BR112020026668A2 - Nucleosídeos ou nucleotídeos, oligonucleotídeo, método de preparação de um polinucleotídeo, método de determinação da sequência de um polinucleotídeo e kit - Google Patents

Abstract

nucleosídeos ou nucleotídeos, oligonucleotídeo, método de preparação de um polinucleotídeo, método de determinação da sequência de um polinucleotídeo e kit. modalidades da presente divulgação se referem a moléculas de nucleotídeo e nucleosídeo com grupos bloqueadores de acetal ou tiocarbamato 3?-oh. também são fornecidos na presente invenção métodos de preparação de tais moléculas de nucleotídeos e nucleosídeos, e os usos de nucleotídeos totalmente funcionalizados contendo o grupo bloqueador 3'-oh para aplicações de sequenciamento.

Description

NUCLEOSÍDEOS OU NUCLEOTÍDEOS, OLIGONUCLEOTÍDEO, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UM POLINUCLEOTÍDEO, MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DA

SEQUÊNCIA DE UM POLINUCLEOTÍDEO E KIT Antecedentes Campo

[001] A presente divulgação em geral se refere a nucleotídeos, nucleosídeos ou oligonucleotídeos compreendendo grupos protetores de 3'- hidróxi e seu uso em métodos de sequenciamento de polinucleotídeos. Métodos de preparação de nucleotídeos, nucleosídeos ou oligonucleotídeos 3'- hidróxi-protegidos também são divulgados. Descrição do Estado da Arte

[002] Os avanços no estudo das moléculas têm sido conduzidos, em parte, pelo aprimoramento das tecnologias utilizadas para caracterizar as moléculas ou suas reações biológicas. Em particular, o estudo dos ácidos nucléicos DNA e RNA tem se beneficiado do desenvolvimento de tecnologias usadas para análise de sequência e o estudo de eventos de hibridização.

[003] Um exemplo das tecnologias que melhoraram o estudo dos ácidos nucleicos é o desenvolvimento de matrizes fabricadas de ácidos nucleicos imobilizados. Essas matrizes consistem tipicamente em um arranjo de alta densidade de polinucleotídeos imobilizados em um material de suporte sólido. Veja, por exemplo, Fodor et al., Trends Biotech. 12: 19-26, 1994, que descreve maneiras de montar os ácidos nucleicos usando uma superfície de vidro sensibilizada quimicamente protegida por uma máscara, mas exposta em áreas definidas para permitir a fixação de fosforamiditos de nucleotídeos adequadamente modificados. Arranjos fabricados também podem ser produzidos pela técnica de “marcação” de polinucleotídeos conhecidos em um suporte sólido em posições predeterminadas (por exemplo, Stimpson et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 6379-6383, 1995).

[004] Uma forma de determinar a sequência de nucleotídeos de um ácido nucleico ligado a uma matriz é chamada de “sequenciamento por síntese” ou “SBS”. Esta técnica para determinar a sequência de DNA requer idealmente a incorporação controlada (isto é, uma de cada vez) do nucleotídeo complementar correto oposto ao ácido nucleico que está sendo sequenciado. Isso permite o sequenciamento preciso adicionando nucleotídeos em vários ciclos, pois cada resíduo de nucleotídeo é sequenciado um de cada vez, evitando assim a ocorrência de uma série descontrolada de incorporações. O nucleotídeo incorporado é lido usando um marcador apropriado anexado ao mesmo antes da remoção da porção do marcador e da próxima rodada subsequente de sequenciamento.

[005] A fim de garantir que apenas uma única incorporação ocorra, uma modificação estrutural (“grupo protetor” ou “grupo bloqueador”) é incluída em cada nucleotídeo marcado que é adicionado à cadeia nascente para garantir que apenas um nucleotídeo seja incorporado. Após o nucleotídeo com o grupo protetor ter sido adicionado, o grupo protetor é então removido, em condições de reação que não interferem na integridade do DNA a ser sequenciado. O ciclo de sequenciamento pode então continuar com a incorporação do próximo nucleotídeo marcado protegido.

[006] Para serem úteis no sequenciamento de DNA, os nucleotídeos, que geralmente são trifosfatos de nucleotídeos, geralmente requerem um grupo protetor de 3'-hidróxi, de modo a evitar que a polimerase usada para o incorporar em uma cadeia de polinucleotídeo continue a replicar uma vez que a base no nucleotídeo foi adicionada. Existem muitas limitações nos tipos de grupos que podem ser adicionados a um nucleotídeo e ainda assim ser adequados. O grupo protetor deve evitar que moléculas de nucleotídeo adicionais sejam adicionadas à cadeia de polinucleotídeo enquanto simultaneamente seja facilmente removível da porção de açúcar sem causar danos à cadeia de polinucleotídeo. Além disso, o nucleotídeo modificado precisa ser compatível com a polimerase ou outra enzima apropriada usada para incorporá-lo na cadeia de polinucleotídeo. O grupo protetor ideal deve, portanto, exibir estabilidade a longo prazo, ser eficientemente incorporado pela enzima polimerase, causar bloqueio da incorporação secundária ou adicional de nucleotídeos e ter a capacidade de ser removido em condições suaves que não causem danos à estrutura do polinucleotídeo, de preferência sob condições aquosas.

[007] Grupos protetores reversíveis foram descritos anteriormente. Por exemplo, Metzker et al., (Nucleic Acids Research, 22 (20): 4259-4267, 1994) divulga a síntese e o uso de oito 2-desoxirribonucleosídeo 5'-trifosfatos modificados 3’ (dNTPs modificados 3’) e o teste em dois ensaios de molde de DNA para atividade de incorporação. O WO 2002/029003 descreve um método de sequenciamento que pode incluir o uso de um grupo protetor de alila para cobrir o grupo 3'-OH em uma fita nascente de DNA em uma reação de polimerase.

[008] Além disso, o desenvolvimento de uma série de grupos protetores reversíveis e métodos de desprotegê-los sob condições compatíveis com DNA foi relatado anteriormente na Publicação de Pedido Internacional Nos WO 2004/018497 e WO 2014/139596, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Sumário

[009] Algumas modalidades da presente divulgação se referem a um nucleotídeo ou nucleosídeo compreendendo uma ribose ou desoxirribose que tem um grupo protetor ou bloqueador de 3'-OH removível formando uma estrutura covalentemente ligada ao átomo de carbono 3', em que: cada R1a e R1b é independentemente H, C1-C6 alquila, C1-C6 haloalquila, C1- C6 alcóxi, C1-C6 haloalcóxi, ciano, halogênio, fenila opcionalmente substituído ou aralquila opcionalmente substituída; cada R2a e R2b é independentemente H, C1-C6 alquila, C1-C6 haloalquila, ciano, ou halogênio; alternativamente, R1a e R2a junto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um grupo heterociclila de cinco a oito membros opcionalmente substituído; R3 é H, C2-C6 alquenila opcionalmente substituído, C3-C7 cicloalquenila opcionalmente substituído, C2-C6 alquinila opcionalmente substituído, ou (C1-C6 alquileno)Si(R4)3 opcionalmente substituído; e cada R4 é independentemente H, C1-C6 alquila, ou C6-C10 arila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, quando cada R1a e R1b é H ou C1-C6 alquila, ambos R2a e R2b são H, então R3 é C2-C6 alquenila substituído, C3-C7 cicloalquenila opcionalmente substituído, C2-C6 alquinila opcionalmente substituído, ou (C1-C6 alquileno)Si(R4)3 opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, quando cada R1a, R1b, R2a e R2b é H, então R3 não é H.

[010] Algumas modalidades da presente divulgação se referem a um nucleosídeo ou nucleotídeo compreendendo uma ribose ou desoxiribose que tem um grupo bloqueador de 3ʹ-OH removível que forma uma estrutura covalentemente ligada ao átomo de carbono 3’, em que: cada de R5 e R6 é independentemente H, C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C1-C6 haloalquila, C2-C8 alcóxialquila, –(CH2)m–fenila opcionalmente substituído, –(CH2)n–(heteroarila de 5 ou 6 membros) opcionalmente substituído, – (CH2)k–C3-C7 carbociclila opcionalmente substituído, ou–(CH2)p–(heterociclila de 3 a 7 membros) opcionalmente substituído; cada de –(CH2)m–, –(CH2)n–, –(CH2)k–, e –(CH2)p– é opcionalmente substituído; e cada de m, n, k, e p é independentemente 0, 1, 2, 3, ou 4.

[011] Algumas modalidades da presente divulgação se referem a um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo uma molécula de nucleotídeo bloqueada 3'-OH descrito na presente invenção.

[012] Algumas modalidades da presente divulgação se referem a um método de preparação de um polinucleotídeo em crescimento complementar a um polinucleotídeo de fita simples alvo em uma reação de sequenciamento, compreendendo a incorporação de uma molécula de nucleotídeo descrita na presente invenção no polinucleotídeo complementar em crescimento, em que a incorporação do nucleotídeo impede a introdução de qualquer nucleotídeo subsequente no polinucleotídeo complementar em crescimento. Em algumas modalidades, a incorporação do nucleotídeo é realizada por uma polimerase, uma desoxinucleotidil transferase terminal (TdT), ou uma transcriptase reversa. Em uma modalidade, a incorporação é realizada por uma polimerase (por exemplo, uma DNA polimerase).

[013] Algumas modalidades adicionais da presente divulgação se referem a um método para determinar a sequência de um polinucleotídeo de fita simples alvo, compreendendo: (a) incorporação de um nucleotídeo compreendendo um grupo bloqueador de 3'-OH e um marcador detectável como descrito na presente invenção em uma cópia da fita polinucleotídica complementar a pelo menos uma porção da fita polinucleotídica alvo; (b) detecção da identidade do nucleotídeo incorporado na cópia da fita polinucleotídica; e (c) remoção química do marcador e do grupo bloqueador de 3'-OH do nucleotídeo incorporado na fita-cópia de polinucleotídeo.

[014] Em algumas modalidades, o método de sequenciamento compreende ainda (d) lavagem do marcador removido quimicamente e do grupo bloqueador a 3' da fita-cópia de polinucleotídeo. Em algumas modalidades, essa etapa de lavagem também remove os nucleotídeos não incorporados. Em algumas de tais modalidades, o grupo bloqueador a 3’ e o marcador detectável do nucleotídeo incorporado são removidos antes da introdução do próximo nucleotídeo complementar. Em algumas outras modalidades, o grupo bloqueador em posição 3’ e o marcador detectável são removidos em uma única etapa da reação química. Em algumas modalidades, a incorporação sequencial descrita na presente invenção é realizada pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 150 vezes, pelo menos 200 vezes ou pelo menos 250 vezes.

[015] Algumas outras modalidades da presente divulgação se referem a kits compreendendo uma pluralidade de moléculas de nucleotídeo ou nucleosídeo descritas na presente invenção e materiais de embalagem para os mesmos. Os nucleotídeos, nucleosídeos, oligonucleotídeos ou kits que são na presente invenção apresentados podem ser usados para detectar, medir ou identificar um sistema biológico (incluindo, por exemplo, processos ou componentes dos mesmos). Técnicas exemplificativas que podem empregar os nucleotídeos, oligonucleotídeos ou kits incluem sequenciamento, análise de expressão, análise de hibridização, análise genética, análise de RNA, ensaio celular (por exemplo, ligação celular ou análise de função celular), ou ensaio de proteína (por exemplo, ensaio de ligação de proteína ou ensaio de atividade de proteína). O uso pode ser em um instrumento automatizado para realizar uma técnica particular, tal como um instrumento de sequenciamento automatizado. O instrumento de sequenciamento pode conter dois ou mais lasers operando em diferentes comprimentos de onda para distinguir entre diferentes marcadores detectáveis. Breve Descrição dos Desenhos

[016] FIG. 1 é um gráfico de linha que ilustra a estabilidade de vários nucleotídeos bloqueados 3’ em função do tempo em uma solução tampão a 65 °C.

[017] FIG. 2A é um gráfico de linhas que ilustra a porcentagem (%) de nucleotídeo remanescente (material de partida) em função do tempo comparando a taxa de desbloqueio de nucleotídeo com o grupo bloqueador de 3'-AOM para nucleotídeo com o grupo bloqueador de 3'-O-azidometil (-CH2N3) em solução.

[018] FIG. 2B é um gráfico de linha que ilustra a porcentagem (%) de nucleotídeos3’ desbloqueados em função do tempo comparando a taxa de desbloqueio de nucleotídeos em posição 3' bloqueados com vários grupos bloqueadores acetal em solução.

[019] FIGs. 3A e 3B ilustram os resultados de sequenciamento no instrumento Illumina MiniSeq® usando nucleotídeos totalmente funcionalizados (ffNs) com grupo bloqueador de 3'-AOM na mistura de incorporação.

[020] FIG. 3C ilustra a taxa de erro de sequenciamento usando nucleotídeos totalmente funcionalizados (ffNs) com grupo bloqueador de 3'- AOM na mistura de incorporação em comparação com os ffNs padrão com grupo bloqueador de 3'-O-azidometila.

[021] FIG. 4A e 4B cada ilustra a comparação das métricas de sequenciamento primáriaa incluindo faseamento, pré-faseamento e taxa de erro usando nucleotídeos totalmente funcionalizados com grupos bloqueadores de 3'-AOM e 3'-O-azidometila usando duas DNA polimerases diferentes (Pol 812 e Pol 1901) respectivamente.

[022] FIG. 5 é um gráfico de linhas que ilustra a estabilidade de sequenciamento de nucleotídeos totalmente funcionalizados com grupos bloqueadores de 3'-AOM ou de 3'-O-azidometila em função do tempo em uma solução tampão a 45 °C.

[023] FIG. 6 é um gráfico de linha que ilustra a estabilidade de nucleosídeos com vários grupos bloqueadores a 3’ em função do tempo em uma solução tampão a 65 °C.

[024] FIG. 7 é um gráfico de linha que ilustra a porcentagem (%) do nucleotídeo bloqueado 3’ remanescente em função do tempo, comparando a taxa de clivagem (desbloqueio) de um grupo bloqueadores de tiocarbamato 3' dimetiltiocarbamato (DMTC) sob duas condições diferentes (Oxone® ou NaIO4) para aquele do grupo bloqueador de 3ʹ-O-azidometila (3ʹ-O-CH2N3). Descrição Detalhada

[025] Modalidades da presente divulgação se referem a nucleosídeos e nucleotídeos com grupos bloqueadores de 3 OH-OH acetal ou tiocarbamato para aplicações de sequenciamento, por exemplo, sequenciamento por síntese (SBS). Esses grupos bloqueadores oferecem melhor estabilidade em solução em comparação com aqueles conhecidos no estado da técnica. Em particular, os grupos bloqueadores de 3'-OH têm estabilidade melhorada durante a síntese dos nucleotídeos totalmente funcionalizados (ffNs) e também grande estabilidade em solução durante a formulação, armazenamento e operação nos instrumentos de sequenciamento. Além disso, os grupos bloqueadores de 3ʹ- OH descritos na presente invenção também podem atingir pré-faseamento baixo, decaimento de sinal inferior para qualidade de dados aprimorada, o que permite leituras mais longas a partir das aplicações de sequenciamento. Definições

[026] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção possuem o mesmo significado que é comumente entendido por um técnico no assunto. O uso do termo “incluindo”, bem como outras formas, como “inclui”, “incluem” e “incluído”, não é limitativo. O uso do termo “tendo”, bem como outras formas, como “têm”, “tem” e “tinha,” não é limitante. Conforme usado neste relatório descritivo, seja em uma frase de transição ou no quadro reivindicatório, os termos “compreende (m)” e “compreendendo” devem ser interpretados como tendo um significado aberto. Ou seja, os termos acima devem ser interpretados como sinônimos com as frases “tendo pelo menos” ou “incluindo pelo menos”. Por exemplo, quando usado no contexto de um processo, o termo “compreendendo” significa que o processo inclui pelo menos as etapas citadas, mas pode incluir etapas adicionais. Quando usado no contexto de um composto, composição ou dispositivo, o termo “compreendendo” significa que o composto, composição ou dispositivo inclui pelo menos os recursos ou componentes citados, mas também pode incluir recursos ou componentes adicionais.

[027] Tal como aqui utilizado, as abreviaturas orgânicas comuns são definidas como segue: °C - Temperatura em graus centígrados dATP - Trifosfato de desoxiadenosina dCTP - Trifosfato de desoxicitidina dGTP - Trifosfato de desoxiguanosina dTTP - Trifosfato de desoxitimidina ddNTP - trifosfato de didesoxinucleotídeo ffN - Nucleotídeo totalmente funcionalizado RT - Temperatura ambiente SBS - Sequenciamento por Síntese SM – Material de partida.

[028] Conforme usado na presente invenção, o termo “arranjo” se refere a uma população de diferentes moléculas de prova que estão ligadas a um ou mais substratos, de modo que as diferentes moléculas de prova possam ser diferenciadas umas das outras de acordo com a localização relativa. Um arranjo pode incluir diferentes moléculas de sonda, cada uma localizada em um sítio endereçável diferente em um substrato. Alternativamente, ou adicionalmente, um arranjo pode incluir substratos separados, cada um contendo uma molécula de prova diferente, em que as diferentes moléculas de prova podem ser identificadas de acordo com as localizações dos substratos em uma superfície à qual os substratos estão ligados ou de acordo com as localizações dos substratos em um líquido. Arranjos exemplificativos nos quais substratos separados estão localizados em uma superfície incluem, sem limitação, aqueles incluindo microesferas em poços como descrito, por exemplo, na Patente U.S. Nº 6,355,431 B1, US 2002/0102578 e Publicação PCT Nº WO 00/63437. Formatos exemplificativos que podem ser usados na invenção para distinguir microesferas em um arranjo de líquido, por exemplo, usando um dispositivo microfluídico, tal como um classificador de células ativadas por fluorescência (FACS), são descritos, por exemplo, na Patente US Nº 6.524.793. Outros exemplos de arranjos que podem ser utilizados na invenção incluem, sem limitação, aqueles descritos nas Patentes U.S. Nos 5,429,807; 5,436,327; 5,561,071; 5,583,211; 5,658,734; 5,837,858; 5,874,219; 5,919,523; 6,136,269;

6,287,768; 6,287,776; 6,288,220; 6,297,006; 6,291,193; 6,346,413; 6,416,949; 6,482,591; 6,514,751 e 6,610,482; e WO 93/17126; WO 95/11995; WO 95/35505; EP 742 287; e EP 799 897.

[029] Conforme usado na presente invenção, o termo “fixado covalentemente” ou “ligado covalentemente” se refere à formação de uma ligação química que é caracterizada pelo compartilhamento de pares de elétrons entre átomos. Por exemplo, um revestimento de polímero covalentemente ligado se refere a um revestimento de polímero que forma ligações químicas com uma superfície funcionalizada de um substrato, em comparação com a fixação à superfície por meio de outros meios, por exemplo, adesão ou interação eletrostática. Será apreciado que os polímeros que estão ligados covalentemente a uma superfície também possam ser ligados por meio de meios, além da ligação covalente.

[030] Tal como na presente invenção utilizado, qualquer grupo “R” representa substituintes que podem ser ligados ao átomo indicado. Um grupo R pode ser substituído ou não substituído. Se dois grupos “R” forem descritos como “junto com os átomos aos quais estão ligados” formando um anel ou sistema de anel, isso significa que a unidade coletiva dos átomos, ligações intermediárias e os dois grupos R são o anel referido. Por exemplo, quando a seguinte subestrutura está presente: e R1 e R2 são definidos como selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio e alquila, ou R1 e R2 junto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um arila ou carbociclila, significa que R1 e R2 podem ser selecionados a partir de hidrogênio ou alquila, ou alternativamente, a subestrutura tem estrutura: em que A é um anel arila ou um carbociclila contendo a ligação dupla representada.

[031] Deve ser entendido que certas convenções de nomenclatura de radicais podem incluir um mono-radical ou um di-radical, dependendo do contexto. Por exemplo, onde um substituinte requer dois pontos de ligação ao resto da molécula, entende-se que o substituinte é um radical di. Por exemplo, um substituinte identificado como alquila que requer dois pontos de ligação inclui radicais di, tais como –CH2–, –CH2CH2–, –CH2CH(CH3)CH2–, e similares. Outras convenções de nomenclatura de radicais indicam claramente que o radical é um di-radical como “alquileno” ou “alquenileno.”

[032] O termo “halogênio” ou “halo”, conforme usado na presente invenção, significa qualquer um dos átomos radioestáveis da coluna 7 da Tabela Periódica dos Elementos, por exemplo, flúor, cloro, bromo, ou iodo, com flúor e o cloro sendo preferido.

[033] Conforme usado na presente invenção, “Ca a Cb” em que “a” e “b” são inteiros se referem ao número de átomos de carbono em um grupo alquila, alquenila ou alquinila, ou o número de átomos do anel de um grupo cicloalquila ou grupo arila. Ou seja, o alquila, o alquenila, o alquinila, o anel cicloalquila, e o anel arila podem conter de “a” a “b”, inclusive, átomos de carbono. Por exemplo, um grupo “C1 a C4-alquila” se refere a todos os grupos alquila com 1 a 4 carbonos, isto é, CH3-, CH3CH2-, CH3CH2CH2-, (CH3)2CH-, CH3CH2CH2CH2-, CH3CH2CH(CH3)- e (CH3)3C-; um grupo C3 a C4 cicloalquila se refere a todos os grupos cicloalquila com 3 a 4 átomos de carbono, ou seja, ciclopropila e ciclobutila. Da mesma forma, um grupo “heterociclila de 4 a 6 membros” se refere a todos os grupos heterociclila com 4 a 6 átomos no anel total, por exemplo, azetidina, oxetano, oxazolina, pirrolidina, piperidina, piperazina, morfolina e semelhantes. Se nenhum “a” e “b” forem designados em relação a um grupo alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, ou arila, a faixa mais ampla descrita nestas definições deverá ser adotada. Conforme usado na presente invenção, o termo “C1-C6” inclui C1, C2, C3, C4, C5 e C6, e uma faixa definida por qualquer um dos dois números. Por exemplo, C1-C6 alquila inclui C1, C2, C3, C4, C5 e C6 alquila, C2-C6 alquila, C1-C3 alquila, etc. De modo semelhante, C2-C6 alquenila inclui C2, C3, C4, C5 e C6 alquenila, C2-C5 alquenila, C3-C4 alquenila, etc.; e C2-C6 alquinila inclui C2, C3, C4, C5 e C6 alquinila, C2-C5 alquinila, C3-C4 alquinila, etc. C3-C8 cicloalquila cada um inclui anel hidrocarboneto contendo 3, 4, 5, 6, 7 e 8 átomos de carbono, ou uma faixa definida por qualquer um dos dois números, como C3-C7 cicloalquila ou C5-C6 cicloalquila.

[034] Conforme usado na presente invenção, “alquila” se refere a uma cadeia hidrocarbônica linear ou ramificada que está totalmente saturada (ou seja, não contém ligações duplas ou triplas). O grupo alquila pode ter de 1 a 20 átomos de carbono (sempre que aparecer na presente invenção, uma faixa numérica como “1 a 20” se refere a cada número inteiro na faixa indicada; por exemplo, “1 a 20 átomos de carbono” significa que o grupo alquila pode consistir em 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., até e incluindo 20 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “alquila”, onde nenhuma faixa numérica é designada). O grupo alquila também pode ser um alquila de tamanho médio com 1 a 9 átomos de carbono. O grupo alquila também pode ser um alquila inferior com 1 a 6 átomos de carbono. O grupo alquila pode ser designado como “C1-C4alquila” ou indicações similares. A título de exemplo apenas, “C1-C6 alquila” indica que há um a seis átomos de carbono na cadeia de alquila, ou seja, a cadeia de alquila é selecionada a partir do grupo que consiste em metila, etila, propila, iso-propila, n- butila, iso-butila, sec-butila, e t-butila. Grupos alquila típicos incluem, mas não estão de forma alguma limitados a, metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, butila terciário, pentila, hexila e semelhantes.

[035] Tal como utilizado na presente invenção, “alcóxi” se refere à fórmula –OR em que R é um alquila conforme definido acima, tal como “C1-C9 alcóxi”, incluindo, mas não se limitando a metóxi, etóxi, n-propóxi, 1- metiletóxi (isopropóxi), n-butóxi, iso-butoxi, sec-butóxi, e terc-butóxi, e semelhantes.

[036] Conforme usado na presente invenção, “alquenila” se refere a uma cadeia hidrocarbônica linear ou ramificada contendo uma ou mais ligações duplas. O grupo alquenila pode ter de 2 a 20 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “alquenila”, onde nenhuma faixa numérica é designada. O grupo alquenila também pode ser um alquenila de tamanho médio com 2 a 9 átomos de carbono. O grupo alquenila também pode ser um alquenila inferior com 2 a 6 átomos de carbono. O grupo alquenila pode ser designado como “C2-C6 alquenila” ou designações semelhantes. A título de exemplo apenas, “C2-C6 alquenila” indica que existem dois a seis átomos de carbono na cadeia de alquenila, ou seja, a cadeia de alquenila é selecionada a partir do grupo que consiste em etenila, propen-1-ila, propen-2- ila, propen-3-ila, buten-1-ila, buten-2-ila, buten-3-ila, buten-4-ila, 1- metil-propen-1-ila, 2-metil-propen-1- ila, 1-etil-eten-1-ila, 2-metil-propen-3-ila, buta-1,3-dienila, buta-1,2, -dienila, e buta-1,2-dien-4- ila. Os grupos alquenila típicos incluem, mas não estão limitados a, etenila, propenila, butenila, pentenila, e hexenila e semelhantes.

[037] Conforme usado na presente invenção, “alquinila” se refere a uma cadeia hidrocarbônica linear ou ramificada contendo uma ou mais ligações triplas. O grupo alquinila pode ter de 2 a 20 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “alquinila” onde nenhuma faixa numérica é designada. O grupo alquinila também pode ser uma alquinila de tamanho médio com 2 a 9 átomos de carbono. O grupo alquinila também pode ser um alquinila inferior com 2 a 6 átomos de carbono. O grupo alquinila pode ser designado como “C2-C6 alquinila” ou designações semelhantes. Apenas a título de exemplo, “C2-C6 alquinila” indica que existem dois a seis átomos de carbono na cadeia de alquinila, ou seja, a cadeia de alquinila é selecionada a partir do grupo que consiste em etinila, propin-1-ila, propin-2- ila, butin-1-ila, butin-3-ila, butin-4-ila, e 2-butinila. Os grupos alquinila típicos incluem, mas não estão de forma alguma limitados a, etinila, propinila, butinila, pentinila, e hexinila e semelhantes.

