KR20210109439A - 3'-하이드록시 차단기를 갖는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용의 실시형태는 아세탈 또는 티오카바메이트 3'-OH 차단기를 갖는 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 분자에 관한 것이다. 본원에서는 이 같은 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 분자를 제조하기 위한 방법 및 서열분석 응용을 위한 3'-OH 차단기를 함유하는 완전 작용화된 뉴클레오티드의 용도가 또한 제공된다.
Description
본 개시내용은 일반적으로 3'-하이드록시 보호기를 포함하는 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드 서열분석 방법에서의 이들의 용도에 관한 것이다. 3'-하이드록시로 보호된 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법이 또한 개시되어 있다.
부분적으로는, 분자 또는 이들의 생물학적 반응을 특성 분석하기 위해 사용되는 기술에서의 개선이 분자 연구에서의 발전으로 이어져 왔다. 특히, 핵산인 DNA 및 RNA의 연구는 서열 분석 및 혼성화 이벤트의 연구를 위해 사용되는 기술의 개발로부터 혜택을 받아 왔다.
핵산의 연구를 개선시킨 기술의 일례는 고정된 핵산의 가공 어레이(fabricated array)를 개발하는 것이다. 이들 어레이는 전형적으로 고체 지지 물질 상에 고정된 폴리뉴클레오티드의 고밀도 매트릭스로 이루어져 있다. 예를 들어, 적절하게 변형된 뉴클레오티드 포스포라미다이트의 부착을 가능케 하도록 한정된 영역에 노출되지만 마스크에 의해 보호된 화학적으로 감작된 유리 표면을 이용하여 핵산을 조립하는 방식을 기술하고 있는 문헌[Fodor et al., Trends Biotech. 12: 19-26, 1994]을 참고한다. 또한, 가공 어레이는 소정의 위치에서 고체 지지체 상에 공지의 폴리뉴클레오티드를 "스포팅"(spotting)하는 기법에 의해 제작될 수 있다(예를 들어, 문헌[Stimpson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 6379-6383, 1995]).
어레이에 결합된 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 하나의 방식은 "합성에 의한 서열분석"(sequencing by synthesis) 또는 "SBS"로 지칭된다. DNA의 서열을 결정하는 이러한 기법에서는 이상적으로 서열분석 중인 핵산의 맞은편의 정확한 상보성 뉴클레오티드의 제어된 혼입(즉, 한 번에 하나의 혼입)이 요구된다. 이는 각각의 뉴클레오티드 잔기를 한 번에 하나씩 서열분석함에 따라 수회의 사이클로 뉴클레오티드를 부가함으로써 정밀한 서열분석을 허용하며, 이에 따라 제어되지 않은 일련의 혼입이 일어나는 것을 방지한다. 혼입된 뉴클레오티드는 표지 모이어티(moiety)를 제거하고 후속적으로 다음 차례의 서열분석을 하기 전에 여기에 부착된 적절한 표지를 이용하여 판독된다.
단일 혼입만이 일어난다는 것을 보장하기 위해, 구조적 수식("보호기(protecting group)" 또는 "차단기(blocking group)")이 하나의 뉴클레오티드만이 혼입된다는 것을 보장하기 위해 성장하는 사슬에 부가된 각각의 표지된 뉴클레오티드에 포함된다. 보호기를 갖는 뉴클레오티드가 부가된 후, 보호기는 이어서 서열분석 중인 DNA의 온전성(integrity)을 간섭하지 않는 반응 조건 하에서 제거된다. 이어서, 서열분석 사이클은 그 다음 보호되고 표지된 뉴클레오티드의 혼입을 계속할 수 있다.
DNA 서열분석에서의 유용성을 위해, 뉴클레오티드(통상적으로 뉴클레오티드 트라이포스페이트임)는 일반적으로 일단 뉴클레오티드 상의 염기가 부가되면 폴리뉴클레오티드 사슬 내로 혼입시키기 위해 사용되는 폴리머라아제가 계속해서 복제하는 것을 방지하기 위해 3'-하이드록시 보호기를 필요로 한다. 뉴클레오티드 상에 부가될 수 있고 여전히 적합할 수 있는 유형의 기에 대한 많은 제한이 존재한다. 보호기는 폴리뉴클레오티드 사슬을 손상시키지 않으면서 부가적인 뉴클레오티드 분자가 폴리뉴클레오티드 사슬에 부가되는 동시에 당 모이어티로부터 용이하게 제거 가능한 것을 방지해야 한다. 또한, 변형된 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 사슬 내로 혼입하기 위해 사용되는 폴리머라아제 또는 다른 적절한 효소와 상용성일 필요가 있다. 따라서, 이상적인 보호기는 장기 안정성을 나타내고, 폴리머라아제 효소에 의해 효과적으로 혼입되고, 2차적 또는 추가의 뉴클레오티드 혼입을 차단하고, 폴리뉴클레오티드 구조를 손상시키지 않는 온화한 조건 하에, 바람직하게는 수성 조건 하에 제거될 능력을 가져야 한다.
가역적 보호기는 앞서 기술된 바 있다. 예를 들어, 메츠커(Metzker) 등(문헌[Nucleic Acids Research, 22 (20): 4259-4267, 1994])은 8개의 3'-변형된 2-데옥시리보뉴클레오시드 5'-트라이포스페이트(3'-변형된 dNTP)의 합성 및 용도, 및 혼입 활성을 위한 2개의 DNA 주형 검정에서의 시험을 개시하고 있다. WO 2002/029003에는 폴리머라아제 반응에서 성장하는 DNA 가닥 상에 3'-OH 기를 캐핑(capping)하기 위해 알릴 보호기를 사용하는 단계를 포함할 수 있는 서열분석 방법이 기술되어 있다.
또한, 각각의 전문이 본원에서 참고로 인용된 국제 출원 공개공보 제WO 2004/018497호 및 제WO 2014/139596호에서는 다수의 가역적 보호기의 개발 및 DNA 상용성 조건 하에 이들을 탈보호하는 방법이 이미 보고된 바 있다.
본 개시내용의 일부 실시형태는 3'-탄소 원자에 공유 부착되어 있는 하기 구조를 형성하는, 제거 가능한 3'-OH 보호기 또는 차단기를 갖는 리보오스 또는 데옥시리보오스를 포함하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드에 관한 것이다:
상기 식에서,
R1a 및 R1b는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알콕시, 시아노, 할로겐, 선택적으로 치환된 페닐 또는 선택적으로 치환된 아르알킬이고;
R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 시아노 또는 할로겐이고;
대안적으로, R1a 및 R2a는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 선택적으로 치환된 5원 내지 8원 헤테로사이클릴기를 형성하고;
R3은 H, 선택적으로 치환된 C2-C6 알케닐, 선택적으로 치환된 C3-C7 사이클로알케닐, 선택적으로 치환된 C2-C6 알키닐 또는 선택적으로 치환된 (C1-C6 알킬렌)Si(R4)3이고;
각각의 R4는 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 선택적으로 치환된 C6-C10 아릴이다. 일부 실시형태에서, R1a 및 R1b가 각각 H 또는 C1-C6 알킬이고, R2a 및 R2b 둘 모두가 H인 경우, R3은 선택적으로 치환된 C2-C6 알케닐, 선택적으로 치환된 C3-C7 사이클로알케닐, 선택적으로 치환된 C2-C6 알키닐 또는 선택적으로 치환된 (C1-C6 알킬렌)Si(R4)3이다. 일부 실시형태에서, R1a, R1b, R2a 및 R2b가 H인 각각 경우, R3은 H가 아니다.
본 개시내용의 일부 실시형태는 3'-탄소 원자에 공유 부착되어 있는 하기 구조를 형성하는, 제거 가능한 3'-OH 차단기를 갖는 리보오스 또는 데옥시리보오스를 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에 관한 것이다:
상기 식에서,
R5 및 R6 각각은 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 할로알킬, C2-C8 알콕시알킬, 선택적으로 치환된 -(CH2)m-페닐, 선택적으로 치환된 -(CH2)n-(5원 또는 6원 헤테로아릴), 선택적으로 치환된 -(CH2)k-C3-C7 카보사이클릴 또는 선택적으로 치환된 -(CH2)p-(3원 내지 7원 헤테로사이클릴)이고;
-(CH2)m-, -(CH2)n-, -(CH2)k- 및 -(CH2)p- 각각은 선택적으로 치환되고;
m, n, k 및 p 각각은 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
본 개시내용의 일부 실시형태는 본원에 기술되어 있는 3'-OH-차단된 뉴클레오티드 분자를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 개시내용의 일부 실시형태는 서열분석 반응에서 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오티드에 상보적인 성장하는 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본원에 기술되어 있는 뉴클레오티드 분자를 성장하는 상보성 폴리뉴클레오티드에 혼입시키는 단계를 포함하며, 이때 뉴클레오티드의 혼입은 임의의 후속적인 뉴클레오티드가 성장하는 상보성 폴리뉴클레오티드 내에 도입되는 것을 방지한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오티드의 혼입은 폴리머라아제, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라아제(TdT) 또는 역전사 효소에 의해 달성된다. 하나의 실시형태에서, 혼입은 폴리머라아제(예를 들어, DNA 폴리머라아제)에 의해 달성된다.
본 개시내용의 일부 추가의 실시형태는 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은,
(a) 본원에 기술되어 있는 바와 같이 3'-OH 차단기 및 검출 가능한 표지를 포함하는 뉴클레오티드를 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 적어도 일부에 상보적인 복제 폴리뉴클레오티드 가닥(copy polynucleotide strand) 내에 혼입하는 단계;
(b) 복제 폴리뉴클레오티드 가닥 내에 혼입된 뉴클레오티드의 동일성(identity)을 검출하는 단계; 및
(c) 복제 폴리뉴클레오티드 가닥 내에 혼입된 뉴클레오티드로부터의 표지 및 3'-OH 차단기를 화학적으로 제거하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열분석 방법은 (d) 화학적으로 제거된 표지 및 3'-OH 차단기를 복제 폴리뉴클레오티드 가닥으로부터 세척 제거하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 세척 단계에서는 혼입되지 않은 뉴클레오티드가 또한 제거된다. 일부 이 같은 실시형태에서, 혼입한 뉴클레오티드의 3'-차단기 및 검출 가능한 표지는 다음의 상보성 뉴클레오티드를 도입하기 전에 제거된다. 일부 추가의 실시형태에서, 3'-차단기 및 검출 가능한 표지는 화학 반응의 단일 단계에서 제거된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 순차적 혼입은 적어도 50회, 적어도 100회, 적어도 150회, 적어도 200회 또는 적어도 250회 실시한다.
본 개시내용의 일부 추가의 실시형태는 본원에 개시된, 복수의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 및 이를 위한 포장재를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본원에 기술된, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드 또는 키트는 생물학적 시스템(예를 들어, 그의 과정 또는 성분)을 검출, 측정 또는 확인하기 위해 사용될 수 있다. 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 키트를 사용할 수 있는 예시적인 기법은, 서열분석, 발현 분석, 혼성화 분석, 유전 분석, RNA 분석, 세포 검정(예컨대, 세포 결합 또는 세포 기능 분석), 또는 단백질 검정(예컨대, 단백질 결합 검정 또는 단백질 활성 검정)을 포함한다. 상기 용도는 자동화 서열분석 기기와 같은, 특정 기술을 수행하기 위한 자동화 기기에 있을 수 있다. 서열분석 기기는 상이한 검출가능한 표지들을 구별하도록 상이한 파장에서 작동하는 2개 이상의 레이저를 포함할 수도 있다.
도 1은 65℃에서 완충 용액 중에서의 시간의 함수로서 다양한 3'-차단된 뉴클레오티드의 안정성을 나타낸 선도표이다.
도 2a는 용액 중에서 3'-AOM 차단기를 갖는 뉴클레오티드의 탈차단율(deblocking rate)을 3'-O-아지도메틸(-CH2N3) 차단기를 갖는 뉴클레오티드와 비교한 시간의 함수로서 잔류 뉴클레오티드(출발 물질)의 비율(%)을 나타낸 선도표이다.
도 2b는 용액 중에서 다양한 아세탈 차단기를 갖는 3'-차단된 뉴클레오티드의 탈차단율을 비교한 시간의 함수로서 3'-탈차단된 뉴클레오티드의 비율(%)을 나타낸 선도표이다.
도 3a 및 도 3b는 혼입 믹스(incorporation mix) 내의 3'-AOM 차단기를 갖는 완전 작용화된 뉴클레오티드(ffN)를 이용하여 일루미나(Illumina) MiniSeq® 기기 상의 서열분석 결과를 보여준다.
도 3c는 3'-O-아지도메틸 차단기를 갖는 ffN 표준물질과 비교할 때 혼입 믹스 내의 3'-AOM 차단기를 갖는 완전 작용화된 뉴클레오티드(ffN)를 이용하여 서열분석 오차율을 보여준다.
도 4a 및 도 4b 각각은 2개의 상이한 DNA 폴리머라아제(Pol 812 및 Pol 1901)를 각각 이용하여 3'-AOM 및 3'-O-아지도메틸 차단기를 갖는 완전 작용화된 뉴클레오티드를 이용하여 페이싱(phasing), 예비 페이싱(pre-phasing) 및 오차율을 비롯한 1차 서열분석 메트릭스(primary sequencing metrics)를 비교한 것을 보여준다.
도 5는 45℃에서 완충 용액 중에서의 시간의 함수로서 3'-AOM 또는 3'-O-아지도메틸 차단기를 갖는 완전 작용화된 뉴클레오티드의 서열분석 안정성을 나타낸 선도표이다.
도 6은 65℃에서 완충 용액 중에서의 시간의 함수로서 다양한 3'-차단기를 갖는 뉴클레오시드의 안정성을 나타낸 선도표이다.
도 7은 2개의 상이한 조건(옥손®(Oxone®) 또는 NaIO4) 하의 티오카바메이트 3'-차단기인 디메틸티오카바메이트(DMTC)의 절단율(탈차단율)을 3'-O-아지도메틸(3'-O-CH2N3) 차단기의 절단율과 비교한, 시간의 함수로서 잔류 3'-차단된 뉴클레오티드의 비율(%)을 나타낸 선도표이다.
도 2a는 용액 중에서 3'-AOM 차단기를 갖는 뉴클레오티드의 탈차단율(deblocking rate)을 3'-O-아지도메틸(-CH2N3) 차단기를 갖는 뉴클레오티드와 비교한 시간의 함수로서 잔류 뉴클레오티드(출발 물질)의 비율(%)을 나타낸 선도표이다.
도 2b는 용액 중에서 다양한 아세탈 차단기를 갖는 3'-차단된 뉴클레오티드의 탈차단율을 비교한 시간의 함수로서 3'-탈차단된 뉴클레오티드의 비율(%)을 나타낸 선도표이다.
도 3a 및 도 3b는 혼입 믹스(incorporation mix) 내의 3'-AOM 차단기를 갖는 완전 작용화된 뉴클레오티드(ffN)를 이용하여 일루미나(Illumina) MiniSeq® 기기 상의 서열분석 결과를 보여준다.
도 3c는 3'-O-아지도메틸 차단기를 갖는 ffN 표준물질과 비교할 때 혼입 믹스 내의 3'-AOM 차단기를 갖는 완전 작용화된 뉴클레오티드(ffN)를 이용하여 서열분석 오차율을 보여준다.
도 4a 및 도 4b 각각은 2개의 상이한 DNA 폴리머라아제(Pol 812 및 Pol 1901)를 각각 이용하여 3'-AOM 및 3'-O-아지도메틸 차단기를 갖는 완전 작용화된 뉴클레오티드를 이용하여 페이싱(phasing), 예비 페이싱(pre-phasing) 및 오차율을 비롯한 1차 서열분석 메트릭스(primary sequencing metrics)를 비교한 것을 보여준다.
도 5는 45℃에서 완충 용액 중에서의 시간의 함수로서 3'-AOM 또는 3'-O-아지도메틸 차단기를 갖는 완전 작용화된 뉴클레오티드의 서열분석 안정성을 나타낸 선도표이다.
도 6은 65℃에서 완충 용액 중에서의 시간의 함수로서 다양한 3'-차단기를 갖는 뉴클레오시드의 안정성을 나타낸 선도표이다.
도 7은 2개의 상이한 조건(옥손®(Oxone®) 또는 NaIO4) 하의 티오카바메이트 3'-차단기인 디메틸티오카바메이트(DMTC)의 절단율(탈차단율)을 3'-O-아지도메틸(3'-O-CH2N3) 차단기의 절단율과 비교한, 시간의 함수로서 잔류 3'-차단된 뉴클레오티드의 비율(%)을 나타낸 선도표이다.
본 개시내용의 실시형태는 서열분석 응용, 예를 들어 합성에 의한 서열분석(SBS)을 위한 3'-OH 아세탈 또는 티오카바메이트 차단기를 갖는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 관한 것이다. 이들 차단기는 당해 기술분야에 알려져 있는 것과 비교하여 용액 중에서 보다 양호한 안정성을 제공한다. 특히, 3'-OH 차단기는 완전 작용화된 뉴클레오티드(ffN)의 합성 동안에 개선된 안정성을 나타내며, 또한 제형화, 저장 및 서열분석 기기 상에서의 운전 동안에 용액 중에서 상당한 안정성을 나타낸다. 게다가, 본원에 기술되어 있는 3'-OH 차단기에 의해 낮은 예비 페이싱, 개선된 데이터 품질에 대한 보다 낮은 신호 감시가 또한 달성될 수 있으며, 이는 서열분석 응용으로부터 보다 긴 판독을 가능케 한다.
정의
달리 한정하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 흔히 이해하고 있는 바와 동일한 의미를 갖는다. "포함하는"이란 용어뿐만 아니라 "포함하다" 및 "포함되는"과 같은 기타 형태의 사용은 비제한적이다. "갖는(having)"이란 용어뿐만 아니라, "가지다" 및 "가졌다"와 같은 기타 형태의 사용은 비제한적이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 연결 문구(transitional phrase)에서든 또는 청구범위의 내용에서든, "포함하다" 및 "포함하는"이란 용어는 개방형 의미(open-ended meaning)를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는"과 같은 문구와 동의어로 해석되어야 한다. 예를 들어, 방법의 맥락에서 사용되는 경우, "포함하는"이란 용어는 공정이 적어도 인용된 단계를 포함하지만, 부가적인 단계를 포함할 수도 있다는 것을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치의 맥락에서 사용되는 경우, "포함하는"이란 용어는 화합물, 조성물 또는 장치가 적어도 인용된 특징부 또는 요소를 포함하지만, 부가적인 특징부 또는 요소를 포함할 수도 있다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 흔한 유기 약어는 하기에 정의되어 있다:
℃: 섭씨온도
dATP: 데옥시아데노신 트리포스페이트
dCTP: 데옥시시티딘 트리포스페이트
dGTP: 데옥시구아노신 트리포스페이트
dTTP: 데옥시티미딘 트리포스페이트
ddNTP: 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트
ffN: 완전 작용화된 뉴클레오티드
RT: 실온
SBS: 합성에 의한 서열분석
SM: 출발 물질
본원에서 사용되는 바와 같이, "어레이"란 용어는 상이한 프로브 분자가 상대적 위치에 따라 서로 구별될 수 있도록 하나 이상의 기질에 부착되어 있는 상이한 프로브 분자의 집단을 지칭한다. 어레이는 기질 상의 상이한 접근 가능한 위치에서 각각 위치하고 있는 상이한 프로브 분자를 포함할 수 있다. 대안적 또는 부가적으로, 어레이는 각각이 상이한 프로브 분자를 보유하는 별개의 기질을 포함할 수 있으며, 이때 상이한 프로브 분자는 기질이 부착되어 있는 표면 상의 기질의 위치에 따라, 또는 액체 중의 기질의 위치에 따라 식별될 수 있다. 별개의 기질이 표면 상에 위치하는 예시적인 어레이는, 예를 들어 미국 특허 제6,355,431 B1호, 제US 2002/0102578호 및 PCT 공개공보 제WO 00/63437호에 기술되어 있는 웰(well) 내 비드를 포함하는 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류기(FACS)와 같은 미세유체 장치를 이용하여 액체 어레이 내의 비드를 구별하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 예시적인 형식은, 예를 들어 미국 특허 제6,524,793호에 기술되어 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 어레이의 추가의 예로는 미국 특허 제5,429,807호; 제5,436,327호; 제5,561,071호; 제5,583,211호; 제5,658,734호; 제5,837,858호; 제5,874,219호; 제5,919,523호; 제6,136,269호; 제6,287,768호; 제6,287,776호; 제6,288,220호; 제6,297,006호; 제6,291,193호; 제6,346,413호; 제6,416,949호; 제6,482,591호; 제6,514,751호 및 제6,610,482호; 및 제WO 93/17126호; 제WO 95/11995호; 제WO 95/35505호; 제EP 742 287호; 및 제EP 799 897호에 기술되어 있는 것들을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "공유 부착된" 또는 "공유 결합된"이란 용어는 원자들 사이의 전자쌍을 공유하는 것을 특징으로 하는 화학적 결합의 형성을 지칭한다. 예를 들어, 공유 부착된 중합체 코팅은 기타 수단, 예를 들어 접착 또는 정전기 상호작용을 통해 표면에 부착된 것에 비교하여 기질의 작용화된 표면과 화학적 결합을 형성하는 중합체 코팅을 지칭한다. 표면에 공유 부착되어 있는 중합체가 공유 부착 이외에 수단을 통해 또한 결합될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 임의의 "R" 기(들)는 표시된 원자에 부착될 수 있는 치환기를 나타낸다. R 기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 2개의 "R" 기가 "이들이 부착되어 있는 원자와 함께" 고리 또는 고리 시스템을 형성하는 것으로 기술되어 있는 경우, 이는 원자, 그 사이의 결합 및 2개의 R 기의 집합 단위가 인용된 고리임을 의미한다. 예를 들어, 하기 하부구조가 존재하고,
R1 및 R2가 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 바와 같이 정의되거나, R1 및 R2가 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 아릴 또는 카보사이클릴을 형성하는 경우, 이는 R1 및 R2가 수소 또는 알킬로부터 선택될 수 있거나, 대안적으로는 하부구조는 하기 구조를 갖는다는 것을 의미한다:
상기 식에서, A는 표시된 이중 결합을 함유하는 아릴 고리 또는 카보사이클릴이다.
특정 라디칼 명명 규칙은 맥락에 따라 모노라디칼 또는 디라디칼 중 하나를 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 치환기가 분자의 나머지 부분에 대한 2개의 부착점을 필요로 하는 경우, 치환기는 디라디칼인 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 부착점을 필요로 하는 알킬로서 식별되는 치환기는 -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2- 등과 같은 디라디칼을 포함한다. 기타 라디칼 명명 규칙에 따르면 라디칼은 "알킬렌" 또는 "알케닐렌"과 같은 디라디칼인 것으로 명확하게 나타나 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "할로겐" 또는 "할로"란 용어는 원소의 주기율표에서 7열의 방사선 안정 원자들 중 임의의 하나, 예를 들어 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미하며, 여기서 불소 및 염소가 바람직하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "Ca 내지 Cb"(여기서, "a" 및 "b"는 정수임)는 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기 내의 탄소 원자의 개수를 지칭하거나, 사이클로알킬기 또는 아릴기의 고리 원자의 개수를 지칭한다. 즉, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬의 고리 및 아릴의 고리는 "a"개 내지 "b"개(범위 값을 포함함)의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 예를 들어, "C1 내지 C4 알킬"기는 1개 내지 4개의 탄소를 갖는 모든 알킬기, 즉 CH3-, CH3CH2-, CH3CH2CH2-, (CH3)2CH-, CH3CH2CH2CH2-, CH3CH2CH(CH3)- 및 (CH3)3C-를 지칭하고; C3 내지 C4 사이클로알킬기는 3개 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 모든 사이클로알킬기, 즉 사이클로프로필 및 사이클로부틸을 지칭한다. 유사하게, "4원 내지 6원 헤테로사이클릴"기는 총 4개 내지 6개의 고리 원자를 갖는 모든 헤테로사이클릴기, 예를 들어 아제티딘, 옥세탄, 옥사졸린, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 모르폴린 등을 지칭한다. "a" 및 "b" 중 어떠한 것도 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 사이클로알킬기 또는 아릴기와 관련하여 지정되지 않는 경우, 이들 정의에서 기술되어 있는 가장 넓은 범위가 추정되어야 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "C1-C6"이란 용어는 C1, C2, C3, C4, C5 및 C6, 및 상기 2개의 수치 중 임의의 것에 의해 한정되는 범위를 포함한다. 예를 들어, C1-C6 알킬은 C1, C2, C3, C4, C5 및 C6 알킬, C2-C6 알킬, C1-C3 알킬 등을 포함한다. 유사하게, C2-C6 알케닐은 C2, C3, C4, C5 및 C6 알케닐, C2-C5 알케닐, C3-C4 알케닐 등을 포함하고; C2-C6 알키닐은 C2, C3, C4, C5 및 C6 알키닐, C2-C5 알키닐, C3-C4 알키닐 등을 포함한다. C3-C8 사이클로알킬은 각각 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 및 8개의 탄소 원자, 및 상기 2개의 수치 중 임의의 것에 의해 한정되는 범위를 함유하는 탄화수소 고리, 예를 들어 C3-C7 사이클로알킬 또는 C5-C6 사이클로알킬을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "알킬"은 완전히 포화된 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬(즉, 어떠한 이중 결합 또는 삼중 결합도 함유하지 않음)을 지칭한다. 알킬기는 1개 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다(이것이 본원에서 나타날 때마다 "1 내지 20"과 같은 수치 범위는 주어진 범위 내의 각각의 정수를 지칭하고; 예를 들어, "1개 내지 20개의 탄소 원자"는 알킬기가 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자 등(최대 20개까지의 탄소 원자를 포함함)으로 이루어질 수 있다는 것을 의미하지만, 본 정의는 어떠한 수치 범위도 지정되지 않은 "알킬"이란 용어의 경우도 포함함). 또한, 알킬기는 1개 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 알킬일 수 있다. 알킬기는 또한 1개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알킬일 수 있다. 알킬기는 "C1-C4 알킬" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 단지 일례로서, "C1-C6 알킬"은 알킬 사슬 내에 1개 내지 6개의 탄소 원자가 존재한다는 것을 나타내는데, 즉 알킬 사슬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 t-부틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알킬기로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3차 부틸, 펜틸, 헥실 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "알콕시"는 화학식 -OR을 지칭하며, 여기서 R은 상기에서 정의된 바와 같은 알킬, 예를 들어 "C1-C9 알콕시"로서, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 1-메틸에톡시 (이소프로폭시), n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시 및 tert-부톡시 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알케닐기는 2개 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 어떠한 수치 범위도 지정되지 않은 "알케닐"이란 용어의 경우도 포함한다. 또한, 알케닐기는 2개 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 알케닐일 수 있다. 알케닐기는 또한 2개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알케닐일 수 있다. 알케닐기는 "C2-C6 알케닐" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 단지 일례로서, "C2-C6 알케닐"은 알케닐 사슬 내에 2개 내지 6개의 탄소 원자가 존재한다는 것을 나타내는데, 즉 알케닐 사슬은 에텐일, 프로펜-1-일, 프로펜-2-일, 프로펜-3-일, 부텐-1-일, 부텐-2-일, 부텐-3-일, 부텐-4-일, 1-메틸-프로펜-1-일, 2-메틸-프로펜-1-일, 1-에틸-에텐-1-일, 2-메틸-프로펜-3-일, 부타-1,3-디엔일, 부타-1,2-디엔일 및 부타-1,2-디엔-4-일로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알케닐기로는 에텐일, 프로펜일, 부텐일, 펜텐일 및 헥센일 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알키닐기는 2개 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 어떠한 수치 범위도 지정되지 않은 "알키닐"이란 용어의 경우도 포함한다. 또한, 알키닐기는 2개 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 알키닐일 수 있다. 알키닐기는 또한 2개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알키닐일 수 있다. 알키닐기는 "C2-C6 알키닐" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 단지 일례로서, "C2-C6 알키닐"은 알키닐 사슬 내에 2개 내지 6개의 탄소 원자가 존재한다는 것을 나타내는데, 즉 알키닐 사슬은 에틴일, 프로핀-1-일, 프로핀-2-일, 부틴-1-일, 부틴-3-일, 부틴-4-일 및 2-부틴일로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알키닐기로는 에틴일, 프로핀일, 부틴일, 펜틴일 및 헥신일 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "헤테로알킬"은 사슬 골격 내에 하나 이상의 헤테로원자, 즉 탄소를 제외한 원소(질소, 산소 및 황을 포함하지만, 이에 제한되지 않음)를 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다. 헤테로알킬기는 1개 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 어떠한 수치 범위도 지정되지 않은 "헤테로알킬"이란 용어의 경우도 포함한다. 또한, 헤테로알킬기는 1개 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 헤테로알킬일 수 있다. 헤테로알킬기는 또한 1개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 헤테로알킬일 수 있다. 헤테로알킬기는 "C1-C6 헤테로알킬" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 헤테로알킬기는 하나 이상의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 단지 일례로서, "C4-C6 헤테로알킬"은 헤테로알킬 사슬 내에 4개 내지 6개의 탄소 원자가 존재하고, 또한 사슬의 골격 내에는 하나 이상의 헤테로원자가 존재한다는 것을 나타낸다.
