JP2022515944A - ３’－ヒドロキシブロッキング基を有するヌクレオシドおよびヌクレオチド、ならびにそれらのポリヌクレオチドシーケンシング方法における使用 - Google Patents

３’－ヒドロキシブロッキング基を有するヌクレオシドおよびヌクレオチド、ならびにそれらのポリヌクレオチドシーケンシング方法における使用 Download PDF

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Abstract

本開示の実施形態は、アセタールまたはチオカルバメート３’－ＯＨブロッキング基を有するヌクレオチドおよびヌクレオシド分子に関する。また、本明細書では、そのようなヌクレオチドおよびヌクレオシド分子を調製する方法、およびシーケンシングアプリケーションのための３’－ＯＨブロッキング基を含む完全に官能化されたヌクレオチドの使用を提供する。

Description

（背景）
（分野）
本開示は、一般に、３’－ヒドロキシ保護基を含むヌクレオチド、ヌクレオシド、またはオリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドシーケンシング方法におけるそれらの使用に関する。３’－ヒドロキシ保護ヌクレオチド、ヌクレオシド、またはオリゴヌクレオチドを調製する方法もまた、開示される。
（関連技術の説明）
分子の研究の進歩は、部分的には、分子またはその生物学的反応を特徴づけるために使用される技術の改善によって導かれてきた。特に、核酸ＤＮＡおよびＲＮＡの研究は、配列分析およびハイブリダイゼーションイベントの研究に使用される技術の開発から恩恵を受けている。
核酸の研究を改善した技術の例は、固定化された核酸の作製されたアレイの開発である。これらのアレイは、通常、固体支持材料上に固定化されたポリヌクレオチドの高密度マトリックスからなる。例えば、Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １２： １９－２６， １９９４を参照されたい。これは、マスクによって保護されているが、適切に修飾されたヌクレオチドホスホルアミダイトの付着を可能にするために定義された領域で露出されている化学的に増感されたガラス表面を使用して核酸を組み立てる方法を記載している。製造されたアレイはまた、既知のポリヌクレオチドを所定の位置で固体支持体上に「スポット」する技術によって製造することができる（例えば、Ｓｔｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９２： ６３７９－６３８３， １９９５）。
アレイに結合した核酸のヌクレオチド配列を決定する１つの方法は、「合成によるシーケンシング」または「ＳＢＳ」と呼ばれる。ＤＮＡの配列を決定するためのこの技術は、理想的には、シーケンスされている核酸の反対側の正しい相補的ヌクレオチドの制御された（すなわち、一度に１つずつ）取り込みを必要とする。これにより、各ヌクレオチド残基が一度に１つずつシーケンスされるため、複数のサイクルでヌクレオチドを追加することで正確なシーケンスが可能になり、制御されていない一連の取り込みが発生するのを防ぐ。取り込まれたヌクレオチドは、標識部分の除去およびその後の次のシーケンシングの前に、それに付着した適切な標識を使用して読み取られる。
単一の取り込みのみが発生することを保証するために、構造修飾（「保護基」または「ブロッキング基」）が、成長鎖に追加される各標識ヌクレオチドに含まれ、１つのヌクレオチドのみが組み込まれることを保証する。保護基を有するヌクレオチドが添加された後、次に、シーケンスされているＤＮＡの完全性を妨げない反応条件下で、保護基が除去される。その後、シーケンシングサイクルは、次の保護された標識ヌクレオチドの取り込みを継続できる。
ＤＮＡシーケンシングに役立つために、通常ヌクレオチド三リン酸であるヌクレオチドは、ヌクレオチドの塩基が追加されると、それをポリヌクレオチド鎖に組み込むために使用されるポリメラーゼが複製し続けるのを防ぐために、一般に３’－ヒドロキシ保護基を必要とする。ヌクレオチドに追加でき、それでも適切なグループのタイプには多くの制限がある。保護基は、ポリヌクレオチド鎖に損傷を与えることなく糖部分から容易に除去可能であると同時に、追加のヌクレオチド分子がポリヌクレオチド鎖に付加されるのを防ぐべきである。さらに、修飾ヌクレオチドは、それをポリヌクレオチド鎖に組み込むために使用されるポリメラーゼまたは別の適切な酵素と適合性である必要がある。したがって、理想的な保護基は、長期安定性を示し、ポリメラーゼ酵素によって効率的に取り込まれ、二次またはさらなるヌクレオチド取り込みの遮断を引き起こし、ポリヌクレオチド構造に損傷を与えない穏やかな条件下で、好ましくは水性条件下で除去される能力を有さなければならない。
可逆的保護基は以前に記載されている。たとえば、Ｍｅｔｚｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２２ （２０）： ４２５９－４２６７， １９９４）は、８つの３’修飾２－デオキシリボヌクレオシド５’－三リン酸（３’修飾ｄＮＴＰ）の合成と使用、および取り込み活性のための２つのＤＮＡテンプレートアッセイ。ＷＯ２００２／０２９００３は、ポリメラーゼ反応において成長中のＤＮＡ鎖上の３’－ＯＨ基をキャップするためのアリル保護基の使用を含み得るシーケンシング方法を記載している。
さらに、いくつかの可逆的保護基の開発およびＤＮＡ適合性条件下でそれらを脱保護する方法は、国際出願公開番号ＷＯ２００４／０１４８９７およびＷＯ２０１４／１３９５９６で以前に報告されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
（概要）
本開示のいくつかの実施形態は、３’-炭素原子に共有結合した構造
Figure 2022515944000001
 を形成する除去可能な３’－ＯＨ保護または遮断基を有するリボースまたはデオキシリボースを含むヌクレオチドまたはヌクレオシドであって、式中：
各Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルコキシ、シアノ、ハロゲン、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよいアラルキルである。
各Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、シアノ、またはハロゲンであり；
あるいは、Ｒ１ａおよびＲ２ａは、それらが結合している原子とともに、必要に応じて置換された５～８員のヘテロシクリル基を形成し；
Ｒ３は、Ｈ、置換されていてもよいＣ２～Ｃ６アルケニル、置換されていてもよいＣ３～Ｃ７シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ２～Ｃ６アルキニル、または置換されていてもよい（Ｃ１～Ｃ６アルキレン）Ｓｉ（Ｒ４）３であり；かつ
各Ｒ４は、独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、または任意に置換されたＣ６～Ｃ１０アリールである、ヌクレオチドまたはヌクレオシドに関する。いくつかの実施形態では、各Ｒ１ａおよびＲ１ｂがＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｒ２ａおよびＲ２ｂの両方がＨである場合、Ｒ３は、置換Ｃ２～Ｃ６アルケニル、置換されていてもよいＣ３～Ｃ７シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ２～Ｃ６アルキニル、または置換されていてもよい（Ｃ１～Ｃ６アルキレン）Ｓｉ（Ｒ４）３である。いくつかの実施形態では、各Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａおよびＲ２ｂがＨである場合、Ｒ３はＨではない。
本開示のいくつかの実施形態は、３’－炭素原子に共有結合した構造
Figure 2022515944000002
 を形成する除去可能な３’－ＯＨブロッキング基を有するリボースまたはデオキシリボースを含むヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、式中：
Ｒ５およびＲ６のそれぞれは、独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２～Ｃ８アルコキシアルキル、置換されていてもよい－（ＣＨ２）ｍ－フェニル、置換されていてもよい－（ＣＨ２）ｎ－（５または６員ヘテロアリール）、置換されていてもよい－（ＣＨ２）ｋ－Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、または置換されていてもよい－（ＣＨ２）ｐ－（３～７員ヘテロシクリル）であり；
－（ＣＨ２）ｍ－、－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｋ－、および－（ＣＨ２）ｐ－のそれぞれは置換されていてもよく；かつ
ｍ、ｎ、ｋ、およびｐのそれぞれは、独立して０、１、２、３、または４である、
ヌクレオシドまたはヌクレオチドに関する。
本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の３’－ＯＨブロック化ヌクレオチド分子を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに関する。
本開示のいくつかの実施形態は、シーケンシング反応において標的一本鎖ポリヌクレオチドに相補的な成長ポリヌクレオチドを調製する方法に関連し、ヌクレオチドの取り込みが導入を妨げる、本明細書に記載のヌクレオチド分子を成長する相補的ポリヌクレオチドに取り込むことを含む。成長する相補的ポリヌクレオチドへの後続のヌクレオチドの。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドの取り込みは、ポリメラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、または逆転写酵素によって達成される。一実施形態では、組み込みは、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって達成される。
本開示のいくつかのさらなる実施形態は、以下を含む、標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法に関する：
（ａ）３’－ＯＨブロッキング基および本明細書に記載の検出可能な標識を含むヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチド鎖の少なくとも一部に相補的なコピーポリヌクレオチド鎖に組み込むこと；
（ｂ）コピーポリヌクレオチド鎖に組み込まれたヌクレオチドの同一性を検出すること；および
（ｃ）コピーポリヌクレオチド鎖に組み込まれたヌクレオチドから標識および３’－ＯＨブロッキング基を化学的に除去すること。
いくつかの実施形態において、シーケンシング方法は、（ｄ）化学的に除去された標識および３’ブロッキング基をコピーポリヌクレオチド鎖から洗い流すことをさらに含む。いくつかの実施形態において、そのような洗浄工程はまた、組み込まれていないヌクレオチドを除去する。いくつかのそのような実施形態において、組み込まれたヌクレオチドの３’ブロッキング基および検出可能な標識は、次の相補的ヌクレオチドを導入する前に除去される。いくつかのさらなる実施形態において、３’ブロッキング基および検出可能な標識は、化学反応の単一のステップで除去される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の連続的な組み込みは、少なくとも５０回、少なくとも１００回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、または少なくとも２５０回実行される。
本開示のいくつかのさらなる実施形態は、本明細書に記載の複数のヌクレオチドまたはヌクレオシド分子を含むキット、およびそのための包装材料に関する。本明細書に記載のヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、またはキットを使用して、生物学的システム（例えば、そのプロセスまたは構成要素を含む）を検出、測定、または同定することができる。ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはキットを使用できる例示的な技術には、シーケンシング、発現分析、ハイブリダイゼーション分析、遺伝子分析、ＲＮＡ分析、細胞アッセイ（例えば、細胞結合または細胞機能分析）、またはタンパク質アッセイ（例えば、タンパク質結合アッセイまたはタンパク質活性アッセイ）。自動シーケンシング機器等、特定の技術を実行するための自動機器で使用することができる。シーケンシング機器には、異なる検出可能なラベルを区別するために、異なる波長で動作する２つ以上のレーザーが含まれている場合がある。
図１は、６５℃の緩衝液中での時間の関数としての種々の３’ブロック化ヌクレオチドの安定性を示す折れ線グラフである。 図２Ａは、３’－ＡＯＭブロッキング基を持つヌクレオチドと溶液中の３’－Ｏ－アジドメチル（－ＣＨ２Ｎ３）ブロッキング基を持つヌクレオチドの脱ブロック化率を時間の関数として比較した残りのヌクレオチド（出発物質）のパーセンテージ（％）を例示する折れ線グラフである。図２Ｂは、３’ブロックヌクレオチドのブロック解除率を溶液中の種々のアセタールブロッキング基と比較した時間の関数としての３’ブロック解除ヌクレオチドのパーセンテージ（％）を例示する折れ線グラフである。 図３Ａおよび３Ｂは、取り込みミックスに３’－ＡＯＭブロッキング基を含む完全に機能化されたヌクレオチド（ｆｆＮ）を使用したイルミナＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）機器でのシーケンス結果を例示する。図３Ｃは、３’－Ｏ－アジドメチルブロッキング基を含む標準のｆｆＮと比較した、取り込みミックスに３’－ＡＯＭブロッキング基を含む完全に機能化されたヌクレオチド（ｆｆＮ）を使用したシーケンスエラー率を例示する。 図４Ａおよび４Ｂはそれぞれ、２つの異なるＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ８１２およびＰｏｌ１９０１）を使用した３’－ＡＯＭおよび３’－Ｏ－アジドメチルブロッキング基を含む完全に機能化されたヌクレオチドを使用したフェージング、プレフェージング、およびエラー率を含む主要なシーケンスメトリックの比較をそれぞれ例示する。 図５は、４５℃の緩衝液中での時間の関数としての３’－ＡＯＭまたは３’－Ｏ－アジドメチルブロッキング基を持つ完全に機能化されたヌクレオチドのシーケンス安定性を例示する折れ線グラフである。 図６は、６５℃の緩衝液中での時間の関数としての種々の３’ブロッキング基を持つヌクレオシドの安定性を例示する折れ線グラフである。 図７は、２つの異なる条件下（Ｏｘｏｎｅ（登録商標）またはＮａＩＯ４）でのチオカルバメート３’ブロッキング基ジメチルチオカルバメート（ＤＭＴＣ）の切断（ブロック解除）率を３’－Ｏ－アジドメチル（３’－Ｏ－ＣＨ２Ｎ３）ブロッキング基のそれと比較した、残りの３’ブロックヌクレオチドのパーセンテージ（％）を時間の関数として例示する折れ線グラフである。
（詳細な説明）
本開示の実施形態は、シーケンシング用途、例えば、合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）のための３’－ＯＨアセタールまたはチオカルバメートブロッキング基を有するヌクレオシドおよびヌクレオチドに関する。これらのブロッキング基は、当技術分野で知られているものと比較して、溶液中でより優れた安定性を提供する。特に、３’－ＯＨブロッキング基は、完全に機能化されたヌクレオチド（ｆｆＮ）の合成中の安定性が向上し、シーケンス機器での処方、保存、操作中の溶液中での安定性も向上している。さらに、本明細書に記載の３’－ＯＨブロッキング基はまた、データ品質を改善するために、低いプレフェージング、低い信号減衰を達成し得、これにより、シーケンシングアプリケーションからのより長い読み取りが可能になる。
（定義）
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」といった他の形式の使用は、限定的ではない。用語「有している（ｈａｖｉｎｇ）」ならびに「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有した（ｈａｄ）」といった他の形式の使用は、限定的ではない。本明細書で使用されているように、クレームの移行句（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｐｈｒａｓｅ）中であっても本体部（ｂｏｄｙ）中であっても、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、オープンエンド化された意味を有すると解釈されるべきである。即ち、上記の用語は、句「少なくとも有している（ｈａｖｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」または「少なくとも含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」と同義的に解釈されるべきである。例えば、プロセスの文脈で使用される場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、プロセスが少なくとも記載されたステップを含むが、追加のステップを含んでもよいことを意味する。化合物、組成物、またはデバイスの文脈で使用される場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、化合物、組成物、またはデバイスが少なくとも記載された特徴または成分を含むが、追加の特徴または成分もまた含んでもよいことを意味する。
本明細書で使用される一般的な有機略語は、次のように定義される。
℃ 摂氏温度
ｄＡＴＰ デオキシアデノシン三リン酸
ｄＣＴＰ デオキシシチジン三リン酸
ｄＧＴＰ デオキシグアノシン三リン酸
ｄＴＴＰ デオキシチミジン三リン酸
ｄｄＮＴＰ ジデオキシヌクレオチド三リン酸
ｆｆＮ 完全に機能化されたヌクレオチド
ＲＴ 室温
ＳＢＳ 合成によるシーケンシング
ＳＭ 出発材料
本明細書で使用される「アレイ」という用語は、異なるプローブ分子が相対位置に従って互いに区別できるように、１以上の基板に付着した異なるプローブ分子の集団を指す。アレイは、基板上の異なるアドレス指定可能な位置にそれぞれ配置された異なるプローブ分子を含むことができる。代替的または追加的に、アレイは、それぞれが異なるプローブ分子を有する別個の基板を含むことができ、異なるプローブ分子は、基板が付着する表面上の基板の位置に従って、または基板の位置に従って識別され得る液体で。別個の基板が表面上に位置する典型的なアレイには、例えば、米国特許第６，３５５，４３１Ｂ１号、米国特許第２００２／０１０２５７８号およびＰＣＴ公開第ＷＯ００／６３４３７号に記載されているウェル内にビーズを含むアレイが含まれるが、これらに限定されない。例えば、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）等のマイクロ流体デバイスを使用して、液体アレイ内のビーズを区別するために本発明で使用できる例示的なフォーマットは、例えば、米国特許第６，５２４，７９３号に記載されている。本発明で使用できるアレイのさらなる例には、米国特許第５，４２９，８０７；５，４３６，３２７；５，５６１，０７１；５，５８３，２１１；５，６５８，７３４；５，８３７，８５８；５，８７４，２１９；５，９１９，５２３；６，１３６，２６９；６，２８７，７６８；６，２８７，７７６；６，２８８，２２０；６，２９７，００６；６，２９１，１９３；６，３４６，４１３；６，４１６，９４９；６，４８２，５９１；６，５１４，７５１と６，６１０，４８２号；およびＷＯ９３／１７１２６；ＷＯ９５／１１９９５；ＷＯ９５／３５５０５；ＥＰ７４２２８７；およびＥＰ７９９８９７に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ａｔｔａｃｈｅｄ）」または「共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｂｏｎｄｅｄ）」は、原子間での電子対の共有を特徴とする化学結合の形成を指す。例えば、共有結合されたポリマーコーティングは、他の手段、例えば、接着または静電相互作用を介した表面への結合と比較して、基板の官能化された表面と化学結合を形成するポリマーコーティングを指す。表面に共有結合しているポリマーは、共有結合に加えて手段を介して結合することもできることが理解されよう。
本明細書で使用される「Ｒ」基は、示された原子に結合することができる置換基を表す。Ｒ基は、置換されていても置換されていなくてもよい。２つの「Ｒ」基が「それらが結合している原子とともに」環または環系を形成すると記載されている場合、原子、介在結合、および２つのＲ基の集合単位が列挙された環であることを意味する。例えば、以下のサブ構造が存在し：
Figure 2022515944000003
 かつＲ１およびＲ２が水素およびアルキルからなる群から選択されるものとして定義されるか、またはＲ１およびＲ２がそれらが結合している原子とともにアリールまたはカルボシクリルを形成するものとして定義される場合、Ｒ１およびＲ２は、水素またはアルキルから選択され得るか、あるいは、当該サブ構造は、以下の構造を有し：
Figure 2022515944000004
 式中、Ａは、描かれた二重結合を含むアリール環またはカルボシクリルである。
特定のラジカル命名規則は、文脈に応じて、モノラジカルまたはジラジカルのいずれかを含むことができることを理解されたい。例えば、置換基が分子の残りの部分への２つの結合点を必要とする場合、置換基はジラジカルであることが理解される。例えば、２つの結合点を必要とするアルキルとして識別される置換基には、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－等のジラジカルが含まれる。他のラジカル命名規則は、ラジカルが「アルキレン」や「アルケニレン」等のジラジカルであることを明確に示す。
本明細書で使用される用語「ハロゲン」または「ハロ」は、元素の周期表の列７の放射線安定性原子のいずれか１つ、例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味し、フッ素および塩素が好ましい。
本明細書で使用される場合、「ａ」および「ｂ」が整数である「Ｃａ～Ｃｂ」は、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基の炭素原子の数、またはシクロアルキルまたはアリール基の環原子の数を指す。すなわち、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルの環、およびアリールの環は、「ａ」から「ｂ」までの炭素原子を含むことができる。例えば、「Ｃ１～Ｃ４アルキル」基は、１から４個の炭素を有するすべてのアルキル基、すなわち、ＣＨ３－、ＣＨ３ＣＨ２－、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２－、（ＣＨ３）２ＣＨ－、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－および（ＣＨ３）３Ｃ－；Ｃ３～Ｃ４のシクロアルキル基とは、３から４個の炭素原子を有するすべてのシクロプロピル基、すなわち、シクロプロピルおよびシクロブチルを指す。同様に、「４～６員ヘテロシクリル」基は、合計４から６個の環原子を有するすべてのヘテロシクリル基、例えば、アゼチジン、オキセタン、オキサゾリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン等を指す。アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、またはアリール基に関して「ａ」および「ｂ」が指定されていない場合、これらの定義に記載されている最も広い範囲が想定される。本明細書で使用される場合、「Ｃ１～Ｃ６」という用語は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６、ならびに２つの数値のいずれかによって定義される範囲を含む。例えば、Ｃ１～Ｃ６アルキルは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ３アルキル等を含む。同様に、Ｃ２～Ｃ６アルケニルは、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ５アルケニル、Ｃ３～Ｃ４アルケニル等を含む。Ｃ２～Ｃ６アルキニルは、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６アルキニル、Ｃ２～Ｃ５アルキニル、Ｃ３～Ｃ４アルキニル等を含む。Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルはそれぞれ、３、４、５、６、７および８炭素原子、またはＣ３～Ｃ７シクロアルキルまたはＣ５～Ｃ６シクロアルキル等の２つの数値のいずれかによって定義される範囲を含む炭化水素環を含む。
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、完全に飽和した（すなわち、二重結合または三重結合を含まない）直鎖または分岐炭化水素鎖を指す。アルキル基は、１～２０個の炭素原子を有してもよい（本明細書中に現れる場合は常に、「１～２０」といった数値範囲は、指定された範囲内の各整数を指す；例えば、「１～２０個の炭素原子」は、アルキル基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子等で、２０個までの炭素原子からなってもよいが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アルキル」の出現もカバーする）。アルキル基はまた、１～９個の炭素原子を有する中型アルキルであってもよい。アルキル基はまた、１～６個の炭素原子を有するより低級のアルキルであり得た。アルキル基は、「Ｃ１～Ｃ４アルキル」または同様の呼称として指定してもよい。ほんの一例として、「Ｃ１～Ｃ６アルキル」は、アルキル鎖に１～６個の炭素原子が存在すること、すなわち、アルキル鎖がメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、およびｔ－ブチルからなる群から選択されることを示す。典型的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ターシャリーブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」は、Ｒが上記で定義されるアルキルである式－ＯＲを指し、例えば「Ｃ１～Ｃ９アルコキシ」であり、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、１－メチルエトキシ（イソプロポキシ）、ｎ－ブトキシ、ｉｓｏ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、およびｔｅｒｔ－ブトキシ等が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、１以上の二重結合を含む直鎖または分岐炭化水素鎖を指す。アルケニル基は、２～２０個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アルケニル」の出現もカバーする。アルケニル基はまた、２から９個の炭素原子を有する中型アルケニルであってもよい。アルケニル基はまた、２～６個の炭素原子を有するより低級のアルケニルであってもよい。アルケニル基は、「Ｃ２～Ｃ６アルケニル」または同様の呼称として指定してもよい。ほんの一例として、「Ｃ２～Ｃ６アルケニル」は、アルケニル鎖に２～６個の炭素原子が存在すること、すなわち、アルケニル鎖がエテニル、プロペン－１－イル、プロペン－２－イル、プロペン－３－イル、ブテン－１－イル、ブテン－２－イル、ブテン－３－イル、ブテン－４－イル、１－メチル－プロペン－１－イル、２－メチル－プロペン－１－イル、１－エチル－エテン－１－イル、２－メチル－プロペン－３－イル、ブタ－１，３－ジエニル、ブタ－１，２，－ジエニル、およびブタ－１，２－ジエン－４－イルからなる群から選択されることを示す。典型的なアルケニル基としては、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、およびヘキセニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、１以上の三重結合を含む直鎖または分岐炭化水素鎖を指す。アルキニル基は、２～２０個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アルキニル」の出現もカバーする。アルキニル基はまた、２～９個の炭素原子を有する中型アルキニルであってもよい。アルキニル基はまた、２～６個の炭素原子を有するより低級のアルキニルであり得た。アルキニル基は、「Ｃ２～Ｃ６アルキニル」または同様の呼称として指定してもよい。ほんの一例として、「Ｃ２～Ｃ６アルキニル」は、アルキニル鎖に２～６個の炭素原子が存在すること、すなわち、アルキニル鎖がエチニル、プロピン－１－イル、プロピン－２－イル、ブチン－１－イル、ブチン－３－イル、ブチン－４－イル、および２－ブチニルからなる群から選択されることを示す。典型的なアルキニル基としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、およびヘキシニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」は、１つ以上のヘテロ原子、すなわち、鎖骨格に窒素、酸素および硫黄を含むがこれらに限定されない炭素以外の元素を含む直鎖または分岐炭化水素鎖を指す。ヘテロアルキル基は、１から２０個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない「ヘテロアルキル」という用語の出現もカバーする。ヘテロアルキル基はまた、１から９個の炭素原子を有する中型のヘテロアルキルであり得る。ヘテロアルキル基はまた、１から６個の炭素原子を有するより低いヘテロアルキルであり得る。ヘテロアルキル基は、「Ｃ１～Ｃ６ヘテロアルキル」または同様の呼称として指定され得る。ヘテロアルキル基は、１つまたは複数のヘテロ原子を含み得る。例としてのみ、「Ｃ４～Ｃ６ヘテロアルキル」は、ヘテロアルキル鎖に４～６個の炭素原子があり、さらに鎖の骨格に１つまたは複数のヘテロ原子があることを示す。