[038] Conforme usado na presente invenção, “heteroalquila” se refere a uma cadeia hidrocarbônica linear ou ramificada contendo um ou mais heteroátomos, isto é, um elemento diferente de carbono, incluindo, mas não se limitando a, nitrogênio, oxigênio e enxofre, na estrutura da cadeia. O grupo heteroalquila pode ter de 1 a 20 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “heteroalquila” onde nenhuma faixa numérica é designada. O grupo heteroalquila também pode ser um heteroalquila de tamanho médio com 1 a 9 átomos de carbono. O grupo heteroalquila também pode ser uma heteroalquila inferior com 1 a 6 átomos de carbono. O grupo heteroalquila pode ser designado como “C1-C6- heteroalquila” ou designações semelhantes. O grupo heteroalquila pode conter um ou mais heteroátomos. Apenas a título de exemplo, “C4-C6 heteroalquila” indica que existem quatro a seis átomos de carbono na cadeia de heteroalquila e, adicionalmente, um ou mais heteroátomos na cadeia principal.

[039] O termo “aromático” se refere a um anel ou sistema de anel com um sistema de elétrons pi conjugado e inclui grupos aromáticos carbocíclicos (por exemplo, fenila) e grupos aromáticos heterocíclicos (por exemplo, piridina). O termo inclui grupos monocíclicos ou policíclicos de anel fundido (isto é, anéis que compartilham pares adjacentes de átomos), desde que todo o sistema de anel seja aromático.

[040] Conforme usado na presente invenção, “arila” se refere a um anel aromático ou sistema de anel (ou seja, dois ou mais anéis fundidos que compartilham dois átomos de carbono adjacentes) contendo apenas carbono na estrutura do anel. Quando o arila é um sistema de anéis, todos os anéis do sistema são aromáticos. O grupo arila pode ter de 6 a 18 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “arila” onde nenhuma faixa numérica seja designada. Em algumas modalidades, o grupo arila tem de 6 a 10 átomos de carbono. O grupo arila pode ser designado como “C6-C10-arila”, “C6 ou C10 arila” ou designações semelhantes. Exemplos de grupos arila incluem, mas não estão limitados a, fenila, naftila, azulenila, e antracenila.

[041] Um “aralquila” ou “arilaalquila” é um grupo arila ligado, como um substituinte, por meio de um grupo alquileno, tal como “C7-14 aralquila” e semelhantes, incluindo, mas não se limitando a benzila, 2-fenilaetila, 3- fenilapropila, e naftilalquila. Em alguns casos, o grupo alquileno é um grupo alquileno inferior (isto é, um grupo C1-C6 alquileno).

[042] Tal como na presente invenção utilizado, “heteroarila” se refere a um anel aromático ou sistema de anel (ou seja, dois ou mais anéis fundidos que compartilham dois átomos adjacentes) que contêm um ou mais heteroátomos, isto é, um elemento diferente de carbono, incluindo, mas não se limitando a, nitrogênio, oxigênio e enxofre, na estrutura do anel. Quando a heteroarila é um sistema de anéis, todos os anéis do sistema são aromáticos. O grupo heteroarila pode ter 5-18 membros do anel (ou seja, o número de átomos que constituem a estrutura do anel, incluindo átomos de carbono e heteroátomos), embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “heteroarila”, onde nenhuma faixa numérica é designada. Em algumas modalidades, o grupo heteroarila tem 5 a 10 membros do anel ou 5 a 7 membros do anel. O grupo heteroarila pode ser designado como “heteroarila de 5-7 membros”, “heteroarila de 5-10 membros” ou designações semelhantes. Exemplos de anéis heteroarila incluem, mas não estão limitados a, furila, tienila, ftalazinila, pirrolila, oxazolila, tiazolila, imidazolila, pirazolila, isoxazolila, isotiazolila, triazolila, tiadiazolila, piridinila, piridazinila, pirimidazinila, quiniazinila, iso-zinila, benzimidazolila, benzoxazolila, benzotiazolila, indolila, isoindolila e benzotienila.

[043] Um “heteroaralquila” ou “heteroarilaalquila” é um grupo heteroarila ligado, como um substituinte, por meio de um grupo alquileno. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a 2-tienilmetila, 3-tienilmetila, furilmetila, tieniletila, pirrolilalquila, piridilalquila, isoxazollylalquila e imidazolilalquila. Em alguns casos, o grupo alquileno é um grupo alquileno inferior (isto é, um grupo C1-C6- alquileno).

[044] Conforme usado na presente invenção, “carbociclila” significa um anel cíclico não aromático ou sistema de anel contendo apenas átomos de carbono na estrutura do sistema de anel. Quando o carbociclila é um sistema de anéis, dois ou mais anéis podem ser unidos de forma fundida, em ponte ou ligados por espiro. Os carbociclilas podem ter qualquer grau de saturação, desde que pelo menos um anel em um sistema de anel não seja aromático. Assim, os carbociclilas incluem cicloalquilas, cicloalquenilas e cicloalquinilas. O grupo carbociclila pode ter de 3 a 20 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “carbociclila”, onde nenhuma faixa numérica é designada. O grupo carbociclila também pode ser um carbociclila de tamanho médio com 3 a 10 átomos de carbono. O grupo carbociclila também pode ser um carbociclila com 3 a 6 átomos de carbono. O grupo carbociclila pode ser designado como “C3-C6- carbociclila” ou designações semelhantes. Exemplos de anéis carbociclila incluem, mas não estão limitados a, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, ciclohexenila, 2,3-dihidro-indeno, biciclo[2.2.2] octanila, adamantila, e espiro [4.4] nonanila.

[045] Como usado na presente invenção, “cicloalquila” significa um anel carbociclila totalmente saturado ou sistema de anel. Os exemplos incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila e ciclohexila.

[046] Como usado na presente invenção, “heterociclila” significa um anel cíclico não aromático ou sistema de anel contendo pelo menos um heteroátomo na estrutura do anel. Os heterocíclicos podem ser unidos de forma fundida, em ponte ou ligados por spiro. Os heterociclilos podem ter qualquer grau de saturação, desde que pelo menos um anel no sistema de anéis não seja aromático. O (s) heteroátomo (s) podem estar presentes em um anel não aromático ou aromático no sistema de anel. O grupo heterociclila pode ter 3 a 20 membros no anel (ou seja, o número de átomos que constituem a estrutura do anel, incluindo átomos de carbono e heteroátomos), embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo “heterociclila”, onde nenhuma faixa numérica é designada. O grupo heterociclila também pode ser um heterociclila de tamanho médio com 3 a 10 membros no anel. O grupo heterociclila também pode ser um heterociclila com 3 a 6 membros no anel. O grupo heterociclila pode ser designado como “heterociclila de 3-6 membros” ou designações semelhantes. Em heterocíclicos monocíclicos preferidos de seis membros, o (s) heteroátomo (s) são selecionados de um até três de O, N ou S, e em heterocíclicos monocíclicos preferidos de cinco membros, os heteroátomos são selecionados de um ou dois heteroátomos selecionados de O, N, ou S. Exemplos de anéis heterociclila incluem, mas não estão limitados a, azepinila, acridinila, carbazolila, cinnolinila, dioxolanila, imidazolinila, imidazolidinila, morfolinila, oxiranila, oxepanila, thiepanila, piperidinila, piperolidinila, dioxopiperazinila, pirrolidinila, pirrolidinila, pirrolidinila, pirrolidinila, pirrolidinila, pirrolidinila, pirrolidinila, 4- piperidonila, pirazolinila, pirazolidinila, 1,3-dioxinila, 1,3-dioxanila, 1,4-dioxinila, 1,4-dioxanila, 1,3-oxatianila, 1,4-oxatiinila, 1,4-oxatiinil, 2H-1,2-oxazinila, trioxanila, hexa-hidro-1,3,5-triazinila, 1,3-dioxolila, 1,3-dioxolanila, 1,3-ditiolila, 1,3-ditiolanila, isoxazolinila, isoxazolidinila, oxazolinil, oxazolidinila, oxazolidinonila, tiazolinila, tiazolidinila, 1,3-oxatiolanila, indolinila, isoindolinila, tetra-hidrofuranila, tetra-hidropiranila, tetra-hidrotiofenila, tetrahidrotiopiranila, tetrahidro-1,4-tiazinila, tiamorfolinila, dihidrobenzofuranila, benzimidazolidinila, e tetrahidroquinolina.

[047] Um grupo “O carboxi” se refere a um grupo “-OC (= O) R” em que R é selecionado a partir de hidrogênio, C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C3-C7 carbociclila, C6-C10 arila, heteroarila com 5 a 10 membros, e heterociclila com 3 a 10 membros, conforme definido na presente invenção.

[048] Um grupo “C carboxi” se refere a um grupo “C (= O) OR” em que R é selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C3-C7 carbociclila, C6-C10 arila, heteroarila de 5-10 membros, e heterociclila de 3-10 membros, conforme definido na presente invenção. Um exemplo não limitativo inclui carboxila (isto é, -C(=O)OH).

[049] Um grupo “sulfonila” se refere a um grupo “-SO2R” em que R é selecionado a partir de hidrogênio, C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C3-C7 carbociclila, C6-C10 arila, heteroarila de 5 a 10 membros, e heterociclila de 3 a 10 membros, conforme definido na presente invenção.

[050] Um grupo “sulfino” se refere a um grupo “-S(=O)OH”.

[051] Um grupo “S sulfonamido” se refere a um grupo “-SO2NRARB” em que RA e RB são cada um independentemente selecionados a partir de hidrogênio C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C3-C7 carbociclila, C6-C10 arila, heteroarila de 5-10 membros, e heterociclila de 3-10 membros, conforme definido na presente invenção.

[052] Um grupo “N-sulfonamido” se refere a um grupo “-N(RA)SO2RB” em que RA e Rb são cada um independentemente selecionados a partir de hidrogênio C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C3-C7 carbociclila, C6-C10 arila, heteroarila de 5-10 membros, e heterociclila de 3-10 membros, conforme definido na presente invenção.

[053] Um grupo “C-amido” se refere a um grupo “-C(=O)NRARB” em que RA e RB são cada um independentemente selecionados a partir de hidrogênio C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C3-C7 carbociclila, C6-C10 arila, heteroarila de 5-10 membros, e heterociclila de 3-10 membros, conforme definido na presente invenção.

[054] Um grupo “N-amido” se refere a um grupo “-N(RA)C(=O)RB” em que RA e RB são cada um independentemente selecionados a partir de hidrogênio C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C3-C7 carbociclila, C6-C10 arila, heteroarila de 5-10 membros, e heterociclila de 3-10 membros, conforme definido na presente invenção.

[055] Um grupo “amino” se refere a um grupo “-NRARB” em que RA e RB são cada um independentemente selecionados a partir de hidrogênio C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C3-C7 carbociclila, C6-C10 arila, heteroarila de 5-10 membros, e heterociclila de 3-10 membros, conforme definido na presente invenção. Um exemplo não limitativo inclui amino livre (isto é, -NH2).

[056] Um grupo “aminoalquila” se refere a um grupo amino ligado por meio de um grupo alquileno.

[057] Um grupo “alcoxialquila” se refere a um grupo alcoxi ligado por meio de um grupo alquileno, tal como um “C2-C8 alcoxialquila” e similar.

[058] Conforme usado na presente invenção, um grupo substituído é derivado do grupo parental não substituído em que houve uma troca de um ou mais átomos de hidrogênio por outro átomo ou grupo. A menos que indicado de outra forma, quando um grupo é considerado “substituído”, significa que o grupo é substituído por um ou mais substituintes independentemente selecionados a partir de C1-C6 alquila, C1-C6 alquenila, C1-C6 alquinila, C1-C6 heteroalquila, C3-C7 carbociclila (opcionalmente substituído com halo, C1-C6 alquila, C1-C6 alcoxi, C1-C6 haloalquila, e C1-C6 haloalcoxi), C3-C7-carbociclila-C1- C6-alquila (opcionalmente substituído com halo, C1-C6 alquila, C1-C6 alcoxi, C1-C6 haloalquila, e C1-C6 haloalcoxi), heterociclila de 3-10 membros (opcionalmente substituído com halo, C1-C6 alquila, C1-C6 alcoxi, C1-C6 haloalquila, e C1-C6 haloalcoxi), heterociclila-C1-C6-alquila de 3 a 10 membros (opcionalmente substituído com halo, C1-C6 alquila, C1-C6 alcoxi, C1-C6 haloalquila, e C1-C6 haloalcoxi), arila (opcionalmente substituído com halo, C1-C6 alquila, C1-C6 alcoxi, C1-C6 haloalquila, e C1-C6 haloalcoxi), arila(C1-C6)alquila (opcionalmente substituído com halo, C1-C6 alquila, C1-C6 alcoxi, C1-C6 haloalquila, e C1-C6 haloalcoxi), heteroarila de 5 a 10 membros (opcionalmente substituído com halo, C1-C6 alquila, C1-C6 alcoxi, C1-C6 haloalquila, e C1-C6 haloalcoxi), heteroarila(C1-C6)alquila de 5 a 10 membros (opcionalmente substituído com halo, C1-C6 alquila, C1-C6 alcoxi, C1-C6 haloalquila, e C1-C6 haloalcoxi), halo, -CN, hidróxi, C1-C6 alcoxi, C1-C6 alcoxi(C1-C6)alquila (isto é, éter), arilaoxi, sulfidrila (mercapto), halo(C1-C6)alquila (por exemplo, –CF3), halo(C1-C6)alcoxi (por exemplo, –OCF3), C1-C6 alquilatio, arilatio, amino, amino(C1-C6)alquila, nitro, O- carbamila, N-carbamila, O-tiocarbamila, N-tiocarbamila, C-amido, N-amido, S-

sulfonamido, N-sulfonamido, C-carboxi, O-carboxi, acila, cianato, isocianato, tiocianato, isotiocianato, sulfinila, sulfonila, -SO3H, sulfino, -OSO2C1-4alquila, e oxo (=O). Sempre que um grupo é descrito como “opcionalmente substituído”, esse grupo pode ser substituído com os substituintes acima.

[059] O termo “hidróxi”, conforme usado na presente invenção, se refere a um grupo –OH.

[060] O termo grupo “ciano”, conforme usado na presente invenção, se refere a um grupo “CN”.

[061] O termo “azido”, conforme usado na presente invenção, se refere a um grupo –N3.

[062] Tal como na presente invenção utilizado, um “nucleotídeo” inclui uma base heterocíclica contendo nitrogênio, um açúcar e um ou mais grupos fosfato. Eles são unidades monoméricas de uma sequência de ácido nucleico. No RNA, o açúcar é uma ribose, e no DNA uma desoxiribose, ou seja, um açúcar sem um grupo hidroxila que está presente na ribose. A base heterocíclica contendo nitrogênio pode ser base purina ou pirimidina. As bases de purina incluem adenina (A) e guanina (G), e derivados modificados ou análogos dos mesmos. As bases de pirimidina incluem citosina (C), timina (T), e uracila (U), e derivados modificados ou seus análogos. O átomo C-1 de desoxiribose está ligado a N-1 de uma pirimidina ou N-9 de uma purina.

[063] Conforme usado na presente invenção, um “nucleosídeo” é estruturalmente semelhante a um nucleotídeo, mas está faltando as porções de fosfato. Um exemplo de um análogo de nucleosídeo seria aquele em que o marcador está ligado à base e não há grupo fosfato ligado à molécula de açúcar. O termo “nucleosídeo” é usado na presente invenção em seu sentido comum, conforme entendido pelos técnicos no assunto. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, um ribonucleosídeo compreendendo uma porção de ribose e um desoxirribonucleosídeo compreendendo uma porção de desoxiribose. Uma porção pentose modificada é uma porção pentose em que um átomo de oxigênio foi substituído por um carbono e/ou um carbono foi substituído por um enxofre ou um átomo de oxigênio. Um “nucleosídeo” é um monômero que pode ter uma base substituída e/ou porção de açúcar. Além disso, um nucleosídeo pode ser incorporado em polímeros e oligômeros de DNA e/ou RNA maiores.

[064] O termo “base de purina” é usado na presente invenção em seu sentido comum, conforme entendido pelos técnicos no assunto, e inclui seus tautômeros. Da mesma forma, o termo “base de pirimidina” é usado na presente invenção em seu sentido comum, conforme entendido pelos técnicos no assunto, e inclui seus tautômeros. Uma lista não limitativa de bases purinas opcionalmente substituídas inclui purina, adenina, guanina, hipoxantina, xantina, aloxantina, 7-alquilaguanina (por exemplo 7-metilguanina), teobromina, cafeína, ácido úrico e isoguanina. Exemplos de bases de pirimidina incluem, mas não estão limitados a, citosina, timina, uracila, 5,6-di-hidrouracila e 5-alquilacitosina (por exemplo, 5-metilcitosina).

[065] Conforme usado na presente invenção, quando um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo é descrito como “compreendendo” um nucleosídeo ou nucleotídeo descrito na presente invenção, isso significa que o nucleosídeo ou nucleotídeo descrito na presente invenção forma uma ligação covalente com o oligonucleotídeo ou polinucleotídeo. Da mesma forma, quando um nucleosídeo ou nucleotídeo é descrito como parte de um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo, tal como “incorporado em” um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo, significa que o nucleosídeo ou nucleotídeo descrito na presente invenção forma uma ligação covalente com o oligonucleotídeo ou polinucleotídeo. Em algumas de tais modalidades, a ligação covalente é formada entre um grupo 3’-hidróxi do oligonucleotídeo ou polinucleotídeo com o grupo 5’-fosfato de um nucleotídeo descrito na presente invenção como uma ligação fosfodiéster entre o átomo de carbono 3' do oligonucleotídeo ou polinucleotídeo e o átomo de carbono 5' do nucleotídeo.

[066] Tal como na presente invenção utilizado, “derivado” ou “análogo” significa um nucleotídeo sintético ou derivado de nucleosídeo com porções de base modificadas e/ou porções de açúcar modificadas. Esses derivados e análogos são discutidos em, por exemplo, Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley & Son, 1980) e Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Os análogos de nucleotídeos também podem compreender ligações fosfodiéster modificadas, incluindo ligações fosforotioato, fosforoditioato, alquila-fosfonato, fosforanilidato e fosforamidato. “Derivado”, “análogo” e “modificado”, conforme usado na presente invenção, podem ser usados indistintamente, e são abrangidos pelos termos “nucleotídeo” e “nucleosídeo” definidos na presente invenção.

[067] Conforme usado na presente invenção, o termo “fosfato” é usado em seu sentido comum, conforme entendido pelos técnicos no assunto, e inclui

OH OH

O P O O P O suas formas protonadas (por exemplo, O- e OH ). Conforme usado na presente invenção, os termos “monofosfato”, “difosfato” e “trifosfato” são usados em seu sentido comum, conforme entendido pelos técnicos no assunto, e incluem formas protonadas.

[068] Os termos “grupo protetor” e “grupos protetores”, como usados na presente invenção, se referem a qualquer átomo ou grupo de átomos que é adicionado a uma molécula a fim de evitar que grupos existentes na molécula sofram reações químicas indesejadas. Às vezes, “grupo protetor” e “grupo bloqueador” podem ser usados indistintamente.

[069] Conforme usado na presente invenção, os prefixos “foto” ou “foto- ” significam relacionados à luz ou radiação eletromagnética. O termo pode abranger todo ou parte do espectro eletromagnético, incluindo, mas não se limitando a, uma ou mais das faixas comumente conhecidas como as partes do espectro de rádio, microondas, infravermelho, visível, ultravioleta, raio X ou raio gama. A parte do espectro pode ser aquela que é bloqueada por uma região de metal de uma superfície, tais como os metais estabelecidos na presente invenção. Alternativamente, ou adicionalmente, a parte do espectro pode ser aquela que passa por uma região intersticial de uma superfície tal como uma região de vidro, plástico, sílica, ou outro material na presente invenção estabelecido. Em modalidades particulares, pode ser usada radiação capaz de passar através de um metal. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser utilizada radiação que é mascarada por vidro, plástico, sílica, ou outro material na presente invenção estabelecido.

[070] Conforme usado na presente invenção, o termo “faseamento” se refere a um fenômeno em SBS que é causado pela remoção incompleta dos terminais 3ʹ e fluoróforos, e falha em completar a incorporação de uma porção de fitas de DNA dentro de agrupamentos por polimerases em um dado ciclo de sequenciamento. O pré-faseamento é causado pela incorporação de nucleotídeos sem terminais 3ʹ efetivos, em que o evento de incorporação avança 1 ciclo devido a uma falha de terminação. O faseamento e o pré- faseamento fazem com que as intensidades do sinal medido para um ciclo específico consistam no sinal do ciclo atual, bem como no ruído dos ciclos anteriores e seguintes. À medida que o número de ciclos aumenta, a porção de sequências por agrupamento afetada pelo faseamento e pré-faseamento aumenta, dificultando a identificação da base correta. O pré-faseamento pode ser causado pela presença de uma quantidade residual de nucleotídeos 3'-OH desprotegidos ou não bloqueados durante o sequenciamento por síntese (SBS). Os nucleotídeos 3'-OH desprotegidos podem ser gerados durante os processos de fabricação ou possivelmente durante os processos de armazenamento e manuseio de reagentes. Consequentemente, a descoberta de análogos de nucleotídeos que diminuem a incidência de pré-faseamento é surpreendente e fornece uma grande vantagem em aplicações de SBS sobre os análogos de nucleotídeos existentes. Por exemplo, os análogos de nucleotídeos fornecidos podem resultar em tempo de ciclo de SBS mais rápido, valores de faseamento e pré-faseamento mais baixos, e comprimentos de leitura de sequenciamento mais longos. Grupos Bloqueadores 3ʹ-Hidróxi Acetal

[071] Algumas modalidades da presente divulgação se referem a uma molécula de nucleotídeo ou molécula de nucleosídeo compreendendo uma ribose ou desoxiribose com um grupo bloqueador ou protetor de 3ʹ-OH removível que forma uma estrutura covalentemente ligada ao átomo de carbono 3’, em que: cada R1a e R1b é independentemente H, C1-C6 alquila, C1-C6 haloalquila, C1-C6 alcoxi, C1-C6 haloalcoxi, ciano, halogênio, fenila opcionalmente substituído, ou aralquila opcionalmente substituído; cada R2a e R2b é independentemente H, C1-C6 alquila, C1-C6 haloalquila, ciano, ou halogênio; alternativamente R1a e R2a junto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um grupo heterociclila de cinco a oito membros opcionalmente substituído; R3 é H, C2-C6 alquenila opcionalmente substituído, C3-C7 cicloalquenila opcionalmente substituído, C2-C6 alquinila opcionalmente substituído, ou (C1-C6 alquileno)Si(R4)3 opcionalmente substituído; e cada R4 é independentemente H, C1-C6 alquila, ou C6-C10 arila opcionalmente substituído; desde que quando cada R1a, R1b, R2a e R2b é H, então R3 não é H.

[072] Algumas outras modalidades da presente divulgação se referem ao composto que tem a estrutura da Fórmula (I): (I), em que Rʹ é H, monofosfato, di-fosfato, tri-fosfato, thiofosfato, um análogo éster de fosfato, –O– ligado a um grupo contendo fósforo reativo, ou –O– protegido por um grupo protetor; Rʹʹ é H ou OH; B é uma nucleobase; cada um de R1a, R1b, R2a, R2be R3 é definido acima. Em alguma outra modalidade, B é , , , , , ou .Em algumas outras modalidades, a nucleobase é covalentemente ligada a um marcador detectável (por exemplo, um corante fluorescente), opcionalmente por meio de um ligante, por exemplo, B é , , , ou . Em algumas modalidades, Rʹ é trifosfato. Em alguma dessas modalidades, Rʹʹ é H.

[073] Em algumas modalidades do grupo bloqueador de acetal descrito na presente invenção, pelo menos um de R1a e R1b é H. Em algumas modalidades, cada R1a e R1b é H. Em algumas outras modalidades, pelo menos um de R1a e R1b é C1-C6 alquila, por exemplo, metila, etila, isopropila ou t-butila. Em algumas modalidades, cada um de R2a e R2b é independentemente H, halogênio ou C1-C6 alquila. Em algumas modalidades, pelo menos um de R2a e R2b é H ou C1-C6 alquila. Em alguma dessas modalidades, cada R2a e R2b é H. Em algumas modalidades, cada R2a e R2b é C1-C6 alquila, por exemplo metila, etila, isopropila ou t-butila. Em uma modalidade, cada R2a é R2b é metila. Em algumas modalidades, cada R2a e R2b é independentemente C1-C6 alquila ou halogênio. Em algumas modalidades, R2a é H, e R2b é halogênio ou C1-C6 alquila.

[074] Em algumas modalidades do grupo bloqueador de acetal descrito na presente invenção, R3 é C2-C6 alquenila opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, R3 é C2-C6 alquenila (por exemplo, vinila, propenila) opcionalmente substituído com um ou mais substituintes independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio, C1-C6 alquila, C1-C6 haloalquila, e combinações dos mesmos. Em algumas outras modalidades, R3 é , , , , , , , , , , , , , , ou . Em algumas outras modalidades, R3 é opcionalmente substituído C2-C6 alquinila. Em algumas modalidades, R3 is C2-C6 alquinila (por exemplo, etinila, propinila) opcionalmente substituído com um ou mais substituintes independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio, C1-C6 alquila, C1-C6 haloalquila, e combinações dos mesmos. Em uma modalidade, R3 é etinila opcionalmente substituído ( ). Em algumas outras modalidades, R3 é (C1-C6 alquileno)Si(R4)3 opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, pelo menos um de R4 é C1-4 alquila. Em algumas outras modalidades, cada um de R4 e C1-C4 alquila, por exemplo, metila, etila, isopropila ou t-butila. Em uma modalidade, R3 é –(CH2)-SiMe3. Em algumas modalidades alternativas, R3 é C1-C6 alquila.

[075] Em algumas modalidades alternativas, R1a e R2a junto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um heterociclila de cinco a sete membros. Em algumas modalidades, R1a e R2a junto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um heterociclila de seis membros. Em algumas modalidades, o grupo heterociclila de seis membros tem a estrutura . Em algumas outras modalidades, pelo menos um de cada R1b, R2b e R3 é H. Em algumas outras modalidades, pelo menos um de cada R1b, R2b e R3 é C1-C6 alquila. Em uma modalidade, cada R1b, R2b e R3 é H.