"방향족"이란 용어는 공액 파이 전자계(conjugated pi electron system)를 갖는 고리 또는 고리 시스템을 지칭하며, 탄소 환형 방향족 기(예를 들어, 페닐) 및 헤테로환형 방향족 기(예를 들어, 피리딘) 둘 모두를 포함한다. 상기 용어는 단일 환형 기 또는 융합 고리 다중 환형 기(즉, 인접한 원자 쌍을 공유하는 고리)를 포하며, 단 전체 고리 시스템은 방향족이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아릴"은 고리 골격 내에 탄소만을 함유하는 방향족 고리 또는 고리 시스템(즉, 2개의 인접한 탄소 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)을 지칭한다. 아릴이 고리 시스템인 경우, 시스템 내의 모든 고리는 방향족이다. 아릴기는 6개 내지 18개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 어떠한 수치 범위도 지정되지 않은 "아릴"이란 용어의 경우도 포함한다. 일부 실시형태에서, 아릴기는 6개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다. 아릴기는 "C6-C10 아릴", "C6 또는 C10 아릴" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 아릴기의 예로는 페닐, 나프틸, 아줄렌일 및 안트라센일을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
"아르알킬" 또는 "아릴알킬"은 알킬렌기를 통해 치환기로서 연결된 아릴기, 예를 들어 "C7-14 아르알킬" 등으로, 벤질, 2-페닐에틸, 3-페닐프로필 및 나프틸알킬을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우, 알킬렌기는 저급 알킬렌기(즉, C1-C6 알킬렌기)이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "헤테로아릴"은 고리 골격 내에 하나 이상의 헤테로원자, 즉 탄소를 제외한 원소(질소, 산소 및 황을 포함하지만, 이에 제한되지 않음)를 함유하는 방향족 고리 또는 고리 시스템(즉, 2개의 인접한 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)을 지칭한다. 헤테로아릴이 고리 시스템인 경우, 시스템 내의 모든 고리는 방향족이다. 헤테로아릴기는 5개 내지 18개의 고리원(ring member)(즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 포함하는, 고리 골격을 구성하는 원자의 개수)을 가질 수 있지만, 본 정의는 어떠한 수치 범위도 지정되지 않은 "헤테로아릴"이란 용어의 경우도 포함한다. 일부 실시형태에서, 헤테로아릴기는 5개 내지 10개의 고리원 또는 5개 내지 7개의 고리원을 갖는다. 헤테로아릴기는 "5원 내지 7원 헤테로아릴", "5원 내지 10원 헤테로아릴" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 헤테로아릴 고리의 예로는 푸릴, 티에닐, 프탈라지닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 이속사졸릴, 이소티아졸릴, 트리아졸릴, 티아디아졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트리아지닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀니릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴 및 벤조티에닐을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
"헤테로아르알킬" 또는 "헤테로아릴알킬"은 알킬렌기를 통해 치환기로서 연결된 헤테로아릴기이다. 예로는 2-티에닐메틸, 3-티에닐메틸, 푸릴메틸, 티에닐에틸, 피롤릴알킬, 피리딜알킬, 이속사졸릴알킬 및 이미다졸릴알킬을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우, 알킬렌기는 저급 알킬렌기(즉, C1-C6 알킬렌기)이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "카보사이클릴"은 고리 시스템 골격 내에 탄소 원자만을 함유하는 비방향족 환형 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 카보사이클릴이 고리 시스템인 경우, 2개 이상의 고리는 융합, 가교 또는 스피로 연결 방식으로 함께 연결될 수 있다. 카보사이클릴은 임의의 포화도를 가질 수 있으며, 단 고리 시스템 내의 적어도 하나의 고리는 방향족이 아니다. 따라서, 카보사이클릴은 사이클로알킬, 사이클로알케닐 및 사이클로알키닐을 포함한다. 카보사이클릴기는 3개 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 어떠한 수치 범위도 지정되지 않은 "카보사이클릴"이란 용어의 경우도 포함한다. 또한, 카보사이클릴기는 3개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기의 카보사이클릴일 수 있다. 카보사이클릴기는 또한 3개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 카보사이클릴일 수 있다. 카보사이클릴기는 "C3-C6 카보사이클릴" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 카보사이클릴 고리의 예로는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헥센일, 2,3-디하이드로-인덴, 비사이클[2.2.2]옥탄일, 아다만틸 및 스피로[4.4]노난일을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "사이클로알킬"은 완전 포화 카보사이클릴 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 예로는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "헤테로사이클릴"은 고리 골격 내에 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 비방향족 환형 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 헤테로사이클릴은 융합, 가교 또는 스피로 연결 방식으로 함께 연결될 수 있다. 헤테로사이클릴은 임의의 포화도를 가질 수 있으며, 단 고리 시스템 내의 적어도 하나의 고리는 방향족이 아니다. 헤테로원자(들)는 고리 시스템 내의 비방향족 또는 방향족 고리 중 하나에 존재할 수 있다. 헤테로사이클릴기는 3개 내지 20개의 고리원(즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 포함하는, 고리 골격을 구성하는 원자의 개수)을 가질 수 있지만, 본 정의는 어떠한 수치 범위도 지정되지 않은 "헤테로사이클릴"이란 용어의 경우도 포함한다. 또한, 헤테로사이클릴기는 3개 내지 10개의 고리원을 갖는 중간 크기의 헤테로사이클릴일 수 있다. 헤테로사이클릴기는 또한 3개 내지 6개의 고리원을 갖는 헤테로사이클릴일 수 있다. 헤테로사이클릴기는 "3원 내지 6원 헤테로사이클릴" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 바람직한 6원의 단일 환형 헤테로사이클릴에서, 헤테로원자(들)는 O, N 또는 S 중 하나 또는 최대 3개로부터 선택되고, 바람직한 5원의 단일 환형 헤테로사이클릴에서 헤테로원자(들)는 O, N 또는 S 중 하나 또는 2개의 헤테로원자로부터 선택된다. 헤테로사이클릴 고리의 예로는 아제피닐, 아크리디닐, 카바졸릴, 시놀리닐, 디옥솔라닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 모르폴리닐, 옥시라닐, 옥세파닐, 티에파닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 디옥소피페라지닐, 피롤리디닐, 피롤리도닐, 피롤리디오닐, 4-피페리도닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 1,3-디옥시닐, 1,3-디옥사닐, 1,4-디옥시닐, 1,4-디옥사닐, 1,3-옥사티아닐, 1,4-옥사티이닐, 1,4-옥사티아닐, 2H-1,2-옥사지닐, 트리옥사닐, 헥사하이드로-1,3,5-트리아지닐, 1,3-디옥솔릴, 1,3-디옥솔라닐, 1,3-디티올릴, 1,3-디티올라닐, 이속사졸리닐, 이속사졸리디닐, 옥사졸리닐, 옥사졸리디닐, 옥사졸리디노닐, 티아졸리닐, 티아졸리디닐, 1,3-옥사티오라닐, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐, 테트라하이드로-1,4-티아지닐, 티아모르폴리닐, 디하이드로벤조푸라닐, 벤즈이미다졸리디닐 및 테트라하이드로퀴놀린을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
"O 카복시"기는 R이 본원에서 정의된 바와 같이 수소, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C7 카보사이클릴, C6-C10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택되는 "-OC(=O)R" 기를 지칭한다.
"C 카복시"기는 R이 본원에서 정의된 바와 같이 수소, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C7 카보사이클릴, C6-C10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 "-C(=O)OR" 기를 지칭한다. 비제한적인 예로는 카복실(즉, -C(=O)OH)을 들 수 있다.
"설포닐"기는 R이 본원에서 정의된 바와 같이 수소, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C7 카보사이클릴, C6-C10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택되는 "-SO2R" 기를 지칭한다.
"설피노"기는 "-S(=O)OH" 기를 지칭한다.
"S 설폰아미도"기는 RA 및 RB가 본원에서 정의된 바와 같이 수소, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C7 카보사이클릴, C6-C10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 각각 독립적으로 선택되는 "-SO2NRARB" 기를 지칭한다.
"N 설폰아미도"기는 RA 및 RB가 본원에서 정의된 바와 같이 수소, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C7 카보사이클릴, C6-C10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 각각 독립적으로 선택되는 "-N(RA)SO2RB" 기를 지칭한다.
"C 아미도"기는 RA 및 RB가 본원에서 정의된 바와 같이 수소, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C7 카보사이클릴, C6-C10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 각각 독립적으로 선택되는 "-C(=O)NRARB" 기를 지칭한다.
"N 아미도"기는 RA 및 RB가 본원에서 정의된 바와 같이 수소, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C7 카보사이클릴, C6-C10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 각각 독립적으로 선택되는 "-N(RA)C(=O)RB" 기를 지칭한다.
"아미노"기는 RA 및 RB가 본원에서 정의된 바와 같이 수소, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C3-C7 카보사이클릴, C6-C10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 각각 독립적으로 선택되는 "-NRARB" 기를 지칭한다. 비제한적인 예로는 유리 아미노(즉, -NH2)를 들 수 있다.
"아미노알킬"기는 알킬렌기를 통해 연결된 아미노기를 지칭한다.
"알콕시알킬"기는 알킬렌기를 통해 연결된 알콕시기, 예를 들어 "C2-C8 알콕시알킬" 등을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 치환된 기는 하나 이상의 수소 원자를 다른 원자 또는 기로 교환하는 것이 존재하는 비치환된 모체 기(parent group)에서 유래한다. 달리 표시하지 않는 한, 기가 "치환"되는 것으로 여겨지는 경우, 이는, 기가 C1-C6 알킬, C1-C6 알케닐, C1-C6 알키닐, C1-C6 헤테로알킬, C3-C7 카보사이클릴(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), C3-C7-카보사이클릴-C1-C6-알킬(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 3원 내지 10원 헤테로사이클릴(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 3원 내지 10원 헤테로사이클릴-C1-C6-알킬(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 아릴(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 아릴(C1-C6)알킬(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 5원 내지 10원 헤테로아릴(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 5원 내지 10원 헤테로아릴(C1-C6)알킬(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 할로, -CN, 하이드록시, C1-C6 알콕시, C1-C6 알콕시(C1-C6)알킬(즉, 에테르), 아릴옥시, 설프하이드릴(메르캅토), 할로(C1-C6)알킬(예를 들어, -CF3), 할로(C1-C6)알콕시(예를 들어, -OCF3), C1-C6 알킬티오, 아릴티오, 아미노, 아미노(C1-C6)알킬, 니트로, O-카바밀, N-카바밀, O-티오카바밀, N-티오카바밀, C-아미도, N-아미도, S-설폰아미도, N-설폰아미도, C-카복시, O-카복시, 아실, 시아네이토, 이소시아네이토, 티오시아네이토, 이소티오시아네이토, 설피닐, 설포닐, -SO3H, 설피노, -OSO2C1-4 알킬 및 옥소(=O)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환된다는 것을 의미한다. 기가 "선택적으로 치환되는" 것으로 기술될 때마다 그 기는 상술한 치환기로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "하이드록시"란 용어는 -OH 기를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "시아노"기란 용어는 "-CN" 기를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아지도"란 용어는 -N3 기를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "뉴클레오티드"는 질소 함유 헤테로환형 염기, 당 및 하나 이상의 인산기를 포함한다. 이들은 핵산 서열의 단량체 단위이다. RNA에서, 당은 리보오스이고, DNA에서는 데옥시리보오스, 즉 리보오스에 존재하는 하이드록실기가 없는 당이다. 질소 함유 헤테로환형 염기는 푸린 또는 피리미딘 염기일 수 있다. 푸린 염기는 아데닌(A) 및 구아닌(G) 및 이들의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 피리미딘 염기는 시토신(C), 티민(T) 및 우라실(U) 및 이들의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 데옥시리보오스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 푸린의 N-9에 결합되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "뉴클레오시드"는 뉴클레오티드와 구조적으로 유사하지만, 포스페이트 모이어티가 빠져 있다. 뉴클레오시드 유사체의 예는 표지가 염기에 연결되어 있는 것일 수 있으며, 당 분자에는 어떠한 인산기로 부착되어 있지 않다. "뉴클레오시드"란 용어는 본원에서 당업자가 이해하는 바와 같이 이의 통상의 의미로 사용된다. 예로는 리보오스 모이어티를 포함하는 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보오스 모이어티를 포함하는 데옥시리보뉴클레오시드를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 변형된 펜토오스 모이어티는 산소 원자가 탄소로 교체되어 있고/있거나, 탄소가 황 또는 산소 원자로 교체되어 있는 펜토오스 모이어티이다. "뉴클레오시드"는 치환된 염기 및/또는 당 모이어티를 가질 수 있는 단량체이다. 부가적으로, 뉴클레오시드는 보다 큰 DNA 및/또는 RNA 중합체 및 올리고머 내로 혼입될 수 있다.
"푸린 염기"란 용어는 본원에서 당업자가 이해하는 바와 같이 이의 통상의 의미로 사용되며, 이의 토토머(tautomer)를 포함한다. 유사하게, "피리미딘 염기"란 용어는 본원에서 당업자가 이해하는 바와 같이 이의 통상의 의미로 사용되며, 이의 토토머를 포함한다. 선택적으로 치환된 푸린 염기의 비제한적인 목록에는 푸린, 아데닌, 구아닌, 히포크산틴, 크산틴, 알로크산틴, 7-알킬구아닌(예를 들어 7-메틸구아닌), 테오브로민(theobromine), 카페인, 요산 및 이소구아닌이 포함된다. 피리미딘 염기의 예로는 시토신, 티민, 우라실, 5,6-디하이드로우라실 및 5-알킬시토신(예를 들어, 5-메틸시토신)을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 본원에 기술되어 있는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 "포함하는" 것으로 기술되어 있는 경우, 이는 본원에 기술되어 있는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 공유 결합을 형성한다는 것을 의미한다. 유사하게, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 내에 혼입된 것과 같이 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부로서 기술되어 있는 경우, 이는 본원에 기술되어 있는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 공유 결합을 형성한다는 것을 의미한다. 일부 이 같은 실시형태에서, 공유 결합은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 3'-탄소 원자와 뉴클레오티드의 5'-탄소 원자 사이의 인산디에스테르 결합과 같이 본원에 기술되어 있는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 3'-하이드록시기와 뉴클레오티드의 5'-인산기 사이에서 형성된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유도체" 또는 "유사체"는 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 갖는 합성 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유도체를 의미한다. 이 같은 유도체 및 유사체는, 예를 들어 문헌[Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley & Son, 1980)] 및 문헌[Uhlman et al., Chemical Reviews 90: 543-584, 1990]에 기술되어 있다. 또한, 뉴클레오티드 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬-포스포네이트, 포스포아닐리데이트 및 포로포아미데이트 결합을 비롯한 변형된 인산디에스테르 결합(phosphodiester linkage)을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "유도체", "유사체" 및 "변형된"은 상호 교환 가능하게 사용될 수 있으며, 본원에서 정의된 "뉴클레오티드" 및 "뉴클레오시드"란 용어에 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "포스페이트"란 용어는 당업자가 이해하는 바와 같이 이의 통상의 의미로 사용되며, 이의 양성자화 형태(예를 들어, 
및 
)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "모노포스페이트", "디포스페이트" 및 "트리포스페이트"는 당업자가 이해하는 바와 같이 이의 통상의 의미로 사용되며, 양성자화 형태를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "보호기" 및 "보호기들"이란 용어는 분자 내의 기존의 기가 원치 않는 화학 반응을 거치지 않도록 하기 위해 분자에 부가되는 임의의 원자 또는 일군의 원자를 지칭한다. 종종, "보호기" 및 "차단기"는 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "포토" 또는 "포토-"란 접두사는 광 또는 전자기 방사선과 관련이 있음을 의미한다. 상기 용어는 흔히 스펙트럼의 무선, 마이크로웨이브, 적외선, 가시광선, 자외선, X-선 또는 감마선 부분으로 알려져 있는 하나 이상의 범위를 포함하지만 이에 제한되지 않는 전자기 스펙트럼의 전체 또는 일부를 포함할 수 있다. 스펙트럼의 일부는 본원에 개시된 이들 금속과 같은 표면의 금속 영역에 의해 차단되는 부분일 수 있다. 대안적 또는 부가적으로, 스펙트럼의 일부는 유리, 플라스틱, 실리카, 또는 본원에 개시된 기타 물질로 만들어진 영역과 같은 표면의 사이 영역(interstitial region)을 통과하는 부분일 수 있다. 특정 실시형태에서, 금속을 통과할 수 있는 방사선이 사용될 수 있다. 대안적 또는 부가적으로, 유리, 플라스틱, 실리카, 또는 본원에 개시된 기타 물질에 의해 마스킹되는 방사선이 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "페이싱"이란 용어는 3'-종결자 및 형광단(fluorophore)의 불완전한 제거 및 주어진 서열분석 사이클에서 폴리머라아제에 의한 클러스터(cluster) 내의 DNA 가닥의 일부의 혼입을 완료하지 못함에 의해 야기되는 SBS에서 나타나는 현상을 지칭한다. 예비 페이싱은 효과적인 3'-종결자 없이 뉴클레오티드의 혼입에 의해 야기되며, 이때 혼입 이벤트가 종결 실패로 인해 1 사이클 앞서 이루어진다. 페이싱 및 예비 페이싱은 특성 사이클에 대한 측정된 신호 세기가 현재 사이클에서 유래한 신호뿐만 아니라 이전 및 이후 사이클에서 유래한 노이즈(noise)로 이루어지도록 한다. 사이클 횟수가 증가함에 따라 페이싱 및 예비 페이싱에 의해 영향을 받은 클러스터 당 서열의 분획이 증가하여 정확한 염기의 식별을 방해한다. 예비 페이싱은 합성에 의한 서열분석(SBS) 동안 보호되지 않거나 차단되지 않은 미량의 3'-OH 뉴클레오티드의 존재에 의해 야기될 수 있다. 보호되지 않은 3'-OH 뉴클레오티드는 제작 과정 동안 또는 가능하게는 저장 및 시약 취급 공정 동안 발생될 수 있다. 따라서, 예비 페이싱의 발생을 감소시키는 뉴클레오티드 유사체의 발견은 놀라운 일이며, 기존의 뉴클레오티드 유사체에 비해 SBS 응용에서 커다란 이점을 제공한다. 예를 들어, 제공된 뉴클레오티드 유사체는 보다 신속한 SBS 사이클 시간, 보다 낮은 페이싱 및 예비 페이싱 값 및 보다 긴 서열분석 판독 길이를 초래할 수 있다.
3'-하이드록시 아세탈 차단기
본 개시내용의 일부 실시형태는 3'-탄소 원자에 공유 부착되어 있는 하기 구조를 형성하는, 제거 가능한 3'-OH 보호기 또는 차단기를 갖는 리보오스 또는 데옥시리보오스를 포함하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 분자에 관한 것이다:
상기 식에서,
R1a 및 R1b는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알콕시, 시아노, 할로겐, 선택적으로 치환된 페닐 또는 선택적으로 치환된 아르알킬이고;
R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 시아노 또는 할로겐이고;
대안적으로, R1a 및 R2a는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 선택적으로 치환된 5원 내지 8원 헤테로사이클릴기를 형성하고;
R3은 H, 선택적으로 치환된 C2-C6 알케닐, 선택적으로 치환된 C3-C7 사이클로알케닐, 선택적으로 치환된 C2-C6 알키닐 또는 선택적으로 치환된 (C1-C6 알킬렌)Si(R4)3이고;
각각의 R4는 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 선택적으로 치환된 C6-C10 아릴이며, 단 R1a, R1b, R2a 및 R2b가 각각 H인 경우에 R3은 H가 아니다.
본 개시내용의 일부 추가의 실시형태는 화학식 I의 구조를 갖는 화합물에 관한 것이다:
[화학식 I]
상기 식에서, R'는 H, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 티오포스페이트, 인산에스테르 유사체, 반응성 인 함유기에 부착되어 있는 -O-, 또는 보호기에 의해 보호된 -O-이고; R"는 H 또는 OH이고; B는 핵염기이고; R1a, R1b, R2a, R2b 및 R3 각각은 상기에 정의된 바와 같다. 일부 추가의 실시형태에서, B는 
, 
, 
, 
, 
, 
또는 
이다. 일부 추가의 실시형태에서, 핵염기는 선택적으로는 링커를 통해 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광 염료)에 공유 결합되고, 예를 들어 B는 
, 
, 
또는 
이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R'는 트리포스페이트이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R"는 H이다.
본원에 기술되어 있는 아세탈 차단기의 일부 실시형태에서, R1a 및 R1b 중 적어도 하나는 H이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R1a 및 R1b는 각각 H이다. 일부 기타 실시형태에서, R1a 및 R1b 중 적어도 하나는 C1-C6 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 t-부틸이다. 일부 실시형태에서, R2a 및 R2b 각각은 독립적으로 H, 할로겐 또는 C1-C6 알킬이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R2a 및 R2b 중 적어도 하나는 H 또는 C1-C6 알킬이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R2a 및 R2b는 각각 H이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R2a 및 R2b는 각각 C1-C6 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 t-부틸이다. 하나의 실시형태에서, R2a 및 R2b는 각각 메틸이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 C1-C6 알킬 또는 할로겐이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R2a는 H이고, R2b는 할로겐 또는 C1-C6 알킬이다.
본원에 기술되어 있는 아세탈 차단기의 일부 실시형태에서, R3은 선택적으로 치환된 C2-C6 알케닐이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R3은 할로겐, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환되는 C2-C6 알케닐(예를 들어, 비닐, 프로펜일)이다. 일부 추가의 실시형태에서, R3은 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
또는 
이다. 일부 기타 실시형태에서, R3은 선택적으로 치환된 C2-C6 알키닐이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R3은 할로겐, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환되는 C2-C6 알키닐(예를 들어, 에틴일, 프로핀일)이다. 하나의 실시형태에서, R3은 선택적으로 치환된 에틴일(
)이다. 일부 기타 실시형태에서, R3은 선택적으로 치환된 (C1-C6 알킬렌)Si(R4)3이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R4 중 적어도 하나는 C1-4 알킬이다. 일부 추가의 실시형태에서, R4 중 각각은 C1-C4 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 t-부틸이다. 하나의 실시형태에서, R3은 -(CH2)-SiMe3이다. 일부 대안적인 실시형태에서, R3은 C1-C6 알킬이다.
일부 대안적인 실시형태에서, R1a 및 R2a는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 5원 내지 7원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 이 같은 실시형태에서, R1a 및 R2a는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 6원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 이 같은 실시형태에서, 6원 헤테로사이클릴기는 구조 
를 갖는다. 일부 추가의 실시형태에서, R1b, R2b 및 R3 중 적어도 하나는 각각 H이다. 일부 기타 실시형태에서, R1b, R2b 및 R3 중 적어도 하나는 각각 C1-C6 알킬이다. 하나의 실시형태에서, R1b, R2b 및 R3은 각각 H이다.
일부 추가의 실시형태에서, 화학식 I의 화합물은 또한 화학식 Ia로 나타나 있다:
[화학식 Ia]
상기 식에서, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 H, 할로겐(예를 들어, 플루오로, 클로로), C1-C6 알킬(예를 들어, 메틸, 에틸, 또는 이소프로필) 또는 C1-C6 할로알킬(예를 들어, -CHF2, -CH2F, 또는 -CF3)이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R1a 및 R1b 중 하나는 H이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R1a 및 R1b는 각각 H이다. 일부 기타 실시형태에서, R1a 및 R1b 중 적어도 하나는 C1-C6 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 t-부틸이다. 일부 실시형태에서, R2a 및 R2b 각각은 독립적으로 H, 할로겐 또는 C1-C6 알킬이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R2a 및 R2b는 각각 H이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R2c 및 R2d 각각은 독립적으로 H, 할로겐 또는 C1-C6 알킬이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R2c 및 R2d는 각각 C1-C6 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 t-부틸이다. 하나의 실시형태에서, R2c 및 R2d는 각각 메틸이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R2c 및 R2d는 각각 독립적으로 할로겐이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R2c는 H이고, R2d는 H, 할로겐(플루오로, 클로로) 또는 C1-C6 알킬(예를 들어, 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 t-부틸)이다. 추가의 실시형태에서, R1a 및 R1b는 각각 H이고; R2a는 H이고; R2b는 H, 할로겐 또는 메틸이고; R2c는 H이고; R2d는 H, 할로겐, 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 t-부틸이다.
본원에 기술되어 있는 차단기의 비제한적인 실시형태는 리보오스 또는 데옥시리보오스의 3'-탄소에 공유 부착되어 있는 
, 
, 
, 
, 
, 
및 
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 것을 포함한다.
