甲酰胺基-、经取代的甲酰胺基-、-羰基-、-经取代的羰基-、-烷氧基-、-经取代的烷氧基-、-磺酰胺基-或-经取代的磺酰胺基-。在其它实施例中，至少一个R9取代基是共价键、-甲酰胺基-、经取代的甲酰胺基-、-羰基-、-经取代的羰基-、-烷氧基-、-经取代的烷氧基-、-磺酰胺基-或-经取代的磺酰胺基-。在其它实施例中，R9是氢。
在一些实施例中，氧杂蒽染料的R2和R7选自由以下组成的群组：烷氧基、经取代的烷氧基、酰基、酰胺基、酰氧基、羧基酯)氧基和羟基，其限制条件是R2和R7中的至少一个是羟基，并且氧杂蒽染料是荧光素。
在其它实施例中，氧杂蒽染料的R2和R7选自由以下组成的群组：氨基、经取代的氨基、氨基羰基、氨基硫羰基、氨基羰基氨基、氨基硫羰基-氨基、氨基羰基氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰氧基、氨基磺酰氨基、脒基、(羧基酯)氨基、杂芳基、经取代的杂芳基、杂环基和经取代的杂环基，其中R2和R7各自经由取代基的氮原子连接到氧杂蒽染料的核心，由此形成罗丹明染料。在一些实施例中，R8和R7连在一起并且形成未经取代的不饱和杂环基、经取代的不饱和杂环基、未经取代的饱和杂环基或经取代的饱和杂环基环，其中所述环具有5-7元。在其它实施例中，R1和R2连在一起并且形成未经取代的不饱和杂环基、经取代的不饱和杂环基、未经取代的饱和杂环基或经取代的饱和杂环基环，其中所述环具有5-7元。
在一些实施例中，当R9是氢时，R5和R6连在一起形成稠合5-6元芳环或杂芳环，其可以是未经取代或经取代的。在其它实施例中，R9是氢，R3和R4连在一起形成稠合5-6元芳环或杂芳环，其可以是未经取代或经取代的。在一些实施例中，R9是氢，R3和R4连在一起形成稠合5-6元芳环或杂芳环，其可以是未经取代或经取代的，并且R5和R6连在一起形成稠合5-6元芳环或杂芳环，其可以是未经取代或经取代的。
适用于所述方法、系统、组合物和试剂盒中的一些示例性氧杂蒽染料的合成尤其描述于美国专利第5,188,934号、第5,770,716号、第6,008,379号、第6,025,505号、第6,080,852号、第RE39663号和第6,051,719号中，并且决不是限制性清单。这些专利各自以全文引用的方式并入本文中。
在各种实施例中，大于一种染料可以并入标记物质中，在此处所描述的方法中充当标记多个双链核酸的第一染料或可检测地标记单链大小确定梯的第二染料。当大于一种染料并入标记物质中时，荧光染料可以是聚合染料或能量转移染料。能量转移染料可具有供体染料和受体染料，其中供体染料被配置成吸收一个波长的能量并且发射第二波长的能量，所发射的能量以第二波长激发受体染料。受体染料随后发射可检测的第三波长。在一些实施例中，能量转移染料可具有供体染料(即荧光素染料)和罗丹明受体染料。可使用供体和受体染料类别的任何合适的组合。如果大于一种标记物质用于此处所描述的方法，那么大于一种能量转移染料被配置成在不同波长下检测到，并且因此是光谱可分辨的。
在一些实施例中，染料是NBD、Texas FAMTM、JOETM、TAMRATM、ROXTM、VICTM、HEXTM、TETTM、NEDTM、或其互变异构体或盐。当任何这些染料被共价连接时，染料可以经由连接基团连接。连接基团可以是共价键或还可以包括1-100个非氢原子，包括呈任何排列和氧化状态的碳、氮、氧、硫和磷原子。连接基团可以是直链或支链的，并且可包括环状部分，包括碳环、杂环、芳基或杂芳基环。在其它实施例中，能量转移染料是在相同连接点连接到连接基团，即连接在标记物质的一个原子。在其它实施例中，能量转移染料连接到标记物质中的不同原子，但仍被配置成供给和接受用于能量转移染料表现的激发能量。
在一些实施例中，单链大小确定梯可以用氧杂蒽染料共价标记。氧杂蒽染料可以是如上所述的式X染料。如上所述，氧杂蒽染料可以经由连接基团连接到大小确定梯。氧杂蒽染料可以是罗丹明或荧光素染料。在其它实施例中，大小确定梯可以用能量转移染料共价标记，其中供体或受体染料经由连接基团连接到大小确定梯。适合于共价标记大小确定梯的能量转移染料可包括氧杂蒽染料作为供体和受体染料中的任一个或两个。在一些实施例中，受体染料是罗丹明染料。在其它实施例中，单链大小确定梯可以用花青染料共价标记。
多个双链核酸用第一染料标记。第一染料可以非共价标记多个双链核酸。非共价标记模式可包括嵌入(包括双嵌入)、小沟结合、大沟结合、外部结合或特异性基序识别中的一个或多个。在一些实施例中，第一染料可至少经由嵌入标记多个双链核酸中的每一个。在其它实施例中，第一染料可通过双嵌入标记双链核酸。在各种实施例中，当第一染料作为嵌入剂标记双链核酸时，其它结合模式也可以在一定程度上起作用。在各种实施例中，第一染料被配置成标记多个双链核酸并且其被配置成不标记单链大小确定梯，无论其是否经可检测标记。在一些实施例中，第一染料被配置成标记多个双链核酸的至少一个可检测部分，而不标记单链大小确定梯。合适的第一染料可以选自此处所描述或所属领域中已知的染料。
在一些实施例中，第一染料是花青染料、吖啶染料或菲啶染料，其中第一染料的荧光发射最大值在约450nm至约750nm范围内。花青染料可以是单次甲基花青染料。花青染料可以是不对称花青染料。花青染料可以是二聚花青染料。
在一些实施例中，花青染料具有式I结构：
环成员X可以是O、S、Se或C(CH3)。氮取代基R1是C1-C6烷基。在一些实施例中，R1是甲基。次甲基桥键可以是单次甲基、三次甲基或五次甲基，其中n分别是0、1或2。芳环成分Y是：
--CH2═CH2-
其中下标p和q等于0或1，使得p+q＝1。环取代基K1和K2可以是相同或不同的，并且独立地是氢、具有1-6个碳的烷基、或芳基；或K1和K2组合完成6元芳环以产生喹啉鎓环系统。
LINK是含有4至19个亚甲基(--CH2--)的主链的脂肪族链，其任选地以一个或多个间隔穿插有杂原子，每个杂原子独立地是N、O或S，其中每个N杂原子另外经1-2个H或1-2个具有1至6个碳的烷基取代，所述烷基取代基可以是相同或不同的，限制条件是任何杂原子与另一杂原子分隔至少2个亚甲基，其中LINK的一个亚甲基端连接到吡啶鎓或喹啉鎓杂环的氮原子且LINK的另一个亚甲基端连接到A，除了在A是H或CH3的情况下，LINK必须含有至少一个N杂原子。优选的LINK链含有两个或三个杂原子，每个彼此分隔三个亚甲基。优选地，杂原子是N，其中N经两个具有1-6个碳的烷基取代，所述烷基可以是相同或不同的。优选地，LINK含有12个或更少的亚甲基。
A是H、CH3或是
环成员W是O、S、Se或C(CH3)。氮取代基R2是C1-C6烷基，优选地是甲基。次甲基桥键是单次甲基、三次甲基或五次甲基，即m＝0、1或2。芳环成分Y是--CH2═CH2--，其中下标r和s等于0或1，使得r+s＝1。环取代基K3和K4可以是相同或不同的，并且独立地是氢、具有1-6个碳的烷基、或芳基；或K3和K4组合完成6元芳环以产生喹啉鎓环系统。
当A不是H或CH3时，m和n可以是相同或不同的，并且W和X可以是相同或不同的。这些染料的合成方法可以见于美国专利第5,534,416号、第5,321,130号和第5,435,134号以及其中的参考文献中，其各自以全文引用的方式并入本文中。
在各种实施例中，第一染料可以是具有式I结构的染料，其中X是O。在各种实施例中，第一染料可具有式I结构，其中R1是甲基。在各种实施例中，第一染料可具有式1结构，其中次甲基桥键是单次甲基，其中n是0。在各种实施例中，第一染料可具有式I结构，其中Yp的p＝0并且Yq的q＝1。在各种实施例中，第一染料可具有式I结构，其中K1和K2组合在一起完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统。在各种实施例中，第一染料可具有式I结构，其中LINK的主链具有9-12个亚甲基并以两个间隔穿插有氮原子，其中每个氮原子可以经C1-C6碳单取代或二取代，并且另外其中两个氮原子彼此分隔至少两个亚甲基。在各种实施例中，第一染料可具有式I结构，其中A具有式A结构：
其中W是O。在各种实施例中，式I的第一染料可具有包括式A的结构，其中R2可以是甲基。在各种实施例中，式I的第一染料可具有包括式A的结构，其中27次甲基桥键是单次甲基，其中m＝0。在各种实施例中，式I的第一染料可具有包括式A的结构，其中Yr的r＝0并且Ys的s＝1。在各种实施例中，式I的第一染料可具有包括式A的结构，其中K3和K4组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统。在各种实施例中，具有式I结构的第一染料可具有任何这些限制的任意组合。
在一些实施例中，第一染料可以是式I的花青染料，其中X是O；R1是甲基；次甲基桥键是单次甲基，其中n是0；Yp的p＝0并且Yq的q＝1；K1和K2组合在一起完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；LINK的主链具有9-12个亚甲基并以两个间隔穿插有氮原子，其中每个氮原子经C1-C6碳单取代或二取代，并且另外其中两个氮原子彼此分隔至少两个亚甲基；A具有式A结构：