[076] Em algumas outras modalidades, o composto de Fórmula (I) é também representado pela fórmula (Ia): (Ia), em que cada R2c e R2d é independentemente H, halogênio (por exemplo, fluoro, chloro), C1-C6 alquila (por exemplo, metila, etila, ou isopropila), ou C1-C6 haloalquila (por exemplo, -CHF2, -CH2F, ou –CF3). Em algumas modalidades, um de R1a e R1b é H. Em algumas modalidades, cada R1a e R1b é H. Em algumas outras modalidades, pelo menos um de R1a e R1b é C1-C6 alquila, por exemplo, metila, etila, isopropila ou t-butila. Em algumas modalidades, cada um de R2a e R2b é independentemente H, halogênio ou C1-C6 alquila. Em alguma dessas modalidades, cada R2a e R2b é H. Em algumas modalidades, cada um de R2c e R2d é independentemente H, halogênio ou C1-C6 alquila. Em algumas modalidades, cada R2c e R2d é C1-C6 alquila, por exemplo metila, etila, isopropila ou t-butila. Em uma modalidade, cada R2c e R2d é metila. Em algumas modalidades, cada R2c e R2d é independentemente halogênio. Em algumas modalidades, R2c é H, e R2d é H, halogênio (fluoro, cloro) ou C1-C6 alquila (por exemplo, metila, etila, isopropila ou t-butila). Em outras modalidades, cada R1a e R1b é H; R2a é H; R2b é H, halogênio ou metil; R2c é H; e R2d é H, halogênio, metila, etila, isopropila ou t-butila.

[077] Modalidades não limitativas dos grupos bloqueadores descritos na presente invenção incluindo aqueles que têm a estrutura selecionada do grupo que consiste em: (AOM), (eAOM), (iAOM), (PrOM), (DPrOM), (THP), e (SEM), covalentemente ligado ao carbono 3ʹ da ribose ou desoxiribose. Grupos bloqueadores,3ʹ-hidróxi-tiocarbamato

[078] Algumas modalidades adicionais da presente divulgação se referem ao nucleosídeo ou nucleotídeo compreendendo uma ribose ou desoxiribose que tem um grupo bloqueador de 3ʹ-OH removível que forma uma estrutura covalentemente ligada ao átomo de carbono 3’, em que: cada um de R5 e R6 é independentemente H, C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C1-C6 haloalquila, C2-C8 alcoxialquila, –(CH2)m–fenila opcionalmente substituído,

–(CH2)n–(heteroarila de 5 ou 6 membros) opcionalmente substituído, – (CH2)k–C3-C7 carbociclila opcionalmente substituído, ou –(CH2)p–(heterociclila de 3 a 7 membros) opcionalmente substituído; alternativamente, R5 e R6 junto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um heterociclila opcionalmente substituído de cinco a sete membros; cada um de –(CH2)m–, –(CH2)n–, –(CH2)k–, e –(CH2)p– é opcionalmente substituído; e cada um de m, n, k, e p é independentemente 0, 1, 2, 3, ou 4.

[079] Algumas modalidades adicionais se referem ao composto da fórmula (II): (II), em que Rʹ é H, monofosfato, di-fosfato, tri-fosfato, thiofosfato, um análogo éster de fosfato, –O– ligado a um grupo contendo fósforo reativo, ou –O– protegido por um grupo protetor; Rʹʹ é H ou OH; B é uma nucleobase; cada um de R5 e R6 é definido acima. Em alguma outra modalidade, B é , , , , , ou . Em algumas outras modalidades, a nucleobase é covalentemente ligada a um marcador detectável (por exemplo, um corante fluorescente), opcionalmente por meio de um ligante, por exemplo, B é ,

, ou . Em algumas modalidades, Rʹ é trifosfato. Em alguma dessas modalidades, Rʹʹ é H.

[080] Em algumas modalidades do grupo bloqueador de tiocarbamato descrito na presente invenção, pelo menos um de R5 e R6 é H. Em algumas modalidades, cada R5 e R6 é H. Em algumas modalidades, R5 é H e R6 é C1-C6 alquila, por exemplo, metila, etila, isopropila ou t-butila. Em algumas modalidades, R5 é H e R6 é C2-C6 alquenila (por exemplo, vinila ou alilila) ou C2-C6 alquinila (por exemplo, etinila ou propinila). Em algumas modalidades, R5 é H e R2 é –(CH2)m–fenila opcionalmente substituído, –(CH2)n–(heteroarila de 5 ou 6 membros) opcionalmente substituído,–(CH2)k–C3-C7 carbociclila opcionalmente substituído, ou –(CH2)p–(heterociclila de 3 a 7 membros) opcionalmente substituído. Em alguma outra modalidade, o grupo C3-C7 carbociclila pode ser um C3-C7 cicloalquila ou C3-C7 cicloalquenila. O grupo heterociclila de 3 a 7 membros pode compreender zero ou uma ligação dupla na estrutura do anel. Em outras modalidades, R5 é H e R6 é–(CH2)m–fenila opcionalmente substituído, –(CH2)n– heteroarila de 6 membros opcionalmente substituído, –(CH2)k–C5 ou C6 carbociclila opcionalmente substituído, ou –(CH2)p–(heterociclila de 5 ou 6 membros) opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, m, n, k, ou p é

0. Em outras modalidades, m, n, k ou p é 1 ou 2. Em algumas outras modalidades, pelo menos um de R5 e R6 é C1-C6 alquila, por exemplo, metila, etila, isopropila ou t-butila. Em algumas outras modalidades, ambos R5 e R6 são C1-C6 alquila. Em uma modalidade, ambos R5 e R6 são metila.

[081] Em algumas modalidades alternativas, R5 e R6 junto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um heterociclila opcionalmente substituído de cinco a sete membros. Em algumas modalidades, R5 e R6 junto com os átomos aos quais eles estão ligados formam um piperidinila opcionalmente substituído.

[082] Modalidades não limitativas dos grupos bloqueadores de 3ʹ-O- tiocarbamato descritos na presente invenção incluindo aqueles que têm a estrutura selecionada do grupo que consiste em: , , e (DMTC) covalentemente ligada ao carbono na posição 3ʹ da ribose ou desoxiribose.

[083] Modalidades adicionais da presente divulgação se referem a um oligonucleotídeo ou a um polinucleotídeo compreendendo um nucleosídeo ou nucleotídeo descrito na presente invenção.

[084] Em qualquer uma das modalidades dos grupos bloqueadores descritos na presente invenção, quando um grupo é descrito como “opcionalmente substituído”, pode ser não substituído ou substituído.

[085] Em quaisquer modalidades dos nucleotídeos ou nucleosídeos com o grupo bloqueador de hidróxi 3’descrito na presente invenção, o nucleosídeo ou nucleotídeo pode ser covalentemente ligado a um marcador detectável (por exemplo, um fluoróforo), opcionalmente por meio de um ligante. O ligante pode ser clivável ou não clivável. Em algumas modalidades, o marcador detectável (por exemplo, fluoróforo) é covalentemente ligado à nucleobase do nucleosídeo ou nucleotídeo por meio de um ligante clivável. Em algumas outras modalidades, o marcador detectável (por exemplo, fluoróforo) é covalentemente ligado ao oxigênio 3’ do nucleosídeo ou nucleotídeo por meio de um ligante clivável. Em algumas outras modalidades, tal ligante clivável pode compreender uma porção azido ou uma porção dissulfeto, uma porção acetal ou uma porção tiocarbamato. Em algumas modalidades, o grupo bloqueador de 3’-hidróxi e o ligante clivável (e o marcador ligado) podem ser removidos nas mesmas ou substancialmente nas mesmas condições de reação química, por exemplo, o grupo bloqueador e o marcador detectável podem ser removidos em uma única reação química. Em outras modalidades, o grupo bloqueador e o marcador detectável são removidos em duas etapas separadas.

[086] Em algumas modalidades, os nucleotídeos ou nucleosídeos descritos na presente invenção compreendem 2ʹ desoxiribose. Em alguns aspectos adicionais, a 2ʹ desoxiribose contém um, dois ou três grupos fosfato na posição 5ʹ do anel açúcar. Em algum aspecto adicional, os nucleotídeos descritos na presente invenção são trifosfato de nucleotídeo.

[087] Em algumas modalidades, os nucleotídeos ou nucleosídeos bloqueados a 3’descritos na presente invenção fornecem estabilidade superior em solução durante o armazenamento, ou manipulação de reagentes durante as aplicações de sequenciamento, em comparação com os mesmos nucleotídeos ou nucleosídeos protegidos com um grupo bloqueador de 3' -OH padrão divulgado no estado da técnica, por exemplo, o grupo protetor de 3'-O- azidometila. Por exemplo, os grupos bloqueadores de acetal ou tiocarbamato divulgados na presente invenção podem conferir pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 1500%, 2000%, 2500%, ou 3000% de estabilidade melhorada em comparação com um 3ʹ-OH azidometila-protegido sob a mesma condição pelo mesmo período de tempo, reduzindo assim os valores de pré- faseamento e resultando em comprimentos de leitura de sequenciamento mais longos. Em algumas modalidades, a estabilidade é medida à temperatura ambiente ou abaixo da temperatura ambiente (como 4-10 °C). Em outras modalidades, a estabilidade é medida em temperaturas elevadas, como 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C ou 65 °C. Em algumas modalidades, a estabilidade é medida em solução em um ambiente de pH básico, por exemplo, em pH 9,0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8. ou 10,0. Em algumas modalidades, a estabilidade é medida com ou sem a presença de uma enzima, como uma polimerase (por exemplo, uma DNA polimerase), uma desoxinucleotidil transferase terminal ou uma transcriptase reversa.

[088] Em algumas modalidades, os nucleotídeos ou nucleosídeos bloqueados a 3’descritos na presente invenção fornecem taxa de desbloqueio superior em solução durante a etapa de clivagem química das aplicações de sequenciamento, em comparação com os mesmos nucleotídeos ou nucleosídeos protegidos com um grupo bloqueador de 3'-OH padrão divulgado no estado da técnica, por exemplo, o grupo protetor de 3'-O-azidometila. Por exemplo, os grupos bloqueadores de acetal ou tiocarbamato divulgados na presente invenção podem conferir pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 1500%, ou 2000% de taxa de desbloqueio melhorada em comparação com um 3ʹ-OH azidometila-protegido usando o reagente de desbloqueio padrão (como tris (hidróxipropil) fosfina), reduzindo assim o tempo total para um ciclo de sequenciamento. Em algumas modalidades, a taxa de desbloqueio é medida à temperatura ambiente ou a uma temperatura abaixo da temperatura ambiente (como 4-10 °C). Em outras modalidades, a taxa de desbloqueio é medida em temperaturas elevadas, como 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C ou 65 °C. Em algumas modalidades, a taxa de desbloqueio é medida em solução em um ambiente de pH básico, por exemplo, em pH 9,0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8. ou 10,0. Em algumas modalidades, a razão molar do reagente de desbloqueio para o substrato (isto é, nucleosídeo ou nucleotídeo bloqueado a 3’) é de cerca de 10: 1, cerca de 5: 1, cerca de 2: 1 ou cerca de 1: 1.

[089] Em algumas modalidades, um reagente de desbloqueio de paládio

(por exemplo, Pd (0) é usado para remover os grupos bloqueadores de 3ʹ acetal (por exemplo, grupo bloqueador de AOM). Pd pode formar um complexo de quelação com os dois átomos de oxigênio do grupo AOM, bem como a ligação dupla do grupo alila, permitindo que o reagente de desbloqueio na vizinhança direta da funcionalidade seja removido e possa resultar em uma taxa de desbloqueio acelerada. Desproteção dos grupos bloqueadores de 3ʹ-OH

[090] Os grupos bloqueadores de 3ʹ-acetal descritos na presente invenção pode ser removido ou clivado sob várias condições químicas. Para grupos bloqueadores de acetal que contêm uma porção de vinila ou alquenila, a condição de clivagem não limitativa inclui um complexo de Pd (II), tal como Pd (OAc)2 ou dímero de cloreto de alilPd (II), na presença de um ligante de fosfina, por exemplo tris (hidróximetil) fosfina (THMP), ou tris (hidróxilpropil) fosfina (THP ou THPP). Para aqueles grupos bloqueadores contendo um grupo alquinila (por exemplo, um etinila), eles também podem ser removidos por um complexo de Pd (II) (por exemplo, Pd (OAc) 2 ou dímero de cloreto de alila Pd (II)) na presença de um ligante de fosfina (por exemplo, THP ou THMP). Reagentes de clivagem de paládio

[091] Em algumas modalidades, o grupo bloqueador de acetal descrito na presente invenção pode ser clivado por um catalisador de paládio. Em algumas modalidades, o catalisador de Pd é solúvel em água. Em algumas modalidades, é um complexo de Pd(0) (por exemplo, Tris (3,3’,3’’ - fosfinidinetris(benzenossulfonato)paládio(0) sal mononassódico monahidratado). Em alguns casos, o complexo de Pd (0) pode ser gerado in situ a partir da redução de um complexo de Pd (II) por reagentes, tais como alquenos, álcoois, aminas, fosfinas ou hidretos de metal. Fontes de paládio adequadas incluem Na2PdCl4, Pd(CH3CN)2Cl2, (PdCl(C3H5))2, [Pd(C3H5)(THP)]Cl, [Pd(C3H5)(THP)2]Cl, Pd(OAc)2, Pd(Ph3)4, Pd(dba)2, Pd(Acac)2, PdCl2(COD), e Pd(TFA)2. Em uma tal modalidade, o complexo Pd(0) é gerado in situ a partir de Na2PdCl4. Em outra modalidade, a fonte de paládio é dímero de cloreto de alil paládio (II) [(PdCl(C3H5))2]. Em algumas modalidades, o complexo Pd(0) é gerado em uma solução aquosa pela mistura de um complexo Pd(II) com a fosfina. As fosfinas adequadas incluem fosfinas solúveis em água, tais como tris (hidróxipropil) fosfina (THP), tris (hidróximetil) fosfina (THMP), 1,3,5-triaza-7- fosfadamantano (PTA), sal de potássio bis (p-sulfonatofenil) fenilafosfina di- hidratado, tris (carboxietil) fosfina (TCEP), e sal trissódico de ácido trifenilafosfina-3,3’, 3' '- trissulfônico.

[092] Em algumas modalidades, o Pd(0) é preparado pela mistura de um complexo Pd(II) [(PdCl(C3H5))2] com THP in situ. A razão molar do complex Pd(II) e do THP pode ser cerca de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, ou 1:10. Em algumas outras modalidades, um ou mais agentes redutores podem ser adicionados, tais como ácido ascórbico ou um sal do mesmo (por exemplo, ascorbato de sódio). Em algumas modalidades, a mistura de clivagem pode conter reagentes tampão adicionais, como uma amina primária, uma amina secundária, uma amina terciária, um sal carbonato, um sal fosfato, ou um sal borato, ou combinações dos mesmos. Em algumas outras modalidades, o reagente tampão compreende etanolamina (EA), tris (hidróximetil) aminometano (Tris), glicina, carbonato de sódio, fosfato de sódio, borato de sódio, 2-dimetilaminometanol (DMEA), 2-dietialaminometanol (DEEA), N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina (TEMED), ou N,N,N’,N’- tetraetiletilenodiamina (TEEDA), ou moldes dos mesmos. Em uma modalidade,

o reagente tampão é DEEA. Em outra modalidade, o reagente tampão contém um ou mais sais inorgânicos como um sal carbonato, um sal fosfato, ou um sal borato, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, o sal inorgânico é um sal de sódio.

[093] Alternativamente, a porção alquinila contendo grupos bloqueadores também pode ser clivada na presença de (NH4)2MoS4, a porção alquinila contendo grupos bloqueadores também pode ser clivada na presença de outra condição de clivagem não limitativa para a porção alquinila inclui um complexo Cu (II) com ligante THPTA (tris (3-hidróxipropiltriazolilmetil) amina), e ascorbato. Condições de clivagem não limitativas para grupos bloqueadores contendo um heterociclo de seis membros (por exemplo, tetra-hidropirano) incluem ciclodextrina ou Ln (OTf) 3 (triflato de lantanídeo). Condição de clivagem não limitativa para grupos bloqueadores contendo um grupo alquilasilano (por exemplo, -CH2SiMe3) inclui LiBF4 (tetrafluoroborato de lítio). Outros grupos bloqueadores de acetal, como –O(CH2)O-C1-C6 alquila podem ser removidos por LiBF4 ou Bi(OTf)3 (triflato de bismuto). Condições exemplificativas não limitativas para clivar os vários grupos bloqueadores descritos são ilustradas no Esquema 1 abaixo. Esquema 1. Ilustração das Condições de Desbloqueio a 3’

[094] Os grupos bloqueadores de 3'-O-tiocarbamato descritos na presente invenção podem ser construídos ou clivados sob várias condições determinadas. Condições exemplificativas não limitativas para clivar os grupos bloqueadores de tiocarbamato descritos na presente invenção incluem NaIO 4 e Oxone® (peroximonossulfato de potássio).

[095] Além disso, o grupo azido em –CH2N3 pode ser convertido em um grupo amino pela fosfina. Alternativamente, o grupo azido em –CH2N3 pode ser convertido em um grupo amino por meio do contato de tais moléculas com os tióis, em particular os tióis solúveis em água, como o ditiotreitol (DTT). Em uma modalidade, a fosfina é THP. Compatibilidade com Linearização

[096] A fim de maximizar o rendimento das reações de sequenciamento de ácido nucleico, é vantajoso ser capaz de sequenciar várias moléculas molde em paralelo. O processamento paralelo de vários moldes pode ser alcançado com o uso da tecnologia de arranjo de ácido nucleico. Esses arranjos normalmente consistem em um arranjo de alta densidade de polinucleotídeos imobilizados em um material de suporte sólido.

[097] WO 98/44151 e WO 00/18957 ambos descrevem métodos de amplificação de ácido nucleico que permitem que produtos de amplificação sejam imobilizados em um suporte sólido, a fim de formar arranjos compostos de agrupamentos ou “colônias” formadas a partir de uma pluralidade de fitas de polinucleotídeos imobilizados idênticas e uma pluralidade de fitas complementares imobilizadas idênticas. Arranjos deste tipo são referidos na presente invenção como “arranjos agrupados”. As moléculas de ácido nucleico presentes em colônias de DNA nos arranjos agrupados preparados de acordo com esses métodos podem fornecer moldes para reações de sequenciamento, por exemplo, como descrito no documento WO 98/44152. Os produtos de reações de amplificação em fase sólida, como os descritas em WO 98/44151 e WO 00/18957, são as chamadas estruturas “em ponte” formadas por anelamento de pares de fitas de polinucleotídeo imobilizadas e fitas complementares imobilizadas, ambas as fitas sendo ligadas ao suporte sólido na extremidade 5. A fim de fornecer moldes mais adequados para o sequenciamento de ácido nucleico, é preferível remover substancialmente todos ou pelo menos uma porção de um dos filamentos imobilizados na estrutura “em ponte”, a fim de gerar um molde que é pelo menos parcialmente de fita simples. A porção do molde que é de cadeia simples estará assim disponível para hibridização com um iniciador de sequenciamento. O processo de remoção da totalidade ou de parte de uma fita imobilizada em uma estrutura de ácido nucleico de fita dupla “em ponte” é referido como “linearização”. Existem várias maneiras de linearização, incluindo, mas não se limitando a clivagem enzimática, clivagem fotoquímica, ou clivagem química. Exemplos não limitativos de métodos de linearização são divulgados na Publicação PCT Nº WO 2007/010251, Publicação de Patente U.S. Nº 2009/0088327, Publicação de Patente U.S. Nº 2009/0118128, e Ped. U.S. 62/671.816, que são incorporados por referência em sua totalidade.

[098] Em algumas modalidades, a condição para desproteger ou remover os grupos bloqueadores 3'-OH também é compatível com os processos de linearização. Em algumas outras modalidades, a condição de desproteção é compatível com um processo de linearização química que compreende o uso de um complexo de Pd e uma fosfina, por exemplo Pd (OAc) 2 e THP. Em algumas modalidades, o complexo de Pd é um complexo de Pd (II), que gera Pd (0) in situ na presença da fosfina.

[099] Salvo indicação em contrário, a referência a nucleotídeos também se destina a ser aplicável a nucleosídeos. Nucleotídeos marcados

[0100] De acordo com um aspecto da divulgação, o nucleotídeo 3'-OH - bloqueado descrito também compreende um marcador detectável e tal nucleotídeo é denominado nucleotídeo marcado. O marcador (por exemplo, um corante fluorescente) pode ser conjugado por meio de um ligante opcional por uma variedade de meios, incluindo atração hidrofóbica, atração iônica, e ligação covalente. Em alguns aspectos, os corantes são conjugados ao substrato por ligação covalente. Mais particularmente, a ligação covalente é feita por meio de um grupo de ligação. Em alguns casos, esses nucleotídeos marcados também são referidos como “nucleotídeos modificados.”

[0101] Os nucleosídeos e nucleotídeos marcados são úteis para a marcação de polinucleotídeos formados por síntese enzimática, tal como, a título de exemplo não limitativo, na amplificação por PCR, amplificação isotérmica, amplificação em fase sólida, sequenciamento de polinucleotídeos (por exemplo, sequenciamento em fase sólida), reações de Nick tradução e semelhantes.

[0102] Em algumas modalidades, o corante pode ser covalentemente ligado a oligonucleotídeos ou nucleotídeos por meio da base de nucleotídeos. Por exemplo, o nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado pode ter o marcador ligado à posição C5 de uma base de pirimidina ou à posição C7 de uma base de 7-deaza purina por meio de uma porção ligante.

[0103] A menos que indicado de outra forma, a referência a nucleotídeos também se destina a ser aplicável a nucleosídeos. O presente pedido também será descrito com referência ao DNA, embora a descrição também seja aplicável a RNA, PNA e outros ácidos nucleicos, a menos que indicado de outra forma. Ligantes

[0104] Em algumas modalidades descrita na presente invenção, a base de purina ou pirimidina das moléculas de nucleotídeo ou nucleosídeo descrita na presente invenção pode ser ligada a um marcador detectável como descrito acima. Em algumas modalidades, os ligantes usados são cliváveis. O uso de um ligante clivável garante que o marcador possa, se necessário, ser removido após a detecção, evitando qualquer sinal de interferência com qualquer nucleotídeo marcado ou nucleosídeo incorporado subsequentemente. Em algumas modalidades, o ligante clivável compreende uma porção azido, uma porção –O- C2-C6 alquenila (por exemplo, –O-alila), uma porção dissulfeto, uma porção acetal (igual ou semelhante ao grupo bloqueador de 3’ acetal na presente invenção), ou uma porção tiocarbamato (igual ou semelhante ao grupo bloqueador de 3’acetato descrito na presente invenção).

[0105] Em algumas outras modalidades, os ligantes usados não são cliváveis. Uma vez que em cada caso em que um nucleotídeo marcado da invenção é incorporado, nenhum nucleotídeo precisa ser subsequentemente incorporado e, portanto, o marcador não precisa ser removido do nucleotídeo.

[0106] Os ligantes cliváveis são conhecidos no estado da técnica, e a química convencional pode ser aplicada para ligar um ligante a uma base de nucleotídeo e um marcador. O ligante pode ser clivado por qualquer método adequado, incluindo exposição a ácidos, bases, nucleófilos, eletrófilos, radicais, metais, agentes redutores ou oxidantes, luz, temperatura, enzimas etc. O ligante, como discutido na presente invenção, também pode ser clivado com o mesmo catalisador usado para clivar a ligação do grupo bloqueador de 3'-O. Os ligantes adequados podem ser adaptados a partir de grupos protetores químicos padrão, conforme divulgado em Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons. Outros ligantes cliváveis adequados usados na síntese de fase sólida são divulgados em Guillier et al. (Chem. Rev. 100:2092-2157, 2000).

[0107] Quando o marcador detectável é ligado a base, o ligante pode ser ligado em qualquer posição na base de nucleotídeo, desde que o emparelhamento de base Watson-Crick ainda possa ser realizado. No contexto de bases de purina, é preferido que o ligante seja ligado através da posição 7 da purina ou do análogo de deazapurina preferido, através de uma purina modificada em 8, através de uma adenosina modificada N-6 ou uma guanina modificada N-2. Para pirimidinas, a ligação é de preferência através da posição 5 na citosina, timidina ou uracila e a posição N-4 na citosina.

[0108] Em algumas modalidades, o ligante pode compreender uma unidade espaçadora. O comprimento do ligante não é importante, desde que o marcador seja mantido a uma distância suficiente do nucleotídeo de modo a não interferir com qualquer interação entre o nucleotídeo e uma enzima, por exemplo, uma polimerase.

[0109] Em algumas modalidades, o ligante pode consistir na funcionalidade semelhante ao grupo protetor de 3'-OH. Isso tornará a desproteção e o processo de desproteção mais eficientes, pois apenas um único tratamento será necessário para remover o marcador e o grupo protetor.

[0110] O uso do termo “ligante clivável” não significa que todo o ligante deve ser removido. O sítio de clivagem pode ser localizado em uma posição no ligante que garante que parte do ligante permaneça ligado ao corante e/ou porção do substrato após a clivagem. Os ligantes cliváveis podem ser, a título de exemplo não limitativo, ligantes cliváveis eletrofilicamente, ligantes cliváveis nucleofilicamente, ligantes fotocliváveis, cliváveis sob condições redutivas (por exemplo, dissulfeto ou ligantes contendo azida), condições oxidativas, cliváveis através do uso de ligantes de captura de segurança e clivável por mecanismos de eliminação. O uso de um ligante clivável para ligar o composto de corante a uma porção de substrato garante que o marcador possa, se necessário, ser removido após a detecção, evitando qualquer sinal de interferência nas etapas a jusante.

[0111] Grupos ligantes úteis podem ser encontrados na Publicação PCT Nº WO2004/018493 (aqui incorporada por referência), exemplos dos quais incluem ligantes que podem ser clivados usando fosfinas solúveis em água ou catalisadores de metal de transição solúveis em água formados a partir de um metal de transição e ligantes pelo menos parcialmente solúveis em água, por exemplo, um complexo de Pd (II) e THP. Na solução aquosa, os últimos formam complexos de metal de transição pelo menos parcialmente solúveis em água. Esses ligantes cliváveis podem ser usados para ligar bases de nucleotídeos a marcadores, tais como os corantes na presente invenção estabelecidos.

[0112] Ligantes particulares incluem aqueles divulgados na Publicação PCT

Nº WO2004/018493 (aqui incorporada por referência), tais como aqueles que incluem porções das fórmulas: (em que X é selecionado do grupo que compreende O, S, NH e NQ, em que Q é um grupo C1-10-alquila substituído ou não substituído, Y é selecionado do grupo que compreende O, S, NH e N (alil), T é hidrogênio ou um grupo C1- C10-alquila substituído ou não substituído e * indica onde a porção está ligada ao restante do nucleotídeo ou nucleosídeo). Em alguns aspectos, os ligantes ligam as bases de nucleotídeos a marcadores, como, por exemplo, os compostos corantes descritos na presente invenção.