3'-하이드록시 티오카바메이트 차단기
본 개시내용의 일부 부가적인 실시형태는 3'-탄소 원자에 공유 부착되어 있는 하기 구조를 형성하는, 제거 가능한 3'-OH 차단기를 갖는 리보오스 또는 데옥시리보오스를 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에 관한 것이다:
상기 식에서,
R5 및 R6 각각은 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 할로알킬, C2-C8 알콕시알킬, 선택적으로 치환된 -(CH2)m-페닐, 선택적으로 치환된 -(CH2)n-(5원 또는 6원 헤테로아릴), 선택적으로 치환된 -(CH2)k-C3-C7 카보사이클릴 또는 선택적으로 치환된 -(CH2)p-(3원 내지 7원 헤테로사이클릴)이고;
대안적으로, R5 및 R6은 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 선택적으로 치환된 5원 내지 7원 헤테로사이클릴을 형성하고;
-(CH2)m-, -(CH2)n-, -(CH2)k- 및 -(CH2)p- 각각은 선택적으로 치환되고;
m, n, k 및 p 각각은 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이다.
일부 부가적인 실시형태는 화학식 II의 화합물에 관한 것이다:
[화학식 II]
상기 식에서, R'는 H, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 티오포스페이트, 인산에스테르 유사체, 반응성 인 함유기에 부착되어 있는 -O-, 또는 보호기에 의해 보호된 -O-이고; R"는 H 또는 OH이고; B는 핵염기이고; R5 및 R6 각각은 상기에서 정의된 바와 같다. 일부 추가의 실시형태에서, B는 
, 
, 
, 
, 
, 
또는 
이다. 일부 추가의 실시형태에서, 핵염기는 선택적으로는 링커를 통해 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광 염료)에 공유 결합되고, 예를 들어 B는 
, 
, 
또는 
이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R'는 트리포스페이트이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R"는 H이다.
본원에 기술되어 있는 티오카바메이트 차단기의 일부 실시형태에서, R5 및 R6 중 적어도 하나는 H이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R5 및 R6은 각각 H이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R5는 H이고, R6은 C1-C6 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 t-부틸이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R5는 H이고, R6은 C2-C6 알케닐(예를 들어, 비닐 또는 알릴) 또는 C2-C6 알키닐(예를 들어, 에틴일 또는 프로핀일)이다. 일부 이 같은 실시형태에서, R5는 H이고, R2는 선택적으로 치환된 -(CH2)m-페닐, 선택적으로 치환된 -(CH2)n-(5원 또는 6원 헤테로아릴), 선택적으로 치환된 -(CH2)k-C3-C7 카보사이클릴 또는 선택적으로 치환된 -(CH2)p-(3원 내지 7원 헤테로사이클릴)이다. 일부 추가의 실시형태에서, C3-C7 카보사이클릴기는 C3-C7 사이클로알킬 또는 C3-C7 사이클로알케닐일 수 있다. 3원 내지 7원 헤테로사이클릴기는 고리 구조 내에 0개 또는 1개의 이중 결합을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, R5는 H이고, R6은 선택적으로 치환된 -(CH2)m-페닐, 선택적으로 치환된 -(CH2)n-6원 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 -(CH2)k-C5 또는 C6 카보사이클릴 또는 선택적으로 치환된 -(CH2)p-(5원 또는 6원 헤테로사이클릴)이다. 일부 실시형태에서, m, n, k 또는 p는 0이다. 기타 실시형태에서, m, n, k 또는 p는 1 또는 2이다. 일부 기타 실시형태에서, R5 및 R6 중 적어도 하나는 C1-C6 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 t-부틸이다. 일부 추가의 실시형태에서, R5 및 R6 둘 모두는 C1-C6 알킬이다. 하나의 실시형태에서, R5 및 R6 둘 모두는 메틸이다.
일부 대안적인 실시형태에서, R5 및 R6은 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 선택적으로 치환된 5원 내지 7원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 이 같은 실시형태에서, R5 및 R6은 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 선택적으로 치환된 피페리디닐을 형성한다.
본원에 기술되어 있는 3'-O-티오카바메이트 차단기의 비제한적인 실시형태는 리보오스 또는 데옥시리보오스의 3'-탄소에 공유 부착되어 있는 
, 
및 
로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 것을 포함한다.
본 개시내용의 부가적인 실시형태는 본원에 기술되어 있는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본원에 기술되어 있는 차단기의 실시형태 중 임의의 것에서, 기가 "선택적으로 치환되는" 것으로 기술되어 있는 경우, 이는 비치환되거나 치환될 수 있다.
본원에 기술되어 있는 3'-하이드록시 차단기를 갖는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 임의의 실시형태에서, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 선택적으로는 링커를 통해 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광단)에 공유 부착될 수 있다. 링커는 절단 가능하거나, 절단 불가능할 수 있다. 일부 이 같은 실시형태에서, 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광단)는 절단 가능한 링커를 통해 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 핵염기에 공유 부착된다. 일부 기타 실시형태에서, 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광단)는 절단 가능한 링커를 통해 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 3'산소에 공유 부착된다. 일부 추가의 실시형태에서, 이 같은 절단 가능한 링커는 아지도 모이어티 또는 이황화물 모이어티, 아세탈 모이어티 또는 티오카바메이트 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 3'-하이드록시 차단기 및 절단 가능한 링커(및 부착된 표지)는 동일하거나 실질적으로 동일한 화학 반응 조건 하에 제거될 수 있고, 예를 들어 차단기 및 검출 가능한 표지는 단일 화학 반응으로 제거될 수 있다. 기타 실시형태에서, 차단기 및 검출 가능한 표지는 2개의 별개의 단계로 제거된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드는 2'-데옥시리보오스를 포함한다. 일부 추가의 양태에서, 2'-데옥시리보오스는 당 고리의 5'-위치에 1개, 2개 또는 3개의 인산기를 함유한다. 일부 추가의 양태에서, 본원에 기술되어 있는 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 트리포스페이트이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 3'-차단된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드는 당해 기술분야에 개시되어 있는 표준 3'-OH 차단기, 예를 들어 3'-O-아지도메틸 보호기로 보호된 동일한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드와 비교하여 저장 동안에 용액에서의 우수한 안정성 및 서열분석 응용 동안에 시약 취급성을 제공한다. 예를 들어, 본원에 개시되어 있는 아세탈 또는 티오카바메이트 차단기는 동일한 기간 동안 동일한 조건에서 아지도메틸-보호된 3'-OH와 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1,000%, 1,500%, 2,000%, 2,500% 또는 3,000% 개선된 안정성을 부여할 수 있으며, 그 결과 예비 페이싱 값을 감소시키고 보다 긴 서열분석 판독 길이를 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 안정성은 주위 온도 또는 주위 온도 미만의 온도(예를 들어, 4℃ 내지 10℃)에서 측정된다. 기타 실시형태에서, 안정성은 승온, 예를 들어 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃ 또는 65℃에서 측정된다. 일부 이 같은 실시형태에서, 안정성은 염기성 pH 환경에서, 예를 들어 pH 9.0, pH 9.2, pH 9.4, pH 9.6, pH 9.8 또는 pH 10.0에서 용액 중에서 측정된다. 일부 이 같은 실시형태에서, 안정성은 폴리머라아제(예를 들어, DNA 폴리머라아제), 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라아제 또는 역전사 효소와 같은 효소의 존재 또는 부재 하에 측정된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 3'-차단된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드는 당해 기술분야에 개시되어 있는 표준 3'-OH 차단기, 예를 들어, 3'-O-아지도메틸 보호기로 보호된 동일한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드와 비교하여 서열분석 응용의 화학적 절단 단계 동안에 용액 중에서 우수한 탈차단율을 제공한다. 예를 들어, 본원에 개시되어 있는 아세탈 또는 티오카바메이트 차단기는 표준 탈차단 시약(예를 들어, 트리스(하이드록시프로필)포스핀)을 이용하여 아지도메틸-보호된 3'-OH와 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1,000%, 1,500% 또는 2,000% 개선된 탈차단율을 부여할 수 있으며, 그 결과 서열분석 사이클에 대한 전체 시간을 줄일 수 있다. 일부 실시형태에서, 탈차단율은 주위 온도 또는 주위 온도 미만의 온도(예를 들어, 4℃ 내지 10℃)에서 측정된다. 기타 실시형태에서, 탈차단율은 승온, 예를 들어 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃ 또는 65℃에서 측정된다. 일부 이 같은 실시형태에서, 탈차단율은 염기성 pH 환경에서, 예를 들어 pH 9.0, pH 9.2, pH 9.4, pH 9.6, pH 9.8 또는 pH 10.0에서 용액 중에서 측정된다. 일부 이 같은 실시형태에서, 기질(즉, 3'-차단된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드)에 대한 탈차단 시약의 몰비는 약 10:1, 약 5:1, 약 2:1 또는 약 1:1이다.
일부 실시형태에서, 팔라듐 탈차단 시약(예를 들어, Pd(0))은 3'-아세탈 차단기(예를 들어, AOM 차단기)를 제거하기 위해 사용된다. Pd는 알릴기의 이중 결합뿐만 아니라 AOM 기의 2개의 산소 원자와 킬레이트 복합체(chelation complex)를 형성하여 작용기에 바로 인접한 탈차단 시약이 제거되도록 할 수 있으며, 탈차단율의 가속화를 초래할 수 있다.
3'-OH 차단기의 탈보호
본원에 기술되어 있는 3'-아세탈 차단기는 다양한 화학적 조건 하에 제거 또는 절단될 수 있다. 비닐 또는 알케닐 모이어티를 함유하는 아세탈 차단기 
에 있어서, 비제한적인 절단 조건에는 포스핀 리간드, 예를 들어 트리스(하이드록시메틸)포스핀(THMP) 또는 트리스(하이드록실프로필)포스핀(THP 또는 THPP) 존재 하의 Pd(OAc)2 또는 염화알릴팔라듐(II) 이량체와 같은 Pd(II) 복합체가 포함된다. 알키닐기(예를 들어, 에틴일)를 함유하는 이들 차단기에 있어서, 이들은 또한 포스핀 리간드(예를 들어, THP 또는 THMP)의 존재 하에 Pd(II) 복합체(예를 들어, Pd(OAc)2 또는 염화알릴팔라듐(II) 이량체)에 의해 제거될 수 있다.
팔라듐 절단 시약
일부 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 아세탈 차단기는 팔라듐 촉매에 의해 절단될 수 있다. 일부 이 같은 실시형태에서, Pd 촉매는 수용성이다. 일부 이 같은 실시형태에서, Pd 촉매는 Pd(0) 복합체(예를 들어, 트리스(3,3',3"-포스피니딘트리스(벤젠설포네이토)팔라듐(0) 노나소듐 염 9수화물)이다. 일부의 경우, Pd(0) 복합체는 알켄, 알코올, 아민, 포스핀 또는 금속 수소화물과 같은 시약에 의한 Pd(II) 복합체의 환원으로부터 원 위치(in situ)에서 생성될 수 있다. 적합한 팔라듐 공급원으로는 Na2PdCl4, Pd(CH3CN)2Cl2, (PdCl(C3H5))2, [Pd(C3H5)(THP)]Cl, [Pd(C3H5)(THP)2]Cl, Pd(OAc)2, Pd(Ph3)4, Pd(dba)2, Pd(Acac)2, PdCl2(COD) 및 Pd(TFA)2를 들 수 있다. 하나의 이 같은 실시형태에서, Pd(0) 복합체는 Na2PdCl4로부터 원 위치에서 생성된다. 다른 실시형태에서, 팔라듐 공급원은 염화알릴팔라듐(II) 이량체[(PdCl(C3H5))2]이다. 일부 실시형태에서, Pd(0) 복합체는 Pd(II) 복합체를 포스핀과 혼합함으로써 수용액 중에서 생성된다. 적합한 포스핀으로는 트리스(하이드록시프로필)포스핀(THP), 트리스(하이드록시메틸)포스핀(THMP), 1,3,5-트리아자-7-포스파아다만탄(PTA), 비스(p-설포네이토페닐)페닐포스핀 이무수물 포타슘 염, 트리스(카복시에틸)포스핀(TCEP) 및 트리페닐포스핀-3,3',3"-트리설폰산 트리소듐 염와 같은 수용성 포스핀을 들 수 있다.
일부 실시형태에서, Pd(0)은 Pd(II) 복합체[(PdCl(C3H5))2]를 THP와 원 위치에서 혼합함으로써 제조된다. Pd(II) 복합체와 THP의 몰비는 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 또는 1:10일 수 있다. 일부 추가의 실시형태에서, 아스코르브산 또는 이의 염(예를 들어, 아스코르브산나트륨)과 같은 하나 이상의 환원제가 첨가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 절단 혼합물은 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 카보네이트 염, 포스페이트 염 또는 보레이트 염 또는 이들의 조합과 같은 부가적인 완충 시약을 함유할 수 있다. 일부 추가의 실시형태에서, 완충 시약은 에탄올아민(EA), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris), 글리신, 탄산나트륨, 인산나트륨, 붕산나트륨, 2-디메틸아미노메탄올(DMEA), 2-디에틸아미노메탄올(DEEA), N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 또는 N,N,N',N'-테트라에틸에틸렌디아민(TEEDA) 또는 이들의 조합을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 완충 시약은 DEEA이다. 다른 실시형태에서, 완충 시약은 카보네이트 염, 포스페이트 염 또는 보레이트 염 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 무기염을 함유한다. 하나의 실시형태에서, 무기염은 소듐 염이다.
대안적으로, 차단기를 함유하는 알키닐 모이어티는 또한 (NH4)2MoS4의 존재 하에 절단될 수 있다. 알키닐 모이어티에 대한 기타 비제한적인 절단 조건은 THPTA 리간드(트리스(3-하이드록시프로필트리아졸릴메틸)아민)과의 Cu(II) 복합체 및 아스코르베이트를 포함한다. 6원 헤테로사이클(예를 들어, 테트라하이드로피란)을 함유하는 차단기에 대한 비제한적인 절단 조건은 사이클로덱스트린 또는 Ln(OTf)3(란탄족 트리플레이트(lanthanide triflate))을 포함한다. 알킬실란기(예를 들어, -CH2SiMe3)를 함유하는 차단기에 대한 비제한적인 절단 조건은 LiBF4(리튬 테트라플루오로보레이트)를 포함한다. -O(CH2)O-C1-C6 알킬과 같은 기타 아세탈 차단기는 LiBF4 또는 Bi(OTf)3(비스무트 트리플레이트(bismuth triflate))에 의해 제거될 수 있다. 상술한 다양한 차단기를 절단하기 위한 비제한적이고 예시적인 조건은 하기 반응식 1에 나타나 있다.
[반응식 1]
본원에 기술되어 있는 3'-O-티오카바메이트 차단기는 다양한 화학적 조건 하에 제거 또는 절단될 수 있다. 본원에 기술되어 있는 티오카바메이트 차단기를 절단하기 위한 비제한적이고 예시적인 조건은 NaIO4 및 옥손®(포타슘 퍼옥시모노설페이트)을 포함한다.
또한, -CH2N3 내의 아지도기는 포스핀에 의해 아미노기로 전환될 수 있다. 대안적으로, -CH2N3 내의 아지도기는 이 같은 분자를 티올, 특히 수용성 티올(예를 들어, 디티오트레이톨(DTT))과 접촉시킴으로써 아미노기로 전환될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 포스핀은 THP이다.
선형화와의 상용성
핵산 서열분석 반응의 처리량을 최대화하기 위해, 다수의 주형 분자를 병렬로 서열분석할 수 있는 것이 유리하다. 다수의 주형에 대한 병렬 가공은 핵산 어레이 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 이들 어레이는 전형적으로 고체 지지 물질 상에 고정된 폴리뉴클레오티드의 고밀도 매트릭스로 이루어져 있다.
제WO 98/44151호 및 제WO 00/18957호 둘 모두에는 복수의 동일한 고정된 폴리뉴클레오티드 가닥 및 복수의 동일한 고정된 상보성 가닥으로부터 형성된 클러스터 또는 "콜로니"로 구성된 어레이를 형성하기 위해 증폭 생성물이 고체 지지체 상에 고정되도록 하는 핵산 증폭 방법이 기술되어 있다. 이러한 유형의 어레이는 본원에서 "클러스터형 어레이"로서 지칭된다. 이들 방법에 따라 제조된 클러스터형 어레이 상의 DNA 콜로니 내에 존재하는 핵산 분자는, 예를 들어 제WO 98/44152호에 기술되어 있는 바와 같이, 서열분석 반응용 주형을 제공할 수 있다. 제WO 98/44151호 및 제WO 00/18957호에 기술되어 있는 것과 같은 고체상 증폭 반응의 생성물은 소위 고정된 폴리뉴클레오티드 가닥과 고정된 상보성 가닥의 쌍을 어닐링(annealing)함으로써 형성되는 "가교" 구조이며, 이때 이들 가닥 둘 모두는 5'-말단에서 고체 지지체에 부착된다. 핵산 서열분석용으로 보다 적합한 주형을 제공하기 위해, 적어도 부분적으로 단일 가닥인 주형을 생성하기 위해 "가교" 구조 내의 고정된 가닥들 중 하나의 가닥의 실질적으로 전체 또는 적어도 일부를 제거하는 것이 바람직하다. 따라서, 단일 가닥인 주형의 일부는 서열분석 프라이머와의 혼성화용으로 사용 가능할 것이다. "가교" 이중 가닥 핵산 구조 내의 하나의 고정된 가닥의 전체 또는 일부를 제거하는 공정은 "선형화"로서 지칭된다. 효소적 절단, 포토-화학적 절단 또는 화학적 절단을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 선형화 방법이 존재한다. 선형화 방법의 비제한적인 예는 그 전문이 본원에서 참고로 인용된 PCT 공개공보 제WO 2007/010251호, 미국 특허 공개공보 제2009/0088327호, 미국 특허 공개공보 제2009/0118128호 및 미국 출원 제62/671,816호에 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, 3'-OH 차단기를 탈보호 또는 제거하기 위한 조건은 선형화 공정과 상용성이다. 일부 추가의 실시형태에서, 탈보호 조건은 Pd 복합체 및 포스핀의 사용, 예를 들어 Pd(OAc)2 및 THP의 사용을 포함하는 화학적 선형화 공정과 상용성이다. 일부 실시형태에서, Pd 복합체는 포스핀의 존재 하에 원 위치에서 Pd(0)를 생성하는 Pd(II) 복합체이다.
달리 표시하지 않는 한, 뉴클레오티드에 대한 언급은 또한 뉴클레오시드에 적용할 수 있도록 하기 위한 것이다.
표지된 뉴클레오티드
본 개시내용의 양태에 따르면, 상술한 3'-OH-차단된 뉴클레오티드는 또한 검출 가능한 표지를 포함하고, 이 같은 뉴클레오티드는 표지된 뉴클레오티드로 지칭된다. 표지(예를 들어, 형광 염료)는 소수성 인력, 이온성 인력 및 공유 부착을 비롯한 다양한 수단을 이용하여 선택적인 링커를 통해 접합될 수 있다. 일부 양태에서, 염료는 공유 부착에 의해 기질에 접합된다. 보다 구체적으로는, 공유 부착은 링커 기를 통해 이루어진다. 일부의 경우, 이 같은 표지된 뉴클레오티드는 또한 "변형된 뉴클레오티드"로서 지칭된다.
표지된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는, 비제한적인 예로서 PCR 증폭, 등온선 증폭, 고체상 증폭, 폴리뉴클레오티드 서열분석(예를 들어, 고체상 서열분석), 틈 번역(nick translation) 반응 등에서와 같이 효소적 합성에 의해 형성된 폴리뉴클레오티드를 표지하는데 유용하다.
일부 실시형태에서, 염료는 뉴클레오티드 염기를 통해 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드에 공유 부착될 수 있다. 예를 들어, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 링커 모이어티를 통해 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자푸린 염기의 C7 위치에 부착되어 있는 표지를 가질 수 있다.
달리 표시하지 않는 한, 뉴클레오티드에 대한 언급은 또한 뉴클레오시드에 적용할 수 있도록 하기 위한 것이다. 또한, 본 출원은 DNA를 참고하여 추가로 설명될 것이지만, 달리 표시하지 않는 한, 상기 설명은 또한 RNA, PNA 및 기타 핵산에 적용 가능할 것이다.
링커
본원에 기술되어 있는 일부 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 분자의 푸린 또는 피리미딘 염기는 상술한 바와 같은 검출 가능한 표지에 연결될 수 있다. 일부 이 같은 실시형태에서, 사용된 링커는 절단 가능하다. 절단 가능한 링커를 사용하면 표지가 필요한 경우 검출 이후에 제거될 수 있다는 것이 보장되어, 후속적으로 혼입되는 임의의 표지된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드에 의한 임의의 간섭 신호를 피하게 된다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 아지도 모이어티, -O-C2-C6 알케닐 모이어티(예를 들어, -O-알릴), 이황화물 모이어티, 아세탈 모이어티(본원에 기술되어 있는 3'-아세탈 차단기와 동일하거나 유사함) 또는 티오카바메이트 모이어티(본원에 기술되어 있는 3'-아세탈 차단기와 동일하거나 유사함)를 포함한다.
일부 기타 실시형태에서, 사용된 링커는 절단 불가능하다. 본 발명의 표지된 뉴클레오티드가 혼입되어 있는 각각의 경우 어떠한 뉴클레오티드도 후속적으로 혼입될 필요가 없기 때문에 표지가 뉴클레오티드로부터 제거될 필요가 없다.
절단 가능한 링커는 당해 기술분야에 알려져 있으며, 통상적인 화학이 링커를 뉴클레오티드 염기 및 표지에 부착시키기 위해 적용될 수 있다. 링커는 산, 염기, 구핵원자(nucleophile), 친전자체(electrophile), 라디칼, 금속, 환원제 또는 산화제, 빛, 온도, 효소 등에 대한 노출을 비롯한 임의의 적합한 방법에 의해 절단될 수 있다. 또한, 본원에서 토의된 링커는 3'-O-차단기의 결합을 절단하기 위해 사용되는 동일한 촉매로 절단될 수 있다. 적합한 링커는, 문헌[Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons]에 개시된 바와 같이, 표준 화학적 보호기로부터 변경될 수 있다. 고체상 합성에 사용된 추가의 적합한 절단 가능한 링커는 문헌[Guillier et al. (Chem. Rev. 100: 2092-2157, 2000)]에 개시되어 있다.
검출 가능한 표지가 염기에 부착되어 있는 경우, 링커는 뉴클레오티드 염기상의 임의의 위치에 부착될 수 있으며, 단 왓슨-크릭 염기쌍 형성(Watson-Crick base pairing)은 여전히 실시 가능하다. 푸린 염기의 맥락에서, 링커가 푸린 또는 바람직한 데아자푸린 유사체의 7-위치를 통해, 8-변형된 푸린을 통해, N-6-변형된 아데노신 또는 N-2-변형된 구아닌을 통해 부착되는 경우가 바람직하다. 피리미딘의 경우, 부착은 바람직하게는 시토신, 티미딘 또는 우라실 상의 5-위치 및 시토신 상의 N-4 위치를 통해 이루어진다.
일부 실시형태에서, 링커는 스페이서 유닛을 포함할 수 있다. 링커의 길이는 중요하지 않으며, 단 표지는 뉴클레오티드와 효소, 예를 들어 폴리머라아제 사이의 임의의 상호작용을 방해하지 않도록 뉴클레오티드로부터 충분한 거리가 유지된다.
일부 실시형태에서, 링커는 3'-OH 보호기로서 유사한 작용기로 이루어질 수 있다. 이는, 단일 처리만이 표지 및 보호기 둘 모두를 제거하는데 요구될 것이므로, 탈보호 및 탈보호 공정을 보다 효율적으로 만들 것이다.
"절단 가능한 링커"의 사용은 전체 링커가 제거될 필요가 있다는 것을 내포한다는 것을 의미하는 것은 아니다. 절단 부위는 링커의 일부가 절단 이후에 염료 및/또는 기질 모이어티에 부착되어 있다는 것을 보장하도록 링커 상의 위치에 위치할 수 있다. 절단 가능한 링커는, 비제한적인 일례로, 전기 친화성으로 절단 가능한 링커, 구핵성으로 절단 가능한 링커, 광 절단 가능한 링커일 수 있거나, 환원 조건(예를 들어, 이황화물 또는 아지드 함유 링커) 또는 산화 조건 하에 절단 가능하고, 안전-포획 링커(safety-catch linker)의 사용을 통해 절단 가능하고, 제거 기작에 의해 절단 가능할 수 있다. 염료 화합물을 기질 모이어티에 부착하기 위해 절단 가능한 링커를 사용하면 표지가 필요한 경우 검출 이후에 제거될 수 있다는 것이 보장되어, 하류 단계에서 임의의 간섭 신호를 피하게 된다.
유용한 링커 기는 PCT 공개공보 제WO2004/018493호(본원에서 참고로 인용됨)에 확인될 수 있으며, 이의 예로는 수용성 포스핀, 또는 전이 금속 및 적어도 부분적으로 수용성 리간드, 예를 들어 Pd(II) 복합체 및 THP로부터 형성된 수용성 전이 금속 촉매를 이용하여 절단될 수 있는 링커를 들 수 있다. 수용액 중에서, 후자는 적어도 부분적으로 수용성인 전이 금속 복합체를 형성한다. 이 같은 절단 가능한 링커는 본원에 개시된 염료와 같은 표지에 뉴클레오티드의 염기를 연결시키기 위해 사용될 수 있다.
특징 링커로는 하기 화학식의 모이어티를 포함하는 것과 같이 PCT 공개공보 제WO2004/018493호(본원에서 참고로 인용됨)에 개시되어 있는 것을 들 수 있다:
(상기 식에서, X는 O, S, NH 및 NQ를 포함하는 군으로부터 선택되며, 이때 Q는 C1-10 치환 또는 비치환된 알킬기이고, Y는 O, S, NH 및 N(알릴)을 포함하는 군으로부터 선택되고, T는 수소 또는 C1-C10 치환 또는 비치환된 알킬기이고, *는 모이어티가 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 나머지 부분에 연결되어 있다는 것을 나타냄). 일부 양태에서, 링커는, 예를 들어 본원에 기술되어 있는 염료 화합물과 같은 표지에 뉴클레오티드의 염기를 연결시킨다.
링커의 부가적인 예로는 하기 화학식의 모이어티를 포함하는 것과 같이 미국 공개공보 제2016/0040225호(본원에서 참고로 인용됨)에 개시되어 있는 것을 들 수 있다:
본원에 나타나 있는 링커 모이어티는 뉴클레오티드/뉴클레오시드와 표지 사이에 전체 또는 부분 링커 구조를 포함할 수 있다.