其中W是O；R2是甲基；次甲基桥键是单次甲基，其中m＝0；Yr的r＝0并且Ys的s＝1；并且K3和K4组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统。
在一些实施例中，第一染料是花青染料，并且可以选自由以下组成的群组：YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、BOBO-1、BOBO-3、POPO-1、POPO-3、LOLO-1和LOLO-3。
在其它实施例中，第一染料可以是具有式II结构的花青染料：
其中每个R1独立地是H、C1-C6烷基、三氟甲基、卤素、--OR8、--SR8或--(NR8R9)，其中R8和R9可以是相同或不同的，独立地是H、未经取代或经取代的C1-C6烷基、1-2个脂环、1-2个杂脂环、1-2个芳环或1-2个含有1-4个杂原子的杂芳环，其中杂原子是O、N或S；或R8和R9合在一起是--(CH2)2--L--(CH2)2--，其中L是单键、--O--、--CH2--或--NR10--，其中R10是H或C1-C6烷基；并且t＝1-4；
R2是C1-C6烷基；
X是O、S、Se或--NR15，其中R15是H或C1-C6烷基；或X是CR16R17，其中R16和R17可以是相同或不同的，独立地是C1-C6烷基，或R16和R17组合完成五或六元饱和环；
n＝0、1或2；
Z-是生物相容性抗衡离子；
Q具有式Q1或Q2
其中Y是--CR3＝CR4--；并且p和m＝0或1，使得p+m＝1；
R5是C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6聚烯基、C1-C6炔基或C1-C6聚炔基；或R5是OMEGA；
R3、R4、R6和R7可以是相同或不同的，独立地是H、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6聚烯基、C1-C6炔基、C1-C6聚炔基、卤素、--OH、--OR8、--SR8、--(NR8R9)或--OSO2R19，其中R19是C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基、芳基或OMEGA；
或R6和R7组合成--(CH2)v--，其中v＝3或4，或R6和R7根据式Q2形成稠合芳环；
R11、R12、R13和R14可以是相同或不同的，独立地是H、C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6聚烯基、C1-C6炔基、C1-C6聚炔基、卤素、OMEGA、--OH、--OR8、--SR8或--(NR8R9)；
OMEGA是环己基、环己烯基、吗啉基、哌啶基、萘基、苯基、噻吩基、苯并噻唑基、呋喃基、噁唑基、苯并噁唑基或吡啶基，其未经取代或任选独立地经以下基团取代一次或多次：卤素、烷基、全氟烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基或羧基烷基，具有1-6个碳，并且通过单键连接作为R3、R4、R5、R6、R7、R11、R12、R13或R14；
使得R3、R4、R5、R6、R7、R11、R12、R13和R14中的至少一个是OMEGA，并且其中R3、R4、R5、R6、R7、R11、R12、R13和R14中不止一个是OMEGA，每个OMEGA任选地是相同或不同的。
R8和R9的C1-C6烷基取代基包括经取代或未经取代的氨基。经取代的氨基取代基本身可具有一个、两个或三个取代基，其可以是相同或不同的并且可以是C1-C6烷基、经羟基取代的C1-C6烷基或-C1-C6烷基芳基，其中芳基在一个或多个稠合环中具有6-10个碳并且另外其中芳基可以未经取代或经1-4个选自以下的基团取代：C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、三氟甲基或卤基。
可具有R8和R9的脂环、杂脂环、芳环或杂芳环中的每一个可以是稠合或未稠合的。
在一些实施例中，当第一染料具有式II结构并且Q具有式Q1时，那么n＝0。在一些实施例中，当第一染料具有式II结构时，X是O或S。
当所公开的化合物包括共轭环系统时，共振稳定可允许形式电子电荷分布在整个分子上。虽然特定电荷可以描绘为定域在特定环系统或特定杂原子上，但是通常应理解，可以绘制可比的共振结构，其中电荷可以在形式上定域在化合物的替代部分上。
在各种实施例中，第一染料在光谱上与标记经可检测标记的单链大小确定梯的第二染料可分辨开。
分离.多个经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链大小确定梯的混合物是通过使混合物在电场影响下在通道中迁移而以移动性依赖方式分离。电泳可提供差异性迁移，因为移动性取决于大小和电荷特征。在移动性依赖分离条件下迁移将会在系统的分辨率限度内将多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个分离成具有相同重量的条带或峰。在一些实施例中，限度可以是约一个核苷酸单元的重量，例如约100道尔顿(Da)。当分辨率限度是约一个核苷酸单元时，所检测到的每个条带或峰将与之前或之后的条带或峰相差约一个核苷酸差异。在其它实施例中，分辨率限度可以是约两个核苷酸(200Da)至约5个核苷酸(500Da)的重量。当分辨率限度是约两个核苷酸至约5个核苷酸时，所检测到的每个条带或峰与之前或之后的条带或峰相差约两个至约五个核苷酸。在分辨率限度内，具有相同重量的每个条带或峰可包括一个不同核酸，或其可包括一整套序列不同但是具有相同重量/长度的不同核酸，并因此在移动性依赖分离条件下的移动性相同。在一些实施例中，虽然经可检测标记的单链大小确定梯可以被检测为一组不同并且单独的条带或峰，但是多个经染料标记的双链核酸可能无法检测为单独的条带或峰，而是将在电泳图中作为加宽条带可见，因为多个中的大部分单独双链核酸的总和将具有与多个中的其它双链核酸紧密相关的分子量。
分离介质.通道可含有分离介质，分离介质含有缓冲液和如此处所述的额外组分，其可以经选择以向多个经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链大小确定梯提供电泳力，并且可允许检测电泳分离中所存在的经可检测标记的单链大小确定梯的每个片段的不同迁移时间，以及多个经第一染料标记的双链核酸的迁移时间范围。这些物质的迁移时间可以通过选择除其它变量以外的电场强度、通道长度、分离介质的极性、离子物质和离子强度来减缓。
分离介质包括筛分介质.在各种实施例中，通道可包括用于混合物分离的分离介质中的筛分聚合物。筛分聚合物可以是交联物理凝胶或更通常是以足够高的浓度存在的非交联聚合物以在通道中提供缠结的聚合物网。缠结浓度阈值或更高浓度提供较小分子可更频繁进入的动态缠结网“孔”，使得迁移更快，而比“孔”大的分子通过蠕动行进，其随着大小增加而减缓。
筛分聚合物.可将任何合适的筛分聚合物用于分离。在一些实施例中，可以选择一种或多种水溶性非交联聚合物作为分离介质的筛分聚合组分。可用作筛分聚合物的一些聚合物包括聚丙烯酰胺，包括例如线性聚丙烯酰胺(LPA)；经取代的聚丙烯酰胺，包括(但不限于)聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)、聚N-甲基丙烯酰胺和经取代的丙烯酰胺与丙烯酰胺(特别是LPA)的所有物理类型(嵌段、接枝或随机)的共聚物；乙烯基聚合物，包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙烯噁唑烷酮；多糖聚合物，如甲基纤维素、羟基乙基纤维素或其共聚物；和聚醚聚合物，如PEO。筛分聚合物可以约0.1重量％至约10重量％范围内的浓度存在于分离介质中。在一些实施例中，存在约0.1重量％至约5重量％范围内的筛分聚合物。其平均分子量Mw可以在约50,000Da至约6MDa范围内。在一些实施例中，筛分聚合物的Mw可以在约500,00Da至约3MDa范围内。平均分子量Mw可以通过凝胶渗透色谱法获得并且还可包括通过光散射检测。
其它聚合组分.在一些实施例中，分离介质的聚合组分可包括可以促进除筛分行为外或代替筛分行为的其它行为的其它聚合物。一种示例性而非限制性的额外行为是与通道壁的表面相互作用以减少因不均匀电渗、过量电渗流或溶质吸附所致的迁移条带不规则性，如下所述。表面相互作用聚合物可以是不带电的水溶性二氧化硅吸附聚合物，包括(但不限于)丙烯酰胺和丙烯酰胺衍生物的聚合物，如PDMA和PHEA(聚-N-羟乙基丙烯酰胺)；多糖和其衍生物，如葡聚糖、HPMC(羟丙基甲基纤维素)、MC、HEC(羟乙基纤维素)、HPC(羟丙基纤维素)、MHEC(甲基羟乙基纤维素)；和其它聚合物，如PVP、PVA(聚乙烯醇)和PEG(聚乙二醇)。在一些实施例中，表面相互作用聚合物可以是丙烯酰胺和丙烯酰胺衍生物的共聚物，如PDMA或PHEA，包括随机、嵌段或接枝共聚物。在一些其它实施例中，带电荷的水溶性二氧化硅吸附聚合物可用作表面相互作用聚合物，包括(但不限于)阳离子HEC(用叔铵部分季铵化的羟乙基纤维素)或阳离子淀粉衍生物。