[0113] Exemplos adicionais de ligantes incluem aqueles divulgados na Publicação U.S. Nº 2016/0040225 (aqui incorporada por referência), tais como aqueles que incluem porções das fórmulas:

[0114] As porções de ligante aqui ilustradas podem compreender a estrutura de ligante total ou parcial entre os nucleotídeos/nucleosídeos e os marcadores.

[0115] Exemplos adicionais de ligantes (“L”) incluem porções da fórmula:

, , , , , ou , em que B é uma nucleobase; Z é –N3 (azido), –O-C1-C6 alquila, –O-C2-C6 alquenila, ou –O-C2-C6 alquinila; e Fl compreende um marcador fluorescente, que pode conter estrutura de ligante adicional. Um técnico no assunto entende que o marcador é covalentemente ligado ao ligante pela reação de um grupo funcional do marcador (por exemplo, carboxila) com um grupo funcional do ligante (por exemplo, amino).

[0116] Em modalidades particulares, o comprimento do ligante entre um corante fluorescente (fluoróforo) e uma base de guanina pode ser alterado, por exemplo, pela introdução de um grupo espaçador de polietilenoglicol, aumentando assim a intensidade de fluorescência em comparação com o mesmo fluoróforo ligado à base de guanina através de outras ligações conhecidas no estado da técnica. Ligantes exemplificativos e suas propriedades são apresentados na Publicação PCT Nº WO2007020457 (aqui incorporada por referência). A configuração de ligantes, e principalmente seu comprimento aumentado, pode permitir melhorias no brilho dos fluoróforos ligados às bases guanina dos nucleotídeos da guanosina quando incorporados a polinucleotídeos como o DNA. Desse modo, quando o corante é para uso em qualquer método de análise que requer a detecção de um marcador fluorescente corante ligado a um nucleotídeo contendo guanina, é vantajoso se o ligante compreender um grupo espaçador de fórmula –((CH2)2O)n–, em que n é um número inteiro entre 2 e 50, conforme descrito em WO 2007/020457.

[0117] Os nucleosídeos e nucleotídeos podem ser marcados em sítios no açúcar ou na nucleobase. Como conhecido na técnica, um “nucleotídeo” consiste em uma base nitrogenada, um açúcar e um ou mais grupos fosfato. No RNA, o açúcar é a ribose e no DNA é uma desoxirribose, ou seja, um açúcar sem um grupo hidróxi que está presente na ribose. A base nitrogenada é um derivado da purina ou da pirimidina. As purinas são adenina (A) e guanina (G), e as pirimidinas são citosina (C) e timina (T) ou, no contexto do RNA, uracila (U). O átomo C-l da desoxirribose está ligado a N-l de uma pirimidina ou N-9 de uma purina. Um nucleotídeo também é um éster de fosfato de um nucleosídeo, com esterificação ocorrendo no grupo hidroxi ligado ao C-3 ou C-5 do açúcar. Os nucleotídeos são geralmente mono, di ou trifosfatos.

[0118] Um “nucleosídeo” é estruturalmente semelhante a um nucleotídeo, mas está faltando as porções fosfato. Um exemplo de um análogo de nucleosídeo seria aquele em que o marcador está ligado à base e não há grupo fosfato ligado à molécula de açúcar.

[0119] Embora a base seja geralmente referida como purina ou pirimidina, o técnico no assunto apreciará que estão disponíveis derivados e análogos que não alteram a capacidade do nucleotídeo ou nucleosídeo de sofrer emparelhamento de bases de Watson-Crick. “Derivado” ou “análogo” significa um composto ou molécula cuja estrutura central é a mesma, ou se assemelha muito à de um composto original, mas que tem uma modificação química ou física, como, por exemplo, um grupo lateral diferente ou adicional, que permite que o nucleotídeo ou nucleosídeo derivado seja ligado a outra molécula. Por exemplo, a base pode ser uma deazapurina. Em modalidades particulares, os derivados devem ser capazes de sofrer emparelhamento Watson-Crick.

“Derivado” e “análogo” também incluem, por exemplo, um nucleotídeo sintético ou derivado de nucleosídeo que tem porções de base modificadas e/ou porções de açúcar modificadas. Tais derivados e análogos são discutidos em, por exemplo, Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) e Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Os análogos de nucleotídeos também podem compreender ligações fosfodiéster modificadas, incluindo ligações fosforotioato, fosforoditioato, alquila-fosfonato, fosforanilidato, fosforamidato e semelhantes.

[0120] Um corante pode ser ligado a qualquer posição na base do nucleotídeo, por exemplo, através de um ligante. Em modalidades particulares, o emparelhamento de bases Watson-Crick ainda pode ser realizado para o análogo resultante. Os sítios de marcação de nucleobases particulares incluem a posição C5 de uma base de pirimidina ou a posição C7 de uma base de purina 7-deaza. Conforme descrito acima, um grupo ligante pode ser usado para ligar covalentemente um corante ao nucleosídeo ou nucleotídeo.

[0121] Em modalidades particulares, o nucleosídeo ou nucleotídeo marcado pode ser enzimaticamente incorporável e enzimaticamente extensível. Consequentemente, uma porção de ligação pode ser de comprimento suficiente para ligar o nucleotídeo ao composto de modo que o composto não interfira significativamente com a ligação geral e reconhecimento do nucleotídeo por uma enzima de replicação de ácido nucleico. Assim, o ligante também pode compreender uma unidade espaçadora. O espaçador distancia, por exemplo, a base de nucleotídeo de um sítio de clivagem ou marcador.

[0122] Os nucleosídeos ou nucleotídeos marcados com os corantes descritos na presente invenção podem ter a fórmula:

onde o corante é um composto corante; B é uma nucleobase, como, por exemplo, uracila, timina, citosina, adenina, guanina e semelhantes; L é um grupo ligante opcional que pode ou não estar presente; R' pode ser H, monofosfato, difosfato, trifosfato, tiofosfato, a análogo éster de fosfato, –O– ligado a um grupo contendo fósforo reativo, ou –O– protegido por um grupo bloqueador; R '' pode ser H, OH, uma fosforamidita ou um grupo bloqueador de 3'-OH descrito na presente invenção, e R’’ é H ou OH. Onde R’’’ é fosforamidita, R’ é um grupo protetor de hidróxi clivável por ácido que permite o acoplamento de monômero subsequente sob condições de síntese automatizadas.

[0123] Em uma modalidade particular, o ligante (entre o corante e o nucleotídeo) e o grupo bloqueador estão ambos presentes e são porções separadas. Em modalidades particulares, o ligante e o grupo bloqueador são ambos cliváveis em condições substancialmente semelhantes. Assim, os processos de desproteção e desbloqueio podem ser mais eficientes porque apenas um único tratamento será necessário para remover o composto corante e o grupo bloqueador. No entanto, em algumas modalidades, um ligante e um grupo bloqueador não precisam ser cliváveis em condições semelhantes, em vez de serem cliváveis individualmente em condições distintas.

[0124] A divulgação também abrange polinucleotídeos que incorporam compostos corantes. Esses polinucleotídeos podem ser DNA ou RNA constituídos, respectivamente, por desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos unidos por ligação fosfodiéster. Os polinucleotídeos podem compreender nucleotídeos de ocorrência natural, nucleotídeos de ocorrência não natural (ou modificados) diferentes dos nucleotídeos marcados descritos na presente invenção ou qualquer combinação dos mesmos, em combinação com pelo menos um nucleotídeo modificado (por exemplo, marcado com um composto corante) como definido adiante na presente invenção. Os polinucleotídeos de acordo com a divulgação também podem incluir ligações de cadeia principal não naturais e/ou modificações químicas não nucleotídicas. Estruturas quiméricas compostas por misturas de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos compreendendo pelo menos um nucleotídeo marcado também são contempladas.

[0125] Nucleotídeos marcados exemplificativos não limitativos como descrito na presente invenção incluem:

em que L representa um ligante e R representa um resíduo de açúcar como descrito acima, ou um resíduo de açúcar com a posição 5' substituída com um, dois ou três fosfatos.

[0126] Em algumas modalidades, conjugados corante fluorescente exemplificativos não limitativos são mostrados abaixo:

em que PG representa os grupos bloqueadores de 3’ hidróxi na presente invenção. Em qualquer modalidade do nucleotídeo marcado descrito na presente invenção, o nucleotídeo é um trifosfato de nucleotídeo. Kits

[0127] A presente divulgação também fornece kits incluindo um ou mais nucleosídeos bloqueados a 3' e/ou nucleotídeos descritos na presente invenção, por exemplo, o nucleotídeo bloqueado a 3' de Fórmula (I), (Ia), ou (II). Esses kits geralmente incluirão pelo menos um nucleotídeo bloqueado a 3’ ou um nucleosídeo marcado com um corante junto com pelo menos um outro componente. O (s) outro (s) componente (s) podem ser um ou mais dos componentes identificados em um método estabelecido na presente invenção ou na seção de exemplos abaixo. Alguns exemplos não limitativos de componentes que podem ser combinados em uma divulgação de kit da presente são apresentados abaixo.

[0128] Em uma modalidade particular, um kit pode incluir pelo menos um nucleotídeo bloqueado a 3’ marcado ou nucleosídeo junto com nucleotídeos ou nucleosídeos marcados ou não marcados. Por exemplo, os nucleotídeos marcados com corantes podem ser fornecidos em combinação com nucleotídeos não marcados ou nativos, e/ou com nucleotídeos marcados com fluorescência ou qualquer combinação dos mesmos. As combinações de nucleotídeos podem ser fornecidas como componentes individuais separados (por exemplo, um tipo de nucleotídeo por vaso ou tubo) ou como misturas de nucleotídeos (por exemplo, dois ou mais nucleotídeos misturados no mesmo vaso ou tubo).

[0129] Quando os kits compreendem uma pluralidade, particularmente dois, ou três, ou mais particularmente quatro nucleotídeos bloqueados a 3’ marcados com um composto corante, os diferentes nucleotídeos podem ser marcados com diferentes compostos corantes, ou um pode ser escuro, sem compostos corantes. Quando os diferentes nucleotídeos são marcados com diferentes compostos de corante, é uma característica dos kits que os compostos de corante sejam corante fluorescentes espectralmente distinguíveis. Tal como na presente invenção utilizado, o termo “corantes fluorescentes espectralmente distinguíveis” se refere a corantes fluorescentes que emitem energia fluorescente em comprimentos de onda que podem ser distinguidos por equipamento de detecção fluorescente (por exemplo, uma plataforma comercial de sequenciamento de DNA baseada em capilares) quando dois ou mais desses corantes estão presente em uma amostra. Quando dois nucleotídeos marcados com compostos corante fluorescente são fornecidos na forma de kit, é uma característica de algumas modalidades que os corante fluorescentes espectralmente distinguíveis possam ser excitados no mesmo comprimento de onda, como, por exemplo, pelo mesmo laser. Quando quatro nucleotídeos bloqueados a 3' (A, C, T, e G) marcados com compostos corante fluorescente são fornecidos em forma de kit, é uma característica de algumas modalidades que dois dos corante fluorescentes espectralmente distinguíveis possam ser ambos excitados em um comprimento de onda e o outros dois corantes espectralmente distinguíveis possam ser ambos excitados em outro comprimento de onda. Os comprimentos de onda de excitação particulares são 488 nm e 532 nm.

[0130] Em uma modalidade, um kit inclui um primeiro nucleotídeo bloqueado a 3’ marcado com um primeiro corante e um segundo nucleotídeo marcado com um segundo corante em que os corantes têm uma diferença de absorbância máxima de pelo menos 10 nm, particularmente 20 nm a 50 nm. Mais particularmente, os dois compostos de corante têm deslocamentos de Stokes entre 15-40 nm, onde “deslocamento de Stokes” é a distância entre o pico de absorção e os comprimentos de onda de emissão de pico.

[0131] Em uma modalidade alternativa, os kits da divulgação podem conter nucleotídeos bloqueados a 3’, onde a mesma base é marcada com dois ou mais corantes diferentes. Um primeiro nucleotídeo (por exemplo, trifosfato de nucleotídeo T bloqueado a 3ʹ ou trifosfato de nucleotídeo G bloqueado a 3ʹ) pode ser marcado com um primeiro corante. Um segundo nucleotídeo (por exemplo, trifosfato de nucleotídeo C bloqueado a 3ʹ) pode ser marcado com um segundo corante espectralmente distinto do primeiro corante, por exemplo, uma absorção de corante “verde” inferior a 600 nm, e uma absorção de corante “azul” inferior a 500 nm, por exemplo 400 nm a 500, em particular 450 nm a 460 nm). Um terceiro nucleotídeo (por exemplo, um nucleotídeo trifosfato A bloqueado a 3ʹ) pode ser marcado como uma mistura do primeiro e do segundo corantes, ou uma mistura do primeiro, do segundo e do terceiro corantes, e o quarto nucleotídeo (por exemplo, nucleotídeo trifosfato G bloqueado a 3’ ou nucleotídeo triofosfato T bloqueado a 3ʹ pode ser “escuro” e não conter marcador. Em um exemplo, os nucleotídeos 1-4 podem ser marcados como ‘azul’, ‘verde’, ‘azul/verde’, e escuro. Para simplificar ainda mais a instrumentação, quatro nucleotídeos podem ser marcados com dois corantes excitados com um único laser, e, portanto, a marcação dos nucleotídeos 1-4 pode ser 'azul 1', 'azul 2', 'azul 1/azul 2', e escuro.

[0132] Em modalidades particulares, os kits podem conter quatro nucleotídeos bloqueados a 3’ marcados (por exemplo, A, C, T, G), onde cada tipo de nucleotídeo compreende o mesmo grupo bloqueador 3' e um marcador fluorescente, e em que cada marcador fluorescente tem um máximo de fluorescência distinto e cada um dos marcadores fluorescentes é distinguível dos outros três marcadores. Os kits podem ser tais que dois ou mais marcadores fluorescentes tenham um máximo de absorbância semelhante, mas um deslocamento de Stokes diferente. Em algumas outras modalidades, um tipo de nucleotídeo não está marcado.

[0133] Embora os kits sejam exemplificados na presente invenção em relação a configurações com diferentes nucleotídeos que são marcados com diferentes compostos de corante, será entendido que os kits podem incluir 2, 3, 4 ou mais nucleotídeos diferentes que têm o mesmo composto de corante. Em algumas modalidades, o kit também inclui uma enzima e um tampão apropriado para a ação da enzima. Em algumas modalidades, a enzima é uma polimerase, uma desoxinucleotidil transferase terminal ou uma transcriptase reversa. Em modalidades particulares, a enzima é uma DNA polimerase, tal como DNA polimerase 812 (Pol 812) ou DNA polimerase 1901 (Pol 1901). As sequências de aminoácidos de Pol 812 e Pol 1901 polimerases são descritas,

por exemplo, no Pedido de Patente US Nos 16/670, 876, depositado em 31 de outubro de 2019, e 16/703,569, depositado em 4 de dezembro de 2019, ambos os quais são incorporados por referência aqui.

[0134] Outros componentes a serem incluídos em tais kits podem incluir tampões e semelhantes. Os nucleotídeos da presente divulgação, e outros quaisquer componentes de nucleotídeos, incluindo misturas de diferentes nucleotídeos, podem ser fornecidos no kit em uma forma concentrada para ser diluída antes do uso. Em tais modalidades, um tampão de diluição adequado também pode ser incluído. Novamente, um ou mais dos componentes identificados em um método estabelecido na presente invenção podem ser incluídos em uma divulgação de kit da presente invenção. Métodos de Sequenciamento

[0135] Nucleotídeos ou nucleosídeos marcados de acordo com a presente divulgação podem ser usados em qualquer método de análise, tal como método que inclui a detecção de um marcador fluorescente ligado a um nucleotídeo ou nucleosídeo, seja por si próprio ou incorporado ou associado a uma estrutura molecular maior ou conjugado. Neste contexto, o termo “incorporado a um polinucleotídeo” pode significar que o 5' fosfato está unido por ligação fosfodiéster ao grupo 3'-OH de um segundo nucleotídeo (modificado ou não modificado), que pode ele próprio fazer parte de uma cadeia de polinucleotídeo mais longa. A extremidade 3’ de um nucleotídeo na presente invenção estabelecido pode ou não ser unida por uma ligação de fosfodiéster ao 5’ fosfato de um outro nucleotídeo (modificado ou não modificado). Assim, em uma modalidade não limitativa, a divulgação fornece um método de detecção de um nucleotídeo incorporado em um polinucleotídeo que compreende: (a) incorporação de pelo menos um nucleotídeo da divulgação em um polinucleotídeo e (b) detecção do (s)

nucleotídeo (s) incorporado (s) no polinucleotídeo por meio da detecção do sinal fluorescente do composto corante ligado ao(s) referido(s) nucleotídeo(s).

[0136] Este método pode incluir: uma etapa sintética (a) em que um ou mais nucleotídeos de acordo com a divulgação são incorporados em um polinucleotídeo e uma etapa de detecção (b) em que um ou mais nucleotídeo(s) incorporado(s) ao polinucleotídeo é(são) detectado(s) pela detecção ou medição quantitativa de sua fluorescência.

[0137] Algumas modalidades do presente pedido são direcionadas a métodos de sequenciamento, incluindo: (a) incorporação de pelo menos um nucleotídeo marcado, conforme descrito na presente invenção em um polinucleotídeo; e (b) detecção do(s) nucleotídeo(s) marcado(s) incorporado(s) ao polinucleotídeo por meio da detecção do sinal fluorescente do novo corante fluorescente ligado ao(s) referido(s) nucleotídeo(s).

[0138] Algumas modalidades da presente divulgação se referem a um método para determinação da sequência de um polinucleotídeo alvo de fita simples, compreendendo: (a) incorporar um nucleotídeo compreendendo um grupo bloqueador de 3ʹ-OH e um marcador detectável como descrito na presente invenção em uma fita-cópia de polinucleotídeo complementar a pelo menos uma porção da fita de polinucleotídeo alvo; (b) detectar a identidade do nucleotídeo incorporado na fita-cópia de polinucleotídeo; e (c) remover quimicamente o marcador e o grupo bloqueador de 3ʹ-OH do nucleotídeo incorporado na fita-cópia de polinucleotídeo.

[0139] Em algumas modalidades, o método de sequenciamento compreende ainda (d) lavagem do marcador removido quimicamente e do grupo bloqueador 3’ da fita-cópia de polinucleotídeo. Em algumas modalidades,

o grupo bloqueador 3’e o marcador detectável são removidos antes da introdução do próximo nucleotídeo complementar. Em algumas outras modalidades, o grupo bloqueador 3ʹ e o marcador detectável são removidos em uma única etapa da reação química. Em algumas modalidades, a etapa de lavagem (d) também remove nucleotídeos não incorporados. Em algumas outras formas, um removedor de paládio também é usado na etapa de lavagem após a clivagem química do marcador e do grupo bloqueador 3ʹ.

[0140] Em algumas modalidades, as etapas (a) a (d) são repetidas até que uma sequência da porção da fita do polinucleotídeo molde seja determinada. Em algumas modalidades, as etapas (a) a (d) são repetidas pelo menos 50 vezes, pelo menos 75 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 150 vezes, pelo menos 200 vezes, pelo menos 250 vezes ou pelo menos 300 vezes.

[0141] Em algumas modalidades, o marcador e o grupo bloqueador 3’ são removidos em duas reações químicas separadas. Em algumas modalidades, a remoção do marcador do nucleotídeo incorporado à fita-cópia de polinucleotídeo envolve o contato da fita-cópia, incluindo o nucleotídeo incorporado, com uma solução de primeira clivagem. Em algumas dessas modalidades, a primeira solução de clivagem contém uma fosfina, como uma trialquilafosfina. Exemplos não limitativos de trialquilafosfinas incluem tris (hidróxipropil) fosfina (THP), tris- (2-carboxietil) fosfina (TCEP), tris (hidróximetil) fosfina (THMP), ou tris (hidróxietil) fosfina (THEP). Em uma modalidade, a primeira solução de clivagem contém THP. Em algumas modalidades, a remoção do grupo bloqueador 3’do nucleotídeo incorporado na fita-cópia de polinucleotídeo compreende o contato da fita-cópia, incluindo o nucleotídeo incorporado, com uma segunda solução de clivagem. Em algumas modalidades, a segunda solução de clivagem contém um catalisador de paládio (Pd). Em algumas outras modalidades, o catalisador de Pd é um catalisador de

Pd (0). Em algumas modalidades, o Pd (0) é preparado pela mistura de um complexo de Pd (II) [(PdCl(C3H5))2] com THP in situ. A razão molar do complexo de Pd (II) e o THP pode ser de cerca de 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5, 1: 6, 1: 7, 1: 8, 1: 9, ou 1:10. Em uma modalidade a razão molar de Pd: THP é 1: 5. Em algumas outras modalidades, um ou mais agentes redutores podem ser adicionados, tais como ácido ascórbico ou um sal do mesmo (por exemplo, ascorbato de sódio). Em algumas modalidades, a segunda solução de clivagem pode conter um ou mais reagentes tampão, como uma amina primária, uma amina secundária, uma amina terciária, um sal carbonato, um sal fosfato, ou um sal borato, ou modelos dos mesmos. Em algumas outras modalidades, o reagente tampão compreende etanolamina (EA), tris (hidróximetil) aminometano (Tris), glicina, carbonato de sódio, fosfato de sódio, borato de sódio, 2-dimetilaminometanol (DMEA), 2-dietialaminometanol (DEEA), N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina (TEMED), ou N,N,N’,N’-tetraetiletilenodiamina (TEEDA), ou modelos dos mesmos. Em uma modalidade, o reagente tampão é DEEA. Em outra modalidade, o reagente tampão contém um ou mais sais inorgânicos como um sal carbonato, um sal fosfato, ou um sal borato, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, o sal inorgânico é um sal de sódio. Em algumas outras modalidades, a segunda solução de clivagem contém NaIO4 ou Oxone®. Em algumas outras modalidades, o nucleotídeo bloqueado a 3’ contém um grupo AOM e a segunda solução de clivagem contém um catalisador de paládio (Pd) e um ou mais reagentes tampão descritos na presente invenção (por exemplo, uma amina terciária como DEEA) e têm pH de cerca de 9,0 a cerca de 10,0 (por exemplo, 9,6 ou 9,8).

[0142] Em algumas modalidades alternativas, o marcador e o grupo bloqueador 3-OH são removidos em uma única reação química. Em algumas modalidades, o marcador é ligado ao nucleotídeo por meio de um ligante de clivagem que compreende a mesma porção do grupo bloqueador 3’, por exemplo, ambos o ligante e o grupo bloqueador 3' podem compreender uma porção de acetal ou uma porção tiocarbamato como descrito na presente invenção. Em algumas dessas modalidades, a única reação química é realizada em uma solução de clivagem contendo um catalisador de Pd descrito acima.

[0143] Em algumas outras modalidades, os nucleotídeos usados na etapa de incorporação (a) são totalmente funcionalizados A, C, T e nucleotídeo G triofosfato, cada um contém um grupo bloqueador 3’ descrito na presente invenção. Em algumas modalidades, os nucleotídeos aqui fornecem estabilidade superior em solução durante as execuções de sequenciamento, em comparação com os mesmos nucleotídeos protegidos com um grupo bloqueador de 3'-O-azidometil padrão. Por exemplo, os grupos bloqueadores de acetal ou tiocarbamato divulgados na presente invenção podem conferir pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 1500%, 2000%, 2500%, ou 3000% de estabilidade melhorada em comparação com um 3ʹ-OH azidometil-protegido na mesma condição pelo mesmo período de tempo, reduzindo assim os valores de pré-faseamento e resultando em comprimentos de leitura de sequenciamento mais longos. Em algumas modalidades, a estabilidade é medida à temperatura ambiente ou a uma temperatura abaixo da temperatura ambiente (como 4-10 °C). Em outras modalidades, a estabilidade é medida em temperaturas elevadas, como 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C ou 65 °C. Em algumas modalidades, a estabilidade é medida em solução em um ambiente de pH básico, por exemplo, em pH 9,0, 9,2, 9,4, 9,6,

9,8. ou 10,0. Em algumas outras modalidades, o valor de pré-faseamento com o nucleotídeo bloqueado a 3’ descrito na presente invenção é inferior a cerca de 0,25, 0,24, 0,23, 0,22, 0,21, 0,20, 0,19, 0,18, 0,17, 0,16, 0,15, 0,14, 0,13, 0,12, 0,11, 0,10, 0,09, 0,08, 0,07, 0,06, ou 0,05 após mais de 50, 100 ou 150 ciclos de SBS. Em outras modalidades, o valor de faseamento com o nucleotídeo bloqueado a 3’ é inferior a cerca de 0,25, 0,24, 0,23, 0,22, 0,21, 0,20, 0,19, 0,18, 0,17, 0,16, 0,15, 0,14, 0,13, 0,12, 0,11, 0,10, 0,09, 0,08, 0,07, 0,06, ou 0,05, após mais de 50, 100 ou 150 ciclos de SBS. Em uma modalidade, cada ffN contém o grupo 3’-AOM.

[0144] Em algumas modalidades, os nucleotídeos bloqueados a 3' descritos na presente invenção fornecem taxa de desbloqueio superior em solução durante a etapa de clivagem química da execução de sequenciamento, em comparação com os mesmos nucleotídeos protegidos com um grupo bloqueador de 3'-O-azidometil padrão. Por exemplo, os grupo bloqueadores de acetal (por exemplo, AOM) ou grupos bloqueadores de tiocarbamato divulgados na presente invenção podem conferir pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 1500%, ou 2000% de taxa de desbloqueio melhorada em comparação com um 3ʹ-OH azidometil-protegido usando o reagente de desbloqueio padrão (como tris (hidróxipropil) fosfina), reduzindo assim o tempo total para um ciclo de sequenciamento. Em algumas modalidades, o tempo de desbloqueio para cada nucleotídeo é reduzido em cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, ou 60%. Por exemplo, o tempo de desbloqueio para 3'-AOM e 3'-O-azidometil é de cerca de 4-5 segundos e cerca de 9-10 segundos, respectivamente, sob certas condições de reação química. Em algumas modalidades, a meia-vida (t 1/2) do grupo bloqueador de AOM é pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes mais rápida do que o grupo bloqueador de azidometil. Em algumas dessas modalidades, t1/2 de AOM é de cerca de 1 minuto, enquanto t1/2 de azidometil é de cerca de 11 minutos. Em algumas modalidades, a taxa de desbloqueio é medida à temperatura ambiente ou a uma temperatura abaixo da temperatura ambiente (como 4-10 °C). Em outras modalidades, a taxa de desbloqueio é medida a uma temperatura elevada, como 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C ou 65 °C. Em algumas modalidades, a taxa de desbloqueio é medida em solução em um ambiente de pH básico, por exemplo, em pH 9,0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8. ou 10,0. Em algumas modalidades, a razão molar do reagente de desbloqueio para o substrato (isto é, nucleosídeo ou nucleotídeo bloqueador 3ʹ) é de cerca de 10:1, cerca de 5:1, cerca de 2:1, cerca de 1:1, cerca de 1:2, cerca de 1:5 ou cerca de 1:10. Em uma modalidade, cada ffN contém o grupo 3’-AOM.