링커("L")의 부가적인 예로는 하기 화학식의 모이어티를 들 수 있다:
특정 실시형태에서, 형광 염료(형광단)와 구아닌 염기 사이의 링커의 길이는, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜 스페이서 기를 도입함으로써 변경될 수 있으며, 그 결과 당해 기술분야에 알려져 있는 기타 결합을 통해 구아닌 염기에 부착되는 동일한 형광단과 비교하여 형광 세기를 증가시킬 수 있다. 예시적인 링커 및 이들의 특성은 PCT 공개공보 제WO2007020457호(본원에서 참고로 인용됨)에 개시되어 있다. 링커 및 특히 이들의 증가된 길이에 대한 설계는 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드 내로 혼입되는 경우에 구아노신 뉴클레오티드의 구아닌 염기에 부착되어 있는 형광단의 휘도의 개선을 가능케 할 수 있다. 따라서, 염료가 구아닌 함유 뉴클레오티드에 부착되어 있는 형광 염료 표지의 검출이 요구되는 임의의 분석 방법에 사용하기 위한 것인 경우, 제WO 2007/020457호에 기술되어 있는 바와 같이, 링커는 화학식 -((CH2)2O)n-(여기서, n은 2와 50 사이의 정수임)의 스페이서 기를 포함하는 것이 유리하다.
뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 당 또는 핵염기 상의 부위에 표지될 수 있다. 당해 기술분야에 알려져 있는 바와 같이, "뉴클레오티드"는 질소성 염기, 당 및 하나 이상의 인산기로 이루어져 있다. RNA에서, 당은 리보오스이고, DNA에서는 데옥시리보오스, 즉 리보오스에 존재하는 하이드록실기가 없는 당이다. 질소성 염기는 푸린 또는 피리미딘의 유도체이다. 푸린은 아데닌(A) 및 구아닌(G)이고, 피리미딘은 시토신(C) 및 티민(T)이거나, RNA의 맥락에서는 우라실(U)이다. 데옥시리보오스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 푸린의 N-9에 결합된다. 또한, 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 인산에스테르이며, 여기서 당의 C-3 또는 C-5에 부착되어 있는 하이드록시기 상에서 에스테르화가 일어난다. 뉴클레오티드는 통상 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트이다.
"뉴클레오시드"는 뉴클레오티드와 구조적으로 유사하지만, 포스페이트 모이어티가 빠져 있다. 뉴클레오시드 유사체의 예로는 표지가 염기에 연결되어 있고 어떠한 인산기도 당 분자에 부착되어 있지 않는 것일 수 있다.
염기가 통상 푸린 또는 피리미딘으로 지칭될지라도, 당업자라면 왓슨-크릭 염기쌍 형성을 거치는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 능력을 변경하지 않는 유도체 및 유사체가 이용 가능하다는 것을 인지할 것이다. "유도체" 또는 "유사체"는 코어 구조가 모체 화합의 코어 구조와 동일하거나 매우 비슷하지만, 예를 들어 상이하거나 부가적인 측기(side group)와 같은 화학적 또는 물리적 변형을 갖는 화합물 또는 분자를 의미하며, 이때 상기 변형은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유도체가 다른 분자에 연결되도록 한다. 예를 들어, 염기는 데아자푸린일 수 있다. 특정 실시형태에서, 유도체는 왓슨-크릭 쌍 형성을 거칠 수 있을 것이다. 또한, "유도체" 및 "유사체"는, 예를 들어 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 갖는 합성 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유도체를 포함한다. 이 같은 유도체 및 유사체는, 예를 들어 문헌[Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980)] 및 문헌[Uhlman et al., Chemical Reviews 90: 543-584, 1990]에 토의되어 있다. 또한, 뉴클레오티드 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬-포스포네이트, 포스포아닐리데이트, 포스포아미데이트 결합 등을 포함하는 변형된 인산디에스테르 결합을 포함할 수 있다.
염료는, 예를 들어 링커를 통해 뉴클레오티드 염기 상의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 특정 실시형태에서, 왓슨-크릭 염기쌍 형성은 얻어진 유사체에 대해서도 여전히 수행될 수 있다. 특정 핵염기 표지 부위는 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자푸린 염기의 C7 위치를 포함한다. 상술한 바와 같이, 링커 기는 염료를 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에 공유 부착시키기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 표지된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 효소적으로 혼입 가능하고 효소적으로 연장 가능할 수 있다. 따라서, 링커 모이어티는, 화합물이 핵산 복제 효소에 의한 뉴클레오티드의 전체 결합 및 인식을 유의하게 방해하지 않도록 뉴클레오티드를 화합물에 연결시키기에 충분한 길이를 가질 수 있다. 따라서, 링커는 또한 스페이서 유닛을 포함할 수 있다. 스페이서는, 예를 들어 절단 부위 또는 표지로부터 뉴클레오티드 염기만큼 떨어져 있다.
본원에 기술되어 있는 염료로 표시된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 하기 화학식을 가질 수 있다:
상기 식에서, 염료는 염료 화합물이고; B는, 예를 들어 우라실, 티민, 시토신, 아데닌, 구아닌 등과 같은 핵염기이고; L은 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 선택적인 링커 기이고; R'는 H, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 티오포스페이트, 인산에스테르 유사체, 반응성 인 함유기에 부착되어 있는 -O-, 또는 차단기에 의해 보호된 -O-일 수 있고; R"'는 H, OH, 포스포라미다이트, 또는 본원에 기술되어 있는 3'-OH 차단기일 수 있고; R"는 H 또는 OH이다. R"'가 포스포라미다이트인 경우, R'는 자동화 합성 조건 하에 후속적인 단량체 결합을 가능케 하는 산-절단 가능한 하이드록시 보호기이다.
특정 실시형태에서, 링커(염료와 뉴클레오티드 사이의 링커) 및 차단기는 둘 모두 존재하며, 별개의 모이어티이다. 특정 실시형태에서, 링커 및 차단기는 둘 모두 실질적으로 유사한 조건 하에 절단 가능하다. 따라서, 탈보호 및 탈차단 공정은, 단일 처리만이 염료 화합물 및 차단기 둘 모두를 제거하는데 요구될 것이기 때문에 보다 효율적일 수 있다. 그러나, 일부 실시형태에서 링커 및 차단기는 유사한 조건 하에 절단 가능할 필요가 없는 대신, 별도의 조건 하에 개별적으로 절단 가능하다.
또한, 본 개시내용은 염료 화합물이 혼입되어 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이 같은 폴리뉴클레오티드는 인산디에스테르 결합으로 연결된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로 각각 구성되는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시되어 있는 바와 같은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 염료 화합물로 표지됨)와 조합하여 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드, 본원에 기술되어 있는 표지된 뉴클레오티드를 제외한 비자연적으로 발생하는(또는 변형된) 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오티드는 비자연 골격 결합 및/또는 비뉴클레오티드의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 리보뉴클레오티드와 데옥시리보뉴클레오티드의 혼합물로 구성된 키메라 구조가 또한 고려된다.
본원에 기술되어 있는 바와 같은 비제한적이고 예시적인 표지된 뉴클레오티드는 하기 구조를 포함한다:
상기 식에서, L은 링커를 나타내고, R은 상술한 바와 같은 당 잔기를 나타내거나, 5' 위치가 1개, 2개 또는 3개의 포스페이트로 치환된 당 잔기를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 비제한적이고 예시적인 형광 염료 접합체가 하기에 나타나 있다:
상기 식에서, PG는 본원에 기술되어 있는 3'-하이드록시 차단기를 나타낸다. 본원에 기술되어 있는 표지된 뉴클레오티드의 임의의 실시형태에서, 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 트리포스페이트이다.
키트
또한, 본 개시내용은 본원에 기술되어 있는 하나 이상의 3'-차단된 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드, 예를 들어 화학식 I, 화학식 Ia 또는 화학식 II의 3'-차단된 뉴클레오티드를 포함하는 키트를 제공한다. 이 같은 키트는 일반적으로 적어도 하나의 추가의 성분과 함께 염료로 표지된 적어도 하나의 3'-차단된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함할 것이다. 추가의 성분(들)은 본원에 개시된 방법 또는 하기 실시예 단락에 개시된 방법으로 식별되는 성분들 중 하나 이상일 수 있다. 본 개시내용의 키트 내로 조합될 수 있는 성분의 일부 비제한적인 예가 하기에 개시되어 있다.
특정 실시형태에서, 키트는 표지되거나 표지되지 않은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드와 함께 적어도 하나의 표지되고 3'-차단된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 염료로 표지된 뉴클레오티드는 표지되지 않거나 고유의 뉴클레오티드 및/또는 형광 표지된 뉴클레오티드 또는 임의의 이들 조합과 조합하여 공급될 수 있다. 뉴클레오티드의 조합은 별개의 개개의 성분(예를 들어, 용기 또는 튜브 당 하나의 뉴클레오티드 유형) 또는 뉴클레오티드 혼합물(예를 들어, 동일한 용기 또는 튜브 내에서 혼합된 2개 이상의 뉴클레오티드)로서 제공될 수 있다.
키트가 염료 화합물로 표지된, 복수, 특히 2개 또는 3개, 또는 보다 구체적으로는 4개의 3'-차단된 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 상이한 뉴클레오티드는 상이한 염료 화합물로 표지될 수 있거나, 하나는 염료 화합물 없이 짙은 색일 수 있다. 상이한 뉴클레오티드가 상이한 염료 화합물로 표지되는 경우, 키트의 특징은 염료 화합물이 스펙트럼 상 구별 가능한 형광 염료라는 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "스펙트럼 상 구별 가능한 형광 염료"란 용어는 2개 이상의 이 같은 염료가 하나의 샘플 내에 존재하는 경우에 형광 검출 장비(예를 들어, 상업용 모세관 기반 DNA 서열분석 플랫폼)에 의해 구별 가능할 수 있는 파장에서 형광 에너지를 방출하는 형광 염료를 지칭한다. 형광 염료 화합물로 표지된 2개의 뉴클레오티드가 키트 형태로 공급되는 경우, 일부 실시형태의 특징은 스펙트럼 상 구별 가능한 형광 염료가, 예를 들어 동일한 레이저를 이용하는 것과 같이 동일한 파장에서 여기될 수 있다는 것이다. 형광 염료 화합물로 표지된 4개의 3'-차단된 뉴클레오티드(A, C, T 및 G)가 키트 형태로 공급되는 경우, 일부 실시형태의 특징은 스펙트럼 상 구별 가능한 형광 염료들 중 2개 모두가 하나의 파장에서 여기될 수 있고, 나머지 2개의 스펙트럼 상 구별 가능한 염료 둘 모두가 다른 파장에서 여기될 수 있다는 것이다. 특정 여기 파장은 488 ㎚ 및 532 ㎚이다.
하나의 실시형태에서, 키트는 제1 염료로 표지된 제1 3'-차단된 뉴클레오티드 및 제2 염료로 표지된 제2 뉴클레오티드를 포함하며, 이때 염료는 적어도 10 ㎚, 특히 20 ㎚ 내지 50 ㎚의 흡광 최대치에서의 차이를 갖는다. 보다 구체적으로는, 2개의 염료 화합물은 15 ㎚와 40 ㎚ 사이의 스톡스 이동(Stokes shift)을 가지며, 이때 "스톡스 이동"은 피크 흡광 파장과 피크 발광 파장 사이의 거리이다.
대안적인 실시형태에서, 본 개시내용의 키트는 동일한 염기가 2개 이상의 상이한 염료로 표지되어 있는 3'-차단된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 제1 뉴클레오티드(예를 들어, 3'-차단된 T 뉴클레오티드 트리포스페이트 또는 3'-차단된 G 뉴클레오티드 트리포스페이트)는 제1 염료로 표지될 수 있다. 제2 뉴클레오티드(예를 들어, 3'-차단된 C 뉴클레오티드 트리포스페이트)는 제1 염료와는 스펙트럼 상 별도의 제2 염료, 예를 들어 600 ㎚ 미만에서 흡광하는 "녹색" 염료로 표지될 수 있으며, "청색" 염료는 500 ㎚ 미만, 예를 들어 400 ㎚ 내지 500 ㎚, 특히 450 ㎚ 내지 460 ㎚에서 흡광한다. 제3 뉴클레오티드(예를 들어, 3'-차단된 A 뉴클레오티드 트리포스페이트)는 제1 염료와 제2 염료의 혼합물 또는 제1 염료, 제2 염료와 제3 염료의 혼합물로서 표지될 수 있으며, 제4 뉴클레오티드(예를 들어, 3'-차단된 G 뉴클레오티드 트리포스페이트 또는 3'-차단된 T 뉴클레오티드 트리포스페이트)는 '짙은 색'일 수 있으며, 표지를 함유하지 않는다. 일예에서, 제1 내지 제4 뉴클레오티드는 '청색', '녹색', '청색/녹색' 및 짙은 색으로 표지될 수 있다. 기기 장치를 더 간소화하기 위해, 4개의 뉴클레오티드를 단일 레이저에 의해 여기된 2개의 염료로 표지될 수 있으며, 따라서 제1 내지 제4 뉴클레오티드의 표지는 '청색 1', '청색 2', '청색 1/청색 2' 및 짙은 색일 수 있다.
특정 실시형태에서, 키트는 4개의 표지된 3'-차단된 뉴클레오티드(예를 들어, A, C, T, G)를 함유할 수 있으며, 여기서 각각의 유형의 뉴클레오티드는 동일한 3'-차단기 및 형광 표지를 포함하고, 각각의 형광 표지는 별도의 형광 최대치를 가지며, 형광 표지 각각은 기타 3개의 표지와는 구별 가능하다. 키트는 형광 표지들 중 2개 이상이 유사한 흡광 최대치를 갖지만 상이한 스톡스 이동을 갖도록 이루어질 수 있다. 일부 기타 실시형태에서, 하나의 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않는다.
상이한 염료 화합물로 표지된 상이한 뉴클레오티드를 갖는 구성과 관련하여 키트가 본원에 예시되어 있지만, 키트는 동일한 염료 화합물을 갖는 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 상이한 뉴클레오티드를 함유할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 일부 실시형태에서, 키트는 또한 효소 및 효소의 작용에 적합한 완충제를 포함한다. 일부 이 같은 실시형태에서, 효소는 폴리머라아제, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라아제 또는 역전사 효소이다. 특정 실시형태에서, 효소는 DNA 폴리머라아제 812(Pol 812) 또는 DNA 폴리머라아제 1901(Pol 1901)과 같은 DNA 폴리머라아제가다. Pol 812 및 Pol 1901 폴리머라아제의 아미노산 서열은, 예를 들어 2019년 10월 31일 및 2019년 12월4일자로 각각 출원된 미국 특허 출원 제16/670,876호 및 제16/703,569호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 본원에서 참고로 인용된다.
이 같은 키트에 포함될 기타 성분은 완충제 등을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 뉴클레오티드, 및 상이한 뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 기타 임의의 뉴클레오티드 성분은 사용 전에 희석되도록 농축된 형태로 키트에 제공될 수 있다. 이 같은 실시형태에서, 적합한 희석 완충제가 또한 포함될 수 있다. 이번에도, 본원에 개시된 방법으로 식별된 성분들 중 하나 이상이 본 개시내용의 키트에 포함될 수 있다.
서열분석 방법
본 개시내용에 따른 표지된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드는 단독으로든 큰 분자 구조 또는 접합체 내에 혼입되든 또는 이와 연합되든 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드에 부착되어 있는 형광 표지를 검출하는 단계를 포함하는 방법과 같은 임의의 분석 방법에 사용될 수 있다. 이러한 맥락에서, "폴리뉴클레오티드 내에 혼입된"이란 용어는, 5'-포스페이트가 그 자체가 보다 긴 폴리뉴클레오티드 사슬의 일부를 형성할 수 있는 제2 (변형되거나 변형되지 않은) 뉴클레오티드의 3'-OH 기에 인산디에스테르 결합으로 연결된다는 것을 의미한다. 본원에 개시된 뉴클레오티드의 3'-말단은 추가의 (변형되거나 변형되지 않은) 뉴클레오티드의 5'-포스페이트에 인산디에스테르 결합으로 연결되거나 연결되지 않을 수 있다. 따라서, 하나의 비제한적인 실시형태에서 본 개시내용은 폴리뉴클레오티드 내에 혼입된 뉴클레오티드를 검출하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 (a) 본 개시내용의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 내에 혼입하는 단계 및 (b) 폴리뉴클레오티드 내에 혼입된 뉴클레오티드(들)에 부착된 염료 화합물로부터의 형광 신호를 검출함으로써 상기 뉴클레오티드(들)을 검출하는 단계를 포함한다.
이러한 방법은 본 개시내용에 따른 하나 이상의 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 내로 혼입시키는 합성 단계 (a) 및 폴리뉴클레오티드 내로 혼입된 하나 이상의 뉴클레오티드(들)의 형광을 검출하거나 정량적으로 측정함으로써 이들을 검출하는 검출 단계 (b)를 포함할 수 있다.
본 출원의 일부 실시형태는 서열분석 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 본원에 기술되어 있는 바와 같은 적어도 하나의 표지된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 내로 혼입시키는 단계; 및 (b) 폴리뉴클레오티드 내에 혼입된 표지된 뉴클레오티드(들)에 부착된 새로운 형광 염료로부터의 형광 신호를 검출함으로써 상기 뉴클레오티드(들)을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시형태는 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은,
(a) 본원에 기술되어 있는 바와 같이 3'-OH 차단기 및 검출 가능한 표지를 포함하는 뉴클레오티드를 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 적어도 일부에 상보적인 복제 폴리뉴클레오티드 가닥 내로 혼입시키는 단계;
(b) 복제 폴리뉴클레오티드 가닥 내로 혼입된 뉴클레오티드의 동일성을 검출하는 단계; 및
(c) 복제 폴리뉴클레오티드 가닥 내로 혼입된 뉴클레오티드로부터의 표지 및 3'-OH 차단기를 화학적으로 제거하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열분석 방법은 (d) 화학적으로 제거된 표지 및 3'-차단기를 복제 폴리뉴클레오티드 가닥으로부터 세척 제거하는 단계를 더 포함한다. 일부 이 같은 실시형태에서, 3'-차단기 및 검출 가능한 표지는 다음의 상보성 뉴클레오티드를 도입하기 전에 제거된다. 일부 추가의 실시형태에서, 3'-차단기 및 검출 가능한 표지는 화학 반응의 단일 단계에서 제거된다. 일부 실시형태에서, 세척 단계 (d)에서는 혼입되지 않은 뉴클레오티드가 또한 제거된다. 일부 추가의 실시형태에서, 표지 및 3'-차단기의 화학적 절단 이후 세척 단계에서 팔라듐 스캐빈저(palladium scavenger)가 또한 사용된다.
일부 실시형태에서, 주형 폴리뉴클레오티드 가닥의 일부의 서열을 결정할 때까지 단계 (a) 내지 단계 (d)를 반복한다. 일부 이 같은 실시형태에서, 단계 (a) 내지 단계 (d)를 적어도 50회, 적어도 75회, 적어도 100회, 적어도 150회, 적어도 200회, 적어도 250회 또는 적어도 300회 반복한다.
일부 실시형태에서, 표지 및 3'-차단기를 2개의 별개의 화학 반응으로 제거한다. 일부 이 같은 실시형태에서, 복제 폴리뉴클레오티드 가닥 내에 혼입된 뉴클레오티드로부터의 표지를 제거하는 단계는 혼입된 뉴클레오티드를 포함하는 복제 가닥을 제1 절단 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 이 같은 실시형태에서, 제1 절단 용액은 트리알킬포스핀과 같은 포스핀을 함유한다. 트리알킬포스핀의 비제한적인 예로는 트리스(하이드록시프로필)포스핀(THP), 트리스-(2-카복시에틸)포스핀(TCEP), 트리스(하이드록시메틸)포스핀(THMP) 또는 트리스(하이드록시에틸)포스핀(THEP)을 들 수 있다. 하나의 실시형태에서, 제1 절단 용액은 THP를 포함한다. 일부 이 같은 실시형태에서, 복제 폴리뉴클레오티드 가닥 내로 혼입된 뉴클레오티드로부터 3'-차단기를 제거하는 단계는 혼입된 뉴클레오티드를 포함하는 복제 가닥을 제2 절단 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 이 같은 실시형태에서, 제2 절단 용액은 팔라듐(Pd) 촉매를 함유한다. 일부 추가의 실시형태에서, Pd 촉매는 Pd(0) 촉매이다. 일부 이 같은 실시형태에서, Pd(0)는 Pd(II) 복합체[(PdCl(C3H5))2]를 THP와 원 위치에서 혼합함으로써 제조된다. Pd(II) 복합체와 THP의 몰비는 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 또는 1:10일 수 있다. 하나의 실시형태에서, Pd:THP 몰비는 1:5이다. 일부 추가의 실시형태에서, 아스코르브산 또는 이의 염(예를 들어, 아스코르브산나트륨)과 같은 하나 이상의 환원제가 첨가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 절단 용액은 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 카보네이트 염, 포스페이트 염 또는 보레이트 염 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 완충 시약을 함유할 수 있다. 일부 추가의 실시형태에서, 완충 시약은 에탄올아민(EA), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris), 글리신, 탄산나트륨, 인산나트륨, 붕산나트륨, 2-디메틸아미노메탄올(DMEA), 2-디에틸아미노메탄올(DEEA), N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 또는 N,N,N',N'-테트라에틸에틸렌디아민(TEEDA) 또는 이들의 조합을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 완충 시약은 DEEA이다. 다른 실시형태에서, 완충 시약은 카보네이트 염, 포스페이트 염 또는 보레이트 염 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 무기염을 함유한다. 하나의 실시형태에서, 무기염은 소듐 염이다. 일부 기타 실시형태에서, 제2 절단 용액은 NaIO4 또는 옥손®을 함유한다. 일부 추가의 실시형태에서, 3'-차단된 뉴클레오티드는 AOM 기를 함유하고, 제2 절단 용액은 팔라듐(Pd) 촉매 및 본원에 기술되어 있는 하나 이상의 완충 시약(예를 들어, DEEA와 같은 3차 아민)을 함유하고, 약 9.0 내지 약 10.0(예를 들어, 9.6 또는 9.8)의 pH를 갖는다.
일부 대안적인 실시형태에서, 표지 및 3'-OH 차단기는 단일 화학 반응으로 제거된다. 일부 이 같은 실시형태에서, 표지는 3'-차단기와 동일한 모이어티를 포함하는 절단 링커를 통해 뉴클레오티드에 부착되며, 예를 들어 링커 및 3'-차단기 둘 모두는 본원에 기술되어 있는 바와 같이 아세탈 모이어티(
) 또는 티오카바메이트 모이어티(
)를 포함할 수 있다. 일부 이 같은 실시형태에서, 단일 화학 반응은 상술한 Pd 촉매를 함유하는 절단 용액에서 수행된다.
일부 추가의 실시형태에서, 혼입 단계 (a)에서 사용되는 뉴클레오티드는 완전 작용화된 A, C, T 및 G 뉴클레오티드 트리포스페이트이며, 이때 각각은 본원에 기술되어 있는 3'차단기를 함유한다. 일부 이 같은 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 뉴클레오티드는 표준 3'-O-아지도메틸 차단기로 보호된 동일한 뉴클레오티드와 비교하여 서열분석 운행(sequencing run) 동안에 용액 중에서 우수한 안정성을 제공한다. 예를 들어, 본원에 개시되어 있는 아세탈 또는 티오카바메이트 차단기는 동일한 기간 동안 동일한 조건에서 아지도메틸-보호된 3'-OH와 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1,000%, 1,500%, 2,000%, 2,500% 또는 3,000% 개선된 안정성을 부여할 수 있으며, 그 결과 예비 페이싱 값을 감소시키고 보다 긴 서열분석 판독 길이를 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 안정성은 주위 온도 또는 주위 온도 미만의 온도(예를 들어, 4℃ 내지 10℃)에서 측정된다. 기타 실시형태에서, 안정성은 승온, 예를 들어 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃ 또는 65℃에서 측정된다. 일부 이 같은 실시형태에서, 안정성은 염기성 pH 환경에서, 예를 들어 pH 9.0, pH 9.2, pH 9.4, pH 9.6, pH 9.8 또는 pH 10.0에서 용액 중에서 측정된다. 일부 추가의 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 3'-차단된 뉴클레오티드가 갖는 예비 페이싱 값은 50회 초과, 100회 초과 또는 150회 초과의 SBS 사이클 이후에 약 0.25 미만, 0.24 미만, 0.23 미만, 0.22 미만, 0.21 미만, 0.20 미만, 0.19 미만, 0.18 미만, 0.17 미만, 0.16 미만, 0.15 미만, 0.14 미만, 0.13 미만, 0.12 미만, 0.11 미만, 0.10 미만, 0.09 미만, 0.08 미만, 0.07 미만, 0.06 미만 또는 0.05 미만이다. 일부 추가의 실시형태에서, 3'-차단된 뉴클레오티드가 갖는 페이싱 값은 50회 초과, 100회 초과 또는 150회 초과의 SBS 사이클 이후에 약 0.25 미만, 0.24 미만, 0.23 미만, 0.22 미만, 0.21 미만, 0.20 미만, 0.19 미만, 0.18 미만, 0.17 미만, 0.16 미만, 0.15 미만, 0.14 미만, 0.13 미만, 0.12 미만, 0.11 미만, 0.10 미만, 0.09 미만, 0.08 미만, 0.07 미만, 0.06 미만 또는 0.05 미만이다. 하나의 실시형태에서, 각각의 ffN은 3'-AOM 기를 함유한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 3'-차단된 뉴클레오티드는 표준 3'-O-아지도메틸 차단기로 보호된 동일한 뉴클레오티드와 비교하여 서열분석 운행의 화학적 절단 단계 동안에 용액 중에서 우수한 탈차단율을 제공한다. 예를 들어, 본원에 개시되어 있는 아세탈(예를 들어, AOM) 또는 티오카바메이트 차단기는 표준 탈차단 시약(예를 들어, 트리스(하이드록시프로필)포스핀)을 이용하여 아지도메틸-보호된 3'-OH와 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1,000%, 1,500% 또는 2,000% 개선된 탈차단율을 부여할 수 있으며, 그 결과 서열분석 사이클을 위한 전체 시간을 줄일 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 뉴클레오티드에 대한 탈차단 시간은 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60%로 감소된다. 예를 들어, 3'-AOM 및 3'-O-아지도메틸에 대한 탈차단 시간은 특정 화학 반응 조건 하에 각각 약 4초 내지 5초 및 약 9초 내지 10초이다. 일부 실시형태에서, AOM 차단기의 반감기(t1/2)는 아지도메틸 차단기보다 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 빠르다. 일부 이 같은 실시형태에서, AOM의 t1/2는 약 1분인 반면, 아지도메틸의 t1/2는 약 11분이다. 일부 실시형태에서, 탈차단율은 주위 온도 또는 주위 온도 미만의 온도(예를 들어, 4℃ 내지 10℃)에서 측정된다. 기타 실시형태에서, 탈차단율은 승온, 예를 들어 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃ 또는 65℃에서 측정된다. 일부 이 같은 실시형태에서, 탈차단율은 염기성 pH 환경에서, 예를 들어 pH 9.0, pH 9.2, pH 9.4, pH 9.6, pH 9.8 또는 pH 10.0에서 용액 중에서 측정된다. 일부 이 같은 실시형태에서, 기질(즉, 3'-차단된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드)에 대한 탈차단 시약의 몰비는 약 10:1, 약 5:1, 약 2:1, 약 1:1, 약 1:2, 약 1:5 또는 약 1:10이다. 하나의 실시형태에서, 각각의 ffN은 3'-AOM 기를 함유한다.