在一些实施例中，筛分聚合物是与表面相互作用聚合物相同的聚合物。在其它实施例中，筛分聚合物是与表面相互作用聚合物不同的聚合物。
缓冲液.被配置成允许多个经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链大小确定梯的混合物迁移的缓冲液组合物可以包括在通道中，此时混合物受到电场影响。可使用任何合适的缓冲液。用于CE的缓冲液可具有一个或多个以下特性：在所选pH值范围内的缓冲能力良好；在检测波长下的吸光度低；大的带电极少的离子，其用于使电流生成减到最少。
有效缓冲系统具有以pKa值为中心的大致两个pH单位的范围。多元缓冲液具有大于一个有用的pKa并且因此可在大于一个pH值范围内使用。有用的缓冲液和其pKa包括(但不限于)：磷酸盐2.12(pKa1)；柠檬酸盐3.06(pKa1)；甲酸盐3.75；丁二酸盐4.19(pKa 1)；柠檬酸盐4.74(pKa2)；乙酸盐4.75；柠檬酸盐5.40(pKa3)；丁二酸盐5.57(pKa2)；MES 6.15；ADA 6.60；BIS-TRIS丙烷6.80；PIPES 6.80；ACES 6.90；MOPSO 6.90；咪唑7.00；MOPS 7.20；磷酸盐7.21(pKa2)；TES 7.50；HEPES 7.55；HEPPS 8.00；TRICINE 8.15；甘氨酰胺，8.20；双甘氨肽8.25；TRIS 8.30；BICINE 8.35；吗啉8.49；硼酸盐9.24；CHES 9.50；CHAPSO 9.60；CAPS 10.40；和磷酸盐12.32(pKa3)。Tris、硼酸盐、组氨酸或CAPS尤其有用，因为这些缓冲液离子一般较大并且可以高浓度使用而不生成显著电流。然而，UV吸光度也可能使使用任何这些缓冲液时的考虑因素。
缓冲液添加剂.许多类型的表面活性剂可用于分离，包括阴离子型、阳离子型、两性离子型或非离子型。离子型表面活性剂分子可充当疏水性溶质的增溶剂、充当离子配对试剂或充当壁调节剂。表面活性剂与溶质的相互作用可经由两种机制发生；与表面活性剂的带电荷端的离子相互作用和/或经由烷基链与溶质的疏水性部分之间的疏水性相互作用。除与溶质相互作用以外，许多表面活性剂可吸附于毛细管壁，调节电渗流(EOF)并且还限制可能的溶质吸附。视表面活性剂电荷而定，EOF可以增加、减少或反向。
其它添加剂可包括将手性选择剂添加到运行缓冲液。这些试剂可以是例如环糊精、冠醚、胆盐、铜(II)-天冬氨酸盐络合物并且其性能也可以通过添加调节剂(如醇、表面活性剂、脲和金属离子)来调节。
在一些实施例中，可以将甘油添加到缓冲液中以辅助荧光峰检测。
变性添加剂.在一些实施例中，核酸移动性依赖分离可包括一种或多种变性剂。变性剂可用于分离缓冲液和/或分离介质中以破坏所研究核酸的任何二级或三级结构，所述二级或三级结构可影响核酸的移动性。可用于核酸分离的变性剂包括(但不限于)脲、甲酰胺、吡咯烷、二甲亚砜(DMSO)和乙二醛中的一个或多个。当甲酰胺用作变性添加剂时，其可在需要完全变性条件时以约40重量％至约90重量％存在于分离介质中。当脲用作变性添加剂时，其可在需要完全变性条件时以约4M至约8M存在于分离介质中。对于双链核酸，可以通过如运行温度选择或焦耳加热等其它反应条件调节一种或多种变性添加剂的变性作用。
在其它实施例中，移动性依赖分离可使用不包括变性添加剂的分离缓冲液。在这些分离中，用第一染料标记的双链核酸彼此杂交可能最强并且维持最大量的标记配对的第一染料。二级和三级结构可以在这些条件下分离时得以保留，或可以通过如温度选择或焦耳加热等其它反应条件来调节。视单链大小确定梯的设计而定，行为可以在非变性条件下改变。
通道表面处理.在一些实施例中，通道的内表面可经处理以使因不均匀电渗、过量电渗流或溶质吸附所致的迁移条带不规则性减到最少。涂布通道壁可以是通过降低相互作用自由能而减少溶质吸附的有用方法。涂料可包括缓冲液添加剂，如亲水性聚合物或清洁剂，从而提供壁/溶质相互作用的动态减少，或通过壁的共价调节。这两个都可用于消除或逆转通道壁上的电荷、改变疏水性和限制非特异性吸附。
例如用聚丙烯酰胺或聚乙二醇处理可减少或有助于消除电渗流(EOF)。这是由有效壁电荷减少和壁粘度增加所致。用阳离子基团处理可使EOF反向。用作添加剂的一些含有叔氨基的阳离子聚合物的实例包括(但不限于)BiobreneTM Plus(生命技术公司(LifeTechnologies)目录号：400385，CAS号9011-04-5)和以(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)目录号：107689)销售的海美溴铵(Hexadimethrine bromide)。
组合物.在另一方面，提供了组合物。用于测定多个双链核酸的长度范围的组合物可包括被配置成标记双链核酸的第一染料；多个双链核酸；以及经可检测标记的单链大小确定梯。多个双链核酸可以是DNA、RNA或它们两个的组合。第一染料可被配置成不标记单链核酸或基本上不标记单链核酸。在各种实施例中，第一染料可以非共价标记双链核酸。在一些实施例中，第一染料可以是嵌入剂。在各种实施例中，经可检测标记的单链大小确定梯可以被共价标记。在各种实施例中，经可检测标记的单链大小确定梯可以被荧光标记。经可检测标记的单链大小确定梯可以用芘、萘、氨基吡啶、氧杂蒽、花青、香豆素、硼聚吖吲得辛、苯并呋喃或吲哚染料标记。在一些实施例中，第一染料可以是花青染料、吖啶染料或菲啶染料。在一些实施例中，第一染料可以是花青染料。组合物的花青第一染料可以是单次甲基花青。组合物的花青第一染料可以是二聚花青。第一染料可以是如上所述的式I染料或式II染料，或所述通式中所包括的特定实施例中的任一个。
在各种实施例中，第一染料可以在光谱上与标记经可检测标记的单链大小确定梯的第二染料可分辨开。组合物可另外包括变性添加剂。
试剂盒.用于测定多个双链核酸的长度范围的试剂盒可包括被配置成标记双链核酸的第一染料和经可检测标记的单链大小确定梯。在一些实施例中，第一染料可以基本上标记双链核酸。在其它实施例中，第一染料可以基本上标记双链核酸，不标记单链核酸。在一些实施例中，第一染料可以是花青染料。花青染料可以是单次甲基花青。在其它实施例中，第一染料可以是花青染料、吖啶染料或菲啶染料。在一些实施例中，第一染料可以非共价标记双链核酸。在一些实施例中，第一染料可以是嵌入剂。第一染料可以是如上所述的式I染料或式II染料，或所述通式中所包括的特定实施例中的任一个。
试剂盒的经可检测标记的单链大小确定梯可以被共价标记。在一些实施例中，经可检测标记的单链大小确定梯可以被荧光标记。在各种实施例中，经可检测标记的单链大小确定梯可以用芘、萘、氨基吡啶、氧杂蒽、花青、香豆素、硼聚吖吲得辛、苯并呋喃或吲哚染料标记。这些染料中的任一个可用作第二染料标记单链大小确定梯，其中用于标记多个双链核酸的第一染料可以是花青染料、吖啶染料或菲啶染料。在各种实施例中，第一染料可以在光谱上与标记经可检测标记的单链大小确定梯的第二染料可分辨开。
试剂盒可另外包括通道。通道可以并入微流体芯片中。在各种实施例中，通道包括分离介质。通道可包括变性添加剂。通道可包括缓冲溶液。
用于定量多个双链核酸的量的试剂盒可具有上述试剂盒的任何成分的任意组合。
如本文所用，术语“试剂盒”是指用于递送材料的任何递送系统。在反应分析的情形下，这类递送系统包括允许从一个位置到另一个位置储存、输送或递送反应试剂(例如适合的容器中的寡核苷酸、酶、引物组等)和/或支持材料(例如缓冲液、进行分析的书面说明等)的系统。举例来说，试剂盒可包括一个或多个含有相关反应试剂和/或支持材料的外壳(例如盒子)。如本文所用，术语“分部式试剂盒”是指包含两个或更多个单独容器的传递系统，所述容器各自含有全部试剂盒组分的子部分。容器可共同或单独地购买和/或递送到既定接收方。举例来说，第一个容器可含有用于分析的酶，而第二个容器含有寡核苷酸。实际上，在术语“分部式试剂盒”中包括任何包含两个或更多个单独容器的递送系统，所述容器各自含有全部试剂盒组分的子部分。相比之下，“组合式试剂盒”是指在单个容器中(例如在收纳各种所需组分的单个盒子中)含有反应分析的所有组分的递送系统。术语“试剂盒”包括分部式和组合式试剂盒。
系统.用于测定多个双链核酸的长度范围的系统可包括反应器容器，被配置用于a)使第一染料与多个双链核酸接触，其中第一染料标记多个双链核酸中的每一个，和b)允许添加经可检测标记的单链大小确定梯。所述系统可包括通道，被配置成使经可检测标记的单链大小确定梯和多个经第一染料标记的双链核酸的混合物迁移；可操作地连接到通道的阳极和阴极，被配置成向通道提供电场；以及检测器，被配置成检测第一染料和经可检测标记的单链大小确定梯的标记。
检测器可检测紫外线吸光度、可见光吸光度、荧光或化学发光。
所述系统可另外包括通道的温度可控环境。在其它实施例中，所述系统可另外包括反应器容器的温度可控环境。所述系统可另外包括可操作地连接到检测器的数据处理器。
在所述系统的通道中，通道可另外包括分离介质。分离介质可包括筛分介质。通道可另外包括变性添加剂。在一些实施例中，通道可被配置成微流体芯片的一部分。在其它实施例中，通道可以是电泳毛细管。在各种实施例中，通道是多通道阵列的一部分。