[0145] Em quaisquer modalidades dos métodos descritos na presente invenção, o nucleotídeo marcado é um nucleotídeo triosfato. Em qualquer modalidade do método descrito na presente invenção, a fita de polinucleotídeo alvo é ligada a um suporte sólido, como uma célula de fluxo.

[0146] Em uma modalidade, pelo menos um nucleotídeo é incorporado a um polinucleotídeo na etapa de síntese pela ação de uma enzima polimerase. Em algumas modalidades, a polimerase pode ser DNA polimerase Pol 812 ou Pol 1901. No entanto, outros métodos de ligação de nucleotídeos a polinucleotídeos, como, por exemplo, síntese química de oligonucleotídeos ou ligação de oligonucleotídeos marcados a oligonucleotídeos não marcados, podem ser usados. Portanto, o termo “incorporar”, quando usado em referência a um nucleotídeo e polinucleotídeo, pode abranger a síntese de polinucleotídeo por métodos químicos, bem como métodos enzimáticos.

[0147] Em uma modalidade específica, uma etapa sintética é realizada e pode compreender opcionalmente a incubação de uma fita-molde de polinucleotídeo com uma mistura de reação compreendendo nucleotídeos bloqueados a 3’ marcados da divulgação. Uma polimerase também pode ser fornecida em condições que permitem a formação de uma ligação fosfodiéster entre um grupo 3'-OH livre em uma fita de polinucleotídeo anelada na fita molde de polinucleotídeo e um grupo 5 'fosfato no nucleotídeo. Assim, uma etapa sintética pode incluir a formação de uma fita de polinucleotídeo conforme direcionado pelo pareamento de bases complementares de nucleotídeos a uma fita molde.

[0148] Em todas as modalidades dos métodos, a etapa de detecção pode ser realizada enquanto a fita de polinucleotídeo na qual os nucleotídeos marcados são incorporados é anelada em uma fita molde, ou após uma etapa de desnaturação em que as duas fitas são separadas. Etapas adicionais, por exemplo etapas de reação química ou enzimática ou etapas de purificação, podem ser incluídas entre a etapa de síntese e a etapa de detecção. Em particular, a cadeia alvo que incorpora o (s) nucleotídeo (s) marcado (s) pode ser isolada ou purificada e então processada posteriormente ou usada em uma análise subsequente. A título de exemplo, polinucleotídeos alvo marcados com nucleotídeo (s) conforme descrito na presente invenção em uma etapa sintética podem ser subsequentemente usados como sondas ou iniciadors marcados. Em outras modalidades, o produto da etapa de síntese aqui estabelecida pode ser submetido a outras etapas de reação e, se desejado, o produto dessas etapas subsequentes purificado ou isolado.

[0149] As condições adequadas para a etapa de síntese serão bem conhecidas pelos técnicos no assunto com as técnicas padrão de biologia molecular. Em uma modalidade, uma etapa sintética pode ser análoga a uma reação de extensão de iniciador padrão usando precursores de nucleotídeos, incluindo nucleotídeos como descrito na presente invenção, para formar uma fita alvo estendida complementar à fita molde na presença de uma enzima polimerase adequada. Em outras modalidades, a etapa sintética pode ela própria fazer parte de uma reação de amplificação produzindo um produto de amplificação de fita dupla marcado composto por fitas complementares aneladas derivadas das fitas-alvo e fitas-molde de polinucleotídeo. Outras etapas sintéticas exemplificativas incluem Nick-tradução, polimerização de deslocamento de fita, marcação de DNA iniciada aleatoriamente etc. Uma enzima polimerase particularmente útil para uma etapa sintética é aquela que é capaz de catalisar a incorporação de nucleotídeos como na presente invenção estabelecido. Uma variedade de polimerases de ocorrência natural ou modificadas podem ser usadas. A título de exemplo, uma polimerase termoestável pode ser usada para uma reação sintética que é realizada usando condições de termociclagem, enquanto uma polimerase termoestável pode não ser desejada para reações de extensão de iniciador isotérmico. Polimerases termoestáveis adequadas que são capazes de incorporar os nucleotídeos de acordo com a divulgação incluem aquelas descritas em WO 2005/024010 ou WO 06/120433, cada um dos quais sendo aqui incorporado por referência. Em reações sintéticas que são realizadas a temperaturas mais baixas, como 37 °C, as enzimas polimerase não precisam ser necessariamente polimerases termoestáveis, portanto, a escolha da polimerase dependerá de uma série de fatores, como temperatura de reação, pH, atividade de deslocamento de fita e semelhantes.

[0150] Em modalidades não limitativas específicas, a divulgação abrange métodos de sequenciamento de ácido nucleico, re-sequenciamento, sequenciamento de genoma completo, pontuação de polimorfismo de nucleotídeo único, qualquer outra aplicação envolvendo a detecção do nucleotídeo ou nucleosídeo marcado estabelecido na presente invenção quando incorporado em um polinucleotídeo. Qualquer uma de uma variedade de outras aplicações que beneficiam o uso de polinucleotídeos marcados com os nucleotídeos compreendendo corante fluorescentes pode usar nucleotídeos marcados ou nucleosídeos com os corantes na presente invenção estabelecidos.

[0151] Em uma modalidade particular, a divulgação fornece o uso de nucleotídeos marcados de acordo com a divulgação em uma reação de sequenciamento por síntese de polinucleotídeo (SBS). O sequenciamento por síntese geralmente envolve a adição sequencial de um ou mais nucleotídeos ou oligonucleotídeos a uma cadeia de polinucleotídeo em crescimento na direção de 5 'para 3' usando uma polimerase ou ligase para formar uma cadeia de polinucleotídeo estendida complementar ao ácido nucleico molde a ser sequenciado. A identidade da base presente em um ou mais do (s) nucleotídeo(s) adicionado (s) pode ser determinada em uma etapa de detecção ou “imageamento”. A identidade da base adicionada pode ser determinada após cada etapa de incorporação de nucleotídeos. A sequência molde pode então ser inferida usando as regras convencionais de emparelhamento de bases Watson-Crick. O uso dos nucleotídeos marcados na presente invenção estabelecidos para a determinação da identidade de uma única base pode ser útil, por exemplo, na pontuação de polimorfismos de nucleotídeo único, e tais reações de extensão de base única estão dentro do escopo desta divulgação.

[0152] Em uma modalidade da presente divulgação, a sequência de um polinucleotídeo molde é determinada pela detecção da incorporação de um ou mais nucleotídeos bloqueados a 3ʹ descrito na presente invenção em uma fita nascente complementar ao polinucleotídeo molde a ser sequenciado através da detecção de marcador(es) ligado(s) ao(s) nucleotídeo(s) incorporado(s). O sequenciamento do polinucleotídeo molde pode ser iniciado com um iniciador adequado (ou preparado como uma construção em grampo que conterá o iniciador como parte do grampo), e a cadeia nascente é estendida de forma gradativa pela adição de nucleotídeos na extremidade 3’ do iniciador em uma reação catalisada por polimerase.

[0153] Em modalidades particulares, cada um dos diferentes nucleotídeos triosfato (A, T, G e C) pode ser marcado com um fluoróforo único e também compreende um grupo bloqueador na posição 3’para evitar a polimerização descontrolada. Alternativamente, um dos quatro nucleotídeos pode ser não marcado (escuro). A enzima polimerase incorpora um nucleotídeo na cadeia nascente complementar ao polinucleotídeo molde, e o grupo bloqueador impede a posterior incorporação de nucleotídeos. Quaisquer nucleotídeos não incorporados podem ser lavados e o sinal fluorescente de cada nucleotídeo incorporado pode ser “lido” opticamente por meios adequados, tais como um dispositivo de carga acoplada usando excitação a laser e filtros de emissão adequados. O grupo bloqueador 3’e os compostos corante fluorescente podem então ser removidos (desprotegidos) simultaneamente ou sequencialmente para expor a cadeia nascente para posterior incorporação de nucleotídeos. Normalmente, a identidade do nucleotídeo incorporado será determinada após cada etapa de incorporação, mas isso não é estritamente essencial. Da mesma forma, a Pat. Nº 5,302,509 (que é aqui incorporada por referência) divulga um método para sequenciar polinucleotídeos imobilizados em um suporte sólido.

[0154] O método, conforme exemplificado acima, utiliza a incorporação de nucleotídeos A, G, C, e T bloqueados em 3’ marcados com fluorescência em uma fita nascente complementar ao polinucleotídeo imobilizado, na presença de DNA polimerase. A polimerase incorpora uma base complementar ao polinucleotídeo alvo, mas é impedida de nova adição pelo grupo bloqueador a 3'. O marcador do nucleotídeo incorporado pode então ser determinado, e o grupo bloqueador removido por clivagem química para permitir que ocorra mais polimerização.

O molde de ácido nucleico a ser sequenciado em uma reação de sequenciamento por síntese pode ser qualquer polinucleotídeo que se deseja sequenciar.

O molde de ácido nucleico para uma reação de sequenciamento compreenderá tipicamente uma região de fita dupla possuindo um grupo 3'-OH livre que serve como um iniciador ou ponto de iniciação para a adição de mais nucleotídeos na reação de sequenciamento.

A região do molde a ser sequenciado se projeta sobre este grupo 3'-OH livre na fita complementar.

A região protuberante do molde a ser sequenciado pode ser de fita simples, mas pode ser de fita dupla, desde que uma “cabeça esteja presente” na fita complementar à fita-molde a ser sequenciado para fornecer um grupo 3'-OH livre para iniciação da reação de sequenciamento.

Em tais modalidades, o sequenciamento pode prosseguir por deslocamento da fita.

Em certas modalidades, um iniciador contendo o grupo 3'-OH livre pode ser adicionado como um componente separado (por exemplo, um pequeno oligonucleotídeo) que hibridiza para uma região de fita simples do molde a ser sequenciado.

Alternativamente, o iniciador e a cadeia molde a ser sequenciada podem, cada um, fazer parte de uma cadeia de ácido nucleico parcialmente autocomplementar capaz de formar um duplex intramolecular, tal como, por exemplo, uma estrutura de loop em forma de gancho.

Polinucleotídeos em forma de gancho e métodos pelos quais eles podem ser ligados a suportes sólidos são divulgados nas Publicações PCT Nos WO 01/57248 e WO 2005/047301, cada um dos quais é aqui incorporado por referência.

Os nucleotídeos podem ser adicionados sucessivamente a um iniciador nascente, resultando na síntese de uma cadeia de polinucleotídeo na direção 5 'para 3'. A natureza da base que foi adicionada pode ser determinada, particularmente, mas não necessariamente após cada adição de nucleotídeo, fornecendo assim informações de sequência para o molde de ácido nucleico.

Assim, um nucleotídeo é incorporado a uma fita de ácido nucleico (ou polinucleotídeo) pela união do nucleotídeo ao grupo 3'-OH livre da fita de ácido nucleico por meio da formação de uma ligação fosfodiéster com o grupo 5' fosfato do nucleotídeo.

[0155] O molde de ácido nucleico a ser sequenciado pode ser DNA ou RNA, ou mesmo uma molécula híbrida composta por desoxinucleotídeos e Ribonucleotídeos. O molde de ácido nucleico pode compreender nucleotídeos de ocorrência natural e/ou não natural e ligações de cadeia principal naturais ou não naturais, desde que estes não impeçam a cópia do molde na reação de sequenciamento.

[0156] Em certas modalidades, o molde de ácido nucleico a ser sequenciado pode ser ligado a um suporte sólido por meio de qualquer método de ligação adequado conhecido no estado da técnica, por exemplo, por meio de ligação covalente. Em certas modalidades, o molde de polinucleotídeos pode ser ligado diretamente a um suporte sólido (por exemplo, um suporte à base de sílica). No entanto, em outras modalidades de divulgação, a superfície do suporte sólido pode ser modificada de alguma forma de modo a permitir a ligação covalente direta do molde de polinucleotídeo, ou imobilizar o molde de polinucleotídeo através de uma multicamada de hidrogel ou polieletrólito, que pode ser não-covalentemente ligada ao suporte sólido. Modalidades e alternativas de sequenciamento por síntese

[0157] Algumas modalidades incluem técnicas de pirosequenciamento. O pirosequenciamento detecta a liberação de pirofosfato inorgânico (PPi) conforme nucleotídeos específicos são incorporados à fita nascente (Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M. and Nyren, P. (1996) “Real-time DNA sequencing using detection of pyrofosfato release.” Analytical Biochemistry 242(1), 84-9; Ronaghi, M. (2001) “Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing.” Genome Res. 11(1), 3-11; Ronaghi, M., Uhlen, M. and Nyren, P. (1998) “A sequencing method based on real-time pyrofosfato.” Science 281(5375), 363; U.S. Pat. Nos 6,210,891; 6,258,568 and 6,274,320, cujas divulgações são incorporadas na presente invenção por referência em sua totalidade). No pirosequenciamento, o PPi liberado pode ser detectado por ser imediatamente convertido em trifosfato de adenosina (ATP) pela ATP sulfurase, e o nível de ATP gerado é detectado via fótons produzidos pela luciferase. Os ácidos nucleicos a serem sequenciados podem ser ligados a características em um arranjo e o arranjo pode ser gerado por imagem para capturar os sinais quimioluminescentes que são produzidos devido à incorporação de um nucleotídeo nas características do arranjo. Uma imagem pode ser obtida depois que o arranjo é tratado com um tipo de nucleotídeo específico (por exemplo A, T, C ou G). As imagens obtidas após a adição de cada tipo de nucleotídeo serão diferentes no que diz respeito a quais recursos no arranjo são detectados. Essas diferenças na imagem refletem o conteúdo de sequência diferente das características no arranjo. No entanto, as localizações relativas de cada característica permanecerão inalteradas nas imagens. As imagens podem ser armazenadas, processadas e analisadas usando os métodos na presente invenção estabelecidos. Por exemplo, as imagens obtidas após o tratamento do arranjo com cada tipo de nucleotídeo diferente podem ser tratadas da mesma maneira como na presente invenção exemplificado para imagens obtidas a partir de diferentes canais de detecção para métodos de sequenciamento baseados em terminador reversível.

[0158] Em outro tipo exemplificativo de SBS, o sequenciamento do ciclo é realizado pela adição gradativa de nucleotídeos terminadores reversíveis contendo, por exemplo, um marcador de corante clivável ou fotoescobrível como descrito, por exemplo, em WO 04/018497 e Patente US Nº 7,057,026,

cujas divulgações são aqui incorporadas por referência. Esta abordagem está sendo comercializada pela Solexa (agora Illumina, Inc.), e também é descrita em WO 91/06678 e WO 07/123,744, cada um dos quais é aqui incorporado por referência. A disponibilidade de terminadores marcados com fluorescência em que tanto a terminação pode ser revertida, quanto o marcador fluorescente clivado facilita o sequenciamento de terminação reversível cíclica (CRT) eficiente. As polimerases também podem ser co-projetadas para incorporar e estender com eficiência a partir desses nucleotídeos modificados.

[0159] Preferivelmente, em modalidades de sequenciamento com base em terminador reversível, os marcadores não inibem substancialmente a extensão sob as condições de reação SBS. No entanto, os marcadores de detecção podem ser removíveis, por exemplo, por clivagem ou degradação. As imagens podem ser capturadas após a incorporação de marcadores em características de ácido nucleico em arranjo. Em modalidades particulares, cada ciclo envolve a liberação simultânea de quatro tipos diferentes de nucleotídeos ao arranjo e cada tipo de nucleotídeo tem um marcador espectralmente distinto. Quatro imagens podem então ser obtidas, cada uma usando um canal de detecção que é seletivo para um dos quatro marcadores diferentes. Alternativamente, diferentes tipos de nucleotídeos podem ser adicionados sequencialmente, e uma imagem do arranjo pode ser obtida entre cada etapa de adição. Em tais modalidades, cada imagem mostrará características de ácido nucleico que incorporaram nucleotídeos de um tipo particular. Diferentes características estarão presentes ou ausentes nas diferentes imagens devido ao conteúdo de sequência diferente de cada característica. No entanto, a posição relativa das características permanecerá inalterada nas imagens. Imagens obtidas a partir de tais métodos de terminador reversível-SBS podem ser armazenadas, processadas e analisadas conforme estabelecido na presente invenção. Após a etapa de captura de imagem, os marcadores podem ser removidos, e as porções terminadoras reversíveis podem ser removidas para ciclos subsequentes de adição e detecção de nucleotídeos. A remoção dos marcadores após terem sido detectados em um determinado ciclo e antes de um ciclo subsequente pode fornecer a vantagem de reduzir o sinal de fundo e a interferência entre os ciclos. Exemplos de marcadores úteis e métodos de remoção são apresentados abaixo.

[0160] Algumas modalidades podem utilizar a detecção de quatro nucleotídeos diferentes usando menos de quatro marcadores diferentes. Por exemplo, o SBS pode ser realizado utilizando métodos e sistemas descritos nos materiais incorporados da Pub. U.S. Nº 2013/0079232. Como um primeiro exemplo, um par de tipos de nucleotídeos pode ser detectado no mesmo comprimento de onda, mas distinguido com base em uma diferença de intensidade para um membro do par em comparação com o outro, ou com base em uma mudança em um membro do par (por exemplo, via modificação química, modificação fotoquímica ou modificação física) que faz com que o sinal aparente apareça ou desapareça em comparação com o sinal detectado para o outro membro do par. Como um segundo exemplo, três dos quatro tipos diferentes de nucleotídeos podem ser detectados em condições particulares, enquanto um quarto tipo de nucleotídeo não tem um marcador que seja detectável nessas condições, ou é minimamente detectado nessas condições (por exemplo, detecção mínima devido à fluorescência de fundo etc.). A incorporação dos três primeiros tipos de nucleotídeos em um ácido nucleico pode ser determinada com base na presença de seus respectivos sinais e a incorporação do quarto tipo de nucleotídeo no ácido nucleico pode ser determinada com base na ausência ou detecção mínima de qualquer sinal. Como um terceiro exemplo, um tipo de nucleotídeo pode incluir marcador (es)

que são detectados em dois canais diferentes, enquanto outros tipos de nucleotídeos são detectados em não mais do que um dos canais. As três configurações exemplificativas mencionadas acima não são consideradas mutuamente exclusivas e podem ser usadas em várias combinações. Uma modalidade exemplificativa que combina todos os três exemplos, é um método SBS baseado em fluorescência que usa um primeiro tipo de nucleotídeo que é detectado em um primeiro canal (por exemplo dATP que tem um marcador que é detectado no primeiro canal quando excitado por um primeiro comprimento de onda de excitação), um segundo tipo de nucleotídeo que é detectado em um segundo canal (por exemplo, dCTP que tem um marcador que é detectado no segundo canal quando excitado por um segundo comprimento de onda de excitação), um terceiro tipo de nucleotídeo que é detectado tanto no primeiro quanto no segundo canal (por exemplo dTTP que tem pelo menos um marcador que é detectado em ambos os canais quando excitado pelo primeiro e/ou segundo comprimento de onda de excitação) e um quarto tipo de nucleotídeo que não possui um marcador que não é, ou minimamente, detectado em nenhum dos canais (por exemplo dGTP sem marcador).

[0161] Além disso, conforme descrito nos materiais incorporados da publicação US Nº 2013/0079232, os dados de sequenciamento podem ser obtidos usando um único canal. Em tais abordagens do assim chamado sequenciamento de um corante, o primeiro tipo de nucleotídeo é marcado, mas o marcador é removido após a primeira imagem ser gerada, e o segundo tipo de nucleotídeo é marcado apenas após a geração de uma primeira imagem. O terceiro tipo de nucleotídeo retém seu marcador na primeira e na segunda imagens, e o quarto tipo de nucleotídeo permanece sem marcador em ambas as imagens.

[0162] Algumas modalidades podem utilizar sequenciamento por técnicas de ligação. Tais técnicas utilizam DNA ligase para incorporar oligonucleotídeos e identificar a incorporação de tais oligonucleotídeos. Os oligonucleotídeos normalmente possuem marcadores diferentes que são correlacionados com a identidade de um determinado nucleotídeo em uma sequência com a qual os oligonucleotídeos hibridizam. Tal como acontece com outros métodos SBS, as imagens podem ser obtidas após o tratamento de uma série de características de ácido nucleico com os reagentes de sequenciamento marcados. Cada imagem mostrará características de ácido nucleico que incorporaram marcadores de um tipo específico. Diferentes características estarão presentes ou ausentes nas diferentes imagens devido ao conteúdo de sequência diferente de cada característica, mas a posição relativa das características permanecerá inalterada nas imagens. Imagens obtidas a partir de métodos de sequenciamento baseados em ligação podem ser armazenadas, processadas e analisadas conforme estabelecido na presente invenção. Sistemas SBS exemplificativos e métodos que podem ser utilizados com os métodos e sistemas descritos na presente invenção são descritos na Patente U.S. Nos 6,969,488, 6,172,218, e 6,306,597, cujas divulgações são incorporadas na presente invenção por referência em sua totalidade.

[0163] Algumas modalidades podem utilizar sequenciamento de nanopore (Deamer, D. W. & Akeson, M. “Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing.” Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000); Deamer, D. and D. Branton, “Characterization of nucleic acids by nanopore analysis”, Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002); Li, J., M. Gershow, D. Stein, E. Brandin, e J. A. Golovchenko, “DNA molecules and configurations in a solid- state nanopore microscope” Nat. Mater. 2:611-615 (2003cujas divulgações são incorporadas na presente invenção por referência em sua totalidade). Em tais modalidades, o ácido nucleico alvo passa por um nanoporo. O nanoporo pode ser um poro sintético ou proteína de membrana biológica, como α-hemolisina. Conforme o ácido nucleico alvo passa através do nanoporo, cada par de bases pode ser identificado medindo as flutuações na condutância elétrica do poro. (U.S. Pat. Nº 7,001,792; Soni, G. V. & Meller, “A. Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores.” Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007); Healy, K. “Nanopore-based single-molecule DNA analysis.” Nanomed. 2, 459- 481 (2007); Cockroft, S. L., Chu, J., Amorin, M. & Ghadiri, M. R. “A single- molecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single- nucleotide resolution.” J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008), cujas divulgações são incorporadas na presente invenção por referência em sua totalidade). Os dados obtidos a partir do sequenciamento de nanoporos podem ser armazenados, processados e analisados conforme estabelecido na presente invenção. Em particular, os dados podem ser tratados como uma imagem de acordo com o tratamento exemplificativo de imagens ópticas e outras imagens que é apresentado na presente invenção.

[0164] Algumas outras modalidades do método de sequenciamento envolvem o uso do nucleotídeo bloqueado a 3’ descrito na presente invenção na técnica de sequenciamento de nanobolas, tais como aquelas descritas na Patente U.S. Nº 9.222.132, cuja divulgação é incorporada por referência. Através do processo de amplificação por círculo rolante (RCA), um grande número de nanobolas de DNA discretas pode ser gerado. A mistura de nanobolas é então distribuída em uma superfície lateral padronizada contendo características que permitem que uma única nanobola se associe a cada sítio. Na geração de nanobolas de DNA, o DNA é fragmentado e ligado à primeira de quatro sequências adaptadoras. O molde é amplificado, circularizado e clivado com uma endonuclease do tipo II. Um segundo conjunto de adaptadores é adicionado, seguido por amplificação, circularização e clivagem. Este processo é repetido para os dois adaptadores restantes. O produto final é um molde circular com quatro adaptadores, cada um separado por uma sequência de molde. Moléculas de biblioteca passam por uma etapa de amplificação por círculo rolante, gerando uma grande massa de concatêmeros chamados nanobolas de DNA, que são então depositados em uma célula de fluxo. Goodwin et al., “Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies,” Nat Rev Genet. 2016;17(6):333-51.

[0165] Algumas modalidades podem utilizar métodos envolvendo o monitoramento em tempo real da atividade da DNA polimerase. As incorporações de nucleotídeos podem ser detectadas por meio de interações de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) entre uma polimerase portadora de fluoróforo e nucleotídeos marcados com γ-fosfato, conforme descrito, por exemplo, na Patente U.S. Nos 7,329,492 e 7,211,414, ambos aqui incorporados por referência, ou as incorporações de nucleotídeos podem ser detectadas com guias de onda de modo zero como descrito, por exemplo, na Pat. Nº 7,315,019, que é aqui incorporada por referência, e usando análogos de nucleotídeos fluorescentes e polimerases projetadas como descrito, por exemplo, na Patente U.S. Nº 7,405,281 e U.S. Pub. Nº 2008/0108082, ambos aqui incorporados por referência. A iluminação pode ser restrita a um volume de escala de zeptolitro em torno de uma polimerase ligada à superfície, de modo que a incorporação de nucleotídeos marcados com fluorescência possa ser observada com fundo baixo (Levene, M. J. et al. “Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations.” Science 299, 682-686 (2003); Lundquist, P. M. et al. “Parallel confocal detection of single molecules in real time.” Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach, J. et al. “Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nano structures.” Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008), cujas divulgações são incorporadas na presente invenção por referência em sua totalidade). As imagens obtidas a partir de tais métodos podem ser armazenadas, processadas e analisadas conforme estabelecido na presente invenção.

[0166] Algumas modalidades de SBS incluem a detecção de um próton liberado após a incorporação de um nucleotídeo em um produto de extensão. Por exemplo, o sequenciamento com base na detecção de prótons liberados pode usar um detector elétrico e técnicas associadas que estão comercialmente disponíveis pela Ion Torrent (Guilford, CT, uma subsidiária da Life Technologies) ou métodos e sistemas de sequenciamento descritos em U.S. Pub. Nos 2009/0026082; 2009/0127589; 2010/0137143; e 2010/0282617, todos os quais são incorporados aqui por referência. Os métodos aqui apresentados para amplificar ácidos nucleicos alvo usando exclusão cinética podem ser facilmente aplicados a substratos usados para detectar prótons. Mais especificamente, os métodos aqui estabelecidos podem ser usados para produzir populações clonais de amplicons que são usados para detectar prótons.

