CN110234403A - 作为sting激动剂的环状二核苷酸 - Google Patents

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S.伊曼纽尔
M.里克特
P.J.康诺利
J.P.爱德华兹
王广义
S.K.塔提孔达
L.贝高曼
钟明宏
G.比尼昂
W.舍彭斯
M.维勒沃耶
J.W.J.F.图林
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Abstract

本发明公开了用于治疗受所述STING调制影响的疾病、综合征或障碍的化合物、组合物和方法。此类化合物由下式(I)表示：其中R、R1B、R1C、R2B、R2C、B1、W、X、Y、Z如本文所定义。

Description

作为STING激动剂的环状二核苷酸
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年1月27日提交的美国临时专利申请62/451,301、于2017年2月3日提交的美国临时专利申请62/454,135以及于2017年1月27日提交的美国临时专利申请62/451,351的优先权；这些专利申请据此全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及新型化合物，这些新型化合物为STING(干扰素基因的刺激剂)激动剂，并可用于治疗受STING蛋白调制影响的障碍。本发明还涉及包含此类化合物中的一种或多种的药物组合物、制备此类化合物和组合物的工艺，以及此类化合物或药物组合物用于治疗各种疾病、综合征或障碍的用途。本发明可涉及到下游信号传导途径的激活，进一步引起第二信使和生长因子的激活，以及涉及到先天性免疫和适应性免疫的干扰素的产生。更具体地，本发明涉及此类化合物或药物组合物用于治疗各种感染、疾病、综合征和障碍的用途，该疾病、综合征和障碍包括但不限于黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤和抗病毒疗法。
背景技术
STING(干扰素基因的刺激剂)也称为TMEM173、MITA、MPYS和ERIS，是位于细胞内的跨膜受体和细胞溶质核酸的关键传感器(Chong B等人的“衔接子蛋白MITA将病毒感测受体与IRF3转录因子激活联系起来(The Adaptor Protein MITA Links Virus-SensingReceptors to IRF3Transcription Factor Activation)”，《免疫力(Immunity)》，2008年，第29卷：538-550)。最近的研究揭示STING的生物学及其在调动先天性免疫应答中的作用，从而在小鼠模型中产生强健抗肿瘤活性。STING途径的激活引起通过IRF3(干扰素调节因子3)途径诱导的I型干扰素(主要为IFN-α和IFN-β)的产生。IRF3的激活被认为是由TBK1介导的，该TBK1招募并磷酸化IRF3，从而形成一种能够进入细胞核以转录I型干扰素和其它基因的IRF3同型二聚体(Liu等人的“先天性免疫衔接子蛋白MAVS、STING和TRIF的磷酸化诱导IRF3激活(Phosphorylation of innate immune adaptor proteins MAVS,STING,andTRIF induces IRF3 activation)”《科学(Science)》，2015:2630-2637)。TBK1还激活激活的B细胞途径的核因子kappa轻链增强子，这经由致癌转录因子NF-KB引起促炎细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α等)的产生。此外，STING激活STAT6(信号转导子和转录激活因子6)以诱导(Th2型)、增加(IL-12)或降低(IL-10)各种细胞因子(包括趋化因子CCL2、CCL20和CCL26)的产生(ChenH等人的“通过STING激活STAT6对于抗病毒先天性免疫至关重要(Activation of STAT6 by STING Is Critical for Antiviral Innate Immunity)”《细胞(Cell)》，2011年，第14卷：433-446)。据报道，在激活时Ser366上STING的直接磷酸化也通过TBK1或ULK1发生(Corrales,L.等人的“肿瘤微环境中STING的直接激活引起强效和全身性肿瘤消退和免疫(Direct activation of STING in the tumor microenvironmentleads to potent and systemic tumor regression and immunity)”《细胞报告(CellReports)》，2015年，第11卷：1-13；Konno,H.等人的“环状二核苷酸触发STING的ULK1(ATG1)磷酸化以防止持续的先天性免疫信号传导(Cyclic dinucleotides trigger ULK1(ATG1)phosphorylation of STING to prevent sustained innate immune signaling)”《细胞(Cell)》，2013年，第155卷：688-698)。
已阐明结合并激活STING(2',3')环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸(2',3'-cGAMP)的天然配体和负责其合成的酶(cGAS，也称为C6orf150或MB21D1)，提供调制该途径的机会。cGAMP为在哺乳动物细胞中产生的STING的高亲和力配体，其充当内源性第二信使以激活STING途径。它是一种环状二核苷酸，具有独特的2’,3’连接，由cGAS在外源双链DNA(例如由侵入细菌、病毒或原生动物释放)或哺乳动物中的自身DNA存在下产生(Wu等人，2013年；Sun,L.等人的“环状GMP-AMP合酶为一种激活I型干扰素途径的细胞溶质DNA传感器(Cyclic GMP-AMPSynthase Is a Cytosolic DNA Sensor That Activates the Type I InterferonPathway)”《自然(Science)》,2013年，第339卷：786-791；Bhat N和Fitzgerald KA.“通过cGAS和其它STING依赖性传感器对细胞溶质DNA的识别(Recognition of Cytosolic DNAby cGAS and other STING-dependent sensors)”，《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol)》，2014年3月；44(3):634-40)。STING激活也可通过由侵入细菌释放的外源(3',3)环状二核苷酸(c-di-GMP、c-di-AMP和3’3’-cGAMP)的结合而发生(ZhangX,等人的“包含混合磷二酯连接的环状GMP-AMP为STING的内源性高亲和力配体(Cyclic GMP-AMP Containing MixedPhosphodiester Linkages Is An Endogenous High-Affinity Ligand for STING)”《分子细胞(Molecular Cell)》，2013年，第51卷：226-235；Danilchanka,O和Mekalanos,JJ，“环状二核苷酸和先天性免疫应答(Cyclic Dinucleotides and the Innate ImmuneResponse)”《细胞》(Cell)，2013年，第154卷：第962-970页)。
STING途径的激活触发免疫应答，该免疫应答引起生成可收缩肿瘤并提供持久免疫的特异性杀灭性T细胞，使得它们不再复发。在临床前模型中用STING激动剂获得的显著抗肿瘤活性已对该靶标生成高水平的激动，并且能够调制STING途径的小分子化合物具有治疗癌症和降低自身免疫性疾病两者的潜力。
STING途径的激活还有助于抗病毒应答。无论在细胞还是生物体水平上，功能性应答的丧失都表明在不存在STING的情况下无法控制病毒载量。STING途径的激活触发免疫应答，该免疫应答产生对抗病毒并调动免疫系统的先天和适应性臂的抗病毒和促炎细胞因子。最终，针对病原性病毒开发出持久免疫力。在临床前模型中用STING激动剂获得的显著抗病毒活性已对该靶标生成高水平的激动，并且可调制STING途径的小分子化合物具有治疗慢性病毒感染(诸如乙型肝炎)的潜力。
慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是重大的全球健康问题，影响着世界人口的超过5％(全世界超过3亿5千万的人口和美国125万的个体)。尽管可获得某些HBV疫苗和疗法，但是慢性HBV感染的负担因发展中国家大部分地区的次优治疗选项和持续的新感染率而仍旧为一个重大且未能应对的世界性医学问题。目前的治疗仅受限于两类试剂：充当病毒聚合酶的抑制剂的干扰素α和核苷类似物。然而，这些疗法中没有一种提供对疾病的治愈，并且耐药性、低功效和耐受性问题限制它们的影响。HBV的低治愈率至少部分归因于这样的事实：病毒产生的完全抑制难以用单一的抗病毒剂来实现。然而，HBVDNA的持久性抑制减缓了肝脏疾病的发展并且有助于预防肝细胞癌。对于HBV感染患者的当前治疗目标旨在将血清HBVDNA降至很低或不可检出的水平，并最终减少或预防硬化症和肝细胞癌的发展。因此，本领域需要可提高对病毒产生的抑制并且可治疗、改善、或预防HBV感染的治疗剂。将此类治疗剂作为单一治疗药物施用或与其它HBV治疗或辅助治疗联合施用于HBV感染的患者，可导致病毒载量显著降低、预后改善、疾病发展减慢并且血清转化率增强。
增强先天性免疫和适应性免疫的潜在治疗有益效果使得STING成为有吸引力的治疗靶标，其自身表现出令人印象深刻的活性，并且也可与其它免疫疗法联合。
发明内容
本发明涉及式(I)的化合物
其中
R为CH2或O；
R1B为氢、羟基或氟；
R1C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
R2B为氢、羟基、甲氧基或氟；
R2C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
B1选自由以下项组成的组：环b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7和b8
W为-O-或-NH-；
X为-O-或-NH-；
Y为-CH2-、-O-或-NH-；
Z为-CH2-、-O-或-NH-；
使得在任何情况下，X和Y中只有一个为NH，并且W和Z中只有一个为NH；
并且，使得当R为CH2且B1选自b6或b7时，则R2B不为氟或羟基；
此外，前提条件是式(I)的化合物不为这样的化合物，其中R、W、X、Y和Z各自为O；R1B和R2B各自为羟基；B1为b1；并且R1B和R2B各自为羟基；
或其对映体、非对映体或药学上可接受的盐形式。
本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含以下物质、由以下物质组成和/或基本上由以下物质组成：药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂以及式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式。
本发明还提供了用于制备药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤、由以下步骤组成和/或基本上由以下步骤组成：将式(I)的化合物与药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂混合。
本发明还提供了用于使用式(I)的化合物治疗或改善受试者(包括哺乳动物和/或人)中病毒感染、疾病、综合征或病症的方法，其中病毒感染、疾病、综合征或病症受STING激动的影响。
本发明还提供了用于使用式(I)的化合物治疗或改善受试者(包括哺乳动物和/或人)中病毒感染、疾病、综合征或病症的方法。
本发明还提供了用于使用式(I)的化合物治疗或改善受试者(包括哺乳动物和/或人)中受STING激动的影响的病毒感染、疾病、综合征或病症的方法，其中该病毒感染、疾病、综合征或病症选自由以下项组成的组：黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤和乙型肝炎。
本发明还提供了用于使用式(I)的化合物治疗或改善受试者(包括哺乳动物和/或人)中的病毒感染、疾病、综合征或病症的方法，该病毒感染、疾病、综合征或病症选自由以下项组成的组：黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤和乙型肝炎。
本发明还涉及本文所述化合物中的任一种在制备药物中的用途，其中该药物经制备用于治疗受STING激动的影响的病毒感染、疾病、综合征或病症，该病毒感染、疾病、综合征或病症选自由以下项组成的组：黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤和乙型肝炎。
本发明还涉及本文所述化合物中的任一种在制备药物中的用途，其中该药物经制备用于治疗在对其有需要的受试者中的病毒感染、疾病、综合征或病症，该病毒感染、疾病、综合征或病症选自由以下项组成的组：：黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤和乙型肝炎。
本发明还涉及充当STING选择性激动剂的取代的环状二核苷酸衍生物的制备。
举例说明，本发明为治疗由STING调制的病毒感染、疾病、综合征或病症的方法，该病毒感染、疾病、综合征或病症选自由以下项组成的组：黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤和乙型肝炎，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的上述化合物或药物组合物中的任何。
举例说明，本发明为治疗病毒感染、疾病、综合征或病症的方法，该病毒感染、疾病、综合征或病症选自由以下项组成的组：黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤和乙型肝炎，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的上述化合物或药物组合物中的任何。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗受STING激动的影响的病毒感染、疾病、综合征或病症的式(I)的化合物，该病毒感染、疾病、综合征或病症选自由以下项组成的组：黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤和乙型肝炎。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含用于治疗病毒感染、疾病、综合征或病症的式(I)的化合物的组合物，该病毒感染、疾病、综合征或病症选自由以下项组成的组：黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤和乙型肝炎。
具体实施方式
关于取代基，术语“独立地”是指当可能存在多于一个的取代基时，所述取代基可彼此相同或不同的情况。
术语“烷基”无论是单独使用或作为取代基的部分使用，均是指具有1至8个碳原子的直链或支化的碳链。因此，指定的碳原子数(例如C1-8)独立地指烷基部分中的碳原子数目或指较大的含烷基的取代基的烷基部分中的碳原子数目。在具有多个烷基的取代基诸如(C1-6烷基)2氨基-中，该二烷基氨基的C1-6烷基可相同或不同。
术语“烷氧基”是指-O-烷基，其中术语“烷基”如上文所定义。
术语“烯基”和“炔基”是指具有2至8个碳原子的直链和支化的碳链，其中烯基链含有至少一个双键并且炔基链含有至少一个三键。
术语“环烷基”是指具有3至14个碳原子的饱和或部分饱和的、单环的或多环的烃环。此类环的示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和金刚烷基。
术语“杂环基”是指具有3至10个环成员的非芳族单环体系或二环体系，所述环成员包括至少1个碳原子和1至4个杂原子，所述杂原子独立地选自N、O和S。包括具有5至7个成员的非芳族环状环(其中1至2个成员为N)、或具有5至7个成员的非芳族环状环(其中0、1或2个成员为N，并且至多2个成员为O或S，并且至少一个成员必须为N、O或S)包括于术语杂环基内；其中任选地，所述环含有0至1个不饱和键，并且任选地，当所述环具有6或7个成员时，其含有至多2个不饱和键。形成杂环的碳原子环成员可以是完全饱和的或部分饱和的。术语“杂环基”也包括桥接形成二环的两个5元单环杂环烷基。此类基团不视为是完全芳族的，并且不称它们为杂芳基。当杂环是二环时，杂环的两个环是非芳族的并且至少其中一个环含有杂原子环成员。杂环基的示例包括且不限于吡咯啉基(包括2H-吡咯、2-吡咯啉基或3-吡咯啉基)、吡咯烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基和哌嗪基。除非另外指明，否则杂环在可得到稳定结构的任何杂原子或碳原子上与其侧基连接。
术语“芳基”是指具有6至10个碳成员的不饱和芳族单环或二环。芳环的示例包括苯基和萘基。术语“杂芳基”是指具有5至10个环成员，并含有碳原子和1至4个杂原子的单环芳族环系或二环芳族环系，所述杂原子独立地选自N、O和S。具有5或6个成员的芳族环(其中所述环由碳原子组成并具有至少一个杂原子成员)包括在术语杂芳基内。适宜的杂原子包括氮、氧和硫。在5元环的情况下，杂芳基环优选地含有氮、氧或硫中的一个成员，此外还含有至多3个附加的氮。在6元环的情况下，杂芳基环优选含有1至3个氮原子。对于其中6元环具有3个氮原子的情况，最多2个氮原子是相邻的。杂芳基的示例包括呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、喹啉基、异喹啉基和喹唑啉基。除非另外指明，否则杂芳基在导致稳定结构的任何杂原子或碳原子上与其侧基连接。
术语“卤素”或“卤”是指氟、氯、溴和碘原子。
当术语“烷基”或“芳基”或其前缀词根的任一者出现于取代基(例如，芳基烷基、烷基氨基)的名称中时，该名称应解释为包括上述对“烷基”和“芳基”给予的那些限制。碳原子的指定数目(如C1-C6)独立地指烷基部分、芳基部分中或其中烷基以其前缀词根出现的较大取代基的烷基部分中的碳原子的数目。对于烷基和烷氧基取代基，碳原子的指定数目包括所规定的给定范围内的所有独立成员。举例来说，C1-6烷基单独地包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基，以及它们的子组合(例如，C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C2-6、C3-6、C4-6、C5-6、C2-5等)。
一般来讲，在本公开全部内容中使用的标准命名法下，指定侧链的终端部分首先描述，随后是朝向连接点的邻接官能团。因此，举例而言，“C1-C6烷基羰基”取代基是指下式表示的基团：
在立构中心处的术语“R”指明该立构中心仅具有R-构型，如本领域中所定义；同样，术语“S”意指立构中心仅具有S-构型。如本文所用，在立构中心处的术语“*R”或“*S”用于指明立构中心具有纯的但未知的构型。如本文所用，术语“RS”是指以R-和S-构型的混合物存在的立构中心。类似地，术语“*RS”或“*SR”是指以R-和S-构型的混合物存在并且相对于分子内其它立构中心为未知构型的立构中心。
未划有立体键标号的含有一个立构中心的化合物是两种对映体的混合物。含有两个未划有立体键标号的立构中心的化合物为四种非对映体的混合物。具有均标记“RS”且划有立体键标号的两个立构中心的化合物为具有如所划的相对立体化学性的二-成分混合物。具有均标记“*RS”且划有立体键标号的两个立构中心的化合物为具有未知的相对立体化学性的二-成分混合物。未划有立体键标号的未标记立构中心为R-和S-构型的混合物。对于划有立体键标号的未标记立构中心，绝对立体化学性是如所叙述的。
除非另外指明，否则认为分子中特定位置处的任何取代基或变量的定义独立于其在该分子中其它位置处的定义。应当了解，本发明化合物上的取代基和取代模式可由本领域的普通技术人员选择，以提供化学上稳定且可通过本领域已知技术及本文所示的那些方法容易合成的化合物。
术语“受试者”是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。
术语“治疗有效量”指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其它医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。
术语“组合物”指包括治疗有效量的规定成分的产品，以及直接或间接地由规定量的规定成分的组合产生的任何产品。
术语“STING激动剂”旨在涵盖通过与STING结合并诱导下游信号转导而与STING相互作用的化合物，其特征在于与STING功能相关联的分子的激活。这包括STING、IRF3和/或NF-KB的直接磷酸化，并且还可包括STAT6。STING途径激活引起I型干扰素(主要为IFN-α和IFN-β)的产生和干扰素刺激基因的表达的增加(Chen H,等人的“通过STING激活STAT6对于抗病毒先天性免疫至关重要”(“Activation of STAT6 by STING Is Critical forAntiviral Innate Immunity”)，《细胞》(Cell)，2011年，第14卷：433-446；以及LiuS-Y，等人的“I型和II型干扰素诱导的抗病毒因子的系统鉴定”(“Systematic identification oftype I and type II interferon-induced antiviral factors”)，Proc.Natl.Acad.Sci.2012年，第109卷4239-4244)。
术语“STING调制的”用于指直接或经由STING途径受STING影响的病症，包括但不限于病毒感染、疾病或病症，诸如黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤和乙型肝炎感染。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“由STING调制的障碍”应意指任何病毒感染、疾病、障碍或病症，其特征在于用STING激动剂治疗后其特征性症状中的至少一种得到缓解或消除。适宜的示例包括但不限于黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤和乙型肝炎。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“影响”或“受影响的”(当涉及受STING激动的影响的病毒感染、疾病、综合征、病症或障碍时)包括所述病毒感染、疾病、综合征、病症或障碍的一种或多种症状或临床表现的频率和/或严重性的降低；并且/或者包括防止所述病毒感染、疾病、综合征、病症或障碍的一种或多种症状或临床表现的发展或者所述病毒感染、疾病、病症、综合征或障碍的发展。
本发明的化合物在用于治疗或改善受STING激动的影响的病毒感染、疾病、综合征、病症或障碍的方法中为有用的。此类方法包括下列步骤、由下列步骤组成和/或基本上由下列步骤组成：给受试者施用治疗有效量的式(I)化合物或其对映体、非对映体、溶剂化物或可药用的盐，所述受试者包括需要此类治疗、缓解和/或预防的动物、哺乳动物和人类。
具体地，式(I)的化合物或其对映体、非对映体、溶剂化物或药学上可接受的盐形式可用于治疗或改善疾病、综合征、病症或障碍，诸如黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤和乙型肝炎。
更具体地，式(I)的化合物或其对映体、非对映体、溶剂化物或药学上可接受的盐形式可用于治疗或改善黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤和乙型肝炎，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的如本文定义的式(I)的化合物或或其对映体、非对映体、溶剂化物或药学上可接受的盐形式。
本文所公开的一些实施方案涉及改善和/或治疗病毒感染的方法，该病毒感染包括由嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(诸如乙型肝炎病毒或HBV)引起的感染。该方法可包括给被鉴定为患有病毒感染的受试者施用有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式中的一种或多种，或包含一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式的药物组合物。
本文所公开的其它实施方案涉及一种改善和/或治疗病毒感染的方法，该方法可包括将感染病毒的细胞与有效量的本文所述的一种或多种化合物(例如，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式)，或包含本文所述的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物接触。本文所述的其它实施方案涉及在制造用于改善和/或治疗病毒感染的药物中使用一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式。
本文所述的其它实施方案涉及可用于改善和/或治疗病毒感染的一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，或者包括一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式的药物组合物。本文所公开的一些实施方案涉及抑制病毒复制的方法，该方法可包括将感染病毒的细胞与有效量的一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式，或包含本文所述的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐形式的药物组合物接触。
本文所述的其它实施方案涉及在制造用于抑制病毒复制的药物中使用一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式。本文所述的其它实施方案涉及可用于抑制病毒复制的本文所述的一种或多种化合物(例如，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式)，或包含本文所述的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐形式的药物组合物。
在一些实施方案中，病毒感染可为乙型肝炎病毒感染。该方法可包括给被鉴定为患有HBV受试者施用有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式中的一种或多种，或包含一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式的药物组合物。
本文所公开的一些实施方案涉及一种改善和/或治疗病毒感染的方法，该方法可包括将感染HBV病毒的细胞与有效量的一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式，或包含一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式的药物组合物接触。本文所述的其它实施方案涉及在制造用于改善和/或治疗HBV的药物中使用一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式。
本文所述的其它实施方案涉及可用于改善和/或治疗HBV的一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，或者包括一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式的药物组合物。本文所公开的一些实施方案涉及一种抑制HBV复制的方法，该方法可包括将感染病毒的细胞与有效量的一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式，或包含一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物接触。
本文所述的其它实施方案涉及在制造用于抑制HBV复制的药物中使用一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。本文所述的其它实施方案涉及可用于抑制HBV复制的一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，或包含一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式的药物组合物。
本发明的一个实施方案涉及式(I)的化合物
其中
R为CH2或O；
R1B为氢、羟基或氟；
R1C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
R2B为氢、羟基、甲氧基或氟；
R2C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
B1选自由以下项组成的组：环b1、b2、b3、b4、b5、b6和b8
W为-O-或-NH-；
X为-O-或-NH-；
Y为-CH2-、-O-或-NH-；
Z为-CH2-、-O-或-NH-；
使得在任何情况下，X和Y中只有一个为NH，并且W和Z中只有一个为NH；
并且，使得当R为CH2且B1为b6时，则R2B不为氟或羟基；
此外，前提条件是式(I)的化合物不为这样的化合物，其中R、W、X、Y和Z各自为O；R1B和R2B各自为羟基；B1为b1；并且R1B和R2B各自为羟基；
或其对映体、非对映体或药学上可接受的盐形式。
本发明的一个实施方案涉及式(I)的化合物
其中
R为CH2或O；
R1B为氢、羟基或氟；
R1C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
R2B为氢、羟基、甲氧基或氟；
R2C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
B1选自由以下项组成的组：环b1、b2、b3、b4、b6和b8
W为-O-；
X为-O-或-NH-；
Y为-CH2-、-O-或-NH-；
Z为-CH2-、-O-或-NH-；
使得在任何情况下，X和Y中只有一个为NH；
并且，使得当R为CH2且B1为b6时，则R2B不为氟或羟基；
此外，前提条件是式(I)的化合物不为这样的化合物，其中R、X、Y和Z各自为O；R1B和R2B各自为羟基；B1为b1；并且R1B和R2B各自为羟基；
或其对映体、非对映体或药学上可接受的盐形式。
本发明的一个实施方案涉及式(I)的化合物
其中
R为CH2或O；
R1B为氢、羟基或氟；
R1C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
R2B为氢、羟基、甲氧基或氟；
R2C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
B1为b6
W为-O-；
X为-O-或-NH-；
Y为-CH2-、-O-或-NH-；
Z为-CH2-、-O-或-NH-；
使得在任何情况下，X和Y中只有一个为NH；
并且，使得当R为CH2且B1为b6时，则R2B不为氟或羟基；或其对映体、非对映体或药学上可接受的盐形式。
本发明的一个实施方案涉及式(I)的化合物
其中
R为CH2或O；
R1B为氢、羟基或氟；
R1C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
R2B为氢、羟基、甲氧基或氟；
R2C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
B1选自由以下项组成的组：环b1、b2、b3、b4、b6和b8
W为-NH-；
X为-O-或-NH-；
Y为-CH2-、-O-或-NH-；
Z为-CH2-、-O-或-NH-；
使得在任何情况下，X和Y中只有一个为NH；
并且，使得当R为CH2且B1为b6时，则R2B不为氟或羟基；或其对映体、非对映体或药学上可接受的盐形式。
本发明的一个实施方案涉及式(I)的化合物
其中
R为CH2或O；
R1B为氢、羟基或氟；
R1C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
R2B为氢、羟基、甲氧基或氟；
R2C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
B1为b6
W为-NH-；
X为-O-或-NH-；
Y为-CH2-、-O-或-NH-；
Z为-CH2-、-O-或-NH-；
使得在任何情况下，X和Y中只有一个为NH；
并且，使得当R为CH2且B1为b6时，则R2B不为氟或羟基；或其对映体、非对映体或药学上可接受的盐形式。
本发明的一个实施方案涉及式(I)的化合物
其中
R为CH2；
R1B为氢、羟基或氟；
R1C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
R2B为氢、羟基、甲氧基或氟；
R2C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
B1选自由以下项组成的组：环b1、b2、b3、b4、b5、b6和b8
W为-O-或-NH-；
X为-O-或-NH-；
Y为-CH2-、-O-或-NH-；
Z为-CH2-、-O-或-NH-；
使得在任何情况下，X和Y中只有一个为NH，并且W和Z中只有一个为NH；
并且，使得当B1为b6时，则R2B不为氟或羟基；
或其对映体、非对映体或药学上可接受的盐形式。
本发明的一个实施方案涉及式(I)的化合物
其中
R为CH2；
R1B为氢、羟基或氟；
R1C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
R2B为氢、羟基、甲氧基或氟；
R2C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
B1选自由以下项组成的组：环b1、b2、b3、b4、b5、b6和b8
W为-O-；
X为-O-；
Y为-CH2-或-O-；
Z为-CH2-或-O-；
使得当B1为b6时，则R2B不为氟或羟基；
或其对映体、非对映体或药学上可接受的盐形式。
本发明的一个实施方案涉及式(I)的化合物
其中
R为O；
R1B为氢、羟基或氟；
R1C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
R2B为氢、羟基、甲氧基或氟；
R2C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
B1选自由以下项组成的组：环b1、b2、b3、b4、b5、b6和b8
W为-O-或-NH-；
X为-O-或-NH-；
Y为-CH2-、-O-或-NH-；
Z为-CH2-、-O-或-NH-；
使得在任何情况下，X和Y中只有一个为NH，并且W和Z中只有一个为NH；
此外，前提条件是式(I)的化合物不为这样的化合物，其中R、W、X、Y和Z各自为O；R1B和R2B各自为羟基；B1为b1；并且R1B和R2B各自为羟基；
或其对映体、非对映体或药学上可接受的盐形式。
本发明的实施方案还包括式(Ia)(其中如本文所定义，W、X、Y和Z各自为O)的化合物或其对映体、非对映体、溶剂化物或药学上可接受的盐形式，其中选自本文定义的一个或多个变量(例如，R、R1B、R1C、R2B、R2C和B1)的取代基被独立地选择为来自下表1的列表中所列举的那些取代基中的任何单个取代基或取代基的任何子集。
表1.