一种用于核酸分析的设备可包括：(1)至少一个装载孔，其可以与反应器容器相同或不同，被配置成接收多个双链核酸；(2)至少一个通道，与反应器容器对应排列；和任选地(3)至少一个洗脱孔，与通道对应排列并且用于接收一部分已穿过通道的经第一染料标记的多个双链核酸。在各种实施例中，多个装载孔(或者反应器容器)与多个通道对应排列，并且任选地多个通道各自与相应洗脱孔对应排列。
每个装载孔，其可以是反应器容器，可以是经由离子渗透膜与其相应通道流体连通的容器。每个装载孔的体积容量可以例如在约10μl与约500μl之间，或在约50μl与约150μl之间。每个洗脱孔的体积容量可以例如在约10μl与约500μl之间，或在约50μl与约150μl之间。所述设备可另外包括含有缓冲溶液的储槽，所述储槽经由离子渗透膜与装载孔流体连通。缓冲溶液可以是用于分离经标记核酸的任何合适缓冲液。所述设备可另外包括样品装载器，其被配置成将样品装载到反应器容器中。
如果存在多个通道，那么所述多个通道可以基本上彼此平行。举例来说，通道可具有基本上环状截面，或可具有基本上矩形截面。多个通道可以在结构上连接以形成可作为整体拆卸的通道阵列单元，并且可另外包括以相对侧排列的第一和第二支撑结构，从而形成单个通道阵列单元。在一些实施例中，在阵列中存在至少两个通道，在阵列中存在至少三个通道，或在阵列中存在至少四个通道。在各种其它实施例中，在阵列中存在至少五个通道。通道阵列单元可以被配置成单次使用和一次性的。通道可以被配置成单次使用和一次性的。通道的总长度可以例如在约10cm至约50cm、约10cm至约30cm之间，或可以是约10cm。在一些实施例中，通道的长度可以小于10cm。通道阵列可包括例如至少两个通道、至少三个通道、至少四个通道、至少五个通道、至少十个通道或至少二十个通道。通道的内径可以例如在约150微米与约250微米之间，或在约50微米与约100微米之间，或在约0.1毫米与约2.5毫米之间，或在约0.5毫米与约1.5毫米之间。
所述设备可另外包括排列在装载孔(或反应器容器)与通道之间的离子渗透膜。所述设备可另外包括排列在通道相对侧的至少两个电极，所述至少两个电极可以是铂电极并且可包括排列在通道与洗脱孔之间的正电极和排列在通道与装载孔之间的负电极。所述设备可另外包括电源，其连接到至少两个电极并且配置成使通道的至少一部分经历电场。电场的强度可以例如在约200V/cm与约400V/cm之间，或在约250V/cm与约350V/cm之间。所述设备可另外包括光源，其被配置成使通道的至少一个区经历电磁辐射，并且所述光源可以是例如二极管激光器、蓝光氩离子激光器或黄光氪离子激光器。电磁辐射可以是例如波长在约400-500nm范围内或在约500-600nm范围内的辐射。所述设备可另外包括荧光检测器，其被配置成检测从毛细管发射的荧光，并且所述荧光检测器可以是CCD相机、CMOS相机或PMT检测器。在一些实施例中，可以包括光电倍增管(PMT)检测器以提供更大的动态范围。在一些实施例中，所述设备可另外包括带通滤波器，其排列在通道与荧光检测器之间并且被配置成允许波长为约510nm或更大的辐射通过。在一些实施例中，所述设备可包括带宽滤波器，其排列在通道与荧光检测器之间并且被配置成允许波长在约530nm至约850nm之间的辐射通过。所述设备可以是台式设备，并且可具有不超过约十二英寸的最大宽度、深度或高度。
所述设备可另外包括峰处理器，其被配置成处理与由荧光检测器所检测到的荧光相关的峰，并且所述峰处理器可被配置成生成电泳图，显示代表已迁移穿过通道的经标记核酸的峰，从而揭示每个核酸在洗脱离开通道末端之前通过荧光检测器的时间点。所述设备可另外包括与荧光检测器连通的计算系统，其中所述计算系统被配置成处理与由荧光检测器所检测到的荧光相关的峰。计算系统可被配置成生成电泳图，显示代表已迁移穿过通道的具有相等表观“大小”的经标记核酸的峰，从而揭示每个核酸在洗脱离开通道末端之前通过荧光检测器的时间点。
计算系统可包括或被配置成计算凭经验推导出的相关性，并且可包括或被配置成访问和运行计算机程序产品，所述计算机程序产品被配置成比较所存储的凭经验推导出的相关迁移时间与通过使用所述设备运行获得的所测定的迁移时间，以鉴别在实验期间已迁移穿过通道的个别核酸。
所属领域的技术人员将认识到，各种实施例的操作可以按需要使用硬件、软件、固件或其组合来实施。举例来说，可以在软件、固件或硬连线逻辑的控制下使用处理器或其它数字电路执行一些处理。(本文的术语“逻辑”是指如所属领域的技术人员所公认的用以执行所阐述功能的固定硬件、可编程逻辑和/或其适当组合。)软件和固件可以存储在计算机可读媒体上。如所属领域的一般技术人员所熟知，可以使用模拟电路来实施一些其它处理。另外，在本发明的实施例中可以采用存储器或其它存储装置以及通信组件。
图8是说明根据各种实施例可以用于执行处理功能的计算系统800的框图，随后可以利用荧光检测器的实施例。计算系统800可包括一个或多个处理器，如处理器804。处理器804可以使用通用或专用处理引擎(例如微处理器、控制器或其它控制逻辑)实施。在此实例中，处理器804连接到总线802或其它通信媒体上。
另外，应了解，图8的计算系统800可以用多种形式中的任何形式具体体现，例如机架安装式计算机、大型主机、超级计算机、服务器、客户端、台式计算机、手提电脑、平板电脑、手持式计算装置(例如PDA、蜂窝电话、智能手机、掌上电脑等)、集群网格(clustergrid)、上网本、嵌入系统或任何其它类型的可能期望或适合用于给定应用或环境的专用或通用计算装置。另外，计算系统800可包括常规网络系统，所述网络系统包括客户端/服务器环境和一或多个数据库服务器，或与LIS/LIMS基础设施整合。包括局域网(LAN)或广域网(WAN)并且包括无线和/或有线组件的多种常规网络系统是所属领域中已知的。另外，客户端/服务器环境、数据库服务器和网络在所属领域中是有据可查的。
计算系统800可包括用于传达信息的总线802或其它通信机构，以及与总线802耦合以用于处理信息的处理器804。
计算系统800还包括存储器806，其可以是随机存取存储器(RAM)或其它动态内存，所述存储器与总线802耦合以便存储有待通过处理器804执行的指令。存储器806也可用于在执行有待通过处理器804执行的指令期间存储临时变量或其它中间信息。计算系统800另外包括与总线802耦合以用于存储用于处理器804的静态信息和指令的只读存储器(ROM)808或其它静态存储装置。
计算系统800还可包括存储装置810，如磁盘、光盘或固态驱动器(SSD)，其被提供并耦合于总线802以用于存储信息和指令。存储装置810可包括媒体驱动器和可移动存储接口。媒体驱动器可包括用以支持固定的或可移动的存储媒体的驱动器或其它机构，如硬盘驱动器、软盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、CD或DVD驱动器(R或RW)、闪存驱动器、或其它可移动的或固定的媒体驱动器。如这些实例所说明，存储媒体可包括计算机可读存储媒体，其中存储了特定计算机软件、指令或数据。
在替代实施例中，存储装置810可包括用于允许计算机程序或其它指令或数据加载到计算系统800上的其它类似工具。这类工具可包括例如可移动的存储单元和接口(如程序盒带和盒带接口)、可移动的存储器(如闪存存储器或其它可移动的存储器模块)和存储器槽，以及允许软件和数据从存储装置810传送到计算系统800的其它可移动的存储单元和接口。
计算系统800还可包括通信接口818。通信接口818可用于允许软件和数据在计算系统800与外部装置之间传送。通信接口818的实例可包括调制解调器、网络接口(如以太网(Ethernet)或其它NIC卡)、通信端口(如USB端口、RS-232C串行端口)、PCMCIA插槽和卡、蓝牙等。
计算系统800可以经由总线802耦合到显示器812，如阴极射线管(CRT)或液晶显示器(LCD)，以用于向计算机用户显示信息。包括字母数字和其它按键的输入装置814耦合到总线802以用于例如将信息和命令选择传送到处理器804。输入装置还可以是配置有触摸屏输入功能的显示器，如LCD显示器。另一类型的用户输入装置是用于将方向信息和命令选择传送到处理器804且用于控制显示器812上的光标移动的光标控制件816，如鼠标、轨迹球或光标方向键。这一输入装置通常具有在两个轴(第一轴(例如，x)和第二轴(例如，y))上的两个自由度，其允许所述装置指定平面中的位置。计算系统800提供数据处理并且提供关于此类数据的置信水平。与本发明教示的实施例的某些实施方案相符，计算系统800回应于执行存储器806中包含的一个或多个指令的一或个多个序列的处理器804提供数据处理和置信度值。此类指令可以从另一计算机可读媒体(如存储装置810)读取到存储器806中。存储器806中含有的指令序列的执行使得处理器804能执行本文所描述的处理状态。或者，可以使用硬连线电路代替或结合软件指令来实施本发明教示的实施例。因此，本发明教示的实施例的实施方案不限于硬件电路和软件的任何特定组合。