[0167] Os métodos SBS acima podem ser vantajosamente realizados em formatos multiplex de modo que vários ácidos nucleicos alvo diferentes sejam manipulados simultaneamente. Em modalidades particulares, diferentes ácidos nucleicos alvo podem ser tratados em um vaso de reação comum ou em uma superfície de um substrato particular. Isso permite a entrega conveniente de reagentes de sequenciamento, remoção de reagentes que não reagiram e detecção de eventos de incorporação de maneira multiplex. Em modalidades que usam ácidos nucleicos alvo ligados à superfície, os ácidos nucleicos alvo podem estar em um formato de arranjo. Em um formato de matriz, os ácidos nucleicos alvo podem ser tipicamente ligados a uma superfície de uma maneira espacialmente distinguível. Os ácidos nucleicos alvo podem ser ligados por ligação covalente direta, ligação a uma microesfera ou outra partícula ou ligação a uma polimerase ou outra molécula que está ligada à superfície. O arranjo pode incluir uma única cópia de um ácido nucleico alvo em cada sítio (também referido como uma característica) ou várias cópias com a mesma sequência podem estar presentes em cada sítio ou característica. Múltiplas cópias podem ser produzidas por métodos de amplificação, como amplificação em ponte ou PCR de emulsão conforme descrito em mais detalhes abaixo.

[0168] Os métodos aqui estabelecidos podem usar arranjos com características em qualquer uma de uma variedade de densidades incluindo, por exemplo, pelo menos cerca de 10 características/cm2, 100 características/cm2, 500 características/cm2, 1.000 características/cm2. 5.000 características/cm2. 10.000 características/cm2. 50.000 características/cm2.

100.000 características/cm2. 1.000.000 características/cm2. 5.000.000 características/cm2, ou superior.

[0169] Uma vantagem dos métodos na presente invenção estabelecidos é que eles fornecem detecção rápida e eficiente de uma pluralidade de ácido nucleico alvo em paralelo. Por conseguinte, a presente divulgação fornece sistemas integrados capazes de preparar e detectar ácidos nucleicos usando técnicas conhecidas no estado da técnica, como aquelas exemplificadas acima. Assim, um sistema integrado da presente divulgação pode incluir componentes fluídicos capazes de fornecer reagentes de amplificação e/ou reagentes de sequenciamento para um ou mais fragmentos de DNA imobilizados, o sistema compreendendo componentes como bombas, válvulas, reservatórios, linhas fluídicas e semelhantes. Uma célula de fluxo pode ser configurada e/ou usada em um sistema integrado para detecção de ácidos nucleicos alvo. Células de fluxo exemplificativas são descritas, por exemplo, na Pub. U.S. Nº 2010/0111768 e US Ser. Nº 13/273.666, cada um dos quais é aqui incorporado por referência. Conforme exemplificado para células de fluxo, um ou mais dos componentes fluídicos de um sistema integrado podem ser usados para um método de amplificação e para um método de detecção. Tomando uma modalidade de sequenciamento de ácido nucleico como um exemplo, um ou mais dos componentes fluídicos de um sistema integrado podem ser usados para um método de amplificação na presente invenção estabelecido e para a liberação de reagentes de sequenciamento em um método de sequenciamento, como aqueles exemplificados acima. Alternativamente, um sistema integrado pode incluir sistemas fluídicos separados para realizar métodos de amplificação e para realizar métodos de detecção. Exemplos de sistemas de sequenciamento integrados que são capazes de criar ácidos nucleicos amplificados e também determinar a sequência dos ácidos nucleicos incluem, sem limitação, a plataforma MiSeq™ (Illumina, Inc., San Diego, CA) e dispositivos descritos em US Ser. Nº 13/273.666, que é aqui incorporada por referência.

[0170] Arranjos em que os polinucleotídeos foram diretamente ligados a suportes à base de sílica são aqueles por exemplo divulgados no documento WO 00/06770 (incorporado na presente invenção por referência), em que os polinucleotídeos são imobilizados em um suporte de vidro por reação entre um grupo epóxido pendente no vidro com um grupo amino interno no polinucleotídeo. Além disso, os polinucleotídeos podem ser ligados a um suporte sólido pela reação de um nucleófilo à base de enxofre com o suporte sólido, por exemplo, conforme descrito em WO 2005/047301 (incorporado na presente invenção por referência). Um outro exemplo de polinucleotídeos molde com suporte sólido é quando os polinucleotídeos molde são ligados a hidrogel com suporte em sílica ou outros suportes sólidos, por exemplo, conforme descrito em WO 00/31148, WO 01/01143, WO 02/12566, WO 03/014392, Patente US. Nº 6.465.178 e WO 00/53812, cada um dos quais é incorporado na presente invenção por referência.

[0171] Uma superfície particular na qual os polinucleotídeos molde podem ser imobilizados é um hidrogel de poliacrilamida. Os hidrogéis de poliacrilamida são descritos nas referências citadas acima e em WO 2005/065814, que é aqui incorporado por referência. Hidrogéis específicos que podem ser usados incluem aqueles descritos em WO 2005/065814 e U.S. Pub. Nº 2014/0079923. Em uma modalidade, o hidrogel é PAZAM (poli (N- (5- azidoacetamidilpentil) acrilamida-co-acrilamida)).

[0172] Moléculas de molde de DNA podem ser ligadas a microesferas ou micropartículas, por exemplo, conforme descrito em Pat. Nº 6.172.218 (que é aqui incorporada por referência). A ligação a microesferas ou micropartículas pode ser útil para aplicações de sequenciamento. Bibliotecas de microesferas podem ser preparadas onde cada microesfera contém diferentes sequências de DNA. Bibliotecas e métodos exemplificativos para a sua criação são descritos em Nature, 437, 376-380 (2005); Science, 309, 5741, 1728-1732 (2005), cada um dos quais é aqui incorporado por referência. O sequenciamento de arranjos de tais microesferas usando nucleotídeos na presente invenção estabelecidos está dentro do escopo da divulgação.

[0173] Os moldes a serem sequenciados podem formar parte de um “arranjo” em um suporte sólido, em que o arranjo pode assumir qualquer forma conveniente. Assim, o método da divulgação é aplicável a todos os tipos de arranjos de alta densidade, incluindo arranjos de molécula única, arranjos agrupados e arranjos de microesferas. A divulgação da presente descrição de nucleotídeos marcados pode ser usada para moldes de sequenciamento em essencialmente qualquer tipo de arranjo, incluindo, mas não se limitando àqueles formados pela imobilização de moléculas de ácido nucleico em um suporte sólido.

[0174] No entanto, os nucleotídeos marcados da divulgação são particularmente vantajosos no contexto de sequenciamento de arranjos agrupados. Em arranjos agrupados, regiões distintas no arranjo (muitas vezes chamadas de sítios ou características) compreendem várias moléculas de molde de polinucleotídeo. Geralmente, as várias moléculas de polinucleotídeo não são individualmente distinguidas por meios ópticos e, em vez disso, são detectadas como um conjunto. Dependendo de como o arranjo é formado, cada sítio no arranjo pode compreender várias cópias de uma molécula de polinucleotídeo individual (por exemplo, o sítio é homogêneo para uma determinada espécie de ácido nucleico de fita simples ou dupla) ou mesmo várias cópias de um pequeno número de moléculas de polinucleotídeo diferentes (por exemplo, várias cópias de duas espécies de ácido nucleico diferentes). Arranjos agrupados de moléculas de ácido nucleico podem ser produzidas usando técnicas geralmente conhecidas no estado da técnica. A título de exemplo, os documentos WO 98/44151 e WO 00/18957, cada um dos quais é incorporado aqui, descrevem métodos de amplificação de ácidos nucleicos em que tanto o molde quanto os produtos de amplificação permanecem imobilizados em um suporte sólido, a fim de formar arranjos compreendidos por agrupamentos ou “colônias” de moléculas de ácido nucleico imobilizadas. As moléculas de ácido nucleico presentes nos arranjos agrupados preparados de acordo com estes métodos são modelos adequados para sequenciamento usando os nucleotídeos marcados com compostos corantes da divulgação.

[0175] Os nucleotídeos marcados da presente divulgação também são úteis no sequenciamento de modelos em arranjos de molécula única. O termo “arranjo de molécula única” ou “SMA”, conforme na presente invenção utilizado, se refere a uma população de moléculas de polinucleotídeo, distribuídas (ou agrupadas) sobre um suporte sólido, sendo que o espaçamento de qualquer polinucleotídeo individual de todos os outros da população é tal que é possível resolver individualmente as moléculas de polinucleotídeo individuais. As moléculas de ácido nucleico alvo imobilizadas na superfície do suporte sólido podem, portanto, ser capazes de ser distinguidas por meios ópticos. Em algumas modalidades. Isso significa que um ou mais sinais distintos, cada um representando um polinucleotídeo, ocorrerão dentro da área distinguível do dispositivo de imageamento utilizado.

[0176] A detecção de molécula única pode ser alcançada em que o espaçamento entre as moléculas de polinucleotídeo adjacentes em uma matriz é de pelo menos 100 nm, mais particularmente pelo menos 250 nm, ainda mais particularmente pelo menos 300 nm, ainda mais particularmente pelo menos 350 nm. Assim, cada molécula é individualmente distinguível e detectável como um ponto fluorescente de molécula única, e a fluorescência do referido ponto fluorescente de molécula única também exibe fotodegradação de etapa única.

[0177] Os termos “individualmente distinguidos” e “resolução individual” são usados neste documento para especificar que, quando visualizado, é possível distinguir uma molécula na matriz de suas moléculas vizinhas. A separação entre moléculas individuais na matriz será determinada, em parte, pela técnica particular usada para distinguir as moléculas individuais. As características gerais dos arranjos de molécula única serão compreendidas por referência aos pedidos publicados WO 00/06770 e WO 01/57248, cada um dos quais é aqui incorporado por referência. Embora um uso dos nucleotídeos da divulgação seja em reações de sequenciamento por síntese, a utilidade dos nucleotídeos não é limitada a tais métodos. Na verdade, os nucleotídeos podem ser usados, de forma vantajosa, em qualquer metodologia de sequenciamento que requeira a detecção de marcadores fluorescentes ligados a nucleotídeos incorporados em um polinucleotídeo.

[0178] Em particular, os nucleotídeos marcados da divulgação podem ser usados em protocolos de sequenciamento fluorescente automatizado, particularmente sequenciamento de ciclo de terminador fluorescente corante com base no método de sequenciamento de terminação de cadeia de Sanger e colegas de trabalho. Tais métodos geralmente usam enzimas e sequenciamento de ciclo para incorporar didesoxinucleotídeos marcados com fluorescência em uma reação de sequenciamento de extensão de iniciador. Os chamados métodos de sequenciamento de Sanger, e protocolos relacionados (tipo Sanger), utilizam terminação de cadeia aleatória com didesoxinucleotídeos marcados.

[0179] Assim, a presente divulgação também abrange nucleotídeos marcados que são didesoxinucleotídeos sem grupos hidroxila em ambas as posições 3’ e 2', tais didesoxinucleotídeos sendo adequados para uso em métodos de sequenciamento do tipo Sanger e semelhantes.

[0180] Nucleotídeos marcados da presente divulgação incorporando grupos bloqueadores a 3’, será verificado, também podem ser úteis em métodos de Sanger e protocolos relacionados, uma vez que o mesmo efeito obtido usando didesoxinucleotídeos pode ser alcançado usando nucleotídeos que tem grupos bloqueadores de 3'-OH: ambos evitam a incorporação de nucleotídeos subsequentes. Quando os nucleotídeos de acordo com a presente divulgação, e que tem um grupo bloqueador a 3’devem ser usados em métodos de sequenciamento do tipo Sanger, será apreciado que os compostos de corante ou marcadores detectáveis ligados aos nucleotídeos não precisam ser conectados através de ligantes cliváveis, uma vez que em cada caso em que um nucleotídeo marcado da divulgação é incorporado; nenhum nucleotídeo precisa ser subsequentemente incorporado e, portanto, o marcador não precisa ser removido do nucleotídeo.

[0181] Em quaisquer modalidades dos métodos descritos na presente invenção, o nucleotídeo usado na aplicação de sequenciamento é um nucleotídeo bloqueado a 3, descrito na presente invenção, por exemplo, o nucleotídeo de Fórmula (I), (Ia), ou (II). Em qualquer modalidade, o nucleotídeo bloqueado a 3ʹ é um nucleotídeo triofosfato. Exemplos

[0182] Modalidades adicionais são divulgadas em mais detalhes nos exemplos a seguir, que não se destinam de forma alguma a limitar o escopo das reivindicações. Exemplo 1. Preparação de Nucleosídeos 3'-Acetal -bloqueados

[0183] Neste exemplo, vários nucleosídeos T 3’-acetal-protegidos foram preparados de acordo com o Esquema 2.

Esquema 2.

[0184] Preparação de T1: Em um frasco de 100 mL purgado com nitrogênio seco em forno foi adicionado 5-iodo-2'-desoxiuridina (5,0 g, 14,12 mmol). Este foi co-evaporado 3 vezes com 30 mL de piridina e então colocado sob nitrogênio. Piridina anidra (25 mL) foi adicionada e a reação foi agitada à temperatura ambiente até que uma solução homogênea fosse obtida (~ 15 minutos). A mistura foi resfriada a 0 °C em um banho de água gelada e cloreto de terc-butildifenilasilila (4,04 mL, 15,5 mmol) foi adicionado lentamente, gota a gota sob agitação vigorosa (~ 1 hora). A reação foi mantida a 0 °C durante 8 horas até todo o SM ser consumido por TLC. Solução aquosa saturada de cloreto de amônio (~ 15 mL) foi adicionada e a reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente. A mistura foi diluída com acetato de etila (100 mL) e lavada com cloreto de amônio aquoso saturado (200 mL). A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extraída com acetato de etila (4 x 50 mL). As camadas orgânicas foram combinadas, secas (MgSO4) e concentradas a vacuo para produzir ~ 8 g de óleo amarelo claro após a remoção do solvente residual sob alto vácuo. O produto bruto T1 foi purificado por cromatografia em coluna flash em sílica como um sólido cristalino branco. O rendimento é de 6,94 g (83%). LC-MS (eletropulverização negativa) 591,08 [M-H]

[0185] Preparação de T2: Em um balão de três bocas de 500 mL seco em estufa, purgado com nitrogênio, foi adicionado T1 (6,23 g, 10,5 mmol), iodeto de cobre (I) (200 mg, 1,05 mmol) e bis (trifenilafosfina) dicloreto de paládio (II) (369 mg, 0,526 mmol) sob nitrogênio. O frasco foi protegido da luz e foi adicionado DMF desgaseificado anidro (200 mL). A esta solução foi adicionado 2,2,2-trifluoro-N-prop-2-inil-acetamida (4,74 g, 31,6 mmol), seguido por trietilamina desgaseificada (2,92 mL, 21,0 mmol). A reação foi agitada à temperatura ambiente sob nitrogênio durante 6 horas quando nenhum material de partida adicional foi observado por análise de TLC. Os voláteis foram removidos a vácuo (~ 15 min) e DMF removido sob alto vácuo (~ 1 hora) até o resíduo marrom. Este foi dissolvido em acetato de etila (200 mL) e extraído com EDTA 0,1 M em água (2 x 200 mL). As camadas aquosas foram combinadas e posteriormente extraídas com acetato de etila (200 mL). As fases orgânicas foram combinadas, secas (MgSO4) e os voláteis removidos a vácuo (~ 30 min) e posteriormente secos sob alto vácuo (~ 1 hora) para produzir cerca de 8 g de óleo marrom/amarelo em bruto. A mistura foi purificada por cromatografia em coluna flash em sílica gel como um sólido esbranquiçado. Rendimento: 6,0 g (85%). LC-MS (eletropulverização negativa) 614,19 [M-H].

[0186] Preparação de T3: A um frasco de 100 mL purgado com nitrogênio seco em estufa contendo o nucleosídeo inicial T2 (2,0 g, 3,25 mmol) sob nitrogênio foi adicionado DMSO anidro (6,9 mL, 97,5 mmol) em uma porção à temperatura ambiente e agitado até uma solução homogênea ter sido formada. Ácido acético (11,1 mL, 195 mmol) seguido por anidrido acético (15,1 mL, 162,09 mmol) foram ambos adicionados gota a gota (~ 5 minutos cada). A mistura foi aquecida a 50 °C e agitada até consumo completo do nucleosídeo inicial (~ 5 horas) por TLC (EtOAc/éter de petróleo 3:2). A reação foi então concentrada até metade do volume e resfriada com um banho de gelo a aproximadamente 0,5 °C. O trabalho foi iniciado pela adição lenta de NaHCO3 frio (~ 0,5 °C) (aq, sat.) (45 mL) e agitação adicional permitida até que não se observasse mais efervescência (~ 15 min). A solução foi deixada aquecer até à temperatura ambiente, então o aquoso foi extraído para EtOAc (3 x 100 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre MgSO4, filtradas e os voláteis evaporados sob pressão reduzida e posteriormente por alto vácuo. O produto bruto T3 foi purificado por cromatografia flash em sílica gel como um sólido esbranquiçado. Rendimento: 1,79 g (82%). LC-MS (eletropulverização negativa) 674,20 [M-H] -.

[0187] Preparação de T4: A uma solução do nucleosídeo inicial T3 (1,79 g, 2,649 mmol) em CH2Cl2 anidro (50 mL) sob N2 foi adicionado ciclo-hexeno (1,34 mL, 13,2 mmol). A mistura foi resfriada com um banho de gelo a 0 °C e cloreto de sulfurila destilado (322 L, 3,97 mmol) foi adicionado lentamente gota a gota (~ 20 min) sob N2, após agitação por 20 min a essa temperatura TLC (EtOAc: éter de petróleo = 3:2 v/v) indicou o consumo total do nucleosídeo inicial. O cloreto intermediário foi então extinto por adição direta, gota a gota, do álcool insaturado correspondente (5 eq.) recém destilado como mostrado no Esquema 3. A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas seguida por evaporação dos voláteis sob pressão reduzida. O resíduo oleoso foi particionado entre EtOAc: salmoura (3: 2) (125 mL). A camada orgânica foi separada e a aquosa foi ainda extraída em EtOAc (2 x 50 mL). Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre MgSO4, filtrados e os voláteis evaporados sob pressão reduzida. O resíduo oleoso foi particionado entre EtOAc: salmoura (3:2) (125 mL). A camada orgânica foi separada e a aquosa foi ainda extraída em EtOAc (2 x 50 mL). Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre MgSO4, filtrados e os voláteis evaporados sob pressão reduzida. Os produtos em bruto T4 foram purificados por cromatografia flash em sílica gel para produzir os produtos finais como um óleo amarelo. Rendimento: 1,20 g (69%) para AOM; 1,29 g (71%) para PrOM; 1,34 g (71%) para DPrOM.

[0188] 3'-AOM: óleo amarelo. LC-MS (Eletropulverização negativa) [M-H] 684,24.

[0189] 3'-PrOM: óleo amarelo. LC-MS (Eletropulverização negativa) [M-H] 682,22.

[0190] 3'-DPrOM: óleo amarelo. LC-MS (Eletropulverização negativa) [M- H] 710,25.

Esquema 3.

[0191] Preparação de T5: Ao material de partida T4 (1,04 g, 1,516 mmol) em um frasco de fundo redondo de 50 mL sob nitrogênio foi adicionado THF anidro (9 mL) à temperatura ambiente. Em seguida, TBAF (1,0 M em THF, 1,7 mL, 1,70 mmol) foi adicionado gota a gota e a solução agitada até todo SM ser consumido por TLC (~ 2 horas). A solução tornou-se laranja ao longo da reação. Os voláteis foram removidos a vácuo para produzir um resíduo laranja que foi dissolvido em EtOAc (100 mL) e separado com NaHCO3 (aquosa saturada) (60 mL). As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com EtOAc (60 mL). As camadas orgânicas foram combinadas, secas (MgSO 4), filtradas e evaporadas para produzir o produto bruto como um óleo amarelo. O produto em bruto foi purificado por cromatografia flash em sílica gel para produzir um óleo amarelo claro. Rendimento: 637 mg (94%) para AOM; 526 mg (78%) para PrOM; 617 mg (86%) para DPrOM.

[0192] 3ʹ-AOM: óleo amarelo claro. LC-MS (eletropulverização negativa) [M-H] 446,12.

[0193] 3ʹ-PrOM: óleo amarelo claro (526 mg 78%). LC-MS (eletropulverização negativa): [M-H] 444,10.

[0194] 3ʹ-DPrOM: óleo amarelo claro (617 mg 86%). LC-MS (eletropulverização negativa): [M-H] 472,13.

[0195] Além disso, dois nucleosídeos T bloqueados a 3' adicionais (3'- eAOM T e 3'-iAOM T) foram preparados seguindo a forma semelhante descrita acima. 3’-iAOM T: LC-MS (ES): (íon negativo) m/z 325,5 (M-H+), (íon positivo) 327,3 (M+H+). 3’-eAOM T: LC-MS (ES): (íon positivo) m/z 341,3 (M+1H+).

Exemplo 2. Teste de estabilidade de grupo bloqueador de 3ʹ-OH

[0196] Neste exemplo, os testes de estabilidade para o nucleotídeo 5ʹ-mP 3ʹ-AOM T foram realizados lado a lado em uma solução tampão de incorporação com o nucleotídeo 5ʹ-mP 3’-O-azidometil T padrão.

Formulação da solução tampão

[0197] 1 mL de 0,1 mM de cada nucleotídeo T 5'-monofosfato 3'- protegido em uma solução de tampão de etanolamina 100 mM (pH 9,8), NaCl 100 mM, e EDTA 2,5 mM, foi incubado a 65 °C em um bloco de aquecimento por 2 semanas. Em pontos de tempo definidos, alíquotas de 40 µL foram retiradas e analisadas por HPLC para determinar a porcentagem de nucleotídeo bloqueado restante e a eventual formação de nucleotídeo não bloqueado.

[0198] Os resultados do teste de estabilidade relacionados aos nucleotídeos 5'-monofosfato 3'-protegidos com AOM, PrOM, grupos protetores de acetal DPrOM e o grupo bloqueador de azidometil padrão são ilustrados na

FIG. 1. Foi observado que o nucleotídeo monofosfato bloqueado a 3’ com os grupos bloqueadores AOM, PrOM e DPrOM ofereceu uma melhora de 30-50 vezes na redução da taxa de desbloqueio na solução. Este experimento imita como os nucleotídeos totalmente funcionalizados correspondentes (ffNs) se comportariam quando armazenados em uma mistura de incorporação no cassete gênico de um dispositivo de sequenciamento. A melhoria da estabilidade oferecida por esses grupos protetores de acetal também levaria a uma taxa de pré-faseamento mais baixa nas execuções de sequenciamento. Finalmente, melhora a vida útil do reagente da mistura de incorporação. Exemplo 3. Testagem de desbloqueio de 3ʹ-AOM

[0199] Neste exemplo, os testes de desbloqueio para 5ʹ-mP 3ʹ-AOM T e o nucleotídeo 5ʹ-mP 3ʹ-O-azidometila T padrão foram realizados individualmente em uma solução única para cada grupo bloqueador. As condições foram formuladas para imitar o reagente de desbloqueio padrão da Illumina o mais próximo possível, e seguem a mesma metodologia. As concentrações do reagente de desbloqueio ativo, tampão e nucleosídeo são mantidas as mesmas em todos os testes, mas a identidade de cada componente era única. Desta forma, a diferença observada na taxa entre as químicas de desbloqueio individuais não pode ser devido às diferenças na concentração da formulação.

Condição de desbloqueio de azidometila padrão

[0200] Nucleotídeo: 5ʹ-monofosfato 3ʹ-O-azidometila T. Reagente de desbloqueio ativo: tris (hidróxipropil) fosfina (THP) (1 M em 18 m de água). (Opcional) Aditivo: Ascorbato de sódio (0,1 mM em 18 mΩ de água) conc. = 1 mM. Tampão: Etanolamina pH 9,8 (2 M em 18 ml de água). Reagente de supressão de fluorescência: H2O2. Condição de desbloqueio AOM

[0201] Nucleotídeo: 5'-monofosfato 3'-O-azidometila T. Uma solução concentrada de 3'-AOM T foi diluída para 0,1 mM em um tampão de etanolamina 100 mM (pH 9,8), em um frasco de vidro sob nitrogênio. Uma solução concentrada de aditivo de ascorbato de sódio foi adicionada a uma concentração final de 0,1 mM e a solução foi agitada 5 minutos. Para iniciar o ensaio, os reagentes de desbloqueio (Pd/THP = 1/5; ascorbato de sódio; etanolamina) foram adicionados, para uma concentração final de THP 1 mM, à solução em agitação à temperatura ambiente. Em pontos de tempo especificados, alíquotas de 40 µL foram tomadas e extintas com 6 µL de uma mistura 1:3 de EDTA/H2O2 (0,025:0,075 M). A análise de HPLC foi realizada medindo a área do pico de nucleosídeo inicial, o pico 3'-OH e quaisquer outros picos de nucleotídeo que aparecem no cromatograma de HPLC. Nenhum outro produto secundário à base de nucleotídeo foi observado.

[0202] O resultado comparativo é mostrado na FIG. 2A. Observou-se que o AOM ofereceu uma melhora na velocidade de 10 vezes em termos de taxa de desbloqueio em solução em comparação com o grupo bloqueador de azidometila padrão. Este experimento serve ao propósito de simular como os ffNs correspondentes se comportariam no sequenciamento durante a etapa de desbloqueio. A melhoria substancial na velocidade de desbloqueio permitiria uma etapa de desbloqueio tipo flush-through em vez do tempo de incubação de 10 a 20 segundos normalmente usado em certas plataformas de sequenciamento Illumina. Como resultado, a taxa de desbloqueio terá um impacto significativo no tempo de ciclo de sequenciamento por síntese (SBS).

[0203] Condições de teste semelhantes foram utilizadas para o ensaio de desbloqueio para 3ʹ-eAOM T e 3ʹ-iAOM T. Como uma única alteração, a razão catalisadora de Pd para substrato foi reduzida para 5:1 a fim de observar diferenças menos distintas na taxa de desbloqueio. 3ʹ-AOM T foi usado como referência e os resultados são ilustrados na FIG. 2B. Esses resultados mostraram que a taxa de desbloqueio de eAOM e iAOM é 2 a 3 vezes mais lenta do que AOM nesta concentração específica do reagente de desbloqueio do catalisador Pd. Pode-se esperar que a diferença nas taxas de desbloqueio entre a versão substituída e a versão não substituída dos grupos bloqueadores de AOM seja menor quando a razão catalisadora de Pd para substrato for maior. Exemplo 4. Otimização da mistura de clivagem de paládio para sequenciamento

[0204] O catalisador Pd/THP usado na reação de desbloqueio descrita no Exemplo 2 é muito sensível ao ar. Quando exposto ao ar, mostrou uma perda substancial de atividade. Neste exemplo, um ensaio de estresse de oxidação foi desenvolvido para avaliar a sensibilidade ao ar de diferentes formulações da mistura de clivagem de paládio.