本发明的实施方案还包括式(Ib)(其中如本文所定义，R为O)的化合物或其对映体、非对映体、溶剂化物或药学上可接受的盐形式，其中选自本文定义的一个或多个变量(例如，R1B、R1C、R2B、R2C、W、X、Y、Z和B1)的取代基被独立地选择为来自下表2的列表中所列举的那些取代基中的任何单个取代基或取代基的任何子集。
表2.
本发明的另一个实施方案涉及选自化合物1至33的式(I)的化合物，
或其药学上可接受的盐形式。
对于在医学上的使用，式(I)的化合物的盐是指无毒性的“药学上可接受的盐。”然而，其他盐也可用于制备式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式。式(I)的化合物的合适药学上可接受的盐包括酸加成盐，所述酸加成盐可例如通过将所述化合物的溶液与诸如盐酸、硫酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸的药学上可接受的酸溶液混合而形成。此外，如果式(I)的化合物含有酸性部分，则其合适的药学上可接受的盐可包括碱金属盐，诸如钠盐或钾盐；碱土金属盐(如钙盐或镁盐)；以及与适宜的有机配体形成的盐(如季铵盐)。因此，代表性药学上可接受的盐包括醋酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、依地酸钙盐、右旋樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、对α-羟乙酰氨基苯砷酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘液酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲基葡糖胺铵盐、油酸盐、双羟萘酸盐(扑酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘化物和戊酸盐。
可用于制备药学上可接受的盐的代表性酸和碱包括：酸，包括乙酸、2,2-二氯乙酸、乙酰化的氨基酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、(+)-樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基-乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡糖酸、D-葡萄糖醛酸、L-谷氨酸、α-氧代-戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸、乳糖酸、马来酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、扑酸、磷酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、鞣酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸和十一碳烯酸；以及碱，包括氨、L-精氨酸、苯乙苄胺、苄星、氢氧化钙、胆碱、丹醇、二乙醇胺、二乙胺、2-(二乙基氨基)-乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-甲基-葡糖胺、海巴明、1H-咪唑、L-赖氨酸、氢氧化镁、4-(2-羟乙基)-吗啉、哌嗪、氢氧化钾、1-(2-羟乙基)-吡咯烷、氢氧化钠、三乙醇胺、氨基丁三醇和氢氧化锌。
本发明的实施方案包括式(I)化合物的前药。一般来讲，这种前药会是化合物的官能衍生物，其在体内可容易地转化成所需的化合物。因此，在本发明的治疗或预防实施方案的方法中，术语“施用”涵盖了用具体公开的化合物或未具体公开的化合物治疗或预防所述的多种疾病、病症、综合征和障碍，但所述未具体公开的化合物在施用至患者后会于体内转化成指定化合物。例如，在“DesignofProdrugs(《前药设计》)”，H.Bundgaard编辑，Elsevier(爱思唯尔)，1985年中描述了用于选择和制备适宜的前药衍生物的常规工序。
根据本发明实施方案的化合物具有至少一个手性中心时，它们可相应地作为对映体存在。如果化合物具有两个或更多个手性中心，则它们另外可以非对映体形式存在。应当理解，所有的此类异构体及其混合物涵盖在本发明的范围内。此外，化合物的某些结晶形式可作为多晶型物存在，并因此也旨在包括在本发明内。此外，某些化合物可与水形成溶剂化物(即水合物)或与普通有机溶剂形成溶剂化物，并且这类溶剂化物也旨在涵盖于本发明的范围内。技术人员将理解，本文所使用的术语化合物旨在包括溶剂化的式(I)的化合物。
当用于制备根据本发明某些实施方案的化合物的方法产生立体异构体的混合物时，这些异构体可通过常规技术如制备性色谱法分离。所述化合物可以外消旋形式制备，或者可通过对映体特异性合成或通过拆分来制备单独的对映体。例如，可通过标准技术，如通过与光学活性酸(诸如(-)-二对甲苯酰-d-酒石酸和/或(+)-二对甲苯酰-l-酒石酸)形成盐来形成非对映体对，然后分级结晶并再生游离碱，来将化合物拆分成它们的组分对映体。所述化合物也可通过形成非对映体酯或酰胺，然后进行色谱分离并除去手性助剂来拆分。另选地，可使用手性HPLC柱拆分所述化合物。
本发明的一个实施方案涉及一种组合物，包括药物组合物，其包含式(I)的化合物的(+)-对映体、由其组成和/或基本上由其组成，其中所述组合物基本上不含所述化合物的(-)-异构体。在本发明的上下文中，基本上不含意指少于约25％，优选少于约10％，更优选少于约5％，甚至更优选少于约2％，并且甚至更优选少于约1％的(-)-异构体，其计算方式如下：
本发明的另一个实施方案为一种组合物，包括药物组合物，其包含式(I)化合物的(-)-对映体、由其组成和基本上由其组成，其中所述组合物基本上不含所述化合物的(+)-异构体。在本发明的上下文中，基本上不含意指少于约25％，优选少于约10％，更优选少于约5％，甚至更优选少于约2％，并且甚至更优选少于约1％的(+)-异构体，其计算方式如下：
在用于制备本发明多个实施方案的化合物的任何工艺过程中，可能有必要和/或期望保护所关注的任何分子上的敏感性或反应性基团。这可使用常规保护基团实现，例如在如下文献中描述的那些：Protective Groups in Organic Chemistry(第二版)，J.F.W.McOmie,Plenum Press,1973；T.W.Greene & P.G.M.Wuts，有机合成中的保护基团(Protective Groups in Organic Synthesis)，约翰威立国际出版公司(John Wiley &Sons)，1991；和T.W.Greene & P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis(第三版)，John Wiley & Sons,1999。可使用本领域已知的方法在方便的后续阶段除去保护基团。
尽管本发明实施方案的化合物(包括它们的药学上可接受的盐和药学上可接受的溶剂化物)可单独施用，但它们一般与药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂(根据施用途径和标准药用或兽医实践而选择)混合施用。因此，本发明的具体实施方案涉及药用和兽医用组合物，其包含式(I)的化合物和至少一种药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂。
举例来说，在本发明实施方案的药物组合物中，可将式(I)的化合物与任何合适的粘合剂(一种或多种)、润滑剂(一种或多种)、助悬剂(一种或多种)、包衣剂(一种或多种)、增溶剂(一种或多种)以及它们的组合混合。
视情况而定，含有本发明化合物的固体口服剂型(如片剂或胶囊剂)可一次以至少一种剂型施用。也可按持续释放制剂的方式施用化合物。
其中可施用本发明化合物的其它口服剂型包括酏剂、溶液剂、糖浆和混悬剂；每种剂型任选地含有调味剂和着色剂。
另选地，式(I)化合物可通过吸入(气管内或鼻内)给予或者以栓剂或阴道栓剂形式给予，或者它们可以洗剂、溶液剂、霜膏、油膏剂或扑粉的形式局部给予。例如，可将它们混入霜剂中，所述霜剂包含聚乙二醇或液态石蜡的水乳液、由其组成和/或基本上由其组成。它们也可以所述霜膏的介于约1重量％至约10重量％之间的浓度混入油膏剂中，所述油膏剂包含蜡或软石蜡基以及任何稳定剂和防腐剂(有可能需要)、由其组成和/或基本上由其组成。替代的施用手段包括通过使用皮肤贴剂或透皮贴剂来透皮施用。
本发明的药物组合物(以及单独的本发明化合物)也可通过非肠道注射，例如海绵体内、静脉内、肌内、皮下、皮内或鞘内注射。在这种情况下，该组合物还将包括适宜载体、适宜赋形剂和适宜稀释剂中的至少一种。
对于非肠道施用，本发明的药物组合物最好以无菌水溶液形式使用，其可含有其它物质，例如足够的盐和单糖以制备与血液等渗的溶液。
除了上述治疗癌症的施用途径之外，药物组合物还可适于通过瘤内注射或瘤周注射施用。以这种方式激活免疫系统以杀死远程位点处的肿瘤通常被称为遗传效应，并且已在具有多种治疗模式的动物中得到证明(van der Jeught等人的《肿瘤靶标(Oncotarget)》,2015,6(3),1359-1381)。局部施用或瘤内施用或瘤周施用的另一个优点是能够在低得多的剂量下获得同等功效，从而最小化或消除在高得多的剂量下可观察到的不良事件(Marabelle,A.等人的《临床癌症研究(Clinical Cancer Research)》,2014,20(7),1747-1756)。
对于颊面或舌下施用，本发明的药物组合物可以片剂或锭剂形式施用，所述片剂或锭剂可以常规方式配制。
举个另外的例子，含有至少一种式(I)化合物作为活性成分的药物组合物可根据常规药用混合技术，通过将化合物与可药用载体、可药用稀释剂和/或可药用赋形剂混合而制备。所述载体、赋形剂和稀释剂可采用各种各样的形式，这取决于所需施用途径(例如口服、非肠道施用等)。因此对于诸如混悬剂、糖浆、酏剂和溶液剂的液体口服制剂，适宜的载体、赋形剂和稀释剂包括水、二元醇、油、醇类、调味剂、防腐剂、稳定剂、着色剂等；对于诸如散剂、胶囊剂和片剂的固体口服制剂，适宜的载体、赋形剂和稀释剂包括淀粉、糖、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。固体口服制剂也可任选地用诸如糖的物质包衣，或包肠溶衣，以便调节吸收和崩解的主要部位。对于非肠道施用，载体、赋形剂和稀释剂通常包括无菌水，并且可加入其它成分以增加组合物的溶解度和可保存性。注射用混悬剂或溶液剂也可使用含水载体与适当的添加剂(诸如增溶剂和防腐剂)一起制备。
在平均(70kg)的人的每日约1至约4次的给药方案中，治疗有效量的式(I)的化合物或其药物组合物包含约0.01mg至约3000mg，或其中的任何特定量或范围，具体地约0.05mg至约1000mg，或其中的任何特定量或范围，或更具体地约0.05mg至约250mg，或其中的任何特定量或范围的剂量范围的活性成分；但是，对于本领域的技术人员显而易见的是：式(I)的化合物的治疗有效量将随着进行治疗的疾病、综合征、病症和紊乱而变化。
对于口服施用，药物组合物优选以含有约1.0、约10、约50、约100、约150、约200、约250和约500毫克式(I)的化合物的片剂形式提供。
有利的是，式(I)的化合物可以单次日剂量施用，或者每日总剂量可以每日两次、三次和四次的分剂量施用。
待施用的式(I)的化合物的最佳剂量可容易地确定，并且将随所使用的具体化合物、施用模式、制剂强度以及疾病、综合征、病症或障碍的进展而变化。此外，与待治疗的具体受试者相关的因素(包括受试者性别、年龄、体重、饮食和施用时间)将导致需要调整剂量以实现适当的治疗水平和所需的疗效。因此，上述剂量为一般情况的示例。当然，可能会存在其中较高或较低剂量范围是有益的个别情况，并且这类情况也在本发明的范围内。
式(I)的化合物可以在任何上述组合物和给药方案中施用，或者借助于本领域已确立的那些组合物和给药方案施用，只要式(I)的化合物的使用是需要它的受试者所要求的。
作为STING蛋白激动剂，式(I)的化合物在用于治疗或预防受试者(包括动物、哺乳动物和人)中病毒感染、疾病、综合征、病症或障碍的方法中为有用的，其中该病毒感染、疾病、综合征、病症或障碍受STING蛋白的调制(包括激动)的影响。这种方法包括以下步骤、由以下步骤组成和/或基本上由以下步骤组成：将治疗有效量的式(I)的化合物、盐或溶剂化物施用至受试者，所述受试者包括需要此类治疗或预防的动物、哺乳动物和人。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗癌症、癌症疾病和病症或病毒感染的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式。
式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可具有潜在有益的抗肿瘤效果的癌症疾病和病症的示例包括但不限于肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头癌、颈癌、子宫癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、食道癌、小肠癌、肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、尿道癌、前列腺癌、阴茎癌、睾丸癌、输尿管癌、膀胱癌、肾癌或肝癌；直肠癌；肛门区域癌；输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、肾盂癌、肾细胞癌；软组织肉瘤；粘液瘤；横纹肌瘤；纤维瘤；脂肪瘤；畸胎瘤；胆管癌；肝母细胞瘤；血管肉瘤；血管瘤；肝细胞瘤；纤维肉瘤；软骨肉瘤；骨髓瘤；慢性或急性白血病；淋巴细胞性淋巴瘤；原发中枢神经系统淋巴瘤；中枢神经系统肿瘤；脊柱轴肿瘤；鳞状细胞癌；滑膜肉瘤；恶性胸膜间皮瘤；脑干胶质瘤；垂体腺瘤；支气管腺瘤；软骨粘膜上皮细胞瘤(inesothelioma)；间皮瘤(inesothelioma)；霍奇金氏病或上述癌症中的一种或多种的组合。适宜地，本发明涉及一种用于治疗或减轻癌症严重程度的方法，该癌症选自由以下项组成的组：脑(胶质细胞瘤)、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、小脑发育不良性节细胞瘤、威尔氏瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、头颈部、肾、肝、黑素瘤、卵巢、胰腺、腺癌、导管癌、腺鳞癌、腺泡细胞癌、胰高血糖素瘤、胰岛素瘤、前列腺、肉瘤、骨肉瘤、骨巨细胞瘤、甲状腺、淋巴细胞性T细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性中性粒细胞白血病、急性淋巴细胞性T细胞白血病、浆细胞瘤、免疫母细胞性大细胞白血病、套细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性巨核细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性巨核细胞白血病、箴粒细胞白血病、红白血病、恶性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、淋巴母细胞性T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、尿路上皮癌、外阴癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、间皮瘤、食道癌、唾液腺癌、肝细胞癌、胃癌、鼻咽癌、颊癌、口腔癌、GIST(胃肠道间质瘤)和睾丸癌。
在另一个实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式，其用于治疗受STING激动的影响的障碍，该障碍选自由以下项组成的组：黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤和乙型肝炎。
所公开的式(I)的化合物可用于与一种或多种可用于治疗HBV感染的附加化合物组合。这些附加化合物可包括其它所公开的化合物和/或已知治疗、预防、或减轻HBV感染的症状或效应的化合物。此类化合物包括但不限于HBV聚合酶抑制剂、干扰素、病毒侵入抑制剂、病毒成熟抑制剂、文献描述的衣壳组装调制器、逆转录酶抑制剂、免疫调节剂、TLR-激动剂、以及具有影响HBV生命周期或影响HBV感染后果的不同或未知机制的其它试剂。
在非限制性示例中，所公开的化合物可与选自以下的一种或多种药物(或它们的盐)结合使用：
HBV逆转录酶抑制剂，以及DNA和RNA聚合酶抑制剂，包括但不限于拉米夫定(3TC、Zeffix、Heptovir、Epivir和Epivir-HBV)、恩替卡韦(Baraclude、Entavir)、阿德福韦酯(Hepsara、Preveon、双-POM PMEA)、替诺福韦地索普西富马酸盐(Viread、TDF或PMPA)；
干扰素，包括但不限于干扰素α(IFN-α)、干扰素β(IFN-β)、干扰素λ(IFN-λ)、以及干扰素γ(IFN-γ)；
病毒侵入抑制剂；
病毒成熟抑制剂；
衣壳组装调节剂，诸如但不限于BAY41-4109；
逆转录酶抑制剂；
免疫调节剂，诸如TLR-激动剂；以及
不同或未知机制的试剂，诸如但不限于AT-61((E)-N-(1-氯-3-氧代基-1-苯基-3-(哌啶-1-基)丙-1-烯-2-基)苯甲酰胺)、AT-130((E)-N-(1-溴-1-(2-甲氧基苯基)-3-氧代基-3-(哌啶-1-基)丙-1-烯-2-基)-4-硝基苯甲酰胺)及其类似物。
在一个实施方案中，附加的治疗剂是干扰素。术语“干扰素”或“IFN”指抑制病毒复制和细胞增殖以及调节免疫应答的高度同源种特异性的蛋白质家族的任何成员。例如，人干扰素被分组成三类：I类，包括干扰素α(IFN-α)、干扰素β(IFN-β)、干扰素ω(IFN-ω)，II类，包括干扰素γ(IFN-γ)，以及III类，包括干扰素λ(IFN-λ)。如本文所用，术语“干扰素”涵盖已开发并可商购获得的重组形式的干扰素。如本文所用，术语“干扰素”还涵盖亚型干扰素，诸如化学改性或成熟的干扰素。化学改性的干扰素可包括聚乙二醇化干扰素和糖基化干扰素。干扰素的示例还包括但不限于干扰素-α-2a、干扰素-α-2b、干扰素-α-n1、干扰素-β-1a、干扰素-β-1b、干扰素-λ-1、干扰素-λ-2、以及干扰素-λ-3。聚乙二醇化干扰素的示例包括聚乙二醇化干扰素-α-2a和乙二醇化干扰素α-2b。
因此，在一个实施方案中，式(I)的化合物可与选自以下的干扰素联合施用：干扰素α(IFN-α)、干扰素β(IFN-β)、干扰素λ(IFN-λ)和干扰素γ(IFN-γ)。在一个具体的实施方案中，干扰素为干扰素-α-2a、干扰素-α-2b、或干扰素-α-n1。在另一个具体的实施方案中，干扰素-α-2a或干扰素-α-2b是聚乙二醇化的。在一个优选的实施方案中，干扰素-α-2a是聚乙二醇化干扰素-α-2a(PEGASYS)。在另一个实施方案中，附加治疗剂选自免疫调节剂或免疫刺激剂治疗剂，其包括属于干扰素类的生物制剂。
此外，附加治疗剂可为破坏其它原发性病毒蛋白(一种或多种)或HBV复制或持久生存所需的宿主蛋白的功能的试剂。
在另一个实施方案中，附加治疗剂为阻断病毒侵入或成熟或者靶定HBV聚合酶诸如核苷或核苷酸或非核苷类聚合酶抑制剂的抗病毒剂。在联合治疗的另一个实施方案中，逆转录酶抑制剂或DNA或RNA聚合酶抑制剂为齐多夫定、地达诺新、扎西他滨、ddA、司他夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、恩曲他滨、恩替卡韦、阿立他滨、Atevirapine、三氮唑核苷、阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、缬更昔洛韦、替诺福韦、阿德福韦、PMPA、西多福韦、依非韦伦、奈韦拉平、地拉夫定或依曲韦林。
在一个实施方案中，附加治疗剂为诱导天然限制性免疫应答的免疫调节剂，从而导致针对无关病毒诱导免疫应答。换句话讲，免疫调节剂可影响抗原递呈细胞的成熟，T-细胞的增殖和细胞因子释放(例如，IL-12、IL-18、IFN-α、IFN-β和IFN–γ以及TNF-α等等)。
在另一个实施方案中，附加治疗剂为TLR调节剂或TLR激动剂，诸如TLR-7激动剂或TLR-9激动剂。在联合治疗的另一个实施方案中，TLR-7激动剂选自SM360320(9-苄基-8-羟基-2-(2-甲氧基-乙氧基)腺嘌呤)和AZD8848([3-({[3-(6-氨基-2-丁氧基-8-氧代-7,8-二氢-9H-嘌呤-9-基)丙基][3-(4-吗啉基)丙基]氨基}甲基)苯基]乙酸甲酯)。
在本文提供的任何方法中，该方法还可包括向个体施用至少一种HBV疫苗、核苷HBV抑制剂、干扰素或它们的任何组合。在一个实施方案中，HBV疫苗选自RECOMBIVAXHB、ENGERIX-B、ELOVACB、GENEVAC-B、或SHANVACB中的至少一种。
在一个实施方案中，本文所述的方法还包括施用至少一种选自以下的附加治疗剂：核苷酸/核苷类似物、侵入抑制剂、融合抑制剂、以及这些或其它抗病毒机制的任何组合。
在另一方面，本文提供了一种在对其有需要的个体中治疗HBV感染的方法，该方法包括通过如下方式降低HBV病毒载量：向个体单独施用治疗有效量的所公开化合物或与逆转录酶抑制剂联合施用；并且还向个体施用治疗有效量的HBV疫苗；逆转录酶抑制剂可为以下中的至少一种：齐多夫定、地达诺新、扎西他滨、ddA、司他夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、恩曲他滨、恩替卡韦、阿立他滨、Atevirapine、三氮唑核苷、阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、缬更昔洛韦、替诺福韦、阿德福韦、PMPA、西多福韦、依非韦伦、奈韦拉平、地拉夫定或依曲韦林中。
在另一方面，本文提供了一种在对其有需要的个体中治疗HBV感染的方法，该方法包括通过如下方式降低HBV病毒载量：向个体单独施用治疗有效量的所公开化合物或与靶向HBV核酸的反义寡核苷酸或RNA干扰剂联合施用；并且还向个体施用治疗有效量的HBV疫苗；反义寡核苷酸或RNA干扰剂所具有的与靶HBV核酸的互补性足以抑制病毒基因组复制、病毒RNA转录、或病毒蛋白翻译。
在另一个实施方案中，所公开的化合物和至少一种附加的治疗剂是共配制的。在另一个实施方案中，所公开的化合物和至少一种附加的治疗剂是共施用的。对于本文所述的任何联合治疗，可例如使用诸如以下适宜的方法计算协同增强效应：Sigmoid-Emax公式(Holford & Scheiner,19981,Clin.Pharmacokinet.6：429-453)、Loewe相加模型公式(Loewe & Muischnek,1926,Arch.Exp.Pathol Pharmacol.114：313-326)和中值效应公式(Chou &Talalay,1984,Adv.Enzyme Regul.22:27-55)。可将以上提及的各个公式用于实验数据来生成对应的图，以助于评估药物的组合效应。与以上提及公式相关的对应曲线图分别是浓度-效应曲线、等效应曲线图以及结合指数曲线。
在施用本文提供的联合治疗的方法中任一种的一个实施方案中，还方法还可包括监测或检测受治疗者的HBV病毒载量，其中该方法进行一定的时间段，包括直至HBV病毒不可检出的时刻。
用于本说明书，特别是方案和实施例中的缩写如下：
ACN 乙腈
AcOH 冰醋酸
ADDP 偶氮二甲酰二哌啶
aq. 含水
Bn或Bzl 苄基
BINAP 2,2'-双(二苯基膦)-1,1'-联萘
Boc 叔丁氧羰基
conc. 浓缩的
dba 二亚苄基丙酮
DBU 1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯
DCC N,N'-二环己基-碳二亚胺
DCE 1,2-二氯乙烷
DCM 二氯甲烷
DEAD 偶氮二甲酸二乙酯
DIBAL 二异丁基氢化铝
DIPEA或DIEA 二异丙基-乙胺
DMA 二甲基苯胺
DMAP 4-二甲基氨基吡啶
DME 二甲氧基乙烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
DMT 4,4'-二甲氧三苯甲基
DPPA 二苯基磷酰基叠氮化物
dppf 1,1'-双(二苯基膦)二茂铁
EA 乙酸乙酯
EDCI 1-乙基-3-(3'-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
ESI 电喷射离子化
EtOAcorEA 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
GCMS 气相色谱-质谱联用
H或hr(s) 一个小时或几个小时
HEK 人胚肾
HPLC 高效液相色谱
LAH 氢化铝锂
LDA 二异丙基氨基锂
LHMDS 双(三甲基甲硅烷基)氨基锂
MEK 甲基乙基酮
MeOH 甲醇
MHz 兆赫
min 分钟
MS 质谱法
Ms 甲磺酰基
NBS N-溴代琥珀酰亚胺
NIS N-碘代琥珀酰亚胺
NMM N-甲基吗啉
NMP N-甲基吡咯烷酮
NMR 核磁共振
PCC 氯铬酸吡啶盐
PE 石油醚
RP 反相
rt或RT 室温
Rt 保留时间
Sec 一秒或几秒
SEM-Cl 2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基氯
TBAF 四丁基氟化铵
TBDMS 叔丁基二甲基甲硅烷基
TBP 磷酸三丁酯
TEA或Et3N 三乙胺
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TIPS 三异丙基甲硅烷基
TLC 薄层色谱法
TMS 四甲基硅烷
Ts 4-甲苯磺酰
具体实施例
实施例1中说明的反应方案描述了制备本发明的化合物1及其药学上可接受的盐形式的一种可能途径。
实施例1
步骤1：制备化合物1f
在0℃下，向化合物1e(《杂环化学杂志》(JournalofHeterocyclic Chemistry)，1993年，第30卷：第1213-1220页)(5g，14.7mmol)的吡啶(80.0mL)溶液中加入TMSCl(9.61g，88.4mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌0.5小时。在0℃下滴加苯甲酰氯(2.49g，17.7mmol)。5分钟后，将混合物升温至室温，并且在25℃下搅拌1.5小时。将混合物在0℃下用水(5mL)稀释，并且滴加NH3H2O(25％，7.5mL)。然后将反应混合物减压浓缩，得到残余物。通过硅胶快速柱层析法(DCM:MeOH＝50:1至5:1)纯化残余物，得到白色固体状的化合物1f(1.05g，1.08mmol)。
1H NMR(400MHz,DMSOd6)δ10.86(s,1H),8.59(d,J＝4.8Hz,1H),8.04(d,J＝7.6Hz,2H),7.76-7.37(m,2H),7.65-7.61(m,1H),7.56-7.53(m,2H),5.28(d,J＝6.8Hz,1H),5.12(d,J＝4.8Hz,1H),5.07-5.02(m,2H),4.30-4.25(m,1H),4.06-4.05(m,1H),3.94-3.93(m,1H),3.39(bar,2H)；13C NMR(400MHz,DMSOd6)δ165.7,144.0,136.4,133.7,132.9,132.1,128.5,128.0,126.9,125.8,117.6,86.0,74.8,73.2,71.2,61.6；ESI-MSm/z371(M+1)+。
步骤2：制备化合物1g
在0℃下，向化合物1f(550mg，1.485mmol)的DMF(10.0mL)溶液中加入二(三氟甲磺酸)二叔丁基硅烷二基酯(1.31g，2.97mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时。在0℃下一次性加入1H-咪唑(505.49mg，7.42mmol)。5分钟后，将混合物在25℃下搅拌30分钟。将混合物用DCM(30mL)稀释，并用水/盐水＝1/1(20mL×2)和盐水(20mL)洗涤。将有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并将滤液减压浓缩，得到残余物。通过硅胶快速柱层析法(石油醚/EtOAc＝10/1至1/1)纯化残余物，得到白色泡沫状的化合物1g(670mg，1.281mmol)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)9.49(s,1H),8.09-7.96(m,2H),7.90-7.84(m,1H),7.84-7.78(m,1H),7.67-7.47(m,4H),5.34-5.23(m,1H),4.57(d,J＝5.2Hz,1H),4.49(dd,J＝5.2,9.2Hz,1H),4.16-4.06(m,1H),4.03-3.92(m,2H),1.06(d,J＝0.8Hz,18H)；ESI-MSm/z511.2(M+1)+。