「芳香族」という用語は、共役パイ電子系を有する環または環系を指し、炭素環式芳香族（例えば、フェニル）および複素環式芳香族基（例えば、ピリジン）の両方を含む。この用語は、環系全体が芳香族であるという条件で、単環式または縮合環多環式（すなわち、隣接する原子の対を共有する環）基を含む。
本明細書で使用される場合、「アリール」は、環骨格に炭素のみを含む芳香族環または環系（すなわち、２つの隣接する炭素原子を共有する２つ以上の縮合環）を指す。アリールが環系の場合、系内のすべての環は芳香族である。アリール基は、６～１８個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない「アリール」という用語の出現もカバーする。いくつかの実施形態では、アリール基は、６～１０個の炭素原子を有する。アリール基は、「Ｃ６～Ｃ１０アリール」、「Ｃ６またはＣ１０アリール」、または同様の呼称として指定され得る。アリール基の例としては、これらに限定されないが、フェニル、ナフチル、アズレニル、およびアントラセニルが挙げられる。
「アラルキル」または「アリールアルキル」は、「Ｃ７－１４アラルキル」といった、置換基としてアルキレン基を介して結合されたアリール基であり、ベンジル、２－フェニルエチル、３－フェニルプロピル、およびナフチルアルキルが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの場合では、アルキレン基は、より低級のアルキレン基（すなわち、Ｃ１～Ｃ６アルキレン基）である。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、１以上のヘテロ原子、すなわち、環骨格中の窒素、酸素および硫黄が挙げられるがこれらに限定されない、炭素以外の元素を含む芳香族環または環系（すなわち、２つの隣接する原子を共有する２以上の縮合環）を指す。ヘテロアリールが環系である場合、系内の各環は、芳香族である。ヘテロアリール基は、５～１８個の環員数（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含めた、環骨格を構成する原子の数）を有してもよいが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロアリール」の出現もカバーする。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は、５～１０の環員数または５～７個の環員数を有する。ヘテロアリール基は、「５～７員のヘテロアリール」、「５～１０員のヘテロアリール」、または同様の呼称として指定してもよい。ヘテロアリール環の例としては、フリル、チエニル、フタラジニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イソインドリル、およびベンゾチエニルが挙げられるが、これらに限定されない。
「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアリールアルキル」は、置換基として、アルキレン基を介して結合されたヘテロアリール基である。例としては、２－チエニルメチル、３－チエニルメチル、フリルメチル、チエニルエチル、ピロリルアルキル、ピリジルアルキル、イソキサゾリルアルキル、およびイミダゾリルアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、アルキレン基は、より低級のアルキレン基（すなわち、Ｃ１～Ｃ６アルキレン基）である。
本明細書で使用される場合、「カルボシクリル」は、環系骨格に炭素原子のみを含む非芳香族環状環または環系を意味する。カルボシクリルが環系である場合、２つ以上の環は、融合、架橋、またはスピロ接続された様式で一緒に結合されてもよい。環系の少なくとも１つの環が芳香族でない限り、カルボシクリルは、任意の程度の飽和度を有してもよい。したがって、カルボシクリルとしては、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニルが挙げられる。カルボシクリル基は、３～２０個の炭素原子を有してもよいが、本定義は、数値範囲が指定されていない「カルボシクリル」という用語の出現もカバーする。カルボシクリル基はまた、３～１０個の炭素原子を有する中型カルボシクリルであってもよい。カルボシクリル基はまた、３～６個の炭素原子を有するカルボシクリルであってもよい。カルボシクリル基は、「Ｃ３～Ｃ６カルボシクリル」または同様の呼称として指定してもよい。カルボシクリル環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、２，３－ジヒドロ－インデン、ビシクル［２．２．２］オクタニル、アダマンチル、およびスピロ［４．４］ノナニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」は、完全に飽和したカルボシクリル環または環系を意味する。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ヘテロシクリル」は、環骨格に少なくとも１つのヘテロ原子を含む非芳香族環状環または環系を意味する。ヘテロシクリルは、融合、架橋、またはスピロ結合の方法で一緒に結合してもよい。ヘテロシクリルは、環系の少なくとも１つの環が芳香族でない限り、任意の程度の飽和度を有してもよい。ヘテロ原子は、環系の非芳香族環または芳香族環のいずれかに存在してもよい。ヘテロシクリル基は、３～２０の環員数（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含めた、環骨格を構成する原子の数）を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロシクリル」の出現もカバーする。ヘテロシクリル基はまた、３～１０の環員数を有する中型ヘテロシクリルであってもよい。ヘテロシクリル基はまた、３～６の環員数を有するヘテロシクリルであってもよい。ヘテロシクリル基は、「３－６員ヘテロシクリル」または同様の呼称として指定してもよい。好ましい６員単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳの１つから３つまで選択され、好ましい５員単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳの１つまたは２つのヘテロ原子から選択される。ヘテロシクリル環の例としては、アゼピニル、アクリジニル、カルバゾリル、シノリニル、ジオキソラニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、オキシラニル、オキセパニル、チエパニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ジオキソピペラジニル、ピロリジニル、４－ピペリドニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、１，３－ジオキシニル、１，３－ジオキサニル、１，４－ジオキシニル、１，４－ジオキサニル、１，３－オキサチアニル、１，４－オキサチイニル、１，４－オキサチアニル、２Ｈ－１，２－オキサジニル、トリオキサニル、ヘキサヒドロ－１，３，５－トリアジニル、１，３－ジオキソリル、１，３－ジオキソラニル、１，３－ジチオリル、１，３－ジチオラニル、イソキサゾリニル、イソキサゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキサゾリジノニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、１，３－オキサチオラニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロイオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロ－１，４－チアジニル、チアモルホリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ベンズイミダゾリジニル、およびテトラヒドロキノリンが挙げられるが、これらに限定されない。
「Ｏ－カルボキシ」基とは、Ｒが、水素、本明細書で定義される、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテロシクリルから選択される、「－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ」基を指す。
「Ｃ－カルボキシ」基とは、Ｒが、水素、本明細書で定義される、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテロシクリルからなる群から選択される「Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ」基を指す。非限定的な例には、カルボキシル（すなわち、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）が含まれる。
「スルホニル」基とは、Ｒが、水素、本明細書で定義される、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテロシクリルから選択される「－ＳＯ２Ｒ」基を指す。
「スルフィノ」基は、「－Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ」基を指す。
「Ｓ－スルホンアミド」基とは、ＲＡおよびＲＢが、各々独立して水素、本明細書で定義される、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテロシクリルから選択される、「－ＳＯ２ＮＲＡＲＢ」基を指す。
「Ｎ－スルホンアミド」基とは、ＲＡおよびＲｂが、各々独立して水素、本明細書で定義される、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテロシクリルから選択される、「－Ｎ（ＲＡ）ＳＯ２ＲＢ」基を指す。
「Ｃ－アミド」基とは、ＲＡおよびＲＢが、各々独立して水素、本明細書で定義される、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテロシクリルから選択される、「－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＡＲＢ」基を指す。
「Ｎ－アミド」基とは、ＲＡおよびＲＢが、各々独立して水素、本明細書で定義される、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテロシクリルから選択される、「－Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）ＲＢ」基を指す。
「アミノ」基とは、ＲＡおよびＲＢが、各々独立して水素、本明細書で定義される、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテロシクリルから選択される、「－ＮＲＡＲＢ」基を指す。非限定的な例には、遊離アミノ（すなわち、－ＮＨ２）が含まれる。
「アミノアルキル」基とは、アルキレン基を介して接続されたアミノ基を指す。
「アルコキシアルキル」基とは、「Ｃ２～Ｃ８アルコキシアルキル」等といった、アルキレン基を介して結合したアルコキシ基を指す。
本明細書で使用される場合、置換基は、１以上の水素原子が別の原子または基と交換された非置換の親基に由来する。特に明記しない限り、基が「置換された」と見なされる場合、その基は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルケニル、Ｃ１－Ｃ６アルキニル、Ｃ１－Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３－Ｃ７カルボシクリル（任意でハロ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１－Ｃ６ハロアルコキシで置換）、Ｃ３－Ｃ７－カルボシクリル－Ｃ１－Ｃ６－アルキル（任意でハロ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１－Ｃ６ハロアルコキシで置換）、３－１０員ヘテロシクリル－Ｃ１－Ｃ６－アルキル（任意でハロ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１－Ｃ６ハロアルコキシで置換）、アリール（任意でハロ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１－Ｃ６ハロアルコキシで置換）、アリール（Ｃ１－Ｃ６）アルキル（任意でハロで置換、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１－Ｃ６ハロアルコキシ）、５－１０員ヘテロアリール（任意でハロ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１－Ｃ６ハロアルコキシで置換）、５－１０員ヘテロアリール（Ｃ１－Ｃ６）アルキル（任意でハロ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１－Ｃ６ハロアルコキシで置換）、ハロ、－ＣＮ、ヒドロキシ、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ（Ｃ１－Ｃ６）アルキル（すなわち、エーテル）、アリールオキシ、スルフヒドリル（メルカプト）、ハロ（Ｃ１－Ｃ６）アルキル（例、－ＣＦ３）、ハロ（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシ（例、－ＯＣＦ３）、Ｃ１－Ｃ６アルキルチオ、アリールチオ、アミノ、アミノ（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、ニトロ、Ｏ－カルバミル、Ｎ－カルバミル、Ｏ－チオカルバミル、Ｎ－チオカルバミル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、スルフィニル、スルホニル、－ＳＯ３Ｈスルフィノ、－ＯＳＯ２Ｃ１－４アルキル、およびオキソ（＝Ｏ）から独立して選択される１以上の置換基で置換されていることを意味する。基が「任意で置換された」と記載されている場合はいつでも、その基を、上記の置換基で置換することができる。
本明細書で使用される「ヒドロキシ」という用語は、－ＯＨ基を指す。
本明細書で使用される「シアノ」基という用語は、「ＣＮ」基を指す。
本明細書で使用される「アジド」という用語は、－Ｎ３基を指す。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」には、窒素含有複素環式塩基、糖、および１以上のリン酸基が含まれる。それらは、核酸配列の単量体単位である。ＲＮＡでは糖はリボースであり、ＤＮＡではデオキシリボース、つまりリボースに存在する水酸基を持たない糖である。窒素含有複素環塩基は、プリンまたはピリミジン塩基であり得る。プリン塩基には、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびそれらの修飾誘導体または類似体が含まれる。ピリミジン塩基には、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、およびそれらの修飾誘導体または類似体が含まれる。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１またはプリンのＮ－９に結合する。
本明細書で使用される「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドに構造的に類似しているが、リン酸部分が欠けている。ヌクレオシド類似体の例は、標識が塩基に結合し、リン酸基が糖分子に結合していないものである。本明細書では、「ヌクレオシド」という用語は、当業者に理解される通常の意味で使用される。例には、リボース部分を含むリボヌクレオシドおよびデオキシリボース部分を含むデオキシリボヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。修飾ペントース部分は、酸素原子が炭素で置き換えられているおよび／または炭素が硫黄または酸素原子で置き換えられているペントース部分である。「ヌクレオシド」は、置換された塩基および／または糖部分を有することができるモノマーである。さらに、ヌクレオシドをより大きなＤＮＡおよび／またはＲＮＡポリマーおよびオリゴマーに組み込むことができる。
本明細書では、「プリン塩基」という用語は、当業者に理解される通常の意味で使用され、その互変異性体を含む。同様に、「ピリミジン塩基」という用語は、当業者に理解される通常の意味で本明細書で使用され、その互変異性体を含む。置換されていてもよいプリン塩基の非限定的なリストには、プリン、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、アロキサンチン、７－アルキルグアニン（例えば、７－メチルグアニン）、テオブロミン、カフェイン、尿酸およびイソグアニンが含まれる。ピリミジン塩基の例には、シトシン、チミン、ウラシル、５，６－ジヒドロウラシルおよび５－アルキルシトシン（例えば、５－メチルシトシン）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、本明細書に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチドを「含む」と記載される場合、本明細書に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと共有結合を形成することを意味する。同様に、ヌクレオシドまたはヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに「取り込まれる」等、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部として記載される場合、本明細書に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと共有結合を形成することを意味する。いくつかのそのような実施形態において、共有結合は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’ヒドロキシ基と、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’炭素原子とヌクレオチドの５’炭素原子との間のホスホジエステル結合として本明細書に記載されるヌクレオチドの５’リン酸基との間に形成される。
本明細書で使用される「誘導体」または「類似体」は、修飾された塩基部分および／または修飾された糖部分を有する合成ヌクレオチドまたはヌクレオシド誘導体を意味する。そのような誘導体および類似体は、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ， Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ， １９８０） および Ｕｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３－５８４， １９９０ で議論されている。ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスホルアニリデートおよびホスホルアミデート結合。本明細書で使用される「誘導体」、「類似体」および「修飾された」は交換可能に使用され、本明細書で定義される「ヌクレオチド」および「ヌクレオシド」という用語に包含される。
本明細書で使用される「リン酸塩」という用語は、当業者に理解される通常の意味で使用され、そのプロトン化された形を含む（例えば、
Figure 2022515944000005
 ）。本明細書で使用される「一リン酸」、「二リン酸」、および「三リン酸」という用語は、当業者に理解される通常の意味で使用され、プロトン化された形態を含む。
本明細書で使用される「保護基」および「保護基」という用語は、分子内の既存の基が望ましくない化学反応を起こすのを防ぐために分子に付加される任意の原子または原子団を指す。「保護基」と「保護基」は同じ意味で使用される場合がある。
本明細書で使用される接頭辞「ｐｈｏｔｏ」または「ｐｈｏｔｏ－」は、光または電磁放射に関することを意味する。この用語は、電波、マイクロ波、赤外線、可視、紫外線、Ｘ線、またはスペクトルのガンマ線部分として一般的に知られている１つまたは複数の範囲を含むがこれらに限定されない電磁スペクトルのすべてまたは一部を含むことができる。スペクトルの一部は、本明細書に記載の金属等、表面の金属領域によってブロックされるものであり得る。代替的または追加的に、スペクトルの一部は、ガラス、プラスチック、シリカ、または本明細書に記載の他の材料でできた領域等、表面の隙間領域を通過するものであり得る。特定の実施形態では、金属を通過できる放射線を使用することができる。代替的または追加的に、ガラス、プラスチック、シリカ、または本明細書に記載の他の材料によってマスクされた放射線を使用することができる。
本明細書で使用される場合、「フェージング」という用語は、３’ターミネーターおよびフルオロフォアの不完全な除去、および所与のシーケンシングサイクルでのポリメラーゼによるクラスター内のＤＮＡ鎖の一部の取り込みの完了の失敗によって引き起こされるＳＢＳの現象を指す。プレフェージングは、効果的な３’ターミネーターのないヌクレオチドの取り込みによって引き起こされる。取り込みイベントは、終了の失敗により１サイクル先に進む。フェージングとプレフェージングにより、特定のサイクルで測定された信号強度は、現在のサイクルからの信号と、前後のサイクルからのノイズで構成される。サイクル数が増えると、フェージングとプレフェージングの影響を受けるクラスターあたりの配列の割合が増え、正しい塩基の特定が妨げられる。プレフェージングは、合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）中に、保護されていない、またはブロックされていない３’－ＯＨヌクレオチドが微量存在することによって引き起こされる可能性がある。保護されていない３’－ＯＨヌクレオチドは、製造プロセス中、または場合によっては保管および試薬処理プロセス中に生成される可能性がある。したがって、プレフェージングの発生率を低下させるヌクレオチド類似体の発見は驚くべきことであり、既存のヌクレオチド類似体よりもＳＢＳ用途において大きな利点を提供する。たとえば、提供されるヌクレオチド類似体は、より速いＳＢＳサイクル時間、より低いフェージングおよびプレフェージング値、およびより長いシーケンス読み取り長をもたらす可能性がある。
（３’－ヒドロキシアセタールブロッキング基）
本開示のいくつかの実施形態は、３’－炭素原子に共有結合した構造
Figure 2022515944000006
 を形成する除去可能な３’－ＯＨ保護または遮断基を有するリボースまたはデオキシリボースを含むヌクレオチドまたはヌクレオシド分子であって、式中：
各Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルコキシ、シアノ、ハロゲン、任意で置換されたフェニル、または任意で置換されたアラルキルであり；
各Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、シアノ、またはハロゲンであり；
あるいは、Ｒ１ａおよびＲ２ａは、それらが結合している原子とともに、必要に応じて置換された５～８員のヘテロシクリル基を形成し；
Ｒ３は、Ｈ、任意で置換されたＣ２～Ｃ６アルケニル、任意で置換されたＣ３～Ｃ７シクロアルケニル、任意で置換されたＣ２～Ｃ６アルキニル、または任意で置換された（Ｃ１～Ｃ６アルキレン）Ｓｉ（Ｒ４）３であり；かつ
各Ｒ４は、独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、または任意に置換されたＣ６～Ｃ１０アリールであり；ただし、各Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、およびＲ２ｂがＨの場合、Ｒ３はＨではない、
ヌクレオチドまたはヌクレオシド分子に関する。
本開示のいくつかのさらなる実施形態は、式（Ｉ）の構造：
Figure 2022515944000007
 を有する化合物であって、式中、Ｒ’はＨ、一リン酸、二リン酸、三リン酸、チオリン酸、リン酸エステル類似体、反応性リン含有基に結合した－Ｏ－、または保護基によって保護された－Ｏ－であり；Ｒ’’はＨまたはＯＨであり；Ｂは核酸塩基であり；Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、およびＲ３の各々は、上記で定義されている、化合物に関する。いくつかのさらなる実施形態では、Ｂは、
Figure 2022515944000008
 である。いくつかのさらなる実施形態において、核酸塩基は、場合によりリンカーを介して、検出可能な標識（例えば、蛍光色素）に共有結合し、例えば、Ｂが、
Figure 2022515944000009
 である。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ’は、三リン酸である。いくつかのそのような実施形態では、Ｒ’’は、Ｈである。
本明細書に記載のアセタールブロッキング基のいくつかの実施形態では、Ｒ１ａおよびＲ１ｂの少なくとも１つはＨである。いくつかのそのような実施形態では、各Ｒ１ａおよびＲ１ｂはＨである。他のいくつかの実施形態では、Ｒ１ａおよびＲ１ｂの少なくとも１つはＣ１～Ｃ６アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピルまたはｔ－ブチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２ａおよびＲ２ｂのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、またはＣ１～Ｃ６アルキルである。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ２ａおよびＲ２ｂのうちの少なくとも１つは、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルである。いくつかのそのような実施形態では、各Ｒ２ａおよびＲ２ｂはＨである。いくつかのそのような実施形態では、各Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、Ｃ１～Ｃ６アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピルまたはｔ-ブチルである。一実施形態では、各Ｒ２ａおよびＲ２ｂはメチルである。いくつかのそのような実施形態において、各Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキルまたはハロゲンである。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ２ａはＨであり、Ｒ２ｂはハロゲンまたはＣ１～Ｃ６アルキルである。
本明細書に記載のアセタールブロッキング基のいくつかの実施形態において、Ｒ３は、必要に応じて置換されたＣ２～Ｃ６アルケニルである。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ３は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、およびそれらの組み合わせからなる群から独立して選択される１つ以上の置換基で任意で置換されたＣ２～Ｃ６アルケニル（例えば、ビニル、プロペニル）である。いくつかのさらなる実施形態では、Ｒ３は
Figure 2022515944000010
 である。いくつかの他の実施形態において、Ｒ３は、必要に応じて置換されたＣ２～Ｃ６アルキニルである。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ３は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、およびそれらの組み合わせからなる群から独立して選択される１つ以上の置換基で任意で置換されたＣ２～Ｃ６アルキニル（例えば、エチニル、プロピニル）である。一実施形態では、Ｒ３は、必要に応じて置換されたエチニル（
Figure 2022515944000011
 ）である。他のいくつかの実施形態では、Ｒ３は、任意で置換されている（Ｃ１～Ｃ６アルキレン）Ｓｉ（Ｒ４）３である。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ４の少なくとも１つはＣ１－４アルキルである。いくつかのさらなる実施形態において、Ｒ４のそれぞれは、Ｃ１～Ｃ４アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピルまたはｔ-ブチルである。一実施形態では、Ｒ３は、－（ＣＨ２）－ＳｉＭｅ３である。いくつかの代替の実施形態では、Ｒ３は、Ｃ１～Ｃ６アルキルである。
いくつかの代替の実施形態において、Ｒ１ａおよびＲ２ａは、それらが結合している原子と共に、５から７員のヘテロシクリルを形成する。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ１ａおよびＲ２ａは、それらが結合している原子と共に、６員のヘテロシクリルを形成する。いくつかのそのような実施形態において、６員のヘテロシクリル基は、構造