본원에 기술되어 있는 방법의 임의의 실시형태에서, 표지된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 트리포스페이트이다. 본원에 기술되어 있는 방법의 임의의 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 가닥은 플로우셀(flow cell)과 같은 고체 지지체에 부착되어 있다.
하나의 실시형태에서, 적어도 하나의 뉴클레오티드는 폴리머라아제 효소의 작용에 의해 합성 단계에서 폴리뉴클레오티드 내로 혼입된다. 일부 이 같은 실시형태에서, 폴리머라아제는 DNA 폴리머라아제 Pol 812 또는 Pol 1901일 수 있다. 그러나, 예를 들어 화학적 올리고뉴클레오티드 합성, 또는 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드에 대한 표지된 올리고뉴클레오티드의 결찰(결찰)과 같은 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드에 연결하는 기타 방법이 사용될 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드에 관련하여 사용되는 경우에 "혼입하는"이란 용어는 효소적 방법뿐만 아니라 화학적 방법에 의한 폴리뉴클레오티드 합성을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 합성 단계가 수행되며, 선택적으로는 주형 폴리뉴클레오티드 가닥을 본 개시내용의 표지된 3'-차단된 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물과 함께 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 폴리머라아제는 주형 폴리뉴클레오티드 가닥에 어닐링된 폴리뉴클레오티드 가닥 상의 유리 3'-OH 기와 뉴클레오티드 상의 5' 인산기 사이의 인산디에스테르 결합의 형성을 허용하는 조건 하에 제공될 수 있다. 따라서, 합성 단계는 주형 가닥에 대한 뉴클레오티드의 상보성 염기쌍 형성에 의해 유도되는 바와 같이 폴리뉴클레오티드 가닥을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법의 모든 실시형태에서, 검출 단계는 표지된 뉴클레오티드가 혼입되는 폴리뉴클레오티드 가닥이 주형 가닥에 어닐링되는 동안에 수행될 수 있거나, 2개의 가닥이 분리되는 변성 단계 이후에 수행될 수 있다. 추가의 단계, 예를 들어 화학적 또는 효소적 반응 단계 또는 정제 단계는 합성 단계 및 검출 단계 사이에 포함될 수 있다. 특히, 표지된 뉴클레오티드(들)가 혼입되어 있는 표적 가닥은 단리 또는 정제될 수 있으며, 그 이후에 추가로 가공되거나 후속적인 분석에 사용될 수 있다. 일례로, 합성 단계에서 본원에 기술되어 있는 바와 같은 뉴클레오티드(들)로 표지된 표적 폴리뉴클레오티드는 이후에 표지된 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 기타 실시형태에서, 본원에 개시된 합성 단계의 생성물에는 추가의 반응 단계가 적용될 수 있으며, 필요한 경우 이들 후속적인 단계의 생성물이 정제 또는 단리될 수 있다.
합성 단계에 적합한 조건은 표준 분자 생물학 기법에 익숙한 자들에게 잘 알려져 있을 것이다. 하나의 실시형태에서, 합성 단계는, 적합한 폴리머라아제 효소의 존재 하에 주형 가닥에 상보적인 연장된 표적 가닥을 형성하기 위해 뉴클레오티드 전구체(본원에 기술되어 있는 바와 같은 뉴클레오티드를 포함함)를 이용하는 표준 프라이머 연장 반응과 유사할 수 있다. 기타 실시형태에서, 합성 단계는 그 자체가 표적 및 주형 폴리뉴클레오티드 가닥을 복제한 것에서 유래하는 어닐링된 상보성 가닥으로 구성되어 있는 표지된 이중 가닥 증폭 생성물을 생성하는 증폭 반응의 일부를 형성할 수 있다. 기타 예시적인 합성 단계로는 틈 번역, 가닥 변위 중합, 무작위 프라이밍(priming) DNA 표지 등을 들 수 있다. 합성 단계용으로 특히 유용한 폴리머라아제 효소는 본원에 개시된 바와 같은 뉴클레오티드의 혼입을 촉매할 수 있는 효소이다. 자연적으로 발생하거나 변형된 다양한 폴리머라아제가 사용될 수 있다. 일례로, 열안정성 폴리머라아제가 열순환 조건을 이용하여 수행되는 합성 반응을 위해 사용될 수 있는 반면, 열안정성 폴리머라아제는 등온선 프라이머 연장 반응용으로 요구되지 않을 수 있다. 본 개시내용에 따른 뉴클레오티드를 혼입시킬 수 있는 적합한 열안정성 폴리머라아제로는 각각이 본원에서 참고로 인용된 제WO 2005/024010호 또는 제WO 06/120433호에 기술되어 있는 것들을 들 수 있다. 37℃와 같은 보다 낮은 온도에서 수행되는 합성 반응에서, 폴리머라아제 효소는 반드시 열안정성 폴리머라아제일 필요는 없으며, 따라서 폴리머라아제의 선택은 반응 온도, pH, 가닥 변위 활성 등과 같은 다수의 인자에 의존할 것이다.
특정 비제한적인 실시형태에서, 본 개시내용은 핵산 서열분석 방법, 재서열분석 방법, 전체 유전체 서열분석 방법, 단일 뉴클레오티드 다형성 스코어링(polymorphism scoring) 방법, 폴리뉴클레오티드 내에 혼입되는 경우에 본원에 개시된 표지된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 검출을 수반하는 임의의 기타 응용 방법을 포함한다. 형광 염료를 포함하는 뉴클레오티드로 표지된 폴리뉴클레오티드의 사용에 유익한 다양한 기타 응용들 중 임의의 것이 본원에 개시된 염료를 갖는 표지된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 이용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 폴리뉴클레오티드의 합성에 의한 서열분석(SBS) 반응에서의 본 개시내용에 따른 표지된 뉴클레오티드의 용도를 제공한다. 합성에 의한 서열분석은 일반적으로 서열분석 대상인 주형 핵산에 상보적인 연장된 폴리뉴클레오티드 사슬을 형성하기 위해 폴리머라아제 또는 리가아제를 이용하여 5'-방향에서 3'-방향으로 성장하는 폴리뉴클레오티드 사슬에 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 순차적으로 부가하는 단계를 수반한다. 부가된 뉴클레오티드(들) 중 하나 이상에 존재하는 염기의 동일성은 검출 또는 "이미지화" 단계에서 결정될 수 있다. 부가된 염기의 동일성은 각각의 뉴클레오티드 혼입 단계 이후에 결정될 수 있다. 이어서, 주형의 서열은 통상적인 왓슨-크릭 염기쌍 형성 규칙을 이용하여 추론될 수 있다. 단일 염기의 동일성을 결정하기 위해 본원에 개시된 표지된 뉴클레오티드의 사용은, 예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형성 스코어링에 유용할 수 있으며, 이 같은 단일 염기 연장 반응은 본 개시내용의 범위 내에 있다.
본 개시내용의 실시형태에서, 주형 폴리뉴클레오티드의 서열은, 본원에 기술되어 있는 하나 이상의 3'-차단된 뉴클레오티드를 혼입된 뉴클레오티드(들)에 부착되어 있는 형광 표지(들)의 검출을 통해 서열분석 대상인 주형 폴리뉴클레오티드에 상보적인 신생 가닥 내로 혼입되는 것을 검출함으로써 결정된다. 주형 폴리뉴클레오티드의 서열분석은 적합한 프라이머로 프라이밍될 수 있으며(프라이머를 헤어핀의 일부서 함유할 헤어핀 구조체로서 준비될 수 있음), 신생 사슬은 폴리머라아제 촉매 반응에서 프라이머의 3'-말단에 뉴클레오티드를 부가함으로써 단계적으로 연장된다.
특정 실시형태에서, 상이한 뉴클레오티드 트리포스페이트(A, T, G 및 C) 각각은 특유의 형광단으로 표지될 수 있으며, 또한 제어되지 않은 중합을 방지하기 위해 3'-위치에 차단기를 포함한다. 대안적으로, 4개의 뉴클레오티드 중 하나는 표지되지 않을 수 있다(짙은 색). 폴리머라아제 효소에 의해 뉴클레오티드가 주형 폴리뉴클레오티드에 상보적인 신생 사슬 내로 혼입되고, 차단기는 뉴클레오티드의 추가의 혼입을 방지한다. 임의의 혼입되지 않은 뉴클레오티드는 세척 제거될 수 있으며, 각각의 혼입된 뉴클레오티드에서 유래하는 형광 신호는 레이저 여기를 이용하는 전하 결합 장치 및 적합한 발광 필터와 같은 적합한 수단에 의해 광학적으로 "판독"될 수 있다. 이어서, 3'-차단기 및 형광 염료 화합물은 동시에 또는 순차적으로 제거(탈보호)되어 뉴클레오티드의 추가의 혼입을 위한 신생 사슬을 노출시킬 수 있다. 전형적으로, 혼입된 뉴클레오티드의 동일성은 각각의 혼입 단계 이후에 결정될 것이지만, 이는 엄격하게는 필수적인 것은 아니다. 유사하게, 미국 특허 제5,302,509호(본원에서 참고로 인용됨)에는 고체 지지체 상에 공정된 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는 방법이 개시되어 있다.
상기에 나타나 있는 바와 같이, 상기 방법은 DNA 폴리머라아제의 존재 하에 형광 표지되고 3'-차단된 뉴클레오티드인 A, G, C, 및 T를 고정된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 성장하는 가닥 내에 혼입하는 단계를 이용한다. 폴리머라아제에 의해 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기가 혼입되지만, 3'-차단기에 의해 추가의 부가가 방지된다. 이어서, 혼입된 뉴클레오티드의 표지가 결정될 수 있으며, 차단기는 추가의 중합이 일어나도록 하기 위해 화학적 절단에 의해 제거될 수 있다. 합성에 의한 서열분석 반응에서 서열분석 대상인 핵산 주형은 서열분석이 요구되는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 서열분석 반응을 위한 핵산 주형은 전형적으로 서열분석 반응에서 추가의 뉴클레오티드의 부가를 위한 프라이머 또는 개시점으로서 작용하는 유리 3'-OH 기를 갖는 이중 가닥 영역을 포함할 것이다. 서열분석 대상인 주형의 영역은 상보성 가닥 상의 이러한 유리 3'-OH 기가 돌출되어 있을 것이다. 서열분석 대상인 주형의 돌출 영역은 단일 가닥일 수 있지만 이중 가닥일 수 있으며, 단 서열분석 반응의 개시를 위한 유리 3'-OH 기를 제공하기 위해 서열분석 대상인 주형 가닥에 상보적인 가닥 상에는 "틈(nick)이 존재"한다. 이 같은 실시형태에서, 서열분석은 가닥 변위에 의해 진행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 유리 3'-OH 기를 갖고 있는 프라이머는 서열분석 대상인 주형의 단일 가닥 영역과 혼성화하는 별개의 성분(예를 들어, 짧은 올리고뉴클레오티드)로서 부가될 수 있다. 대안적으로, 프라이머 및 서열분석 대상인 주형 가닥은 각각 예를 들어 헤어핀 루프 구조와 같은 분자 내 이중체(intramolecular duplex)를 형성할 수 있는 부분적으로 자기 상보적인 핵산 가닥의 일부를 형성할 수 있다. 헤어핀 폴리뉴클레오티드 및 이들을 고체 지지체에 부착할 수 있는 방법이 각각이 본원에서 참고로 인용된 PCT 공개공보 제WO 01/57248호 및 WO 제2005/047301호에 개시되어 있다. 뉴클레오티드는 성장하는 프라이머에 연속적으로 부가될 수 있으며, 그 결과 5'-방향에서 3'-방향으로의 폴리뉴클레오티드 사슬의 합성이 이루어질 수 있다. 부가되어 있는 염기의 특성은 각각의 뉴클레오티드의 부가 이후에 필수적이지 않지만 특별히 결정될 수 있으며, 따라서 핵산 주형에 대한 서열 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 5'-인산기와의 인산디에스테르 결합의 형성을 통해 핵산 가닥의 유리 3'-OH 기에 뉴클레오티드를 연결함으로써 핵산 가닥(또는 폴리뉴클레오티드)에 혼입된다.
서열분석 대상인 핵산 주형은 DNA 또는 RNA일 수 있거나, 심지어는 데옥시뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드로 구성되어 있는 혼성 분자일 수 있다. 핵산 주형은 자연적으로 발생하고/하거나 비자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 및 자연 또는 비자연 골격 결합을 포함할 수 있으며, 단 이들은 서열분석 반응에서 주형을 복제하는 것을 방해하지 않는다.
특정 실시형태에서, 서열분석 대상인 핵산 주형은 당해 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 결합 방법, 예를 들어 공유 부착을 통해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 특정 실시형태에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체(예를 들어, 실리카 기반 지지체)에 직접 부착될 수 있다. 그러나, 본 개시내용의 기타 실시형태에서 고체 지지체의 표면은 주형 폴리뉴클레오티드의 직접적인 공유 부착을 허용하거나, 그 자체가 고체 지지체에 비공유적으로 부착될 수 있는 하이드로겔 또는 고분자 전해질 다층을 통해 주형 폴리뉴클레오티드를 고정시키기 위해 어떤 식으로든 변형될 수 있다.
합성에 의한 서열분석의 실시형태 및 대안
일부 실시형태는 파이로서열분석(pyrosequencing) 기법을 포함한다. 파이로서열분석에 의해 특정 뉴클레오티드가 신생 가닥에 혼입됨에 따라 무기 피로포스페이트(PPi)의 방출이 검출된다(그 개시내용의 전문이 본원에서 참고로 인용된 문헌[Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M. and Nyren, P. (1996) "Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release." Analytical Biochemistry 242(1), 84-9]; 문헌[Ronaghi, M. (2001) "Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing." Genome Res. 11(1), 3-11]; 문헌[Ronaghi, M., Uhlen, M. and Nyren, P. (1998) "A sequencing method based on real-time pyrophosphate." Science 281(5375), 363]; 미국 특허 제6,210,891호; 제6,258,568호 및 제6,274,320호). 파이로서열분석에서, 방출된 PPi는 ATP 설퍼라아제(ATP sulfurase)에 의해 아데노신 트리포스페이트(ATP)로 즉시 전환됨으로써 검출될 수 있으며, 생성된 ATP의 수준은 루시페라제-생성 양성자를 통해서 검출될 수 있다. 서열분석 대상인 핵산은 어레이 내의 특징부에 부착될 수 있으며, 상기 어레이는 어레이의 특징부에서의 뉴클레오티드의 혼입으로 인해 생성되는 화학 발광 신호를 캡처하기 위해 이미지화될 수 있다. 이미지는 특정 뉴클레오티드 유형(예를 들어, A, T, C 또는 G)으로 어레이를 처리한 이후에 수득될 수 있다. 각각의 뉴클레오티드 유형을 부가한 이후에 수득된 이미지는 어레이 내 특징부가 검출되는 것과 관련하여 차이가 날 것이다. 이미지에서의 이러한 차이는 어레이 상의 특징부의 상이한 서열 함량을 반영한다. 그러나, 각각의 특징부의 상대적 위치는 이미지에서 변함없이 남아 있을 것이다. 본원에 개시된 방법을 이용하여 이미지를 저장, 가공 및 분석할 수 있다. 예를 들어, 어레이를 각각의 상이한 뉴클레오티드 유형으로 처리한 이후에 수득된 이미지는 가역적 종결자 기반 서열분석 방법에 대한 상이한 검출 채널로부터 수득된 이미지에 대해 본원에 나타나 있는 바와 동일한 방식으로 처리될 수 있다.
다른 예시적인 유형의 SBS에서, 순환 서열분석은, 예를 들어 그 개시내용이 본원에서 참고로 인용된 제WO 04/018497호 및 미국 특허 제7,057,026호에 기술되어 있는 바와 같이, 예를 들어 절단 가능한 또는 광표백성 염료 표지를 함유하는 가역적 종결자 뉴클레오티드를 단계적으로 첨가함으로써 달성된다. 이러한 접근법은 솔렉사(Solexa; 현재는 일루미나 인코포레이티드(Illumina, Inc.)임) 의해 시판 중이며, 또한 각각이 본원에서 참고로 인용된 제WO 91/06678호 및 제WO 07/123,744호에 기술되어 있다. 종결이 역전될 수 있고 형광 표지가 절단된 형광 표지된 종결자의 이용 가능성으로 인해 효율적인 순환식 가역적 종결(CRT) 서열분석이 용이하게 된다. 또한, 폴리머라아제를 동시 조작하여 이들 변형된 뉴클레오티드를 효율적으로 혼입하고 이들로부터 연장할 수 있다.
바람직하게는, 가역적 종결자 기반 서열분석의 실시형태에서, 표지는 SBS 반응 조건 하에 연장을 실질적으로 억제하지 않는다. 그러나, 검출 표지는, 예를 들어 절단 또는 분해에 의해 제거 가능할 수 있다. 이미지는 어레이된 핵산 특징부 내로 표지를 혼입한 이후에 캡처될 수 있다. 특정 실시형태에서, 각각의 사이클은 4개의 상이한 뉴클레오티드 유형을 어레이로 동시에 전달하는 단계를 수반하고, 각각의 뉴클레오티드 유형은 스펙트럼 상 별도의 표지를 갖는다. 이어서, 4개의 이미지는 4개의 상이한 표지 중 하나에 선택적인 검출 채널을 각각 이용하여 수득될 수 있다. 대안적으로, 상이한 뉴클레오티드 유형은 순차적으로 첨가될 수 있고, 어레이의 이미지는 각각의 첨가 단계 사이에 수득될 수 있다. 이 같은 실시형태에서, 각각의 이미지는 특정 유형의 혼입된 뉴클레오티드를 갖는 핵산 특징부를 나타낼 것이다. 상이한 특징부는, 각각의 특징부의 상이한 서열 함량으로 인해 상이한 이미지 내에 존재하거나 존재하지 않을 것이다. 그러나, 특징부의 상대적 위치는 이미지 내에서 변함없이 남아 있을 것이다. 이 같은 가역적 종결자-SBS 방법으로부터 수득된 이미지를 본원에 개시되어 있는 바와 같이 저장, 가공 및 분석할 수 있다. 이미지 캡처 단계 이후, 표지는 제거될 수 있으며, 가역적 종결자 모이어티는 후속적인 뉴클레오티드 부가 및 검출 사이클을 위해 제거될 수 있다. 표지가 특정 사이클에서 검출되고 후속적인 사이클 이전에 검출된 이후에 표지의 제거는 사이클 사이에 배경 신호 및 누화(crosstalk)를 감소시킨다는 이점을 제공할 수 있다. 유용한 표지 및 제거 방법의 예가 하기에 개시되어 있다.
일부 실시형태는 4개 미만의 상이한 표지를 이용한 4개의 상이한 뉴클레오티드의 검출을 이용할 수 있다. 예를 들어, SBS는 미국 공개공보 제2013/0079232호의 인용 자료에 기술되어 있는 방법 및 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 첫 번째 실시예로서, 한 쌍의 뉴클레오티드 유형이 동일한 파장에서 검출될 수 있지만, 상기 쌍의 하나의 구성원과 비교한 다른 구성원에 대한 세기의 차이, 또는 상기 쌍의 하나의 구성원에 대해 검출된 신호와 비교하여 명백한 신호가 나타나거나 사라지도록 하는 상기 쌍의 다른 구성원에 대한 변화(예를 들어, 화학적 변형, 광화학적 변형 또는 물리적 변형을 통한 변화)에 기초하여 구별될 수 있다. 두 번째 실시예로서, 4개의 상이한 뉴클레오티드 유형 중 3개는 특정 조건 하에 검출될 수 있는 반면, 네 번째 뉴클레오티드 유형은 이들 조건 하에 검출 가능한 표지가 없거나, 이들 조건 하에 최소로 검출된다(예를 들어, 배경 형광 등으로 인한 최소 검출). 첫 3개의 뉴클레오티드 유형의 핵산 내로의 혼입은 이들 개개의 신호의 존재에 기초하여 결정될 수 있으며, 네 번째 뉴클레오티드 유형의 핵산 내로의 혼입은 임의의 신호의 부재 또는 최소 검출에 기초하여 결정될 수 있다. 세 번째 실시예로서, 하나의 뉴클레오티드 유형은 2개의 상이한 채널에서 검출되는 표지(들)를 포함할 수 있는 반면, 기타 뉴클레오티드 유형은 채널들 중 하나 정도에서 검출된다. 상술한 3개의 예시적인 구성은 상호 배타적인 것으로 간주되지 않으며, 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 3개의 실시예 모두를 조합하는 예시적인 실시형태는 형광 기반 SBS 방법으로서, 제1 채널에서 검출되는 제1 뉴클레오티드 유형(예를 들어, 제1 여기 파장에 의해 여기되는 경우에 제1 채널에서 검출되는 표지를 갖는 dATP), 제2 채널에서 검출되는 제2 뉴클레오티드 유형(예를 들어, 제2 여기 파장에 의해 여기되는 경우 제2 채널에서 검출되는 표지를 갖는 dCTP), 제1 및 제2 채널 둘 모두에서 검출되는 제3 뉴클레오티드 유형(예를 들어, 제1 및/또는 제2 여기 파장에 의해 여기되는 경우 채널 둘 모두에서 검출되는 적어도 하나의 표지를 갖는 dTTP) 및 어떠한 채널에서도 검출되지 않거나 최소로 검출되는 표지를 갖고 있지 않는 제4 뉴클레오티드 유형(예를 들어, 어떠한 표지도 갖고 있지 않는 dGTP)을 이용한다.
게다가, 미국 공개공보 제2013/0079232호의 인용 자료에 기술되어 있는 바와 같이, 서열분석 데이터는 단일 채널을 이용하여 수득될 수 있다. 소위 이 같은 단일 염료 서열분석 접근법에서, 제1 뉴클레오티드 유형은 표지되지만, 표지는 제1 이미지가 생성된 이후에 제거되고, 제2 뉴클레오티드 유형은 제1 이미지가 생성된 이후에만 표지된다. 제3 뉴클레오티드 유형은 제1 및 제2 이미지 둘 모두에서 자신의 표지를 유지하지만, 제4 뉴클레오티드 유형은 이미지 둘 모두에서 표지되지 않은 채로 남아 있다.
일부 실시형태는 결찰 기법에 의한 서열분석을 이용할 수 있다. 이 같은 기법에서는 DNA 리가아제를 이용하여 올리고뉴클레오티드를 혼입시키고, 이 같은 올리고뉴클레오티드의 혼입을 확인한다. 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 올리고뉴클레오티드가 혼성화하는 서열 내의 특정 뉴클레오티드의 동일성과 상호 관련이 있는 상이한 표지를 갖는다. 기타 SBS 방법과 마찬가지로, 이미지는 핵산 특징부의 어레이를 표지된 서열분석 시약으로 처리한 이후에 수득될 수 있다. 각각의 이미지는 특정 유형의 혼입된 표지를 갖는 핵산 특징부를 나타낼 것이다. 상이한 특징부는, 각각의 특징부의 상이한 서열 함량으로 인해 상이한 이미지 내에 존재하거나 존재하지 않을 것이지만, 특징부의 상대적 위치는 이미지에서 변함없이 남아 있을 것이다. 결찰 기반 서열분석 방법으로부터 수득된 이미지를 본원에 개시되어 있는 바와 같이 저장, 가공 및 분석할 수 있다. 본원에 기술되어 있는 방법 및 시스템과 함께 이용될 수 있는 예시적인 SBS 시스템 및 방법은 그 개시내용의 전문이 본원에서 참고로 인용된 미국 특허 제6,969,488호, 제6,172,218호 및 제6,306,597호에 기술되어 있다.
일부 실시형태는 나노포어 서열분석(nanopore sequencing)을 이용할 수 있다(그 개시내용의 전문이 본원에서 참고로 인용된 문헌[Deamer, D. W. & Akeson, M. "Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing." Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000)]; 문헌[Deamer, D. and D. Branton, "Characterization of nucleic acids by nanopore analysis", Acc. Chem. Res. 35: 817-825 (2002)]; 문헌[Li, J., M. Gershow, D. Stein, E. Brandin, and J. A. Golovchenko, "DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope" Nat. Mater. 2: 611-615 (2003)]). 이 같은 실시형태에서, 표적 핵산은 나노포어를 통과한다. 나노포어는 합성 포어 또는 생물학적 막 단백질(예를 들어, α-용혈소)일 수 있다. 표적 핵산이 나노포어를 통과함에 따라 각각의 염기쌍은 포어의 전기 전도도에서의 변동을 측정함으로써 식별될 수 있다(그 개시내용의 전문이 본원에서 참고로 인용된 미국 특허 제7,001,792호; 문헌[Soni, G. V. & Meller, "A. Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores." Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007)]; 문헌[Healy, K. "Nanopore-based single-molecule DNA analysis." Nanomed. 2, 459-481 (2007)]; 문헌[Cockroft, S. L., Chu, J., Amorin, M. & Ghadiri, M. R. "A single-molecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution." J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)]). 나노포어 서열분석으로부터 수득된 데이터를 본원에 개시되어 있는 바와 같이 저장, 가공 및 분석할 수 있다. 특히, 데이터는 본원에 개시되어 있는 광학 이미지 및 기타 이미지의 예시적인 처리에 따른 이미지로서 처리될 수 있다.
서열분석 방법의 일부 기타 실시형태는, 그 개시내용이 본원에서 참고로 인용된 미국 특허 제9,222,132호에 기술되어 있는 것과 같은 나노볼 서열분석(nanoball sequencing) 기법에서 본원에 기술되어 있는 3'-차단된 뉴클레오티드의 사용의 수반한다. 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification; RCA) 공정을 통해, 다수의 별개의 DNA 나노볼이 생성될 수 있다. 이어서, 나노볼 혼합물은 단일 나노볼이 각각의 위치와 결부되도록 하는 특징부를 함유하는 패턴화된 슬라이드 표면 상에 분포한다. DNA 나노볼의 생성 시, DNA를 단편화하여 4개의 어댑터 서열(adapter sequence) 중 첫 번째 서열에 결찰한다. 주형을 증폭하고, 원형화하고, II형 엔도뉴클레아제로 절단한다. 제2 세트의 어댑터를 첨가한 후, 증폭, 원형화 및 절단을 수행하였다. 나머지 2개의 어댑터에 대해 이러한 공정을 반복하였다. 최종 생성물은 4개의 어댑터를 갖는 원형 주형이며, 이때 각각은 주형 서열에 의해 분리되어 있다. 라이브러리 분자(library molecule)는 롤링 서클 증폭 단계를 거쳐서 DNA 나노볼로 지칭되는 대량의 콘카테머(concatemer)를 생성하며, 그 이후에 이를 플로우셀 상에 침착시킨다(문헌[Goodwin et al., "Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies," Nat Rev Genet. 2016; 17(6): 333-51]).