步骤3：制备化合物1h
在0℃下，向化合物1g(2.53g，4.95mmol)的DMF(50mL)溶液中加入咪唑(2.024g，29.72mmol)和叔丁基氯二甲基硅烷(2.24g，14.86mmol)。将混合物在60℃下搅拌12小时。将混合物用EtOAc(100mL)稀释，并用NaHCO3(50mL)、水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机层用Na2SO4干燥，过滤并将滤液减压浓缩，得到残余物。通过硅胶快速柱层析法(石油醚/EtOAc＝10/1至3/1)纯化残余物，得到白色固体状的化合物3(2.86g，4.577mmol)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)9.47(s,1H),8.02(d,J＝7.5Hz,2H),7.93-7.75(m,2H),7.68-7.45(m,4H),5.17(s,1H),4.66(d,J＝5.0Hz,1H),4.45(dd,J＝5.3,9.3Hz,1H),4.21-4.15(m,1H),3.92(dd,J＝5.3,9.8Hz,1H),3.85(t,J＝9.8Hz,1H),1.05(d,J＝2.5Hz,18H),0.92(s,9H),0.15(d,J＝7.5Hz,6H)；ESI-MSm/z625.7(M+1)+。
步骤4：制备化合物1i
在0℃下，用吡啶(12mL)小心地稀释氢氟化吡啶(1.65mL，18.306mmol)，然后将其滴加到化合物1h(2.86g，4.57mmol)的THF(45mL)溶液中。将混合物升温至室温并搅拌5分钟。通过加入吡啶(12mL)淬灭反应混合物，并用CH2Cl2(50mL)稀释，用盐水(50mL×2)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压浓缩，得到残余物。通过硅胶快速柱层析法(石油醚/EtOAc＝10/1至0/1)纯化残余物，得到白色固体状的化合物1i(2.04g，4.21mmol)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)9.52(s,1H),8.29(d,J＝4.5Hz,1H),8.04(d,J＝7.0Hz,2H),7.77(d,J＝4.5Hz,1H),7.64-7.58(m,2H),7.57-7.49(m,2H),5.09(d,J＝8.0Hz,1H),4.51(dd,J＝5.5,8.0Hz,1H),4.30-4.16(m,2H),4.04-3.85(m,2H),3.49(s,1H),2.82(d,J＝2.5Hz,1H),2.19(br,s,1H),0.83(s,9H),-0.12(s,3H),-0.27(s,3H)。ESI-MSm/z485.1(M+1)+。
步骤5：制备化合物1j
在25℃下，向化合物1i(1.84g，3.797mmol)的吡啶(20mL)溶液中加入DMTrCl(1.93g，5.695mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌12小时。通过加入MeOH(2.0mL)淬灭反应混合物，用EA(100mL)稀释并用盐水(50mL×3)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压浓缩，得到残余物。通过硅胶快速柱层析法(石油醚/EtOAc＝10/1至1/1)纯化残余物，得到白色泡沫状的化合物1j(1.35g，1.715mmol)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)9.47(s,1H),8.35(d,J＝4.4Hz,1H),8.03(d,J＝7.0Hz,2H),7.65-7.57(m,2H),7.56-7.49(m,2H),7.41(d,J＝7.0Hz,2H),7.34-7.20(m,9H),7.04(d,J＝5.0Hz,1H),6.85-6.78(m,4H),5.09(d,J＝8.5Hz,1H),4.76(dd,J＝5.5,8.5Hz,1H),4.44(d,J＝5.0Hz,1H),4.27(d,J＝1.5Hz,1H),3.78(d,J＝2.0Hz,6H),3.50(d,J＝2.0Hz,2H),2.88(d,J＝1.5Hz,1H),0.84(s,9H),-0.14(s,3H),-0.31(s,3H)；ESI-MSm/z787.3(M+1)+。
步骤6：制备化合物1l
在0℃下，向化合物1j(600mg，0.762mmol)的THF(6.0mL)溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(591.2mg，4.57mmol)和2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(541.333mg，2.28mmol)。然后将反应混合物在25℃下搅拌2小时。
在0℃下，向化合物1j(930mg，1.18mmol)的THF(10.0mL)溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(916.37mg，7.09mmol)和2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(839.06mg，3.54mmol)。然后将反应混合物在25℃下搅拌2小时。将反应混合物与第一反应合并，通过加入MeOH(5mL)淬灭合并的混合物，并用EA(50mL)稀释。将有机层用NaHCO3(20mL)和盐水(20mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压下浓缩，得到残余物。通过硅胶快速柱层析法(石油醚/EtOAc＝10/1至3/1)纯化残余物，得到黄色油状的化合物1l(1.76g，1.78mmol)。
31P NMR(162MHz,CDCl3)151.467(s,1P),148.337(s,1P)；ESI-MSm/z904.4(M-(N(iPr)2+OH))+。
步骤7：制备化合物1m
向化合物1l(1.76g，1.783mmol)的CH3CN(10.0mL)和水(64.236μL，3.56mmol)溶液中加入三氟乙酸吡啶鎓(413.16mg，2.14mmol)。5分钟后，加入叔丁胺(10.0mL)并将反应混合物在室温下搅拌15分钟。将混合物减压浓缩，得到白色泡沫。将残余物溶解在CH3CN(10.0mL)中并浓缩，得到泡沫，再重复该过程一次，得到白色泡沫状的化合物1m(1.82g，粗品)，将其用于下一步骤而无需进一步纯化。
步骤8：制备化合物1n
向化合物1m(1.82g，粗品)的CH2Cl2(24mL)溶液中加入水(385.3mg，21.387mmol)，然后加入6％二氯乙酸的CH2Cl2(24mL)溶液。将反应混合物在25℃下搅拌30分钟。加入吡啶(10mL)以淬灭反应，并将反应混合物在25℃下搅拌30分钟。此时，将反应混合物减压浓缩，得到残余物，将其通过硅胶快速柱层析法(CH2Cl2/MeOH＝100/1至5/1)纯化，得到白色泡沫状的化合物1n(910mg，1.66mmol)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)8.85(d,J＝4.6Hz,1H),8.11(d,J＝7.3Hz,2H),7.83(s,1H),7.73-7.61(m,2H),7.61-7.51(m,2H),6.19(s,1H),6.00(s,1H),5.26(d,J＝9.0Hz,1H),4.74(dd,J＝5.0,10.5Hz,1H),4.61(dd,J＝5.2,8.7Hz,1H),4.33(s,1H),3.96-3.88(m,1H),3.84-3.75(m,1H),0.76(s,9H),-0.09(s,3H),-0.39(s,3H)；ESI-MSm/z549.1(M+1)+。
步骤9：制备化合物1p
在室温下，将化合物1n(910mg，1.659mmol)和分子筛的无水乙腈(30mL)溶液在氮气下搅拌3分钟。加入1H-咪唑高氯酸盐(5.14g，30.52mmol)。10分钟后，在25℃下加入(2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺1o(1.77g，1.825mmol)的MeCN(15mL)溶液。将混合物在25℃下搅拌50分钟。将反应混合物(在MeCN中为0.03687M，45mL)用于下一步骤而无需进一步纯化。
步骤10：制备化合物1q
在25℃下，向化合物1p(在MeCN中为0.03687M，45mL)的溶液中加入叔丁基过氧化氢(1.510mL，8.303mmol)。将反应物混合物在25℃下搅拌1小时。将反应混合物过滤，并将滤液减压浓缩，得到残余物。通过反相制备型HPLC(中性，柱：Waters Xbridge 150×25 5μM；流动相:水(10mM NH4HCO3)-ACN，B％：33％-53％，25mL/分钟，梯度时间：8分钟)纯化残余物，得到白色固体状的化合物1q(602mg，0.532mmol)。
31P NMR(162MHz,CD3OD)4.05(s,1P),3.92(s,1P),-2.20(s,1P),-2.98(s,1P)；ESI-MSm/z1131.1(M+1)+。
步骤11：制备化合物1r
在25℃下，向化合物1q(600mg，0.53mmol)和分子筛的吡啶(150mL)溶液中加入DMOCP(293.669mg，1.591mmol)。将混合物在25℃下搅拌1小时。将反应混合物(在Py中为0.00353M，150mL)用于下一步骤而无需进一步纯化。
步骤12：制备化合物1s
在25℃下向化合物1r(在Py中为0.00353M，150mL)的溶液中加入水(95.48mg，5.30mmol)和I2(672.594mg，2.65mmol，5.0当量)。将混合物在25℃下搅拌1小时。将反应用Na2SO3水溶液(50mL)淬灭。将混合物减压浓缩，得到残余物。通过反相制备型HPLC(柱：AgelaDurashell C18150×255μM；流动相：水(10mM NH4HCO3)-CH3CN从35％至55％，流速：25mL/分钟)纯化残余物，得到白色固体状的化合物1s(285mg，0.25mmol)。
ESI-MSm/z1130.1(M+1)+。
步骤13：制备化合物1t
将化合物1s(120mg，0.106mmol)的MeNH2溶液(在EtOH中为33％，10mL)在25℃下搅拌16小时。将反应混合物减压浓缩，得到黄色固体状的粗化合物1t(125mg)，将其用于下一步骤而无需进一步纯化。
步骤14：制备化合物1，三乙胺盐
在25℃下，向化合物1t(125mg，粗品)的Py(5mL)溶液中加入Et3N(1.402g，13.86mmol)和三乙胺三氢氟酸盐(1.117g，6.929mmol，50.0当量)。将反应混合物在50℃下搅拌12小时。将混合物溶于THF(3mL)中，并在25℃下加入异丙氧基三甲基硅烷(3.66g，27.71mmol)并搅拌12小时。将混合物减压浓缩，得到棕色固体状的残余物(108mg，粗品)，收集为批料1。
在25℃下，向化合物1t(183mg，粗品)的Py(6mL)溶液中加入三乙胺(2.05g，20.29mmol)和三乙胺三氢氟酸盐(1.63g，10.145mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌12小时。将混合物溶于THF(5mL)中，并在25℃下加入异丙氧基三甲基硅烷(5.36g，40.58mmol)并搅拌12小时。将混合物减压浓缩，得到残余物，收集为批料2。将批料2与批料1合并，并通过反相制备型HPLC(柱：Agela Durashell C18 150×255μM；流动相：水(0.05％氢氧化铵v/v)-ACN为0％至15％，流速：35ml/分钟)纯化，得到白色固体状的化合物1，三乙胺盐(125mg，0.186mmol)。1H NMR(400MHz,D2O)7.77(s,1H),7.63(s,1H),7.50-7.16(m,2H),5.86(d,J＝7.5Hz,1H),5.74(s,1H),5.13(s,1H),4.90(s,1H),4.54-4.42(m,2H),4.32(br s,1H),4.21(br,d,J＝8.5Hz,4H),3.87(d,J＝11.5Hz,1H)；ESI-MSm/z674.0(M+1)+。
步骤15：制备化合物1，钠盐
将化合物1，三乙胺盐在高真空下干燥，得到白色固体(125mg)。将Dowex50W×8，200-400(H形式，10mL)加入烧杯中(对于125mg的化合物1，三乙胺盐)并用去离子水(2×)洗涤。然后在去离子H2O(50mL)中向树脂中加入15％H2SO4，并且将混合物搅拌15分钟并滗析(1x)。将树脂转移到在去离子H2O中具有15％H2SO4的柱中，并且用15％H2SO4(至少4CV)洗涤，并且然后用去离子H2O洗涤直至中性。将树脂转移回烧杯中，并且加入15％NaOH在去离子H2O溶液(50mL)中，并且将混合物搅拌15分钟，并且滗析(1x)。将树脂转移到柱中并用15％NaOH在去离子H2O(至少4CV)中洗涤，并且然后用去离子H2O洗涤，直至其为中性(至少4CV)。将化合物1，三乙胺盐溶于去离子H2O(125mg，10mL)中，加入柱顶部，并用去离子H2O洗脱。如通过TLC(UV)所检测的，将转化的钠盐在早期馏分中洗脱出来。将产物冻干，得到白色固体状的化合物1，钠盐(85mg，0.117mmol)。1H NMR(400MHz,CD3OD)8.01(s,1H),7.74(d,J＝5.0Hz,2H),7.26(s,1H),6.02(br d,J＝8.5Hz,1H),5.28(s,1H),5.10(s,1H),4.62(t,J＝4.3Hz,1H),4.56(d,J＝3.5Hz,1H),4.45-3.99(m,6H),3.86(d,J＝11.5Hz,1H)；31P NMR(162MHz,CD3OD)0.63(s,1P),-2.91(s,1P)；ESI-MSm/z673.9(M+1)+。
实施例2
步骤1：制备化合物2j
在0℃下，在N2下向2i(WO2013179289)(2g，5.39mmol)的DMF(20mL)溶液中滴加二(三氟甲磺酸)二叔丁基硅烷二基酯(2.61g，5.92mmol)。1小时后，在0℃下一次性加入咪唑(458.32mg，6.73mmol)。5分钟后，将混合物在室温下搅拌25分钟。将混合物用CH2Cl2(100mL)稀释并用水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。将残余物从CH3CN和CH2Cl2中重结晶，得到白色固体状的化合物2j(2.1g，4.10mmol，粗品)。
步骤2：制备化合物2k
将2j(2.1g，4.10mmol)、咪唑(2.24g，32.84mmol)和TBSCl(2.78g，18.47mmol)的DMF(20mL)溶液在60℃下搅拌3小时。将混合物用水淬灭并用EtOAc萃取。将有机层用水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压浓缩。通过硅胶快速柱层析法(CH2Cl2:MeOH＝20:1)纯化残余物，得到白色固体状的化合物2k(2.22g，3.54mmol)。
步骤3：制备化合物2l
将2k(2.52g，4.03mmol)的CH2Cl2(30mL)溶液在0℃下搅拌。向混合物中加入氟化吡啶鎓(1.64mL，18.15mmol)，并且将反应物在室温下搅拌8小时。将混合物用水淬灭并用CH2Cl2萃取。将有机层用水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压浓缩。通过硅胶快速柱层析法(CH2Cl2:MeOH＝10:1)纯化残余物，得到白色固体状的化合物2l(1.60g，3.3mmol)。
步骤4：制备化合物2m
在室温下搅拌2l(2.34g，4.81mmol)的吡啶(23mL)溶液，向其中加入4,4'-(氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(3.26g，9.62mmol)，并且将反应在室温下搅拌2小时。将混合物用水淬灭并用CH2Cl2萃取。将有机层用水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压浓缩。通过硅胶快速柱层析法(CH2Cl2:MeOH＝10:1)纯化残余物，得到黄色固体状的2m(3.59g，4.56mmol)。
步骤5：制备化合物2n
在15℃下，向2m(500mg，0.64mmol)和DIPEA(246.0mg，1.90mmol)的THF(1.56mL)溶液中加入3-((氯(二异丙基氨基)膦基)氧基)丙腈(450.5mg，1.90mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时。加入水以淬灭混合物，并且将混合物用CH2Cl2萃取。将合并的有机层用盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液在减压下浓缩。通过硅胶快速柱层析法(石油醚:EtOAc＝1:2)纯化残余物，得到黄色油状的化合物2n(498mg，0.55mmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3)10.28(s,1H),8.54(s,1H),8.42-8.33(m,2H),7.93-7.77(m,6H),7.66(t,J＝8.4Hz,4H),7.59(s,1H),7.55(s,1H),7.52-7.43(m,1H),7.11(d,J＝8.4Hz,4H),5.55-5.40(m,1H),5.41-5.35(m,1H),5.09(s,1H),4.62(s,1H),4.59-4.36(m,2H),4.05(s,6H),3.87-3.81(m,1H),3.57-3.53(m,1H),3.01-2.90(m,2H),1.03(s,9H),0.31(s,3H),0.00(s,3H)；ESI-MSm/z927.8(M+Na)+。
步骤6：制备化合物2o
在室温下，向2n(813mg，0.898mmol)的水和乙腈溶液中加入三氟乙酸吡啶鎓(208.18mg，1.078mmol)。加入叔丁胺(3.44mL)。将所得混合物在室温下搅拌20分钟。将混合物浓缩，得到黄色固体状的粗产物2o(836.39mg，0.898mmol，粗品)，将其与CH2Cl2(3×)共蒸发，直接用于下一步骤。
步骤7：制备化合物2p
在室温下，在0.5小时内向2o(836.39mg，0.898mmol)的水和CH2Cl2溶液中加入二氯乙酸(407.149mg，3.158mmol)。加入吡啶(0.145mL，1.80mmol)。10分钟后，将混合物浓缩，并通过快速层析法(硅胶，CH2Cl2:MeOH＝1:0至5:1)纯化得到的残余物，得到白色固体状的化合物2p(467.2mg，0.744mmol)。
步骤8：制备化合物2r
在室温下，将2p(467.2mg，0.744mmol)和4A分子筛(0.5g)的CH3CN(27mL)溶液在氩气氛下搅拌3分钟。加入咪唑高氯酸盐(2.51g，14.89mmol)。10分钟后，加入(2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺1o(866.53mg，0.89mmol)的CH3CN溶液。将混合物在26℃下搅拌1小时。加入叔丁基过氧化氢(0.74mL，3.72mmol)。将最终混合物在26℃下搅拌1小时。将混合物浓缩，并且通过反相制备型HPLC纯化残余物，得到2份白色固体状的所需产物2r(62.7mg，0.054mmol和99.4mg，0.076mmol)。ESI-MSm/z1132.7(M+H)+。
步骤9：制备化合物2t
在室温下，在氩气氛下向2r(99.4mg，0.088mmol)和4A分子筛的吡啶(43mL)溶液中加入DMOCP(48.61mg，0.263mmol)。将混合物在26℃下搅拌1小时。加入水(15.81mg，0.87mmol)和I2(111.41mg，0.44mmol)。将反应混合物在26℃下搅拌1小时。将反应用Na2SO3溶液(饱和)淬灭。将混合物过滤，并将滤液减压浓缩，得到粗产物，将其通过反相制备型HPLC纯化，得到白色固体状的化合物2t(50mg，0.044mmol)。ESI-MSm/z1130.4(M+H)+。
步骤10：制备化合物2u和化合物2v
将化合物2t(50mg，0.044mmol)用MeNH2的EtOH(33％，20mL)溶液处理，并在室温下搅拌1小时。将反应混合物减压浓缩，得到化合物2u和2v(40mg，0.044mmol)，将它们用于下一步骤而无需纯化。ESI-MS m/z化合物2u903.3；化合物2v917.2(M+H)+。
步骤11：制备化合物2
向化合物2u和2v(40mg，0.044mmol)的吡啶(1.95mL)溶液中加入三乙胺(537.20mg，5.31mmol)和三乙基氟化铵(427.92mg，2.65mmol)。将混合物在50℃下搅拌10小时。加入异丙氧基三甲基硅烷(1.76g，13.27mmol)，并且将反应在室温下搅拌2小时。将混合物浓缩，通过反相制备型HPLC纯化残余物，得到各自为白色固体状的化合物2铵盐(11.7mg，0.017mmol)。Compound 2:1H NMR(400MHz,D2O)8.12-7.95(m,3H),5.92(d,J＝8.4Hz,1H),5.47(d,J＝3.6Hz,1H),5.27(d,J＝5.2Hz,1H),4.98-4.81(m,1H),4.59-4.44(m,2H),4.37(s,1H),4.31-4.15(m,3H),4.14-4.07(m,1H),4.02(br d,J＝10.4Hz,1H),3.12(d,J＝4.4Hz,3H)。
步骤12：制备化合物2钠盐
将10mL体积的Dowex50W×8，200-400(H形式)加入烧杯中(对于11.7mg的化合物2铵盐)并用DIH2O(2×)洗涤。然后向树脂中加入15％H2SO4的DIH2O(50mL)溶液，将混合物搅拌15分钟，并滗出(1×)。将树脂转移到在DIH2O中具有15％H2SO4的柱中，并且用15％H2SO4(至少4CV)洗涤，并且然后用DIH2O洗涤直至中性。将树脂转移回烧杯中，并且加入15％NaOH在DIH2O溶液(50mL)中，并且将混合物搅拌15分钟，并且滗析(1x)。将树脂转移到柱中并用15％NaOH在DIH2O(至少4CV)中洗涤，并且然后用H2O洗涤，直至其为中性(至少4CV)。将A溶于DI水(11.7mg，5mL)中，加入柱顶部，并且用DIH2O水洗脱。如通过TLC(UV)检测的，化合物7在早期馏分中洗脱出来。将产物冻干，得到白色固体状的化合物2钠盐(8.8mg，0.012mmol)。1HNMR(400MHz,D2O)8.06(s,1H),7.98(s,1H),7.85(s,1H),5.90(d,J＝8.4Hz,1H),5.47(d,J＝4.0Hz,1H),5.27(s,1H),4.96(s,1H),4.58-4.50(m,1H),4.36(s,1H),4.29-4.22(m,2H),4.29-4.22(m,1H),4.17(s,1H),4.14-4.08(m,1H),4.03(d,J＝12.0Hz,1H),3.10(s,3H)；31PNMR(162MHz,D2O)-1.13,-1.75；ESI-MS m/z688.8(M+H)+。
实施例3中说明的反应方案描述了制备本发明的化合物3及其药学上可接受的盐形式的一种可能途径。
实施例3
实施例4中说明的反应方案描述了制备本发明的化合物4及其药学上可接受的盐形式的一种可能途径。
实施例4
实施例5
以及
步骤1：制备化合物5b
在0℃下，向化合物5a(10.0g，33.64mmol)的吡啶(250ml)溶液中滴加TMSCl(18.27g，168.20mmol)。在15℃下搅拌1小时后，在15℃下滴加异丁酰氯(4.30g，40.37mmol)。在15℃下搅拌2小时后，将混合物在0℃下用H2O(50mL)淬灭，并在0℃下加入NH3·H2O(50mL)。10分钟后，将混合物在15℃下搅拌0.5小时。重复上述过程(20g规模的化合物5a)并将两种反应混合物合并。然后将混合物减压浓缩，并且通过快速柱层析法(DCM/MeOH＝100/1至10/1)纯化残余物，得到白色固体状的化合物5b(25.5g)。
步骤2：制备化合物5c
在0℃下，向化合物5b(24.5g，66.69mmol)的吡啶(500ml)溶液中加入二甲氧基三苯甲基氯(24.85g，73.36mmol)。在25℃下搅拌2小时后，将溶液减压浓缩，得到残余物。将残余物用乙酸乙酯(500mL)稀释并用水(300mL×3)洗涤。将有机层减压浓缩，得到残余物。将残余物与另一批料(由2g规模的化合物5b生成)合并，并通过快速柱层析法(DCM/MeOH＝100/1至10/1)纯化，得到黄色固体状的化合物5c(30.0g)。LCMS:m/z670.2[M+H]+。
步骤3：制备化合物1o
在0℃下，向化合物5c(1g，1.49mmol)的THF(20mL)溶液中加入N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(1.16g，8.96mmol)和3-((氯(二异丙基氨基)-膦基)氧基)丙腈(1.11g，4.48mmol，3当量)。在25℃下搅拌2小时，通过加入水(30mL)淬灭反应混合物并用乙酸乙酯(30mL)稀释。将水层用乙酸乙酯(20mL×2)萃取。将合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并在压力下浓缩，得到残余物。通过快速柱层析法(DCM/EA＝10/1至2/1)纯化残余物，得到白色固体状的化合物1o(0.99g)。LCMS:ESI-MS:m/z787.4[M+H]+。
步骤4：制备化合物5d
向化合物1o(0.99g，1.14mmol)的乙腈(7mL)溶液中加入水(0.041g，2.28mmol)和三氟乙酸吡啶鎓(0.263g，1.37mmol)。加入叔丁胺(7mL)并将反应混合物在25℃下搅拌15分钟。然后将混合物减压浓缩，得到泡沫。将泡沫溶于CH3CN(10.0mL)中，减压浓缩，得到白色泡沫状的化合物5d(0.925g)，将其用于下一步骤而无需任何进一步纯化。
步骤5：制备化合物5e
向化合物5d(0.925g，1.14mmol)的二氯甲烷(20mL)和水(0.205g，11.38mmol)溶液中加入2,2-二氯乙酸(20mL，在DCM中为6％)。在25℃下搅拌20分钟后，将混合物用吡啶(3mL)淬灭并减压浓缩，得到残余物。通过快速柱层析法(DCM/MeOH＝10/1至5/1)纯化残余物，得到白色泡沫状的化合物5e(0.43g，0.84mmol)。LCMS:ESI-MS:m/z432.2[M+H]+。
步骤6：制备化合物5g
在25℃下，向化合物5f(4g，10.83mmol)的吡啶(40mL)溶液中加入4,4'-(氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(4.4g，12.99mmol)。在25℃下搅拌2小时后，将反应混合物用甲醇(5mL)淬灭，然后减压浓缩，得到残余物。通过快速柱层析法(DCM/MeOH＝50/1至20/1)纯化残余物，得到黄色泡沫状的化合物5g(6.3g)。LCMS:ESI-MS:m/z672.3[M+H]+。
步骤7：制备化合物5h
在25℃下，向化合物5g(0.5g，0.74mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(8mL)溶液中加入叔丁基氯二甲基硅烷(0.17g，1.12mmol)和1H-咪唑(0.15g，2.23mmol)。在25℃下搅拌12小时后，将反应混合物用甲醇(2mL)淬灭并用乙酸乙酯(40mL)稀释；将有机层依次用H2O(20mL×2)、盐水(20mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并减压下浓缩，得到残余物。通过快速柱层析法(DCM/MeOH＝50/1至10/1)纯化残余物，得到黄色油状的化合物5h(0.14g)。LCMS:ESI-MS:m/z786.8[M+H]+。