Figure 2022515944000012
 を有する。いくつかのさらなる実施形態では、各Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂおよびＲ３の少なくとも１つはＨである。他のいくつかの実施形態では、各Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂおよびＲ３の少なくとも１つはＣ１～Ｃ６アルキルである。一実施形態では、各Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂおよびＲ３はＨである。
いくつかのさらなる実施形態において、式（Ｉ）の化合物はまた、式（Ｉａ）によって表される：
Figure 2022515944000013
 式中、各Ｒ２ｃおよびＲ２ｄは、独立して、Ｈ、ハロゲン（例えば、フルオロ、クロロ）、Ｃ１～Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、またはイソプロピル）、またはＣ１～Ｃ６ハロアルキル（例えば、－ＣＨＦ２、－ＣＨ２Ｆ、または－ＣＦ３）である。いくつかのそのような実施形態では、Ｒ１ａおよびＲ１ｂの１つはＨである。いくつかのそのような実施形態では、各Ｒ１ａおよびＲ１ｂはＨである。他のいくつかの実施形態では、Ｒ１ａおよびＲ１ｂの少なくとも１つはＣ１～Ｃ６アルキル、例えばメチル、エチル、イソプロピルまたはｔ－ブチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２ａおよびＲ２ｂのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、またはＣ１～Ｃ６アルキルである。いくつかのそのような実施形態では、各Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、Ｈである。いくつかのそのような実施形態では、Ｒ２ｃおよびＲ２ｄのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲンまたはＣ１～Ｃ６アルキルである。いくつかのそのような実施形態において、各Ｒ２ｃおよびＲ２ｄは、Ｃ１～Ｃ６アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピルまたはｔ-ブチルである。一実施形態では、各Ｒ２ｃおよびＲ２ｄはメチルである。いくつかのそのような実施形態では、各Ｒ２ｃおよびＲ２ｄは独立してハロゲンである。いくつかのそのような実施形態では、Ｒ２ｃはＨであり、Ｒ２ｄはＨ、ハロゲン（フルオロ、クロロ）またはＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピルまたはｔ-ブチル）である。さらなる実施形態において、各Ｒ１ａおよびＲ１ｂはＨであり；Ｒ２ａはＨであり；Ｒ２ｂはＨ、ハロゲンまたはメチルであり；Ｒ２ｃはＨであり；Ｒ２ｄは、Ｈ、ハロゲン、メチル、エチル、イソプロピル、またはｔ－ブチルである。
本明細書に記載のブロッキング基の非限定的な実施形態が、以下からなる群から選択される構造を有するものを含んでいる：
Figure 2022515944000014
 、リボースまたはデオキシリボースの３’炭素に共有結合されている。
（３’－ヒドロキシチオカルバメートブロッキング基）
本開示のいくつかの追加の実施形態は、３’-炭素原子に共有結合した構造
Figure 2022515944000015
 を形成する除去可能な３’－ＯＨ遮断基を有するリボースまたはデオキシリボースを含むヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、式中：
Ｒ５およびＲ６のそれぞれは、独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２～Ｃ８アルコキシアルキル、任意に置換－（ＣＨ２）ｍ－フェニル、置換されていてもよい－（ＣＨ２）ｎ－（５または６員ヘテロアリール）、置換されていてもよい－（ＣＨ２）ｋ－Ｃ３－Ｃ７カルボシクリル、または置換されていてもよい－（ＣＨ２）ｐ－（３～７員ヘテロシクリル）であり；
あるいは、Ｒ５およびＲ６は、それらが結合している原子とともに、置換されていてもよい５～７員のヘテロシクリルを形成し；
－（ＣＨ２）ｍ－、－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｋ－、および－（ＣＨ２）ｐ－のそれぞれは置換されていてもよく；かつ
ｍ、ｎ、ｋ、およびｐのそれぞれは、独立して０、１、２、３、または４である、
ヌクレオシドまたはヌクレオチドに関する。
いくつかの追加の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物に関する：
Figure 2022515944000016
 式中、Ｒ’はＨ、一リン酸、二リン酸、三リン酸、チオリン酸、リン酸エステル類似体、反応性リン含有基に結合した－Ｏ－、または保護基によって保護された－Ｏ－であり；Ｒ’’はＨまたはＯＨであり；Ｂは核酸塩基であり；Ｒ５とＲ６のそれぞれは上で定義されている。いくつかのさらなる実施形態では、Ｂは、
Figure 2022515944000017
 である。いくつかのさらなる実施形態において、核酸塩基は、場合によりリンカーを介して、検出可能な標識（例えば、蛍光色素）に共有結合し、例えば、Ｂが、
Figure 2022515944000018
 である。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ’は、三リン酸である。いくつかのそのような実施形態では、Ｒ’’は、Ｈである。
本明細書に記載のチオカルバメートブロッキング基のいくつかの実施形態では、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つはＨである。いくつかのそのような実施形態では、各Ｒ５およびＲ６はＨである。いくつかのそのような実施形態では、Ｒ５はＨであり、Ｒ６はＣ１～Ｃ６アルキル、たとえば、メチル、エチル、イソプロピル、またはｔ－ブチルである。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ５はＨであり、Ｒ６はＣ２～Ｃ６アルケニル（例えば、ビニルまたはアリル）またはＣ２～Ｃ６アルキニル（例えば、エチニルまたはプロピニル）である。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ５はＨであり、Ｒ２は、任意で置換された－（ＣＨ２）ｍ－フェニル、任意で置換された－（ＣＨ２）ｎ－（５または６員ヘテロアリール）、任意で置換された－（ＣＨ２）ｋ－Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、または必要に応じて置換－（ＣＨ２）ｐ－（３～７員のヘテロシクリル）。いくつかのさらなる実施形態において、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル基は、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキルまたはＣ３～Ｃ７シクロアルケニルであり得る。３から７員のヘテロシクリル基は、環構造にゼロまたは１つの二重結合を含み得る。さらなる実施形態において、Ｒ５はＨであり、Ｒ６は、任意で置換された－（ＣＨ２）ｍ－フェニル、任意で置換された－（ＣＨ２）ｎ－６員ヘテロアリール、任意で置換された－（ＣＨ２）ｋ－Ｃ５またはＣ６カルボシクリル、または任意で置換された－（ＣＨ２）ｐ－（５または６員のヘテロシクリル）。いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、ｋ、またはｐは０である。他の実施形態では、ｍ、ｎ、ｋまたはｐは１または２である。他のいくつかの実施形態では、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは、Ｃ１～Ｃ６アルキルである。例えば、メチル、エチル、イソプロピルまたはｔ－ブチル。いくつかのさらなる実施形態において、Ｒ５およびＲ６の両方は、Ｃ１～Ｃ６アルキルである。一実施形態では、Ｒ５およびＲ６の両方がメチルである。
いくつかの代替の実施形態において、Ｒ５およびＲ６は、それらが結合している原子と共に、任意で置換された５から７員のヘテロシクリルを形成する。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ５およびＲ６は、それらが結合している原子と共に、必要に応じて置換されたピペリジニルを形成する。
本明細書に記載の３’－Ｏ－チオカルバメートブロッキング基の非限定的な実施形態は、以下からなる群から選択される構造を有するものを含む：
Figure 2022515944000019
 リボースまたはデオキシリボースの３’炭素に共有結合されている。
本開示の追加の実施形態は、本明細書に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに関する。
本明細書に記載のブロッキング基の実施形態のいずれかにおいて、基が「任意で置換された」と記載される場合、それは、非置換または置換のいずれかであり得る。
本明細書に記載の３’ヒドロキシブロッキング基を有するヌクレオチドまたはヌクレオシドの任意の実施形態において、ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、場合によりリンカーを介して、検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）に共有結合し得る。リンカーは、切断可能または切断不可能であり得る。いくつかのそのような実施形態において、検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）は、切断可能なリンカーを介してヌクレオシドまたはヌクレオチドの核酸塩基に共有結合している。いくつかの他の実施形態では、検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）は、切断可能なリンカーを介してヌクレオシドまたはヌクレオチドの３’酸素に共有結合している。いくつかのさらなる実施形態において、そのような切断可能なリンカーは、アジド部分またはジスルフィド部分、アセタール部分、またはチオカルバメート部分を含み得る。いくつかの実施形態において、３’ヒドロキシブロッキング基および切断可能なリンカー（および付着した標識）は、同じまたは実質的に同じ化学反応条件下で除去され得、例えば、ブロッキング基および検出可能な標識は、単一の化学反応において除去され得る。他の実施形態では、ブロッキング基および検出可能な標識は、２つの別個のステップで除去される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるヌクレオチドまたはヌクレオシドは、２’デオキシリボースを含む。いくつかのさらなる局面において、２’デオキシリボースは、糖環の５’位置に１つ、２つ、または３つのリン酸基を含む。いくつかのさらなる態様において、本明細書に記載されるヌクレオチドは、ヌクレオチド三リン酸である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の３’ブロックヌクレオチドまたはヌクレオシドは、先行技術に開示された標準の３’－ＯＨブロッキング基で保護された同じヌクレオチドまたはヌクレオシドと比較して、保存中の溶液またはシーケンシングアプリケーション中の試薬取り扱いにおいて優れた安定性を提供する。例えば、３’－Ｏ－アジドメチル保護基。例えば、本明細書に開示されるアセタールまたはチオカルバメートブロッキング基は、同時に同じ期間のコンディションでアジドメチルで保護された３’－ＯＨと比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１５００％、２０００％、２５００％、または３０００％向上した安定性を付与し得、それにより、プレフェーズ値が減少し、シーケンスの読み取り長が長くなる。いくつかの実施形態では、安定性は、周囲温度または周囲温度より低い温度（例えば、４～１０℃）で測定される。他の実施形態では、安定性は、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃または６５℃等の高温で測定される。いくつかのそのような実施形態では、安定性は、塩基性ｐＨ環境、例えば、ｐＨ９．０、９．２、９．４、９．６、９．８または１０．０の溶液中で測定される。いくつかのそのような実施形態において、安定性は、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、または逆転写酵素等の酵素の存在の有無にかかわらず測定される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の３’ブロックヌクレオチドまたはヌクレオシドは、先行技術に開示された標準３’－ＯＨブロッキング基で保護された同じヌクレオチドまたはヌクレオシドと比較して、シーケンシングアプリケーションの化学的切断ステップ中に溶液中で優れた脱ブロッキング速度を提供する。例えば、３’－Ｏ－アジドメチル保護基。例えば、本明細書に開示されるアセタールまたはチオカルバメートブロッキング基は、標準の脱ブロック試薬（トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン等）を使用したアジドメチル保護３’－ＯＨと比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１５００％、または２０００％向上した脱ブロック化率を付与し得、それによってシーケンスサイクルの全体的な時間を短縮する。いくつかの実施形態では、脱ブロック化率は、周囲温度または周囲温度より低い温度（例えば、４～１０℃）で測定される。他の実施形態では、脱ブロック化率は、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、または６５℃等の高温で測定される。いくつかのそのような実施形態では、脱ブロック化速度は、塩基性ｐＨ環境、例えば、ｐＨ９．０、９．２、９．４、９．６、９．８または１０．０の溶液中で測定される。いくつかのそのような実施形態では、脱ブロック試薬と基質（すなわち、３’ブロックヌクレオシドまたはヌクレオチド）のモル比は、約１０：１、約５：１、約２：１、または約１：１である。
いくつかの実施形態では、パラジウム脱ブロック試薬（例えば、Ｐｄ（０）を使用して、３’アセタールブロッキング基（例えば、ＡＯＭブロッキング基）を除去する。Ｐｄは、ＡＯＭ基の２つの酸素原子ともキレート錯体を形成し得る。アリル基の二重結合として、官能基のすぐ近くにある脱ブロック試薬を除去できるようにし、脱ブロック化速度を加速させることができる。
（３’－ＯＨブロッキング基の脱保護）
本明細書に記載の３’－アセタールブロッキング基は、様々な化学的条件下で除去または切断することができる。ビニルまたはアルケニル部分を含むアセタールブロッキング基
Figure 2022515944000020
 の場合、非限定的な切断条件には、ホスフィン配位子、例えばトリス（ヒドロキシメチル）の存在下でのＰｄ（ＯＡｃ）２またはアリルＰｄ（ＩＩ）クロリドダイマー等のＰｄ（ＩＩ）錯体が含まれる。ホスフィン（ＴＨＭＰ）、またはトリス（ヒドロキシルプロピル）ホスフィン（ＴＨＰまたはＴＨＰＰ）。アルキニル基（例えば、エチニル）を含むそれらのブロッキング基については、それらはまた、ホスフィンリガンド（例えば、ＴＨＰまたはＴＨＭＰ）の存在下で、Ｐｄ（ＩＩ）錯体（例えば、Ｐｄ（ＯＡｃ）２またはアリルＰｄ（ＩＩ）クロリドダイマー）によって除去され得る。
（パラジウム切断試薬）
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアセタール遮断基は、パラジウム触媒によって切断され得る。いくつかのそのような実施形態において、Ｐｄ触媒は水溶性である。いくつかのそのような実施形態では、Ｐｄ（０）錯体（例えば、トリス（３，３’、３’’－ホスフィンジネトリス（ベンゼンスルホナト）パラジウム（０）非ナトリウム塩非水和物）である。場合によっては、Ｐｄ（０）錯体は、アルケン、アルコール、アミン、ホスフィン、金属水素化物等の試薬によるＰｄ（ＩＩ）錯体の還元からその場で生成される。適切なパラジウム源には、Ｎａ２ＰｄＣｌ４、Ｐｄ（ＣＨ３ＣＮ）２Ｃｌ２、（ＰｄＣｌ（Ｃ３Ｈ５））２、［Ｐｄ（Ｃ３Ｈ５）（ＴＨＰ）］Ｃｌ、［Ｐｄ（Ｃ３Ｈ５）（ＴＨＰ）２］Ｃｌ、Ｐｄ（ＯＡｃ）２、Ｐｄ（Ｐｈ３）４、Ｐｄ（ｄｂａ）２、Ｐｄ（Ａｃａｃ）２、ＰｄＣｌ２（ＣＯＤ）、そのような一実施形態では、Ｐｄ（０）錯体は、Ｎａ２ＰｄＣｌ４からその場で生成される。別の実施形態では、パラジウム源は、アリルパラジウム（ＩＩ）クロリドダイマー［（ＰｄＣｌ（Ｃ３Ｈ５））２］である。いくつかの実施形態では、Ｐｄ（０）錯体は、Ｐｄ（ＩＩ）錯体をホスフィンと混合することによって水溶液中で生成される。適切なホスフィンには、トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）、トリス（ヒドロキシメチル）、ホスフィン（ＴＨＭＰ）、１，３，５－トリアザ－７－ホスファアダマンタン（ＰＴＡ）、ビス（ｐ－スルホナトフェニル）フェニルホスフィン二水和物カリウム塩、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、およびトリフェニルホスフィン－３，３’、３’－トリスルホン酸三ナトリウム塩等の水溶性ホスフィンが含まれる。
いくつかの実施形態では、Ｐｄ（０）は、Ｐｄ（ＩＩ）錯体［（ＰｄＣｌ（Ｃ３Ｈ５））２］をその場でＴＨＰと混合することによって調製される。Ｐｄ（ＩＩ）錯体とＴＨＰのモル比は、約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０である可能性がある。いくつかのさらなる実施形態において、アスコルビン酸またはその塩（例えば、アスコルビン酸ナトリウム）等の１つ以上の還元剤を添加することができる。いくつかの実施形態において、開裂混合物は、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、炭酸塩、リン酸塩、またはホウ酸塩、またはそれらの組み合わせ等の追加の緩衝試薬を含み得る。いくつかのさらなる実施形態において、緩衝試薬は、エタノールアミン（ＥＡ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、グリシン、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、２－ジメチルアミノメタノール（ＤＭＥＡ）、２－ジエチルアミノメタノール（ＤＥＥＡ）、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、またはＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラエチルエチレンジアミン（ＴＥＥＤＡ）、またはそれらの組合せを含む。一実施形態では、緩衝試薬はＤＥＥＡである。別の実施形態では、緩衝試薬は、炭酸塩、リン酸塩、またはホウ酸塩、あるいはそれらの組合せ等の１つまたは複数の無機塩を含む。一実施形態では、無機塩は、ナトリウム塩である。
あるいは、ブロッキング基を含むアルキニル部分は、（ＮＨ４）２ＭｏＳ４の存在下でも切断され得る。アルキニル部分の他の非限定的な切断条件には、ＴＨＰＴＡ配位子（トリス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン）とのＣｕ（ＩＩ）錯体、およびアスコルビン酸塩が含まれる。６員複素環（例えば、テトラヒドロピラン）を含むブロッキング基の非限定的な切断条件には、シクロデキストリンまたはＬｎ（ＯＴｆ）３（ランタニドトリフラート）が含まれる。アルキルシラン基を含むブロッキング基（例えば、－ＣＨ２ＳｉＭｅ３）の非限定的な切断条件には、ＬｉＢＦ４（四フッ化ホウ酸リチウム）が含まれる。－Ｏ（ＣＨ２）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル等の他のアセタールブロッキング基は、ＬｉＢＦ４またはＢｉ（ＯＴｆ）３（ビスマストリフラート）によって除去できる。記載された様々なブロッキング基を切断するための非限定的な例示的な条件は、以下のスキーム１に示されている。
スキーム１．３’－脱ブロック化条件の例示
Figure 2022515944000021
本明細書に記載の３’－Ｏ－チオカルバメートブロッキング基は、様々な化学的条件下で除去または切断することができる。本明細書に記載のチオカルバメートブロッキング基を切断するための非限定的な例示的な条件には、ＮａＩＯ４およびＯｘｏｎｅ（登録商標）（ペルオキシ一硫酸カリウム）が含まれる。
さらに、－ＣＨ２Ｎ３のアジド基はホスフィンによってアミノ基に変換できる。あるいは、－ＣＨ２Ｎ３のアジド基は、そのような分子をチオール、特にジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の水溶性チオールと接触させることによってアミノ基に変換することができる。一実施形態では、ホスフィンはＴＨＰである。
（線形化との互換性）
核酸シーケンシング反応のスループットを最大化するために、複数のテンプレート分子を並行してシーケンシングできることが有利である。複数のテンプレートの並列処理は、核酸アレイ技術を使用して実現できる。これらのアレイは、通常、固体支持材料上に固定化されたポリヌクレオチドの高密度マトリックスからなる。
ＷＯ９８／４４１５１およびＷＯ００／１８９５７は両方とも、複数の同一の固定化ポリヌクレオチド鎖および複数の同一の固定化ポリヌクレオチド鎖から形成されるクラスターまたは「コロニー」からなるアレイを形成するために、増幅産物を固体支持体に固定化することを可能にする核酸増幅の方法を記載している。複数の同一の固定化された相補鎖。このタイプのアレイは、本明細書では「クラスター化アレイ」と呼ばれる。これらの方法に従って調製されたクラスター化アレイ上のＤＮＡコロニーに存在する核酸分子は、例えば、ＷＯ９８／４４１５２に記載されているように、シーケンシング反応のためのテンプレートを提供することができる。ＷＯ９８／４４１５１およびＷＯ００／１８９５７に記載されるような固相増幅反応の生成物は、固定化ポリヌクレオチド鎖および固定化相補鎖の対のアニーリングによって形成されるいわゆる「架橋」構造であり、両方の鎖が５’端のしっかりしたサポート。核酸シーケンシングのためのより適切なテンプレートを提供するために、少なくとも部分的に一本鎖であるテンプレートを生成するために、「架橋」構造における固定化鎖の１つの実質的にすべてまたは少なくとも一部を除去することが好ましい。したがって、一本鎖であるテンプレートの部分は、シーケンシングプライマーへのハイブリダイゼーションに利用可能である。「架橋」二本鎖核酸構造内の１つの固定化鎖の全部または一部を除去するプロセスは、「線形化」と呼ばれる。線形化には、酵素的切断、光化学的切断、または化学的切断を含むがこれらに限定されない種々の方法がある。線形化方法の非限定的な例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／０１０２５１、米国特許公開番号２００９／００８８３２７、米国特許公開番号２００９／０１１８１２８、および米国特許出願第６２／６７１，８１６号に開示され、これらは参照により全体に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、３’－ＯＨブロッキング基の脱保護または除去のための条件はまた、線形化プロセスと適合性がある。いくつかのさらなる実施形態において、脱保護条件は、Ｐｄ錯体およびホスフィン、例えば、Ｐｄ（ＯＡｃ）２およびＴＨＰの使用を含む化学的線形化プロセスと適合性がある。いくつかの実施形態では、Ｐｄ複合体は、ホスフィンの存在下でインサイチュでＰｄ（０）を生成するＰｄ（ＩＩ）複合体である。
特に明記しない限り、ヌクレオチドへの言及は、ヌクレオシドにも適用可能であることを意図している。
（標識ヌクレオチド）
本開示の一態様によれば、記載された３’－ＯＨブロック化ヌクレオチドはまた、検出可能な標識も含み、そのようなヌクレオチドは標識ヌクレオチドと呼ばれる。標識（例えば、蛍光色素）は、疎水性引力、イオン引力、および共有結合を含む種々の手段によって、オプションのリンカーを介して結合することができる。いくつかの局面において、染料は、共有結合によって基質にコンジュゲートされる。より具体的には、共有結合はリンカー基による。場合によっては、そのような標識ヌクレオチドは「修飾ヌクレオチド」とも呼ばれる。
標識ヌクレオチドは、非限定的な例として、ＰＣＲ増幅、等温増幅、固相増幅、ポリヌクレオチドシーケンシング（例えば、固相シーケンシング）、ニックトランスレーション反応等において、酵素合成によって形成されたポリヌクレオチドを標識するために有用である。
いくつかの実施形態において、色素は、ヌクレオチド塩基を介してオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドに共有結合され得る。例えば、標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、リンカー部分を介して、ピリミジン塩基のＣ５位置または７－デアザプリン塩基のＣ７位置に付着した標識を有することができる。
特に明記しない限り、ヌクレオチドへの言及はヌクレオシドにも適用できるものとする。本出願はまた、ＤＮＡを参照してさらに説明されるが、特に明記しない限り、説明はＲＮＡ、ＰＮＡ、および他の核酸にも適用可能である。
（リンカー）
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチドまたはヌクレオシド分子のプリンまたはピリミジン塩基は、上記の検出可能な標識に結合することができる。そのようないくつかの実施形態では、使用されるリンカーは切断可能である。切断可能なリンカーを使用すると、必要に応じて検出後に標識を確実に除去でき、その後に組み込まれる標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドとの干渉信号を回避できる。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、アジド部分、－Ｏ－Ｃ２～Ｃ６アルケニル部分（例えば、－Ｏ－アリル）、ジスルフィド部分、アセタール部分（本明細書に記載の３’アセタールブロッキング基と同じまたは類似）を含む。）、またはチオカルバメート部分（本明細書に記載の３’アセタールブロッキング基と同じまたは類似）。
いくつかの他の実施形態では、使用されるリンカーは切断不可能である。本発明の標識ヌクレオチドが組み込まれる各場合において、その後にヌクレオチドを組み込む必要がなく、したがって、ヌクレオチドから標識を除去する必要がない。
切断可能なリンカーは当技術分野で知られており、従来の化学を適用して、リンカーをヌクレオチド塩基および標識に結合させることができる。リンカーは、酸、塩基、求核剤、求電子剤、ラジカル、金属、還元剤または酸化剤、光、温度、酵素等への暴露を含む、任意の適切な方法によって切断することができる。３’－Ｏ－ブロッキング基結合を切断するために使用される。適切なリンカーは、Ｇｒｅｅｎｅ ＆ Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ に開示されている標準的な化学保護基から適合させることができる。固相合成で使用されるさらに適切な切断可能なリンカーは、Ｇｕｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １００：２０９２－２１５７， ２０００）に開示される。
検出可能な標識が塩基に付着している場合、ワトソン・クリック塩基対形成が依然として実行できる限り、リンカーはヌクレオチド塩基上の任意の位置に付着することができる。プリン塩基の文脈では、リンカーがプリンまたは好ましいデアザプリン類似体の７位を介して、８修飾プリンを介して、Ｎ－６修飾アデノシンまたはＮ－２修飾グアニンを介して結合している場合が好ましい。ピリミジンの場合、結合はシトシン、チミジンまたはウラシルの５位およびシトシンのＮ－４位を介することが好ましい。
いくつかの実施形態では、リンカーはスペーサーユニットを含むことができる。ヌクレオチドと酵素、例えばポリメラーゼとの間の相互作用を妨害しないように、標識がヌクレオチドから十分な距離を保っている限り、リンカーの長さは重要ではない。
いくつかの実施形態において、リンカーは、３’－ＯＨ保護基と同様の官能基からなり得る。これにより、ラベルと保護基の両方を１回の処理で除去するだけで済むため、脱保護と脱保護のプロセスがより効率的になる。
用語「切断可能なリンカー」の使用は、リンカー全体が除去される必要があることを意味するものではない。切断部位は、リンカーの一部が切断後に色素および／または基質部分に結合したままであることを保証するリンカー上の位置に配置することができる。切断可能なリンカーは、非限定的な例として、求電子的に切断可能なリンカー、求核的に切断可能なリンカー、光切断可能なリンカー、還元的条件下（例えば、ジスルフィドまたはアジド含有リンカー）、酸化的条件下で切断可能であり、安全キャッチリンカーの使用を介して切断可能であり、排除メカニズムによって切断可能であるものであってもよい。切断可能なリンカーを使用して色素化合物を基質部分に結合させることにより、必要に応じて、検出後に標識を除去することができるようになり、下流ステップでの干渉シグナルを回避することができる。
有用なリンカー基は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２００４／０１８４９３号（参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得、その例としては、遷移金属および少なくとも部分的に水溶性の配位子から形成された水溶性ホスフィンまたは水溶性遷移金属触媒を使用して切断され得るリンカーが挙げられる。水溶液中で、後者は少なくとも部分的に水溶性の遷移金属錯体、例えば、Ｐｄ（ＩＩ）錯体およびＴＨＰを形成する。そのような切断可能なリンカーを使用して、ヌクレオチドの塩基を、本明細書に記載の色素といった標識に接続することができる。