일부 실시형태는 DNA 폴리머라아제 활성의 실시간 모니리터링을 수반하는 방법을 이용할 수 있다. 뉴클레오티드의 혼입은, 예를 들어 둘 모두가 본원에서 참고로 인용된 미국 특허 제7,329,492호 및 제7,211,414호에 기술되어 있는 바와 같이 형광단-보유 폴리머라아제와 γ-포스페이트-표지된 뉴클레오티드 사이의 형광 공명 에너지 전달(FRET) 상호작용을 통해 검출될 수 있거나, 뉴클레오티드의 혼입은, 예를 들어 본원에서 참고로 인용된 미국 특허 제7,315,019호에 기술되어 있는 바와 같이 제로 모드 도파관(zero-mode waveguide)을 이용하여 검출될 수 있으며, 예를 들어 둘 모두가 본원에서 참고로 인용된 미국 특허 제7,405,281호 및 미국 공개공보 제2008/0108082호에 기술되어 있는 바와 같이 형광 뉴클레오티드 유사체 및 조작된 폴리머라아제를 이용하여 검출될 수 있다. 조명은, 형광 표지된 뉴클레오티드의 혼입을 낮은 배경으로 관찰할 수 있도록 표면-테더링된(surface-tethered) 폴리머라아제 주변에서 젭토리터 규모(zeptoliter-scale)의 부피로 제한될 수 있다(그 개시내용의 전문이 본원에서 참고로 인용된 문헌[Levene, M. J. et al. "Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations." Science 299, 682-686 (2003)]; 문헌[Lundquist, P. M. et al. "Parallel confocal detection of single molecules in real time." Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008)]; 문헌[Korlach, J. et al. "Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nano structures." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)]). 이 같은 방법으로부터 수득된 이미지를 본원에 개시되어 있는 바와 같이 저장, 가공 및 분석할 수 있다.
일부 SBS 실시형태는 뉴클레오티드를 연장 생성물 내에 혼입시킬 때 방출되는 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양성자의 검출에 기초한 서열분석은 이온 토렌트(Ion Torrent)(코네티컷주 길퍼드 소재의 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 자회사)로부터 상업적으로 이용 가능한 전기 검출기 및 연관된 기법, 또는 모두가 본원에서 참고로 인용된 미국 공개공보 제2009/0026082호; 제2009/0127589호; 제2010/0137143호; 및 제2010/0282617호에 기술되어 있는 서열분석 방법 및 시스템을 사용할 수 있다. 동역학적 배제(kinetic exclusion)를 사용하여 표적 핵산을 증폭하기 위해 본원에 개시된 방법이 양성자를 검출하는 데 사용되는 기질에 용이하게 적용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 본원에 개시된 방법은 양성자를 검출하기 위해 사용되는 앰플리콘(amplicon)의 클론 집단을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
상기의 SBS 방법은 다수의 상이한 표적 핵산을 동시에 조작하도록 멀티플렉스 형식으로 유리하게 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상이한 표적 핵산은 일반적인 반응 용기에서 처리되거나, 특정 기질의 표면 상에서 처리될 수 있다. 이는 서열분석 시약의 편리한 전달, 미반응 시약의 제거 및 혼입 이벤트의 검출을 멀티플렉스 방식으로 허용한다. 표면-결합형 표적 핵산을 사용하는 실시형태에서, 표적 핵산은 어레이 형식일 수 있다. 어레이 형식에서, 표적 핵산은 전형적으로 공간적으로 구별 가능한 방식으로 표면에 결합될 수 있다. 표적 핵산은 직접적인 공유 부착, 비드 또는 기타 입자에 대한 부착 또는 폴리머라아제 또는 표면에 부착되어 있는 기타 분자에 대한 결합에 의해 결합될 수 있다. 어레이는 각각의 부위(특징부로도 지칭됨)에서 표적 핵산의 단일 복제를 포함할 수 있거나, 동일한 서열을 갖는 다수의 복제가 각각의 부위 또는 특징부에 존재할 수 있다. 다수의 복제는 증폭 방법, 예를 들어 하기에 보다 상세하게 기술되어 있는 바와 같은 가교 증폭 또는 유화 PCR에 의해 생산될 수 있다.
본원에 개시된 방법은, 예를 들어 적어도 약 10개 특징부/㎠, 100개 특징부/㎠, 500개 특징부/㎠, 1,000개 특징부/㎠, 5,000개 특징부/㎠, 10,000개 특징부/㎠, 50,000개 특징부/㎠, 100,000개 특징부/㎠, 1,000,000개 특징부/㎠, 5,000,000 특징부/㎠ 또는 그 이상을 비롯한 다양한 밀도 중 임의의 것으로 특징부를 갖는 어레이를 사용할 수 있다.
본원에 개시된 방법의 이점은 이들이 복수의 표적 핵산의 신속하고 효율적인 검출을 동시에 제공한다는 것이다. 따라서, 본 개시내용은 상기에 나타나 있는 것과 같은 당해 기술분야에 알려져 있는 기법을 사용하여 핵산을 제조 및 검출할 수 있는 통합 시스템을 제공한다. 따라서, 본 개시내용의 통합 시스템은 증폭 시약 및/또는 서열분석 시약을 하나 이상의 고정된 DNA 단편에 전달할 수 있는 유체 성분을 포함할 수 있으며, 이때 시스템은 펌프, 밸브, 저장소, 유체 라인 등과 같은 성분을 포함한다. 플로우셀은 표적 핵산의 검출을 위한 통합 시스템에서 구성 및/또는 사용될 수 있다. 예시적인 플로우셀은, 예를 들어 각각이 본원에서 참고로 인용된 미국 공개공보 제2010/0111768호 및 미국 일련번호 제13/273,666호에 기술되어 있다. 플로우셀에 대해 나타나 있는 바와 같이, 통합 시스템의 유체 성분들 중 하나 이상이 증폭 방법 및 검출 방법을 위해 사용될 수 있다. 핵산 서열분석 실시형태를 일례로 들자면, 통합 시스템의 유체 성분들 중 하나 이상은 본원에 개시된 증폭 방법을 위해 그리고 상기에 나타나 있는 것과 같은 서열분석 방법에서 서열분석 시약의 전달을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 통합 시스템은 증폭 방법을 수행하고 검출 방법을 수행하기 위한 별개의 유체 시스템을 포함할 수 있다. 증폭된 핵산을 생성하고, 또한 핵산의 서열을 결정할 수 있는 통합 서열분석 시스템의 예로는 MiSeqTM 플랫폼(캘리포니아주 샌디에고 소재의 일루미나 인코포레이티드) 및 본원에서 참고로 인용된 미국 일련번호 제13/273,666호에 기술되어 있는 장치를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
폴리뉴클레오티드가 실리카 기반 지지체에 직접 부착되어 있는 어레이는, 예를 들어 제WO 00/06770호(본원에서 참고로 인용됨)에 개시되어 있는 것들이며, 이때 폴리뉴클레오티드는 유리 상의 에폭시 현수기(pendant epoxide)와 폴리뉴클레오티드 상의 내부 아미노기 사이의 반응에 의해 유리 지지체 상에 고정된다. 게다가, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 제WO 2005/047301호(본원에서 참고로 인용됨)에 기술되어 있는 바와 같이 황계 구핵원자의 고체 지지체와의 반응에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 고체 지지된 주형 폴리뉴클레오티드의 또 다른 예는, 예를 들어 각각이 본원에서 참고로 인용된 제WO 00/31148호, 제WO 01/01143호, 제WO 02/12566호, 제WO 03/014392호, 미국 특허 제6,465,178호 및 제WO 00/53812호에 기술되어 있는 바와 같이 주형 폴리뉴클레오티드가 실리카 기반 고체 지지체 또는 기타 고체 지지체 상에 지지된 하이드로겔에 부착되어 있는 것이다.
주형 폴리뉴클레오티드가 고정될 수 있는 특정 표면은 폴리아크릴아미드 하이드로겔이다. 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 상기에 인용된 참고문헌, 및 본원에서 참고로 인용된 제WO 2005/065814호에 기술되어 있다. 사용 가능한 특정 하이드로겔로는 제WO 2005/065814호 및 미국 공개공보 제2014/0079923호에 기술되어 있는 것을 들 수 있다. 하나의 실시형태에서, 하이드로겔은 PAZAM(폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-공-아크릴아미드))이다.
DNA 주형 분자는, 예를 들어 미국 특허 제6,172,218호(본원에서 참고로 인용됨)에 기술되어 있는 바와 같이 비드 또는 마이크로입자에 부착될 수 있다. 비드 또는 마이크로입자에 대한 부착은 서열분석 응용에 유용할 수 있다. 각각의 비드가 상이한 DNA 서열을 함유하는 비드 라이브러리를 제조할 수 있다. 예시적인 라이브러리 및 이들의 생성 방법은 각각이 본원에서 참고로 인용된 문헌[Nature, 437, 376-380 (2005)]; 문헌[Science, 309, 5741, 1728-1732 (2005)]에 기술되어 있다. 본원에 개시된 뉴클레오티드를 이용한 이 같은 비드 어레이의 서열분석은 본 개시내용의 범위 내에 있다.
서열분석되어야 하는 주형은 고체 지지체 상의 "어레이"의 일부를 형성할 수 있으며, 이 경우 어레이는 임의의 편리한 형태를 취할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 방법은 단일 분자 어레이, 클러스터형 어레이 및 비드 어레이를 비롯한 모든 유형의 고밀도 어레이에 적용 가능하다. 본 개시내용의 표지된 뉴클레오티드는, 고체 지지체 상에 핵산 분자를 고정함으로써 형성되는 어레이를 들 수 있지만 이에 제한되지 않는 본질적으로 임의의 유형의 어레이 상의 주형을 서열분석하는 데 사용될 수 있다.
그러나, 본 개시내용의 표지된 뉴클레오티드는 클러스터형 어레이의 서열분석의 맥락에서 특히 유리하다. 클러스터형 어레이에서, 어레이 상의 별도의 영역(종종 부위 또는 특징부로서 지칭됨)은 다수의 폴리뉴클레오티드 주형 분자를 포함한다. 일반적으로, 다수의 폴리뉴클레오티드 분자는 광학 수단에 의해 개별적으로 분해 불가능하며, 대신에 앙상블(ensemble)로서 검출된다. 어레이가 형성되는 방식에 따라, 어레이 상의 각각의 부위는 하나의 개개의 폴리뉴클레오티드 분자의 다수의 복제(예를 들어, 부위는 특정 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 종에 대해 균질함) 및 소수의 상이한 폴리뉴클레오티드 분자의 다수의 복제(예를 들어, 2개의 상이한 핵산 종의 다수의 복제)를 포함할 수 있다. 핵산 분자의 클러스터형 어레이는 당해 기술분야에 일반적으로 알려져 있는 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 일례로, 각각이 본원에서 참고로 인용된 제WO 98/44151호 및 제WO 00/18957호에는 핵산을 증폭하는 방법이 기술되어 있으며, 이때 주형 및 증폭 생성물 둘 모두는 고정된 핵산 분자의 클러스터 또는 "콜로니"로 구성된 어레이를 형성하기 위해 고체 지지체 상에 고정된 채로 남아 있다. 이들 방법에 따라 제조된 클러스터형 어레이 상에 존재하는 핵산 분자는 본 개시내용의 염료 화합물로 표지된 뉴클레오티드를 이용하는 서열분석에 적합한 주형이다.
또한, 본 개시내용의 표지된 뉴클레오티드는 단일 분자 어레이 상의 주형의 서열분석에 유용하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "단일 분자 어레이" 또는 "SMA"이란 용어는 고체 지지체 전체에 분포(또는 어레이)되어 있는 폴리뉴클레오티드 분자의 집단을 지칭하며, 이때 상기 집단의 기타 모든 폴리뉴클레오티드 분자로부터 임의의 개개의 폴리뉴클레오티드의 간격은 개개의 폴리뉴클레오티드 분자를 개별적으로 분해하는 것이 가능하도록 하는 것이다. 따라서, 고체 지지체의 표면 상에 고정된 표적 핵산 분자는 일부 실시형태에서 광학 수단에 의해 분해될 수 있다. 이는, 하나 이상의 별도의 신호(각각은 하나의 폴리뉴클레오티드를 나타냄)가 특정의 사용된 이미지화 장치의 분해 가능한 영역 내에서 발생할 것이라는 것을 의미한다.
어레이 상의 인접한 폴리뉴클레오티드 분자 사이의 간격이 적어도 100 ㎚, 보다 구체적으로는 적어도 250 ㎚, 더욱 더 구체적으로는 적어도 300 ㎚, 더더욱 구체적으로는 적어도 350 ㎚인 단일 분자 검출이 구현될 수 있다. 따라서, 각각의 분자는 개별적으로 분해 가능하고, 단일 분자 형광점으로서 검출 가능하며, 상기 단일 분자 형광점에서 유래한 형광은 또한 단일 단계 광표백을 나타낸다.
"개별적으로 분해된" 및 "개별 분해"란 용어는, 시각화되는 경우 어레이 상의 하나의 분자를 이의 이웃한 분자들과 구별하는 것이 가능하다는 것을 규명하기 위해 본원에서 사용된다. 어레이 상의 개개의 분자들 사이의 분리는 부분적으로는 개개의 분자를 분해하기 위해 사용되는 특정 기법에 의해 결정될 것이다. 단일 분자 어레이의 일반적인 특징부는 각각이 본원에서 참고로 인용된 공개 출원 제WO 00/06770호 및 제WO 01/57248호에 대한 언급으로 이해될 것이다. 본 개시내용의 뉴클레오티드의 1회 사용은 합성에 의한 서열분석 반응에서 일지라도, 뉴클레오티드의 유용성은 이 같은 방법에 제한되지 않는다. 사실 상, 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 내에 혼입된 뉴클레오티드에 부착되어 있는 형광 표지의 검출이 요구되는 임의의 서열분석 방법에서 유리하게 사용될 수 있다.
특히, 본 개시내용의 표지된 뉴클레오티드는 자동화 형광 서열분석 프로토콜, 특히 생거(Sanger) 및 동료들의 사슬 종결 서열분석 방법에 기초한 형광 염료-종결자 순환 서열분석에 사용될 수 있다. 이 같은 방법은 일반적으로 프라이머 연장 서열분석 반응에서 형광 표지된 디데옥시뉴클레오티드를 혼입시키기 위해 효소 및 순환 서열분석을 사용한다. 소위 생거 서열분석 방법 및 관련된 프로토콜(생거식(Sanger-type))은 표지된 디데옥시뉴클레오티드에 의한 무작위 사슬 종결을 이용한다.
따라서, 본 개시내용은 또한 3'-위치 및 2'-위치 둘 모두에서 하이드록실기가 없는 디데옥시뉴클레오티드인 표지된 뉴클레오티드를 포함하며, 이때 각각의 디데옥시뉴클레오티드는 생거식 서열분석 방법 등에 사용하기에 적합하다.
3'-차단기가 혼입되어 있는 본 개시내용의 표지된 뉴클레오티드는, 디데옥시 뉴클레오티드를 이용하여 달성되는 동일한 효과가 3'-OH 차단기를 갖는 뉴클레오티드를 이용하여 달성될 수 있으므로 생거 방법 및 관련된 프로토콜에서 또한 유용할 수 있으며, 이때 둘 모두는 후속적인 뉴클레오티드의 혼입을 방지하는 것으로 인지될 것이다. 3'-차단기를 갖는 본 개시내용에 따른 뉴클레오티드가 생거식 서열분석 방법에 사용될 경우, 뉴클레오티드에 부착되어 있는 염료 화합물 또는 검출 가능한 표지는, 본 개시내용의 표지된 뉴클레오티드가 혼입되어 있는 각각의 경우에 어떠한 뉴클레오티드도 후속적으로 혼입될 필요가 없으며, 따라서 표지가 뉴클레오티드로부터 제거될 필요가 없으므로 절단 가능한 링커를 통해 연결될 필요도 없는 것으로 인식될 것이다.
본원에 기술되어 있는 방법의 임의의 실시형태에서, 서열분석 응용에 사용된 뉴클레오티드는 본원에 기술되어 있는 3'-차단된 뉴클레오티드, 예를 들어 화학식 I, 화학식 Ia 또는 화학식 II의 뉴클레오티드이다. 임의의 실시형태에서, 3'-차단된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 트리포스페이트이다.
실시예
부가적인 실시형태는 하기 실시예에서 보다 상세하게 개시되어 있으며, 이는 임의의 방식으로 청구범위의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예 1. 3'-아세탈-차단된 뉴클레오시드의 제조
본 실시예에서, 다양한 3'-아세탈-보호된 T 뉴클레오시드를 반응식 2에 따라 제조하였다.
[반응식 2]
T1의 제조: 오븐에서 건조되고 질소로 퍼징된 100 ㎖ 플라스크 내에 5-요오도-2'-데옥시우리딘(5.0 g, 14.12 mmol)을 첨가하였다. 이를 30 ㎖의 피리딘으로 3회 동시 증발시킨 후, 질소 하에 방치하였다. 무수 피리딘(25 ㎖)을 첨가하고, 반응물을 균질한 용액이 수득될 때(대략 15분)까지 실온에서 교반하였다. 혼합물을 빙수조에서 0℃까지 냉각시키고, tert-부틸디페닐실릴클로라이드(4.04 ㎖, 15.5 mmol)를 격렬하게 교반하면서 천천히 적가하였다(대략 1시간). TLC에 의해 모든 SM이 소모될 때까지 반응물을 8시간 동안 0℃로 유지하였다. 포화 염화암모늄 수용액(대략 15 ㎖)을 첨가하고, 반응물을 실온까지 가온하도록 하였다. 혼합물을 에틸아세테이트(100 ㎖)로 희석하고, 포화 염화암모늄 수용액(200 ㎖)으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 수성층을 에틸아세테이트(4 x 50 ㎖)로 추출하였다. 유기층을 모으고, 건조하고(MgSO4), 진공 하에 농축하여 높은 진공 하에 잔류 용매를 제거한 후에 대략 8 g의 투명한 황색 오일을 얻었다. 조질의 생성물(T1)을 실리카 상의 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 백색 결정성 고체로서 정제하였다. 수율은 6.94 g(83%). LC-MS(전기 분무 음성) 591.08 [M-H]
T2의 제조: 오븐에서 건조되고 질소로 퍼징된 갈색의 500 ㎖ 3구 플라스크 내에 T1(6.23 g, 10.5 mmol), 요오드화제일구리(200 ㎎, 1.05 mmol) 및 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 2염화물(369 ㎎, 0.526 mmol)을 질소 하에 첨가하였다. 플라스크를 빛으로부터 보호하고, 탈기된 무수 DMF(200 ㎖)를 첨가하였다. 이 용액에 2,2,2-트리플루오로-N-프로프-2-이닐-아세트아미드(4.74 g, 31.6 mmol)를 참가한 후, 탈기된 트리에틸아민(2.92 ㎖, 21.0 mmol)을 첨가하였다. TLC 분석에 의해 추가의 출발 물질이 관찰되지 않는 경우 반응물을 질소 하에 6시간 동안 실온에서 교반하였다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거하고(대략 15분), DMF를 높은 진공 하에 제거하여(대략 1시간) 갈색 잔류물을 얻었다. 이를 에틸아세테이트(200 ㎖)에 용해하고, 수중 0.1 M EDTA(2 x 200 ㎖)로 추출하였다. 수성층을 모으고, 에틸아세테이트(200 ㎖)로 추가로 추출하였다. 유기상을 모으고, 건조하였으며(MgSO4), 휘발성 물질을 진공 하에 제거하고(대략 30분), 높은 진공 하에 추가로 건조하여(대략 1시간) 약 8 g의 조질의 갈색/황색 오일을 얻었다. 혼합물을 실리카 겔 상의 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 회백색 고체로서 정제하였다. 수율: 6.0 g(85%). LC-MS(전기 분무 음성) 614.19 [M-H].
T3의 제조: 질소 하에 출발 뉴클레오시드(T2; 2.0 g, 3.25 mmol)가 담겨 있는, 오븐에서 건조되고 질소로 퍼징된 100 ㎖ 플라스크에 무수 DMSO(6.9 ㎖, 97.5 mmol)를 1회 분량으로 실온에서 첨가하고, 균질한 용액이 형성할 때까지 교반하였다. 아세트산(11.1 ㎖, 195 mmol) 및 그 이후에 아세트산 무수물(15.1 ㎖, 162.09 mmol)을 둘 모두 적가하였다(각각 대략 5분). 혼합물을 50℃까지 가온하고, TLC(EtOAc/석유 에테르 3:2)에 의해 출발 뉴클레오시드가 완전히 소모될 때(대략 5시간)까지 교반하였다. 이어서, 반응물을 절반의 부피까지 농축하고, 얼음조(ice bath)를 이용하여 대략 0.5℃까지 냉각시켰다. 차가운(대략 0.5℃) NaHCO3(포화 수용액)(45 ㎖)을 천천히 첨가함으로써 후처리 공정(Work-up)을 개시하였으며, 어떠한 거품 형성(fizzing)도 관찰되지 않을 때(대략 15분)까지 추가의 교반을 허용하였다. 용액을 실온까지 가온하도록 허용한 후, 수성층을 EtOAc(3 x 100 ㎖)로 추출하였다. 모은 유기층을 MgSO4 상에서 건조하고 여과하였으며, 휘발성 물질을 감압 하에 증발시키고, 높은 진공으로 추가로 증발시켰다. 조질의 생성물(T3)을 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 회백색 고체로서 정제하였다. 수율: 1.79 g(82%). LC-MS(전기 분무 음성) 674.20 [M-H]-.
T4의 제조: N2 하에 무수 CH2Cl2(50 ㎖) 중의 출발 뉴클레오시드(T3; 1.79 g, 2.649 mmol) 용액에 사이클로헥센(1.34 ㎖, 13.2 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 얼음조를 이용하여 0℃까지 냉각시키고, 증류된 염화설푸릴(322 ㎕, 3.97 mmol)을 N2 하에 천천히 적가하였다(대략 20분). 이 온도에서 20분 동안 교반한 후, TLC(EtOAc:석유 에테르 = 3:2(v/v))에 따르면 출발 뉴클레오시드가 완전히 소모한 것으로 나타났다. 이어서, 반응식 3에 나타나 있는 바와 같이 새로 증류된 상응하는 불포화 알코올(5 당량)을 직접 적가함으로써 염화물 중간체를 켄칭(quenching)하였다. 얻어진 용액을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 감압 하에 휘발성 물질을 증발시켰다. 오일성 잔류물을 EtOAc:염수(3:2)(125 ㎖) 사이로 분할하였다. 유기층을 분리하고, 수성층을 EtOAc(2 x 50 ㎖)로 추가로 추출하였다. 모든 유기 추출물을 MgSO4 상에서 건조하고 여과하였으며, 휘발성 물질을 감압 하에 증발시켰다. 오일성 잔류물을 EtOAc:염수(3:2)(125 ㎖) 사이로 분할하였다. 유기층을 분리하고, 수성층을 EtOAc(2 x 50 ㎖)로 추가로 추출하였다. 모든 유기 추출물을 MgSO4 상에서 건조하고 여과하였으며, 휘발성 물질을 감압 하에 증발시켰다. 조질의 생성물(T4)을 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 황색 오일로서 최종 생성물을 수득하였다. 수율: AOM의 경우 1.20 g(69%); PrOM의 경우 1.29 g(71%); DPrOM의 경우 1.34 g(71%).
3'-AOM: 황색 오일. LC-MS(전기 분무 음성) [M-H] 684.24.
3'-PrOM: 황색 오일. LC-MS(전기 분무 음성) [M-H] 682.22.
3'-DPrOM: 황색 오일. LC-MS(전기 분무 음성) [M-H] 710.25.
[반응식 3]
T5의 제조: 질소 하의 50 ㎖의 둥근 바닥 플라스크 내의 출발 물질(T4; 1.04 g, 1.516 mmol)에 무수 THF(9 ㎖)를 실온에서 첨가하였다. 이어서, TBAF(THF 중의1.0 M, 1.7 ㎖, 1.70 mmol)를 적가하고, TLC에 의해 모든 SM이 소모될 때(대략 2시간)까지 용액을 교반하였다. 반응 과정 동안에 용액은 오렌지색으로 변했다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거하여 오렌지색 잔류물을 얻었으며, 이를 EtOAc(100 ㎖)에서 용해하고, NaHCO3(포화 수용액)(60 ㎖)으로 분리하였다. 2개의 층을 분리하였으며, 수성층을 EtOAc(60 ㎖)로 추출하였다. 유기층을 모으고, 건조하고(MgSO4), 여과하고, 증발시켜 황색 오일로서 조질의 생성물을 얻었다. 조질의 생성물을 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 투명한 황색 오일을 수득하였다. 수율: AOM의 경우 637 ㎎(94%); PrOM의 경우 526 ㎎(78%); DPrOM의 경우 617 ㎎(86%).
3'-AOM: 투명한 황색 오일. LC-MS(전기 분무 음성) [M-H] 446.12.
3'-PrOM: 투명한 황색 오일(526 ㎎ 78%). LC-MS(전기 분무 음성): [M-H] 444.10.
3'-DPrOM: 투명한 황색 오일(617 ㎎ 86%). LC-MS(전기 분무 음성): [M-H] 472.13.
게다가, 2개의 부가적인 3'-차단된 T 뉴클레오시드(3'-eAOM T 및 3'-iAOM T)를 상술한 바와 같은 유사한 방식으로 제조하였다. 3'-iAOM T: LC-MS(ES): (음이온) m/z 325.5(M-H+), (양이온) 327.3(M+H+). 3'-eAOM T: LC-MS(ES): (양이온) m/z 341.3(M+1H+).
실시예 2. 3'-OH 차단기 안정성 시험
본 실시예에서, 5'-mP 3'-AOM T 뉴클레오티드5'-mP 3'-AOM T 뉴클레오티드에 대한 안정성 시험을 혼입 완충 용액 중에서 표준 5'-mP 3'-O-아지도메틸 T 뉴클레오티드와 함께 수행하였다.
완충 용액의 제형화
100 mM 에탄올아민 완충제(pH 9.8), 100 mM NaCl 및 2.5 mM EDTA의 용액 중의 1 ㎖의 각각의 5'-모노포스페이트 3'-보호된 T 뉴클레오티드(0.1 mM)를 가열 블록 내에서 65℃에서 2주 동안 배양하였다. 설정된 시점에, 40 ㎕의 분취액을 취하고, HPLC에 의해 분석하여 차단된 뉴클레오티드의 잔류 비율(%)을 측정하고 차단되지 않은 뉴클레오티드의 궁극적인 형성을 결정하였다.