步骤8：制备化合物5i
在0℃下，向化合物5h(0.5g，0.64mmol)的THF(9mL)溶液中加入N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(0.49g，3.82mmol)和3-((氯(二异丙基氨基)-膦基)氧基)丙腈(0.45g，1.91mmol)。在25℃下搅拌12小时后，将反应混合物用MeOH(3mL)淬灭，用乙酸乙酯(30mL)和水(30mL)稀释。将水层用乙酸乙酯(20mL×2)萃取。将合并的有机层依次用无水Na2SO4干燥，过滤并在压力下浓缩，得到残余物。通过快速柱层析法(DCM/EA＝10/1至1/1)纯化残余物，得到白色固体状的化合物5i(0.48g，0.49mmol)。LCMS:ESI-MS:m/z903.5[MH-iPr2]+。
步骤9：制备化合物5j
向化合物5e(0.25g，0.49mmol)的乙腈(10mL)溶液中加入4A分子筛；将所得混合物在25℃下搅拌10分钟。加入1H-咪唑高氯酸盐(0.42g，2.45mmol)并将混合物在25℃下再搅拌10分钟。加入化合物5i(0.48g，0.49mmol)，并将混合物在25℃搅拌1小时。然后加入N,N-二甲基-N'-(5-亚磺酰基-1,2,4-二噻唑-3-基)-甲亚胺酰胺(DDTT)(0.5g，2.45mmol)，并将混合物在25℃下再搅拌1小时。将反应混合物过滤，并将滤液减压浓缩，得到残余物。通过快速柱层析法(DCM/甲醇＝10/1至3/1)纯化残余物，得到白色固体状的化合物5j(0.42g)。
步骤10：制备化合物5k
向化合物5j(0.42g，0.31mmol)的二氯甲烷(20mL)和水(0.056g，3.115mmol，10当量)溶液中加入2,2-二氯乙酸(在DCM中为6％，20mL)。在25℃下搅拌20分钟后，然后将混合物用吡啶(3mL)淬灭，然后减压浓缩，得到残余物。通过快速柱层析法(DCM/MeOH＝10/1至2/1)纯化残余物，得到白色固体状的化合物5k(0.29g)。LCMS:ESI-MS:m/z＝1046.5[M+1]+；
步骤11：制备化合物5l和5m
向化合物5k(0.34g，0.32mmol)的吡啶(80mL)溶液中加入2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧杂环己烷2-氧化物(0.18g，0.97mmol)；将所得混合物在25℃下搅拌1小时。然后加入3H-苯并[c][1,2]二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(0.325g，1.62mmol)，并将混合物在25℃下搅拌1小时。将反应混合物减压浓缩；通过制备型HPLC(柱：Agela DuraShell 150mm×25mm×5μm；水(10mM NH4HCO3)-v/v)(A)-CH3CN(B)为37％至67％；流速：25mL/分钟)纯化残余物，得到两种级分，包括白色固体状的类似物5m(46mg)和5l(59mg)的混合物。然后分别进行每种级分。LCMS:ESI-MS:m/z1060.3[M+H]+(化合物5m)；LCMS:ESI-MS:m/z1060.4[M+H]+(化合物5l)。
步骤12：制备化合物5o
将化合物5m(80mg，0.075mmol)用甲胺(8mL，在EtOH中为35％)处理；在25℃下搅拌12小时后，将反应混合物减压浓缩，得到化合物5o(62.8mg)，将其用于下一步骤而无需任何进一步纯化。
步骤13：制备化合物5和6
向化合物5o(62.8mg，0.075mmol)的吡啶(8mL)溶液中加入三乙胺(0.46g，4.53mmol)和三乙胺三氢氟酸盐(0.37g，2.26mmol)；将所得混合物在50℃下搅拌10小时。在15℃下加入异丙氧基三甲基硅烷(0.99g，7.55mmol)并将混合物再搅拌2小时。将混合物减压浓缩，并且通过制备型HPLC(柱：Agela DuraShell 150mm×25mm×5μm；水(0.05％的氢氧化铵v/v)(A)-CH3CN(B)；B为1％至16％；流量：25mL/分钟)纯化残余物，得到白色固体状的化合物5铵盐(27mg)和化合物6铵盐(11mg)。LCMS:ESI-MS:m/z718.8[M+H]+(化合物5)；LCMS:ESI-MS:m/z718.8[M+H]+(化合物6)。
步骤14：制备5钠盐
将20mL体积的Dowex 50W×8，200-400(H形式)加入烧杯中(对于58mg的化合物5)并用DI H2O(2×)洗涤。然后向树脂中加入15％H2SO4的DIH2O(50mL)溶液，将混合物搅拌15分钟，并滗出(1×)。将树脂转移到具有15％H2SO4的DI H2O溶液的柱中，并且用15％H2SO4(至少4柱体积)洗涤，并且然后用DI H2O洗涤，直至其为中性。将树脂转移回烧杯中，并且加入15％NaOH的H2O溶液(50mL)；将混合物搅拌15分钟，并滗出(1×)。将树脂转移到柱中并用15％NaOH的H2O溶液(至少4柱体积)洗涤，然后用H2O洗涤，直至其为中性(至少4柱体积)。将化合物5铵盐溶于DI水(58mg，5mL)中，加入柱顶部，并用DI水洗脱。如通过TLC(UV)检测的，5在早期馏分中洗脱出来。将产物冻干，得到白色固体状的化合物5钠盐(55.1mg)。1H NMR(400MHz,D2O)δ＝8.39(s,1H),8.35(s,1H),8.19(s,1H),5.98(d,J＝8.5Hz,1H),5.50(ddd,J＝4.3,8.7,12.9Hz,1H),5.09-5.02(m,1H),4.91(q,J＝7.4Hz,1H),4.74(dd,J＝4.8,6.3Hz,1H),4.58(br s,1H),4.32(d,J＝4.3Hz,1H),4.30-4.17(m,3H),4.05-3.97(m,1H),3.63(s,3H),2.82-2.68(m,2H),1.93-1.82(m,1H)；31P NMR(162MHz,D2O)δ＝57.599,54.556；LCMS:ESI-MS:m/z718.8[M+H]+。
步骤15：制备6钠盐
将8mL体积的Dowex 50W×8，200-400(H形式)加入烧杯中(对于22mg的化合物6)并用DIH2O(2×)洗涤。然后向树脂中加入15％H2SO4的DIH2O(50mL)溶液，将混合物搅拌15分钟，并滗出(1×)。将树脂转移到具有15％H2SO4的DI H2O溶液的柱中，并且用15％H2SO4(至少4柱体积)洗涤，并且然后用DI H2O洗涤，直至其为中性。将树脂转移回烧杯中，并且加入15％NaOH的H2O溶液(50mL)；将混合物搅拌15分钟，并滗出(1×)。将树脂转移到柱中并用15％NaOH的H2O溶液(至少4柱体积)洗涤，然后用H2O洗涤，直至其为中性(至少4柱体积)。将化合物6铵盐溶于DI水(39mg，5mL)中，加入柱顶部，并用DI水洗脱。如通过TLC(UV)检测的，6在早期馏分中洗脱出来。将产物冻干，得到白色固体状的化合物6钠盐(10.1mg)。1H NMR(400MHz,D2O)δ＝8.47(s,1H),8.26(s,1H),7.98(s,1H),5.95(d,J＝8.5Hz,1H),5.77(ddd,J＝4.3,8.4,12.7Hz,1H),5.13-5.05(m,1H),4.97-4.90(m,1H),4.58(br s,1H),4.53(t,J＝3.9Hz,1H),4.47-4.38(m,1H),4.29(d,J＝4.5Hz,1H),4.24(td,J＝5.4,10.6Hz,1H),4.12(br d,J＝12.3Hz,1H),4.05(br d,J＝10.3Hz,1H),3.62(s,3H),2.91-2.69(m,2H),2.17-2.01(m,1H)；31P NMR(162MHz,D2O)δ＝55.896,54.936；LCMS:ESI-MS:m/z718.8[M+H]+。
实施例5a
步骤1：制备化合物5p
将化合物5l(60mg，0.057mmol)用甲胺(6mL，在EtOH中为35％)处理；在25℃下搅拌12小时后，将反应混合物减压浓缩，得到化合物5p(47.14mg)，将其用于下一步骤而无需任何进一步纯化。
步骤2：制备化合物7和8
向化合物5p(47.14mg，0.06mmol)的吡啶(5mL)溶液中加入三乙胺(0.34g，3.4mmol)和三乙胺三氢氟酸盐(0.27g，1.7mmol)；将所得混合物在50℃下搅拌10小时。在15℃下加入异丙氧基三甲基硅烷(0.75g，5.66mmol)并将混合物再搅拌2小时。将混合物减压浓缩，并且通过制备型HPLC(柱：Agela DuraShell 150mm×25mm×5μm；水(0.05％的氢氧化铵v/v)(A)-CH3CN(B)；B为1％至16％；流量：25mL/分钟)纯化残余物，得到白色固体状的化合物7铵盐(8mg)和化合物8铵盐(19mg)。
LCMS:ESI-MS:m/z718.8[M+H]+(化合物8)；LCMS:ESI-MS:m/z718.8[M+H]+(化合物7)。
步骤3：制备7钠盐
将8mL体积的Dowex 50W×8，200-400(H形式)加入烧杯中(对于20mg的化合物7)并用DI H2O(2×)洗涤。然后向树脂中加入15％H2SO4的DIH2O(50mL)溶液，将混合物搅拌15分钟，并滗出(1×)。将树脂转移到具有15％H2SO4的DI H2O溶液的柱中，并且用15％H2SO4(至少4柱体积)洗涤，并且然后用DI H2O洗涤，直至其为中性。将树脂转移回烧杯中，并且加入15％NaOH的H2O溶液(50mL)；将混合物搅拌15分钟，并滗出(1×)。将树脂转移到柱中并用15％NaOH的H2O溶液(至少4柱体积)洗涤，然后用H2O洗涤，直至其为中性(至少4柱体积)。将化合物7铵盐溶于DI水(39mg，5mL)中，加入柱顶部，并用DI水洗脱。如通过TLC(UV)检测的，7在早期馏分中洗脱出来。将产物冻干，得到白色固体状的化合物7钠盐(15.5mg)。1H NMR(400MHz,D2O)δ＝8.32(s,1H),8.25(s,2H),6.00(d,J＝8.5Hz,1H),5.57-5.42(m,1H),4.98-4.83(m,3H),4.63(br s,1H),4.44(d,J＝4.0Hz,1H),4.24(br s,2H),4.14(br d,J＝5.0Hz,2H),3.62(s,3H),2.85-2.64(m,2H),2.04-1.91(m,1H)；31P NMR(162MHz,D2O)δ54.121,52.853；ESI-MS:m/z718.8[M+H]+。
步骤4：制备8钠盐
将8mL体积的Dowex 50W×8，200-400(H形式)加入烧杯中(对于39mg的化合物8)并用DIH2O(2×)洗涤。然后向树脂中加入15％H2SO4的DIH2O(50mL)溶液，将混合物搅拌15分钟，并滗出(1×)。将树脂转移到具有15％H2SO4的DI H2O溶液的柱中，并且用15％H2SO4(至少4柱体积)洗涤，并且然后用DI H2O洗涤，直至其为中性。将树脂转移回烧杯中，并且加入15％NaOH的H2O溶液(50mL)；将混合物搅拌15分钟，并滗出(1×)。将树脂转移到柱中并用15％NaOH的H2O溶液(至少4柱体积)洗涤，然后用H2O洗涤，直至其为中性(至少4柱体积)。将化合物8铵盐溶于DI水(39mg，5mL)中，加入柱顶部，并用DI水洗脱。如通过TLC(UV)检测的，8在早期馏分中洗脱出来。将产物冻干，得到白色固体状的化合物8钠盐(25.8mg)。1H NMR(400MHz,D2O)δ＝8.21(d,J＝2.3Hz,2H),7.91(s,1H),5.90(d,J＝8.8Hz,1H),5.83-5.74(m,1H),5.01(dt,J＝4.1,8.1Hz,1H),4.88-4.83(m,1H),4.59(br s,1H),4.49-4.38(m,2H),4.32(d,J＝4.3Hz,1H),4.28-4.20(m,1H),4.14-4.04(m,2H),3.60(s,3H),2.89-2.70(m,2H),2.13-2.03(m,1H)；31P NMR(162MHz,D2O)δ＝54.483,52.291；LCMS:ESI-MS:m/z718.8[M+H]+。
实施例6
步骤1：制备中间体3f
将二醇3e([1834500-45-6]，27.2g，40.6mmol)和咪唑(8.3g，121.7mmol)溶于DCM(600mL)中，然后加入叔丁基二甲基甲硅烷基氯(10.4g，69.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时，然后将其倒入NaHCO3水溶液中并用DCM萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并减压蒸发。通过二氧化硅柱层析法(梯度洗脱：0-50％EtOAc的石油醚溶液)纯化粗产物，得到中间体1b和其3'-羟基保护的异构体(结构未示出)的混合物(总共25g，收率：79％)。通过制备反相HPLC(固定相：Phenomenex Synergi，10μmMax-RP，250×50mm；流动相：H2O(A)-MeCN(B)；等度洗脱：92％B，流速：110mL/分钟)分离该区域异构体混合物，得到纯中间体3f，为首先洗脱的异构体(12g，收率：37％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm-0.42(s,3H),-0.21(s,3H),0.62(s,9H),1.89-2.02(m,1H),2.17-2.30(m,2H),3.07-3.15(m,1H),3.15-3.23(m,1H),3.73(s,6H),3.83-3.90(m,1H),4.41(dd,J＝8.8,5.3Hz,1H),4.45(d,J＝5.3Hz,1H),5.03-5.15(m,1H),6.64(d,J＝3.5Hz,1H),6.91(d,J＝8.8Hz,4H),7.23(t,J＝7.5Hz,1H),7.27-7.38(m,6H),7.45(d,J＝7.1Hz,2H),7.49(d,J＝3.5Hz,1H),7.54(t,J＝7.5Hz,2H),7.63(t,J＝7.1Hz,1H),8.06(d,J＝7.1Hz,2H),8.48(s,1H),11.05(br s,1H)；ESI-MS:m/z785.3[M+H]+
步骤2：制备中间体6a
将2g活化的MS加入中间体3f(2.5g，3.2mmol)的吡啶(12.5mL)和1,4-二恶烷(35mL)溶液中，将所得反应混合物在室温下搅拌15分钟。加入2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧杂磷杂环戊烯-4-酮(1.26g，6.2mmol)的无水1,4-二恶烷(2.5mL)溶液，并继续搅拌30分钟。通过加入15mL水和吡啶的1/1混合物，然后加入额外量的水(50mL)淬灭反应混合物。将所得的混合物过滤并用EtOAc萃取。将合并的有机相用NaHCO3水溶液洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到白色固体状的粗中间体6a(3.3g)。将粗产物原样用于下一步骤而无需纯化。
ESI-MS:m/z849.2[M+H]+
步骤3：制备中间体6b
向粗中间体6a(6.5g，5.7mmol)的DCM(80mL)溶液中加入H2O(1.0mL，56.7mmol)和二氯乙酸(1.46g，11.3mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟。加入额外量的二氯乙酸(472μL，5.7mmol)并继续搅拌20分钟。通过加入叔丁胺(26mL，248.1mmol)淬灭反应，并真空浓缩。通过二氧化硅柱层析法(梯度洗脱：0-30％MeOH的DCM溶液)纯化所得的残余物，得到白色固体状的中间体1d(3g，收率：82％)。将中间体6b作为在DCM(30mL)中的溶液在叔丁胺存在下搅拌1小时，将其转化为对应的叔丁基铵盐，然后减压浓缩并在高真空下干燥。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δppm-0.4(s,3H),-0.1(s,3H),0.6(s,9H),1.3(s,9H),1.7-1.8(m,1H),2.2(dt,J＝12.9,8.6Hz,1H),2.3-2.4(m,1H),3.5-3.6(m,2H),4.2-4.4(m,2H),5.1-5.2(m,1H),5.8(br s,1H),6.7(d,J＝583.9Hz,1H),6.7(d,J＝3.7Hz,1H),7.5(t,J＝7.7Hz,2H),7.6-7.7(m,2H),8.0(br s,3H),8.1(d,J＝7.3Hz,2H),8.5(s,1H),11.0(br s,1H)；ESI-MS:m/z547.0[M+H]+。
步骤4：制备中间体6c
在氮气下，将1H-咪唑鎓高氯酸盐(IMP，2.4g，14.0mmol)加入中间体6b(500mg，0.81mmol)的无水MeCN(23mL)溶液中。将所得混合物在室温下搅拌10分钟，之后加入5'-O-(4,4-二甲氧三苯甲基)-N2-异丁酰基-3'-O-甲基鸟苷-2'-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺)([179479-04-0]，1.4g，1.56mmol)的无水MeCN(2mL)溶液。将反应混合物在室温下搅拌2小时，加入tBuOOH(在癸烷中为5.5M，0.71mL，3.9mmol)并继续搅拌1小时。将反应混合物过滤并减压浓缩，得到无色油状物，将其通过制备型反相HPLC(固定相：Waters XBridge，5μm，150×25mm；流动相：H2O(A)-MeCN(B)；梯度洗脱：18％-48％B的A溶液，流速：25mL/分钟)纯化，得到中间体6c(250mg，收率：31％)。ESI-MS:m/z515.4[(M+H)/2]+。
步骤5：制备中间体6d
将DMOCP(52mg，0.29mmol)加入中间体6c(100mg，0.095mmol)的吡啶(60mL)溶液中，将反应混合物在室温下搅拌3小时。加入水(17mg，0.95mmol)和I2(120mg，0.48mmol)，继续搅拌1小时。用Na2SO3水溶液(8mL)淬灭反应，过滤并减压浓缩。通过制备型反相HPLC(固定相：Waters XBridge，5μm，150×25mm；流动相：10mM碳酸氢氨水溶液(A)-MeCN(B)；梯度洗脱17-47％B的A溶液；流速：25mL/分钟)纯化残余物，得到白色固体状的中间体1f(250mg，0.238mmol)。使用类似的规模重复先前的过程，以生成总量为100mg(收率：46％)的中间体6d。ESI-MS:m/z1027.4[M+H]+。
步骤6：制备化合物9
将中间体6d(100mg，0.97mmol)在33％甲胺的乙醇(40mL)溶液中在室温下搅拌6小时，然后将反应混合物减压浓缩。以68mg规模重复该过程。将所得粗产物的总量溶于吡啶(8mL)中，然后加入三乙胺(1.1g，10.5mmol)和三乙胺三氢氟酸盐(847mg，5.25mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌12小时，然后将其冷却至室温；加入异丙氧基三甲基硅烷(2.8g，21.0mmol)并继续搅拌12小时。通过制备型反相HPLC(固定相：AgelaDurashellC18，5μm，150×25mm；流动相：0.05％氢氧化铵水溶液(A)-MeCN(B)；梯度洗脱：0-15％B的A溶液，流速：35mL/分钟)纯化减压浓缩后得到的残余物，得到化合物9，为铵盐(60mg，50％)。通过在填充有50WX8Na+形式树脂的柱上洗脱水溶液来进行化合物9钠盐的转化。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.28-1.41(m,1H),2.22-2.39(m,2H),3.49(s,3H),3.55-3.65(m,1H),3.75(br d,J＝11.4Hz,1H),3.90-4.00(m,1H),4.03(d,J＝4.1Hz,1H),4.14(br s,1H),4.36(dd,J＝10.0,3.9Hz,1H),4.76-4.84(m,1H),4.90(q,J＝9.5Hz,1H),5.35(td,J＝9.2,4.1Hz,1H),5.81(d,J＝8.5Hz,1H),6.57(br s,2H),6.65(d,J＝3.3Hz,1H),7.37(d,J＝3.3Hz,1H),7.65(br s,2H),7.98(s,1H),8.00(s,1H),10.73(s,1H)；31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δppm0.83(s,1P),1.63(s,1P)；ESI-MS:m/z685.9[M+H]+。
实施例7
步骤1：制备中间体7a
向中间体6b(700mg，1.13mmol)的叔丁基铵盐和活化的分子筛中加入Activator42([175205-09-1]，9.9mL的0.25M溶液，2.49mmol)的MeCN溶液。将所得混合物在氮气下振摇75分钟，然后加入5'-O-(4,4-二甲氧三苯甲基)-N2-异丁酰基-3'-O-甲基鸟苷-2'-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺)1o(1.28g，在无水MeCN(9mL)中；1.4mmol，在使用前在分子筛上干燥的溶液)。将反应混合物振摇1小时，然后加入额外部分的1o(248mg，在MeCN中；0.282mmol，在使用前在分子筛上干燥的溶液)，在额外振摇一小时之后，加入第三部分的5'-O-(4,4-二甲氧三苯甲基)-N2-异丁酰基-3'-O-甲基鸟苷-2'-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺)(98mg，在MeCN中；0.113mmol，使用前在分子筛上干燥的溶液)。继续振摇1小时，然后减压浓缩反应混合物。加入吡啶(10mL)，随后加入二硫化苯乙酰(PADS，854mg，2.82mmol)，振摇混合物1小时。通过过滤去除分子筛，并用DCM洗涤分子筛，浓缩滤液并将所得残余物与MeCN共蒸发。粗产物7a原样用于下一步骤。ESI-MS:m/z672.8[M-H]-.
步骤2：制备中间体7b
将水(204μL，11.3mmol)、三乙基硅烷(1.8mL，11.3mmol)和二氯乙酸(370μL，4.5mmol)加入到粗中间体7a的DCM(10mL)溶液中。搅拌反应混合物1小时，然后用吡啶(457μL，5.6mmol)淬灭反应，并减压浓缩反应混合物。通过硅胶柱层析(梯度洗脱液：溶于DCM中的5％至20％MeOH)纯化粗产物，得到中间体7b(700mg，纯度75％，收率：44％)。ESI-MS:m/z1045.3[M+H]+.
步骤3：制备中间体7c
将DMOCP(1.1g，6.0mmol)加入到中间体7b(625mg，0.60mmol)的吡啶(22mL)溶液中，在室温下搅拌反应混合物90分钟。接着，加入水(78mg，59.8mmol)和3H-1,2-苯并二磺酚-3-酮(503mg，3.0mmol)，并且继续搅拌40分钟。通过加入盐水淬灭该反应，并用EtOAc对该反应物进行萃取。合并的有机相用NaHCO3水溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩，得到粗中间体7c，该粗中间体原样用于下一步骤。
ESI-MS:m/z1059.3[M+H]+.
步骤4：制备非对映异构体化合物10至13
在50℃下，将粗中间体7c在33％甲胺的乙醇(30mL)溶液中搅拌4小时。将减压浓缩后得到的残余物溶解在三乙胺(4.2mL)和吡啶(4.8mL)的混合物中，向该混合物中加入三乙胺三氢氟酸盐(2.5mL，14.9mmol)。在50℃下搅拌所得反应混合物3小时，然后将其冷却至室温，然后加入异丙氧基三甲基硅烷(3.2mL，17.9mmol)，继续搅拌1小时。接着，加入水，所得的水相用EtOAc洗涤，并冻干。向油性冻干物中加入甲醇，这使得沉淀出粗非对映异构体10至13。通过制备型反相HPLC进行纯化(固定相：XBridgeC18OBD，5μm，250×30mm；流动相：0.25％碳酸氢铵水溶液(A)-MeCN(B)；梯度洗脱液：0％至15％的B在A中超过45分钟，流速：30mL/min)，得到所有四种非对映异构体：化合物10(20mg，得率：中间体7b的4.5％)、化合物11(18mg，得率：中间体7b的4％)、化合物12(44mg，得率：中间体7b的10％)以及化合物13(60mg，得率：中间体7b的13.5％)。通过水溶液在填充有AmberliteIRNa+式树脂的柱上的洗脱来将所有化合物转化为对应的钠盐。
化合物10.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.31-1.43(m,1H),2.26(dt,J＝13.2,9.1Hz,1H),2.36-2.48(m,1H),3.50(s,3H),3.57(m,J＝10.6Hz,1H),3.76-3.91(m,2H),4.01-4.14(m,2H),4.18(d,J＝4.1Hz,1H),4.37(ddd,J＝8.8,4.1,2.4Hz,1H),4.90(q,J＝9.0Hz,1H),5.00(dt,J＝10.2,3.7Hz,1H),5.33(ddd,J＝12.2,8.8,3.9Hz,1H),5.60(d,J＝2.9Hz,1H),5.81(d,J＝9.0Hz,1H),6.37(br s,2H),6.55(d,J＝3.3Hz,1H),6.87(br s,2H),7.23(d,J＝3.7Hz,1H),8.04(s,1H),8.23(s,1H),10.64(br s,1H)；31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δppm53.49(s,1P),55.64(s,1P)；ESI-MS:m/z717.1[M+H]+.
化合物11：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.31-1.42(m,1H),2.22(dt,J＝13.3,8.7Hz,1H),2.52-2.60(m,1H),3.53(s,3H),3.71-3.80(m,2H),3.83-3.90(m,2H),4.12(brq,J＝2.0Hz,1H),4.31(d,J＝3.7Hz,1H),4.41(dd,J＝8.0,4.7Hz,1H),4.82(dt,J＝9.0,4.1Hz,1H),4.92(q,J＝9.0Hz,1H),5.32(ddd,J＝11.0,9.4,4.1Hz,1H),5.45(br s,1H),5.81(d,J＝9.0Hz,1H),6.45(br s,2H),6.59(d,J＝3.7Hz,1H),7.05(br s,2H),7.29(d,J＝3.3Hz,1H),8.07(s,1H),8.23(s,1H),10.56(s,1H)；31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δppm54.03(s,1P),56.86(s,1P)；ESI-MS:m/z717.1[M+H]+.
化合物12：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.21-1.33(m,1H),2.20-2.39(m,2H),3.50(s,3H),3.46-3.53(m,1H),3.65(br d,J＝11.0Hz,1H),3.92(d,J＝4.4Hz,1H),3.99(brt,J＝11.0Hz,1H),4.11-4.26(m,2H),4.34(dd,J＝10.5,3.9Hz,1H),4.92(q,J＝9.9Hz,1H),5.23(dd,J＝8.8,3.7Hz,1H),5.36(ddd,J＝12.7,8.7,4.3Hz,1H),5.81(d,J＝9.0Hz,1H),6.46(br s,2H),6.65(d,J＝3.5Hz,1H),7.34(d,J＝3.5Hz,1H),7.31(br s,2H),8.08(s,1H),8.12(s,1H),10.56(s,1H)；31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δppm56.36(s,1P),59.35(s,1P)；ESI-MS:m/z717.1[M+H]+.