如本文所用的术语“计算机可读媒体”和“计算机程序产品”一般是指与向处理器804提供用于执行的一个或多个序列或一个或多个指令有关的任何媒体。这些指令，一般称为“计算机程序代码”(其可以用计算机程序或其它分组的形式来分组)，在被执行时，使得计算系统800能够执行本发明的实施例的特征或功能。这些和其它形式的计算机可读媒体可以采用许多形式，包括(但不限于)非易失性媒体、易失性媒体以及传输媒体。非易失性媒体包括例如固态盘、光盘或磁盘，如存储装置810。易失性媒体包括动态存储器，如存储器806。传输媒体包括同轴电缆、铜线和光纤，包括包含总线802的电线。
计算机可读媒体的常见形式包括例如软盘、软磁盘、硬盘、磁带或任何其它磁性媒体、CD-ROM、任何其它光学媒体、穿孔卡片、纸带、具有孔洞图案的任何其它物理媒体、RAM、PROM和EPROM、FLASH-EEPROM、任何其它存储器芯片或盒带、如下文所描述的载波，或计算机可以从中进行读取的任何其它媒体。
各种形式的计算机可读媒体可以参与将一个或多个指令的一个或多个序列载送到处理器804以便执行。举例来说，指令可以首先承载在远程计算机的磁盘上。远程计算机可以将指令加载到其动态存储器中，并使用调制解调器经由电话线发送指令。计算系统800本地的调制解调器可以接收电话线上的数据并使用红外发射器将数据转换成红外信号。耦合到总线802的红外检测器可以接收红外信号中所载送的数据并将数据放置于总线802上。总线802将数据载送到存储器806，处理器804从所述存储器检索并执行指令。由存储器806接收的指令可以任选地在通过处理器804执行之前或之后存储在存储装置810上。
应了解，为清楚起见，以上说明已经参考不同功能单元和处理器描述了本发明的实施例。然而，将显而易见的是，在不偏离本发明的情况下可以使用在不同功能单元、处理器或域之间的任何合适的功能分布。举例来说，将通过单独的处理器或控制器执行的图示功能可以通过同一处理器或控制器执行。因此，对特定功能单元的提及仅被视为提及用于提供所描述功能的合适装置，而非指示严格的逻辑或物理结构或组织。
另外，根据本文所述的各种实施例，荧光检测器可以与计算系统经由网络通信。
图9中示出了典型互联网配置900的一些元件，其中示出可能在远程本地办事处的多个客户端机器902连接到网关/集线器/隧道服务器/等910，本身经由某个互联网服务提供方(ISP)连接910而连接到互联网908。此外示出经由ISP连接914类似地连接到互联网908的其它可能的客户端912，这些单元例如经由连接到网关/隧道服务器918的ISP连接916与可能的重要实验室或办事处通信，所述网关/隧道服务器连接920到各个企业应用服务器922，所述应用服务器可经由另一集线器/路由器926连接到各个本地客户端930。这些服务器922中的任一个可充当分析潜在内容管理并传输如本发明中所述的设计解决方案的开发服务器，如下文更全面地描述。
用于测定双链核酸样品大小的方法和系统显示并且描述在图10和11中。
图10是说明根据本文所述的各种实施例的用于生成校准曲线的系统1000的框图。系统1000包括荧光检测器接口1002、迁移时间相关器104、校准曲线数据库1006和显示器1010。荧光检测器接口1002被配置成接收与以下各项相关的数据：
1)使多个经第一染料标记的双链核酸在移动性依赖分离条件下迁移。每个双链核酸的大小是已知的。
2)使多个经可检测标记的单链参考核酸在移动性依赖分离条件下迁移。每个经可检测标记的单链参考核酸的大小是已知的。
3)分离多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个并测定多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间。
4)分离经可检测标记的单链参考核酸中的每一个并测定经可检测标记的单链参考核酸中每一个的迁移时间。
迁移时间相关器1004被配置成基于所测定的多个经第一染料标记的双链核酸的迁移时间和所测定的经可检测标记的单链参考核酸的迁移时间，内插单链参考核酸的相关大小。迁移时间相关器1004另外被配置成生成关于经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链参考核酸的校准曲线。
校准曲线数据库1006被配置成存储校准曲线。
显示器1010被配置成向用户显示校准曲线。
图11是说明根据本文所述的各种实施例的用于生成校准曲线的方法的流程图。所述方法可以由图8中所示的示例性计算系统来实施。所述方法包括在步骤1102中，由处理器接收与以下各项相关的数据：
1)使多个经第一染料标记的双链核酸在移动性依赖分离条件下迁移。每个双链核酸的大小是已知的。
2)使多个经可检测标记的单链参考核酸在移动性依赖分离条件下迁移。每个经可检测标记的单链参考核酸的大小是已知的。
3)分离多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个并测定多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间。
4)分离经可检测标记的单链参考核酸中的每一个并测定经可检测标记的单链参考核酸中每一个的迁移时间。
所述方法另外包括步骤1104：由处理器基于所测定的多个经第一染料标记的双链核酸的迁移时间和所测定的经可检测标记的单链参考核酸的迁移时间，内插单链参考核酸的相关大小。
在步骤1106中，由处理器生成关于经第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链参考核酸的校准曲线。
方法1100还可以处理器可执行的指令形式存储在计算机可读存储媒体上。
用于定量双链核酸的方法和系统描述并且显示在图12和13中。
图12是说明根据本文所述的各种实施例的用于测定相对样品浓度的系统1200的框图。系统1200包括荧光检测器接口1202、相对浓度计算器1204、相对浓度数据库1206和显示器1210。
荧光检测器接口1202被配置成接收与经第一染料标记的双链核酸相关的荧光数据。荧光数据包括随时间推移的强度值。
相对浓度计算器1204被配置成鉴别荧光数据内的峰，测定峰的面积，并且将峰的面积数据归一化以生成经第一染料标记的双链核酸的相对浓度值。
相对浓度数据库1206被配置成存储相对浓度值。
显示器1210被配置成向用户显示相对浓度值。
图13是说明根据本文所述的各种实施例的用于测定相对样品浓度的方法1300的流程图。方法1300包括步骤1302：接收与经第一染料标记的双链核酸相关的荧光数据，其中所述荧光数据包括随时间推移的强度值。在步骤1304中，鉴别荧光数据内的峰。在步骤1306中，测定峰的面积。在步骤1308中，将峰的面积数据归一化以生成经第一染料标记的双链核酸的相对浓度值。
额外分析组件.系统可以连接到额外组件以提供与上文所述的电泳分离不同的第二分析测量。第二分析测量可以选自质谱分析、UV吸光度、亲水性液相色谱、核磁共振或提供不同或正交分析模式的其它分析方法。第二分析测量可包括在不同缓冲液或电场条件下的第二电泳分离，以使得不同迁移力可实现混合物的不同迁移行为。第一电泳分离的输出物可以与第二分析仪器的输入物可操作地连接，或由第一电泳分离产生的经分离核酸的所选等分试样可以手动转移到第二分析仪器。
实例
实例1.在CE系统上的DNA/NGS文库QC/确定大小
所制备的经非共价标记的各种尺寸的扩增子和大肠杆菌DH10B 200和400-bp IONPGM对照文库用于证明以下能力：1)区别所选的准备运行NGS文库的大小与潜在的杂质(如掺入的扩增子)，2)估计“未知”杂质(双链(ds)-DNA扩增子)的大小和NGS 200和400-bp文库的ds-DNA分布，3)证明当在分离条件下存在于相同毛细管内时，使用经共价标记的单链(ss)大小标准品几乎不受ds标记染料的影响。
材料
AmpliTaq360PCR混合物(AppliedPN 4398881，赛默飞世尔科技公司)；ExoSAP-(Affymetrix,Inc.PN 78201 1ML)；DNA缓冲液(10mM Tris/0.1mMEDTA，pH 8.0)(Teknova PN T0223)；UltraPureTM无DNA酶/RNA酶的蒸馏水(AppliedPN 10977-015，赛默飞世尔科技公司)；MicroAmpTM透明粘合剂膜(AppliedPN 4306311，赛默飞世尔科技公司)；光学96孔反应板(AppliedPN N8010560，赛默飞世尔科技公司)；YOYO-1 IODIDE(491/509，1-mM 200-ul)(Molecular Probes PN Y3601，赛默飞世尔科技公司)；无水DMSO(Molecular Probes PND12345，赛默飞世尔科技公司)；-1200大小标准品试剂盒(AppliedPN 4379950，赛默飞世尔科技公司)；Ion对照物试剂盒V2(IonPN 4482010，赛默飞世尔科技公司)；Applied基因分析仪3730xl(50cm/96封盖阵列)和3500xl(50cm/24封盖阵列)，赛默飞世尔科技公司)；Applied电泳分离介质，赛默飞世尔科技公司)以及如表2中所示用于扩增子生成的PCR引物。(赛默飞世尔科技公司)。
表2.