AOM, PrOM, DPrOM 아세탈 보호기 및 표준 아지도메틸 차단기를 갖는 5'-모노포스페이트 3'-보호된 뉴클레오티드와 관련한 안정성 시험 결과는 도 1에 나타나 있다. AOM, PrOM 및 DPrOM 차단기를 갖는 3'-차단된 뉴클레오티드 모노포스페이트는 용액 중의 탈차단율의 감소에서 30배 내지 50배 초과의 개선을 제공하는 것으로 관찰되었다. 본 실험은, 상응하는 완전 작용화된 뉴클레오티드(ffN)가 서열분석 장치의 카트리지 상의 혼입 믹스에서 저장되는 경우 거동할 수 있는 방법을 모방한 것이다. 이들 아세탈 보호기에 의해 제공되는 안정성의 개선으로 인해 서열분석 운행에서 예비 페이싱 비율이 보다 낮아질 수 있었다. 최종적으로, 이는 혼입 믹스 시약의 저장 수명을 개선시켰다.
실시예 3. 3'-AOM 탈차단 시험
본 실시예에서, 5'-mP 3'-AOM T 뉴클레오티드 및 표준 5'-mP 3'-O-아지도메틸 T 뉴클레오티드에 대한 탈차단 시험을 각각의 차단기 특유의 용액 중에서 개별적으로 실시하였다. 일루미나의 표준 탈차단 시약을 가능한 한 치밀하게 모방하고 동일한 방법을 따르기 위한 조건을 조성하였다. 활성 탈차단 시약, 완충제 및 뉴클레오시드의 농도를 모든 시험에서 동일하게 유지하지만, 각각의 성분의 동일성은 독특하였다. 이러한 방식으로, 개개의 탈차단 화학 사이에서 관찰된 속도의 차이는 제형의 농도에서의 차이에서 기인하지 않을 수 있다.
표준 아지도메틸 탈차단 조건
뉴클레오티드: 5'-모노포스페이트 3'-O-아지도메틸 T. 활성 탈차단 시약: 트리스(하이드록시프로필)포스핀(THP)(18 mΩ 물 중 1 M). (선택적) 첨가제: 아스코르브산나트륨(18 mΩ 물 중 0.1 M) 최종 농도 = 1 mM. 완충제: 에탄올아민(pH 9.8; 18 mΩ 물 중의 2 M). 시약: H2O2.
AOM 탈차단 조건
뉴클레오티드: 5'-모노포스페이트 3'-O-아지도메틸 T. 3'-AOM T의 저장 용액을 질소 하에 유리 바이알(glass vial) 내의 100 mM 에탄올아민 완충제(pH 9.8)에서 0.1 mM로 희석하였다. 아스코르브산나트륨 첨가제의 저장 용액을 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 첨가하고, 용액을 5분 동안 교반하였다. 검정을 개시하기 위해, 탈차단 시약(Pd/THP =1/5; 아스코르브산나트륨; 에탄올아민)을 THP의 최종 농도가 1 mM이 되도록 실온에서 교반 용액에 첨가하였다. 명시된 시점에, 40 ㎕의 분취액을 취하고, EDTA/H2O2(0.025:0.075 M)의 1:3 혼합물 6 ㎕로 켄칭하였다. 출발 뉴클레오시드 피크, 3'-OH 피크, 및 HPLC 크로마토그램에 나타나는 임의의 기타 뉴클레오티드 피크의 면적을 측정함으로써 HPLC 분석을 수행하였다. 기타 어떠한 뉴클레오티드 기반 부산물도 관찰되지 않았다.
비교 결과는 도 2a에 나타나 있다. AOM이 표준 아지도메틸 차단기와 비교하여 용액 중에서의 탈차단율 측면에서 10배의 속도 개선을 제공하는 것으로 관찰되었다. 본 실험은, 상응하는 ffN이 탈차단 단계 동안에 서열분석에서 거동할 수 있는 방법을 모방하기 위한 것이다. 탈차단 속도에서의 실질적인 개선은 특정 일루미나 서열분석 플랫폼에서 전형적으로 사용되는 10초 내지 20초 배양 시간 대신에 플러쉬-쓰루(flush-through) 탈차단 단계를 허용할 수 있었다. 그 결과, 탈차단율은 합성에 의한 서열분석(SBS) 사이클 시간에 유의한 영향을 미칠 것이다.
3'-eAOM T 및 3'-iAOM T에 대한 탈차단 검정을 위해 유사한 실험 조건이 사용되었다. 단일 변경으로서, 탈차단율에서의 덜 뚜렷한 차이를 관찰하기 위해 Pd 촉매 대 기질 비율을 5:1로 감소시켰다. 3'-AOM T를 참고물질로서 사용하였으며, 그 결과는 도 2b에 나타나 있다. 이들 결과에 따르면 eAOM 및 iAOM의 탈차단율이 이러한 Pd 촉매 탈차단 시약의 특정 농도에서 AOM보다 2배 내지 3배 느린 것으로 나타나 있다. AOM 차단기의 치환된 버전과 비치환된 버전 사이에서 탈차단율의 차이는 Pd 촉매 대 기질 비율이 보다 높을수록 보다 낮을 수 있다는 것이 예상될 수 있다.
실시예 4. 서열분석용 팔라듐 절단 믹스의 최적화
실시예 2에 기술되어 있는 탈차단 반응에서 사용되는 Pd/THP 촉매는 매우 공기 민감성이다. 공기에 노출되는 경우, 이는 실질적인 활성 손실을 나타냈다. 본 실시예에서, 팔라듐 절단 믹스로 이루어진 상이한 제형의 공기 민감성을 평가하기 위해 산화 스트레스 검정을 개발하였다.
0.5 ㎖의 Pd 절단 믹스를 5 ㎖의 유리 바이알에 분취하고, 실온에서 3시간 동안 공기에 개방된 채로 방치하였다. 하기와 같이 3'-AOM T의 절단을 측정함으로써 산화된 절단 믹스의 잔류 활성을 평가하였다. 3'-AOM T의 저장 용액을 100 mM 절단 믹스 완충제에서 0.1 mM까지 희석하였다. 아스코르브산나트륨 저장 용액을 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가한 후, 산화된 절단 믹스를 최종적으로 1/20로 희석하였다. 1시간 후, 40 ㎕의 용액을 10 ㎕의 EDTA/H2O2 1:1 혼합물(0.25:0.25 M)로 즉시 켄칭하고, HPLC에 의해 분석하였다. 본 실험에서, 1차 아민(예를 들어, 에탄올아민, Tris 및 글리신); 3차 아민(예를 들어, 2-디메틸아미노메탄올((DMEA), 2-디에틸아미노메탄올(DEEA), N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 또는 N,N,N',N'-테트라에틸에틸렌디아민(TEEDA)); 및 다양한 무기염(예를 들어, 보레이트 염, 카보네이트 염, 포스페이트 염)을 비롯한 다양한 완충 시약을 스크리닝하였다. 무기 완충 시약(예를 들어, 붕산나트륨, 탄산나트륨, 인산나트륨)은 최상의 공기 안정성을 제공하며, 팔라듐 복합체는 높은 활성(%)을 보유한다는 것이 관찰되었다. 게다가, 3차 아민은 또한 1차 아민과 비교할 때 Pd 절단 믹스의 안정성을 실질적으로 개선시켰다.
이들 발견에 기초하여, 2개의 팔라듐 절단 믹스를 제조하였다. 제1 실시예에서, 250 mM 붕산염 완충액(pH 9.6, 20 ㎖)의 저장 용액을 THP(100 mM Tris 중의 1 M, pH 9, 5 ㎖, 5.0 mmol) 및 염화알릴팔라듐(II) 이량체(183 ㎎, 0.5 mmol)의 저장 용액을 첨가하기 전에 물 (14 ㎖)로 희석하였다. 1 M 아스코르브산나트륨 수용액(0.5 ㎖, 0.5 mmol), 5 M NaCl 수용액(10 ㎖) 및 10%(v/v) 트윈 20(0.5 ㎖)을 첨가하기 전에 혼합물을 실온에서 수분 동안 격렬하게 교반하였다. 제2 실시예에서, 2 M DEEA 완충액(pH 9.6, 0.6 ㎖)의 저장 용액을 THP(100 mM Tris 중의 1 M, pH 9, 1.2 ㎖, 1.2 mmol) 및 고체 염화알릴팔라듐(II) 이량체(43.9 ㎎, 0.12 mmol)의 저장 용액을 첨가하기 전에 물(7.6 ㎖)로 희석하였다. 1 M 아스코르브산나트륨 수용액(0.12 ㎖, 0.12 mmol), 5 M NaCl 수용액(2.4 ㎖) 및 10%(v/v) 트윈 20(0.12 ㎖)을 첨가하기 전에 혼합물을 격렬하게 교반하였다.
실시예 5. 완전 작용화된 뉴클레오티드의 제조 및 서열분석 응용을 위한 용도
본 실시예에서는 3'-AOM 차단기를 갖는 다양한 완전 작용화된 뉴클레오티드(ffN)의 제조가 보다 상세하게 기술되어 있다. 또한, 이들 ffN을 일루미나 MiniSeq® 플랫폼에 대한 합성에 의한 서열분석 응용에 사용하였다.
[반응식 4]
중간체(AOM C2)의 합성: 뉴클레오시드(C1; 0.5 g, 0.64 mmol)를 N2 하에 무수 DCM(12 ㎖)에서 용해하고, 혼합물을 0℃까지 냉각시켰다. 사이클로헥센(0.32 ㎖, 3.21 mmol)을 첨가한 후, SO2Cl2(1.0 M in DCM, 1.27 ㎖, 1.27 mmol)를 적가하였다. 부가적인 사이클로헥센(0.32 ㎖, 3.21 mmol)을 첨가한 후, 반응물을 회전 증발기로 신속하게 전달하여 감압 하에 모든 휘발성 물질을 제거하였다. 고체 잔류물을 N2 하에 무수 DCM(5 ㎖)에 용해하기 전에 높은 진공 하에 10분 동안 추가로 건조하였다. 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 빙냉 알릴알코올(5 ㎖)을 적가하였다. 반응물을 0℃에서 2시간 동안 교반한 후, 포화 NaHCO3 수용액(50 ㎖) 및 DCM(30 ㎖)을 첨가함으로써 켄칭하였다. 2개의 상을 분리하고, 수성층을 EtOAc(2 x 50 ㎖)로 추출하였다. 유기층을 모으고, MgSO4 상에서 건조하고, 여과하였으며, 휘발성 물질을 감압 하에 증발시켰다. 조질의 생성물을 EtOAc/석유 에테르를 이용하여 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색 고체로서 AOM C2(264 ㎎, 52% 수율)를 수득하였다. LC-MS(전기 분무 음성): [M-H] 787, [M+Cl] 823.
중간체(AOM C3)의 합성: AOM C2(246 ㎎, 0.31 mmol)를 N2 하에 무수 THF(9.5 ㎖)에서 용해하고, 혼합물을 0℃까지 냉각시켰다. 아세트산(0.054 ㎖, 0.94 mmol)을 첨가한 후, TBAF(THF 중의 1.0 M, 5 중량%의 물, 0.99 ㎖, 0.94 mmol)를 적가하였다. 반응물을 0℃에서 5시간 동안 교반한 후, EtOAc(20 ㎖)로 희석하고, 이어서 0.05 M HCl 수용액(20 ㎖)에 부었다. 2개의 층을 분리하고, 수성층을 EtOAc(2 x 20 ㎖)로 추출하였다. 유기층을 모으고, MgSO4 상에서 건조하고, 여과하였으며, 휘발성 물질을 감압 하에 증발시켰다. 조질의 생성물을 DCM/EtOAc을 이용하여 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 황색을 띤 고체로서 AOM C3(114 ㎎, 66% 수율)을 얻었다. LC-MS(전기 분무 음성): [M-H] 549, [M+H2O-H] 567, [M+Cl] 585, (전기 분무 양성): [M+H] 551, [M+H2O+H] 569.
중간체(AOM C4)의 합성: AOM C3(0.114 g, 0.21 mmol), 새로 활성화된 4 Å 분자체, 프로톤 스폰지(proton sponge; 0.066 g, 0.31 mmol) 및 자석 교반기를 N2 하에 놓고, 무수 트리메틸포스페이트(1.0 ㎖)를 첨가하였다. 반응물을 -10℃에서 냉각시키고, 새로 증류된 POCl3(23 ㎕, 0.25 mmol)을 적가하였다. 반응물을 -10℃에서 1시간 동안 교반하였다. 비스-트리-n-부틸암모늄염(DMF 중의 0.5 M, 1.7 ㎖, 0.85 mmol) 및 무수 트리-n-부틸아민(0.41 ㎖, 1.74 mmol)으로서의 피로포스페이트 용액을 예비 혼합하고, 빙냉의 활성화된 뉴클레오시드 용액에 1회 분량으로 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 격렬하게 교반하였다. 반응 혼합물을 격렬하게 교반된 2 M TEAB 수용액(대략 10 ㎖)이 담겨 있는 별도의 플라스크 내에 부었다. 반응 플라스크를 소량의 H2O로 세정하고, 세척액을 2 M TEAB 용액에 첨가하였다. 이어서, 모은 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하고, 그 이후에 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 NH3 수용액(35%, 대략 10 ㎖)에서 용해하고, 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 반응물을 진공 하에 농축하고, DEAE-세파덱스(Sephadex) 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물을 분취용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 순수한 AOM C4(62 μmol, 30% 수율, UV-Vis 분광 분석법에 의해 결정됨, λmax = 294 ㎚, ε = 8,600 M-1cm-1)를 얻었다. LC-MS(전기 분무 음성): [M-H] 589.
3'-AOM-ffC-LN3-SO7181의 합성: LN3-SO7181(0.0205 mmol)을 N2 하에 무수 DMA(4 ㎖)에서 용해하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(28.6 ㎕, 0.164 mmol)을 첨가한 후, TSTU(DMA 중의 0.1 M, 234 ㎕, 0.0234 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 N2 하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 사이에, AOM C4(0.0101 mmol) 수용액을 감압 하에 증발 건조하고, 0.1 M TEAB 수용액(400 ㎕)에서 재현탁하고, LN3-SO7181 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 17.5시간 동안 교반한 후, 0.1 M TEAB 수용액(4 ㎖)으로 켄칭하였다. 조질의 생성물을 DEAE-세파덱스 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물을 분취용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 순수한 3'-AOM-ffC-LN3-SO7181(6.81 μmol, 67% 수율, UV-Vis 분광 분석법에 의해 결정됨, λmax = 644 ㎚, ε = 200,000 M-1cm-1)을 얻었다. LC-MS(전기 분무 음성): [M-H] 1561, [M-2H] 781, [M-3H] 520.
[반응식 5]
중간체(AOM A2)의 합성: 뉴클레오시드(A1; 716 ㎎, 0.95 mmol)를 N2 분위기 하에 10 ㎖의 무수 디클로로메탄에서 용해하고, 사이클로헥센(481 ㎕, 4.75 mmol)을 첨가하고, 용액을 대략 -15℃까지 냉각시켰다. 염화설푸릴(증류됨, 92 ㎕, 1.14 mmol)을 적가하고, 반응물을 20분 동안 교반하였다. 모든 출발 물질이 소모된 후, 추가 분량의 사이클로헥센을 첨가하고(481 ㎕, 4.75 mmol), 반응물을 감압 하에 증발 건조하였다. 잔류물을 빨리 질소로 퍼징한 후, 알릴알코올(5 ㎖, 대략 100 mmol)을 0℃에서 교반하면서 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 1시간 동안 교반한 후, 50 ㎖의 포화 NaHCO3 수용액으로 켄칭하였다. 혼합물을 2 x 100 ㎖의 에틸아세테이트로 추출하였다. 모은 유기상을 100 ㎖의 물 및 100 ㎖의 염수로 세척한 후, MgSO4 상에서 건조하고, 여과하고, 증발 건조하였다. 잔류물을 석유 에테르/EtOAc를 이용하여 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 60% 수율(435 ㎎, 0.57 mmol). LC-MS(ES 및 CI): (양이온) m/z 763 (M+H+); (음이온) m/z 761 (M-H+).
중간체(AOM A3)의 합성: 뉴클레오시드(AOM A2; 476 ㎎, 0.62 mmol)를 N2 분위기 하에 무수 THF(5 ㎖)에서 용해한 후, THF 중의 1.0 M TBAF 용액(750 ㎕, 0.75 mmol)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 용액을 50 ㎖의 EtOAc로 희석한 후, 100 ㎖의 NaH2PO4 수용액(pH = 3)로 세척하고, 100 ㎖의 염수로 세척하였다. 유기상을 MgSO4 상에서 건조하고, 여과하고, 증발 건조하였다. 잔류물을 EtOAc/MeOH를 이용하여 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 90% 수율(292 ㎎, 0.55 mmol). LC-MS(ES 및 CI): (양이온) m/z 525 (M+H+); (음이온) m/z 523 (M-H+).
중간체(AOM A4)의 합성: 뉴클레오시드(AOM A3; 285 ㎎, 0.544 mmol,)를 감압 하에 P2O5 상에서 18시간 동안 건조하였다. 여기에 무수 트리에틸포스페이트(2 ㎖) 및 일부 새로 활성화된 4 Å 분자체를 질소 하에 첨가한 후, 반응 플라스크를 얼음조에서 0℃까지 냉각시켰다. 새로 증류된 POCl3(61 ㎕, 0.65 mmol)을 적가한 후, 프로톤 스폰지®(175 ㎎, 0.816 mmol)를 적가하였다. 첨가 이후, 반응물을 0℃에서 15분 동안 추가로 교반하였다. 이어서, 무수 DMF 중의 비스-트리-n-부틸암모늄염(5.4 ㎖, 2.72 mmol)로서의 0.5 M 피로포스페이트 용액을 빨리 첨가한 직후, 트리-n-부틸아민(540 ㎕, 2.3 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 추가의 10분 동안 빙수조에서 방치한 후, 이를 1 M 중탄산트리에틸암모늄 수용액(TEAB, 20 ㎖)에 부어서 켄칭하고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 모든 용매를 감압 하에 증발시켰다. 35% 암모니아 수용액(20 ㎖)을 상기의 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 적어도 5시간 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 먼저, 조질의 생성물을 DEAE-세파덱스 A25 상의 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다(100 g). 칼럼을 중탄산트리에틸암모늄 수용액의 구배로 용출하였다. 트리포스페이트를 함유하는 분획을 모으고, 용매를 감압 하에 증발 건조하였다. 조질의 물질을 YMC-Pack-Pro C18 칼럼을 이용하여 분취 규모의 HPLC에 의해 추가로 정제하였으며, 이를 0.1 M TEAB 및 아세토니트릴로 용출하였다. 화합물(AOM A4)을 트리에틸암모늄염으로서 수득하였다. 56% 수율(306 μmol). LC-MS(ES 및 CI): (음이온) m/z 612 (M-H+); (양이온) m/z 614 (M+H+), 715 (M+Et3NH+).
ffA 합성을 위한 일반적인 과정: 염료-링커(0.020 mmol)를 2 ㎖의 무수 N,N'-디메틸아세트아미드(DMA)에서 용해하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(28.4 ㎕, 0.163 mmol)을 첨가한 후, 무수 DMA(TSTU, 232 ㎕, 0.023 mmol) 중의 0.1 M 용액으로서 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-석신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트를 첨가하였다. 반응물을 질소 하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 사이에, 트리포스페이트(AOM A4) 수용액(0.01 mmol)을 감압 하에 증발 건조하고, 수중 0.1 M 중탄산트리에틸암모늄 (TEAB) 용액 200 ㎕에서 재현탁하였다. 활성화된 염료-링커 용액을 트리포스페이트에 첨가하고, 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 먼저, 조질의 생성물을 DEAE-세파덱스 A25 상의 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다(25 g). 트리포스페이트를 함유하는 분획을 모으고, 용매를 감압 하에 증발 건조하였다. 조질의 물질을 YMC-Pack-Pro C18 칼럼을 이용하여 분취 규모의 RP-HPLC에 의해 추가로 정제하였다. 3'-AOM-ffA-LN3-NR7180A: 38% 수율(3.8 μmol). LC-MS(ES): (음이온) m/z 1459 (M-H+), 729 (M-2H+), 486 (M-3H+). 3'-AOM-ffA-LN3-BL-NR550S0: 37% 수율(3.7 μmol). LC-MS(ES): (음이온) m/z 1771 (M-H+), 885 (M-2H+), 589 (M-3H+). 3'-AOM ffA-LN3-BL-NR650C5: 51% 수율(51 μmol). LC-MS(ES): (음이온) m/z 1917 (M-H+), 958 (M-2H+), 645 (M-3H+).
[반응식 6]
중간체(AOM G4)의 합성: 공지의 뉴클레오시드(dG3; 100 ㎎, 0.143 mmol)를 N2 분위기 하에 10 ㎖의 무수 디클로로메탄에서 용해하고, 사이클로헥센(72 ㎕, 0.714 mmol)을 첨가하였으며, 용액을 -12℃까지 냉각시켰다. 염화설푸릴(증류됨, (DCM 중의 1 M), 171 ㎕, 0.171 mmol)을 적가하고, 반응물을 10분 동안 교반하였다. 추가 분량의 사이클로헥센(72 ㎕, 0.714 mmol)을 첨가하고, 반응물을 -12℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응물을 감압 하에 증발 건조하고, 잔류물을 질소로 퍼징하였으며, 빙냉의 순수 알릴알코올(증류됨, 0.8 ㎖, 12 mmol)을 -12℃에서 교반하면서 첨가하였다. 반응물을 -12℃에서 60분 동안 교반한 후, 2 ㎖의 포화 NaHCO3 수용액으로 켄칭하였다. 혼합물을 에틸아세테이트(2 ㎖)로 분리하고, 수성층을 에틸아세테이트로 추출하였다. 모은 유기상을 4 ㎖의 물 및 4 ㎖의 염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조하고, 여과하고, 증발시켜 조질의 오일을 얻었다. 잔류물을 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 투명한 오일로서 AOM G4를 얻었다. 36% 수율(50.9 ㎎, 0.072 mmol). LC-MS(ES 및 CI): (양이온) m/z 710 [M+H]+; (음이온) m/z 708 [M-H]-.
중간체(AOM G5)의 합성: 뉴클레오시드(AOM-G4; 111 ㎎, 0.156 mmol)를 N2 분위기 하에 무수 THF(5 ㎖)에서 용해하였다. 아세트산(27 ㎕, 0.468 mmol)을 첨가한 후, THF 중의 1.0 M TBAF 용액(296 ㎕, 0.296 mmol)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 용액을 10 ㎖의 EtOAc로 희석하고, 10 ㎖의 0.05 M HCl 수용액으로 세척하였으며, 유기층을 분리하였다. 수성상을 에틸아세테이트로 추출하였다. 모은 유기상을 MgSO4 상에서 건조하고, 여과하고, 증발 건조하였다. 잔류물을 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색 고체로서 AOM G5를 얻었다. 44% 수율(32.4 ㎎, 0.068 mmol). LC-MS(ES 및 CI): (양이온) m/z 472 [M+H]+; (음이온) m/z 470 [M-H]-.
3'-AOM-pppG의 합성: 새로 활성화된 4 Å 분자체를 갖는 뉴클레오시드(AOM-G5; 79 ㎎, 0.168 mmol,)를 감압 하에 P2O5 상에서 18시간 동안 건조하였다. 프로톤 스폰지®(175 ㎎, 0.816 mmol) 및 무수 트리에틸포스페이트(0.8 ㎖)를 질소 하에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 플라스크를 얼음조에서 0℃까지 냉각시키고, 새로 증류된 POCl3(19 ㎕, 0.202 mmol)을 적가하였으며, 반응물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 무수 DMF 중의 비스-트리-n-부틸암모늄염으로서의 0.5 M 피로포스페이트 용액 (1.68 ㎖, 0.84 mmol)을 빨리 첨가한 직후, 트리-n-부틸아민(168 ㎕, 0.705 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 얼음조/수조에서 제거하고, 5분 동안 격렬하게 교반한 후, 이를 1 M 중탄산트리에틸암모늄 수용액(TEAB, 6 ㎖)에 부어서 켄칭하고, 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 모든 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 35% 암모니아 수용액(10 ㎖)에서 용해하고, 실온에서 적어도 5시간 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 감압 하에 증발시키고, 추가로 물로 동시 증발시켰다. 먼저, 조질의 생성물을 DEAE-세파덱스 A25 상의 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다(50 g). 칼럼을 트리에틸암모늄 수용액의 선형 구배로 용출하였다. 트리포스페이트를 함유하는 분획을 수집하고, 용매를 감압 하에 증발 건조하였다. 조질의 물질을 YMC-Pack-Pro C18 칼럼을 이용하여 분취 규모의 HPLC에 의해 추가로 정제하였다. 트리에틸암모늄염으로서 3'-AOM-pppG를 수득하였다. 24% 수율(39.7 μmol). LC-MS(ES 및 CI): (음이온) m/z 576 [M-H]-; (양이온) m/z 578 [M+H]+.
3'-AOM-ffT-LN3-NR550S0을 3'-AOM ffA 및 ffC의 제조에서 기술되어 있는 바와 유사한 방식으로 합성하였다.
[반응식 7]
중간체(T1)의 합성: 5-요오도-2'-데옥시우리딘(3 g, 8.4 mmol) 및 아세트산팔라듐(II)(1.6 g, 7.14 mmol)을 탈기된 무수 DMF에서 용해한 후, N-알릴트리플루오로아세트아미드(6.4 ㎖, 42 mmol)를 첨가하였다. 용액을 진공 하에 방치한 후, 질소로 3회 퍼징하였으며, 이어서 탈기된 트리에틸아민(2.3 ㎖, 16.8 mmol)을 첨가하였다. 용액을 2시간 동안 80℃까지 가열하였다. 흑색 혼합물을 실온까지 냉각시킨 후, 50 ㎖의 메탄올로 희석하였다. 대략 0.5 g의 활성탄을 첨가하고, 용액을 셀라이트(Celite) 상에서 여과한 후, 감압 하에 증발시켜 갈색은 짙은 오일을 수득하였다. 이러한 조질의 물질을 EtOAc/MeOH를 이용하여 실리카 겔 상의 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 수율: (2.27 g, 5.99 mmol). LC-MS(ES 및 CI): (음이온) m/z 378 (M-H+).