特別なリンカーとしては、以下の式の部分を含むものといった、ＰＣＴ公開番号国際公開２００４／０１８４９３号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものが含まれる：
Figure 2022515944000022
 （式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮＱを含む基から選択され、Ｑは、Ｃ１－１０置換または非置換アルキル基であり、Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮ（アリル）を含む群から選択され、Ｔは、水素またはＣ１－Ｃ１０置換または非置換アルキル基であり、かつ＊は、部分がヌクレオチドまたはヌクレオシドの残りの部分に接続されている場所を示す）。いくつかの態様では、リンカーは、ヌクレオチドの塩基を、例えば、本明細書に記載の色素化合物といった、標識に接続する。
リンカーの追加の例としては、以下の式の部分を含むものといった、米国公開番号２０１６／００４０２２５（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものが含まれる：
Figure 2022515944000023
 本明細書に示されるリンカー部分は、ヌクレオチド／ヌクレオシドと標識との間のリンカー構造全体または部分を含んでもよい。
リンカー（「Ｌ」）の追加の例には、式の一部が含まれる：
Figure 2022515944000024
 ここで、Ｂは核酸塩基であり；Ｚは－Ｎ３（アジド）、－Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、－Ｏ－Ｃ２～Ｃ６アルケニル、または－Ｏ－Ｃ２～Ｃ６アルキニル；Ｆ１は、追加のリンカー構造を含み得る蛍光標識を含む。当業者は、標識の官能基（例えば、カルボキシル）をリンカーの官能基（例えば、アミノ）と反応させることによって、標識がリンカーに共有結合していることを理解している。
特別な実施形態では、蛍光色素（フルオロフォア）とグアニン塩基との間のリンカーの長さは、例えば、ポリエチレングリコールスペーサー基を導入することによって変更することができ、それにより、グアニン塩基と当該分野で公知の他のリンケージを介して結合した同じフルオロフォアと比較して蛍光強度を増加させる。例示的なリンカーおよびそれらの特性は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２００７０２０４５７号（参照により本明細書に組み込まれる）に示される。リンカーの設計、特にそれらの長さの増加により、ＤＮＡ等のポリヌクレオチドに組み込まれたときにグアノシンヌクレオチドのグアニン塩基に結合したフルオロフォアの輝度を向上させることができる。したがって、色素がグアニン含有ヌクレオチドに結合した蛍光色素標識の検出を必要とする分析方法で使用する場合、リンカーが、国際公開第２００７／０２０４５７号に記載されているように式－（（ＣＨ２）２Ｏ）ｎ－のスペーサー基であって、式中ｎが２と５０との間の整数であるものを含むと、有利である。
ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖または核酸塩基上の部位で標識され得る。当該分野で公知のように、「ヌクレオチド」は、窒素塩基、糖、および１以上のリン酸基からなる。ＲＮＡでは、糖は、リボースであり、ＤＮＡでは、デオキシリボース、すなわちリボースに存在するヒドロキシ基を欠く糖である。窒素塩基は、プリンまたはピリミジンの誘導体である。プリンは、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）であり、ピリミジンは、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）、またはＲＮＡの文脈では、ウラシル（Ｕ）である。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１またはプリンのＮ－９に結合する。ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルでもあり、糖のＣ－３またはＣ－５に結合したヒドロキシ基でエステル化が起こる。ヌクレオチドは通常、一、二、または三リン酸である。
「ヌクレオシド」は構造的にヌクレオチドに類似しているが、リン酸部分が欠落している。ヌクレオシド類似体の例は、標識が塩基に結合しており、糖分子にリン酸基が結合していないものである。
塩基は通常プリンまたはピリミジンと呼ばれるが、当業者は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドがＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を受ける能力を変化させない誘導体および類似体が利用可能であることを理解するであろう。「誘導体」または「類似体」は、コア構造が親化合物と同じであるか、またはそれに非常に類似しているが、例えば、異なるまたは追加の側鎖といった、誘導体ヌクレオチドまたはヌクレオシドを別の分子に結合させることを可能にする、化学的または物理的修飾を有する化合物または分子を意味する。例えば、塩基は、デアザプリンであってもよい。特別な実施形態では、誘導体は、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋペアリングを受けることが可能であるべきである。「誘導体」および「類似体」はまた、例えば、修飾された塩基部分および／または修飾された糖部分を有する合成ヌクレオチドまたはヌクレオシド誘導体を含む。そのような誘導体および類似体は、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ，１９８０）およびＵｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３－５８４，１９９０で考察されている。ヌクレオチド類似体はまた、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスホラニリデート、ホスホルアミデート結合等を含む修飾ホスホジエステル結合を含み得る。
色素は、例えばリンカーを介して、ヌクレオチド塩基上の任意の位置に結合させることができる。特別な実施形態では、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成は、得られた類似体に対して依然として実施することができる。特定の核酸塩基標識部位としては、ピリミジン塩基のＣ５位置または７－デアザプリン塩基のＣ７位置が挙げられる。上記のように、リンカー基を使用して、色素をヌクレオシドまたはヌクレオチドに共有結合させ得る。
特別な実施形態では、標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、酵素的に組み込まれ、酵素的に伸長可能であり得る。したがって、リンカー部分は、化合物が核酸複製酵素によるヌクレオチドの全体的な結合および認識を著しく妨害しないように、ヌクレオチドを化合物に接続するのに十分な長さであり得る。したがって、リンカーはスペーサーユニットを含むこともできる。スペーサーは、例えば、切断部位または標識からヌクレオチド塩基を離す。
本明細書に記載の色素で標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、以下の式を有してもよい：
Figure 2022515944000025
 式中、Ｄｙｅは、色素化合物であり；Ｂは、例えば、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、グアニンといった、核酸塩基であり；Ｌは、存在しても存在しなくてもよい任意のリンカー基であり；Ｒ’は、Ｈ、一リン酸、二リン酸、三リン酸、チオリン酸、リン酸エステル類似体、反応性リン含有基に結合した－Ｏ－、またはブロッキング基によって保護された－Ｏ－であり得；Ｒ’’’は、Ｈ、ＯＨ、ホスホルアミダイト、または本明細書に記載の３’－ＯＨブロッキング基であり、Ｒ’’は、ＨまたはＯＨである。Ｒ’’’がホスホルアミダイトである場合、Ｒ’は、酸で切断可能なヒドロキシ保護基であり、自動合成条件下でのその後のモノマーカップリングを可能にする。
特別な実施形態では、リンカー（色素とヌクレオチドの間）およびブロッキング基は両方とも存在し、かつ別個の部分である。特別な実施形態では、リンカーおよびブロッキング基は両方とも、実質的に同様の条件下で切断可能である。したがって、色素化合物とブロッキング基の両方を除去するために必要な処理は１回だけであるため、脱保護および脱ブロック化プロセスはより効率的であり得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、リンカーおよびブロッキング基は、同様の条件下で切断可能である必要はなく、代わりに、別個の条件下で個別に切断可能である。
本開示はまた、色素化合物を組み込んだポリヌクレオチドを包含する。そのようなポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合されたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから各々構成されるＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、本明細書に記載の標識化ヌクレオチド以外の非天然に存在する（または修飾）ヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせを、本明細書に記載の少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（例えば、色素化合物で標識）と組み合わせて含んでもよい。本開示によるポリヌクレオチドはまた、非天然骨格結合および／または非ヌクレオチド化学修飾を含んでもよい。リボヌクレオチドおよび少なくとも１つの標識化ヌクレオチドを含むデオキシリボヌクレオチドの混合物からなるキメラ構造もまた企図される。
本明細書に記載される非限定的な例示的な標識化ヌクレオチドとしては、以下が挙げられる：
Figure 2022515944000026
 式中、Ｌは、リンカーを表し、Ｒは、上記の糖残基、または５’位が１、２、または３つのリン酸で置換された糖残基を表す。
いくつかの実施形態では、非限定的な例示的な蛍光色素コンジュゲートは、下記に示される：
Figure 2022515944000027
 式中、ＰＧは本明細書に記載の３’ヒドロキシブロッキング基を表す。本明細書に記載の標識ヌクレオチドの任意の実施形態において、ヌクレオチドはヌクレオチド三リン酸である。
（キット）
本開示はまた、１つ以上の３’ブロックヌクレオシドおよび／または本明細書に記載のヌクレオチド、例えば、式（Ｉ）、（Ｉａ）、または（ＩＩ）の３'ブロックヌクレオチドを含むキットを提供する。そのようなキットは、概して、少なくとも１つのさらなる成分と共に、色素で標識された少なくとも１つの３’ブロック化ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含むであろう。さらなる構成要素は、本明細書に記載の方法または以下の実施例のセクションに記載の方法で特定される１以上の構成要素であってもよい。本開示のキットに組み合わせることができる構成要素のいくつかの非限定的な例を以下に記載する。
特定の実施形態では、キットは、少なくとも１つの標識３’ブロック化ヌクレオチドまたはヌクレオシドを、標識または非標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドとともに含むことができる。例えば、染料で標識されたヌクレオチドは、非標識または天然ヌクレオチド、および／または蛍光標識ヌクレオチドまたはそれらの任意の組み合わせと組み合わせて供給され得る。ヌクレオチドの組み合わせは、別個の個別の成分（例えば、容器またはチューブごとに１つのヌクレオチドタイプ）またはヌクレオチド混合物（例えば、同じ容器またはチューブ内で混合された２つ以上のヌクレオチド）として提供される。
キットが、色素化合物で標識された複数、特に２つ、または３つ、またはより具体的には４つの３’ブロック化ヌクレオチドを含む場合、異なるヌクレオチドは異なる色素化合物で標識されてもよいし、色素化合物なしで１つが暗色であってもよい。異なるヌクレオチドが異なる色素化合物で標識されている場合、その色素化合物がスペクトル的に区別可能な蛍光色素であることは、キットの特徴である。本明細書で使用される場合、「スペクトル的に識別可能な蛍光色素」という用語は、２つ以上のそのような色素が存在する場合に、蛍光検出装置（例えば、市販のキャピラリーベースのＤＮＡシーケンシングプラットフォーム）によって識別できる波長で蛍光エネルギーを放出する蛍光色素を指す。１つのサンプルに存在する。蛍光色素化合物で標識された２つのヌクレオチドがキットの形で提供される場合、スペクトル的に区別可能な蛍光色素が、例えば同じレーザー等によって同じ波長で励起できることが、いくつかの実施形態の特徴である。蛍光色素化合物で標識された４つの３’ブロックヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＧ）がキットの形で提供される場合、スペクトル的に識別可能な蛍光色素の２つが両方とも１つの波長で励起され、他の２つのスペクトル的に識別可能な色素は、両方とも別の波長で励起できる。特定の励起波長は４８８ｎｍと５３２ｎｍである。
一実施形態では、キットは、第１の色素で標識された第１の３’ブロックヌクレオチドおよび第２の色素で標識された第２のヌクレオチドを含み、色素は、少なくとも１０ｎｍ、特に２０ｎｍから５０ｎｍの最大吸光度の差を有する。より具体的には、２つの色素化合物は、１５～４０ｎｍのストークスシフトを有し、ここで、「ストークスシフト」は、ピーク吸収波長とピーク発光波長との間の距離である。
代替の実施形態では、本開示のキットは、同じ塩基が２つ以上の異なる色素で標識されている３’ブロックヌクレオチドを含み得る。第１のヌクレオチド（例えば、３’ブロックされたＴヌクレオチド三リン酸または３’ブロックされたＧヌクレオチド三リン酸）は、第１の色素で標識され得る。第２のヌクレオチド（例えば、３’ブロックＣヌクレオチド三リン酸）は、第１の色素とはスペクトル的に異なる第２の色素、例えば、６００ｎｍ未満で吸収する「緑色」色素、および以下で吸収する「青色」色素で標識され得る。５００ｎｍ、たとえば４００ｎｍ～５００、特に４５０ｎｍ～４６０ｎｍ）。第３のヌクレオチド（例えば、３’ブロックＡヌクレオチド三リン酸）は、第１および第２の色素の混合物、または第１、第２および第３の色素と第４のヌクレオチド（例えば、３’ブロックＧ）の混合物として標識され得る。ヌクレオチド三リン酸または３’ブロックＴヌクレオチド三リン酸）は「暗い」可能性があり、ラベルが含まれていません。一例では、ヌクレオチド１～４は、「青」、「緑」、「青／緑」、および暗色とラベル付けされ得る。機器をさらに簡素化するために、４つのヌクレオチドを単一のレーザーで励起された２つの色素で標識することができる。したがって、ヌクレオチド１～４の標識は、「青１」、「青２」、「青１／青２」、および闇。
特定の実施形態では、キットは、４つの標識された３’ブロックヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）を含み得、ここで、各タイプのヌクレオチドは、同じ３’ブロッキング基および蛍光標識を含み、各蛍光標識は、別個のものを有する。最大蛍光および各蛍光標識は、他の３つの標識と区別できる。キットは、２つ以上の蛍光標識が同様の最大吸光度を有するが異なるストークスシフトを有するようなものであり得る。他のいくつかの実施形態では、１つのタイプのヌクレオチドは標識されていない。
本明細書では、異なる色素化合物で標識された異なるヌクレオチドを有する構成に関してキットが例示されているが、キットは、同じ色素化合物を有する２、３、４またはそれ以上の異なるヌクレオチドを含み得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態において、キットはまた、酵素および酵素の作用に適切な緩衝液を含む。いくつかのそのような実施形態において、酵素は、ポリメラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、または逆転写酵素である。特定の実施形態では、酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ８１２（Ｐｏｌ ８１２）またはＤＮＡポリメラーゼ１９０１（Ｐｏｌ １９０１）等のＤＮＡポリメラーゼである。Ｐｏｌ ８１２およびＰｏｌ １９０１ポリメラーゼのアミノ酸配列は、例えば、２０１９年１０月３１日に出願された米国特許出願第１６／６７０，８７６号および２０１９年１２月４日に出願された１６／７０３，５６９に記載されている。参照により本明細書に組み込まれる。
そのようなキットに含まれる他の成分には、緩衝液等が含まれる。本開示のヌクレオチド、および異なるヌクレオチドの混合物を含む他の任意のヌクレオチド成分は、使用前に希釈される濃縮形態でキットに提供され得る。そのような実施形態では、適切な希釈緩衝液も含まれ得る。ここでも、本明細書に記載の方法で特定される構成要素の１以上を、本開示のキットに含めることができる。
（シーケンシングの方法）
本開示による標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、ヌクレオチドまたはヌクレオシドに付着した蛍光標識の検出を含む方法等の任意の分析方法で使用することができる。この文脈において、「ポリヌクレオチドに組み込まれる」という用語は、５’リン酸がリン酸ジエステル結合で第２の（修飾または非修飾）ヌクレオチドの３’ヒドロキシ－ＯＨ基に結合していることを意味し、それ自体が長いポリヌクレオチド鎖の一部を形成している可能性がある。本明細書に記載のヌクレオチドの３’末端は、さらなる（修飾または非修飾）ヌクレオチドの５’リン酸にホスホジエステル結合で結合していても結合していなくてもよい。したがって、１つの非限定的な実施形態において、本開示は、（ａ）本開示の少なくとも１つのヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込むこと、および（ｂ）組み込まれたヌクレオチドを検出することを含む、ポリヌクレオチドに組み込まれるヌクレオチドを検出する方法を提供する。前記ヌクレオチドに結合した色素化合物からの蛍光シグナルを検出することにより、ポリヌクレオチドに挿入する。
この方法は、本開示による１以上のヌクレオチドがポリヌクレオチドに組み込まれる合成ステップ（ａ）、および検出によってポリヌクレオチドに組み込まれた１以上のヌクレオチドが検出される検出ステップ（ｂ）を含むことができる。またはそれらの蛍光を定量的に測定する。
本出願のいくつかの実施形態は、以下を含むシーケンシング方法を対象とする。（ａ）本明細書に記載の少なくとも１つの標識ヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込むこと；（ｂ）前記ヌクレオチドに付着した新しい蛍光色素からの蛍光シグナルを検出することにより、ポリヌクレオチドに組み込まれた標識ヌクレオチドを検出する。
本開示のいくつかの実施形態は、以下を含む、標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法に関する：
（ａ）３’－ＯＨブロッキング基および本明細書に記載の検出可能な標識を含むヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチド鎖の少なくとも一部に相補的なコピーポリヌクレオチド鎖に組み込むこと；
（ｂ）コピーポリヌクレオチド鎖に取り込まれたヌクレオチドの同一性を検出すること；および
（ｃ）コピーポリヌクレオチド鎖に取り込まれたヌクレオチドから標識および３’－ＯＨブロッキング基を化学的に除去すること。
いくつかの実施形態において、シーケンシング方法は、（ｄ）化学的に除去された標識および３’ブロッキング基をコピーポリヌクレオチド鎖から洗い流すことをさらに含む。いくつかのそのような実施形態において、３’ブロッキング基および検出可能な標識は、次の相補的ヌクレオチドを導入する前に除去される。いくつかのさらなる実施形態において、３’ブロッキング基および検出可能な標識は、化学反応の単一のステップで除去される。いくつかの実施形態において、洗浄工程（ｄ）はまた、組み込まれていないヌクレオチドを除去する。いくつかのさらなる実施形態において、パラジウムスカベンジャーはまた、標識および３’ブロッキング基の化学的開裂後の洗浄工程において使用される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）～（ｄ）は、テンプレートポリヌクレオチド鎖の部分の配列が決定されるまで繰り返される。いくつかのそのような実施形態では、ステップ（ａ）～（ｄ）は、少なくとも５０回、少なくとも７５回、少なくとも１００回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、少なくとも２５０回、または少なくとも３００回繰り返される。
いくつかの実施形態では、標識および３’ブロッキング基は、２つの別個の化学反応で除去される。いくつかのそのような実施形態において、コピーポリヌクレオチド鎖に組み込まれたヌクレオチドから標識を除去することは、組み込まれたヌクレオチドを含むコピー鎖を第１の切断溶液と接触させることを含む。いくつかのそのような実施形態では、第１の切断溶液は、トリアルキルホスフィン等のホスフィンを含む。トリアルキルホスフィンの非限定的な例には、トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）、トリス－（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＭＰ）、またはトリス（ヒドロキシエチル）ホスフィン（ＴＨＥＰ）が含まれる。一実施形態では、第１の切断溶液はＴＨＰを含む。いくつかのそのような実施形態において、コピーポリヌクレオチド鎖に組み込まれたヌクレオチドから３’ブロッキング基を除去することは、組み込まれたヌクレオチドを含むコピー鎖を第２の切断溶液と接触させることを含む。いくつかのそのような実施形態では、第２の開裂溶液は、パラジウム（Ｐｄ）触媒を含む。いくつかのさらなる実施形態において、Ｐｄ触媒は、Ｐｄ（０）触媒である。いくつかのそのような実施形態において、Ｐｄ（０）は、Ｐｄ（ＩＩ）錯体［（ＰｄＣｌ（Ｃ３Ｈ５））２］をその場でＴＨＰと混合することによって調製される。 Ｐｄ（ＩＩ）錯体とＴＨＰのモル比は、約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０である可能性がある。一実施形態では、Ｐｄ：ＴＨＰのモル比は１：５である。いくつかのさらなる実施形態において、アスコルビン酸またはその塩（例えば、アスコルビン酸ナトリウム）等の１つ以上の還元剤を添加することができる。いくつかの実施形態において、第２の開裂溶液は、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、炭酸塩、リン酸塩、またはホウ酸塩、またはそれらの組み合わせ等の１つ以上の緩衝試薬を含み得る。いくつかのさらなる実施形態において、緩衝試薬は、エタノールアミン（ＥＡ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、グリシン、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、２－ジメチルアミノメタノール（ＤＭＥＡ）、２－ジエチルアミノメタノール（ＤＥＥＡ）、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、またはＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラエチルエチレンジアミン（ＴＥＥＤＡ）、またはそれらの組合せを含む。一実施形態では、緩衝試薬はＤＥＥＡである。別の実施形態では、緩衝試薬は、炭酸塩、リン酸塩、またはホウ酸塩、あるいはそれらの組み合わせ等の１つまたは複数の無機塩を含む。一実施形態では、無機塩はナトリウム塩である。他のいくつかの実施形態では、第２の切断溶液は、ＮａＩＯ４またはＯｘｏｎｅ（登録商標）を含む。いくつかのさらなる実施形態において、３’ブロックヌクレオチドは、ＡＯＭ基を含み、第２の切断溶液は、パラジウム（Ｐｄ）触媒および本明細書に記載の１つ以上の緩衝試薬（例えば、ＤＥＥＡ等の第三級アミン）を含み、約９．０～約１０．０（たとえば、９．６または９．８）のｐＨを有する。
いくつかの代替の実施形態では、標識および３’－ＯＨ遮断基は、単一の化学反応で除去される。いくつかのそのような実施形態において、標識は、３’ブロッキング基と同じ部分を含む切断リンカーを介してヌクレオチドに結合され、例えば、リンカーおよび３’ブロッキング基の両方は、本明細書に記載されているような、アセタール部分
Figure 2022515944000028
 またはチオカルバメート部分
Figure 2022515944000029
 を含み得る。いくつかのそのような実施形態において、単一の化学反応は、上記のＰｄ触媒を含む開裂溶液中で実施される。
いくつかのさらなる実施形態において、組み込みステップ（ａ）で使用されるヌクレオチドは、完全に官能化されたＡ、Ｃ、ＴおよびＧヌクレオチド三リン酸であり、それぞれ、本明細書に記載の３’ブロッキング基を含む。いくつかのそのような実施形態において、本明細書のヌクレオチドは、標準的な３’－Ｏ－アジドメチルブロッキング基で保護された同じヌクレオチドと比較して、シーケンシングの実行中に溶液中で優れた安定性を提供する。例えば、本明細書に開示されるアセタールまたはチオカルバメートブロッキング基は、同じ条件で同じ期間にアジドメチルで保護された３’－ＯＨと比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１５００％、２０００％、２５００％、または３０００％の向上した安定性を付与し得、それにより、プレフェーズ値が減少し、シーケンスの読み取り長が長くなる。いくつかの実施形態では、安定性は、周囲温度または周囲温度より低い温度（例えば、４～１０℃）で測定される。他の実施形態では、安定性は、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃または６５℃等の高温で測定される。いくつかのそのような実施形態では、安定性は、塩基性ｐＨ環境、例えば、ｐＨ９．０、９．２、９．４、９．６、９．８または１０．０の溶液中で測定される。いくつかのさらなる実施形態において、本明細書に記載の３’ブロックヌクレオチドを用いたプレフェージング値は、ＳＢＳを５０、１００、または１５０サイクル以上実行した後、約０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、または０．０５未満である。いくつかのさらなる実施形態において、３’ブロックヌクレオチドを伴う位相値は、 ＳＢＳを５０、１００、または１５０サイクル以上実行した後、約０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、または０．０５未満である。一実施形態では、各ｆｆＮは３’－ＡＯＭグループを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の３’ブロックヌクレオチドは、標準的な３’－Ｏ－アジドメチルブロッキング基で保護された同じヌクレオチドと比較して、シーケンシング実行の化学的切断ステップ中に溶液中で優れた脱ブロック化速度を提供する。例えば、本明細書に開示されるアセタール（例えば、ＡＯＭ）またはチオカルバメートブロッキング基は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１５００％、または２０００％は、アジドメチルで保護された３’－ＯＨと比較して脱ブロック化率が向上している。標準の脱ブロック試薬（トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン等）を使用することにより、シーケンスサイクルの全体的な時間を短縮する。いくつかの実施形態では、各ヌクレオチドの脱ブロック化時間は、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％短縮される。たとえば、３’－ＡＯＭおよび３’－Ｏ－アジドメチルの脱ブロック化時間は、特定の化学反応条件下でそれぞれ約４～５秒および約９～１０秒である。いくつかの実施形態において、ＡＯＭ遮断基の半減期（ｔ１／２）は、アジドメチル遮断基よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍速い。いくつかのそのような実施形態では、ＡＯＭのｔ１／２は約１分であり、アジドメチルのｔ１／２は約１１分である。いくつかの実施形態では、脱ブロック化率は、周囲温度または周囲温度より低い温度（例えば、４～１０℃）で測定される。他の実施形態では、脱ブロック化率は、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、または６５℃等の高温で測定される。いくつかのそのような実施形態では、脱ブロック化速度は、塩基性ｐＨ環境、例えば、ｐＨ９．０、９．２、９．４、９．６、９．８または１０．０の溶液中で測定される。いくつかのそのような実施形態において、脱ブロック試薬と基質（すなわち、３’ブロックされたヌクレオシドまたはヌクレオチド）のモル比は、約１０：１、約５：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：５または約１：１０である。一実施形態では、各ｆｆＮは３’－ＡＯＭグループを含む。
本明細書に記載の方法の任意の実施形態において、標識されたヌクレオチドは、ヌクレオチド三リン酸である。本明細書に記載の方法の任意の実施形態において、標的ポリヌクレオチド鎖は、フローセル等の固体支持体に付着している。