扩增子生成.对于聚合酶链反应(PCR)，即产生扩增子的扩增反应，将1ul DNA模板样品(在此情况下，Ion对照物试剂盒V2)、2ul PCR引物(1.2um/ea)、5μl AmpliTaq360PCR混合物、0.5ul(5％)GC增强子(AmpliTaq360PCR试剂盒的一部分以及1.5ul蒸馏水(无RNA酶/DNA酶)组合形成10ul反应体积。使反应体积经历下表3中所示的循环条件。PCR反应产物用如表4中所示的步骤处理，得到用作多个双链核酸的扩增子混合物。
表3.AmpliTaq360PCR循环条件
表4.PCR产物清理/ExoSAP-IT处理(4ul ExoSapit/10ul PCR产物)
样品标记.YOYO-1的10uM储备溶液是通过将10ul YOYO-1添加到990ul无水DMSO中而在DMSO中由商业供应品制成。将溶液储存在-20℃下。工作标记溶液是通过将4ul 10uMYOYO-1储备液添加到796ul超纯蒸馏水中来每日新鲜制造，得到50nM(1:20,000×)YOYO-1标记溶液。
为了标记双链核酸，将8ul 50nM YOYO-1溶液添加到1ul-1200大小标准品并充分混合。添加1ul NGS文库(包括掺入的扩增子，如果存在)以产生每孔10ul混合物。在培育期期间用粘合剂膜密封孔以降低蒸发。根据表5中的循环培育反应混合物。在标记循环完成之后，去除粘合剂膜并添加膈片准备进行电泳分离。
表5.标记反应的培育循环.
电泳分离.由于在电泳期间可能的焦耳加热，所以预备运行条件在3500与3730CE仪器之间略微变化。
3500运行参数：聚合物是运行模块是LongFragmentAnalysis50-POP7xl。烘箱温度40℃。运行电压8.5千伏。预运行电压15千伏。注入电压1.6千伏。运行时间6600秒。预运行时间180秒。注入时间15秒。数据延迟是240秒。
3730运行参数：聚合物是烘箱温度35℃。缓冲液温度35℃。预运行电压15千伏。预运行时间180秒。注入电压2.0千伏。注入时间15秒。第一读取时间200毫秒。第二读取时间200毫秒。运行电压8.5千伏。电压阶跃数40。电压阶跃间隔15秒。电压容差0.6千伏。电流稳定度30uA。斜变延迟1秒。数据延迟360秒。运行时间6600秒。
结果.
图14：掺有179-bp扩增子的200-bp文库.在此实验中，200-bp文库(DH10B，Ion)掺有大致179bp双链单一扩增子。出于此实验的目的，经染料共价标记的单链1200bp大小标准品被分配大致2×ss-DNA大小的ds-DNA大小估计值；此值可以相对于经ROXTM染料共价标记的双链大小标准品进行校准以提供更精确的实际大小估计值。图14证明当在基因分析仪CE 3500仪器上使用聚合物和50CM阵列运行时，～179-bp扩增子“杂质”以及200-bp PGM对照文库都可以被标记、检测到并且彼此区分开。随着接头(～71-bp)连接到200-bp文库，所得双链核酸文库预计分布在300-bp周围，这在所示电泳图中得到确认。LIZ-1200大小标准品(具有单独大小标记的尖峰)有可能被优化并用于以自动化方式确定“杂质”(在此情况下，扩增子)以及PGM 200-bp文库的大小，并且通过使用以每个曲线下面积计算所得的比率确定每个的相对量。双链扩增子和文库可证明峰由于用YOYO-1标记不完整或由于一些YOYO-1标记的差异性损失而加宽。YOYO-1标记往往会沿着双链核酸嵌入大致每5个核苷酸。在这些至少部分变性条件下，可能出现一些YOYO-1标记的损失。然而，已显示单个扩增子掺入物以及双链核酸文库都通过此电泳方法正确地确定了大小。
图15：仅200-bp文库.在此实验中，经标记的200-bp文库(DH10B，Ion)与经染料共价标记的单链1200bp大小标准品分离。大小标准品的大小被分配ds-DNA大小估计值，如上文关于图14所论述。图15证明均匀大小标准品片段分布和确定在预期范围内的大小：当在基因分析仪CE 3500仪器上使用聚合物和50cm阵列运行时，预期连接有接头(～71-bp)的200-bp文库分布在300-bp周围，这在所示电泳图中得到确认。
图16：掺有197-bp扩增子的400-bp文库.此实验证明当在基因分析仪CE 3500仪器上使用聚合物和50cm阵列运行时，～197-bp扩增子“杂质”掺入物以及400-bp(DH10B PGM)对照文库都可以被标记、检测到并且彼此区分开。注意与图14相比，197-bp扩增子片段与图14的实验的179-bp扩增子相比略微向后迁移，表明电泳分离中迁移的再现性。因此，可以区分大小相对类似的扩增子。在3500POP7/50cm系统上，400-bp PGM对照文库迁移到预期比197-bp扩增子大几乎2倍的位置。
图17.仅400-bp文库.此实验证明当在基因分析仪CE 3500仪器上使用聚合物和50cm阵列运行时，400-bp(DH10B PGM)对照文库可以被标记、检测到并且与200bp文库区分开。显示均匀片段分布和确定在预期范围内的大小。
图18：掺有172-bp扩增子的200-bp文库.此实验证明当在经染料共价标记的1200bp单链大小标准品存在下，在基因分析仪CE 3730仪器上使用聚合物分离介质和50cm阵列分离时，有可能标记、检测和区分掺入混合物中的“杂质”峰(在此实例中，172-bp扩增子)和经50-nM YOYO-1标记的200-bp文库(DH10B PGM对照物)。LIZ1200大小标准品未用嵌入剂标记并且充当用于确定ds-DNA大小的内部大小标准品。3730基线噪声显得高，但并不认为与化学系统相关并且似乎是毛细管中的一些种类或微泡的潜在电干扰。
图19.仅200bp文库.此实验证明在基因分析仪3730CE仪器上使用聚合物和50cm阵列检测具有均匀片段分布和大小确定在预期范围内的200-bp文库(DH10B PGM对照物)的能力。连接有接头(～71-bp)的200-bp文库预计分布在300-bp周围。这清楚地显示在图19的电泳图中。
图20：掺有197-bp扩增子的400-bp文库.此实验证明当在经染料共价标记的1200bp单链大小标准品存在下，在基因分析仪CE 3730仪器上使用聚合物分离介质和50-cm阵列分离时，～197-bp扩增子“杂质”掺入物以及400-bp(DH10B PGM)对照文库都经50-nM YOYO-1标记。LIZ1200大小标准品未用嵌入剂标记并且充当用于确定ds-DNA大小的内部大小标准品。在3730POP7/50cm系统上，400-bp PGM对照文库迁移到预期比197-bp扩增子大几乎2倍的位置。
图21：仅400-bp文库.此实验证明在基因分析仪3730CE仪器上使用聚合物和50cm阵列检测具有均匀片段分布和大小确定在预期范围内的400-bp文库(DH10B PGM对照物)的能力。连接有接头(～71-bp)的200-bp文库预计分布在300-bp周围。这清楚地显示在图21的电泳图中。
所属领域的技术人员了解，所采用的检测技术一般不是限制性的。实际上，广泛多种检测方式在所公开的方法和试剂盒的范围内，限制条件是其允许测定存在或不存在经标记的核酸。虽然已经结合特定实施例描述了本发明的原理，但是应明确了解，这些描述仅仅是为了举例并且不打算限制本发明的范围。已经出于说明和描述的目的提供了本文中已经公开的内容。这并不打算是穷尽性的或将所公开的内容限制于所述的精确形式。许多修改以及变化对于所属领域的技术人员来说将是显而易见的。选择并描述所公开的内容以便最佳地解释所述领域所公开的实施例的原理和实际应用，由此使得所属领域的其它技术人员能够了解适合于所涵盖的特定用途的各个实施例和各种修改。公开内容的范围打算由以下权利要求书和其等效物限定。

Claims (77)

1.一种用于测定多个双链核酸的长度范围的方法；其包含以下步骤：
使所述多个双链核酸与a)第一染料和b)经可检测标记的单链大小确定梯在所述第一染料被配置成标记双链核酸的条件下接触；
产生包含多个经第一染料标记的双链核酸和所述经可检测标记的单链大小确定梯的混合物；
使所述混合物在移动性依赖分离条件下迁移；
分离所述多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个；以及
测定所述多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间。
2.根据权利要求1所述的方法，其另外包含以下步骤：测定所述经可检测标记的单链大小确定梯的多个片段中每一个的迁移时间。
3.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其另外包含将所述多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间转换成长度。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述转换步骤包含以下步骤：比较所述经第一染料标记的双链核酸的迁移时间与所述经可检测标记的单链大小确定梯的至少一个片段的迁移时间。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述比较所述经第一染料标记的双链核酸的迁移时间与所述经可检测标记的单链大小确定梯的至少一个片段的迁移时间的步骤另外包含比较所述经第一染料标记的双链核酸迁移时间与所述经可检测标记的单链大小确定梯的多个片段迁移时间。
6.根据权利要求4和5中任一权利要求所述的方法，其中所述转换步骤另外包含基于分配给所述经可检测标记的单链大小确定梯的每个片段的相关性因数分配每个经第一染料标记的双链核酸的长度。
7.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述多个双链核酸是具有至少一部分双链结构的核糖核酸。
8.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述第一染料被配置成标记所述多个双链核酸的至少一个可检测部分。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一染料被配置成标记所述多个双链核酸的相当大一部分。
10.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述第一染料被配置成基本上不标记单链核酸。