[0205] 0,5 mL de mistura de clivagem de Pd foram aliquotados em um frasco de vidro de 5 mL e deixados abertos ao ar por 3 horas em temperatura ambiente. A atividade residual da mistura de clivagem oxidada foi avaliada medindo a clivagem de 3'-AOM T como segue. Uma solução concentrada de 3'- AOM T foi diluída para 0,1 mM em 100 mM de tampão de mistura de clivagem. Uma solução concentrada de ascorbato de sódio foi adicionada para uma concentração final de 1 mM, seguida pela mistura de clivagem oxidada para uma diluição final de 1/20. Após 1 hora, 40 µL da solução foram imediatamente extintos com 10 µL de uma mistura 1:1 de EDTA/H2O2 (0,25: 0,25 M) e analisados por HPLC. Neste experimento, vários reagentes tampão foram selecionados, incluindo: aminas primárias (como etanolamina, Tris e glicina); aminas terciárias (como 2-dimetilaminometanol ((DMEA), 2- dietialaminometanol (DEEA), N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina (TEMED) ou N,N,N’,N’-tetraetiletilenodiamina (TEEDA); e vários sais inorgânicos (como um sal de borato, um sal de carbonato, um sal de fosfato). Observou-se que reagentes tampão inorgânicos (como borato de sódio, carbonato de sódio, fosfato de sódio) ofereceram a melhor estabilidade ao ar e o complexo de paládio manteve alta % das atividades. Além disso, as aminas terciárias também melhoraram substancialmente a estabilidade da mistura de clivagem de Pd em comparação com as aminas primárias.

[0206] Com base nessas descobertas, duas misturas de clivagem de paládio foram preparadas. Em um primeiro exemplo, uma solução concentrada de tampão borato 250 mM aq. (pH 9,6, 20 mL) foi diluída com água (14 mL) antes da adição de uma solução concentrada de THP (1 M em Tris 100 mM, pH 9,5 mL, 5,0 mmol) e de dímero de cloreto de alilpaládio (II) (183 mg, 0,5 mmol). A mistura foi agitada vigorosamente durante alguns minutos à temperatura ambiente antes da adição de ascorbato de sódio aq. (0,5 mL, 0,5 mmol), NaCl aq. 5 M (10 mL) e Tween20 a 10% v/v (0,5 mL). Em um segundo exemplo, uma solução concentrada de tampão DEEA 2 M aq. (pH 9,6, 0,6 mL) foi diluída com água (7,6 mL) antes da adição de uma solução concentrada de THP (1 M em Tris 100 mM, pH 9, 1,2 mL, 1,2 mmol) e de dímero de cloreto de alilpaládio (II) sólido (43,9 mg, 0,12 mmol). A mistura foi agitada vigorosamente durante alguns minutos à temperatura ambiente antes da adição de ascorbato de sódio aq. (0,12 mL, 0,12 mmol), NaCl 5 M aq. (2,4 mL) e Tween20 10% v/v (0,12 mL). Exemplo 5. Preparação de Nucleotídeos Totalmente Funcionalizados e Usos para Aplicação de Sequenciamento

[0207] Neste exemplo, a preparação de vários nucleotídeos totalmente funcionalizados (ffNs) com o grupo bloqueador de 3'-AOM são descritos em detalhes. Esses ffNs também foram usados no sequenciamento por aplicação de síntese na plataforma Illumina MiniSeq®. Esquema 4. Síntese de 3'-AOM-ffC-LN3-SO7181

[0208] Síntese do intermediário AOM C2: O nucleosídeo C1 (0,5 g, 0,64 mmol) foi dissolvido em DCM anidro (12 mL) sob N2, e a mistura foi resfriada a 0 °C. Ciclohexeno (0,32 mL, 3,21 mmol) foi adicionado, seguido por SO2Cl2 gota a gota (1,0 M em DCM, 1,27 mL, 1,27 mmol). Ciclohexeno adicional (0,32 mL, 3,21 mmol) foi adicionado antes de transferir rapidamente a reação para um evaporador rotativo para remover todos os voláteis sob pressão reduzida. O resíduo sólido foi adicionalmente seco sob alto vácuo durante 10 min antes de ser dissolvido em DCM anidro (5 mL) sob N2. A mistura foi resfriada a 0 °C e álcool alílico gelado (5 mL) foi adicionado gota a gota. A reação foi agitada a 0 °C durante 2h, antes de ser extinta pela adição de NaHCO3 aq. (50 mL) e DCM (30 mL). As duas fases foram separadas e a camada aquosa foi extraída com EtOAc (2 x 50 mL). As camadas orgânicas foram combinadas, secas sobre MgSO4, filtradas e os voláteis foram evaporados sob pressão reduzida. O produto em bruto foi purificado por cromatografia flash em sílica gel usando EtOAc/éter de petróleo para produzir AOM C2 como um sólido branco (264 mg, 52% de rendimento). LC-MS (eletropulverização negativa): [M-H] 787, [M+Cl] 823.

[0209] Síntese do intermediário AOM C3: AOM C2 (246 mg, 0,31 mmol) foi dissolvido em THF anidro (9,5 mL) sob N2 e a mistura foi resfriada a 0oC. Foi adicionado ácido acético (0,054 mL, 0,94 mmol), seguido por TBAF gota a gota (1,0 M em THF, 5% em peso de água, 0,99 mL, 0,94 mmol). A reação foi agitada a 0oC durante 5 h, antes de ser diluída com EtOAc (20 mL) e então vertida em 0,05 M de HCl aq. (20 mL). As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com EtOAc (2 x 20 mL). As camadas orgânicas foram combinadas, secas sobre MgSO4, filtradas e os voláteis foram evaporados sob pressão reduzida. O produto em bruto foi purificado por cromatografia flash em sílica gel usando um DCM/EtOAc para produzir AOM C3 como um sólido amarelado (114 mg, 66% de rendimento). LC-MS (eletropulverização negativa): [M-H] 549, [M+H2O-H] 567, [M+Cl] 585, (eletropulverização positiva): [M+H] 551, [M+H2O + H] 569.

[0210] Síntese do intermediário AOM C4: AOM C3 (0,114 g, 0,21 mmol), peneiras moleculares de 4Å ativadas recentemente, esponja de prótons (0,066 g, 0,31 mmol) e um agitador magnético foram colocados sob N 2 e trimetil fosfato anidro (1,0 mL) foi adicionado. A reação foi resfriada a -10 °C e POCl3 recém destilado (23 uL, 0,25 mmol) foi adicionado gota a gota. A reação foi agitada a -10 °C durante 1 hora. Uma solução de pirofosfato como sal bis-tri-n- butilamônio (0,5 M em DMF, 1,7 mL, 0,85 mmol) e tri-n-butil amina anidra (0,41 mL, 1,74 mmol) foram pré-misturados e adicionados à solução de nucleosídeo ativada por resfriamento a gelo em uma porção. A mistura foi agitada vigorosamente durante 5 minutos à temperatura ambiente. A mistura de reação foi vertida para um frasco separado contendo uma solução vigorosamente agitada de 2 M TEAB aq. (~ 10 mL). O frasco de reação foi enxaguado com uma pequena quantidade de H2O e as lavagens adicionadas à solução de TEAB 2 M. A mistura combinada foi então agitada à temperatura ambiente durante 4 horas, após o que o solvente fosse evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em NH3 aq. (35%, ~ 10 mL) e agitado à temperatura ambiente durante a noite. A reação foi concentrada sob vácuo e purificada por cromatografia flash em DEAE-Sephadex. O produto foi ainda purificado por HPLC preparativa para produzir AOM C4 puro (62 nmol, 30% de rendimento, determinado por espectrometria UV-Vis, λmax = 294 nm, ε = 8600 M-1 cm-1). LC-MS (eletropulverização negativa): [M-H] 589.

[0211] Síntese de 3ʹ-AOM-ffC-LN3-SO7181: LN3-SO7181 (0,0205 mmol) foi dissolvido em DMA anidro (4 mL) sob N2. N, N-diisopropilaetilamina (28,6 µL, 0,164 mmol) foi adicionado, seguido por TSTU (0,1 M em DMA, 234 µL, 0,0234 mmol). A reação foi agitada sob N2 à temperatura ambiente durante 1 hora. Entretanto, uma solução aquosa de AOM C4 (0,0101 mmol) foi evaporada até à secura sob pressão reduzida, ressuspensa em 0,1 M TEAB aq. (400 µL) e adicionado à solução LN3-SO7181. A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 17,5 horas e então extinta com 0,1 M TEAB aq. (4 mL). O produto bruto foi purificado por cromatografia flash em DEAE-Sephadex. O produto foi ainda purificado por HPLC preparativa para produzir 3'-AOM-ffC-LN3-SO7181 puro (6,81 nmol, 67% de rendimento, determinado por espectrometria UV-Vis, λmax

= 644 nm, ε = 200000 M-1 cm- 1). LC-MS (eletropulverização negativa): [M-H] 1561, [M-2H] 781, [M-3H] 520. Esquema 5. Síntese de 3'-AOM-ffA

[0212] Síntese do intermediário AOM A2: Nucleosídeo A1 (716 mg, 0,95 mmol) foi dissolvido em 10 mL de diclorometano anidro sob atmosfera de N2, foi adicionado ciclohexeno (481 µL, 4,75 mmol) e a solução foi resfriada a aproximadamente -15 °C. Foi adicionado cloreto de sulfurila (destilado, 92 µL, 1,14 mmol) gota a gota e a reação foi agitada durante 20 minutos. Depois de todo o material de partida ter sido consumido, uma porção extra de ciclohexeno foi adicionada (481 µL, 4,75 mmol) e a reação foi evaporada até a secura sob pressão reduzida. O resíduo foi rapidamente purgado com nitrogênio, então álcool alílico (5 mL, ~ 100 mmol) foi adicionado sob agitação a 0 °C. A reação foi agitada a 0 °C durante 1 hora, então extinta com 50 mL de solução NaHCO3 aquosa. A mistura foi extraída com 2x 100 mL de acetato de etila. As fases orgânicas reunidas foram lavadas com 100 mL de água e 100 mL de salmoura, depois secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em sílica gel usando éter de petróleo/EtOAc. Rendimento de 60% (435 mg, 0,57 mmol). LC-MS (ES e CI): (íon positivo) m/z 763 (M+H+); (íon negativo) m/z 761 (M-H+).

[0213] Síntese do intermediário AOM A3: O nucleosídeo AOM A2 (476 mg, 0,62 mmol) foi dissolvido em THF seco (5 mL) sob atmosfera de N2, então uma solução de 1,0 M de TBAF em THF (750 µL, 0,75 mmol) foi adicionada. A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 1,5 horas. A solução foi diluída com 50 mL de EtOAc, então lavada com 100 mL de NaH2PO4 sat. (pH = 3), e com 100 mL de salmoura. A fase orgânica foi seca sobre MgSO 4, filtrada e evaporada até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em sílica gel usando EtOAc/MeOH. Rendimento de 90% (292 mg, 0,55 mmol). LC- MS (ES e CI): (íon positivo) m/z 525 (M+H+); (íon negativo) m/z 523 (M-H+).

[0214] Síntese do intermediário AOM A4: O nucleosídeo AOM A3 (285 mg, 0,544 mmol) foi seco sob pressão reduzida sobre P2O5 durante 18 horas. Fosfato de trietila anidro (2 mL) e algumas peneiras moleculares de 4 Å recém ativadas foram adicionados a ele sob nitrogênio, então o balão de reação foi resfriado a 0 °C em um banho de gelo. POCl3 recentemente destilado (61 µL, 0,65 mmol) foi adicionado gota a gota seguido por Proton Sponge® (175 mg, 0,816 mmol). Após a adição, a reação foi ainda agitada a 0 °C durante 15 minutos. Em seguida, uma solução 0,5 M de pirofosfato como sal bis-tri-n- butilamônio (5,4 mL, 2,72 mmol) em DMF anidro foi rapidamente adicionada, seguida imediatamente por tri-n-butil amina (540 µL, 2,3 mmol). A reação foi mantida no banho de água gelada por mais 10 minutos, então extinta por vertê-la em bicarbonato de trietilamônio aquoso 1 M (TEAB, 20 mL) e agitada à temperatura ambiente durante 4 horas. Todos os solventes foram evaporados sob pressão reduzida. Uma solução aquosa a 35% de amônia (20 mL) foi adicionada ao resíduo acima e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por pelo menos 5 horas. Os solventes foram então evaporados sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado primeiramente por cromatografia de troca iônica em DEAE-Sephadex A25 (100 g). A coluna foi eluída com um gradiente de bicarbonato de trietilamônio aquoso. As frações contendo o trifosfato foram reunidas e o solvente foi evaporado até à secura sob pressão reduzida. O material bruto foi ainda purificado por HPLC em escala preparativa usando uma coluna YMC-Pack-Pro C18, eluindo com 0,1 M TEAB e acetonitrila. O composto AOM A4 foi obtido como sal de trietilamônio. Rendimento de 56% (306 µmol). LC-MS (ES e CI): (íon negativo) m/z 612 (M-H+); (íon positivo) m/z 614 (M+H+), 715 (M+Et3NH+).

[0215] Procedimento geral para a síntese de ffA: O ligante corante (0,020 mmol) foi dissolvido em 2 mL de N, N'-dimetilacetamida anidro (DMA). N,N- diisopropilaetilamina (28,4 µL, 0,163 mmol) foi adicionado, seguido por N,N,N',N'-tetrametil-O-(N-succinimidil)tetrafluoroborato de urônio como solução 0,1 M em DMA anidro (TSTU, 232 µL, 0,023 mmol). A reacção foi agitada sob azoto à temperatura ambiente durante 1 hora.

Nesse ínterim, a solução aquosa do trifosfato AOM A4 (0,01 mmol) foi evaporada à secura sob pressão reduzida e Ressuspensa em 200 µL de solução de bicarbonato de trietilamônio 0,1 M (TEAB) em água.

A solução de ligante corante ativada foi adicionada ao trifosfato e a reação foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas.

O produto bruto foi purificado primeiramente por cromatografia de troca iônica em DEAE-Sephadex A25 (25 g). As frações contendo o trifosfato foram reunidas e o solvente foi evaporado até a secura sob pressão reduzida.

O material em bruto foi ainda purificado por RP-HPLC em escala preparativa usando uma coluna YMC-Pack-Pro C18. 3'-AOM-ffA-LN3-NR7180A: rendimento de 38% (3,8 µmol). LC-MS (ES): (íon negativo) m/z 1459 (M-H+), 729 (M-2H+), 486 (M-3H+). 3ʹ-AOM-ffA-LN3-BL-NR550S0: rendimento de 37% (3,7 µmol). LC- MS (ES): (íon negativo) m/z 1771 (M-H+), 885 (M-2H+), 589 (M-3H+). 3ʹ-AOM ffA- LN3-BL-NR650C5: rendimento de 51% (51 µmol). LC-MS (ES): (íon negativo) m/z 1917 (M-H+), 958 (M-2H+), 645 (M-3H+). Esquema 6. Síntese de 3'-AOM-pppG

[0216] Síntese do intermediário AOM G4: O nucleosídeo conhecido dG3 (100 mg, 0,143 mmol) foi dissolvido em 10 mL de diclorometano anidro sob atmosfera de N2, ciclohexeno (72 µL, 0,714 mmol) foi adicionado e a solução resfriada a -12 °C.

Cloreto de sulfurila (destilado, (1M em DCM), 171 µL, 0,171 mmol) foi adicionado gota a gota e a reação foi agitada durante 10 min.

Uma porção extra de ciclohexeno (72 µL, 0,714 mmol) foi adicionada e a reação foi agitada durante 30 min a -12 °C.

A reação foi evaporada até a secura sob pressão reduzida, o resíduo foi purgado com nitrogênio, e gelado, álcool alílico puro (destilado, 0,8 mL, 12 mmol) foi adicionado sob agitação a -12 °C.

A reação foi agitada a -12 °C durante 60 min, então extinta com 2 mL de solução aquosa saturada de NaHCO3. A mistura foi separada com acetato de etila (2 mL), a camada aquosa extraída com acetato de etila.

As fases orgânicas combinadas foram lavadas com 4 mL de água e 4 mL de salmoura, secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas até óleo bruto.

O resíduo foi purificado por cromatografia flash em sílica gel para dar AOM G4 como um óleo transparente.

Rendimento de 36% (50,9 mg, 0,072 mmol). LC-MS (ES e CI): (íon positivo) m/z 710 [M+H] +; (íon negativo) m/z 708 [M-H]-.

[0217] Síntese do intermediário AOM G5: O nucleosídeo AOM-G4 (111 mg, 0,156 mmol) foi dissolvido em THF seco (5 mL) sob atmosfera de N2. Foi adicionado ácido acético (27 µL, 0,468 mmol), seguido por uma solução de TBAF 1,0 M em THF (296 µL, 0,296 mmol). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 5 horas. A solução foi diluída com 10 mL de EtOAc, lavada com 10 mL de 0,05 M aq. HCl e orgânicos separados. A fase aquosa foi extraída com acetato de etila. As fases orgânicas combinadas foram secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em sílica gel para produzir AOM G5 como um sólido branco. Rendimento de 44% (32,4 mg, 0,068 mmol). LC-MS (ES e CI): (íon positivo) m/z 472 [M+H] +; (íon negativo) m/z 470 [M-H]-.

[0218] Síntese de 3'-AOM-pppG: O nucleosídeo AOM-G5 (79 mg, 0,168 mmol) com peneiras moleculares de 4 Å ativadas recentemente foram secas sob pressão reduzida sobre P2O5 por 18 horas. Proton Sponge® (175 mg, 0,816 mmol) e trietil fosfato anidro (0,8 mL) foram adicionados sob nitrogênio e agitados à temperatura ambiente durante 1 hora. O balão de reação foi resfriado a 0 °C em um banho de gelo, POCl3 recém destilado (19 µL, 0,202 mmol) foi adicionado gota a gota e a reação foi agitada a 0 °C durante 15 minutos. Em seguida, uma solução 0,5 M de pirofosfato como sal bis-tri-n- butilamônio (1,68 mL, 0,84 mmol) em DMF anidro foi rapidamente adicionada, seguida imediatamente por tri-n-butil amina (168 µL, 0,705 mmol). A reação foi removida do banho de gelo/água e agitada vigorosamente durante 5 minutos, então extinta, sendo vertida em bicarbonato de trietilamônio aquoso 1 M (TEAB, 6 mL) e agitada à temperatura ambiente durante 18 horas. Todos os solventes foram evaporados sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em solução aquosa de amônia a 35% (10 mL) e foi agitado à temperatura ambiente por pelo menos 5 horas. Os solventes foram então evaporados sob pressão reduzida e posteriormente co-evaporados com água. O produto bruto foi purificado primeiramente por cromatografia de troca iônica em DEAE-Sephadex A25 (50 g). A coluna foi eluída com um gradiente linear de trietilamônio aquoso. As porções contendo o trifosfato foram recolhidas e o solvente foi evaporado até à secura sob pressão reduzida. O material bruto foi ainda purificado por HPLC em escala preparativa usando uma coluna YMC-Pack-Pro C18. 3'-AOM- pppG foi obtido como sal de trietilamônio. Rendimento de 24% (39,7 µmol). LC- MS (ES e CI): (íon negativo) m/z 576 [M-H] -; (íon positivo) m/z 578 [M+H]+.

[0219] 3ʹ-AOM-ffT-LN3-NR550S0 foi sintetizado de forma semelhante conforme descrito na preparação de 3ʹ-AOM ffA e ffC. Esquema 7. Síntese de 3'-AOM-ffT-LN3ʹ-NR550S0

[0220] Síntese do intermediário T1: 5-Iodo-2'-desoxiuridina (3 g, 8,4 mmol) e acetato de paládio (II) (1,6 g, 7,14 mmol) foram dissolvidos em DMF desgaseificado seco, então N-aliltrifluoroacetamida (6,4 mL, 42 mmol) foi adicionada. A solução foi colocada sob vácuo, então purgada com nitrogênio por 3 vezes, então trietilamina desgaseificada (2,3 mL, 16,8 mmol) foi adicionada. A solução foi aquecida a 80 °C durante 2 horas. A mistura preta foi resfriada até a temperatura ambiente e então diluída com 50 mL de metanol. Aproximadamente 0,5 g de carvão ativado foi adicionado, e a solução foi filtrada em Celite, em seguida evaporada sob pressão reduzida para produzir um óleo espesso marrom. Este produto bruto foi purificado por cromatografia em gel de sílica usando EtOAc/MeOH. Rendimento: (2,27 g, 5,99 mmol). LC-MS (ES e CI): (íon negativo) m/z 378 (M-H+).

[0221] Síntese do intermediário T2: 5- [3- (2,2,2-trifluoroacetamido) -alil] - 2'-desoxiuridina (T1) (2,55 g, 6,72 mmol) foi dissolvido em DMF seco. Imidazol (1,37 g, 20,1 mmol) foi adicionado seguido por 4- (dimetilamino) piridina (410 mg, 3,36 mmol). A reação foi resfriada a 0 °C, então terc-butil (cloro) difenilasilano (1,92 mL, 7,39 mmol) foi adicionado lentamente em 3 porções, 30 minutos de intervalo. A reação foi agitada a 0 °C durante 6 horas. O solvente foi então evaporado, e o resíduo ressuspenso em 200 mL de EtOAc e lavado com 2x 200 mL de NaHCO3 aquosa saturada e 200 mL de água, então 100 mL de salmoura. A fase orgânica foi seca sobre MgSO4, filtrada e evaporada até à secura. O produto bruto foi purificado por cromatografia flash em sílica usando DCM/EtOAc. Rendimento de 68% (2,806 g, 4,54 mmol). LC-MS (ES e CI): (íon positivo) m/z 618 (M+H+); (íon negativo) m/z 616 (M-H+).

[0222] Síntese do intermediário T3: 5'-O-(terc-butildifenilasilil) -5- [3- (2,2,2-trifluoroacetamido) -alil] -2'-desoxiuridina (T2) (2,8 g, 4,53 mmol) foi dissolvido em 10 mL de DMSO anidro (136 mmol), em seguida ácido acético glacial (16 mL, 272 mmol) e anidrido acético (16 mL, 158 mmol) foram adicionados. A reação foi aquecida a 50 °C durante 6 horas, em seguida, extinta com 200 mL de aq. NaHCO3 saturado. Depois que a solução parou de borbulhar,

ela foi extraída com 2x 150 mL de EtOAc. As fases orgânicas foram combinadas e lavadas com 2 x 200 mL de NaHCO3 aquosa saturada, 200 mL de água e 100 mL de salmoura. A fase orgânica foi seca sobre MgSO4, filtrada e evaporada até à secura. O produto bruto foi purificado por cromatografia flash em sílica usando DCM/EtOAc. Rendimento de 77% (2,375g, 3,51 mmol). LC-MS (ES e CI): (íon positivo) m/z 678 (M+H+); (íon negativo) m/z 676 (M-H+).

[0223] Síntese do intermediário T4: 5'-O- (terc-butildifenilasilil) -3'-O- metilthiometil-5- [3- (2,2,2-trifluoroacetamido) -alil] -2'-desoxiuridina (T3) (310 mg, 0,45 mmol) foi dissolvido em 5 mL de diclorometano anidro sob atmosfera de N2, ciclohexeno (228 µL, 2,25 mmol) foi adicionado e a solução foi resfriada a aproximadamente -15 °C. Foi adicionado cloreto de sulfurila (destilado, 55 µL, 0,675 mmol) gota a gota e a reação foi agitada durante 20 minutos. Após todo o material de partida ter sido consumido, uma porção extra de ciclohexeno foi adicionada (228 µL, 2,25 mmol) e a reação foi evaporada até a secura sob pressão reduzida. O resíduo foi rapidamente purgado com nitrogênio, então álcool alílico gelado (2,5 mL) foi adicionado sob agitação a 0 °C. A reação foi agitada a 0 °C durante 35 minutos, então extinta com 25 mL de solução aquosa saturada de NaHCO3, em seguida diluída adicionalmente com 100 mL de solução aquosa saturada de NaHCO3. A mistura foi extraída com 2x 50 mL de acetato de etilo. As fases orgânicas reunidas foram secas sobre MgSO4, filtradas e evaporadas até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em sílica gel usando DCM/EtOAc. Rendimento de 69% (214 mg, 0,311 mmol). LC- MS (ES e CI): (íon positivo) m/z 688 (M+H+); (íon negativo) m/z 686 (M-H+).

[0224] Síntese do intermediário T5: 5'-O- (terc-butildifenilasilil) -3'-O- aliloximetil-5-[3-(2,2,2-trifluoroacetamido)-alil]-2'-desoxiuridina (T4) (210 mg, 0,305 mmol) foi dissolvido em THF seco (3 mL) sob atmosfera de N2. Foi adicionada uma solução de TBAF 1,0 M em THF (367 µL, 0,367 mmol). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução foi diluída com 50 mL de EtOAc, depois lavada com 50 mL de NaH2PO4 sat. (pH = 3), e com 50 mL de água. A fase orgânica foi seca sobre MgSO4, filtrada e evaporada até à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em sílica gel usando DCM/EtOAc. Rendimento de 95% (130 mg, 0,289 mmol). LC- MS (ES e CI): (íon negativo) m/z 448 (M-H+), 484 (M+Cl-).