化合物13：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.32(brt,J＝8.8Hz,1H),2.24-2.41(m,2H),3.52(s,3H),3.49-3.59(m,1H),3.68(br d,J＝11.4Hz,1H),3.85(q,J＝11.0Hz,1H),3.93-4.05(m,2H),4.95(br s,1H),4.36(dd,J＝9.8,4.1Hz,1H),4.97(dd,J＝8.6,4.1Hz,1H),4.93(q,J＝9.0Hz,1H),5.36-5.50(m,1H),5.80(d,J＝9.0Hz,1H),6.49(br s,2H),6.74(d,J＝3.7Hz,1H),7.50(d,J＝3.7Hz,1H),7.83(br s,2H),8.01(s,1H),8.20(s,1H),10.57(s,1H)；31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δppm54.46(s,1P),58.63(s,1P),58.66(s,1P)；ESI-MS:m/z717.1[M+H]+.
实施例8中说明的反应方案描述了制备本发明的化合物14及其药学上可接受的盐形式的一种可能的途径。
实施例8
实施例9中说明的反应方案描述了制备本发明的化合物15及其药学上可接受的盐形式的一种可能的途径。
实施例9
实施例10中说明的反应方案描述了制备本发明的化合物16及其药学上可接受的盐形式的一种可能的途径。
实施例10
实施例11
步骤1：制备化合物11b
在25℃下，向化合物11a(4.1g，16.383mmol，1.0当量)的吡啶(50mL)溶液中加入4-二甲基氨基吡啶(0.4g，3.277mmol，0.2当量)和叔丁基二甲基氯硅烷(3.704g，24.575mmol，1.5当量)。然后，在25℃下搅拌反应混合物12小时。减压浓缩溶剂，得到残余物，通过硅胶柱层析法(DCM/MeOH＝50/1至10/1)纯化该残余物，得到白色固体状的化合物11b(2.86g，48％收率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)8.32(s,1H),8.21(s,1H),6.47(dd,J＝5.2,7.2Hz,1H),4.31-4.18(m,2H),4.06-3.96(m,1H),3.94-3.84(m,1H),3.18-3.06(m,1H),2.80-2.70(m,1H),0.85(s,9H),0.03(d,J＝9.6Hz,6H)；ESI-MSm/z365.1[M+1]+.
步骤2：制备化合物11c
向化合物11b(3.5g，9.602mmol，1.0当量)的水/THF(v/v2/1，150mL)溶液中加入碳酸钠(1.348g，12.482mmol，1.3当量)和氯甲酸苄酯(2.129g，12.482mmol，1.3当量)。在25℃下搅拌混合物24小时。通过加入NH4Cl(水溶液)淬灭反应混合物，然后用EtOAc(50mL)稀释该反应混合物。有机部分用水(50mL)、盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩滤液，得到残余物。通过快速柱层析(石油醚/EtOAc＝10/1至EtOAc)纯化该残余物，得到白色固体状的化合物11c(2.72g，57％收率)。1HNMR(400MHz,CDCl3)8.34(s,1H),8.20(s,1H),7.43-7.29(m,5H),6.42(t,J＝5.8Hz,1H),5.62(s,2H),5.19-4.99(m,3H),4.53(t,J＝6.0Hz,1H),4.04(s,1H),3.99-3.77(m,2H),2.86-2.73(m,1H),2.60-2.44(m,1H),0.91(s,9H),0.09(s,6H)；ESI-MSm/z521.1[M+Na]+.
步骤3：制备化合物11d
在25℃下，向化合物11c(2.7g，5.415mmol，1.0当量)的吡啶(30mL)溶液中加入苯甲酰氯(1.142g，8.122mmol，1.5当量)。在25℃下搅拌反应混合物12小时。通过加入水(5mL)淬灭反应混合物，然后加入NH4OH(5mL)。在25℃下搅拌混合物1小时。反应混合物用EtOAc(100mL)稀释，用水(50mL)、盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩滤液，得到残余物。通过快速柱层析(石油醚/EtOAc＝10/1至EtOAc)纯化该残余物，得到白色固体状的化合物11d(2.42g，74％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)9.03(s,1H),8.79(s,1H),8.40(s,1H),8.02(d,J＝7.6Hz,2H),7.66-7.57(m,1H),7.56-7.47(m,2H),7.42-7.30(m,5H),6.62-6.37(m,1H),5.24-4.98(m,3H),4.55(t,J＝6.0Hz,1H),4.24-4.03(m,1H),4.02-3.76(m,2H),2.97-2.73(m,1H),2.70-2.46(m,1H),0.90(s,9H),0.09(s,6H)；ESI-MS m/z603.2[M+1]+.
步骤4：制备化合物11e
在25℃下，向化合物11d(2.4g，3.982mmol，1.0当量)的THF(20mL)溶液中加入四正丁基氟化铵(THF中1M，19.91mL，19.909mmol，5.0当量)。在25℃下搅拌反应混合物2小时。减压浓缩反应混合物，得到残余物。该残余物溶解在EtOAc(50mL)中，用水(50mL)、盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩滤液以得到残余物。通过快速柱层析(丙酮/EtOAc＝3/1至1/1)纯化所得残余物，以得到白色固体状的化合物11e(1.89g，97％收率)。1H NMR(400MHz,CD3OD)8.72(s,2H),8.09(d,J＝7.6Hz,2H),7.78-7.47(m,3H),7.44-7.20(m,5H),6.53(t,J＝5.6Hz,1H),5.11(s,2H),4.60(s,1H),4.14-3.99(m,1H),3.94-3.64(m,2H),2.91(m,1H),2.67-2.47(m,1H)；LCMS:ESI-MSm/z489.1[M+1]+.
步骤5：制备化合物11f
在25℃下，向化合物11e(1.4g，2.866mmol，1.0当量)的吡啶(20mL)溶液中加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(1.457g，4.299mmol，1.5当量)。在25℃下搅拌反应混合物2小时。通过加入MeOH(5mL)淬灭反应混合物，并且搅拌混合物30分钟。混合物用EA(50mL)稀释并用水(50mL)、盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩滤液，得到残余物。通过快速柱层析(石油醚/EtOAc＝10/1至EtOAc)纯化该残余物，得到白色固体状的化合物11f(2.03g，89％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)8.97(s,1H),8.76(s,1H),8.18(s,1H),8.02(d,J＝7.2Hz,2H),7.67-7.58(m,1H),7.58-7.48(m,2H),7.45-7.14(m,15H),6.78(m,4H),6.44(s,1H),5.10(s,2H),4.94(s,1H),4.59(s,1H),3.76(s,6H),3.45(s,2H),3.11-2.94(m,1H),2.62(s,1H)；ESI-MSm/z791.2[M+1]+.
步骤6：制备化合物11g
在氩气气氛下，向化合物11f(2.03g，2.567mmol，1.0当量)的MeOH(200mL)溶液中加入10％Pd/C(2.0g)。然后用氢气气氛(3x)对反应混合物进行替换。在25℃下搅拌该反应混合物18小时(50psi)。过滤反应混合物，并用MeOH(100mL×3)洗涤滤饼。将有机层减压浓缩，得到残余物。通过快速硅胶层析(DCM/MeOH＝100/1至10/1)纯化残余物，得到白色固体状的化合物11g(1.24g，74％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)9.10(s,1H),8.74(s,1H),8.19(s,1H),8.00(d,J＝7.2Hz,2H),7.57(m,1H),7.54-7.46(m,2H),7.42-7.33(m,2H),7.30-7.15(m,8H),6.78(d,J＝8.4Hz,4H),6.42(dd,J＝3.6,6.8Hz,1H),3.91-3.80(m,2H),3.75(s,6H),3.40(m,2H),2.82(m,1H),2.45-2.30(m,1H)；LCMS:ESI-MSm/z657.2[M+1]+.
步骤7：制备化合物11h
在25℃下，向化合物8k(16.50g，46.698mmol，1.00当量)的吡啶(200mL)溶液中加入4,4'-(氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(23.734g，70.048mmol，1.50当量)。在25℃下搅拌反应混合物过夜。用甲醇(10mL)淬灭反应混合物，然后浓缩反应混合物，得到残余物。通过硅胶柱层析法(DCM/MeOH＝50/1至10/1)纯化残余物，得到黄色固体状的化合物11h(23.9g，78％得率)。LCMS:ESI-MS:m/z656.1[M+H]+.
步骤8：制备化合物11i
在25℃下，向化合物11h(23.9g，36.450mmol，1.00当量)的N,N-二甲基甲酰胺(120mL)溶液中加入叔丁基氯二甲基硅烷(8.241g，54.675mmol，1.50当量)和1H-咪唑(6.204g，91.124mmol，2.50当量)。在25℃下搅拌反应混合物过夜。用甲醇(5mL)淬灭反应混合物，并浓缩反应混合物，得到残余物。通过制备型HPLC(水(0.225％甲酸-CH3CN))纯化残余物，得到黄色固体状的化合物11i(6.7g，24％得率)。LCMS:ESI-MS:m/z770.3[M+H]+.
步骤9：制备化合物11j
在25℃下，向化合物11i(5.000g，6.494mmol，1.00当量)的1,4-二氧戊环(50mL)溶液中加入DMAP(79.334mg，0.649mmol，0.1当量)、N,N'-甲烷二环己基二亚胺(4.020g，19.482mmol，3当量)和4-氧代戊酸(1.508g，12.988mmol，2.0当量)。在25℃下搅拌混合物3小时。对反应混合物进行过滤，并用EtOAc(30mL)洗涤滤饼。减压浓缩合并的有机层，得到残余物。该残余物溶解在EtOAc(100mL)中，用水(50mL)、盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩滤液以得到残余物。通过硅胶柱层析(DCM/MeOH＝100/1至10/1)纯化残余物，得到白色泡沫状的化合物11j(5.1g，90％得率)。LCMS:ESI-MS:m/z868.4[M+H]+.
步骤10：制备化合物11k
向化合物11j(5.1g，5.875mmol，1.00当量)的DCM(12mL)溶液中加入2,2,2-三氟乙酸(300uL)和三乙基硅烷(6mL)。在25℃下搅拌混合物10分钟。用NaHCO3的饱和溶液(20mL)淬灭反应混合物，然后用DCM(30mL×3)稀释反应混合物。合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩滤液，得到残余物。通过柱层析(DCM/MeOH＝50/1至10/1)纯化残余物，得到黄色固体状的化合物11k(3.1g，93％得率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)12.11(s,1H),11.64(s,1H),8.42-8.22(m,1H),6.00(d,J＝6.8Hz,1H),5.74(s,1H),5.54(dd,J＝5.0,6.7Hz,1H),5.26(t,J＝5.2Hz,1H),4.55(dd,J＝2.4,4.9Hz,1H),3.98(br d,J＝2.4Hz,1H),3.67(td,J＝4.9,11.9Hz,1H),3.61-3.51(m,1H),2.77(spt,J＝6.8Hz,1H),2.70-2.60(m,2H),2.02(s,3H),1.11(d,J＝6.6Hz,6H),0.89(s,9H),0.10(s,3H),0.06(s,3H).
步骤11：制备化合物11l
在0℃下，向化合物11k(3.1g，5.480mmol，1.00当量)的THF(40mL)溶液中加入N-乙基-N-异丙基丙烷-2-胺(4.250g，32.880mmol，6.0当量)和3-((氯(二异丙基氨基)膦基)氧基)丙腈(3.891g，16.440mmol，3.0当量)。在0℃下搅拌混合物2小时。通过加入MeOH(3mL)淬灭反应混合物，然后用EA(50mL)稀释该反应混合物。有机层用NaHCO3(40mL)和盐水(40mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩滤液，得到残余物。通过柱层析(DCM/EtOAc＝10/1至1/1)纯化残余物，得到无色油状的化合物11l(3.1g，74％得率)。LCMS:ESI-MS:m/z683.1[M-N(iPr)2+18]+.
步骤12：制备化合物11m
在25℃下，向化合物11l(2.1g，2.742mmol，1.0当量)的乙腈(16mL)溶液中加入1H-四唑(0.45M)的乙腈/水(9/1、18/2mL)溶液。在25℃下搅拌溶液2小时。将反应混合物冷却至0℃，用乙酸乙酯(50mL)稀释，依次用冷水(20mL)、冷的5％碳酸氢钠(20mL)、冷水(20mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩滤液，得到无色油状的化合物11m(1.62g，87％收率)。31P NMR(162MHz,CDCl3)11.43(s,1P),7.10(s,1P)；LCMS:ESI-MSm/z683.1[M+1]+.
步骤13：制备化合物11n
将化合物11g(1.2g，1.827mmol，1.0当量)在乙腈/二氯甲烷/四氯甲烷(1/1/1，30mL)和三乙胺(900uL)的混合物中的溶液加入到含有化合物11m(1.62g，2.375mmol，1.3当量)的密封烧瓶中。在25℃下搅拌所得溶液2小时。减压浓缩反应混合物至干，得到残余物。通过快速柱层析(DCM/MeOH＝100/1至100/2)纯化残余物，得到白色泡沫状的化合物11n(1.21g，50％收率)。31P NMR(162MHz,CD3OD)9.13(s,1P),8.73(s,1P)；LCMS:ESI-MSm/z1337.5[M+1]+.
步骤14：制备化合物11o
在25℃下，向化合物11n(1.1g，0.822mmol，1.0当量)的MeCN(30mL)溶液中加入乙酸肼(757.462mg，8.225mmol，10.0当量)。在25℃下搅拌反应混合物2小时。然后，反应混合物用EA(50mL)稀释，用水(50mL)和盐水(30mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩滤液，得到残余物。通过快速柱层析(DCM/MeOH＝100/1至100/5)纯化残余物，得到白色固体状的化合物11o(833mg，82％收率)。LCMS:ESI-MSm/z1261.2[M+23]+.
步骤14：制备化合物11p
向化合物11o(653mg，0.527mmol，1.0当量)和分子筛的1,4-二氧戊环(9.0mL)和吡啶(3.0mL)溶液中加入2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧二氧磷-4-酮(160.068mg，0.790mmol，1.5当量)的1,4-二氧戊环(5mL)溶液。在25℃下搅拌反应混合物30分钟。通过加入水/吡啶(1/1，5mL)淬灭反应混合物，并将所得混合物倒入NaHCO3溶液(20mL)中。用EtOAc(30×3mL)对混合物进行萃取，使其分层。将合并的EtOAc萃取物减压浓缩至干，得到无色泡沫状的化合物11p(723mg，粗品)，将该产物用于下一步骤中，无需进一步纯化。
步骤15：制备化合物11q
向化合物11p(723mg，粗品)的DCM(5mL)溶液中加入水和DCA(在DCM中6％，5mL)。在25℃下搅拌反应混合物30分钟。通过加入吡啶(3mL)淬灭反应混合物并搅拌10分钟。将反应混合物减压浓缩至干，得到残余物。通过制备型HPLC(柱：Waters Xbridge150*255u；流动相：水(10mM NH4HCO3)-ACN，22％至42％，流速：25mL/min，梯度时间：8分钟)纯化所得残余物，得到白色固体状的化合物11q(197mg，针对两个步骤的35％收率)。31P NMR(162MHz,D2O)9.23(s,1P),8.62(s,1P),4.48(s,1P)；LCMS:ESI-MSm/z1001.5[M+1]+.
步骤16：制备化合物11r
在25℃下，向化合物11q(197mg，0.197mmol，1.0当量)和分子筛的吡啶(60mL)溶液中加入2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧杂环己烷-2-氧化物(127.131mg，0.689mmol，3.5当量)。在25℃下搅拌反应混合物1小时。将含有化合物11r的反应混合物(在Py中为0.00328M，60mL)用于下一步骤，无需进一步纯化。
步骤17：制备化合物11s
通过加入水(36.49mg，1.97mmol，10.0当量)淬灭化合物11r(在Py中为0.00328M，60mL)的溶液，然后将I2(250mg，0.985mmol，5.0当量)加入到溶液中。在25℃下搅拌混合物1小时。然后通过加入Na2SO3水溶液(2mL)淬灭该混合物，对该混合物进行过滤，并减压浓缩滤液，得到残余物。通过制备型HPLC(柱：Waters Xbridge150*255u；流动相：28％至48％的水(10mM NH4HCO3)-ACN，流速：25mL/min，梯度时间：8分钟)纯化该残余物，得到白色固体状的化合物11a(68mg，针对两个步骤的35％收率)。LCMS:ESI-MSm/z999.1[M+1]+.
步骤18：制备化合物11t
将化合物11s(35mg，0.035mmol，1.0当量)的MeNH2(在EtOH中33％，2mL)溶液在25℃下搅拌12小时。减压浓缩该反应混合物，得到黄色固体状的化合物11t(粗品，32mg)。
步骤18：制备化合物17
在25℃下，向化合物11t(32mg，粗品)的吡啶(2mL)溶液中加入三乙胺(209.805mg，2.073mmol，50当量)和三乙胺三氢氟酸盐(167.124mg，1.037mmol，25当量)。在50℃下搅拌反应混合物12小时。在25℃下向反应混合物中加入THF(1mL)和异丙氧基三甲基硅烷(548.516mg，4.147mmol，100当量)，并搅拌混合物12小时。减压浓缩混合物，得到残余物。通过制备型HPLC(柱：Agela Durashell C18 150*255u；流动相：水(0.05％氢氧化铵v/v)-ACN，0％至15％，流速：35mL/min，梯度时间：10分钟)纯化残余物，得到白色固体状的作为铵盐(9.5mg，针对两个步骤的35％收率)化合物17。1H NMR(400MHz,D2O)8.66-7.98(m,2H),7.83(s,1H),6.24(s,1H),6.04-5.50(m,2H),4.60(s,1H),4.42-3.93(m,7H),2.76(s,1H),2.44(s,1H)；31P NMR(162MHz,D2O)7.62(s,1P),7.49(s,1P),-3.40(s,1P).
步骤19：制备化合物17，钠盐
将5mL体积的Dowex50W×8，200-400(H形式)加入烧杯(用于9.5mg的化合物17，铵盐)中并用去离子水(2×)洗涤。然后向树脂中加入15％H2SO4的DI水(50mL)溶液，将混合物搅拌15分钟，并且滗析(1x)。将树脂转移到具有15％H2SO4的DI水溶液的柱中，并且用15％H2SO4(至少4CV)洗涤，并且然后用DI水洗涤，直至其pH为中性。将树脂转移回烧杯中，并且加入15％NaOH水溶液(50mL)，将混合物搅拌15分钟，并且滗析(1x)。将树脂转移到柱中并用15％NaOH水溶液(至少4CV)洗涤，然后用水洗涤，直至其pH为中性(至少4CV)。将化合物17铵盐溶解在DI水(2mL中9.5mg)中，并将该溶液加入到柱顶部，并且用DI水洗脱。如通过TLC(UV)检测的，产物在早期馏分中洗脱出来。将产物冻干，得到白色固体状的化合物17钠盐(7.4mg，98％纯度，71.819％收率)。1H NMR(400MHz,D2O)8.31(s,1H),8.17(s,1H),7.92(s,1H),6.32(d,J＝6.4Hz,1H),5.95(d,J＝8.0Hz,1H),5.69(m,1H),4.66(d,J＝4.0Hz,1H),4.40-4.31(m,2H),4.24-4.06(m,5H),2.89-2.84(m,1H),2.51-2.46(m,1H)；31P NMR(162MHz,D2O)7.56(s,1P),-1.86(s,1P)；LCMS:ESI-MSm/z657.8[M+1]+.
实施例12
步骤1：制备化合物12b
向化合物12a(7.8g，29.187mmol)和DMAP(2.995g，24.517mmol)的吡啶(240mL)溶液中加入TrCl(27.665g，99.236mmol)。将反应混合物在80℃下加热5小时之后，将反应物冷却至环境温度，并用EtOH(150mL)淬灭。浓缩反应混合物，并通过硅胶快速柱层析(DCM:EA＝0/1至1:1)纯化反应混合物，得到白色固体状的化合物12b(10.45g，13.899mmol)。ESI-MS:m/z774.1[M+Na]+.
步骤2：制备化合物12c
将化合物12b(11.5g，15.295mmol)和DMAP(4.671g，38.238mmol)溶解在吡啶(300mL)中。将该溶液冷却至0℃，并且滴加三氟甲磺酸酐溶液(20.672mL，122.362mmol)。将反应混合物在0℃下保持30分钟，然后使其在3小时的时间段内升温至室温。用CH2Cl2(500mL)稀释该反应混合物，并用水(0℃下300mL)对该反应混合物进行萃取。减压去除溶剂，并通过硅胶快速柱层析(石油醚(PE)/EtOAc＝1:0至1:1)纯化残余物，得到白色无定形固体状的化合物12c(11g，10.827mmol)。ESI-MS:m/z1037.8[M+Na]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)7.89(s,1H),7.84(s,1H),7.39-7.29(m,12H),7.28-7.17(m,18H),6.98(s,1H),6.45(t,J＝5.2Hz,1H),6.21(d,J＝6.0Hz,1H),5.86-5.81(m,1H),4.48(q,J＝3.6Hz,1H),3.69(dd,J＝4.3,11.2Hz,1H),3.36(dd,J＝4.0,11.2Hz,1H).
步骤3：制备化合物12d
将化合物12c(9.5g，9.350mmol)溶解在含四丁基亚硝酸铵(21.579g，74.804mmol)和水(26mL)的甲苯(200mL)中。在剧烈搅拌反应混合物40小时之后，用t-BuOCH3(200mL)和水(2×100mL)该混合物进行萃取。合并有机层，该合并的有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩滤液，得到粗产物。通过硅胶快速柱层析(PE/EtOAc＝1:0至2:1)纯化残余物，得到白色无定形固体状的化合物12d(3.87g，5.274mmol)。ESI-MS:m/z756.0[M+Na]+.
步骤4：制备化合物12e
将化合物12d(3.87g，5.274mmol)、NH4Cl(0.564g，10.547mmol)、NaN3(2.1g，32.303mmol)、DMF(16mL)和水(2.4mL)的混合物加热回流(100℃)1小时。然后，用CH2Cl2(100mL)和水(100mL)对反应混合物进行萃取。有机层用水(3×100mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩滤液。通过硅胶快速柱层析(PE/EtOAc＝1:0至3:1)纯化残余物，得到白色无定形固体状的化合物12e(2.86g，3.681mmol)，以及另一异构体(500mg，0.245mmol)。ESI-MS:m/z799.1[M+Na]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)8.00(d,J＝9.3Hz,2H),7.33(dt,J＝1.5,7.2Hz,12H),7.26-7.17(m,18H),7.05(s,1H),6.05(d,J＝5.2Hz,1H),5.53(br d,J＝8.8Hz,1H),4.58-4.49(m,1H),4.43(t,J＝6.0Hz,1H),3.91-3.83(m,1H),3.49-3.39(m,1H),3.27(dd,J＝4.3,10.5Hz,1H).
步骤5：制备化合物12f
将DAST(3.798g，23.561mmol)的溶液滴加到12e(2.86g，3.681mmol)的甲苯(50mL)和吡啶(5.359mL)溶液中。在室温下搅拌30分钟之后，将反应混合物在80℃下加热1小时，然后用EtOAc(70mL)稀释该反应混合物。有机层依次用7％NaHCO3水溶液(100mL)和水(100mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩滤液。通过硅胶快速柱层析(PE/EtOAc＝1:0至5:1)纯化残余物，得到淡黄色无定形固体状的化合物12f(2.24g，2.876mmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3)7.97(s,1H),7.90(s,1H),7.40-7.30(m,14H),7.25-7.17(m,16H),6.11(d,J＝19.6Hz,1H),5.93-5.76(m,1H),4.79-4.68(m,1H),4.29-4.22(m,1H),3.57(dd,J＝3.0,10.9Hz,1H),3.33(dd,J＝4.0,11.0Hz,1H).
步骤6：制备化合物12g
在0℃下，向化合物12f(1.7g，2.183mmol)的DCM溶液中加入TFA、Et3SiH和DCM(24mL)。在25℃下搅拌溶液2小时之后，反应混合物用NaHCO3饱和水溶液(30mL)淬灭，用DCM(20mL)稀释并用DCM(50mL×2)萃取。然后，减压浓缩合并的有机层，得到残余物。通过硅胶快速柱层析(DCM:MeOH＝1:0至10:1)纯化残余物，得到白色固体状的化合物12g(440mg，1.495mmol)。ESI-MS:m/z＝295.0[M+1]+.
步骤7：制备化合物12h
在室温下，向化合物12g(440mg，1.196mmol)的吡啶溶液中加入三甲基氯硅烷。2小时之后，将混合物冷却至0℃，并滴加BzCl。在室温下搅拌3小时之后，反应混合物在冰浴中冷却，并且用水在0℃下淬灭。然后加入NH4OH，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后，混合物用DCM(50mL)稀释，并用DCM(20mL)萃取。然后，合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，用NaSO4干燥，过滤，并浓缩滤液。通过硅胶快速柱层析(DCM/MeOH：1/0至10/1)纯化所得残余物，得到黄色固体状的化合物12h(372mg)。ESI-MS:m/z＝399.1[M+1]+.
步骤8：制备化合物12i
在室温下，在N2气氛下，将化合物12h(372mg，0.934mmol)和MS(3g)的CH3CN(30mL)溶液搅拌3分钟。加入1H-四唑(12.451mL，5.603mmol)。10分钟之后，加入化合物1o的CH3CN(5mL)(ChemGenes Corporation)(1.268g，1.307mmol)溶液。将混合物在26℃下搅拌1小时。然后，加入叔丁基过氧化氢(0.934mL，4.669mmol)。在26℃下搅拌1小时之后，对混合物进行过滤，并浓缩滤液。通过硅胶快速柱层析(DCM:MeOH＝1:0至10:1)纯化残余物，得到黄色固体状的化合物12i(1.15g)。ESI-MS:m/z＝1283.7[M+1]+.
步骤9：制备化合物12j
在室温下，向化合物12i(1.15g，0.896mmol)的水和DCM溶液加入二氯乙酸(406.140mg，8.961mmol)。然后加入三乙基硅烷(5mL)。在室温下搅拌48小时之后，加入吡啶(0.289mL，3.584mmol)。搅拌10分钟之后，浓缩混合物，并通过硅胶快速柱层析(DCM:MeOH＝10:1)纯化残余物，得到白色固体状的化合物12j(607mg)。ESI-MS:m/z＝981.4[M+1]+；1HNMR(400MHz,CDCL3)8.76(d,J＝8Hz,1H),8.36(s,1H),8.12-7.96(m,3H),7.64-7.57(m,1H),7.55-7.47(m,2H),6.39-6.20(m,1H),6.02-5.95(m,1H),4.77-4.62(m,1H),4.47(brs,1H),4.43-4.29(m,1H),4.28-4.16(m,2H),4.15-4.06(m,2H),4.15-4.06(m,1H),4.15-4.06(m,1H),4.05-3.96(m,1H),3.96-3.87(m,1H),3.67(brt,J＝12.0Hz,1H),3.47-3.37(m,1H),2.73-2.58(m,3H),1.28-1.13(m,7H),0.88(d,J＝14Hz,9H),0.12-0.04(m,6H).