11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述第一染料非共价标记所述多个双链核酸。
12.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述移动性依赖分离是在至少一种变性添加剂存在下进行。
13.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述移动性依赖分离条件被配置成维持标记所述多个双链核酸中每一个的所述第一染料标记至少一个可检测的量。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述移动性依赖分离条件包含被配置成维持经第一染料标记的双链核酸至少可检测的量的运行温度。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述运行温度是所述多个经第一染料标记的双链核酸保留所述第一染料标记的温度。
16.根据权利要求12至15中任一权利要求所述的方法，其中所述移动性依赖分离条件基本上维持所述多个经第一染料标记的双链核酸的标记至少第一部分的所述第一染料标记。
17.根据权利要求12至16中任一权利要求所述的方法，其中维持在所述移动性依赖分离条件下的所述经第一染料标记的双链核酸中每一个的比例与所述迁移时间相关。
18.根据权利要求1至11中任一权利要求所述的方法，其中所述移动性依赖分离条件不包含变性添加剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述移动性依赖分离条件被配置成基本上维持标记所述多个双链核酸中每一个的所述第一染料标记。
20.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述第一染料非共价标记所述多个双链核酸中的每一个。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述第一染料作为嵌入染料标记所述多个双链核酸中的每一个。
22.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述第一染料具有式I结构：
其中X是O、S、Se或C(CH3)；R1是C1-C6烷基；n＝0、1或2；Y是--CH2═CH2-，其中p和q等于0或1，使得p+q＝1；K1和K2是相同或不同的，并且独立地是氢、具有1-6个碳的烷基、或芳基；或K1和K2组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；LINK是含有4至19个亚甲基(--CH2--)的主链的脂肪族链，其任选地以一个或多个间隔穿插有杂原子，每个杂原子独立地是N、O或S，其中每个N杂原子另外经1-2个H或1-2个具有1至6个碳的烷基取代，所述烷基取代基可以是相同或不同的，限制条件是任何杂原子与另一杂原子分隔至少2个亚甲基，其中LINK的一个亚甲基端连接到所述吡啶鎓或喹啉鎓杂环的氮原子且LINK的另一个亚甲基端连接到A，除了在A是H或CH3的情况下，LINK必须含有至少一个N杂原子；
A是H、CH3或具有式A结构：
其中W是O、S、Se或C(CH3)；R2是C1-C6烷基；m＝0、1或2；Y是--CH2═CH2--，其中下标r和s等于0或1，使得r+s＝1；K3和K4可以是相同或不同的，并且独立地是氢、具有1-6个碳的烷基、或芳基；或K3和K4组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；当A不是H或CH3时，m和n可以是相同或不同的；以及
W和X可以是相同或不同的。
23.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述经可检测标记的单链大小确定梯经第二染料共价标记。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第二染料在光谱上与第一染料可分辨开。
25.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其另外包含通过使所述多个经第一染料标记的双链核酸的至少第一多个检测到的峰的一个或多个曲线下面积与所述经可检测标记的大小确定梯的片段的第二多个检测到的峰的至少一个或多个曲线下面积相关联而获得所述多个双链核酸的定量。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述多个经第一染料标记的双链核酸的至少第一多个检测到的峰是所述多个经第一染料标记的双链核酸的所有检测到的峰。
27.根据权利要求25所述的方法，其另外包含将所述多个经第一染料标记的双链核酸的所有相关曲线下面积求和，由此提供所述多个双链核酸的定量。
28.一种定量多个双链核酸的量的方法，所述方法包含：
使所述多个双链核酸与a)第一染料和b)经可检测标记的单链大小确定梯在所述第一染料被配置成标记双链核酸的条件下接触；
产生包含多个经第一染料标记的双链核酸和所述经可检测标记的单链大小确定梯的混合物；
使所述混合物在移动性依赖分离条件下迁移；
分离所述多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个；
接收与所述多个第一染料双链核酸相关的荧光数据，其中所述荧光数据包括随时间推移的强度值；
鉴别所述荧光数据内的峰；
测定所述峰的面积；以及
将所述峰的面积数据归一化以生成经所述第一染料标记的所述双链核酸的相对浓度值。
29.一种生成校准曲线的方法，所述方法包含：
接收与以下各项相关的数据：
使多个经第一染料标记的双链核酸在移动性依赖分离条件下迁移，其中所述双链核酸中每一个的大小是已知的，
使多个经可检测标记的单链参考核酸在所述移动性依赖分离条件下迁移，其中所述经可检测标记的单链参考核酸中每一个的大小是已知的，
分离所述多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个并测定所述多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间，以及
分离所述经可检测标记的单链参考核酸中的每一个并测定所述经可检测标记的单链参考核酸中每一个的迁移时间；
基于所测定的所述多个经第一染料标记的双链核酸的迁移时间和所测定的所述经可检测标记的单链参考核酸的迁移时间，内插单链参考核酸的相关大小；以及
生成关于经所述第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链参考核酸的校准曲线。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述校准曲线用于确定经所述第一染料标记的未知双链核酸的大小。
31.根据权利要求29所述的方法，其另外包含：
将所述校准曲线存储在存储器中。
32.一种经通过处理器可执行的指令编码的计算机可读存储媒体，所述指令包括用于以下的指令：
接收与以下各项相关的数据：
使多个经第一染料标记的双链核酸在移动性依赖分离条件下迁移，其中所述双链核酸中每一个的大小是已知的，
使多个经可检测标记的单链参考核酸在所述移动性依赖分离条件下迁移，其中所述经可检测标记的单链参考核酸中每一个的大小是已知的，
分离所述多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个并测定所述多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间，以及
分离所述经可检测标记的单链参考核酸中的每一个并测定所述经可检测标记的单链参考核酸中每一个的迁移时间；
基于所测定的所述多个经第一染料标记的双链核酸的迁移时间和所测定的所述经可检测标记的单链参考核酸的迁移时间，内插单链参考核酸的相关大小；以及
生成关于经所述第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链参考核酸的校准曲线。
33.一种用于生成校准曲线的系统，所述系统包含：
荧光检测器接口，被配置成接收与以下各项相关的数据：
使多个经第一染料标记的双链核酸在移动性依赖分离条件下迁移，其中所述双链核酸中每一个的大小是已知的，
使多个经可检测标记的单链参考核酸在所述移动性依赖分离条件下迁移，其中所述经可检测标记的单链参考核酸中每一个的大小是已知的，
分离所述多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个并测定所述多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间，以及
分离所述经可检测标记的单链参考核酸中的每一个并测定所述经可检测标记的单链参考核酸中每一个的迁移时间；
迁移时间相关器，被配置成：
基于所测定的所述多个经第一染料标记的双链核酸的迁移时间和所测定的所述经可检测标记的单链参考核酸的迁移时间，内插单链参考核酸的相关大小，
生成关于经所述第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链参考核酸的校准曲线；
校准曲线数据库，被配置成存储所述校准曲线，以及
显示器，被配置成向用户显示所述校准曲线。
34.一种用于生成校准曲线的系统，所述系统包含：
处理器；以及
经通过所述处理器可执行的指令编码的存储器，所述指令用于接收与以下各项相关的数据：
使多个经第一染料标记的双链核酸在移动性依赖分离条件下迁移，其中所述双链核酸中每一个的大小是已知的，
使多个经可检测标记的单链参考核酸在所述移动性依赖分离条件下迁移，其中所述经可检测标记的单链参考核酸中每一个的大小是已知的，
分离所述多个经第一染料标记的双链核酸中的每一个并测定所述多个经第一染料标记的双链核酸中每一个的迁移时间，以及
分离所述经可检测标记的单链参考核酸中的每一个并测定所述经可检测标记的单链参考核酸中每一个的迁移时间；
基于所测定的所述多个经第一染料标记的双链核酸的迁移时间和所测定的所述经可检测标记的单链参考核酸的迁移时间，内插单链参考核酸的相关大小；以及
生成关于经所述第一染料标记的双链核酸和经可检测标记的单链参考核酸的校准曲线。
35.一种测定相对浓度的方法，所述方法包含：
接收与经第一染料标记的双链核酸相关的荧光数据，其中所述荧光数据包括随时间推移的强度值；