１つの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオチドは、ポリメラーゼ酵素の作用により合成ステップでポリヌクレオチドに組み込まれる。いくつかのそのような実施形態において、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＰｏｌ ８１２またはＰｏｌ １９０１であり得る。しかしながら、ヌクレオチドをポリヌクレオチドに結合する他の方法、例えば、化学的オリゴヌクレオチド合成または標識オリゴヌクレオチドの非標識オリゴヌクレオチドへのライゲーションを使用することができる。したがって、「組み込む」という用語は、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに関して使用される場合、化学的方法および酵素的方法によるポリヌクレオチド合成を包含することができる。
特定の実施形態では、合成ステップが実施され、本開示の標識化３’ブロック化ヌクレオチドを含む反応混合物と共にテンプレートポリヌクレオチド鎖をインキュベートすることを任意に含み得る。テンプレートポリヌクレオチド鎖にアニールされたポリヌクレオチド鎖上の遊離３’－ＯＨ基とヌクレオチド上の５’リン酸基との間のホスホジエステル結合の形成を可能にする条件下でポリメラーゼを提供することもできる。したがって、合成ステップは、テンプレート鎖に対するヌクレオチドの相補的塩基対形成によって指示されるポリヌクレオチド鎖の形成を含むことができる。
本方法のすべての実施形態において、標識ヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチド鎖がテンプレート鎖にアニールされる間、または２本の鎖が分離される変性工程の後に、検出工程を実施することができる。合成工程と検出工程との間に、さらなる工程、例えば化学または酵素反応工程または精製工程を含めることができる。特に、標識ヌクレオチドを組み込んだ標的鎖を単離または精製し、さらに処理するか、またはその後の分析に使用することができる。例として、合成ステップにおいて本明細書に記載のヌクレオチドで標識された標的ポリヌクレオチドは、続いて標識プローブまたはプライマーとして使用され得る。他の実施形態では、本明細書に記載の合成ステップの生成物は、さらなる反応ステップにかけられてもよく、必要に応じて、これらの後続ステップの生成物は精製または単離されてもよい。
合成ステップに適した条件は、標準的な分子生物学技術に精通している者にはよく知られている。一実施形態では、合成ステップは、本明細書に記載のヌクレオチドを含むヌクレオチド前駆体を使用する標準的なプライマー伸長反応に類似し、適切なポリメラーゼ酵素の存在下でテンプレート鎖に相補的な伸長標的鎖を形成することができる。他の実施形態では、合成工程自体が増幅反応の一部を形成し、標的および鋳型ポリヌクレオチド鎖のコピーに由来するアニールされた相補鎖からなる標識二本鎖増幅産物を生成する。他の例示的な合成ステップには、ニックトランスレーション、鎖置換重合、ランダムプライムＤＮＡ標識等が含まれる。合成ステップに特に有用なポリメラーゼ酵素は、本明細書に記載のヌクレオチドの取り込みを触媒できるものである。種々の天然または修飾ポリメラーゼを使用することができる。例として、熱安定性ポリメラーゼは、熱サイクル条件を使用して実行される合成反応に使用することができるが、等温プライマー伸長反応には熱安定性ポリメラーゼは望ましくない場合がある。本開示によるヌクレオチドを組み込むことができる適切な熱安定性ポリメラーゼには、ＷＯ２００５／０２４０１０またはＷＯ０６／１２０４３３に記載されているものが含まれ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。３７℃等の低温で行われる合成反応では、ポリメラーゼ酵素は必ずしも熱安定性ポリメラーゼである必要はない。したがって、ポリメラーゼの選択は、反応温度、ｐＨ、鎖置換活性、およびお気に入り。
特定の非限定的な実施形態では、本開示は、核酸シーケンシング、再シーケンシング、全ゲノムシーケンシング、一塩基多型スコアリングの方法、ポリヌクレオチドに組み込まれた場合の本明細書に記載の標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドの検出を含む他の適用を包含する。蛍光色素を含むヌクレオチドで標識されたポリヌクレオチドの使用に利益をもたらす他の様々な用途はいずれも、本明細書に記載の色素で標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドを使用することができる。
特定の実施形態において、本開示は、本開示による標識ヌクレオチドの合成によるポリヌクレオチドシーケンシング（ＳＢＳ）反応における使用を提供する。合成によるシーケンシングは、通常、ポリメラーゼまたはリガーゼを使用して、成長中のポリヌクレオチド鎖に１つまたは複数のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを５’から３’方向に順次追加して、テンプレート核酸に相補的な伸長ポリヌクレオチド鎖を形成する。順序付けられた追加されたヌクレオチドの１つまたは複数に存在する塩基の同一性は、検出または「イメージング」ステップで決定することができる。付加された塩基の同一性は、各ヌクレオチド取り込みステップの後に決定することができる。次に、テンプレートのシーケンスは、従来のワトソン－クリック塩基対形成規則を使用して推測することができる。単一塩基の同一性を決定するための本明細書に記載の標識ヌクレオチドの使用は、例えば、単一ヌクレオチド多型のスコアリングにおいて有用である可能性があり、そのような単一塩基伸長反応は本開示の範囲内である。
本開示の一実施形態において、テンプレートポリヌクレオチドの配列は、組み込まれたポリヌクレオチドに付着した蛍光標識の検出を通じて、シーケンシングされるテンプレートポリヌクレオチドに相補的な新生鎖への１つ以上の本明細書に記載の３’ブロック化ヌクレオチドの組み込みを検出することによって決定される。ヌクレオチド。テンプレートポリヌクレオチドのシーケンシングは、適切なプライマー（またはヘアピンの一部としてプライマーを含むヘアピンコンストラクトとして準備）でプライムすることができ、３’末端へのヌクレオチドの付加によって新生鎖が段階的に伸長される。ポリメラーゼ触媒反応におけるプライマーの量。
特定の実施形態において、異なるヌクレオチド三リン酸（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）のそれぞれは、独特のフルオロフォアで標識され得、制御されない重合を防止するために３’位にブロッキング基も含む。または、４つのヌクレオチドの１つが非標識（暗色）である可能性がある。ポリメラーゼ酵素は、テンプレートポリヌクレオチドに相補的な新生鎖にヌクレオチドを組み込み、ブロッキング基はヌクレオチドのさらなる組み込みを防ぐ。取り込まれていないヌクレオチドはすべて洗い流すことができ、取り込まれた各ヌクレオチドからの蛍光シグナルは、レーザー励起および適切な発光フィルターを使用する電荷結合素子等の適切な手段によって光学的に「読み取る」ことができる。次に、３’－ブロッキング基と蛍光色素化合物を同時にまたは連続して除去（脱保護）して、さらなるヌクレオチド取り込みのために新生鎖を露出させることができる。通常、組み込まれたヌクレオチドの同一性は、各組み込みステップの後に決定されるが、これは厳密には必須ではない。同様に、米国特許Ｎｏ．米国特許第５，３０２，５０９号（参照により本明細書に組み込まれる）は、固体支持体に固定化されたポリヌクレオチドを配列する方法を開示している。
この方法は、上に例示したように、蛍光標識された３’－ブロックヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴを、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、固定化ポリヌクレオチドに相補的な成長鎖に組み込むことを利用する。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドに相補的な塩基を組み込んでいるが、３’－ブロッキング基によってそれ以上の付加が妨げられている。次に、取り込まれたヌクレオチドの標識を決定し、化学的切断によって保護基を除去して、さらに重合を行うことができる。合成によるシーケンシング反応においてシーケンシングされる核酸テンプレートは、シーケンシングが望まれる任意のポリヌクレオチドであり得る。シーケンシング反応のための核酸テンプレートは、典型的には、シーケンシング反応におけるさらなるヌクレオチドの付加のためのプライマーまたは開始点として機能する遊離の３’－ＯＨ基を有する二本鎖領域を含む。シーケンシングされるテンプレートの領域は、相補鎖上のこの遊離の３’－ＯＨ基をオーバーハングする。シーケンシングされるテンプレートのオーバーハング領域は、一本鎖でもよいが、シーケンシングされるテンプレート鎖に相補的な鎖上に「ニックが存在する」ことにより、開始のための遊離の３’－ＯＨ基を提供するという条件で、二本鎖でもよい。シーケンス反応。そのような実施形態では、シーケンシングは鎖置換によって進行し得る。特定の実施形態において、遊離３’－ＯＨ基を有するプライマーは、シーケンシングされるテンプレートの一本鎖領域にハイブリダイズする別個の成分（例えば、短いオリゴヌクレオチド）として加えられ得る。あるいは、シーケンシングされるプライマーおよびテンプレート鎖は、例えばヘアピンループ構造等の分子内二本鎖を形成することができる部分的に自己相補的な核酸鎖の一部をそれぞれ形成することができる。ヘアピンポリヌクレオチドおよびそれらを固体支持体に付着させる方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／５７２４８およびＷＯ２００５／０４７３０１に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ヌクレオチドは、成長するプライマーに連続して追加され、５’から３’方向のポリヌクレオチド鎖が合成される。付加された塩基の性質は、特に各ヌクレオチド付加後に決定されるが、必ずしもそうである必要はないので、核酸テンプレートの配列情報を提供する。したがって、ヌクレオチドの５’リン酸基とのホスホジエステル結合の形成を介して、ヌクレオチドを核酸鎖の遊離３’－ＯＨ基に結合することにより、ヌクレオチドが核酸鎖（またはポリヌクレオチド）に組み込まれます。
シーケンシングされる核酸テンプレートは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはデオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドからなるハイブリッド分子でさえあり得る。核酸テンプレートは、シーケンシング反応におけるテンプレートのコピーを妨げない限り、天然および／または非天然ヌクレオチドおよび天然または非天然骨格結合を含んでもよい。
特定の実施形態では、シーケンシングされる核酸テンプレートは、当技術分野で公知の任意の適切な結合方法、例えば共有結合によって固体支持体に結合され得る。特定の実施形態において、テンプレートポリヌクレオチドは、固体支持体（例えば、シリカベースの支持体）に直接付着され得る。しかしながら、本開示の他の実施形態において、固体支持体の表面は、テンプレートポリヌクレオチドの直接的な共有結合を可能にするか、またはそれ自体が非であり得るヒドロゲルまたは高分子電解質多層を通してテンプレートポリヌクレオチドを固定化するように、何らかの方法で修飾され得る。－固体支持体に共有結合している。
（合成によるシーケンシングの実施形態および代替物）
いくつかの実施形態は、パイロシーケンシング技術を含む。パイロシーケンシングは、特定のヌクレオチドが新生鎖に組み込まれるときに無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ｒｏｎａｇｈｉ、Ｍ．、Ｋａｒａｍｏｈａｍｅｄ、Ｓ．、Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、Ｂ．、Ｕｈｌｅｎ、Ｍ。ａｎｄ Ｎｙｒｅｎ、Ｐ。（１９９６） “Ｒｅａｌ－ピロリン酸放出の検出を使用した時間ＤＮＡシーケンシング。”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２（１）、８４－９； Ｒｏｎａｇｈｉ、Ｍ。（２００１）"パイロシーケンシングはＤＮＡシーケンシングに光を当てる。 “ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ。１１（１）、３－１１； Ｒｏｎａｇｈｉ 、Ｍ．、Ｕｈｌｅｎ、Ｍ。およびＮｙｒｅｎ、Ｐ。（１９９８）「リアルタイムピロリン酸に基づくシーケンシング方法」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７５）、３６３；米国特許第６，２１０，８９１号；第６，２５８，５６８号および第６，２７４，３２０号の開示。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。パイロシーケンスでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルファラーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に即座に変換されることで検出でき、生成されたＡＴＰのレベルはルシフェラーゼで生成された光子を介して検出される。シーケンスされる核酸は、アレイ内の特徴に付着させることができ、アレイは、アレイの特徴にヌクレオチドが組み込まれるために生成される化学発光シグナルを捕捉するために画像化することができる。アレイを特定のヌクレオチドタイプ（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ等）で処理した後、画像を取得できる。各ヌクレオチドタイプの追加後に得られる画像は、アレイ内のどの特徴が検出されるかに関して異なる。画像のこれらの違いは、アレイ上のフィーチャのシーケンスコンテンツの違いを反映している。ただし、各フィーチャの相対的な位置は画像内で変更されない。画像は、本明細書に記載の方法を使用して保存、処理、および分析することができる。例えば、それぞれの異なるヌクレオチドタイプでアレイを処理した後に得られた画像は、可逆的ターミネーターベースのシーケンシング方法のための異なる検出チャネルから得られた画像について本明細書に例示されるのと同じ方法で処理することができる。
別の例示的なタイプのＳＢＳでは、サイクルシーケンシングは、例えば、ＷＯ０４／０１８４９７および米国特許第７，０５７，０２６号に記載されているように、例えば、切断可能または光退色可能な色素標識を含む可逆的ターミネーターヌクレオチドの段階的添加によって達成される。その開示は参照により本明細書に組み込まれる。このアプローチは、ソレクサ（現在のイルミナ社）によって商品化されており、それぞれが参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９１／０６６７８およびＷＯ０７／１２３，７４４にも記載されている。両方の終端を逆にすることができ、蛍光標識が切断される蛍光標識ターミネーターの可用性は、効率的なサイクリックリバーシブルターミネーション（ＣＲＴ）シーケンスを容易にする。ポリメラーゼはまた、これらの修飾ヌクレオチドを効率的に組み込み、そこから伸長するように共同設計することができる。
好ましくは、可逆的ターミネーターベースのシーケンシングの実施形態において、標識は、ＳＢＳ反応条件下での伸長を実質的に阻害しない。しかしながら、検出ラベルは、例えば、切断または分解によって除去することができる。配列された核酸の特徴にラベルを組み込んだ後、画像をキャプチャすることができる。特定の実施形態では、各サイクルは、アレイへの４つの異なるヌクレオチドタイプの同時送達を含み、各ヌクレオチドタイプは、スペクトル的に異なる標識を有する。次に、４つの異なるラベルの１つに対して選択的な検出チャネルをそれぞれ使用して４つの画像を取得できる。あるいは、異なるヌクレオチドタイプを連続して添加することができ、アレイの画像を各添加ステップの間に取得することができる。そのような実施形態では、各画像は、特定のタイプのヌクレオチドを組み込んだ核酸の特徴を示すであろう。各機能のシーケンスコンテンツが異なるため、種々の画像に種々の機能が存在するか、存在しません。ただし、フィーチャの相対位置は画像内で変更されない。このような可逆ターミネーター－ＳＢＳ法から得られた画像は、本明細書に記載されているように保存、処理、および分析することができる。画像キャプチャステップに続いて、ラベルを削除することができ、ヌクレオチドの追加と検出の後続のサイクルのために可逆的なターミネーター部分を削除することができる。特定のサイクルで検出された後、次のサイクルの前にラベルを除去すると、バックグラウンド信号とサイクル間のクロストークを低減できるという利点がある。有用なラベルと除去方法の例を以下に示す。
いくつかの実施形態は、４つ未満の異なる標識を使用する４つの異なるヌクレオチドの検出を利用することができる。例えば、ＳＢＳは、米国公開番号第２０１３／００７９２３２号。最初の例として、ヌクレオチドタイプのペアは同じ波長で検出できるが、ペアの一方のメンバーと他方のメンバーの強度の違いに基づいて、またはペアの一方のメンバーへの変化に基づいて区別される（例：化学修飾、光化学修飾、または物理的修飾を介して）、ペアの他のメンバーで検出された信号と比較して、見かけの信号が表示または非表示になる。 ２番目の例として、４つの異なるヌクレオチドタイプのうち３つは特定の条件下で検出できるが、４番目のヌクレオチドタイプはそれらの条件下で検出可能なラベルがないか、これらの条件下で最小限に検出される（たとえば、バックグラウンド蛍光による最小限の検出等）。核酸への最初の３つのヌクレオチドタイプの組み込みは、それらのそれぞれのシグナルの存在に基づいて決定することができ、核酸への第４のヌクレオチドタイプの組み込みは、任意のシグナルの不在または最小限の検出に基づいて決定することができる。第３の例として、１つのヌクレオチドタイプは、２つの異なるチャネルで検出される標識を含むことができるが、他のヌクレオチドタイプは、１つ以下のチャネルで検出される。前述の３つの例示的な構成は、相互に排他的であるとは見なされず、様々な組み合わせで使用することができる。３つすべての例を組み合わせた例示的な実施形態は、第１のチャネルで検出される第１のヌクレオチドタイプ（例えば、第１の励起波長によって励起されたときに第１のチャネルで検出される標識を有するｄＡＴＰ）を、第２のチャネルで検出される第２のヌクレオチド型（例えば、第２の励起波長によって励起されたときに第２のチャネルで検出される標識を有するｄＣＴＰ）、第１および第２のチャネルの両方で検出される第３のヌクレオチド型（例えば、第１および／または第２の励起波長によって励起されたときに両方のチャネルで検出される少なくとも１つの標識を有するｄＴＴＰ、およびどちらのチャネルでも検出されないか、または最小限に検出されない標識を欠く第４のヌクレオチドタイプ（例えば、ラベル）を使用する蛍光ベースのＳＢＳ法である。
さらに、米国公開番号第２０１３／００７９２３２号の組み込まれた資料に記載されているように、シーケンスデータは単一チャネルを使用して取得できる。このようないわゆるワンダイシーケンシングアプローチでは、最初のヌクレオチドタイプはラベル付けされるが、ラベルは最初の画像が生成された後に削除され、２番目のヌクレオチドタイプは最初の画像が生成された後にのみラベル付けされる。３番目のヌクレオチドタイプは１番目と２番目の画像の両方でそのラベルを保持し、４番目のヌクレオチドタイプは両方の画像でラベル付けされていないままである。
いくつかの実施形態は、ライゲーション技術によるシーケンシングを利用することができる。そのような技術は、オリゴヌクレオチドを組み込むためにＤＮＡリガーゼを利用し、そのようなオリゴヌクレオチドの組み込みを識別する。オリゴヌクレオチドは、典型的には、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列中の特定のヌクレオチドの同一性と相関する異なる標識を有する。他のＳＢＳ法と同様に、標識されたシーケンシング試薬で一連の核酸機能を処理した後、画像を取得できる。各画像には、特定のタイプのラベルが組み込まれた核酸の特徴が表示される。各特徴のシーケンスコンテンツが異なるため、異なる画像には異なる特徴が存在するか存在しませんが、特徴の相対位置は画像内で変更されない。ライゲーションベースのシーケンシング方法から得られた画像は、本明細書に記載されているように保存、処理、および分析することができる。本明細書に記載の方法およびシステムと共に利用することができる例示的なＳＢＳシステムおよび方法は、米国特許第６，９６９，４８８、６，１７２，２１８、および６，３０６，５９７号に記載されている（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態は、ナノポアシーケンシングを利用することができる（Ｄｅａｍｅｒ、ＤＷ＆Ａｋｅｓｏｎ、Ｍ。「ナノポアおよび核酸：超高速シーケンシングの展望」。ナノポア分析による核酸の分析」、Ａｃｃ。Ｃｈｅｍ。Ｒｅｓ。３５：８１７－８２５（２００２）； Ｌｉ、Ｊ．、Ｍ。Ｇｅｒｓｈｏｗ、Ｄ。Ｓｔｅｉｎ、Ｅ。Ｂｒａｎｄｉｎ、およびＪＡ Ｇｏｌｏｖｃｈｅｎｋｏ、「ＤＮＡ分子および構成固体ナノポア顕微鏡」Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ。２：６１１－６１５（２００３）、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。そのような実施形態では、標的核酸はナノポアを通過する。ナノポアは、合成ポアまたはα－溶血素等の生体膜タンパク質である可能性がある。標的核酸がナノポアを通過するとき、ポアの電気コンダクタンスの変動を測定することにより、各塩基対を特定することができる。 （米国特許第７，００１，７９２号； Ｓｏｎｉ、ＧＶ＆Ｍｅｌｌｅｒ、 “Ａ。固体ナノポアを使用した超高速ＤＮＡシーケンシングに向けた進歩。” Ｃｌｉｎ。Ｃｈｅｍ。５３、１９９６－２００１（２００７）； Ｈｅａｌｙ、Ｋ。 “ナノポアベース。単一分子ＤＮＡ分析。 “Ｎａｎｏｍｅｄ。２、４５９－４８１（２００７）； Ｃｏｃｋｒｏｆｔ、ＳＬ、Ｃｈｕ、Ｊ．、Ａｍｏｒｉｎ、Ｍ。＆Ｇｈａｄｉｒｉ、ＭＲ”単一分子ナノポアデバイスは単一ヌクレオチドでＤＮＡポリメラーゼ活性を検出する決議。」Ｊ．Ａｍ。Ｃｈｅｍ。Ｓｏｃ。１３０、８１８－８２０（２００８）、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ナノポアシーケンシングから得られたデータは、本明細書に記載されているように保存、処理、および分析することができる。特に、データは、本明細書に記載されている光学画像および他の画像の例示的な処理に従って画像として扱うことができる。
シーケンシング方法の他のいくつかの実施形態は、米国特許第９，２２２，１３２号に記載されているもの等、ナノボールシーケンシング技術において本明細書に記載されている３’ブロックヌクレオチドの使用を含み、その開示は参照により組み込まれる。ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）のプロセスを通じて、多数の個別のＤＮＡナノボールが生成される可能性がある。次に、ナノボール混合物は、単一のナノボールを各位置に関連付けることを可能にする特徴を含むパターン化されたスライド表面に分配される。ＤＮＡナノボールの生成では、ＤＮＡは断片化され、４つのアダプター配列の最初の配列にライゲーションされる。テンプレートは、ＩＩ型エンドヌクレアーゼで増幅、環状化、切断される。アダプターの２番目のセットが追加され、続いて増幅、環状化、および切断が行われます。このプロセスは、残りの２つのアダプターに対して繰り返される。最終製品は、それぞれがテンプレートシーケンスで区切られた４つのアダプターを備えた円形テンプレートである。ライブラリ分子はローリングサークル増幅ステップを経て、ＤＮＡナノボールと呼ばれる大量のコンカテマーを生成し、フローセルに堆積する。Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｏｍｉｎｇ ｏｆ ａｇｅ： ｔｅｎ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，” Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ． ２０１６；１７（６）：３３３－５１。
いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを含む方法を利用することができる。ヌクレオチドの取り込みは、例えば、米国特許第７，３２９，４９２号および第７，２１１，４１４号（これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、フルオロフォア含有ポリメラーゼとγ－リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用を介して検出することができる。またはヌクレオチド組み込みは、例えば、米国特許第７，３１５，０１９号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ゼロモード導波路で検出することができる。例えば、米国特許第７，４０５，２８１号および米国公開番号第２００８／０１０８０８２号（これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、蛍光ヌクレオチド類似体および操作されたポリメラーゼを使用する。照明は、蛍光標識ヌクレオチドの取り込みが低バックグラウンドで観察できるように、表面につながれたポリメラーゼの周りのゼプトリットルスケールの体積に制限することができる（Ｌｅｖｅｎｅ， Ｍ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． ”Ｚｅｒｏ－ｍｏｄｅ ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９， ６８２－６８６ （２００３）； Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ， Ｐ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． ”Ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ．” Ｏｐｔ． Ｌｅｔｔ． ３３， １０２６－１０２８ （２００８）； Ｋｏｒｌａｃｈ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． ”Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｚｅｒｏ－ｍｏｄｅ ｗａｖｅｇｕｉｄｅ ｎａｎｏ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０５， １１７６－１１８１ （２００８）、その開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。）。そのような方法から得られた画像は、本明細書に記載されるように保存、処理、および分析することができる。
いくつかのＳＢＳの実施形態は、ヌクレオチドが伸長産物に組み込まれると放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づくシーケンシングは、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販されている電気検出器および関連技術、または米国公開番号第２００９／００２６０８２；２００９／０１２７５８９；２０１０／０１３７１４３；および２０１０／０２８２６１７号（これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているシーケンシング方法およびシステムを使用することができる。速度論的排除を使用して標的核酸を増幅するための本明細書に記載の方法は、プロトンを検出するために使用される基質に容易に適用することができる。より具体的には、本明細書に記載の方法を使用して、プロトンを検出するために使用されるアンプリコンのクローン集団を生成することができる。
上記のＳＢＳ方法は、複数の異なる標的核酸が同時に操作されるように、多重フォーマットで有利に実行することができる。特定の実施形態では、異なる標的核酸は、共通の反応容器内または特定の基質の表面上で処理することができる。これにより、シーケンス試薬の便利なデリバリー、未反応試薬の除去、および取り込みイベントの検出が多重に可能になる。表面結合標的核酸を使用する実施形態において、標的核酸は、アレイフォーマットであり得る。アレイフォーマットでは、標的核酸は通常、空間的に区別可能な方法で表面に結合することができる。標的核酸は、直接共有結合、ビーズまたは他の粒子への付着、または表面に付着しているポリメラーゼまたは他の分子への結合によって結合することができる。アレイは、各部位に標的核酸の単一のコピー（特徴とも呼ばれる）を含むことができ、または同じ配列を有する複数のコピーが各部位または特徴に存在することができる。複数のコピーは、以下でさらに詳細に説明するように、ブリッジ増幅またはエマルジョンＰＣＲ等の増幅方法によって生成することができる。
本明細書に記載の方法は、例えば、少なくとも約１０個の特徴／ｃｍ２、１００個の特徴／ｃｍ２、５００個の特徴／ｃｍ２、１０００個の特徴／ｃｍ２、５０００個の特徴／ｃｍ２、１０，０００機能／ｃｍ２、５０，０００機能／ｃｍ２、１００，０００機能／ｃｍ２、１，０００，０００機能／ｃｍ２、５，０００，０００機能／ｃｍ２以上を含む、様々な密度のいずれかの特徴を有するアレイを使用することができる。