步骤10：制备化合物12k
向化合物12j(607mg，0.619mmol)、1H-四唑(1.031mL，0.464mmol)、LiCl(131.162mg，3.094mmol)和MS的DCM(68mL)溶液中加入二甲基二异丙基亚磷酰胺(125.54mg，0.650mmol)。在室温下搅拌72小时之后，对混合物进行过滤，并通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini C18 250*5010u；流动相：水(10mM NH4HCO3)-ACN，28％至58％，流速：22mL/min)纯化所得残余物，得到白色固体状的化合物12k(160mg)。ESI-MS:m/z＝978.2[M+1]+；1H NMR(400MHz,CD3OD)8.81(s,1H),8.30-8.21(m,3H),8.06(s,1H),7.75-7.65(m,3H),6.53(d,J＝17.2Hz,1H),6.24(d,J＝8.4Hz,1H),5.46-5.28(m,1H),5.08-4.97(m,1H),5.02(dt,J＝3.8,8.4Hz,1H),4.76(d,J＝3.2Hz,1H),4.51-4.36(m,2H),4.29-4.18(m,1H),3.86(d,J＝11.2Hz,3H),2.80-2.69(m,1H),1.28-1.24(m,6H),1.00(s,9H),0.32(s,3H),0.27-0.24(m,3H).
步骤11：制备化合物12l
向化合物12k(160mg，0.164mmol)的EtOH(10mL)溶液中加入浓NH4OH(10mL)，同时搅拌。在50℃下搅拌反应混合物2天之后，减压浓缩反应混合物，得到白色粗制固体状的化合物12l(125mg)。该粗产物用于下一步骤，无需进一步纯化。ESI-MS:m/z＝790.5[M+1]+.
步骤12：制备化合物18三乙基铵盐
将化合物12l(125mg，0.158mmol)、三乙胺(961.056mg，9.498mmol)和三乙基氟化铵(765.545，4.749mmol)的吡啶(4mL)溶液在50℃下搅拌5小时。然后向该反应混合物中加入异丙氧基三甲基硅烷(3.141g，23.744mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。浓缩混合物，并通过制备型HPLC(柱：Agela Durashell C18 150*255u；流动相：水(10mMNH4HCO3)-CH3CN，0％至15％，流速：35mL/min)纯化残余物，得到白色固体状的作为其三乙基铵盐的化合物5(70mg，0.080mmol)。1H NMR(400MHz,D2O)8.54-7.99(m,2H),7.78(br s,1H),6.25(br s,1H),5.90-5.80(m,1H),5.85(br s,1H),5.71(br s,1H),5.32-5.03(m,1H),4.55(br s,1H),4.32-4.01(m,6H),3.94(br s,1H).31P NMR(162MHz,D2O)6.42(br s,1P),-3.47(br s,1P).
步骤13：制备化合物18三乙基钠盐
将70mL体积的Dowex50Wx8,200-400(H形式)加入到烧杯中(用于70mg的化合物18)，然后用去离子化水(2x)洗涤该溶液。将体积为15％的H2SO4的去离子水(100mL)溶液加入到树脂中，并将混合物搅拌15分钟，然后滗析(1x)。将树脂转移到具有15％H2SO4去离子水溶液的柱中，并用15％H2SO4(至少4个柱体积)洗涤，然后用去离子水洗涤，直到树脂的pH为中性。将树脂转移回烧杯中，并且加入15％NaOH的去离子水溶液(100mL)。将混合物搅拌15分钟，并滗析(1x)。将树脂转移到柱中，并用15％NaOH的去离子水溶液(至少4个柱体积)洗涤，并且然后用水洗涤，直至其pH为中性(至少4个柱体积)。将化合物18三乙基铵盐溶解在去离子水(50mL中70mg)中，然后加入到柱顶部，并用DI水洗脱。如通过TLC(UV)检测的，化合物18在早期馏分中洗脱出来。将产物冻干，得到化合物18三乙基钠盐(49.9mg，0.068mmol)。ESI-MS:m/z＝675.8[M+1]+；1H NMR(400MHz,D2O)8.39-8.06(m,2H),7.78(s,1H),6.28(d,J＝13.6Hz,1H),5.86(d,J＝.0Hz,1H),5.69(s,1H),5.35-5.08(m,1H),4.56(d,J＝4.5Hz,1H),4.33-4.06(m,6H),3.99(d,J＝10.4Hz,1H).19F NMR(376MHz,D2O)-200.54(s,1F).31PNMR(162MHz,D2O)6.48(s,1P),-2.71(s,1P).
实施例13中说明的反应方案描述了制备本发明的化合物19及其药学上可接受的盐形式的一种可能的途径。
实施例13
实施例14中说明的反应方案描述了制备本发明的化合物20及其药学上可接受的盐形式的一种可能的途径。
实施例14
实施例15中说明的反应方案描述了制备本发明的化合物21及其药学上可接受的盐形式的一种可能的途径。
实施例15
实施例16中说明的反应方案描述了制备本发明的化合物22及其药学上可接受的盐形式的一种可能的途径。
实施例16
实施例17中说明的反应方案描述了制备本发明的化合物23及其药学上可接受的盐形式的一种可能的途径。
实施例17
实施例18
步骤1：制备化合物15g
3'-氟-鸟苷，化合物15f(2.0g，7.01mmol)与无水甲苯(3×20mL)共蒸发，并将其悬浮于无水吡啶(35mL)中。在0℃下，向该混合物中加入三甲基氯硅烷(8.0mL，63.09mmol)。在室温下搅拌反应混合物2小时之后，将反应物冷却至0℃。然后加入异丁酰氯(1.46mL，14.02mmol)。在室温下搅拌2小时之后，将反应混合物冷却至0℃，然后加入水(15mL)和NH3水溶液(15mL)。将反应混合物搅拌30分钟，然后蒸发至干，得到粗残余物，通过快速柱层析(CH2Cl2中的N0％-20％MeOH，v/v)纯化该粗残余物，以得到白色固体状的化合物15g(1.8g)。LCMS:m/z355.95(M+1)+.
步骤2：制备化合物18a
3'-氟-N-异丁酰基鸟苷，15g(830mg，2.35mmol)与无水甲苯(2×20mL)共蒸发，并且溶解在无水DMF(14mL)中。在室温下，加入三苯基膦(925mg，3.52mmol)、NaN3(458mg，7.05mmol)、四丁基碘化铵(173mg，0.470mmol)和CBr4(1.16g，3.52mmol)。在室温下搅拌反应混合物过夜之后，将反应混合物蒸发至干，并且通过快速硅胶层析(DCM中0％-20％MeOH，v/v)纯化所得粗制反应混合物，得到白色固体粉末状的化合物18a(780mg)。ESI-MS:m/z381.00[M+H]+.
步骤3：制备化合物18c
在室温下，在Ar(g)气氛下，将化合物18a(800mg，2.10mmol)、分子筛粉末(3g)和1H-咪唑高氯酸盐(3.52g，21.0mmol)的无水CH3CN(80mL)溶液搅拌10分钟。加入Amidite18b(可商购获得，2.1g，2.10mmol)的无水CH3CN(10mL)溶液。在室温下搅拌反应混合物50分钟之后，加入叔丁基过氧化氢(5.5M，1.90mL，10.5mmol)，并搅拌反应混合物1小时。该反应混合物用EtOAc(150mL)稀释，用饱和NaHCO3(1×30mL)水溶液和饱和NaCl(1×30mL)水溶液洗涤，并且将有机相减压蒸发至干。通过快速柱层析(CH2Cl2中0％-15％MeOH，v/v)纯化所得残余物，得到白色固体状的二聚物18c(2.1g)。ESI-MS:m/z1283.30[M+H]+.
步骤4：制备化合物18d
将化合物18c(1.1g，0.86mmol)溶解在无水CH2Cl2(24mL)中。向该混合物中加入三乙基硅烷(0.7mL，5.14mmol)和二氯乙酸(0.43mL，5.14mmol)。在将反应混合物搅拌35分钟之后，用吡啶(0.83mL，10.28mmol)淬灭该混合物，并将其蒸发至干。通过快速柱层析(CH2Cl2中20％-80％丙酮，v/v)纯化所得粗产物，得到白色固体状的二聚物18d(0.75g)。ESI-MS:m/z981.15[M+H]+.
步骤5和6：制备化合物18f
化合物18d(570mg，0.581mmol)与无水甲苯(2×20mL)共蒸发，并溶解在无水CH3CN(10mL)中。加入分子筛粉末(2g)和四唑(8mL，3.48mmol，CH3CN中0.45M)，并将Ar(g)鼓入到反应混合物中，持续2分钟，然后在室温下搅拌10分钟。加入二甲基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(0.3mL，1.16mmol)。在室温下搅拌反应混合物1小时之后，对反应混合物进行过滤，并用EtOAc(150mL)稀释滤液，然后用饱和NaHCO3(1×30mL)水溶液和饱和NaCl(1×30mL)水溶液依次洗涤滤液。有机相用MgSO4干燥(搅拌10分钟)，过滤，并减压浓缩滤液至干。粗制化合物18e用于下一步骤，无需进一步纯化。
步骤6：将化合物18e(0.581mmol)溶解在无水吡啶(25mL)中，并且加入LiCl(150mg，3.48mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌5.5小时之后，将反应混合物用EtOAc(300mL)稀释，并用水(1×25mL)洗涤。用EtOAc(1×30mL)对水相进行反萃取。将合并的有机相浓缩至干，并通过快速柱层析(CH2Cl2中0％-15％MeOH，v/v)纯化所得残余物，得到白色固体状的化合物18f(150mg)。ESI-MS:m/z1031.15[M+H]+.
步骤7：制备化合物18g
将化合物18f(125mg，0.121mmol)溶解在NH3:EtOH水溶液(8mL，3:1，v/v)中。在55℃下搅拌反应物20小时之后，将混合物浓缩至干。所得沉淀通过制备型HPLC(流动相：缓冲液A：50mM TEAA的水溶液，缓冲液B：50mM TEAA的CH3CN溶液，在20分钟内，从25％至65％的梯度)纯化，得到白色固体状的化合物18g(58mg)。ESI-MS:m/z790.25[M+H]+.
步骤8：制备化合物24
将化合物18g(12mg，0.021mmol)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中。向该溶液中加入四丁基氟化铵(0.15mL，THF中1M TBAF)。在室温下搅拌反应物2小时之后，将反应混合物浓缩至干，并通过制备型HPLC(流动相：缓冲液A：50mM TEAA的水溶液，缓冲液B：50mM TEAA的CH3CN溶液，在20分钟内，从0％至25％的梯度)纯化，得到作为其TEA盐的化合物24(2.5mg)。ESI-MS:m/z674.1[M-1]-.
步骤9：制备化合物24，钠盐
将3mL体积的Dowex 50W×8,200-400(H形式)加入到烧杯中(用于2.5mg的化合物24，TEA盐)，并用去离子水(2x)洗涤。然后向树脂中加入15％H2SO4的去离子水(50mL)溶液，将混合物搅拌15分钟，并滗析(1x)。将树脂转移到具有15％H2SO4去离子水溶液的柱中，并用15％H2SO4(至少4CV)洗涤，然后用去离子水洗涤，直到其pH为中性。将树脂转移回烧杯中，并且加入15％NaOH水溶液(50mL)，将混合物搅拌15分钟，并滗析(1x)。将树脂转移到柱中并用15％NaOH水溶液(至少4CV)洗涤，然后用水洗涤，直到其pH为中性(至少4CV)。将化合物24TEA盐(2.5mg)溶解在去离子水(2mL)中，将该溶液加入到柱顶部，并用去离子水洗脱。如通过TLC(UV)所检测的，化合物在早期馏分中洗脱出来。将产物冻干，得到白色泡沫状的目标化合物24，钠盐(2.0mg)。1H NMR(400MHz,D2O,)δ8.23(s,1H),8.13(s,1H),7.71(s,1H),6.04(s,1H),5.95(d,J＝8.4Hz,1H),5.42-5.58(m,1H),5.12(d,J＝4Hz,0.5H),5.01(d,J＝4Hz,0.5H),4.62-4.70(m,1H),4.50-4.58(m,0.5H),4.46-4.51(m,0.5H),4.40-4.43(m,1H),4.30-4.40(m,2H),3.92-4.02(m,1H),3.15-3.25(m,2H)；31P NMR(162MHz,D2O):δ7.95,-2.76；19F NMR(379MHz,D2O):δ-195.59(quintet)；ESI-MS:m/z674.1[M-1]-.
实施例19
步骤1：制备化合物8b
在室温下，向化合物8a(5.0g，18.57mmol)的吡啶(100mL)溶液中加入三甲基氯硅烷(18.16g，167.14mmol)。1.5小时之后，在室温下，滴加苯甲酰氯(7.83g，55.71mmol)。将最终混合物在室温下搅拌3小时。在0℃下用水(50mL)淬灭混合物，并且在0℃下滴加NH3-H2O(50mL)。浓缩反应混合物，并通过硅胶快速柱层析(DCM/MeOH＝10/1)纯化反应混合物，得到灰、白色固体状的化合物8b(5.2g)。1H NMR(400MHz,CD3ODand DMSO-d6)δ8.73(d,J＝0.8Hz,2H),8.09-8.02(m,2H),7.68-7.65(m,1H),7.59-7.55(m,2H),6.47-6.42(m,1H),5.56-5.41(m,1H),4.71-4.64(m,1H),4.17-4.15(m,1H),3.98-3.94(m,1H),3.81-3.77(m,1H).
步骤2：制备化合物17b
化合物8b(1g，2.68mmol)与无水甲苯(2×20mL)共蒸发，并溶解在无水DMF(16mL)中。在室温下，加入三苯基膦(1.05g，4.02mmol)、NaN3(650mg，10.00mmol)、四丁基碘化铵(197.87mg，0.54mmol)、四溴化碳(1.33g，4.02mmol)。在室温下搅拌过夜之后，将反应混合物蒸发至干，并且通过硅胶快速柱层析(DCM/MeOH＝10/1)纯化所得残余物，得到白色固体粉末状的化合物17b(890mg)。
步骤3：制备化合物19b
在室温下，向化合物19a(5.0g，16.82mmol)的吡啶(72mL)溶液中加入三甲基氯硅烷(16.45g，151.38mmol)。1.5小时之后，在室温下滴加异丁酰氯(5.38g，50.46mmol)。在室温下搅拌3小时之后，在0℃下用水(50mL)淬灭反应混合物，并且在0℃下滴加NH3-H2O(50mL)。浓缩反应混合物，并通过硅胶快速柱层析(DCM/MeOH＝10/1)纯化反应混合物，得到灰、白色固体状的化合物19b(5.28g)。ESI-MS:m/z368.1[M+1]+.
步骤4：制备化合物19c
在0℃下，向化合物19b(1g，2.72mmol)和1H-咪唑(315.04mg，4.63mmol)的DMF(15mL)溶液中加入TBSCl(656.46mg，4.36mmol)。在室温下搅拌4小时之后，用MeOH(27mL)淬灭反应混合物，并浓缩反应混合物以得到残余物。将残余物溶解在DCM(35mL)中，并浓缩，通过硅胶快速柱层析(DCM/MeOH＝20/1)纯化该残余物，得到白色固体状的化合物12c(1.19g)。ESI-MS:m/z482.2[M+1]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.02(d,J＝5.6Hz,1H),5.76(d,J＝4.4Hz,1H),4.55(t,J＝4.4Hz,1H),4.13(d,J＝3.2Hz,1H),3.93-3.80(m,2H),3.72(d,J＝9.6Hz,1H),3.37(s,3H),1.16(d,J＝6.8Hz,6H),0.81(s,9H),0.00(d,J＝2.4Hz,6H).
步骤5：制备化合物19d
在室温下，向化合物19c(1.19g，2.47mmol)的Py(12mL)溶液中加入4,4'-(氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(1.67g，4.94mmol)和DMAP(0.33g，2.72mmol)。在50℃下搅拌过夜之后，用水淬灭反应混合物，并用二氯甲烷对其进行萃取。合并有机层，合并的有机层用水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，并浓缩滤液。通过硅胶快速柱层析(二氯甲烷:甲醇＝20:1)纯化该残余物，得到白色固体状的化合物19d(1.37g)。
ESI-MS:m/z＝784.5[M+1]+.
步骤6：制备化合物19e
向化合物19d(1.37g，1.75mmol)的THF(5mL)溶液中加入四丁基氟化铵(7.86mL，7.86mmol)。在室温下搅拌2小时之后，反应混合物用乙酸乙酯稀释，并用水洗涤。然后合并有机层，合并的有机层用盐水洗涤，过滤，并浓缩以得到残余物。通过硅胶快速柱层析(DCM:MeOH＝20:1)纯化该残余物，得到白色固体状的化合物19e(1.01g)。ESI-MS:m/z＝670.1[M+1]+.
步骤7：制备化合物19f
在15℃下，向化合物19e(500mg，0.75mmol)和DIPEA(289.469mg，2.240mmol)的THF(1.88mL)溶液中加入3-((氯(二异丙基氨基)膦基)氧基)丙腈(530.10mg，2.240mmol)。在室温下搅拌1小时之后，将水加入到反应混合物中，然后用二氯甲烷对混合物进行萃取。合并有机层，合并的有机层用盐水洗涤，过滤，并浓缩以得到残余物。通过硅胶快速柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝1:2)纯化残余物，得到化合物19f(411mg)。ESI-MS:m/z＝787.1[M-N(Pi)2]+.
步骤8：制备化合物19g
在室温下，在氩气气氛下，将化合物17b(134.428mg，0.337mmol)和分子筛(2g)的CH3CN(10mL)溶液搅拌3分钟。加入1H-四唑(4.499mL，2.025mmol)。10分钟之后，在室温下，加入化合物19f(411mg，0.472mmol)的CH3CN(3.44mL)溶液。在26℃下搅拌1小时之后，将叔丁基过氧化氢(0.337mL，1.687mmol)加入到反应混合物中。在26℃下搅拌1小时之后，浓缩该混合物，得到化合物19g，该化合物用于下一步骤，无需进一步纯化。
步骤9：制备化合物19h
向化合物19g(239.55mg，0.202mmol)的水和二氯甲烷溶液中加入二氯乙酸(91.769mg，0.712mmol)。在室温下搅拌3小时之后，向反应混合物中加入三乙基硅烷(2mL)。然后加入吡啶(0.033mL，0.41mmol)。在室温下搅拌10分钟之后，浓缩反应混合物，并通过硅胶快速柱层析(DCM:MeOH＝10:1)纯化残余物，得到浅黄色固体状的化合物19h(136.8mg)。ESI-MS:m/z＝881.2[M+1]+.
步骤10：制备化合物19i
将化合物19h(136.8mg，0.155mmol)、1H-四唑(0.259mL，0.116mmol)、LiCl(32.926mg，0.777mmol)和分子筛的DCM(17.1mL)溶液在室温下搅拌2小时。加入二甲基二异丙基亚磷酰胺(31.513mg，0.163mmol)。在室温下搅拌过夜之后，反应混合物过滤，浓缩，并通过反相制备型HPLC(柱：Phenomenex Gemini C18 250x5010μm；条件：水(10mMNH4HCO3)(A)-CH3CN(B)；开始B：16；结束B：46；流速：22mL/min)纯化反应混合物，得到白色固体状的化合物19i(40.1mg)。ESI-MS:m/z878.3＝[M+1]+.
步骤11：制备化合物25
将化合物19i(10mg，0.011mmol)的EtOH甲胺(6mL)溶液在50℃下搅拌1天。然后浓缩反应混合物，并通过反相制备型HPLC(柱：DuraShell 150x25mm 5mm；条件：水(10mMNH4HCO3)(A)-CH3CN(B)；开始B：0；结束B：15；流速：35mL/min)纯化反应混合物，得到白色固体状的化合物25，铵盐(1.5mg)。31P NMR(162MHz,D2O)δ7.69,-1.28.
步骤12：制备化合物25
将一定体积的Dowex(50W x 8，200-400，H形式)(99mL)加入到烧杯中(用于74.9mg的化合物25，铵盐)，并用去离子水(2x)洗涤。然后向树脂中加入15％H2SO4的去离子水(50mL)溶液，将混合物搅拌15分钟，并滗析(1x)。将树脂转移到具有15％H2SO4去离子水溶液的柱中，并用15％H2SO4(至少4个柱体积(CV))洗涤，然后用去离子水洗涤，直到其pH为中性。将树脂转移回烧杯中，并且加入15％NaOH的去离子水溶液(50mL)，并且将混合物搅拌15分钟，并滗析(1x)。将树脂转移到柱中，并用15％NaOH的去离子水溶液(至少4CV)洗涤，并且然后用水洗涤直至其pH为中性(至少4CV)。将化合物25铵盐溶解在去离子水(25mL中74.9mg)中，加入到柱顶部，并且用去离子水洗脱。如通过TLC(UV)检测的，化合物25在早期馏分中洗脱出来。将产物冻干，得到化合物25钠盐(63.0mg)。ESI-MS:m/z＝689.9[M+1]+；1H NMR(400MHz,D2O)δ8.08-8.05(m,1H),7.97(s,1H),7.37-7.36(m,1H),6.41-6.33(m,1H),5.88(d,J＝8.0Hz,1H),5.64(d,J＝4.4Hz,1H),5.44-5.27(m,2H),4.48(d,J＝2.4Hz,1H),4.38-4.30(m,2H),4.20-4.11(m,2H),3.50(s,3H),3.46(d,J＝13.6Hz,1H),3.22-3.18(m,1H)；19FNMR(376MHz,D2O)-196.87(s,1F)；31P NMR(162MHz,D2O)7.80(s,1P),-1.22(s,1P).