鉴别所述荧光数据内的峰；
测定所述峰的面积；以及
将所述峰的面积数据归一化以生成经所述第一染料标记的所述双链核酸的相对浓度值。
36.一种经通过处理器可执行的指令编码的计算机可读存储媒体，所述指令包括用于以下的指令：
接收与经第一染料标记的双链核酸相关的荧光数据，其中所述荧光数据包括随时间推移的强度值；
鉴别所述荧光数据内的峰；
测定所述峰的面积；以及
将所述峰的面积数据归一化以生成经所述第一染料标记的所述双链核酸的相对浓度值。
37.一种用于测定相对浓度的系统，所述系统包含：
荧光检测器接口，被配置成接收与经第一染料标记的双链核酸相关的荧光数据，其中所述荧光数据包括随时间推移的强度值；
相对浓度计算器，被配置成：
鉴别所述荧光数据内的峰，
测定所述峰的面积，以及
将所述峰的面积数据归一化以生成经所述第一染料标记的所述双链核酸的相对浓度值；
相对浓度数据库，被配置成存储所述相对浓度值；以及
显示器，用于向用户显示所述相对浓度值。
38.一种用于测定相对浓度的系统，所述系统包含：
处理器；以及
经通过所述处理器可执行的指令编码的存储器，所述指令用于：
接收与经第一染料标记的双链核酸相关的荧光数据，其中所述荧光数据包括随时间推移的强度值；
鉴别所述荧光数据内的峰；
测定所述峰的面积；以及
将所述峰的面积数据归一化以生成经所述第一染料标记的所述双链核酸的相对浓度值。
39.一种用于测定多个双链核酸的长度范围的系统；其包含：
反应器容器，被配置成用于a)使第一染料与多个双链核酸接触，其中所述第一染料标记所述多个双链核酸中的每一个，和b)允许添加经可检测标记的单链大小确定梯；
通道，被配置成使所述经可检测标记的单链大小确定梯和多个经第一染料标记的双链核酸的混合物迁移；
可操作地连接到所述通道的阳极和阴极，被配置成向所述通道提供电场；以及
检测器，被配置成检测所述第一染料和所述经可检测标记的单链大小确定梯的标记。
40.根据权利要求39所述的系统，其中所述检测器检测紫外线吸光度、可见光吸光度、荧光或化学发光。
41.根据权利要求39至40中任一权利要求所述的系统，其另外包含所述通道的温度可控环境。
42.根据权利要求39至41中任一权利要求所述的系统，其另外包含所述反应器容器的温度可控环境。
43.根据权利要求39至42中任一权利要求所述的系统，其另外包含可操作地连接到所述检测器的数据处理器。
44.根据权利要求39至43中任一权利要求所述的系统，其中所述通道另外包含分离介质。
45.根据权利要求44所述的系统，其中所述分离介质是筛分介质。
46.根据权利要求39至45中任一权利要求所述的系统，其中所述通道另外包含变性添加剂。
47.根据权利要求39至46中任一权利要求所述的系统，其中所述通道被配置在微流体芯片内。
48.根据权利要求39至47中任一权利要求所述的系统，其中所述通道是电泳毛细管。
49.根据权利要求39至48中任一权利要求所述的系统，其中所述通道是多通道阵列的一部分。
50.一种用于测定多个双链核酸的长度范围的试剂盒；其包含：
被配置成标记双链核酸的第一染料；以及
经可检测标记的单链大小确定梯。
51.根据权利要求50所述的试剂盒，其中所述第一染料非共价标记所述双链核酸。
52.根据权利要求50至51中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述第一染料是嵌入剂。
53.根据权利要求50至52中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述经可检测标记的单链大小确定梯经共价标记。
54.根据权利要求50至53中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述经可检测标记的单链大小确定梯经荧光标记。
55.根据权利要求50至54中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述经可检测标记的单链大小确定梯用芘、萘、氨基吡啶、氧杂蒽、花青、香豆素、硼聚吖吲得辛、苯并呋喃或吲哚染料标记。
56.根据权利要求50至55中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述第一染料是花青染料、吖啶染料或菲啶染料。
57.根据权利要求50至56中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述第一染料是花青染料并且是单次甲基花青染料。
58.根据权利要求50至57中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述第一染料是花青染料并且是二聚花青染料。
59.根据权利要求56至58中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述花青染料具有式I结构：
其中X是O、S、Se或C(CH3)；R1是C1-C6烷基；n＝0、1或2；Y是--CH2═CH2-，其中p和q等于0或1，使得p+q＝1；K1和K2是相同或不同的，并且独立地是氢、具有1-6个碳的烷基、或芳基；或K1和K2组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；LINK是含有4至19个亚甲基(--CH2--)的主链的脂肪族链，其任选地以一个或多个间隔穿插有杂原子，每个杂原子独立地是N、O或S，其中每个N杂原子另外经1-2个H或1-2个具有1至6个碳的烷基取代，所述烷基取代基可以是相同或不同的，限制条件是任何杂原子与另一杂原子分隔至少2个亚甲基，其中LINK的一个亚甲基端连接到所述吡啶鎓或喹啉鎓杂环的氮原子且LINK的另一个亚甲基端连接到A，除了在A是H或CH3的情况下，LINK必须含有至少一个N杂原子；
A是H、CH3或具有式A结构：
其中W是O、S、Se或C(CH3)；R2是C1-C6烷基；m＝0、1或2；Y是--CH2═CH2--，其中下标r和s等于0或1，使得r+s＝1；K3和K4可以是相同或不同的，并且独立地是氢、具有1-6个碳的烷基、或芳基；或K3和K4组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；当A不是H或CH3时，m和n可以是相同或不同的；以及
W和X可以是相同或不同的。
60.根据权利要求50至59中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述第一染料在光谱上与标记所述经可检测标记的单链大小确定梯的第二染料可分辨开。
61.根据权利要求50至60中任一权利要求所述的试剂盒，其另外包含合并在微流体芯片中的通道。
62.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述通道包含分离介质。
63.根据权利要求61至62中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述通道包含变性添加剂。
64.根据权利要求61至63中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述通道包含缓冲溶液。
65.一种用于测定多个双链核酸的长度范围的组合物；其包含：
被配置成标记双链核酸的第一染料；
多个双链核酸；以及
经可检测标记的单链大小确定梯。
66.根据权利要求65所述的组合物，其中所述多个双链核酸是具有至少一部分双链结构的核糖核酸。
67.根据权利要求65至66中任一权利要求所述的组合物，其另外包含变性添加剂。
68.根据权利要求65至67中任一权利要求所述的组合物，其中所述第一染料被配置成不标记单链核酸。
69.根据权利要求65至68中任一权利要求所述的组合物，其中所述第一染料非共价标记所述双链核酸。
70.根据权利要求65至69中任一权利要求所述的组合物，其中所述第一染料是嵌入剂。
71.根据权利要求65至70中任一权利要求所述的组合物，其中所述经可检测标记的单链大小确定梯经共价标记。
72.根据权利要求65至71中任一权利要求所述的组合物，其中所述经可检测标记的单链大小确定梯经荧光标记。
73.根据权利要求65至72中任一权利要求所述的组合物，其中所述经可检测标记的单链大小确定梯用芘、萘、氨基吡啶、氧杂蒽、花青、香豆素、硼聚吖吲得辛、苯并呋喃或吲哚染料标记。
74.根据权利要求65至73中任一权利要求所述的组合物，其中所述第一染料是花青染料、吖啶染料或菲啶染料。
75.根据权利要求65至74中任一权利要求所述的组合物，其中所述第一染料是花青染料并且选自单次甲基花青或二聚花青。
76.根据权利要求73至75中任一权利要求所述的组合物，其中所述花青染料具有式I结构：
其中X是O、S、Se或C(CH3)；R1是C1-C6烷基；n＝0、1或2；Y是--CH2═CH2-，其中p和q等于0或1，使得p+q＝1；K1和K2是相同或不同的，并且独立地是氢、具有1-6个碳的烷基、或芳基；或K1和K2组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；LINK是含有4至19个亚甲基(--CH2--)的主链的脂肪族链，其任选地以一个或多个间隔穿插有杂原子，每个杂原子独立地是N、O或S，其中每个N杂原子另外经1-2个H或1-2个具有1至6个碳的烷基取代，所述烷基取代基可以是相同或不同的，限制条件是任何杂原子与另一杂原子分隔至少2个亚甲基，其中LINK的一个亚甲基端连接到所述吡啶鎓或喹啉鎓杂环的氮原子且LINK的另一个亚甲基端连接到A，除了在A是H或CH3的情况下，LINK必须含有至少一个N杂原子；
A是H、CH3或具有式A结构：
其中W是O、S、Se或C(CH3)；R2是C1-C6烷基；m＝0、1或2；Y是--CH2═CH2--，其中下标r和s等于0或1，使得r+s＝1；K3和K4可以是相同或不同的，并且独立地是氢、具有1-6个碳的烷基、或芳基；或K3和K4组合完成6元芳环，产生喹啉鎓环系统；当A不是H或CH3时，m和n可以是相同或不同的；以及
W和X可以是相同或不同的。
77.根据权利要求65至76中任一权利要求所述的组合物，其中所述第一染料在光谱上与标记所述经可检测标记的单链大小确定梯的染料可分辨开。
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