本明細書に記載の方法の利点は、それらが複数の標的核酸の迅速かつ効率的な検出を並行して提供することである。したがって、本開示は、上に例示されたもの等の当技術分野で知られている技術を使用して核酸を調製および検出することができる統合システムを提供する。したがって、本開示の統合システムは、増幅試薬および／またはシーケンシング試薬を１つまたは複数の固定化ＤＮＡフラグメントに送達することができる流体構成要素を含むことができ、システムは、ポンプ、バルブ、リザーバー、流体ライン等の構成要素を含む。フローセルは、標的核酸を検出するための統合システムで構成および／または使用することができる。例示的なフローセルは、例えば、米国公開番号第２０１０／０１１１７６８号及び米国シリアル番号第１３／２７３，６６６号に記載されている。これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。フローセルについて例示されるように、統合システムの１つまたは複数の流体構成要素は、増幅方法および検出方法に使用することができる。核酸シーケンシングの実施形態を例として取り上げると、統合システムの流体構成要素の１つまたは複数を、本明細書に記載の増幅方法、および上記に例示したようなシーケンシング方法におけるシーケンシング試薬の送達に使用することができる。あるいは、統合システムは、増幅方法を実行し、検出方法を実行するための別個の流体システムを含むことができる。増幅された核酸を作成し、また核酸の配列を決定することができる統合シーケンシングシステムの例には、ＭｉＳｅｑ（商標）プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）および米国シリアル番号第１３／２７３，６６６号に記載のデバイスが挙げられ、参照により本明細書に組み込まれる。
ポリヌクレオチドがシリカベースの支持体に直接付着したアレイは、例えば、ＷＯ００／０６７７０（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているものであり、ポリヌクレオチドは、ガラス上のペンダントエポキシド基とポリヌクレオチド上の内部アミノ基。さらに、ポリヌクレオチドは、例えば、ＷＯ２００５／０４７３０１（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、硫黄ベースの求核剤と固体支持体との反応によって、固体支持体に結合させることができる。固体に支持されたテンプレートポリヌクレオチドのさらに別の例は、テンプレートポリヌクレオチドが、例えば、ＷＯ００／３１１４８、ＷＯ０１／０１１４３、ＷＯ０２／１２５６６、ＷＯ０３／０１４３９２、米国特許米国特許第６，４６５，１７８号およびＷＯ００／５３８１２を参照されたい。これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
テンプレートポリヌクレオチドが固定化され得る特定の表面は、ポリアクリルアミドヒドロゲルである。ポリアクリルアミドヒドロゲルは、上で引用した参考文献およびＷＯ２００５／０６５８１４に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。使用できる特定のヒドロゲルには、ＷＯ２００５／０６５８１４およびＵ．Ｓ．Ｐｕｂ．番号２０１４／００７９９２３。一実施形態では、ヒドロゲルはＰＡＺＡＭ（ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－コ－アクリルアミド））である。
ＤＮＡテンプレート分子は、例えば、米国特許第５，２５３，００３号に記載されているように、ビーズまたは微粒子に付着することができる。米国特許第６，１７２，２１８号（参照により本明細書に組み込まれる）。ビーズまたは微粒子への付着は、シーケンシングアプリケーションに役立ちます。ビーズライブラリは、各ビーズが異なるＤＮＡ配列を含むように準備することができる。ライブラリの例とその作成方法は、Ｎａｔｕｒｅ、４３７、３７６－３８０ （２００５） に記載される。 Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０９， ５７４１， １７２８－１７３２ （２００５）、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のヌクレオチドを使用するそのようなビーズのアレイのシーケンシングは、本開示の範囲内である。
シーケンシングされるテンプレートは、固体支持体上の「アレイ」の一部を形成することができ、その場合、アレイは任意の便利な形をとることができる。したがって、本開示の方法は、単一分子アレイ、クラスター化アレイ、およびビーズアレイを含む、あらゆるタイプの高密度アレイに適用可能である。本開示の標識ヌクレオチドは、固体支持体上への核酸分子の固定化によって形成されるものを含むがこれらに限定されない、本質的に任意のタイプのアレイ上でテンプレートをシーケンシングするために使用され得る。
しかし、本開示の標識ヌクレオチドは、クラスター化アレイのシーケンシングの文脈において特に有利である。クラスター化されたアレイでは、アレイ上の異なる領域（サイトまたはフィーチャと呼ばれることが多い）が、複数のポリヌクレオチドテンプレート分子を構成する。一般に、複数のポリヌクレオチド分子は光学的手段によって個別に分解することはできず、代わりに集団として検出される。アレイの形成方法に応じて、アレイ上の各部位は、１つの個別のポリヌクレオチド分子の複数のコピー（例えば、その部位は特定の一本鎖または二本鎖の核酸種に対して均質である）または少数の複数のコピーを含む場合がある。異なるポリヌクレオチド分子の（例えば、２つの異なる核酸種の複数のコピー）。核酸分子のクラスター化されたアレイは、当技術分野で一般的に知られている技術を使用して生成され得る。例として、ＷＯ９８／４４１５１およびＷＯ００／１８９５７（それぞれが本明細書に組み込まれている）は、クラスターからなるアレイを形成するために、テンプレートと増幅産物の両方が固体支持体に固定されたままである核酸の増幅方法を記載している。または固定化された核酸分子の「コロニー」。これらの方法に従って調製されたクラスター化アレイ上に存在する核酸分子は、本開示の色素化合物で標識されたヌクレオチドを使用してシーケンシングするための適切なテンプレートである。
本開示の標識ヌクレオチドは、単一分子アレイ上のテンプレートのシーケンシングにも有用である。本明細書で使用される「単一分子アレイ」または「ＳＭＡ」という用語は、固体支持体上に分散（または配列）したポリヌクレオチド分子の集団を指し、個々のポリヌクレオチドと他のすべての集団との間隔は、個々のポリヌクレオチド分子を個別に分離することが可能である。したがって、固体支持体の表面に固定化された標的核酸分子は、いくつかの実施形態において、光学的手段によって分解することができる。これは、それぞれが１つのポリヌクレオチドを表す１つまたは複数の異なる信号が、使用される特定のイメージングデバイスの分解可能な領域内で発生することを意味する。
アレイ上の隣接するポリヌクレオチド分子間の間隔が少なくとも１００ｎｍ、より詳細には少なくとも２５０ｎｍ、さらにより詳細には少なくとも３００ｎｍ、さらにより詳細には少なくとも３５０ｎｍである単一分子検出を達成することができる。このように、各分子は単一分子の蛍光点として個別に分解および検出可能であり、前記単一分子の蛍光点からの蛍光も単一段階の光退色を示す。
本明細書では、「個別に分解」および「個別の分解」という用語を使用して、視覚化すると、アレイ上の１つの分子をその隣接する分子から区別できることを指定する。アレイ上の個々の分子間の分離は、部分的に、個々の分子を分解するために使用される特定の技術によって決定される。単一分子アレイの一般的な特徴は、公開された出願ＷＯ００／０６７７０およびＷＯ０１／５７２４８を参照することによって理解されるであろう。これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。本開示のヌクレオチドの一用途は、合成反応によるシーケンシングであるが、ヌクレオチドの有用性はそのような方法に限定されない。実際、ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに組み込まれたヌクレオチドに付着した蛍光標識の検出を必要とする任意のシーケンシング方法で有利に使用することができる。
特に、本開示の標識ヌクレオチドは、自動蛍光シーケンシングプロトコル、特にサンガーおよび共同研究者の連鎖停止シーケンシング法に基づく蛍光色素ターミネーターサイクルシーケンシングにおいて使用され得る。このような方法は、通常、酵素とサイクルシーケンシングを使用して、蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドをプライマー伸長シーケンシング反応に組み込む。いわゆるサンガーシーケンシング法、および関連プロトコル（サンガータイプ）は、標識されたジデオキシヌクレオチドによるランダム化された連鎖停止を利用する。
したがって、本開示は、３’および２’位の両方にヒドロキシル基を欠くジデオキシヌクレオチドである標識ヌクレオチドも包含し、そのようなジデオキシヌクレオチドは、サンガー型シーケンシング法等での使用に適している。
３’－ブロッキング基を組み込んだ本開示の標識ヌクレオチドは、サンガー法および関連プロトコルにおいても有用であり得る。なぜなら、ジデオキシヌクレオチドを使用することによって達成されるのと同じ効果が、３’－ＯＨブロッキング基を有するヌクレオチドを使用することによって達成され得るからである。：両方が後続のヌクレオチドの取り込みを防ぐ。本開示によるヌクレオチドがサンガー型シーケンシング法で使用される場合、ヌクレオチドに結合した色素化合物または検出可能な標識は、切断可能なリンカーを介して結合する必要がないことが理解されるであろう。本開示の標識ヌクレオチドが組み込まれる各例。ヌクレオチドを後で組み込む必要がないため、ヌクレオチドからラベルを除去する必要はない。
本明細書に記載の方法の任意の実施形態において、シーケンシングアプリケーションで使用されるヌクレオチドは、本明細書に記載の３’ブロックヌクレオチド、例えば、式（Ｉ）、（Ｉａ）、または（ＩＩ）のヌクレオチドである。任意の実施形態において、３’ブロックヌクレオチドは、ヌクレオチド三リン酸である。
追加の実施形態は、特許請求の範囲を限定することを決して意図しない以下の実施例においてさらに詳細に開示される。
（例１．３’－アセタールブロックヌクレオシドの調製）
この例では、スキーム２に従って種々の３’－アセタール保護Ｔヌクレオシドを調製した。
Figure 2022515944000030
Ｔ１の調製：オーブンで乾燥させた窒素パージした１００ｍＬフラスコに、５－ヨード－２’－デオキシウリジン（５．０ｇ、１４．１２ｍｍｏｌ）を加えた。これを３０ｍＬのピリジンと３回共蒸発させた後、窒素下に置いた。無水ピリジン（２５ｍＬ）を加え、均一な溶液が得られるまで（約１５分）、反応物を室温で撹拌した。混合物を氷水浴中で０℃に冷却し、塩化ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル（４．０４ｍＬ、１５．５ｍｍｏｌ）を激しく攪拌しながら（約１時間）ゆっくりと滴下して加えた。すべてのＳＭがＴＬＣによって消費されるまで、反応を０℃で８時間維持した。飽和塩化アンモニウム水溶液（約１５ｍＬ）を加え、反応物を室温まで温めた。混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液（２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル（４ｘ５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空で濃縮して、高真空下で残留溶媒を除去した後、約８ｇの透明な黄色の油を得た。粗生成物Ｔ１を、シリカ上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、白色の結晶性固体として精製した。収量は６．９４ｇ（８３％）である。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）５９１．０８［Ｍ－Ｈ］
Ｔ２の調製：オーブン乾燥した窒素パージした茶色の５００ｍＬ３つ口フラスコに、Ｔ１（６．２３ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（２００ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）およびビス（トリフェニルホスフィン）を加えた。窒素下の二塩化パラジウム（ＩＩ）（３６９ｍｇ、０．５２６ミリモル）。フラスコを光から保護し、無水の脱気したＤＭＦ（２００ｍＬ）を加えた。この溶液に、２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－プロプ－２－イニル－アセトアミド（４．７４ｇ、３１．６ｍｍｏｌ）を加え、続いて脱気したトリエチルアミン（２．９２ｍＬ、２１．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を窒素下、室温で６時間撹拌し、ＴＬＣ分析によってそれ以上の出発物質が観察されなかった。揮発性物質を真空（～１５分）で除去し、ＤＭＦを高真空（～１時間）下で除去して褐色の残留物にした。これを酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解し、０．１ＭＥＤＴＡ水溶液（２ｘ２００ｍＬ）で抽出した。水層を合わせ、さらに酢酸エチル（２００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、揮発性物質を真空で除去し（～３０分）、さらに高真空下で乾燥させ（～１時間）、約８ｇの粗褐色／黄色油を得た。混合物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーによりオフホワイトの固体として精製した。収量：６．０ｇ（８５％）。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）６１４．１９［Ｍ－Ｈ］。
Ｔ３の調製：窒素下で開始ヌクレオシドＴ２（２．０ｇ、３．２５ｍｍｏｌ）を含むオーブン乾燥窒素パージ１００ｍＬフラスコに、無水ＤＭＳＯ（６．９ｍｌ、９７．５ｍｍｏｌ）を室温で一度に加え、均一な溶液になるまで撹拌した。形成された。酢酸（１１．１ｍＬ、１９５ｍｍｏｌ）、続いて無水酢酸（１５．１ｍＬ、１６２．０９ｍｍｏｌ）の両方を滴下した（それぞれ約５分）。混合物を５０℃に温め、ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／石油エーテル３：２）によって出発ヌクレオシドが完全に消費されるまで（約５時間）撹拌した。次に、反応物を半分の体積に濃縮し、氷浴で約０．５℃に冷却した。冷（～０．５℃）ＮａＨＣＯ３（ａｑ、ｓａｔ。）（４５ｍＬ）をゆっくりと加え、さらに攪拌して、発泡が観察されなくなるまで（～１５分）、後処理を開始した。溶液を室温まで温め、次に水をＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）に抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、揮発性物質を減圧下、さらに高真空で蒸発させた。粗生成物Ｔ３を、オフホワイトの固体としてシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量：１．７９ｇ（８２％）。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）６７４．２０［Ｍ－Ｈ］－。
Ｔ４の調製：Ｎ２下の無水ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中の出発ヌクレオシドＴ３（１．７９ｇ、２．６４９ｍｍｏｌ）の溶液に、シクロヘキセン（１．３４ｍＬ、１３．２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を氷浴で０℃に冷却し、蒸留塩化スルフリル（３２２μＬ、３．９７ミリモル）をＮ２下でゆっくりと滴下（約２０分）し、その温度で２０分間撹拌した後、ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：石油エーテル）＝３：２ｖ／ｖ）は、開始ヌクレオシドが完全に消費されたことを示している。次に、スキーム３に示すように、新たに蒸留した対応する不飽和アルコール（５当量）を直接滴下して塩化物中間体をクエンチした。得られた溶液を室温で２時間撹拌し、続いて減圧下で揮発性物質を蒸発させた。油性残留物をＥｔＯＡｃ：ブライン（３：２）（１２５ｍＬ）に分配した。有機層を分離し、水性物をさらにＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）に抽出した。合わせた有機抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。油性残留物をＥｔＯＡｃ：ブライン（３：２）（１２５ｍＬ）に分配した。有機層を分離し、水性物をさらにＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）に抽出した。合わせた有機抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。粗生成物Ｔ４をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、最終生成物を黄色の油として得た。収量：ＡＯＭで１．２０ｇ（６９％）。ＰｒＯＭの場合は１．２９ｇ（７１％）。ＤＰｒＯＭの場合は１．３４ｇ（７１％）。
３’－ＡＯＭ：黄色のオイル。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）［Ｍ－Ｈ］６８４．２４。
３’－ＰｒＯＭ：黄色のオイル。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）［Ｍ－Ｈ］６８２．２２。
３’－ＤＰｒＯＭ：黄色のオイル。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）［Ｍ－Ｈ］７１０．２５。
Figure 2022515944000031
 スキーム３．
Ｔ５の調製：窒素下の５０ｍＬ丸底フラスコ中の出発物質Ｔ４（１．０４ｇ、１．５１６ｍｍｏｌ）に、室温で無水ＴＨＦ（９ｍＬ）を加えた。次に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１．０Ｍ、１．７ｍＬ、１．７０ｍｍｏｌ）を滴下し、すべてのＳＭがＴＬＣによって消費されるまで溶液を撹拌した（約２時間）。反応の過程で溶液はオレンジ色に変わった。揮発性物質を真空で除去してオレンジ色の残留物を得、これをＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶解し、ＮａＨＣＯ３（飽和水溶液）（６０ｍＬ）で分離した。２つの層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、蒸発させて、粗生成物を黄色の油として得た。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、透明な黄色の油を得た。収量：ＡＯＭで６３７ｍｇ（９４％）。ＰｒＯＭの場合は５２６ｍｇ（７８％）。ＤＰｒＯＭの場合は６１７ｍｇ（８６％）。
３’－ＡＯＭ：透明な黄色のオイル。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）［Ｍ－Ｈ］４４６．１２。
３’－ＰｒＯＭ：透明な黄色の油（５２６ｍｇ７８％）。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）：［Ｍ－Ｈ］４４４．１０。
３’－ＤＰｒＯＭ：透明な黄色の油（６１７ｍｇ８６％）。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）：［Ｍ－Ｈ］４７２．１３。
さらに、２つの追加の３’ブロックＴヌクレオシド（３’－ｅＡＯＭＴおよび３’－ｉＡＯＭＴ）を、上記と同様の方法で調製した。３’－ｉＡＯＭＴ：ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ）：（負イオン）ｍ／ｚ３２５．５（Ｍ－Ｈ＋）、（正イオン）３２７．３（Ｍ＋Ｈ＋）。３’－ｅＡＯＭＴ：ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ）：（陽イオン）ｍ／ｚ３４１．３（Ｍ＋１Ｈ＋）。
Figure 2022515944000032
（例２．３’－ＯＨブロッキング基の安定性テスト）
この例では、５’－ｍＰ ３’－ＡＯＭ Ｔヌクレオチドの安定性テストを、標準の５’－ｍＰ３’－Ｏ－アジドメチルＴヌクレオチドを含む取り込み緩衝液中で並べて実行した。
Figure 2022515944000033
（緩衝液の製剤化）
１００ｍＭエタノールアミンバッファー（ｐＨ９．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、および２．５ｍＭ ＥＤＴＡの溶液中の０．１ｍＭの各５’－一リン酸３’保護Ｔヌクレオチド１ｍＬを、加熱ブロック内で６５℃で２週間インキュベートした。設定した時点で、４０μＬのアリコートを採取し、ＨＰＬＣで分析して、ブロックされたヌクレオチドの残りの割合と、ブロックされていないヌクレオチドの最終的な形成を決定した。
ＡＯＭ、ＰｒＯＭ、ＤＰｒＯＭアセタール保護基および標準アジドメチルブロッキング基を有する５’－一リン酸３’保護ヌクレオチドに関する安定性試験の結果を図１に示す。ＡＯＭ、ＰｒＯＭおよびＤＰｒＯＭを含む３’ブロックヌクレオチド一リン酸が観察された。ブロッキング基は、溶液中の脱ブロッキング率の低下を３０～５０倍以上改善した。この実験は、対応する完全に機能化されたヌクレオチド（ｆｆＮ）が、シーケンスデバイスのカートリッジ上の組み込みミックスに保存されたときにどのように動作するかを模倣する。これらのアセタール保護基によって提供される安定性の改善はまた、シーケンシング実行におけるより低いプレフェージング速度につながるであろう。最後に、それは取り込み混合試薬の貯蔵寿命を改善する。
（例３．３’－ＡＯＭ脱ブロック化テスト）
この例では、５’－ｍＰ ３’－ＡＯＭ Ｔおよび標準の５’－ｍＰ３’－Ｏ－アジドメチルＴヌクレオチドの脱ブロック化テストが、各ブロックグループに固有のソリューションで個別に実行された。条件は、イルミナの標準的なブロック解除試薬を可能な限り模倣し、同じ方法論に従うように策定された。活性脱ブロック試薬、バッファー、ヌクレオシドの濃度はすべてのテストで同じに保たれているが、各成分の同一性は独特であった。このように、個々の脱ブロック化化学物質間で観察された速度の違いは、製剤の濃度の違いによるものではない。
Figure 2022515944000034
（標準のアジドメチル脱ブロック条件）
ヌクレオチド：５’－一リン酸３’－Ｏ－アジドメチルＴ．アクティブ脱ブロック試薬：トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）（１８ｍΩ水中で１Ｍ）。（オプション）添加剤：アスコルビン酸ナトリウム（１８ｍΩ水中０．１ｍＭ）最終濃度＝１ｍＭ。緩衝液：エタノールアミンｐＨ９．８（１８ｍΩ水中で２Ｍ）。クエンチング試薬：Ｈ２Ｏ２。
（ＡＯＭ脱ブロック条件）
ヌクレオチド：５’－一リン酸３’－Ｏ－アジドメチルＴ。３’－ＡＯＭＴのストック溶液を、窒素下のガラスバイアル内で、１００ｍＭエタノールアミンバッファー（ｐＨ９．８）で０．１ｍＭに希釈した。アスコルビン酸ナトリウム添加剤のストック溶液を最終濃度が０．１ｍＭになるように添加し、溶液を５分間撹拌した。アッセイを開始するために、脱ブロック試薬（Ｐｄ／ＴＨＰ＝１／５；アスコルビン酸ナトリウム；エタノールアミン）を、室温で攪拌溶液に最終濃度１ｍＭＴＨＰで添加した。指定された時点で、４０μＬのアリコートを採取し、ＥＤＴＡ／Ｈ２Ｏ２（０．０２５：０．０７５Ｍ）の１：３混合物６μＬでクエンチした。ＨＰＬＣ分析は、開始ヌクレオシドピーク、３’－ＯＨピーク、およびＨＰＬＣクロマトグラムに表示されるその他のヌクレオチドピークの面積を測定することによって実行された。他のヌクレオチドベースの副産物は観察されないであった。
比較結果を図２Ａに示す。ＡＯＭは、標準のアジドメチルブロッキング基と比較して、溶液中の非ブロッキング率に関して１０倍の速度改善を提供することが観察された。この実験は、対応するｆｆＮが脱ブロック化ステップ中のシーケンスでどのように動作するかを模倣する目的を果たす。脱ブロッキング速度の大幅な改善により、特定のイルミナシーケンスプラットフォームで通常使用される１０～２０秒のインキュベーション時間の代わりに、フラッシュスルー脱ブロッキングステップが可能になる。結果として、脱ブロック化率は、合成によるシーケンス（ＳＢＳ）サイクルタイムに大きな影響を及ぼす。
同様の実験条件を３’－ｅＡＯＭ Ｔおよび３’－ｉＡＯＭ Ｔの脱ブロック化アッセイに使用した。単一の変更として、脱ブロック化率の明確な違いを観察するために、Ｐｄ触媒と基質の比率を５：１に減らした。３’－ＡＯＭ Ｔを参照として使用し、結果を図２Ｂに示す。これらの結果は、ｅＡＯＭおよびｉＡＯＭの脱ブロック化速度が、この特定の濃度のＰｄ触媒脱ブロック化試薬でＡＯＭよりも２～３倍遅いことを示している。ＡＯＭブロッキング基の置換バージョンと非置換バージョンの間の脱ブロック化率の差は、Ｐｄ触媒と基質の比率が高いほど小さくなると予想できる。
（例４．シーケンシングのためのパラジウム開裂混合物の最適化）
実施例２に記載の脱ブロック化反応で使用されるＰｄ／ＴＨＰ触媒は、非常に空気に敏感である。空気にさらされると、それは実質的な活動の喪失を示した。この例では、酸化ストレスアッセイを開発して、パラジウム開裂混合物の種々の配合物の空気感受性を評価した。
０．５ｍＬのＰｄクリーブミックスを５ｍＬのガラスバイアルに分注し、室温で３時間大気に開放したままにした。酸化された切断混合物の残留活性は、以下のように３’－ＡＯＭ Ｔの切断を測定することによって評価された。３’－ＡＯＭ Ｔのストック溶液を、１００ｍＭ切断混合バッファーで０．１ｍＭに希釈した。アスコルビン酸ナトリウムのストック溶液を最終濃度が１ｍＭになるように添加し、続いて酸化開裂混合物を添加して最終１／２０希釈した。１時間後、４０μＬの溶液を１０μＬのＥＤＴＡ／Ｈ２Ｏ２（０．２５：０．２５Ｍ）の１：１混合液で直ちにクエンチし、ＨＰＬＣで分析した。この実験では、次のような種々のバッファー試薬をスクリーニングした。第一級アミン（エタノールアミン、トリス、グリシン等）。第三級アミン（２－ジメチルアミノメタノール（（ＤＭＥＡ）、２－ジエチルアミノメタノール（ＤＥＥＡ）、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）またはＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラエチルエチレンジアミン（ＴＥＥＤＡ）等）；および種々の無機塩（ホウ酸塩、炭酸塩、リン酸塩等）。無機緩衝剤試薬（ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等）が最高の空気安定性を提供し、パラジウム錯体が高い％活性を保持したことが観察された。さらに、第三級アミンは、第一級アミンと比較して、Ｐｄ開裂混合物の安定性も大幅に改善した。
これらの発見に基づいて、２つのパラジウム開裂混合物を調製した。最初の例では、２５０ｍＭホウ酸緩衝液のストック溶液を使用する。（ｐＨ９．６、２０ｍＬ）を水（１４ｍＬ）で希釈した後、ＴＨＰ（１００ｍＭＴｒｉｓ中１Ｍ、ｐＨ９、５ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）および塩化アリルパラジウム（ＩＩ）ダイマー（１８３ｍｇ、０．５ミリモル）。混合物を室温で数分間激しく撹拌した後、１Ｍアスコルビン酸ナトリウム水溶液を添加した。（０．５ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）、５ＭＮａＣｌ ａｑ．（１０ｍＬ）および１０％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０（０．５ｍＬ）。２番目の例では、２Ｍ ＤＥＥＡバッファー水溶液のストック溶液。（ｐＨ９．６、０．６ｍＬ）を水（７．６ｍＬ）で希釈した後、ＴＨＰ（１００ｍＭＴｒｉｓ中１Ｍ、ｐＨ９、１．２ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）および固体塩化アリルパラジウム（ＩＩ）ダイマー（ＩＩ）のストック溶液を添加した。４３．９ｍｇ、０．１２ミリモル）。混合物を室温で数分間激しく撹拌した後、１Ｍアスコルビン酸ナトリウム水溶液を添加した。（０．１２ｍＬ、０．１２ｍｍｏｌ）、５ＭＮａＣｌ ａｑ．（２．４ｍＬ）および１０％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０（０．１２ｍＬ）。
（実施例５．完全に機能化されたヌクレオチドの調製およびシーケンシング用途への使用）
この例では、３’－ＡＯＭブロッキング基を持つ種々の完全に機能化されたヌクレオチド（ｆｆＮ）の調製について詳しく説明する。これらのｆｆＮは、イルミナＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）プラットフォームでの合成アプリケーションによるシーケンスにも使用された。
スキーム４．３’－ＡＯＭ－ｆｆＣ－ＬＮ３－ＳＯ７１８１の合成
Figure 2022515944000035