实施例20
步骤1：制备20b
室温下，向20a(1g，1.49mmol)的THF(3.8mL)溶液和DIPEA(0.58g，4.48mmol)中加入3-((氯(二异丙基氨基)膦)氧基)丙腈(1.06g，4.48mmol)。在室温下搅拌混合物反应1.5小时后，加入水。用DCM(50mL)萃取有机层，用盐水洗涤并减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(DCM:MeOH＝1:0至20:1)纯化残余物，得到20b(1.35g)，为无色固体。ESI-MS：m/z＝787.2[M-83]+；31P NMR(162MHz,CDCl3)150.71(s,1P),150.48(s,1P),14.18(s,1P)。
步骤2：制备20c
将12h(700mg，1.76mmol)的CH3CN(50mL)溶液和4A分子筛(7g)在室温下和N2气氛下搅拌3分钟。然后加入1H-四唑(23.43mL，10.54mmol)。搅拌10分钟后，加入20b(2.06g，2.37mmol)的CH3CN(20mL)溶液。将混合物在室温下搅拌1.5小时，然后加入N,N-二甲基-N'-(3-硫代-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲脒(DDTT，1.81g，8.79mmol)。在室温下搅拌1小时后，过滤并减压浓缩反应混合物。通过硅胶快速柱色谱法(DCM:MeOH＝1:0至10:1)纯化残余物，得到13c黄色固体(2.1g)。ESI-MS:m/z＝1199.5[M+1]+。
步骤3：制备20d
在室温下，向20c(2.1g)的水(315.49mg，17.51mmol)和DCM(60mL)溶液中滴加二氯乙酸(790.316mg，6.129mmol)。加入Et3SiH(12mL)并在室温下搅拌48小时。加入吡啶(0.56mL，7.0mmol)。搅拌10分钟后，减压浓缩反应混合物，并且通过硅胶快速柱色谱法(DCM:MeOH＝1:0至10:1)纯化残余物，得到20d白色固体(901mg)。ESI-MS:m/z＝897.3[M+1]+。
步骤4：制备20e
向20d(500mg，0.56mmol)的DCM(60mL)溶液中加入4A分子筛(5g)、1H-四唑(0.93mL，0.42mmol)、LiCl(118.18mg，2.79mmol)，然后加入二甲基二异丙基亚磷酰胺(113.12mg，0.58mmol)。在室温下搅拌反应混合物72小时后，将混合物过滤并减压浓缩，得到粗20e(495mg)，将其直接用于下一步骤而无需进一步纯化。ESI-MS:m/z＝947.3[M+1]+。
步骤5：制备化合物26和化合物27
在室温下向20e(495mg，粗品)的EtOH(12mL)溶液中加入NH3·H2O(12mL)。在50℃下搅拌反应混合物3天后，将混合物过滤并通过反相制备HPLC纯化(柱：Agela DuraShell150mm×25mm×5μM；流动相：水(10mM NH4HCO3)-ACN，1％至16％，流速：25ml/min)，得到粗品26和27，为白色固体(220mg)。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.29(br s,1H),8.13(br s,1H),7.70(br s,1H),6.25(br d,J＝11.8Hz,1H),5.92-5.70(m,2H),5.24-4.99(m,1H),4.43-4.26(m,3H),4.20(br d,J＝10.8Hz,2H),4.06(br s,3H),3.49(s,2H),3.56-3.45(m,1H)；19FNMR(376MHz,D2O)-75.65(s,1F),-199.98(br s,1F)；31P NMR(162MHz,D2O)51.33(br s,1P),6.49(br s,1P)。
步骤6：制备化合物26和化合物27
通过反相制备型HPLC纯化先前的化合物26和化合物27的混合物(柱：PhenomenexSynergi C18，150×30mm×4μm；流动相：水(10mM NH4HCO3)-ACN，0％至15％，流速：25ml/min)，得到26铵盐(16.3mg)和27铵盐(50.1mg)，为白色固体。
步骤7：制备26钠盐
将20mL体积的Dowex 50W×8，200-400(H形式)加入烧杯(用于16.3mg 26)中并用去离子水(2x)洗涤。在去离子水(50mL)中向树脂中加入15％H2SO4，将混合物搅拌15分钟，并且滗析(1x)。将树脂转移到在去离子水中具有15％H2SO4的柱中，并且用15％H2SO4(至少4个柱体积(CV))洗涤，然后用去离子水洗涤直至pH中性。将树脂转移回烧杯中，并且加入15％NaOH的去离子水溶液(50mL)，并且将混合物搅拌15分钟，并滗析(1x)。将树脂转移到柱中，并用15％NaOH的去离子水溶液(至少4CV)洗涤，并且然后用水洗涤直至其pH为中性(至少4CV)。将化合物26铵盐溶于去离子水(16.3mg，20mL)中，加入柱顶部，并且用去离子水洗脱。如通过TLC(UV)检测的，化合物26在早期馏分中洗脱出来。将产物冻干，得到化合物26钠盐(8.5mg)。ESI-MS：m/z＝705.8；1H NMR(400MHz,D2O)δ8.50(s,1H),8.18(s,1H),7.78(s,1H),6.35(d,J＝13.6Hz,1H),5.94-5.80(m,2H),5.33-5.10(m,1H),4.45-4.35(m,2H),4.30-4.13(m,4H),4.09-4.01(m,2H),3.51(s,3H)；19F NMR(377MHz,D2O)δ-200.69(s,1F)；31P NMR(162MHz,D2O)δ53.89(s,1P),6.60(s,1P)。
步骤8：制备27钠盐
将50mL体积的Dowex 50W×8，200-400(H形式)加入烧杯(用于50.1mg27)中并用去离子水(2x)洗涤。在去离子水(50mL)中向树脂中加入15％H2SO4，将混合物搅拌15分钟，并且滗析(1x)。将树脂转移到在去离子水中具有15％H2SO4的柱中，并且用15％H2SO4(至少4个柱体积(CV))洗涤，然后用去离子水洗涤直至pH中性。将树脂转移回烧杯中，并且加入15％NaOH的去离子水溶液(50mL)，并且将混合物搅拌15分钟，并滗析(1x)。将树脂转移到柱中，并用15％NaOH的去离子水溶液(至少4CV)洗涤，并且然后用水洗涤直至其pH为中性(至少4CV)。将化合物27铵盐溶于去离子水(50.1mg，50mL)中，加入柱顶部，并且用去离子水洗脱。如通过TLC(UV)检测的，化合物27在早期馏分中洗脱出来。将产物冻干，得到化合物27钠盐(29mg)。ESI-MS：m/z＝705.8；1H NMR(400MHz,D2O)δ8.25-8.11(m,2H),7.80(s,1H),6.30(d,J＝13.8Hz,1H),5.85-5.73(m,2H),5.33-5.12(m,1H),4.51-4.42(m,2H),4.33-4.26(m,2H),4.22-4.11(m,2H),4.09-4.00(m,2H),3.50(s,3H)；19F NMR(377MHz,D2O)δ-200.70(s,1F)；31P NMR(162MHz,D2O)δ51.87(s,1P),6.53(s,1P)。
实施例21
步骤1：制备21a
在室温下，向12h(500mg，1.22mmol)的吡啶(6mL)溶液中滴加DMTrCl(0.638g，1.88mmol)。在室温下搅拌反应混合物4小时后，用CH2Cl2(30mL)稀释，并且用水淬灭。将反应混合物用CH2Cl2(20mL)萃取，将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝1:0至10:1)纯化残余物，得到21a，为黄色固体(933mg)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ9.10(s,1H),8.82-8.75(m,1H),8.78(s,1H),8.66-8.57(m,1H),8.23(s,1H),8.04(d,J＝7.3Hz,2H),7.72-7.59(m,2H),7.58-7.50(m,1H),7.58-7.50(m,1H),7.36(d,J＝7.0Hz,2H),7.26-7.23(m,4H),6.80(d,J＝8.3Hz,4H),6.26(dd,J＝1.6,18.4Hz,1H),5.99-5.82(m,1H),4.76-4.65(m,1H),4.35-4.29(m,1H),3.67-3.57(m,1H),3.37(dd,J＝3.6,11.2Hz,1H)；ESI-MS:m/z＝701.1[M+1]+。
步骤2：制备21b
将21a(933mg，1.105mmol)与作为催化剂的Pd/C(2.606g，2.210mmol)在EtOAc(130mL)中的混合物在室温(大气压)下氢化。2小时后，通过过滤去除催化剂，并且将滤液减压浓缩，得到残余物。通过硅胶快速柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝1:0至10:1)纯化残余物，得到21b，为白色固体(712mg)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ9.07(s,1H),8.80(s,1H),8.30(s,1H),8.07-7.99(m,2H),7.65-7.58(m,1H),7.56-7.50(m,2H),7.41-7.36(m,2H),7.30(d,J＝1.2Hz,2H),7.28-7.27(m,2H),7.25-7.17(m,2H),6.82-6.77(m,4H),6.30(d,J＝18Hz,1H),5.51-5.34(m,1H),4.13-4.00(m,2H),3.64-3.56(m,1H),3.44(dd,J＝3.6,10.8Hz,1H)；ESI-MS:m/z＝675.1[M+1]+。
步骤3：制备21c
将21b(300mg，0.445mmol)和5-苄基巯基四唑(BMT)(213.69mg，1.11mmol)的混合物与乙腈共沸三次并溶解在无水DMF(20mL)中。在室温下和N2下滴加19f(1.54g，1.78mmol)的DMF(4mL)溶液，并将反应混合物在室温下搅拌1小时。将氢化黄原素(133.60mg，0.89mmol)和吡啶(140.68mg，1.78mmol)加入到反应混合物中。在室温下搅拌1小时后，加入饱和NaHCO3水溶液(20mL)，并且用CH2Cl2(50mL)萃取混合物。然后合并有机层，依次用饱和NaHCO3水溶液(30mL)、盐水(50mL)洗涤，接着经Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(CH2Cl2/MeOH＝1/0至10/1)纯化残余物，得到21c(510mg)，为黄色油状物。ESI-MS:m/z＝1174.3[M+1]+。
步骤4：制备21d
在室温下，向21c(3.1g)的水(476.03mg，26.42mmol)和CH2Cl2(100mL)溶液中加入二氯乙酸(1.19g，9.248mmol，6％的DCM溶液)，然后加入三乙基硅烷(20mL)。在室温下搅拌24小时后，加入吡啶(0.85mL)。搅拌10分钟后，减压浓缩混合物，并且通过硅胶快速柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝1:0至10:1)纯化残余物，得到21d，为黄色固体(1.247g)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.67(d,J＝2.4Hz,1H),8.64(d,J＝4.2Hz,1H),8.19-8.14(m,1H),8.12-8.03(m,1H),8.12-8.03(m,3H),7.68-7.61(m,1H),7.59-7.51(m,2H),6.39(dd,J＝11.8,18.0Hz,1H),5.91-5.83(m,1H),5.91-5.83(m,1H),5.62-5.38(m,1H),4.71-4.51(m,2H),4.44-4.11(m,8H),4.09-3.96(m,2H),3.85-3.73(m,1H),3.85-3.73(m,1H),3.34(s,1H),1.22-1.17(m,7H)；ESI-MS:m/z＝1174.3[M+1]+。
步骤5：制备21e
将化合物21d(370mg，0.425mmol)与无水甲苯:乙腈(1:1，v/v，3×10mL)的混合物共蒸发。然后将所得残余物溶于CH3CN/THF(35mL，v/v＝7:3)中，随后加入分子筛(4g)和四唑(7.55mL，0.45M的CH3CN溶液)。在25℃下搅拌0.5小时后，将3-((双(二异丙基氨基)-膦)氧基)丙腈(204.91mg，0.68mmol)的CH3CN(10mL)加入上述溶液中。在25℃下搅拌混合物2小时，并将另外的四唑(1.88mL，0.45M的CH3CN溶液)加入上述溶液中。在25℃下搅拌混合物0.5小时后，将DDTT(436.20mg，2.14mmol)加入到溶液中。在25℃下搅拌混合物1.5小时后，过滤反应混合物，减压浓缩，并且通过硅胶快速柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝10:1)纯化，得到21e(436mg)。
步骤6：制备28至31
向21e(463mg，0.46mmol)的EtOH(20mL)溶液中加入NH3.H2O(20mL)。在50℃下搅拌所得溶液2天后，将混合物减压浓缩，得到化合物27，为非对映体的混合物。化合物27然后通过反相制备型HPLC(柱：Agela Durashell C18 150×25 5μM；流动相：水(0.05％氢氧化铵v/v)-CH3CN，0％至13％，流速：35ml/min)纯化，得到粗产物，该粗产物通过反相制备型HPLC(柱：Agela Durashell C18 150×25 5μM；流动相：水(0.05％氢氧化铵v/v)-ACN，0％至10％，流速：35ml/min)重新纯化，得到化合物28(10.6mg)、29(13.6mg)、30(8.3mg)和31(5.5mg)，为白色固体(铵盐)。28至31的LCMS-ESI-MS：m/z＝721.7[M+1]+。
步骤7：制备28，钠盐
将15mL体积的Dowex 50W×8，200-400(H形式)加入烧杯(用于10.6mg15铵盐)中并用去离子水(2x)洗涤。在去离子水(50mL)中向树脂中加入15％H2SO4，将混合物搅拌15分钟，并且滗析(1x)。将树脂转移到在去离子水中具有15％H2SO4的柱中，并且用15％H2SO4(至少4个柱体积(CV))洗涤，然后用去离子水洗涤直至pH中性。将树脂转移回烧杯中，并且加入15％NaOH的去离子水溶液(50mL)，并且将混合物搅拌15分钟，并滗析(1x)。将树脂转移到柱中，并用15％NaOH的去离子水溶液(至少4CV)洗涤，并且然后用水洗涤直至其pH为中性(至少4CV)。将化合物15铵盐溶于去离子水(10.6mg，15mL)中，加入柱顶部，并且用去离子水洗脱。如通过TLC(UV)所检测的，将所需产物在早期馏分中洗脱出来。将产物冻干，得到28钠盐(9.2mg)，为白色固体。ESI-MS：m/z＝721.7[M+1]+；1H NMR(400MHz,D2O)8.42(s,1H),8.16(s,1H),7.90(s,1H),6.34(d,J＝14.3Hz,1H),5.83(d,J＝8.8Hz,1H),5.70-5.47(m,2H),4.48(br d,J＝2.3Hz,1H),4.51-4.46(m,1H),4.39(br d,J＝11.8Hz,1H),4.27-4.18(m,3H),4.12-4.03(m,3H),3.49(s,3H)；19F NMR(376MHz,D2O)-122.38(br s,1F),-199.72(brs,1F)；31P NMR(162MHz,D2O)55.75(br s,1P),53.63(s,1P)。
步骤8：制备29，钠盐
按照与步骤7相同的程序(制备28，钠盐)，将化合物29钠盐(12mg)制备为白色固体；ESI-MS：m/z＝721.7[M+1]+；1H NMR(400MHz,D2O)8.46(br s,1H),8.17(s,1H),7.77(s,1H),6.32(d,J＝13.8Hz,1H),5.90-5.78(m,2H),5.30-5.11(m,1H),4.47(br s,1H),4.43-4.35(m,1H),4.32-4.18(m,4H),4.08-3.95(m,2H),3.49(s,3H)；19F NMR(376MHz,D2O)-122.77(br s,1F),-199.68(br s,1F)；31P NMR(162MHz,D2O)56.01(s,1P),53.31(br s,1P)。
步骤9：制备30，钠盐
按照与步骤7相同的程序(制备28，钠盐)，将化合物30钠盐(7.2mg)制备为白色固体。ESI-MS:m/z＝721.7[M+1]+；1H NMR(400MHz,D2O)8.17(s,1H),8.08(s,1H),7.97(s,1H),6.34-6.26(m,1H),5.82(d,J＝8.8Hz,1H),5.67-5.44(m,2H),4.51(br s,1H),4.46-4.38(m,1H),4.34(br d,J＝4.3Hz,1H),4.24(br d,J＝10.5Hz,1H),4.16-3.99(m,4H),3.47(s,3H)；19F NMR(376MHz,D2O)-122.35(s,1F),-199.36(br s,1F)；31P NMR(162MHz,D2O)56.00-55.06(m,1P),51.89(s,1P)。
步骤10：制备31，钠盐
按照与步骤7相同的程序(制备28，钠盐)，将化合物31钠盐(4.5mg)制备为白色固体。ESI-MS:m/z＝721.7[M+1]+；1H NMR(400MHz,D2O)8.16(d,J＝3.0Hz,2H),7.77(s,1H),6.29(d,J＝13.8Hz,1H),5.81-5.76(m,1H),5.73-5.65(m,1H),5.35-5.17(m,1H),4.50(brs,1H),4.43(br d,J＝12.0Hz,1H),4.35-4.22(m,4H),4.08(dd,J＝3.3,11.8Hz,1H),3.97(dd,J＝2.4,11.9Hz,1H),3.46(s,3H)；19F NMR(376MHz,D2O)-122.24(s,1F),-199.92(s,1F)；31P NMR(162MHz,D2O)55.73(s,1P),51.80(s,1P)。
实施例22
步骤1：制备化合物8b
在室温下，向化合物8a(30g，111.428mmol)的吡啶(400mL)溶液滴加TMSCl(84.85mL，668.57mmol)。在搅拌混合物40分钟后，在室温下滴加苯甲酰氯(46.99g，334.28mmol)。在室温下搅拌过夜后，将混合物过滤，并且在0℃下用水(120mL)淬灭滤液，然后在0℃下逐滴加入NH3.H2O(120mL)。在15℃下搅拌混合物0.5小时后，减压浓缩混合物，并且用乙酸乙酯(600mL)稀释残余物。通过过滤收集固体，得到8b(70g)，将其直接用于下一步骤而无需进一步纯化。
步骤2：制备化合物8c
向化合物8b(30g，80.35mmol)的吡啶(250mL)溶液中添加4,4’-二甲氧三苯甲基氯(54.45g，160.71mmol)。在室温下搅拌3小时后，加入EtOAc(1L)并过滤混合物。将有机层依次用盐水(300mL×3)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(MeOH溶于DCM＝0％至5％)纯化该残余物，得到化合物8c(31.2g)，为白色固体。ESI-MS：m/z676.3[M+H]+。
步骤3：制备化合物8d
在室温下和N2下，向化合物8c(31.2g，46.17mmol)和1H-咪唑(9.43g，138.52mmol)的DMF(500mL)溶液中添加叔丁基氯二甲基硅烷(13.92g，92.35mmol)。在室温下搅拌反应混合物3小时后，用水(1000mL)淬灭混合物并用EtOAc(400mL×3)萃取。然后将合并的有机层依次经无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液浓缩，得到粗产物，为黄色油状物。通过硅胶快速柱色谱法(MeOH溶于DCM＝0％至5％)纯化该残余物，得到8d(29g)，为黄色固体。ESI-MS:m/z790.4[M+H]+。
步骤4：制备化合物8e
向化合物8d(29g，36.71mmol)的DCM(160mL)溶液中加入DCM(320mL)，然后在0℃下加入TFA(8mL)和Et3SiH(32mL)。在0℃下搅拌0.5小时，然后在25℃下搅拌4小时后，将反应混合物减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(MeOH溶于DCM＝0％至5％)纯化所得残余物，得到8e(11.5g，21.60mmol)，为白色固体。ESI-MS:m/z488.2[M+H]+。
步骤5：制备化合物8f
在25℃下，向化合物8e(11.5g，23.58mmol)和1,3-二环己基碳二亚胺(19.46g，94.34mmol)的DMSO(80mL)溶液中加入吡啶(2.65g，33.49mmol)和三氟乙酸(2.01g，17.69mmol)。在25℃下搅拌混合物17小时后，将反应混合物用EtOAc(400mL)和水(200mL)稀释。将有机层依次用盐水(100mL×2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并将滤液减压浓缩，得到8f(11.45g，23.58mmol)，将其用于下一步骤而不作任何进一步纯化。ESI-MS：m/z518.1[M+33]+。
步骤6：制备化合物22b
在0℃下，向化合物22a(6.39g，27.52mmol)的THF(75mL)溶液中添加60％NaH(1.43g，35.78mmol)。在0℃下搅拌混合物0.5小时后，在0℃下滴加化合物8f(11.45g，23.58mmol)的THF(75mL)溶液。在0℃下搅拌1小时，然后在25℃下搅拌2小时后，用饱和NH4Cl水溶液(100mL)稀释反应混合物并用EtOAc(150mL×2)萃取。然后将有机层合并，依次用盐水(130mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(MeOH溶于DCM＝0％至5％)纯化该残余物，得到22b(6.1g)，为黄色固体。ESI-MS:m/z592.1[M+H]+。
步骤7：制备化合物22c
将化合物22b(1.1g，1.86mmol)和铂(IV)氧化物(0.33g，1.48mmol)的EtOH(30ml)溶液在氢气气氛(15Psi)下在室温下搅拌过夜。然后过滤混合物，并将滤液减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(DCM/MeOH＝20/1)纯化残余物，得到22c(0.8g)，为黄色固体。ESI-MS:m/z594.1[M+H]+。
步骤8：制备化合物22d
将LiBr的THF溶液(30.32mL，0.5M THF溶液)在25℃下加入22c(3g，5.05mmol)中。在50℃下搅拌混合物48小时后，加入CH3CN(30mL)、水(60mL)和1MHCl水溶液(10mL)。然后冻干混合物。通过硅胶快速柱色谱法(MeOH溶于DCM＝0％至15％)纯化该残余物，得到22d(2.4g)，为黄色固体。ESI-MS：m/z＝580.1[M+1]+。
步骤9：制备化合物22e
将化合物22d(1.8g，3.105mmol)和化合物20a(2.49g，3.72mmol)的混合物与30mL干燥吡啶(3x)共沸。将所得混合物用无水DCM/THF(80mL，1:1，v/v)稀释，然后加入分子筛(200mg)、NMI(3.06g，37.26mmol)和TPSCl(2.82g，9.31mmol)。将所得溶液在氮气气氛下于25℃下搅拌48小时。用饱和NaHCO3水溶液(100mL)淬灭该反应物然后过滤。用DCM(80mL×3)萃取滤液；然后合并有机层，经无水MgSO4干燥，过滤并减压浓缩滤液。通过硅胶快速柱色谱法(MeOH溶于DCM＝0％至10％)纯化该残余物，得到粗产物，为黄色固体(3g)。通过反相制备型HPLC纯化粗产物(柱：Phenomenex Gemini 250×50mm×10μm；条件：H2O(10mM NH4HCO3)(A)-CH3CN(B)；开始B：55；结束B：85；流速：110mL/min)，得到22e(1.01g)，为白色固体。ESI-MS：m/z1231.7[M+H]+。1H NMR(CD3CNd3,400MHz)δ11.73-12.00(m,1H),9.69(br s,1H),9.34(br s,1H),8.53(br s,1H),8.10(s,1H),7.81-7.94(m,2H),7.70(d,J＝9.3Hz,1H),7.36-7.53(m,3H),7.24(br d,J＝7.7Hz,2H),7.01-7.15(m,7H),6.60-6.69(m,4H),5.97-6.16(m,1H),5.79-5.88(m,1H),5.24-5.56(m,2H),4.46-4.68(m,1H),3.99-4.11(m,2H),3.81-3.97(m,1H),3.59(s,6H),3.39(s,1H),3.34-3.37(m,1H),3.36(s,1H),3.27(s,1H),3.17(s,3H),2.36-2.55(m,1H),0.91-1.01(m,6H),0.77-0.82(m,9H),-0.12-0.08ppm(m,6H)。
步骤10：制备化合物22f
在25℃下，向化合物22e(400mg，0.325mmol)的THF(4mL)溶液中添加1M TBAF的THF(0.975mL，0.975mmol)溶液。在25℃下搅拌混合物2小时，然后用乙酸乙酯(20mL)和水(15mL)稀释。将混合物用乙酸乙酯(20mL×2)萃取。然后将有机层合并，依次用盐水(50mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(MeOH溶于DCM＝0％至5％)纯化该残余物，得到22f(325mg)，为黄色固体。ESI-MS:m/z1117.3[M+H]+。
步骤11：制备化合物22g
向化合物22f(325mg，0.29mmol)的DCM(4mL)溶液中添加水(52.37mg，2.93mmol)和6％DCA的DCM(4mL)溶液。将混合物在25℃下搅拌1小时。然后向混合物中加入吡啶，直至红色反应混合物变为无色。减压浓缩反应混合物。通过硅胶快速柱色谱法(MeOH溶于DCM＝0％至15％)纯化该残余物，得到22g(180mg)，为白色固体。ESI-MS:m/z815.1[M+H]+。
步骤12：制备化合物22i
向化合物22g(180mg，0.22mmol)的CH3CN/THF(21.6mL，v/v＝1:1)溶液中加入分子筛(500mg)和四唑(3.96mL，0.45M CH3CN溶液)。在25℃下搅拌反应混合物0.5小时后，滴加3-((双(二异丙基氨基)-膦)氧基)丙腈(133.18mg，0.44mmol)的CH3CN(1.8mL)溶液。在25℃下搅拌混合物2小时，并将另外的四唑(1mL，0.45M的CH3CN溶液)加入上述溶液中。将混合物在25℃下搅拌0.5小时，得到化合物22h。然后加入Beaucage试剂(3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物，221.19mg，1.105mmol)。将混合物在25℃下搅拌0.5小时然后过滤。将滤液减压浓缩得到22i(250mg粗品)。
ESI-MS:m/z946.3[M+H]+。
步骤13：制备化合物32
向化合物22i(80mg，0.085mmol)的EtOH(5mL)溶液中加入NH3.H2O(5mL)。在50℃下搅拌混合物48小时后，过滤反应混合物，并减压浓缩滤液。通过反相制备型HPLC(柱：Synergi 4μm，Hydro RP，250mm×30mm，流动相：缓冲液A:50mM三乙基乙酸铵的H2O溶液；缓冲液B:50mM三乙基乙酸铵的CH3CN溶液，梯度：0-30％的B，经过30分钟，流速24mL/min)纯化残余物，然后通过反相制备型HPLC进行2次纯化(Kinetex 5μm，100A；250×21.2mm，缓冲液A：0.1％甲酸H2O溶液，缓冲液B：0.1％甲酸的MeCN溶液；流速：15mL/min，30分钟内缓冲液B的梯度0-30％)，得到化合物32(6.9mg)，为白色固体。ESI-MS:m/z:703.00[M-1]-。ESI-MS:m/z705.10[M+H]+。
制备化合物32，钠盐
将Dowex 50 W×8，200-400(5mL，H形式)加入到烧杯中并用去离子水(30mL)洗涤。然后在去离子水中向树脂中加入15％H2SO4，将混合物轻轻搅拌5分钟，然后滗析(30mL)。将树脂转移到在去离子水中具有15％H2SO4的柱中，并且用15％H2SO4(至少4个柱体积)洗涤，然后用去离子水洗涤直至中性。将树脂移回烧杯中，并且加入15％NaOH在去离子水溶液中，并且将混合物轻轻搅拌5分钟，并且滗析(1x)。将树脂转移到柱中并用15％NaOH水溶液(至少4个柱体积)洗涤，然后用去离子水洗涤直至中性。将化合物32三乙基铵盐(6.9mg)溶于最小量的去离子水中，加入柱顶部，并且用去离子水洗脱。将级分合并并冻干，得到化合物32钠盐(6.1mg)，为白色固体(包含约20％或杂质或具有相同分子量的其他异构体—主要产物的分析数据)。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.08(s,1H),8.00(s,1H),7.92(s,1H),6.22(d,1H),5.79-5.85(m,1H),5.53-5.70(m,1H),4.73-5.13(m,3H),4.45-4.50(m,1H),4.21-4.35(m,1H),3.40-4.19(m,4H),3.45(s,3H),1.78-1.90(m,2H),1.60-1.70(m,2H)；31P NMR(162MHz,D2O)δ54.66(PS峰),25.13(1.0,膦酸酯)；19F NMR(379MHz,D2O)δ-199.48(m)；ESI-MS:m/z:ESI-MS:703.00[M-1]-。ESI-MS:m/z705.10[M+H]+。
实施例23
步骤1：制备23a
在N2下向化合物19c(1g，2.02mmol)的DCM(20mL)溶液中添加戴斯马丁氧化剂(1.45g，3.43mmol)。在室温下搅拌反应混合物16小时后，加入含有Na2S2O3(3g)的饱和NaHCO3水溶液(20mL)并将混合物搅拌0.5小时。分离有机层并用饱和NaHCO3水溶液(20mL)洗涤。然后合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(梯度洗脱液：EtOAc/石油醚为0/100至1/0)纯化残余物，得到23a(1g)，为白色固体。ESI-MS:m/z＝498.1[M+H2O]+
步骤2：制备23b
向0℃预冷却的23a的乙醇(10mL)溶液中加入NaBH4(0.14g，3.63mmol)。在0℃下搅拌反应混合物10分钟，然后在室温下搅拌30分钟，再用EtOAc(20mL)和盐水(10mL)稀释。将水层用EtOAc(10mL)萃取。然后合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(梯度洗脱液：EtOAc/石油醚为0/100至1/1)纯化残余物，得到23b(300mg)以及回收的23a(200mg)，为白色固体。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm12.07(s,1H)11.71(s,1H)8.00(s,1H)6.06(d,J＝4.85Hz,1H)5.85(d,J＝5.29Hz,1H)4.24-4.34(m,1H)3.76-3.93(m,4H)3.40(s,3H)2.76(quin,J＝6.84Hz,1H)1.12(d,J＝6.84Hz,6H)0.90(s,9H)0.04-0.13(m,6H)；ESI-MS：m/z＝482.1[M+1]+。