[0225] Síntese do intermediário T6: 3'-O-aliloximetil-5- [3- (2,2,2- trifluoroacetamido) -alil] -2'-desoxiuridina (T5) (120 mg, 0,267 mmol) foi seco sob pressão reduzida sobre P2O5 por 18 horas. Trietil fosfato anidro (1 mL) e algumas peneiras moleculares de 4 Å ativadas recentememte foram adicionados a ele sob nitrogênio, então o balão de reação foi resfriado a 0 oC. POCl3 recentemente destilado (30 µL, 0,32 mmoles) foi adicionado gota a gota seguido por Proton Sponge® (85 mg, 0,40 mmol). Após a adição, a reação foi ainda agitada a 0 °C durante 15 minutos. Em seguida, uma solução 0,5 M de pirofosfato como sal bis-tri-n-butilamônio (2,7 mL, 1,33 mmol) em DMF anidro foi rapidamente adicionada, seguida imediatamente por tri-n-butil amina (270 µL, 1,2 mmol). A reação foi mantida no banho de água gelada por mais 10 minutos, então extinta sendo vertida em bicarbonato de trietilamônio aquoso 1 M (TEAB, 10 mL) e agitada à temperatura ambiente durante 4 horas. Todos os solventes foram evaporados sob pressão reduzida. Uma solução aquosa a 35% de amônia (10 mL) foi adicionada ao resíduo acima e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas. Os solventes foram então evaporados sob pressão reduzida, o resíduo ressuspenso em 10 mL de 0,1 M TEAB e filtrado. O filtrado foi purificado primeiramente por cromatografia de troca iônica em DEAE-Sephadex A25 (100 g). A coluna foi eluída com bicarbonato de trietilamônio aquoso (TEAB). As frações contendo o trifosfato foram reunidas e o solvente foi evaporado até à secura sob pressão reduzida. O material bruto foi ainda purificado por HPLC em escala preparativa usando uma coluna YMC-Pack- Pro C18. O composto T6 foi obtido como sal de trietilamônio. Rendimento de 33% (89 µmol). LC-MS (ES e CI): (íon negativo) m/z 592 (M-H+), 295 (M-2H+).

[0226] Síntese de 3ʹ-AOM-ffT-LN3ʹ-NR550S0: O composto conhecido seco LN3-NR550S0 (0,015 mmol) foi dissolvido em DMA anidro (2 mL) sob N 2. N, N- diisopropilaetilamina (17 µL, 0,1 mmol) foi adicionado, seguido por TSTU (0,1 M em DMA, 180 µL, 0,018 mmol). A reação foi agitada sob N2 à temperatura ambiente durante 1 hora. Entretanto, uma solução aquosa de T6 (0,01 mmol) foi evaporada até à secura sob pressão reduzida, ressuspensa em 0,1 M TEAB aq. (200 µL) e adicionado à solução LN3-NR550S0. A reação foi agitada à TA durante 18 horas e depois extinta com 0,1 M TEAB aq. (4 mL). O produto bruto foi purificado por cromatografia flash em DEAE-Sephadex. O produto foi ainda purificado por HPLC preparativa para produzir 3'-AOM-ffT-LN3'-NR550S0 puro. Rendimento de 67% (41 mol, determinado por espectrometria UV-Vis, λmax = 550 nm, ε = 125000 M-1 cm-1). LC-MS (ES): (íon negativo) m/z 1521 (M-H+), 761 (M-2H+), 507 (M-3H+). Experimentos de Sequenciamento por Síntese

[0227] Os ffNs foram posteriormente testados em sequenciamento usando um instrumento Illumina MiniSeq®. Com exceção de uma nova mistura de incorporação incluindo esses ffNs, todos os reagentes comerciais padrão foram usados. Uma receita padrão 2x150 foi usada. Além dos protocolos de sequenciamento por síntese (SBS) padrão, uma incubação de 5 segundos em uma solução de mistura de clivagem de paládio (Pd: THP = 1/5 em DEEA conforme descrito em Exemplo 4) foi adicionada para desbloquear 3ʹ-AOM.

[0228] Em um primeiro experimento, os seguintes ffNs foram usados na mistura de incorporação: 3ʹ-AOM-ffT-LN3-NR550S0, 3ʹ-AOM-ffA-LN3-BL- NR550S0, 3ʹ-AOM-ffA-LN3-BL -NR650C5, 3'-AOM-ffA-LN3-NR7180A, 3'-AOM-

ffC-LN3-SO7181, e 3'-AOM-pppG (escuro G). e o resultado da sequência para a leitura 1 está resumido abaixo.

Lido %PF Faseamento Prefaseamento ER 1 90,2% 0,798 0,159 3,12 %PF: Porcentagem de filtro de passagem do agrupamento após 26 ciclos

[0229] Em um segundo experimento, 3ʹ-AOM-pppT não marcado foi sintetizado de forma semelhante à preparação de 3ʹ-AOM-pppG descrita acima (LC-MS (ES): (íon negativo) m/z 551 (M-H+)). Foi usado na presença de ffG-LN3- PEG12-ATTO532 verde comercial (usado em sistemas de 4 canais da Illumina) no sequenciamento e os mesmos ffAs e ffC foram usados como aqueles descritos no primeiro experimento acima. Os resultados estão resumidos a seguir. Houve melhorias significativas nos valores de faseamento e pré- faseamento e nenhum decaimento de sinal foi observado (FIG. 3A). Além disso, as taxas de erro para Leitura 1 e Leitura 2 também foram reduzidas.

Lido Faseamento Prefaseamento ER 1 0,173 0,046 1,21 2 0,175 0,057 1,99

[0230] Em outro experimento, uma mistura de incorporação contendo 3ʹ- AOM-ffT-LN3ʹ-NR550S0, 3ʹ-AOM-ffA-LN3-BL-NR550S0, 3ʹ-AOM-ffA-LN3-BL- NR650C5, 3ʹ-AOM-ffA -LN3-NR7180A, 3'-AOM-ffC-LN3-SO7181, e 3'-AOM-pppG

(escuro G) foi usado. Similarmente às execuções anteriores, uma incubação de 5 segundos com uma mistura de clivagem contendo um catalisador de paládio (Pd/THP = 1:10; 100 mM DEEA conforme descrito no Exemplo 4) foi adicionada ao ciclo de SBS padrão. Foi usada DNA polimerase MiniSeq® padrão, mas com 2x o tempo de incorporação. Nenhum fenótipo de decaimento de sinal foi observado (FIG. 3B). Além disso, esses resultados de sequenciamento foram comparados com execuções comerciais do MiniSeq® (média de 3; N = 3) usando ffNs com o grupo bloqueador de azidometil padrão. Foi observado que as taxas de erro eram quase idênticas (FIG. 3C). Os resultados do sequenciamento estão resumidos abaixo.

Lido Faseamento Prefaseamento ER 1 0,121 0,063 0,40 2 0,129 0,062 0,57

[0231] Além disso, as métricas de sequenciamento primária para os ffNs com grupos bloqueadores de 3’-AOM foram comparadas às produzidas pelo kit comercial MiniSeq® padrão incluindo DNA polimerase Pol 812 e os resultados comparativos são demonstrados na FIG. 4A. Um pré-faseamento muito baixo foi observado devido à estabilidade melhorada dos 3ʹ-AOM-ffNs. No entanto, o faseamento ainda era elevado, mesmo se o tempo de incorporação 2x fosse usado.

[0232] Em ainda outro experimento, uma polimerase de DNA diferente (Pol 1901) foi usada em vez da polimerase de DNA nos kits comerciais MiniSeq® (Pol 812). A Pol 1901 permitia o tempo de incorporação padrão 1x no sequenciamento em vez do tempo de incorporação 2x descrito acima. Além disso, a incubação na mistura de clivagem de Pd foi reduzida pela metade em comparação com a execução padrão. Isso permitiu uma economia de tempo de

10% no ciclo completo de química SBS. As métricas de sequenciamento foram significativamente melhoradas e excederam os valores obtidos dos kits comerciais padrão contendo grupo de bloqueio 3'-O-azidometila (FIG. 4B). Teste de estabilidade do grupo bloqueador a 3' no sequenciamento

[0233] Para demonstrar a melhoria da estabilidade dos ffNs com 3ʹ-AOM, eles foram comparados lado a lado com MiniSeq® ffNs padrão com grupo 3ʹ-O- azidometila. Os dois conjuntos de ffNs foram incubados a 45 °C durante vários dias em formulações de mistura de incorporação padrão excluindo apenas a DNA polimerase. Para cada ponto de tempo, polimerase recente foi adicionada para completar a mistura de incorporação diretamente antes do carregamento no MiniSeq®. As condições de sequenciamento descritas anteriormente foram utilizadas. A% de pré-faseamento é um indicador direto da porcentagem de 3'OH-ffNs presentes na mistura, portanto, se correlaciona diretamente com a estabilidade do grupo bloqueador a 3'. Os valores de pré-faseamento para ambos os conjuntos de ffNs foram registrados e plotados (FIG. 5). A 45 °C, foi observado que 3'-AOM contendo ffNs parecia ser 6x mais estável do que ffNs padrão com grupo 3'-O-azidometila. As métricas de sequenciamento também confirmaram a tendência observada durante o ensaio de estabilidade em solução - o bloco 3ʹ-AOM foi significativamente mais estável do que o grupo 3ʹ- O-azidometila. Exemplo 6. Preparação de Nucleosídeos 3'-O-tiocarbamato- bloqueados

[0234] Neste exemplo, vários nucleosídeos T 3'-O-tiocarbamato- protegidos foram preparados de acordo com o Esquema 8. Esquema 8. Síntese de Nucleosídeo T 3ʹ-O-Dimetiltiocarbamato

[0235] Preparação de T-7: Em um frasco de 100 mL purgado com nitrogênio seco em forno foi adicionado 5'-O-(4,4'-Dimetoxitritil) timidina (1,0 g, 1,836 mmol). Este foi co-evaporado com DMF anidro (3 x 20 mL) e colocado sob nitrogênio. DCM anidro (9,2 mL) e 4-dimetilaminopiridina (224 mg, 0,184 mmol) foram adicionados e agitados à temperatura ambiente até que uma solução homogênea fosse formada. Em seguida, 1,1'-tiocarbonildiimidazol (360 mg, 2,02 mmol) foi adicionado rapidamente ao longo de uma corrente de nitrogênio, a reação foi novamente selada e agitada à temperatura ambiente por 2 horas até que todo o material de partida fosse consumido. A mistura de reação é filtrada através de uma almofada de sílica gel e o bolo do filtro é lavado com EtOAc (10 mL). Os voláteis foram removidos a vacuo e o resíduo bruto utilizado sem purificação adicional.

[0236] Preparação de T-8: O composto T-7 da etapa anterior foi usado imediatamente após a secagem a vacuo. O resíduo foi colocado sob nitrogênio em um frasco de fundo redondo de 25 mL e dimetilamina (2 M em THF, 7,3 mL, 14,6 mmol) foi adicionada e a reação foi agitada durante 2 horas até que todo o material de partida fosse consumido de acordo com TLC. Todos os voláteis foram removidos a vácuo para formar um resíduo em bruto límpido, que foi purificado por cromatografia em coluna flash em sílica gel para proporcionar T- 8 como um sólido branco. Rendimento: 1,15g (99%). LC-MS (negativo de eletropulverização) 630,23 [M-H].

[0237] Preparação de T-9: O nucleosídeo inicial T-8 (320 mg, 0,504 mmol) foi dissolvido em acetonitrila mínima em um frasco de fundo redondo de 50 mL ao ar. Uma solução de AcOH/H2O 5: 1 (12,5 mL: 2,5 mL) foi adicionada de uma vez e a reação foi agitada à temperatura ambiente até todo o material de partida ser consumido (2-4 horas). A evaporação de todos os voláteis sob vácuo e a coevaporação do resíduo em tolueno (2 x 60 mL) fornecem o produto bruto como um sólido esbranquiçado. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash para proporcionar T-9 como um sólido branco. Rendimento: 123 mg (74%). LC-MS (eletropulverização negativa) [M-H] 328,10.

[0238] Seguindo procedimento sintético semelhante usando o MeNH2 ou NH3 correspondente, nucleosídeos com dois outros grupos protetores de tiocarbamato também foram preparados. O esquema geral de reação é demonstrado abaixo: Testagem de Estabilidade de Grupos Bloqueadores de 3ʹ-O-tiocarbamato

[0239] Os testes de estabilidade para nucleotídeo 5 -mP 3-DMTC T foram realizados lado a lado em uma solução tampão de incorporação com nucleotídeo 5 -mP 3ʹ-O-azidometila T padrão.

[0240] Para ambos 5ʹ-mP 3ʹ-DMTC T e 5ʹ-mP 3ʹ-O-azidometila T, o volume da solução final foi de 1 mL e as concentrações finais dos nucleotídeos correspondentes foram ambas 0,1 mM. Outros componentes da solução tampão aquosa incluem etanolamina (EA), etanolamina HCl, NaCl (100 mM), e EDTA (2,5 mM). A solução tampão tem a seguinte concentração: tampão EA 0,5 M, NaCl 0,5 M, EDTA 0,01 M. Metodologia de teste de estabilidade

[0241] 200 µL de solução tampão 10x foram adicionados a um microtubo de bloqueio instantâneo de polipropileno de 1,7 mL e diluídos com o volume correto de 18 mΩ de água. O nucleosídeo correspondente foi então adicionado, o frasco foi selado e misturado por inversão, agitação suavemente ou bombeamento com uma micropipeta. Uma alíquota de 40 µL foi retirada e analisada por HPLC para atuar como um valor inicial (ou t = 0). Os frascos foram então colocados em uma manta de aquecimento pré-aquecida ajustada a 65 °C, cobertos com uma espessa camada de papel alumínio e deixados para aquecer por um mês. Alíquotas de 40 µL foram retiradas periodicamente (semana 1: uma vez ao dia. Semanas 2-4: 1 a cada 2 dias) e analisadas por HPLC para determinar a porcentagem de material de partida e a porcentagem de nucleotídeo desbloqueado (3'-OH) nas amostras. A análise de HPLC foi realizada medindo a área do pico de nucleotídeo de determinação e o pico 3'OH. Esses valores foram usados para calcular uma porcentagem de nucleotídeo desbloqueado que foi apresentado graficamente e usado para comparar a estabilidade em um tampão de incorporação entre as amostras. A FIG. 6 ilustra os resultados comparativos de estabilidade de três diferentes nucleotídeos bloqueadores de tiocarbamato 3’em relação ao nucleotídeo bloqueado com grupo bloqueador de 3'-O-azidometila a 65 °C. Foi observado que enquanto o nucleotídeo com 3ʹ-OC (= S) NH2 ou 3ʹ-OC (= S) NHCH3 era menos estável do que o nucleotídeo protegido com o grupo 3 -O-azidometila padrão, o nucleotídeo com 3ʹ-DMTC conferido melhorou estabilidade durante o período de teste de 9 dias. Como tal, DMTC demonstrou estabilidade superior em relação ao grupo bloqueador de azidometila padrão. Exemplo 7. Teste de desbloqueio de grupo bloqueador de 3ʹ-O- tiocarbamato

[0242] Neste exemplo, os testes de desbloqueio ou desbloqueio para 5ʹ- mP 3ʹ-DMTC T e o nucleotídeo 5ʹ-mP 3ʹ-O-azidometil T padrão foram realizados individualmente em uma solução única para cada grupo bloqueador. As condições foram formuladas para imitar o reagente de desbloqueio padrão da Illumina o mais próximo possível, e seguem a mesma metodologia. As concentrações do reagente de desbloqueio ativo, tampão e nucleosídeo são mantidas as mesmas em todos os testes, mas a identidade de cada componente era única. Desta forma, a diferença observada na taxa entre as químicas de desbloqueio individuais não pode ser atribuída às diferenças na concentração da formulação.

Metodologia geral de teste de desbloqueio

[0243] Cada componente de reação foi formulado individualmente como um estoque concentrado em 18 mΩ de água, armazenado adequadamente, e alíquotas combinadas em uma ordem específica fornecida abaixo. A reação foi iniciada pela adição do reagente de desbloqueio pré-formulado. Concentrações finais: nucleosídeo (0,1 mM), reagente de desbloqueio ativo (1 mM), aditivo (específico para reagente de desbloqueio), tampão (100 mM). Volume final: 2000 µL.

[0244] Em um frasco de vidro de 3 mL foi adicionada a solução tampão pré-formulada seguida pela solução aditiva pré-formulada. Esta foi diluída com o volume correto de 18 ml de água e agitada por 10 minutos. Uma alíquota de solução de nucleotídeo foi então adicionada e agitada por 5 minutos. Uma alíquota de 40 µL foi então retirada, reagente de extinção adicionado e analisado por HPLC como um pico de referência (ou t = 0 min). O reagente de desbloqueio foi então adicionado de uma vez à solução de agitação e o tempo foi iniciado. Em pontos de tempo especificados, alíquotas de 40 µL foram retiradas e extintas imediatamente com um reagente de extinção apropriado, então analisadas por HPLC para determinar a quantidade de nucleotídeo desbloqueado que ocorreu nesses pontos de tempo especificados. Os resultados foram plotados graficamente e são usados para comparar a eficiência e eficácia do desbloqueio.

Desbloqueio DMTC

[0245] Nucleotídeo: 5’-mP 3’-DMTC T. Reagente de desbloqueio ativo: NaIO4 (0,1 M em 18 mΩ de água) ou Oxone® (0,1 M em 18 mΩ de água). Aditivo: nenhum. Tampão para NaIO4: tampão fosfato de pH 6,75 (1 M em 18 ml de água). Tampão para Oxone®: tampão fosfato pH 8,65 (1 M em 18 m de água). Reagente de extinção: tiossulfato de sódio. A condição de desbloqueio de 3ʹ-O-azidometila é a mesma descrita no Exemplo 3.

[0246] A análise de HPLC foi realizada medindo a área do pico do nucleosídeo em questão, o pico 3'-OH e quaisquer outros picos de nucleotídeo que aparecem no cromatograma de HPLC. Esses valores foram usados para calcular uma porcentagem do nucleotídeo inicial e do nucleotídeo desbloqueado que foi apresentado graficamente e usado para comparar a taxa de desbloqueio, eficiência e eficácia entre as amostras. O resultado comparativo é mostrado na FIG. 7. Foi observado que o desbloqueio DMTC com NaIO4 não foi eficiente. No entanto, a % de material de partida restante foi significativamente menor para o nucleotídeo com o grupo bloqueador de DMTC quando DMTC foi clivado com Oxone®. Em resumo, o DMTC demonstrou uma taxa de desbloqueio superior (com Oxone®) sobre a taxa de desbloqueio do grupo bloqueador de azidometila padrão.

Claims (52)

REIVINDICAÇÕES

1. Nucleosídeo ou nucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma ribose ou desoxirribose que tem um grupo bloqueador 3ʹ-OH removível que forma uma estrutura covalentemente ligada ao átomo de carbono 3’, em que: cada R1a e R1b é independentemente H, C1-C6 alquila, C1-C6 haloalquila, C1-C6 alcoxi, C1-C6 haloalcoxi, ciano, halogênio, fenila opcionalmente substituída ou aralquila opcionalmente substituída; cada R2a e R2b é independentemente H, C1-C6 alquila, C1-C6 haloalquila, ciano ou halogênio; R3 é C2-C6 alquenila opcionalmente substituída, C3-C7 cicloalquenila opcionalmente substituída, C2-C6 alquinila opcionalmente substituída ou (C1-C6 alquileno)Si(R4)3 opcionalmente substituído; e cada R4 é independentemente H, C1-C6 alquila ou C6-C10 arila opcionalmente substituída.

2. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de R1a e R1b é H.

3. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que cada R1a e R1b é H.

4. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que cada de R2a e R2b é independentemente H, halogênio ou C1-C6 alquila.

5. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que cada R2a e R2b é H.

6. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 4,

caracterizado pelo fato de que cada R2a e R2b é independentemente C1-C6 alquila ou halogênio.

7. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que cada R2a e R2b é metila.

8. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que R2a é H e R2b é halogênio ou C1-C6 alquila.

9. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que R3 é C2-C6 alquinila opcionalmente substituída com um ou mais substituintes independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio, C1-C6 alquila, C1-C6 haloalquila e combinações dos mesmos.

10. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que R3 é .

11. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que R3 é C2-C6 alquenila opcionalmente substituída com um ou mais substituintes independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio, C1-C6 alquila, C1-C6 haloalquila e combinações dos mesmos.

12. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que R3 é , , , , , , , , , , , , , , ou .

13. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que R3 é (C1-C6 alquileno)Si(R4)3 opcionalmente substituído e em que cada R4 é C1-C6 alquila.

14. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que R3 é –(CH2)-SiMe3.

15. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo bloqueador 3ʹ-OH compreende a estrutura selecionada a partir do grupo que consiste em: , , , , , e covalentemente ligada ao carbono 3’ da ribose ou desoxirribose.

16. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o grupo bloqueador 3’-OH é covalentemente ligado ao carbono 3’ da ribose ou desoxirribose.

17. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o grupo bloqueador 3’-OH é covalentemente ligado ao carbono 3’ da 2’-desoxirribose.

18. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o nucleosídeo ou nucleotídeo é nucleotídeo trifosfato.

19. Nucleosídeo ou nucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma ribose ou desoxirribose que tem um grupo bloqueador 3ʹ-OH removível que forma uma estrutura covalentemente ligada ao átomo de carbono 3’, em que: cada de R5 e R6 é independentemente H, C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, C1-C6 haloalquila, C2-C8 alcoxialquila, –(CH2)m–fenila opcionalmente substituída, –(CH2)n–(heteroarila de 5 ou 6 membros) opcionalmente substituída, –(CH2)k–C3-C7 carbociclila opcionalmente substituída, ou –(CH2)p–(heterociclila de 3 a 7 membros) opcionalmente substituída; cada de –(CH2)m–, –(CH2)n–, –(CH2)k–, e –(CH2)p– é opcionalmente substituído; e cada de m, n, k, e p é independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4.

20. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de R5 e R6 é H ou C1-C6 alquila.

21. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que cada R5 e R6 é H.

22. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que R5 é H e R6 é C1-C6 alquila, C2-C6 alquenila, C2-C6 alquinila, –(CH2)m–fenila opcionalmente substituída ou–(CH2)n–heteroarila de 6 membros opcionalmente substituída, e em que cada de m e n é 0 ou 1.

23. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que cada R5 e R6 é C1-C6 alquila.

24. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que cada R5 e R6 é metila.

25. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o grupo bloqueador 3ʹ-OH compreende a estrutura selecionada a partir do grupo que consiste em , ,e .

26. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o nucleosídeo ou nucleotídeo é covalentemente ligado a um marcador detectável, opcionalmente por meio de um ligante clivável.

27. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o marcador detectável é covalentemente ligado a uma nucleobase do nucleosídeo ou nucleotídeo por meio de um ligante clivável.

28. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o ligante é um ligante clivável que compreende uma porção azido, uma porção –O-alila, uma porção dissulfeto, uma porção acetal ou uma porção tiocarbamato.

29. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o grupo bloqueador 3ʹ-OH e o ligante clivável podem ser removidos nas mesmas condições de reação química.

30. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que compreende uma 2ʹ- desoxirribose.

31. Nucleosídeo ou nucleotídeo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo é um nucleotídeo trifosfato.

32. Oligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende um nucleotídeo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31.

33. Método de preparação de um polinucleotídeo complementar em crescimento a um polinucleotídeo de fita simples alvo em uma reação de sequenciamento, caracterizado pelo fato de que compreende a incorporação de um nucleotídeo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 em um polinucleotídeo complementar em crescimento, em que a incorporação do nucleotídeo impede a introdução de qualquer nucleotídeo subsequente no polinucleotídeo complementar em crescimento.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo incorporado é um nucleotídeo trifosfato que tem um grupo bloqueador 3’-OH da estrutura covalentemente ligado ao carbono 3’ da 2ʹ-desoxirribose.

35. Método de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que a incorporação do nucleotídeo é realizada por uma polimerase, uma desoxinucleotidil transferase terminal ou uma transcriptase reversa.

36. Método de determinação da sequência de um polinucleotídeo de fita simples alvo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) incorporar um nucleotídeo definido em qualquer uma das reivindicações 26 a 31 em uma fita-cópia de polinucleotídeo complementar a pelo menos uma porção da fita de polinucleotídeo alvo; (b) detectar a identidade do nucleotídeo incorporado na fita-cópia de polinucleotídeo; e (c) remover quimicamente o marcador e o grupo bloqueador 3ʹ-OH do nucleotídeo incorporado na fita-cópia do polinucleotídeo.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo incorporado na etapa (a) é um nucleotídeo trifosfato que tem um grupo bloqueador 3’-OH da estrutura covalentemente ligado ao carbono 3’ da 2ʹ-desoxirribose.

38. Método de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracterizado pelo fato de que compreende ainda (d) lavagem do marcador removido quimicamente e do grupo bloqueador 3’-OH, removendo-os da fita-cópia de polinucleotídeo.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que compreende ainda repetição das etapas (a) a (d) até que uma sequência da porção da fita-molde de polinucleotídeo seja determinada.

40. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) a (d) são repetidas pelo menos 50 vezes.

41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 40, caracterizado pelo fato de que o marcador e o grupo bloqueador 3ʹ-OH do nucleotídeo incorporado na fita-cópia do polinucleotídeo são removidos em uma única reação química.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende o contato do nucleotídeo incorporado com uma solução de clivagem que compreende um catalisador de paládio.

43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 40, caracterizado pelo fato de que o marcador e o grupo bloqueador 3ʹ-OH do nucleotídeo incorporado à fita-cópia do polinucleotídeo são removidos em duas reações químicas separadas.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende o contato do nucleotídeo incorporado com uma solução de clivagem que compreende uma fosfina e uma solução de clivagem que compreende um catalisador de paládio.

45. Método de acordo com a reivindicação 42 ou 44, caracterizado pelo fato de que a fosfina é tris(hidroximetil)fosfina, tris(hidroxietil)fosfina ou tris(hidroxipropil)fosfina.

46. Método de acordo com a reivindicação 42, 44 ou 45, caracterizado pelo fato de que a solução de clivagem que compreende o catalisador de paládio compreende ainda um ou mais reagentes tampão selecionados a partir do grupo que consiste em uma amina primária, uma amina secundária, uma amina terciária, um sal carbonato, um sal fosfato, e um sal borato e combinações dos mesmos.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que os reagentes tampões são selecionados a partir do grupo que consiste em etanolamina (EA), tris(hidroximetil)aminometano(Tris), glicina, um sal carbonato, um sal fosfato, um sal borato, 2-dimetialaminoetanol (DMEA), 2- dietialaminoetanol (DEEA), N,N,Nʹ,Nʹ-tetrametiletilenodiamina (TEMED), e N,N,Nʹ,Nʹ-tetraetiletilenodiamina (TEEDA) e combinações dos mesmos.

48. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais nucleosídeos ou nucleotídeos definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a

31.

49. Kit de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que pelo menos um nucleosídeo ou nucleotídeo é um nucleotídeo de trifosfato que tem um grupo bloqueador 3’-OH da estrutura covalentemente ligada ao carbono 3’ da 2’-desoxirribose.

50. Kit de acordo com a reivindicação 48 ou 49, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma enzima e um tampão apropriado para a ação da enzima.

51. Kit de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a enzima é uma polimerase, uma desoxinucleotidil transferase terminal ou uma transcriptase reversa.

52. Kit de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a polimerase é uma DNA polimerase.