中間体ＡＯＭ Ｃ２の合成：ヌクレオシドＣ１（０．５ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）をＮ２下の無水ＤＣＭ（１２ｍＬ）に溶解し、混合物を０℃に冷却した。シクロヘキセン（０．３２ｍＬ、３．２１ｍｍｏｌ）を加え、続いてＳＯ２Ｃｌ２（ＤＣＭ中１．０Ｍ、１．２７ｍＬ、１．２７ｍｍｏｌ）を滴下した。反応物をロータリーエバポレーターに素早く移して減圧下ですべての揮発性物質を除去する前に、追加のシクロヘキセン（０．３２ｍＬ、３．２１ミリモル）を加えた。固体残留物をさらに高真空下で１０分間乾燥させた後、Ｎ２下で無水ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した。混合物を０℃に冷却し、氷冷アリルアルコール（５ｍＬ）を滴下した。反応物を０℃で２時間撹拌した後、ｓａｔを添加してクエンチした。ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）およびＤＣＭ（３０ｍＬ）。２つの相を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、ＥｔＯＡｃ／石油エーテルを使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、ＡＯＭ Ｃ２を白色固体として得た（２６４ｍｇ、５２％収率）。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）：［Ｍ－Ｈ］７８７、［Ｍ＋Ｃｌ］８２３。
中間体ＡＯＭ Ｃ３の合成：ＡＯＭ Ｃ２（２４６ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）をＮ２下で無水ＴＨＦ（９．５ｍＬ）に溶解し、混合物を０℃に冷却した。酢酸（０．０５４ｍＬ、０．９４ｍｍｏｌ）を加え、続いてＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１．０Ｍ、５ｗｔ。％水、０．９９ｍＬ、０．９４ｍｍｏｌ）を滴下した。反応物を０℃で５時間撹拌した後、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、次に０．０５Ｍ ＨＣｌ水溶液に注いだ。（２０ｍＬ）。２つの層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、ＡＯＭ Ｃ３を黄色がかった固体として得た（１１４ｍｇ、６６％収率）。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）：［Ｍ－Ｈ］５４９、［Ｍ＋Ｈ２Ｏ－Ｈ］５６７、［Ｍ＋Ｃｌ］５８５、（エレクトロスプレーポジティブ）：［Ｍ＋Ｈ］５５１、［Ｍ＋Ｈ２Ｏ＋Ｈ］５６９。
中間体ＡＯＭＣ４の合成：ＡＯＭ Ｃ３（０．１１４ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）、新たに活性化した４Åモレキュラーシーブ、プロトンスポンジ（０．０６６ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）、マグネチックスターラーをＮ２の下に置き、無水リン酸トリメチル（１．０ｍＬ）を加えた。反応物を－１０℃に冷却し、新たに蒸留したＰＯＣｌ３（２３μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）を滴下した。反応物を－１０℃で１時間撹拌した。ビス－トリ－ｎ－ブチルアンモニウム塩としてのピロリン酸の溶液（ＤＭＦ中０．５Ｍ、１．７ｍＬ、０．８５ミリモル）および無水トリ－ｎ－ブチルアミン（０．４１ｍＬ、１．７４ミリモル）を予混合し、氷冷活性化物に加えた。一部のヌクレオシド溶液。混合物を室温で５分間激しく撹拌した。反応混合物を、２Ｍ ＴＥＡＢ水溶液の激しく攪拌された溶液を含む別のフラスコに注いだ。（～１０ｍＬ）。反応フラスコを少量のＨ２Ｏですすぎ、洗浄液を２Ｍ ＴＥＡＢ溶液に加えた。次に、合わせた混合物を室温で４時間撹拌し、その後、溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物をＮＨ３水溶液に溶解した。（３５％、約１０ｍＬ）、室温で一晩撹拌した。反応物を真空下で濃縮し、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物を分取ＨＰＬＣによりさらに精製して、純粋なＡＯＭ Ｃ４（６２μｍｏｌ、３０％収率、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法により測定、λｍａｘ＝２９４ｎｍ、ε＝８６００Ｍ－１ ｃｍ－１）を得た。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）：［Ｍ－Ｈ］５８９。
３’－ＡＯＭ－ｆｆＣ－ＬＮ３－ＳＯ７１８１の合成：ＬＮ３－ＳＯ７１８１（０．０２０５ｍｍｏｌ）をＮ２下の無水ＤＭＡ（４ｍＬ）に溶解した。Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２８．６μＬ、０．１６４ｍｍｏｌ）を加え、続いてＴＳＴＵ（ＤＭＡ中０．１Ｍ、２３４μＬ、０．０２３４ｍｍｏｌ）を加えた。反応物をＮ２下、室温で１時間撹拌した。その間に、ＡＯＭ Ｃ４の水溶液（０．０１０１ミリモル）を減圧下で蒸発乾固させ、０．１Ｍ ＴＥＡＢ水溶液に再懸濁した。（４００μＬ）そしてＬＮ３－ＳＯ７１８１溶液に加えられる。反応物を室温で１７．５時間撹拌し、次に０．１Ｍ ＴＥＡＢ水溶液でクエンチした。（４ｍＬ）。粗生成物を、ＤＥＡＥ－セファデックスでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を分取ＨＰＬＣによりさらに精製して、純粋な３’－ＡＯＭ－ｆｆＣ－ＬＮ３－ＳＯ７１８１（６．８１モル、６７％収率、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法により決定、λｍａｘ＝６４４ｎｍ、ε＝２００００００Ｍ－１ ｃｍ－１）。を得た。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）：［Ｍ－Ｈ］１５６１、［Ｍ－２Ｈ］７８１、［Ｍ－３Ｈ］５２０。
スキーム５．３’－ＡＯＭ－ｆｆＡの合成
Figure 2022515944000036
Figure 2022515944000037
中間体ＡＯＭ Ａ２の合成：ヌクレオシドＡ１（７１６ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）をＮ２雰囲気下で１０ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解し、シクロヘキセン（４８１μＬ、４．７５ｍｍｏｌ）を加え、溶液を約－１５℃に冷却した。塩化スルフリル（蒸留、９２μＬ、１．１４ｍｍｏｌ）を滴下し、反応物を２０分間撹拌した。すべての出発物質が消費された後、シクロヘキセンの余分な部分（４８１μＬ、４．７５ｍｍｏｌ）を加え、反応物を減圧下で蒸発乾固させた。残留物を窒素で素早くパージし、次にアリルアルコール（５ｍＬ、約１００ミリモル）を０℃で撹拌しながら加えた。反応物を０℃で１時間撹拌し、次に５０ｍＬのＮａＨＣＯ３飽和水溶液でクエンチした。混合物を２×１００ｍＬの酢酸エチルで抽出した。プールした有機相を１００ｍＬの水および１００ｍＬのブラインで洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させた。残留物を、石油エーテル／ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。６０％の収率（４３５ｍｇ、０．５７ミリモル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陽イオン）ｍ／ｚ７６３（Ｍ＋Ｈ＋）；（陰イオン）ｍ／ｚ７６１（Ｍ－Ｈ＋）。
中間体ＡＯＭ Ａ３の合成：ヌクレオシドＡＯＭ Ａ２（４７６ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）をＮ２雰囲気下で乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、次にＴＨＦ（７５０μＬ、０．７５ｍｍｏｌ）中の１．０Ｍ ＴＢＡＦの溶液を加えた。溶液を室温で１．５時間撹拌した。溶液を５０ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、次に１００ｍＬのＮａＨ２ＰＯ４ ｓａｔで洗浄した。（ｐＨ＝３）、１００ｍＬのブラインを使用。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。残留物を、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨを使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。９０％の収率（２９２ｍｇ、０．５５ミリモル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陽イオン）ｍ／ｚ５２５（Ｍ＋Ｈ＋）；（陰イオン）ｍ／ｚ５２３（Ｍ－Ｈ＋）。
中間体ＡＯＭ Ａ４の合成：ヌクレオシドＡＯＭ Ａ３（２８５ｍｇ、０．５４４ｍｍｏｌ）を、減圧下、Ｐ２Ｏ５上で１８時間乾燥させた。無水リン酸トリエチル（２ｍＬ）といくつかの新たに活性化された４Åモレキュラーシーブを窒素下でそれに加え、次に反応フラスコを氷浴中で０℃に冷却した。新たに蒸留したＰＯＣｌ３（６１μＬ、０．６５ｍｍｏｌ）を滴下し、続いてＰｒｏｔｏｎＳｐｏｎｇｅ（登録商標）（１７５ｍｇ、０．８１６ｍｍｏｌ）を加えた。添加後、反応物をさらに０℃で１５分間撹拌した。次に、無水ＤＭＦ中のビス－トリ－ｎ－ブチルアンモニウム塩（５．４ｍＬ、２．７２ｍｍｏｌ）としてのピロリン酸の０．５Ｍ溶液を素早く加え、続いてすぐにトリ－ｎ－ブチルアミン（５４０μＬ、２．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を氷水浴中にさらに１０分間保持し、次にそれを１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ、２０ｍＬ）に注ぐことによってクエンチし、室温で４時間撹拌した。すべての溶媒を減圧下で蒸発させた。上記の残留物にアンモニアの３５％水溶液（２０ｍＬ）を加え、混合物を室温で少なくとも５時間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、最初に、ＤＥＡＥ－セファデックスＡ２５（１００ｇ）でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。カラムは、水性重炭酸トリエチルアンモニウムの勾配で溶出された。三リン酸を含む画分をプールし、溶媒を減圧下で蒸発乾固させた。粗物質を、ＹＭＣ－Ｐａｃｋ－Ｐｒｏ Ｃ１８カラムを使用し、０．１Ｍ ＴＥＡＢおよびアセトニトリルで溶出する分取スケールＨＰＬＣによってさらに精製した。化合物ＡＯＭ Ａ４は、トリエチルアンモニウム塩として得られた。５６％の収率（３０６μｍｏｌ）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陰イオン）ｍ／ｚ６１２（Ｍ－Ｈ＋）；（陽イオン）ｍ／ｚ６１４（Ｍ＋Ｈ＋）、７１５（Ｍ＋Ｅｔ３ＮＨ＋）。
ｆｆＡ合成の一般的な手順：色素リンカー（０．０２０ｍｍｏｌ）を２ｍＬの無水Ｎ、Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）に溶解した。Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２８．４μＬ、０．１６３ｍｍｏｌ）を加え、続いてＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボレートを０．１Ｍ無水ＤＭＡ溶液（ＴＳＴＵ、２３２μＬ）として加えた。、０．０２３ミリモル）。反応物を窒素下、室温で１時間撹拌した。その間に、三リン酸ＡＯＭ Ａ４（０．０１ｍｍｏｌ）の水溶液を減圧下で蒸発乾固し、２００μＬの０．１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）水溶液に再懸濁した。活性化された色素リンカー溶液を三リン酸に加え、反応物を室温で１８時間撹拌した。粗生成物を、最初に、ＤＥＡＥ－セファデックスＡ２５（２５ｇ）でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。三リン酸を含む画分をプールし、溶媒を減圧下で蒸発乾固させた。粗物質を、ＹＭＣ－Ｐａｃｋ－ＰｒｏＣ１８カラムを使用する分取スケールＲＰ－ＨＰＬＣによってさらに精製した。３’－ＡＯＭ－ｆｆＡ－ＬＮ３－ＮＲ７１８０Ａ：３８％の収率（３．８μｍｏｌ）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ）：（陰イオン）ｍ／ｚ１４５９（Ｍ－Ｈ＋）、７２９（Ｍ－２Ｈ＋）、４８６（Ｍ－３Ｈ＋）。３’－ＡＯＭ－ｆｆＡ－ＬＮ３－ＢＬ－ＮＲ５５０Ｓ０：３７％の収率（３．７μｍｏｌ）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ）：（陰イオン）ｍ／ｚ１７７１（Ｍ－Ｈ＋）、８８５（Ｍ－２Ｈ＋）、５８９（Ｍ－３Ｈ＋）。３’－ＡＯＭｆｆＡ－ＬＮ３－ＢＬ－ＮＲ６５０Ｃ５：５１％の収率（５１μｍｏｌ）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ）：（陰イオン）ｍ／ｚ１９１７（Ｍ－Ｈ＋）、９５８（Ｍ－２Ｈ＋）、６４５（Ｍ－３Ｈ＋）。
スキーム６．３’－ＡＯＭ－ｐｐｐＧの合成
Figure 2022515944000038
中間体ＡＯＭＧ４の合成：既知のヌクレオシドｄＧ３（１００ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）をＮ２雰囲気下で１０ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解し、シクロヘキセン（７２μＬ、０．７１４ｍｍｏｌ）を加え、溶液を－１２℃に冷却した。塩化スルフリル（蒸留、（ＤＣＭ中１Ｍ）、１７１μＬ、０．１７１ｍｍｏｌ）を滴下し、反応物を１０分間撹拌した。シクロヘキセンの余分な部分（７２μＬ、０．７１４ミリモル）を加え、反応物を－１２℃で３０分間撹拌した。反応物を減圧下で蒸発乾固し、残留物を窒素でパージし、氷冷したニートのアリルアルコール（蒸留、０．８ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）を－１２℃で撹拌しながら加えた。反応物を－１２℃で６０分間撹拌し、次に２ｍＬの飽和水溶液でクエンチした。ＮａＨＣＯ３。混合物を酢酸エチル（２ｍＬ）で分離し、水層を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を４ｍＬの水および４ｍＬのブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて原油にした。残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーで精製して、ＡＯＭＧ４を透明な油状物として得た。３６％の収率（５０．９ｍｇ、０．０７２ミリモル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陽イオン）ｍ／ｚ７１０［Ｍ＋Ｈ］＋；（陰イオン）ｍ／ｚ７０８［Ｍ－Ｈ］－。
中間体ＡＯＭ Ｇ５の合成：ヌクレオシドＡＯＭ－Ｇ４（１１１ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）をＮ２雰囲気下で乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した。酢酸（２７μＬ、０．４６８ｍｍｏｌ）を加え、続いて１．０Ｍ ＴＢＡＦのＴＨＦ溶液（２９６μＬ、０．２９６ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で５時間撹拌した。溶液を１０ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、１０ｍＬの０．０５Ｍ水溶液で洗浄した。ＨＣｌと有機物が分離された。水相を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーで精製して、ＡＯＭＧ５を白色固体として得た。４４％の収率（３２．４ｍｇ、０．０６８ミリモル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陽イオン）ｍ／ｚ４７２［Ｍ＋Ｈ］＋；（陰イオン）ｍ／ｚ４７０［Ｍ－Ｈ］－。
３’－ＡＯＭ－ｐｐｐＧの合成：新たに活性化された４Åモレキュラーシーブを有するヌクレオシドＡＯＭ－Ｇ５（７９ｍｇ、０．１６８ｍｍｏｌ）を、減圧下、Ｐ２Ｏ５上で１８時間乾燥させた。プロトンスポンジ（登録商標）（１７５ｍｇ、０．８１６ｍｍｏｌ）および無水リン酸トリエチル（０．８ｍＬ）を窒素下で加え、室温で１時間撹拌した。反応フラスコを氷浴中で０℃に冷却し、新たに蒸留したＰＯＣｌ３（１９μＬ、０．２０２ｍｍｏｌ）を滴下し、反応物を０℃で１５分間撹拌した。次に、無水ＤＭＦ中のビス－トリ－ｎ－ブチルアンモニウム塩（１．６８ｍＬ、０．８４ミリモル）としてのピロリン酸の０．５Ｍ溶液を素早く加え、すぐにトリ－ｎ－ブチルアミン（１６８μＬ、０．７０５ミリモル）を加えた。反応物を氷／水浴から取り出し、５分間激しく撹拌し、次にそれを１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ、６ｍＬ）に注ぐことによりクエンチし、室温で１８時間撹拌した。すべての溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物を３５％アンモニア水溶液（１０ｍＬ）に溶解し、室温で少なくとも５時間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で蒸発させ、さらに水と共蒸発させた。粗生成物を、最初に、ＤＥＡＥ－セファデックスＡ２５（５０ｇ）でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。カラムは、水性トリエチルアンモニウムの直線勾配で溶出された。三リン酸を含む画分を集め、溶媒を減圧下で蒸発乾固させた。粗物質を、ＹＭＣ－Ｐａｃｋ－ＰｒｏＣ１８カラムを使用する分取スケールＨＰＬＣによってさらに精製した。３’－ＡＯＭ－ｐｐｐＧはトリエチルアンモニウム塩として得られた。２４％の収率（３９．７μｍｏｌ）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陰イオン）ｍ／ｚ５７６［Ｍ－Ｈ］－；（陽イオン）ｍ／ｚ５７８［Ｍ＋Ｈ］＋。
３’－ＡＯＭ－ｆｆＴ－ＬＮ３－ＮＲ５５０Ｓ０は、３’－ＡＯＭｆｆＡおよびｆｆＣの調製で説明したのと同様の方法で合成された。
スキーム７．３’－ＡＯＭ－ｆｆＴ－ＬＮ３’－ＮＲ５５０Ｓ０の合成
Figure 2022515944000039
中間体Ｔ１の合成：５－ヨード－２’－デオキシウリジン（３ｇ、８．４ミリモル）および酢酸パラジウム（ＩＩ）（１．６ｇ、７．１４ミリモル）を乾燥脱気ＤＭＦに溶解し、次にＮ－アリルトリフルオロアセトアミド（６．４ｍＬ、４２ミリモル）に溶解した。）が追加された。溶液を真空下に置き、次に窒素で３回パージし、次に脱気したトリエチルアミン（２．３ｍＬ、１６．８ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を８０℃に２時間加熱した。黒色の混合物を室温まで冷却し、次に５０ｍＬのメタノールで希釈した。約０．５ｇの活性炭を加え、溶液をセライトで濾過し、次に減圧下で蒸発させて、褐色の濃厚な油を得た。この粗生成物を、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨを使用するシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製した。収量：（２．２７ｇ、５．９９ミリモル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陰イオン）ｍ／ｚ３７８（Ｍ－Ｈ＋）。
中間体Ｔ２の合成：５－［３－（２，２，２－トリフルオロアセトアミド）－アリル］－２’－デオキシウリジン（Ｔ１）（２．５５ｇ、６．７２ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦに溶解した。イミダゾール（１．３７ｇ、２０．１ミリモル）を加え、続いて４－（ジメチルアミノ）ピリジン（４１０ｍｇ、３．３６ミリモル）を加えた。反応物を０℃に冷却し、次にｔｅｒｔ－ブチル（クロロ）ジフェニルシラン（１．９２ｍＬ、７．３９ｍｍｏｌ）を３０分間隔で３回に分けてゆっくりと加えた。反応物を０℃で６時間撹拌した。次に、溶媒を蒸発させ、残留物を２００ｍＬのＥｔＯＡｃに再懸濁し、２×２００ｍＬの水溶液で洗浄した。飽和ＮａＨＣＯ３と２００ｍＬの水、次に１００ｍＬのブライン。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。粗生成物を、ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃを使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。６８％の収率（２．８０６ｇ、４．５４ミリモル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陽イオン）ｍ／ｚ６１８（Ｍ＋Ｈ＋）；（陰イオン）ｍ／ｚ６１６（Ｍ－Ｈ＋）。
中間体Ｔ３の合成：５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－５－［３－（２，２，２－トリフルオロアセトアミド）－アリル］－２’－デオキシウリジン（Ｔ２）（２．８ｇ、４．５３ミリモル）を溶解した１０ｍＬの無水ＤＭＳＯ（１３６ミリモル）中、次に氷酢酸（１６ｍＬ、２７２ミリモル）および無水酢酸（１６ｍＬ、１５８ミリモル）を加えた。反応物を５０℃に６時間加熱し、次に２００ｍＬの水溶液でクエンチした。飽和ＮａＨＣＯ３。溶液の泡立ちが止まった後、２ｘ１５０ｍＬのＥｔＯＡｃで抽出した。有機相をプールし、２ｘ２００ｍＬの水溶液で洗浄した。飽和ＮａＨＣＯ３、２００ｍＬの水および１００ｍＬのブライン。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。粗生成物を、ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃを使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。７７％の収率（２．３７５ｇ、３．５１ミリモル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陽イオン）ｍ／ｚ６７８（Ｍ＋Ｈ＋）；（陰イオン）ｍ／ｚ６７６（Ｍ－Ｈ＋）。
中間体Ｔ４の合成：５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－メチルチオメチル－５－［３－（２，２，２－トリフルオロアセトアミド）－アリル］－２’－デオキシウリジン（Ｔ３）（３１０ｍｇ、０．４５ミリモル）をＮ２雰囲気下で５ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解し、シクロヘキセン（２２８μＬ、２．２５ミリモル）を加え、溶液を約－１５℃に冷却した。塩化スルフリル（蒸留、５５μＬ、０．６７５ｍｍｏｌ）を滴下し、反応物を２０分間撹拌した。すべての出発物質が消費された後、シクロヘキセンの余分な部分（２２８μＬ、２．２５ミリモル）を加え、反応物を減圧下で蒸発乾固させた。残留物を窒素で素早くパージし、次に氷冷アリルアルコール（２．５ｍＬ）を０℃で撹拌しながら加えた。反応物を０℃で３５分間撹拌し、次に２５ｍＬの飽和水溶液でクエンチした。次に、ＮａＨＣＯ３を１００ｍＬの飽和水溶液でさらに希釈する。ＮａＨＣＯ３。混合物を２×５０ｍＬの酢酸エチルで抽出した。プールした有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。残留物を、ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。６９％の収率（２１４ｍｇ、０．３１１ミリモル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陽イオン）ｍ／ｚ６８８（Ｍ＋Ｈ＋）；（陰イオン）ｍ／ｚ６８６（Ｍ－Ｈ＋）。
中間体Ｔ５の合成：５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－アリルオキシメチル－５－［３－（２，２，２－トリフルオロアセトアミド）－アリル］－２’－デオキシウリジン（Ｔ４）（２１０ｍｇ、０．３０５ｍｍｏｌ）をＮ２雰囲気下で乾燥ＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解した。ＴＨＦ中の１．０ＭＴＢＡＦの溶液（３６７μＬ、０．３６７ミリモル）を加えた。溶液を室温で３時間撹拌した。溶液を５０ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、次に５０ｍＬのＮａＨ２ＰＯ４ ｓａｔで洗浄した。（ｐＨ＝３）、および５０ｍＬの水を使用する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。残留物を、ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。９５％の収率（１３０ｍｇ、０．２８９ミリモル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陰イオン）ｍ／ｚ４４８（Ｍ－Ｈ＋）、４８４（Ｍ＋Ｃｌ－）。
中間体Ｔ６の合成：３’－Ｏ－アリルオキシメチル－５－［３－（２，２，２－トリフルオロアセトアミド）－アリル］－２’－デオキシウリジン（Ｔ５）（１２０ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ、）を減圧下で乾燥させた。Ｐ２Ｏ５で１８時間。無水リン酸トリエチル（１ｍＬ）といくつかの新たに活性化された４Åモレキュラーシーブを窒素下でそれに加え、次に反応フラスコを０℃に冷却した。新たに蒸留したＰＯＣｌ３（３０μＬ、０．３２ｍｍｏｌ）を滴下し、続いてＰｒｏｔｏｎＳｐｏｎｇｅ（登録商標）（８５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を加えた。添加後、反応物をさらに０℃で１５分間撹拌した。次に、無水ＤＭＦ中のビス－トリ－ｎ－ブチルアンモニウム塩（２．７ｍＬ、１．３３ミリモル）としてのピロリン酸の０．５Ｍ溶液を素早く加え、続いてすぐにトリ－ｎ－ブチルアミン（２７０μＬ、１．２ミリモル）を加えた。反応物を氷水浴中にさらに１０分間保持し、次にそれを１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ、１０ｍＬ）に注ぐことによってクエンチし、室温で４時間撹拌した。すべての溶媒を減圧下で蒸発させた。上記の残留物にアンモニアの３５％水溶液（１０ｍＬ）を加え、混合物を室温で１８時間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物を１０ｍＬの０．１ＭＴＥＡＢに再懸濁し、濾過した。濾液を最初に、ＤＥＡＥ－セファデックスＡ２５（１００ｇ）でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。カラムを水性重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）で溶出した。三リン酸を含む画分をプールし、溶媒を減圧下で蒸発乾固させた。粗物質を、ＹＭＣ－Ｐａｃｋ－ＰｒｏＣ１８カラムを使用する分取スケールＨＰＬＣによってさらに精製した。化合物Ｔ６をトリエチルアンモニウム塩として得た。３３％の収率（８９μｍｏｌ）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陰イオン）ｍ／ｚ５９２（Ｍ－Ｈ＋）、２９５（Ｍ－２Ｈ＋）。
３’－ＡＯＭ－ｆｆＴ－ＬＮ３’－ＮＲ５５０Ｓ０の合成：乾燥した既知の化合物ＬＮ３－ＮＲ５５０Ｓ０（０．０１５ｍｍｏｌ）をＮ２下の無水ＤＭＡ（２ｍＬ）に溶解した。Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１７μＬ、０．１ｍｍｏｌ）を加え、続いてＴＳＴＵ（ＤＭＡ中０．１Ｍ、１８０μＬ、０．０１８ｍｍｏｌ）を加えた。反応物をＮ２下、室温で１時間撹拌した。その間に、Ｔ６の水溶液（０．０１ミリモル）を減圧下で蒸発乾固し、０．１Ｍ ＴＥＡＢ水溶液に再懸濁した。（２００μＬ）そしてＬＮ３－ＮＲ５５０Ｓ０溶液に加えられる。反応物を室温で１８時間撹拌し、次に０．１ＭＴＥＡＢ水溶液でクエンチした。（４ｍＬ）。粗生成物を、ＤＥＡＥ－セファデックスでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を分取ＨＰＬＣによりさらに精製して、純粋な３’－ＡＯＭ－ｆｆＴ－ＬＮ３’－ＮＲ５５０Ｓ０を得た。６７％の収率（４１・ｍｏｌ、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法で測定、λｍａｘ＝５５０ｎｍ、ε＝１２５０００Ｍ－１ｃｍ－１）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ）：（陰イオン）ｍ／ｚ１５２１（Ｍ－Ｈ＋）、７６１（Ｍ－２Ｈ＋）、５０７（Ｍ－３Ｈ＋）。
（合成によるシーケンシング実験）
続いて、イルミナＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）機器を使用したシーケンスでｆｆＮをテストした。これらのｆｆＮを含む新しい組み込みミックスを除いて、すべての標準的な市販試薬が使用された。標準の２ｘ１５０レシピが使用された。標準的な合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）プロトコルに加えて、パラジウム開裂混合物の溶液中での５秒間のインキュベーション（実施例４に記載のＤＥＥＡでＰｄ：ＴＨＰ＝１／５）を追加して、３’－ＡＯＭのブロックを解除した。