步骤3：制备23c
向化合物23b(120mg，0.22mmol)的吡啶(4mL)溶液和DIEA(87.96mg，0.68mmol)中加入二苯基氨基甲酰氯(105.11mg，0.45mmol)。在25℃下搅拌1小时后，减压浓缩反应混合物。通过硅胶快速柱色谱法(梯度洗脱液：EtOAc/石油醚为0/100至1/0)纯化残余物，得到23c(110mg)，为白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3-d)δppm8.32(s,1H)7.96(s,1H)7.31-7.51(m,8H)7.25(brs,2H)6.21(d,J＝3.01Hz,1H)4.90(d,J＝9.54Hz,1H)4.37(br d,J＝9.03Hz,1H)4.14(d,J＝2.26Hz,1H)3.98(s,1H)3.94(d,J＝3.01Hz,1H)3.92-3.99(m,1H)3.82(dd,J＝11.17,2.38Hz,1H)3.50(s,3H)2.93(br s,1H)1.27(d,J＝6.78Hz,6H)0.93(s,9H)0.14(s,6H)；ESI-MS:m/z＝699.6[M+Na]+。
步骤4：制备23d
在0℃下，向化合物23c(200mg，0.28mmol)的吡啶(5mL)溶液中添加Tf2O(606.11mg，2.14mmol)。在0-5℃下搅拌3小时后，用DCM(10mL)稀释该反应混合物，并用盐水(5mL×1)洗涤。分离各相，用DCM(10mL×2)萃取水层。然后合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(梯度洗脱液：EtOAc/石油醚为0/100至1/1)纯化残余物，得到23d(250mg)，为白色固体。ESI-MS:m/z＝831.2[M+Na]+
步骤5：制备23e
向化合物23d(610mg，0.75mmol)的DMF(15mL)溶液添加叠氮化钠(814mg，7.06mmol)。将混合物在25℃下搅拌16小时后，用DCM(100mL)稀释，并用饱和NaHCO3水溶液(50mL)和盐水(50mL)洗涤。然后合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(梯度洗脱液：EtOAc/石油醚为0/100至1/00)纯化油状残余物，得到23e(500mg)，为白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm12.12(s,1H)11.68(s,1H)8.21(s,1H)5.91(d,J＝4.63Hz,1H)4.87(t,J＝4.96Hz,1H)4.26(brt,J＝5.07Hz,1H)4.08(br d,J＝4.41Hz,1H)3.86(br dd,J＝11.47,4.19Hz,1H)3.71-3.81(m,1H)3.46(s,3H)2.77-2.82(m,1H)1.12(d,J＝6.84Hz,6H)0.87(s,9H)0.06(s,6H)；ESI-MS：m/z＝507.2[M+1]+。
步骤6：制备23f
在0℃下，向化合物23e(450mg，0.84mmol)的THF(10mL)溶液添加TBAF(1.52mL，1.52mmol，1M THF溶液)。在室温下搅拌4小时后，减压浓缩混合物，得到油状物。将油状物溶于DMCM(50mL)并用盐水(20mL)洗涤。分离各相，用CDM(20mL×2)萃取水相。然后合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，并将滤液减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(梯度洗脱液：DCM/MeOH为1/0至100/7)纯化残余物，得到23f(220mg)，为白色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3-d)δppm12.13(br s,1H)8.57(br s,1H)7.81(s,1H)5.84(d,J＝7.72Hz,1H)5.08(br s,1H)4.59(dd,J＝7.50,5.29Hz,1H)4.33(d,J＝1.76Hz,1H)4.20(dd,J＝5.29,1.98Hz,1H)4.03(dd,J＝12.46,2.09Hz,1H)3.76(br s,1H)3.56(s,3H)2.61-2.76(m,1H)1.27-1.35(m,6H)；ESI-MS:m/z＝415.0[M+Na]+
步骤7：制备23h
将化合物23f(220mg，0.56mmol)和分子筛(3g)的CH3CN(18mL)溶液在室温下和N2气氛下搅拌3分钟。逐滴加入1H-四唑(7.48mL，3.36mmol，0.45M CH3CN溶液)。搅拌10分钟后，滴加化合物23g的CH3CN(4mL)溶液。在室温下搅拌混合物1小时后，加入叔丁基过氧化氢(0.56mL，2.80mmol，5M癸烷溶液)。在室温下搅拌混合物1小时后，将混合物过滤并减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(梯度洗脱液：DCM:MeOH＝1:0至10:1)纯化残余物，得到23h(950mg，粗产物)，为白色固体，将其直接用于下一步骤而无需进一步纯化。ESI-MS:m/z＝1183.5[M+1]+
步骤8：制备23i
在室温下向化合物23h(950mg，粗产物)的DCM(15mL)和水(68.83mg，3.82mmol)的溶液中加入二氯乙酸(172.57mg，1.33mmol)，然后加入三乙基硅烷(3.5mL)。在室温下搅拌2小时后，加入吡啶(121mg，1.53mmol)，并且将混合物在室温下搅拌10分钟，然后减压浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(梯度洗脱液：DCM:MeOH＝1:0至10:1)纯化残余物，得到23i(570mg)，为白色固体。1H NMR(400MHz,CD3OD-d4)δppm8.57-8.74(m,2H)8.04-8.16(m,3H)7.66(d,J＝6.61Hz,1H)7.53-7.61(m,2H)6.38-6.53(m,1H)5.90-6.06(m,1H)4.53(br d,J＝5.51Hz,2H)4.40-4.46(m,1H)4.31-4.40(m,4H)3.92(br d,J＝13.23Hz,1H)3.73-3.83(m,1H)3.58(d,J＝11.69Hz,3H)2.70-2.79(m,1H)1.21(dd,J＝6.84,2.43Hz,6H)；ESI-MS:m/z＝881.4[M+1]+
步骤9：制备23j
向化合物23i(470mg，0.39mmol)、1H-四唑(0.66mL，0.3mmol，0.45M的CH3CN溶液)、LiCl(84.23mg，1.98mmol)和分子筛(2g)的DCM(60mL)溶液中加入二甲基N,N-二异丙基亚磷酰胺(94.50mg，0.48mmol)。将反应混合物在室温下搅拌72小时，过滤并减压浓缩，得到23j(400mg，粗产物)，为白色固体，将其直接用于下一步骤而无需进一步纯化。ESI-MS:m/z＝931.1[M+1]+
步骤10：制备化合物33
在室温下向化合物23j(400mg，粗产物)的EtOH(15mL)溶液中加入NH3.H2O(15mL)。在50℃下搅拌3天后，将反应混合物过滤，并将滤液减压浓缩至干。通过反相制备型HPLC(柱：Synergi 4μm，Hydro RP，250mm×30mm，流动相：缓冲液A:50mM三乙基乙酸铵的H2O溶液；缓冲液B：50mM三乙基乙酸铵的CH3CN溶液，梯度：0-30％的B，经过30分钟，流速24mL/min)纯化残余物，得到化合物33(24.5mg)。通过反相制备型HPLC(Synergi 4μm，Hydro RP，250mm×30mm，缓冲液A：0.1％甲酸的H2O溶液，缓冲液B：0.1％甲酸的MeCN溶液；流速：15mL/min，30分钟内缓冲液B的梯度0-30％)进一步纯化化合物33，得到化合物33三乙基铵盐(16.3mg)。
化合物33的钠盐交换：
将Dowex 50 W×8，200-400(5mL，H形式)加入到烧杯中并用去离子水(30mL)洗涤。然后在去离子水中向树脂中加入15％H2SO4，将混合物轻轻搅拌5分钟，然后滗析(30mL)。将树脂转移到在去离子水中具有15％H2SO4的柱中，并且用15％H2SO4(至少4个柱体积)洗涤，然后用去离子水洗涤直至树脂为中性。将树脂转移回烧杯中，并且加入15％NaOH在去离子水溶液中，并且将混合物轻轻搅拌5分钟，然后滗析。将树脂转移到柱中并用15％NaOH水溶液(至少4个柱体积)洗涤，然后用去离子水洗涤直至中性。将化合物33三乙基铵盐(16.3mg)溶于最小量的去离子水中，加入柱顶部，并且用去离子水洗脱。将级分合并并冻干，得到化合物33钠盐(15.4mg)，为白色固体。1H NMR(400MHz,D2O)δppm8.21(s,1H),8.15(s,1H),7.66(s,1H),6.22(d,1H),5.49(d,1H),5.20-5.36(d,1H),4.88(d,1H),4.30-4.37(m,3H),4.06-4.12(m,2H),3.80-3.90(m,2H),3.42(s,3H)；31P NMR(162MHz,D2O):δ4.23(酰胺化物),-1.32(磷酸盐)；19F NMR(379MHz,D2O):δ-201.958(m)；
ESI-MS:m/z:ESI-MS:m/z:687.70[M-1]-。ESI-MS:m/z690.10[M+H]+。
生物学实施例
体外测试
STING SPA结合测定
人STING SPA结合测定法测量标记为2',3'cGAMP(环状(鸟苷-(2'—>5')-单磷酸-腺苷-(3'—>5')-单磷酸)的氚向生物素化STING蛋白的位移。重组STING的可溶性型式在缺乏四个跨膜结构域的大肠杆菌中表达，并且包含在232位(H232R)处具有R的Q86WV6的残基139-379。基于58％的群体的等位基因频率，H232R被认为是野生型(Yi等人的“人STING的单核苷酸多态性可影响对环状二核苷酸的先天性免疫应答(Single NucleotidePolymorphisms of Human STING can affect innate immune response to cyclicdinucleotides)”《公共科学图书馆(PLOS ONE)》，2013,8(10),e77846)。STING构建体具有N末端HIS标签，随后为TEV蛋白酶裂解位点和AVI标签，以允许通过BirA生物素连接酶进行定向生物素酰化(Beckett等人的生物素全酶合成酶催化的生物素酰化中的最小肽底物(Aminimal peptide substrate in biotin holoenzyme synthetase-catalyzedbiotinylation)，(1999)《蛋白质科学(Protein Science)》8,921-929)。在纯化之后和在生物素酰化之前裂解HIS标签。
通过在测定缓冲液中加入8nM[3H]-2’3’-cGAMP和40nM生物素-STING蛋白，在1536孔板中以每孔8μL的总体积进行测定[25mM HEPES(Corning 25-060-C1)pH7.5，150mM NaCl(Sigma S5150)，0.5mg/mL BSA(Gibco 15260-037)，0.001％ Tween-20(Sigma P7949)，分子级水(Corning 46-000-CM)]。用声学分配器(EDC生物系统)在100％DMSO中加入测试化合物(80mL)，最终测定浓度为1％DMSO。将平板离心1分钟，并且在室温下温育60分钟。最后，加入(2μL)聚苯乙烯链霉亲和素SPA珠粒(PerkinElmer RPNQ0306)，密封板并在室温下离心1分钟。使平板暗适应2小时，并且在ViewLux(Perkin Elmer)上读取12分钟/平板。[3H]-2’3’-cGAMP的饱和结合曲线显示与STING结合的KD为3.6±0.3nM，与天然配体的报告值相当(Zhang等人的包含混合磷酸二酯键的环状GMP-AMP为STING的内源性高亲和力配体)。
包括环状di-GMP的其它天然配体也在该测定中返回预期范围内的值。参考化合物为cGAMP，结果以抑制百分比和IC50值报告。与小鼠STING的结合使用一种类似于上述包含Q3TBT3的残基138-378的构建体。
全长人STING结合测定
在HEK293-EXPI细胞中重组表达来自在232位(H232R)处具有R的Q86WV6的残基1-379的人STING，该232位具有H232RN末端6HIS标签，随后为FLAG标签、TEV蛋白酶裂解位点和用于生物素酰化HEK293的AVI标签。由这些细胞制备纯化的膜，并通过免疫印迹来确认和量化STING表达。将包含STING的膜与测试化合物在Greiner 384孔测定板中混合，并且在室温下在用于STING SPA结合测定的同一测定缓冲液中温育一小时。接着，加入[3H]-2’3’-cGAMP，并且将平板在室温下温育30分钟。将反应转移至预洗涤的Pall 5073滤板上，并且将每个孔用50μL测定缓冲液洗涤3次。将滤板在50℃下干燥1小时。向每个孔中加入10μLMicroscint闪烁流体，密封板并在TopCount(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))上读取1分钟/孔。
STING SPR结合测定
在S200 biacore SPR仪器(通用电气医疗集团(GE Healthcare))上分析化合物。经由生物素捕获(GE Healthcare #BR100531)将大肠杆菌产生的截短的STING蛋白固定在S系列链霉亲和素芯片上。在运行缓冲液(10mM HEPES，pH7.4,150mM NaCl，0.005％ P20,1mMTECEP)中以100μM至0.195μM的1:2稀释度筛选化合物。使用1:1结合模型进行稳态亲和力和动力学评估(STING被视为二聚体)。运行参数如下：IFM化合物60秒开，300秒关，环状二聚GMP(60秒开/60秒关)，硫醇异构体1(60秒开/300秒关)和cGAMP(60秒开/1200秒关)，其流速为50μL/min且数据采集频率为40Hz，温度为25℃。
STING人细胞报告基因测定
通过干扰素调节因子(IRF)诱导型SEAP报告构建体的稳定整合，在来源于人THP1单核细胞系的THP1-ISG细胞(Invivogen,cat#thp-isg)中评估人STING途径的激动。THP1-Blue ISG细胞在ISG54最小启动子的控制下与五个干扰素(IFN)刺激的应答元件联合表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因。因此，THP1-Blue ISG细胞允许通过确定SEAP的活性来监测IRF活化。用碱性磷酸酶检测介质(即SEAP检测试剂)容易地评估细胞培养上清液中IRF诱导的SEAP的水平。这些细胞对Zeocin具有抗性。2’3’cGAMP在本测定中用作阳性对照。为了进行测定，将60,000个细胞以30μL/孔分配到白色不透明的底部组织培养物处理过的384孔板中。
以10μL(1％DMSO最终浓度)的体积加入测试化合物。最初在100％DMSO中制备化合物，点样在中间稀释板上，标签然后在转移前在培养基中稀释。将分析物在37℃、5％CO2下温育24小时，然后将平板以1200rpm(120xg)离心5分钟。在最终温育之后，将90μL碱性磷酸酶检测培养基-底物加入新的384孔透明板的每个孔中，并且使用Biomek FX将10μL细胞上清液从测定板转移至新的碱性磷酸酶检测培养基平板上，并混合4次。将平板在室温下温育20分钟，然后在Tecan Safire2上测定655nm处的吸光度。
STING小鼠细胞报告基因测定
通过稳定整合干扰素诱导型Lucia荧光素酶报告构建体，在来源于小鼠RAW 264.7巨噬细胞系的RAW Lucia细胞(Invivogen,cat#rawl-isg)中评估小鼠STING途径的激动。RAWLucia细胞在ISG54最小启动子的控制下与五种干扰素(IFN)刺激的应答元件联合表达分泌的荧光素酶报告基因。因此，RAWLucia细胞允许通过确定荧光素酶的活性来监测IRF活化。用荧光素酶检测试剂QUANTI-LucTM容易地评估细胞培养上清液中IRF诱导的荧光素酶水平。这些细胞对Zeocin具有抗性。2’3’cGAMP在本测定中用作阳性对照。为了进行测定，将100,000个细胞以90μL/孔分配到透明平底组织培养物处理过的96孔板中。以10μL的体积加入测试化合物。将该测定在37℃、5％CO2下温育24小时和48小时。温育后，将来自测定板的20μL细胞上清液转移至新的96uL孔白板上，并且加入50uL QUANTI-Luc底物。将平板在室温下温育，摇动5分钟，然后在EnVision 2104上以0.1秒的积分时间读取发光。
人干扰素β诱导测定
THP1-Blue ISG细胞用于测量在STING途径激活后IFN-β向培养上清液中的分泌。为了进行该测定，将抗IFN-β捕获抗体涂在96孔多阵列板(Mesoscale Discovery)上。温育一小时后，洗涤平板，并且将来自STING人细胞报告基因测定平板或IFN-β标准物的50μL上清液与涂布板中的20μL磺基标签缀合检测抗体混合。将平板温育，振荡2小时，洗涤，并且施用读缓冲液。在SectorImager上测量电化学发光。
STING细胞信号传导途径评估
通过磷酸化STING(S366)、磷酸化TBK1(S172)和磷酸化IRF3(S396)的蛋白质印迹在THP1 BLUE ISG细胞中测量STING途径的激动。简而言之，将90μL核转染缓冲液中的5百万个细胞与10μL测试化合物混合。将这些混合物使用程序V-001在Amaxa Nucleofector(瑞士龙沙集团(Lonza))上电穿孔。将细胞转移到具有新鲜培养基的12孔板中，并使其在37℃，5％CO2下回收一小时。然后将细胞在冷HBSS中洗涤并溶于RIPA缓冲液中。将样品进行总蛋白归一化，并且在蛋白质简单样品缓冲液或LDS加载缓冲液中稀释。样品在95℃下热变性5分钟，然后使用PeggySue(ProteinSimple)测量磷酸和总STING和IRF3，同时使用NuPAGE(Invitrogen)系统测量TBK1。分别使用Compass或Licor Odsey软件分析数据。
STING体内活性
就所有研究而言，雌性Balb/c小鼠得自查尔斯河实验室(Charles River Labs)(马萨诸塞州威尔明顿(Wilmington，MA))，并且当它们在6至8周龄时使用且体重大约20g。在实验使用之前，允许所有动物适应环境并从任何与运输相关的压力中恢复至少5天。随意提供反渗透氯化水和经照射的食物(实验室可高压灭菌的啮齿动物饮食5010，实验室饮食)，并且将动物在12小时光照和黑暗循环中保持不变。使用前对笼子和寝具进行高压消毒，标签每周更换一次。所有实验都根据《实验室动物护理和使用指南(The Guide for theCare and Use of Laboratory Animals)》进行，并得到了宾夕法尼亚州春天之家JanssenR & D机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee ofJanssen R & D,Spring House,PA)的批准。每个实验组包含8只小鼠。通过将500,000个CT26结肠癌肿瘤细胞皮下植入Balb/c小鼠并使肿瘤建立到100mm3至300mm3来确定小鼠CT26肿瘤模型的体内功效。将化合物以0.1mL/注射的体积在磷酸盐缓冲盐水中在瘤内注射配制。每三天给小鼠施用0.05mg，总共三剂。当所有对照动物仍在研究时，如根据下式：((C-T)/(C))*100，通过治疗肿瘤体积(T)相对于对照肿瘤体积(C)的尺寸减小而计算出的肿瘤生长抑制百分比(TGI)来测量功效。将治愈定义为在施用最后一剂后，检测到在10个肿瘤体积倍增时间(TVDT)下没有可测量肿瘤的动物数量。所得数据示于表3中。
表3.
ND：未完成
体内活性测定
通过将MC38细胞植入C57BL/6小鼠或将CT26细胞植入Balb/c小鼠的右翼并允许肿瘤建立至约100-200mm3的尺寸，可以在动物模型中评估活性。肿瘤可以用载体(PBS或HBSS)或肿瘤内测试化合物注射，每次注射体积为100μL。每个治疗组可以具有7至8只小鼠，并且可以每三天施用治疗，总共3个剂量(q3dx3)。可以用卡尺测量肿瘤尺寸，并且可以使用以下公式计算所估计的肿瘤重量：肿瘤重量＝w2(l)/2，其中w＝宽度，l＝以毫米为单位的长度。功效可以通过肿瘤生长抑制百分比(％TGI)和每组中“治愈”的数量来确定。当所有对照动物仍在研究时，％TGI可以根据下式((C-T)/(C-初始尺寸))*100计算为治疗肿瘤体积(T)相对于对照肿瘤体积(C)的尺寸减小百分比。可以将治愈定义为在施用最后一剂后，检测到在10个肿瘤体积倍增时间(TVDT)下没有可测量肿瘤的动物数量。
生物学实施例2
STING原代人PBMC细胞因子诱导测定
在来源于人全血的原代人外周血单核细胞(PBMC)中评估人STING途径的激动性。将1品脱(大约420ml)新鲜供体血液(加利福尼亚州阿拉米达的AllCells公司(AllCellsInc.,Alameda,CA))在淋巴细胞分离培养基(1.077g/ml至1.080g/ml，弗吉尼亚州康宁公司(Corning,Manassas,VA))上分层，然后在室温下以500g离心20分钟而不施加破碎。收获在血清和淋巴细胞分离培养基之间的界面处收集的PBMC，洗涤，然后计数。PBMC由淋巴细胞和单核细胞(诸如B细胞、T细胞等)的亚型组成，并且这些亚型已在文献中表征为表达不同水平的STING蛋白。响应于STING激动剂，诸如2’3’-cGAMP，这些细胞被激活并且被诱导以表达多种促炎和抗病毒细胞因子。另外，在用STING激动剂刺激时，这些细胞上调激活标记。细胞因子诱导水平可通过多种方法测量，包括ELISA、Luminex和MSD。激活标记上调的水平可通过流式细胞术测量。
为了进行测定，将1,000,000个细胞分配到225μL/孔的平底组织培养处理过的96孔板中。在10x浓度下以加入25μL体积加入测试化合物。将一些化合物溶于100％DMSO中，并且在接受这些化合物的培养物中DMSO的最终浓度为1％。将测定在37℃、5％CO2下温育48小时。收获200μl上清液，而不干扰平板底部的细胞，然后在-20℃下冷冻直至Luminex测量的时间。按照制造商的方案，使用来自MILLIPLEX MAP人细胞因子/趋化因子磁珠面板的G-CSF、IFNα2、IFNγ、IL-1b、IL-6、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、TNFa以及来自MILLIPLEXMAP人细胞因子/趋化因子磁珠面板IV试剂盒(马萨诸塞州比勒里卡市EMD Millipore公司(EMD Millipore,Billerica,MA))的IFNβ1分析物进行Luminex测定。使用Luminex FlexMAP(宾夕法尼亚州拉多尔Luminex公司(Luminex Corporation,Radnor,PA))测量细胞因子诱导。使用MILLIPLEX Analyst软件(EMD Millipore公司)对收集的Luminex数据进行分析。
使用来自STING激活的原代人PBMC的条件培养基抑制PHH细胞中的HBV病毒
原代人肝细胞可感染乙型肝炎病毒，并且在建立的感染期间，将产生可通过ELISA检测的病毒蛋白，诸如HBsAg和HBeAg。用诸如恩替卡韦的化合物进行治疗可抑制HBV繁殖，这可通过降低的病毒蛋白产量来测量。(细胞数)将4×105个细胞/孔原代人肝细胞(纽约韦斯特伯里生物克隆公司(BioReclamation,Westbury,NY))分配到500μL/孔的平底组织培养处理过的24孔板中。24小时后，用30moi至75moi的HBV感染细胞。第二天，将PHH洗涤3次，并将新鲜的维持培养基加入细胞中。同时，如前所述分离PBMC。为了刺激PBMC，将10,000,000个细胞分配到400μL/孔的平底组织培养处理过的24孔板中。以100μL的体积加入测试化合物，然后将培养物在37℃、5％CO2下温育48小时。收获上清液。使用流式细胞术测量细胞的激活标记上调。简而言之，细胞用针对CD56、CD19、CD3、CD8a、CD14、CD69、CD54、CD161、CD4和CD80的荧光标记抗体进行染色。在Attune NxT流式细胞计(加利福尼亚州卡尔斯巴德赛默飞世尔公司((Thermo Fisher,Carlsbad,CA))上分析样品
如前文所述，从受刺激的PBMC培养物中，保留一部分上清液用于Luminex的细胞因子检测。将剩余的上清液分成两半，并且将一份等分试样储存在4℃下用于测定的d8上。将另一份上清液等分试样用2X PHH培养基稀释1∶1稀释，然后加入d4感染的PHH细胞中。96小时后，更换用过的培养基，并用2X PHH培养基以1∶1的稀释度加入上清液。此时，使用HBsAgELISA试剂盒(中国北京万泰生物制药公司(Wantai Bio-pharm,Beijing,China))进行HBsAg的临时测量。96小时后，收集培养基并测量HBsAg。
表4：用CDN化合物刺激的PBMC培养物中细胞因子的诱导倍数。通过测量在48小时后被大约20μM的化合物诱导的细胞因子的浓度，然后除以用PBS温育的细胞的细胞因子产生的基线水平来计算诱导倍数。该数据为三次实验中多个供体的平均值。nt＝未测试。
表4.
表5：用较高浓度的CDN化合物刺激的PBMC培养物中细胞因子的诱导倍数。通过测量48小时后诱导的细胞因子的浓度(所指示的化合物浓度)，然后除以用PBS温育的细胞的细胞因子产生的基线水平来计算诱导倍数。该数据为三次实验中多个供体的平均值。nt＝未测试。
表5.
表6.来自用CDN刺激的PBMC的条件培养基可抑制HBV感染的PHH细胞的病毒载量。用指定的CDN在20μM、4μM、0.8μM下刺激PBMC 48小时。将上清液与新鲜培养基以1∶1的比率混合，然后加入HBV感染的PHH细胞中。8天后测量HBsAg产量。该数据为两个独立供体的平均值。
表6.
化合物编号 EC50(μM)
1 4.02E-04
表7：CDN激活PBMC。用20μm的CDN刺激PBMC 48小时。通过流式细胞术评估细胞，以用于单核细胞上CD54的上调。相对于静息细胞上的水平计算平均荧光强度的倍数增加。该数据为两个独立供体的平均值。
表7.
化合物编号 MFI
1 5.6
4-2'3'-cGAMP 4.5
PBS 1.0
尽管上述说明通过提供的实施例进行说明来指出了本发明的原理，但应当理解，本发明的实践涵盖以下权利要求书及其等同形式的范围内的所有一般变型形式、改变形式和/或修改形式。

Claims (23)

1.一种式(I)的化合物
其中
R为CH2或O；
R1B为氢、羟基或氟；
R1C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
R2B为氢、羟基、甲氧基或氟；
R2C选自由以下项组成的组：羟基、硫醇和BH3 -；
B1选自由以下项组成的组：环b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7和b8
W为-O-或-NH-；
X为-O-或-NH-；
Y为-CH2-、-O-或-NH-；
Z为-CH2-、-O-或-NH-；
使得在任何情况下，X和Y中只有一个为NH，并且W和Z中只有一个为NH；
并且，使得当R为CH2且B1选自b6或b7时，则R2B不为氟或羟基；
此外，前提条件是式(I)的化合物不为这样的化合物：其中R、W、X、Y和Z各自为O；R1B和R2B各自为羟基；B1为b1；并且R1B和R2B各自为羟基；
或其对映体、非对映体或药学上可接受的盐形式。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中B1选自由以下项组成的组：环b1、b2、b3、b4、b5、b6和b8
3.根据权利要求1所述的化合物，其中W为O；并且B1选自由以下项组成的组：环b1、b2、b3、b4、b6和b8
4.根据权利要求3所述的化合物，其中B1为b6
5.根据权利要求1所述的化合物，其中W为NH；并且B1选自由以下项组成的组：环b1、b2、b3、b4、b6和b8
6.根据权利要求5所述的化合物，其中B1为b6
7.根据权利要求1所述的化合物，其中R为CH2；并且B1选自由以下项组成的组：环b1、b2、b3、b4、b5和b8
8.根据权利要求7所述的化合物，其中W和X为-O-；使得当B1是b6时，R2B不是氟或羟基。
9.根据权利要求1所述的化合物，其中R为O；并且B1选自由以下项组成的组：环b1、b2、b3、b4、b5、b6和b8
10.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物选自由以下项组成的组：化合物1至化合物33，
或其药学上可接受的盐形式。
11.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至10所述的化合物以及药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的稀释剂中的至少一种。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述组合物为固体口服剂型。
13.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述组合物为糖浆、酏剂或悬浮液。
14.一种治疗由STING调制的疾病、综合征或病症的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1所述的化合物。
15.一种治疗疾病、综合征或病症的方法，其中所述疾病、综合征或病症受所述STING激动的影响，所述方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1所述的化合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述疾病、综合征或病症为癌症。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述癌症选自由以下项组成的组：黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和纤维肉瘤。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述疾病、综合征或病症为病毒感染。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述病毒感染为乙型肝炎。
20.一种治疗疾病、综合征或病症的方法，所述疾病、综合征或病症选自由以下项组成的组：病毒感染、黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和纤维肉瘤，所述方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求8所述的组合物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述病毒感染为乙型肝炎。
22.根据权利要求1所述的化合物在制备用于在对其有需要的受试者中治疗疾病、综合征或病症的药物中的用途，所述疾病、综合征或病症选自由以下项组成的组：病毒感染、黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和纤维肉瘤。
23.根据权利要求1所述的化合物用于在对其有需要的受试者中治疗疾病、综合征或病症的方法中的用途，所述疾病、综合征或病症选自由以下项组成的组：病毒感染、黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和纤维肉瘤。
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