最初の実験では、次のｆｆＮを組み込みミックスで使用した：３’－ＡＯＭ－ｆｆＴ－ＬＮ３－ＮＲ５５０Ｓ０、３’－ＡＯＭ－ｆｆＡ－ＬＮ３－ＢＬ－ＮＲ５５０Ｓ０、３’－ＡＯＭ－ｆｆＡ－ＬＮ３－ＢＬ－ＮＲ６５０Ｃ５、３’－ＡＯＭ－ｆｆＡ－ＬＮ３－ＮＲ７１８０Ａ、３’－ＡＯＭ－ｆｆＣ－ＬＮ３－ＳＯ７１８１、および３’－ＡＯＭ－ｐｐｐＧ（ダークＧ）。リード１のシーケンス結果を以下に要約する。
Figure 2022515944000040
２番目の実験では、上記の３’－ＡＯＭ－ｐｐｐＧの調製と同様に非標識３’－ＡＯＭ－ｐｐｐＴを合成した（ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ）：（負イオン）ｍ／ｚ５５１（Ｍ－Ｈ＋））。市販のグリーンｆｆＧ－ＬＮ３－ＰＥＧ１２－ＡＴＴＯ５３２（イルミナ４チャンネルシステムで使用）の存在下でシーケンスに使用され、上記の最初の実験で説明したものと同じｆｆＡおよびｆｆＣが使用された。結果を以下に要約する。フェージング値とプレフェージング値に大幅な改善が見られ、信号の減衰は観察されなかった（図３Ａ）。さらに、読取り１と読取り２の両方のエラー率も減少した。
Figure 2022515944000041
別の実験では、３’－ＡＯＭ－ｆｆＴ－ＬＮ３’－ＮＲ５５０Ｓ０、３’－ＡＯＭ－ｆｆＡ－ＬＮ３－ＢＬ－ＮＲ５５０Ｓ０、３’－ＡＯＭ－ｆｆＡ－ＬＮ３－ＢＬ－ＮＲ６５０Ｃ５、３’－ＡＯＭ－ｆｆＡ－ＬＮ３－を含む組み込みミックスＮＲ７１８０Ａ、３’－ＡＯＭ－ｆｆＣ－ＬＮ３－ＳＯ７１８１、および３’－ＡＯＭ－ｐｐｐＧ（ダークＧ）を使用した。以前の実行と同様に、パラジウム触媒（Ｐｄ／ＴＨＰ＝１：１０；例４で説明した１００ｍＭ ＤＥＥＡ）を含む切断混合物との５秒間のインキュベーションを標準ＳＢＳサイクルに追加した。標準のＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用したが、取り込み時間は２倍であった。シグナル減衰表現型は観察されなかった（図３Ｂ）。さらに、これらのシーケンス結果は、標準のアジドメチルブロッキング基を持つｆｆＮを使用した市販のＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）ラン（平均３；Ｎ＝３）と比較された。エラー率はほぼ同じであることが観察された（図３Ｃ）。シーケンシングの結果を以下に要約する。
Figure 2022515944000042
さらに、３’－ＡＯＭブロッキング基を持つｆｆＮの主要なシーケンスメトリックを、ＤＮＡポリメラーゼＰｏｌ ８１２を含む標準のＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）市販キットによって生成されたものと比較し、比較結果を図４Ａに示す。３’－ＡＯＭ－ｆｆＮの安定性が向上したため、非常に低いプレフェージングが観察された。ただし、２倍の取り込み時間を使用した場合でも、位相は依然として上昇していた。
さらに別の実験では、市販のＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）キット（Ｐｏｌ ８１２）のＤＮＡポリメラーゼの代わりに、別のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ １９０１）を使用した。Ｐｏｌ １９０１は、上記の２倍の取り込み時間の代わりに、シーケンスで標準の１倍の取り込み時間を可能にした。さらに、Ｐｄ切断混合物でのインキュベーションは、標準的な実行と比較して半分に減少した。これにより、ＳＢＳケミストリーサイクル全体で１０％の時間を節約できた。シーケンシングメトリクスは大幅に改善され、３’－Ｏ－アジドメチルブロッキング基を含む標準的な市販キットから得られた値を上回った（図４Ｂ）。
（シーケンシングにおける３’ブロッキング基安定性テスト）
３’－ＡＯＭによるｆｆＮの安定性の向上を実証するために、３’－Ｏ－アジドメチル基を持つ標準のＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）ｆｆＮと並べて比較した。２セットのｆｆＮは、ＤＮＡポリメラーゼのみを除く標準的な取り込み混合製剤で、４５℃で数日間インキュベートされた。各時点で、ＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）にロードする直前に新しいポリメラーゼを添加して取り込みミックスを完了した。前述のシーケンス条件が使用された。プレフェーズ％は、混合物に存在する３’ＯＨ－ｆｆＮのパーセンテージの直接的な指標であるため、３’ブロックグループの安定性と直接相関する。ｆｆＮの両方のセットのプレフェーズ値が記録され、プロットされた（図５）。４５℃では、ｆｆＮを含む３’－ＡＯＭは、３’－Ｏ－アジドメチル基を含む標準のｆｆＮよりも６倍安定しているように見えることが観察された。シーケンシングメトリクスは、溶液中での安定性アッセイ中に観察された傾向も確認した－３’－ＡＯＭブロックは３’－Ｏ－アジドメチル基よりも有意に安定していた。
（実施例６．３’－Ｏ－チオカルバメートブロックヌクレオシドの調製）
この例では、種々の３’－Ｏ－チオカルバメートで保護されたＴヌクレオシドをスキーム８に従って調製した。
スキーム８．３’－Ｏ－ジメチルチオカルバメートＴヌクレオシドの合成
Figure 2022515944000043
Ｔ－７の調製：オーブンで乾燥させた窒素パージした１００ｍＬフラスコに５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）チミジン（１．０ｇ、１．８３６ｍｍｏｌ）を加えた。これを無水ＤＭＦ（３ｘ２０ｍＬ）と共蒸発させ、窒素下に置きた。無水ＤＣＭ（９．２ｍＬ）および４－ジメチルアミノピリジン（２２４ｍｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）を加え、均一な溶液が形成されるまで室温で撹拌した。次に、１，１’－チオカルボニルジイミダゾール（３６０ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ）を窒素流にすばやく加え、反応物を再封し、すべての出発物質が消費されるまで室温で２時間撹拌した。反応混合物をシリカゲルのパッドを通して濾過し、フィルターケーキをＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で洗浄する。揮発性物質を真空で除去し、粗残留物をさらに精製することなく使用した。
Ｔ－８の調製：前のステップからの化合物Ｔ－７を、真空中で乾燥させた直後に使用した。残留物を２５ｍＬの丸底フラッシュ中で窒素下に置き、ジメチルアミン（ＴＨＦ中２Ｍ、７．３ｍＬ、１４．６ｍｍｏｌ）を加え、ＴＬＣに従ってすべての出発物質が消費されるまで反応物を２時間撹拌した。すべての揮発性物質を真空で除去して透明な粗残留物を形成し、これをシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、Ｔ－８を白色の固体として得た。収量：１．１５ｇ（９９％）。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）６３０．２３［Ｍ－Ｈ］。
Ｔ－９の調製：出発ヌクレオシドＴ－８（３２０ｍｇ、０．５０４ｍｍｏｌ）を、空気中の５０ｍＬ丸底フラスコ内の最小アセトニトリルに溶解した。ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ ５：１（１２．５ｍＬ：２．５ｍＬ）の溶液を一度に加え、すべての出発物質が消費されるまで（２～４時間）、反応物を室温で撹拌した。真空下で、すべての揮発性物質を蒸発させ、残留物をトルエン（２ｘ６０ｍＬ）で共蒸発させると、粗生成物がオフホワイトの固体として得られる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、Ｔ－９を白色固体として得た。収量：１２３ｍｇ（７４％）。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）［Ｍ－Ｈ］３２８．１０。
対応するＭｅＮＨ２またはＮＨ３を使用した同様の合成手順に従って、他の２つのチオカルバメート保護基を持つヌクレオシドも調製した。一般的な反応スキームを以下に示す。
Figure 2022515944000044
（３’－Ｏ－チオカルバメートブロッキング基の安定性試験）
５’－ｍＰ ３’－ＤＭＴＣ Ｔヌクレオチドの安定性試験は、標準の５’－ｍＰ３’－Ｏ－アジドメチルＴヌクレオチドを含む取り込み緩衝液中で並べて実施した。
Figure 2022515944000045
５’－ｍＰ ３’－ＤＭＴＣ Ｔと５’－ｍＰ ３’－Ｏ－アジドメチルＴの両方で、最終溶液量は１ｍＬで、対応するヌクレオチドの最終濃度は両方とも０．１ｍＭであった。緩衝水溶液の他の成分には、エタノールアミン（ＥＡ）、エタノールアミンＨＣｌ、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）、およびＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）が含まれる。緩衝液の濃度は次のとおりである。０．５ＭＥＡ緩衝液、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ。
（安定性試験方法）
２００μＬの１０ｘ緩衝液を１．７ｍＬポリプロピレンスナップロックマイクロチューブに加え、適切な量の１８ｍΩ水で希釈した。次に、対応するヌクレオシドを添加し、バイアルを密封し、反転、穏やかに攪拌、またはマイクロピペットでポンピングすることにより混合した。４０μＬのアリコートを採取し、ＨＰＬＣで分析して、開始値（またはｔ＝０）として機能させた。次に、バイアルを６５℃に設定された予熱された加熱マントルに入れ、アルミホイルの厚い層で覆い、１か月間加熱する。４０μＬのアリコートを定期的に採取し（１週目：１日１回、２～４週目：２日ごとに１回）、ＨＰＬＣで分析して、サンプル中の出発物質の割合とブロック解除された（３’－ＯＨ）ヌクレオチドの割合を決定した。ヌクレオチドピークと３’ＯＨピークの面積を測定することにより、ＨＰＬＣ分析を実施した。これらの値は、グラフで表示され、サンプル間の取り込みバッファーの安定性を比較するために使用される、ブロック解除されたヌクレオチドのパーセンテージを計算するために使用された。図６は、６５℃で３’－Ｏ－アジドメチルブロッキング基でブロックされたヌクレオチドに対する３つの異なるチオカルバメート３’ブロッキングヌクレオチドの安定性の比較結果を示している。３’－ＯＣ（＝Ｓ）ＮＨ２または３’－ＯＣ（＝Ｓ）ＮＨＣＨ３を含むヌクレオチドは、標準の３’－Ｏ－アジドメチル基で保護されたヌクレオチドよりも安定性が低いが、３’－ＤＭＴＣを含むヌクレオチドは改善されたことが観察された。９日間のテスト期間中の安定性。そのため、ＤＭＴＣは標準のアジドメチルブロッキング基よりも優れた安定性を示した。
（例７．３’－Ｏ－チオカルバメートブロッキング基脱ブロッキングテスト）
この例では、５’－ｍＰ ３’－ＤＭＴＣ Ｔおよび標準の５’－ｍＰ ３’－Ｏ－アジドメチルＴヌクレオチドの脱ブロック化または脱ブロック化テストが、各ブロッキング基に固有のソリューションで個別に実行された。条件は、イルミナの標準的なブロック解除試薬を可能な限り模倣し、同じ方法論に従うように策定された。活性脱ブロック試薬、バッファー、ヌクレオシドの濃度はすべてのテストで同じに保たれているが、各成分の同一性は独特であった。このように、個々の脱ブロック化化学物質間で観察された速度の違いは、製剤の濃度の違いによるものではない。
Figure 2022515944000046
（ブロック解除テストの一般的な方法論）
各反応成分は、１８ｍΩの水中で濃縮ストックとして個別に処方され、適切に保管され、アリコートは以下に示す特定の順序で組み合わされた。予め処方された脱ブロック試薬の添加により反応を開始した。最終濃度：ヌクレオシド（０．１ｍＭ）、活性脱ブロック試薬（１ｍＭ）、添加剤（脱ブロック試薬に固有）、バッファー（１００ｍＭ）。最終容量：２０００μＬ。
３ｍＬのガラスバイアルに、事前に処方された緩衝液、続いて事前に処方された添加剤溶液を加えた。これを正しい量の１８ｍΩの水で希釈し、１０分間撹拌した。次に、ヌクレオチド溶液のアリコートを加え、５分間撹拌した。次に、４０μＬのアリコートを採取し、クエンチング試薬を添加して、参照（またはｔ＝０分）ピークとしてＨＰＬＣで分析した。次に、脱ブロック試薬を一度に攪拌溶液に加え、計時を開始した。指定された時点で、４０μＬのアリコートを採取し、適切なクエンチング試薬で直ちにクエンチし、ＨＰＬＣで分析して、これらの指定された時点で発生したブロック解除されたヌクレオチドの量を決定した。結果はグラフでプロットされ、ブロック解除の効率と有効性を比較するために使用される。
（ＤＭＴＣ脱ブロッキング）
ヌクレオチド：５’－ｍＰ ３’－ＤＭＴＣ Ｔ．アクティブ脱ブロック試薬：ＮａＩＯ４（１８ｍΩ水中で０．１Ｍ）またはＯｘｏｎｅ（登録商標）（１８ｍΩ水中で０．１Ｍ）。添加剤：なし。ＮａＩＯ４用バッファー：ｐＨ６．７５リン酸バッファー（１８ｍΩ水中１Ｍ）。Ｏｘｏｎｅ（登録商標）用バッファー：ｐＨ８．６５リン酸バッファー（１８ｍΩ水中１Ｍ）。急冷試薬：チオ硫酸ナトリウム。３’－Ｏ－アジドメチル脱ブロック化条件は、例３で説明したものと同じである。
ＨＰＬＣ分析は、ヌクレオシドピーク、３’－ＯＨピーク、およびＨＰＬＣクロマトグラムに表示されるその他のヌクレオチドピークの面積を測定することによって実行された。これらの値を使用して、開始ヌクレオチドとブロック解除されたヌクレオチドのパーセンテージを計算し、グラフで表示して、サンプル間のブロック解除率、効率、および有効性を比較した。比較結果を図７に示す。ＮａＩＯ４によるＤＭＴＣの脱ブロック化は効率的ではないことが観察された。ただし、ＤＭＴＣをＯｘｏｎｅ（登録商標）で切断した場合、ＤＭＴＣブロッキング基を持つヌクレオチドの残りの出発物質の割合は大幅に少なくなった。要約すると、ＤＭＴＣは、標準のアジドメチルブロッキング基の脱ブロック化率よりも優れた脱ブロック化率（Ｏｘｏｎｅ（登録商標）を使用）を示している。

Claims (50)

  1. ３’－炭素原子に共有結合した構造
    Figure 2022515944000047
     を形成する除去可能な３’－ＯＨブロッキング基を有するリボースまたはデオキシリボースを含むヌクレオシドまたはヌクレオチドであって：
    各Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルコキシ、シアノ、ハロゲン、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよいアラルキルであり；
    各Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、シアノ、またはハロゲンであり；
    あるいは、Ｒ１ａおよびＲ２ａは、それらが結合している原子と一緒になって、置換されていてもよい５～８員のヘテロシクリル基を形成し；
    Ｒ３は、Ｈ、置換されていてもよいＣ２～Ｃ６アルケニル、置換されていてもよいＣ３～Ｃ７シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ２－Ｃ６アルキニル、または置換されていてもよい（Ｃ１～Ｃ６アルキレン）Ｓｉ（Ｒ４）３であり；かつ
    各Ｒ４は、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、または置換されていてもよいＣ６～Ｃ１０アリールであり；ただし、各Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａおよびＲ２ｂがＨである場合、Ｒ３は、Ｈではない、
    ヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  2. Ｒ１ａおよびＲ１ｂの少なくとも一方が、Ｈである、請求項１に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  3. 各Ｒ１ａおよびＲ１ｂが、Ｈである、請求項２に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  4. Ｒ２ａおよびＲ２ｂの各々が、独立して、Ｈ、ハロゲンまたはＣ１～Ｃ６アルキルである、請求項１～３のいずれか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  5. 各Ｒ２ａおよびＲ２ｂが、Ｈである、請求項４に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  6. 各Ｒ２ａおよびＲ２ｂが、独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキルまたはハロゲンである、請求項４に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  7. 各Ｒ２ａおよびＲ２ｂが、メチルである、請求項６に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  8. Ｒ２ａが、Ｈであり、Ｒ２ｂが、ハロゲンまたはＣ１～Ｃ６アルキルである、請求項４記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  9. Ｒ３が、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキルおよびそれらの組合せからなる群から独立して選択される１以上の置換基で置換されていてもよいＣ２～Ｃ６アルキニルである、請求項１～７のいずれか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  10. Ｒ３が、
    Figure 2022515944000048
     である、請求項９に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  11. Ｒ３が、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキルおよびそれらの組合せからなる群から独立して選択される１以上の置換基で置換されていてもよいＣ２～Ｃ６アルケニルである、請求項１～７のいずれか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  12. Ｒ３が、
    Figure 2022515944000049
     である、請求項１１に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  13. Ｒ３が、置換されていてもよい（Ｃ１～Ｃ６アルキレン）Ｓｉ（Ｒ４）３であり、各Ｒ４が、Ｃ１～Ｃ６アルキルである、請求項１から７のいずれか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  14. Ｒ３が、－（ＣＨ２）－ＳｉＭｅ３である、請求項１３に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  15. Ｒ１ａおよびＲ２ａが、それらが結合している原子と一緒になって、６員ヘテロシクリルを形成する、請求項１に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  16. ６員ヘテロシクリル基が、構造
    Figure 2022515944000050
     を有する、請求項１５に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  17. 各Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂおよびＲ３が、Ｈである、請求項１５または１６に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  18. ３’－ＯＨブロッキング基が、リボースまたはデオキシリボースの３’－炭素に共有結合した：
    Figure 2022515944000051
     からなる群から選択される構造を含む、請求項１に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  19. ３’－炭素原子に共有結合した構造
    Figure 2022515944000052
     を形成する除去可能な３’－ＯＨブロッキング基を有するリボースまたはデオキシリボースを含むヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、
    Ｒ５およびＲ６の各々は、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２～Ｃ８アルコキシアルキル、任意で置換された－（ＣＨ２）ｍ－フェニル、任意で置換された－（ＣＨ２）ｎ－（５または６員のヘテロアリール）、任意で置換された－（ＣＨ２）ｋ－Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、または任意で置換された－（ＣＨ２）ｐ－（３～７員のヘテロシクリル）であり；
    －（ＣＨ２）ｍ－、－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｋ－、および－（ＣＨ２）ｐ－の各々は、任意で置換され；かつ
    ｍ、ｎ、ｋ、およびｐの各々は、独立して、０、１、２、３、または４である、
    ヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  20. Ｒ５およびＲ６の少なくとも一方が、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルである、請求項１９に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  21. 各Ｒ５およびＲ６が、Ｈである、請求項２０に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  22. Ｒ５がＨであり、Ｒ６が、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、置換されていてもよい－（ＣＨ２）ｍ－フェニルまたは置換されていてもよい－（ＣＨ２）ｎ－６員ヘテロアリールであり、かつ、ｍおよびｎの各々が、０または１である。請求項２０に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  23. 各Ｒ５およびＲ６が、Ｃ１～Ｃ６アルキルである、請求項２０に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  24. 各Ｒ５およびＲ６が、メチルである、請求項２３に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  25. ３’－ＯＨブロッキング基が：
    Figure 2022515944000053
     からなる群から選択される構造を含む、請求項１９に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  26. ヌクレオシドまたはヌクレオチドが、任意で切断可能なリンカーを介して、検出可能な標識に共有結合している、請求項１～２５のいずれか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  27. 検出可能な標識が、切断可能なリンカーを介してヌクレオシドまたはヌクレオチドの核酸塩基に共有結合している、請求項２６記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  28. 検出可能な標識が、切断可能なリンカーを介してヌクレオシドまたはヌクレオチドの３’－酸素に共有結合している、請求項２６に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  29. リンカーが、アジド部分、－Ｏ－アリル部分、ジスルフィド部分、アセタール部分、またはチオカルバメート部分を含む切断可能なリンカーである、請求項２７または２８に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  30. ３’－ＯＨブロッキング基および切断可能なリンカーが、同じ化学反応条件下で除去され得る、請求項２７～２９のいずれか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  31. ２’デオキシリボースを含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  32. ヌクレオチドが、ヌクレオチド三リン酸である、請求項３１に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
  33. 請求項１～３２のいずれか一項に記載のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
  34. シーケンシング反応において標的一本鎖ポリヌクレオチドに相補的な成長中のポリヌクレオチドを調製する方法であって、請求項１～３２のいずれか一項に記載のヌクレオチドを、成長中の相補的ポリヌクレオチドの中へ組み込むことを含み、
    ヌクレオチドの組込みが、成長する相補的ポリヌクレオチドの中への後続のヌクレオチドの導入を防止する、方法。
  35. ヌクレオチドの取込みが、ポリメラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、または逆転写酵素によって達成される、請求項３４に記載の方法。
  36. 標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、以下：
    （ａ）請求項２６～３２のいずれか一項に記載のヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチド鎖の少なくとも一部に相補的なコピーポリヌクレオチド鎖の中へ取り込むこと；
    （ｂ）コピーポリヌクレオチド鎖の中へ取り込まれたヌクレオチドの同一性を検出すること；および
    （ｃ）コピーポリヌクレオチド鎖の中へ取り込まれたヌクレオチドから、標識および３’ブロッキング基を化学的に除去すること
    を含む、方法。
  37. （ｄ）化学的に除去された標識および３’ブロッキング基をコピーポリヌクレオチド鎖から洗浄することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
  38. ステップ（ａ）～（ｄ）を、テンプレートポリヌクレオチド鎖の前記一部の配列が決定されるまで繰り返すことをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
  39. ステップ（ａ）～（ｄ）が、少なくとも５０回繰り返される、請求項３７に記載の方法。
  40. コピーポリヌクレオチド鎖の中へ取り込まれたヌクレオチド由来の標識および３’ブロッキング基が、単一の化学反応で除去される、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. ステップ（ｃ）が、取り込まれたヌクレオチドを、パラジウム触媒を含む切断溶液と接触させることを含む、請求項４０に記載の方法。
  42. コピーポリヌクレオチド鎖の中へ取り込まれたヌクレオチド由来の標識および３’ブロッキング基が、２つの別個の化学反応で除去される、請求項 ３６～３９のいずれか一項に記載の方法。
  43. ステップ（ｃ）が、組み込まれたヌクレオチドを、ホスフィンを含む切断溶液、およびパラジウム触媒を含む切断溶液と接触させることを含む、請求項４１に記載の方法。
  44. ホスフィンがトリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン、トリス（ヒドロキシエチル）ホスフィンまたはトリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィンである、請求項４１または４３に記載の方法。
  45. パラジウム触媒を含む切断溶液が、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、炭酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、およびそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の緩衝試薬をさらに含む、請求項４１、４３または４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 緩衝試薬が、エタノールアミン（ＥＡ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、グリシン、炭酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、２－ジメチルアミノメタノール（ＤＭＥＡ）、２－ジエチルアミノメタノール（ＤＥＥＡ）、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラエチルエチレンジアミン（ＴＥＥＤＡ）、およびそれらの組み合わせ。からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
  47. 請求項１～３２のいずれか一項に記載の１以上のヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むキット。
  48. 酵素および酵素の作用に適した緩衝液をさらに含む、請求項４７に記載のキット。
  49. 酵素がポリメラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、または逆転写酵素である、請求項４８記載のキット。
  50. ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４９に記載のキット。
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