중간체(T2)의 합성: 5-[3-(2,2,2-트리플루오로아세트아미도)-알릴]-2'-데옥시우리딘(T1)(2.55 g, 6.72 mmol)을 무수 DMF에서 용해하였다. 이미다졸(1.37 g, 20.1 mmol)을 첨가한 후, 4-(디메틸아미노)피리딘(410 ㎎, 3.36 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 0℃까지 냉각시킨 후, tert-부틸(클로로)디페닐실란(1.92 ㎖, 7.39 mmol)을 3회 분량으로 천천히 30분 간격으로 첨가하였다. 반응을 0℃에서 6시간 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 증발시키고, 잔류물을 200 ㎖의 EtOAc에서 재현탁하고, 2 x 200 ㎖의 포화 NaHCO3 수용액 및 200 ㎖의 물로 세척한 후, 100 ㎖의 염수로 세척하였다. 유기상을 MgSO4 상에서 건조하고, 여과하고, 증발 건조하였다. 조질의 물질을 DCM/EtOAc를 이용하여 실리카 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 68% 수율(2.806 g, 4.54 mmol). LC-MS(ES 및 CI): (양이온) m/z 618 (M+H+); (음이온) m/z 616 (M-H+).
중간체(T3)의 합성: 5'-O-(tert-부틸디페닐실릴)-5-[3-(2,2,2-트리플루오로아세트아미도)-알릴]-2'-데옥시우리딘(T2; 2.8 g, 4.53 mmol)을 10 ㎖의 무수 DMSO(136 mmol)에서 용해한 후, 빙초산(16 ㎖, 272 mmol) 및 아세트산 무수물(16 ㎖, 158 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 6시간 동안 50℃까지 가열한 후, 200 ㎖의 포화 NaHCO3 수용액으로 켄칭하였다. 용액에서 거품 형성이 중단된 후, 이를 2 x 150 ㎖의 EtOAc로 추출하였다. 유기상을 모으고, 2 x 200 ㎖의 포화 NaHCO3 수용액, 200 ㎖의 물 및 100 ㎖의 염수로 세척하였다. 유기상을 MgSO4 상에서 건조하고, 여과하고, 증발 건조하였다. 조질의 물질을 DCM/EtOAc를 이용하여 실리카 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 77% 수율(2.375 g, 3.51 mmol). LC-MS(ES 및 CI): (양이온) m/z 678 (M+H+); (음이온) m/z 676 (M-H+).
중간체(T4)의 합성: 5'-O-(tert-부틸디페닐실릴)-3'-O-메틸티오메틸-5-[3-(2,2,2-트리플루오로아세트아미도)-알릴]-2'-데옥시우리딘(T3)(310 ㎎, 0.45 mmol)을 N2 분위기 하에 5 ㎖의 무수 디클로로메탄에서 용해하고, 사이클로헥센(228 ㎕, 2.25 mmol)을 첨가하였으며, 용액을 대략 -15℃까지 냉각시켰다. 염화설푸릴(증류됨, 55 ㎕, 0.675 mmol)을 적가하고, 반응물을 20분 동안 교반하였다. 모든 출발 물질이 소모된 후, 추가 분량의 사이클로헥센을 첨가하고(228 ㎕, 2.25 mmol), 반응물을 감압 하에 증발 건조하였다. 잔류물을 빨리 질소로 퍼징한 후, 빙냉 알릴알코올(2.5 ㎖)을 0℃에서 교반하면서 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 35분 동안 교반한 후, 25 ㎖의 포화 NaHCO3 수용액으로 켄칭하고, 이어서 100 ㎖의 포화 NaHCO3 수용액으로 추가로 희석하였다. 혼합물을 2 x 50 ㎖의 에틸아세테이트로 추출하였다. 모은 유기상을 MgSO4 상에서 건조하고, 여과하고, 증발 건조하였다. 잔류물을 DCM/EtOAc를 이용하여 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 69% 수율(214 ㎎, 0.311 mmol). LC-MS(ES 및 CI): (양이온) m/z 688 (M+H+); (음이온) m/z 686 (M-H+).
중간체(T5)의 합성: 5'-O-(tert-부틸디페닐실릴)-3'-O-알릴옥시메틸-5-[3-(2,2,2-트리플루오로아세트아미도)-알릴]-2'-데옥시우리딘(T4)(210 ㎎, 0.305 mmol)을 N2 분위기 하에 무수 THF(3 ㎖)에서 용해하였다. THF 중의 1.0 M TBAF 용액(367 ㎕, 0.367 mmol)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용액을 50 ㎖의 EtOAc로 희석한 후, 50 ㎖의 포화 NNaH2PO4(pH = 3)로 세척하고, 50 ㎖의 물로 세척하였다. 유기상을 MgSO4 상에서 건조하고, 여과하고, 증발 건조하였다. 잔류물을 DCM/EtOAc를 이용하여 실리카 겔 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 95% 수율(130 ㎎, 0.289 mmol). LC-MS(ES 및 CI): (음이온) m/z 448 (M-H+), 484 (M+Cl-).
중간체(T6)의 합성: 3'-O-알릴옥시메틸-5-[3-(2,2,2-트리플루오로아세트아미도)-알릴]-2'-데옥시우리딘(T5)(120 ㎎, 0.267 mmol)을 감압 하에 P2O5 상에서 18시간 동안 건조하였다. 여기에 무수 트리에틸포스페이트(1 ㎖) 및 일부 새로 활성화된 4 Å 분자체를 질소 하에 첨가한 후, 반응 플라스크를 0℃까지 냉각시켰다. 새로 증류된 POCl3(30 ㎕, 0.32 mmol)을 적가한 후, 프로톤 스폰지®(85 ㎎, 0.40 mmol)를 적가하였다. 첨가 이후, 반응물을 0℃에서 15분 동안 추가로 교반하였다. 이어서, 무수 DMF 중의 비스-트리-n-부틸암모늄염로서의 0.5 M 피로포스페이트 용액(2.7 ㎖, 1.33 mmol)을 빨리 첨가한 직후, 트리-n-부틸아민(270 ㎕, 1.2 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 추가의 10분 동안 빙수조에서 방치한 후, 이를 1 M 중탄산트리에틸암모늄 수용액(TEAB, 10 ㎖)에 부어서 켄칭하고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 모든 용매를 감압 하에 증발시켰다. 35% 암모니아 수용액(10 ㎖)을 상기의 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 이어서, 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 10 ㎖의 0.1 M TEAB에서 재현탁하고, 여과하였다. 먼저, 여과액을 DEAE-세파덱스 A25 상의 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다(100 g). 칼럼을 중탄산트리에틸암모늄 수용액(TEAB)으로 용출하였다. 트리포스페이트를 함유하는 분획을 모으고, 용매를 감압 하에 증발 건조하였다. 조질의 물질을 YMC-Pack-Pro C18 칼럼을 이용하여 분취 규모의 HPLC에 의해 추가로 정제하였다. 트리에틸암모늄염으로서 화합물(T6)을 수득하였다. 33% 수율(89 μmol). LC-MS(ES 및 CI): (음이온) m/z 592 (M-H+), 295 (M-2H+).
3'-AOM-ffT-LN3'-NR550S0의 합성: 공지의 건조된 화합물(LN3-NR550S0; 0.015 mmol)를 N2 하에 무수 DMA(2 ㎖)에서 용해하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(17 ㎕, 0.1 mmol)을 첨가한 후, TSTU(DMA 중의 0.1 M, 180 ㎕, 0.018 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 N2 하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 사이에, T6 수용액(0.01 mmol)을 감압 하에 증발 건조하고, 0.1 M TEAB 수용액(200 ㎕)에서 재현탁하고, LN3-NR550S0 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반한 후, 0.1 M TEAB 수용액(4 ㎖)으로 켄칭하였다. 조질의 생성물을 DEAE-세파덱스 상의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물을 분취용 HPLC에 의해 추가로 정제하여 순수한 3'-AOM-ffT-LN3'-NR550S0을 얻었다. 67% 수율(41 μmol, UV-Vis 분광 분석법에 의해 결정됨, λmax = 550 ㎚, ε = 125,000 M-1cm-1). LC-MS(ES): (음이온) m/z 1521 (M-H+), 761 (M-2H+), 507 (M-3H+).
합성에 의한 서열분석 실험
이어, 일루미나 MiniSeq® 기기를 이용한 서열분석에서 ffN을 시험하였다. 이들 ffN를 포함하는 새로운 혼입 믹스를 제외하고, 모든 표준 상업용 시약을 사용하였다. 표준 2 x 150 레시피(recipe)를 사용하였다. 표준 합성에 의한 서열분석(SBS) 프로토콜 이외에, 팔라듐 절단 믹스 용액(실시예 4에 기술되어 있는 바와 같은 DEEA 중의 Pd:THP = 1/5)의 5초 배양액을 첨가하여 3'-AOM을 탈차단하였다.
첫 번째 실험에서, 하기 ffN을 혼입 믹스에서 사용하였다: 3'-AOM-ffT-LN3-NR550S0, 3'-AOM-ffA-LN3-BL-NR550S0, 3'-AOM-ffA-LN3-BL-NR650C5, 3'-AOM-ffA-LN3-NR7180A, 3'-AOM-ffC-LN3-SO7181 및 3'-AOM-pppG(짙은 G). 그리고, 판독 1에 대한 서열분석 결과는 하기에 요약되어 있다.
| 판독 | %PF | 페이싱 | 예비 페이싱 | ER |
| 1 | 90.2% | 0.798 | 0.159 | 3.12 |
| PF(%): 26회 사이클 이후의 필터를 통과한 클러스터의 비율(%) | ||||
두 번째 실험에서, 표지되지 않은 3'-AOM-pppT를 상술한 3'-AOM-pppG의 제조에서와 유사하게 합성하였다(LC-MS (ES): (음이온) m/z 551 (M-H+)). 이를 서열분석에서 상업용 녹색 ffG-LN3-PEG12-ATTO532(일루미나 4-채널 시스템 상에서 사용됨)의 존재 하에 사용하였으며, 상기의 첫 번째 실험에 기술되어 있는 것과 동일한 ffA 및 ffC를 사용하였다. 그 결과는 하기에 요약되어 있다. 페이싱 및 예비 페이싱 값에 대한 유의한 개선이 존재하였으며, 어떠한 신호 감쇠도 관찰되지 않았다(도 3a). 게다가, 판독 1 및 판독 2에 대한 오차율이 또한 감소하였다.
| 판독 | 페이싱 | 예비 페이싱 | ER |
| 1 | 0.173 | 0.046 | 1.21 |
| 2 | 0.175 | 0.057 | 1.99 |
다른 실험에서, 3'-AOM-ffT-LN3'-NR550S0, 3'-AOM-ffA-LN3-BL-NR550S0, 3'-AOM-ffA-LN3-BL-NR650C5, 3'-AOM-ffA-LN3-NR7180A, 3'-AOM-ffC-LN3-SO7181, 및 3'-AOM-pppG (짙은 G)를 함유하는 혼입 믹스가 사용되었다. 이전 운행과 유사하게, 팔라듐 촉매를 함유하는 절단 혼합물(Pd/THP = 1:10; 실시예 4에 기술되어 있는 100 mM DEEA)에 의한 5초 배양액을 표준 SBS 사이클에 부가하였다. 표준 MiniSeq® DNA 폴리머라아제를 사용하였지만, 2x 혼입 시간으로 사용하였다. 어떠한 신호 감쇠 표현형도 관찰되지 않았다(도 3b). 게다가, 이들 서열분석 결과는 표준 아지도메틸 차단기를 갖는 ffN을 이용한 상업용 MiniSeq® 운행(평균 3회; N = 3)과 비교하였다. 오차율은 거의 동일한 것으로 관찰되었다.(도 3c). 서열분석 결과는 하기에 요약되어 있다.
| 판독 | 페이싱 | 예비 페이싱 | ER |
| 1 | 0.121 | 0.063 | 0.40 |
| 2 | 0.129 | 0.062 | 0.57 |
게다가, 3'-AOM 차단기를 갖는 ffN에 대한 1차 서열분석 메트릭스는 DNA 폴리머라아제 Pol 812를 포함하는 표준 MiniSeq® 상업용 키트에 의해 생성된 것과 비교하였으며, 비교 결과는 도 4에 나타나 있다. 3'-AOM-ffN의 개선된 안정성으로 인해 매우 낮은 예비 페이싱이 관찰되었다. 그러나, 2x 혼입 시간을 사용한 경우에도 페이싱은 여전히 높았다.
또 다른 실험에서, 상업용 MiniSeq® 키트(Pol 812) 내의 DNA 폴리머라아제 대신에 다른 DNA 폴리머라아제(Pol 1901)를 사용하였다. Pol 1901은 서열분석에서 상술한 2x 혼입 시간 대신에 표준 1x 혼입 시간을 허용하였다. 게다가, Pd 절단 혼합물 내에서의 배양은 표준 운행과 비교하여 절반으로 감소하였다. 이는 완전한 SBS 화학 사이클에 대한 10% 시간 절약을 허용하였다. 서열분석 메트릭스는 유의하게 개선되었으며, 3'-O-아지도메틸 차단기를 함유하는 표준 상업용 키트로부터 수득된 값을 초과하였다(도 4b).
서열분석에서의 3'-차단기 안정성 시험
3'-AOM을 갖는 ffN의 안정성 개선을 증명하기 위해, 이들을 3'-O-아지도메틸기를 갖는 표준 MiniSeq® ffN과 함께 비교하였다. 2세트의 ffN을 DNA 폴리머라아제만이 제외된 표준 혼입 믹스 제형에서 45℃에서 수일 동안 배양하였다. 각각의 시점에 대해, 혼입 믹스를 완성하기 위해 MiniSeq® 상의 적재 직전에 신선한 폴리머라아제를 첨가하였다. 앞서 기술된 서열분석 조건이 사용되었다. 예비 페이싱(%)은 상기 믹스에 존재하는 3'OH-ffN의 비율(%)에 대한 직접적인 지표이며, 따라서 3'-차단기의 안정성과 직접적인 상관관계가 있다. 2세트의 ffN 둘 모두에 대한 예비 페이싱 값을 기록하고 플로팅하였다(도 5). 45℃에서, 3'-AOM 함유 ffN은 3'-O-아지도메틸기를 갖는 ffN 표준물질보다 6배 더 안정하게 보이는 것으로 관찰되었다. 또한, 서열분석 메트릭스에 따르면 용액 중의 안정성 검정 동안에 관찰된 경향이 확인되었으며; 3'-AOM 차단기는 3'-O-아지도메틸기보다 유의하게 더 안정적이었다.
실시예 6. 3'-O-티오카바메이트-차단된 뉴클레오시드의 제조
본 실시예에서, 다양한 3'-O-티오카바메이트-보호된 T 뉴클레오시드를 반응식 8에 따라 제조하였다.
[반응식 8]
T-7의 제조: 오븐에서 건조되고 질소로 퍼징된 100 ㎖ 플라스크 내에 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)티미딘(1.0 g, 1.836 mmol)을 첨가하였다. 이를 무수 DMF(3 x 20 ㎖)로 동시 증발시키고, 질소 하에 방치하였다. 무수 DCM(9.2 ㎖) 및 4-디메틸아미노피리딘(224 ㎎, 0.184 mmol)을 첨가하고, 균질한 용액이 형성될 때까지 실온에서 교반하였다. 이어서, 1,1'-티오카보닐디이미다졸(360 ㎎, 2.02 mmol)을 빨리 질소 스트림 상에 첨가하였으며, 반응물을 다시 밀봉하고, 모든 출발 물질이 소모될 때까지 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실리카 겔 패드를 통해 여과하고, 필터 케이크를 EtOAc(10 ㎖)로 세척하였다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거하고, 조질의 잔류물은 추가의 정제 없이 사용하였다.
T-8의 제조: 이전 단계에서 얻어진 화합물(T-7)을 진공 하의 건조 직후에 사용하였다. 잔류물을 25 ㎖ 둥근 바닥 플라스크 내에서 질소 하에 방치하고, 디메틸아민(THF 중의 2 M, 7.3 ㎖, 14.6 mmol)을 첨가하였으며, 반응물을 모든 출발 물질이 TLC에 따라 소모될 때까지 2시간 동안 교반하였다. 모든 휘발성 물질을 진공 하에 제거하여 조질의 투명한 잔류물을 형성하였으며, 이를 실리카 겔 상의 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색 고체로서 T-8을 수득하였다. 수율: 1.15 g(99%). LC-MS(전기 분무 음성) 630.23 [M-H].
T-9의 제조: 출발 뉴클레오시드(T-8; 320 ㎎, 0.504 mmol)를 대기 중의 50 ㎖ 둥근 바닥 플라스크 내에서 최소량의 아세토니트릴에서 용해하였다. AcOH/H2O(5:1) 용액(12.5 ㎖:2.5 ㎖)을 한꺼번에 첨가하고, 반응물을 모든 출발 물질이 소모될 때(2시간 내지 4시간)까지 실온에서 교반하였다. 진공 하의 모든 휘발성 물질의 증발 및 톨루엔(2 x 60 ㎖) 중의 잔류물의 동시 증발에 의해 회백색 고체로서 조질의 생성물이 얻어졌다. 조질의 생성물을 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색 고체로서 T-9을 수득하였다. 수율: 123 ㎎(74%). LC-MS(전기 분무 음성) [M-H] 328.10.
상응하는 MeNH2 또는 NH3을 이용한 유사한 합성 과정 이후, 2개의 기타 티오카바메이트 보호기를 갖는 뉴클레오시드를 또한 제조하였다. 일반적인 반응식은 하기에 나타나 있다:
3'-O-티오카바메이트 차단기의 안정성 시험
5'-mP 3'-DMTC T 뉴클레오티드에 대한 안정성 시험을 혼입 완충 용액 중에서 표준 5'-mP 3'-O-아지도메틸 T 뉴클레오티드와 함께 수행하였다.
5'-mP 3'-DMTC T 및 5'-mP 3'-O-아지도메틸 T 둘 모두에 있어서, 최종 용액 부피는 1 ㎖이고, 상응하는 뉴클레오티드의 최종 농도는 둘 모두 0.1 mM이었다. 완충 수용액의 기타 성분으로는 에탄올아민(EA), 에탄올아민 HCl, NaCl(100 mM) 및 EDTA(2.5 mM)를 들 수 있다. 완충 용액은 하기 농도를 갖는다: 0.5 M EA 완충제, 0.5 M NaCl, 0.01 M EDTA.
안정성 시험 방법
200 ㎕의 10x 완충 용액을 1.7 ㎖ 폴리프로필렌 스냅록 마이크로튜브(snap lock microtube)에 첨가하고, 정확한 부피의 18 mΩ 물로 희석하였다. 이어서, 상응하는 뉴클레오시드를 첨가하고, 바이알을 밀봉하고, 약하게 교반하거나 마이크로피펫으로 펌핑하면서 뒤집어 혼합하였다. 40 ㎕의 분취액을 취하고, HPLC에 의해 분석하여 시작값(또는 t = 0)으로서 역할을 하였다. 이어서, 바이알을 65℃로 설정된 예열된 가열 맨들(heating mantle)에 넣고, 알루미늄 호일 박층으로 덮고, 1개월 동안 가열하도록 방치하였다. 40 ㎕의 분취액을 주기적으로 취하고(첫째 주: 1일 1회. 둘째 주 내지 넷째 주: 2일마다 1회), HPLC에 의해 분석하여 샘플 내의 출발 물질의 비율(%) 및 탈차단된 (3'-OH) 뉴클레오티드의 비율(%)을 결정하였다. 출발 뉴클레오티드 피크 및 3'-OH 피크의 면적을 측정함으로써 HPLC 분석을 수행하였다. 이들 값을 이용하여 탈차단된 뉴클레오티드의 비율(%)을 계산하였으며, 이를 도표로 나타냈으며, 이를 이용하여 샘플들 사이의 혼입 완충제 내에서의 안정성을 비교하였다. 도 6은 65℃에서 3'-O-아지도메틸 차단기로 차단된 뉴클레오티드에 대한 3개의 상이한 티오카바메이트 3'-차단 뉴클레오티드의 안정성의 비교 결과를 보여준다. 3'-O-C(=S)NH2 또는 3'-O-C(=S)NHCH3을 갖는 뉴클레오티드가 표준 3'-O-아지도메틸기로 보호된 뉴클레오티드보다 안정성이 낮은 반면, 3'-DMTC를 갖는 뉴클레오티드는 9일간의 시험 기간 동안에 개선된 안정성을 부여하는 것으로 관찰되었다. 이와 같이, DMTC는 표준 아지도메틸 차단기에 비해 우수한 안정성을 보여주었다.
실시예 7. 3'-O-티오카바메이트 차단기 탈차단 시험
본 실시예에서, 5'-mP 3'-DMTC T 및 표준 5'-mP 3'-O-아지도메틸 T 뉴클레오티드에 대한 탈차단 또는 탈차단 시험을 각각의 차단기 특유의 용액 중에서 개별적으로 실시하였다. 일루미나의 표준 탈차단 시약을 가능한 한 치밀하게 모방하고 동일한 방법을 따르기 위한 조건을 조성하였다. 활성 탈차단 시약, 완충제 및 뉴클레오시드의 농도를 모든 시험에서 동일하게 유지하였지만, 각각의 성분의 동일성은 독특하였다. 이러한 방식으로, 개개의 탈차단 화학 사이에서 관찰된 속도의 차이는 제형의 농도에서의 차이에서 기인하지 않을 수 있다.
탈차단 시험의 일반적인 방법
각각의 반응 성분을 18 mΩ 물 중의 농축 저장액으로서 개별적으로 제형화하고, 적절히 저장하였으며, 분취액을 하기에 주어진 특정 순서로 모았다. 예비 제형화된 탈차단 시약을 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 최종 농도: 뉴클레오시드(0.1 mM), 활성 탈차단 시약(1 mM), 첨가제(탈차단 시약에 특이적임), 완충제(100 mM). 최종 부피: 2,000 ㎕.
3 ㎖의 유리 바이알 내에 예비 제형화된 완충 용액을 첨가한 후, 예비 제형화된 첨가제 용액을 첨가하였다. 이를 정확한 부피의 18 mΩ 물로 희석하고, 10분 동안 교반하였다. 이어서, 뉴클레오티드 용액의 분취액을 첨가하고, 5분 동안 교반하였다. 40 ㎕의 분취액을 취하고, 켄칭 시약을 첨가하여 HPLC에 의해 참고(또는 t = 0분)용 피크로서 분석하였다. 이어서, 탈차단 시약을 한꺼번에 교반 용액에 첨가하고, 타이밍(timing)을 개시하였다. 명시된 시점에, 40 ㎕의 분취액을 취하고, 적절한 켄칭 시약으로 즉시 켄칭한 후, HPLC에 의해 분석하여, 이러한 명시된 시점에 발생한 탈차단된 뉴클레오티드의 양을 측정하였다. 결과를 도표로 작도하였으며, 이를 이용하여 탈차단 효율 및 효능을 비교하였다.
DMTC 탈차단
뉴클레오티드: 5'-mP 3'-DMTC T. 활성 탈차단 시약: NaIO4(18 mΩ 물 중 0.1 M) 또는 옥손®(18 mΩ 물 중 0.1 M). 첨가제: 없음. NaIO4용 완충제: pH 6.75 인산 완충제(18 mΩ 물 중 1 M). 옥손®용 완충제: pH 8.65 인산 완충제(18 mΩ 물 중 1 M). 켄칭 시약: 티오황산나트륨. 3'-O-아지도메틸 탈차단 조건은 실시예 3에 기술되어 있는 바와 동일하다.
출발 뉴클레오시드 피크, 3'-OH 피크, 및 HPLC 크로마토그램에 나타나는 임의의 기타 뉴클레오티드 피크의 면적을 측정함으로써 HPLC 분석을 수행하였다. 이들 값을 이용하여 출발 뉴클레오티드 및 탈차단된 뉴클레오티드의 비율(%)을 계산하였으며, 여기서 이를 도표로 나타냈으며, 이를 이용하여 샘플들 사이의 탈차단율, 효율 및 효능을 비교하였다. 비교 결과는 도 7에 나타나 있다.
NaIO4를 이용한 DMTC의 탈차단이 효율적이지 않은 것으로 관찰되었다. 그러나, DMTC가 옥손®에 의해 절단되는 경우 DMTC 차단기를 갖는 뉴클레오티드에 있어서 잔류 출발 물질의 비율(%)이 매우 낮았다. 요약하면, DMTC는 표준 아지도메틸 차단기의 탈차단율보다 우수한 탈차단율(옥손®을 이용함)을 나타냈다.
Claims (50)
- 3'-탄소 원자에 공유 부착되어 있는 하기 구조를 형성하는, 제거 가능한 3'-OH 차단기를 갖는 리보오스 또는 데옥시리보오스를 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드:
상기 식에서,
R1a 및 R1b는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알콕시, 시아노, 할로겐, 선택적으로 치환된 페닐 또는 선택적으로 치환된 아르알킬이고;
R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 시아노 또는 할로겐이고;
대안적으로 R1a 및 R2a는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 선택적으로 치환된 5원 내지 8원 헤테로사이클릴기를 형성하고;
R3은 H, 선택적으로 치환된 C2-C6 알케닐, 선택적으로 치환된 C3-C7 사이클로알케닐, 선택적으로 치환된 C2-C6 알키닐 또는 선택적으로 치환된 (C1-C6 알킬렌)Si(R4)3이고;
각각의 R4는 독립적으로 H, C1-C6 알킬 또는 선택적으로 치환된 C6-C10 아릴이고; 단 R1a, R1b, R2a 및 R2b가 각각 H인 경우에 R3은 H가 아니다. - 제1항에 있어서, R1a 및 R1b 중 적어도 하나는 H인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제2항에 있어서, R1a 및 R1b는 각각 H인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R2a 및 R2b은 각각 독립적으로 H, 할로겐 또는 C1-C6 알킬인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제4항에 있어서, R2a 및 R2b는 각각 H인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제4항에 있어서, R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 C1-C6 알킬 또는 할로겐인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제6항에 있어서, R2a 및 R2b는 각각 메틸인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제4항에 있어서, R2a는 H이고, R2b는 할로겐 또는 C1-C6 알킬인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
R3은 할로겐, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환되는 C2-C6 알키닐인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드. - 제9항에 있어서, R3은인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
R3은 할로겐, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환되는 C2-C6 알케닐인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드. - 제11항에 있어서, R3은,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
또는
인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
R3은 선택적으로 치환된 (C1-C6 알킬렌)Si(R4)3이고, 각각의 R4는 C1-C6 알킬인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드. - 제13항에 있어서, R3은 -(CH2)-SiMe3인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, R1a 및 R2a는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 6원 헤테로사이클릴을 형성하는, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제15항에 있어서, 6원 헤테로사이클릴기는 하기 구조를 갖는, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드:
.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, R1b, R2b 및 R3은 각각 H인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 3'-OH 차단기는 리보오스 또는 데옥시리보오스의 3'-탄소에 공유 부착되어 있는,
,
,
,
,
,
및
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 포함하는, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 3'-탄소 원자에 공유 부착되어 있는 하기 구조를 형성하는, 제거 가능한 3'-OH 차단기를 갖는 리보오스 또는 데옥시리보오스를 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드:
상기 식에서,
R5 및 R6은 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, C1-C6 할로알킬, C2-C8 알콕시알킬, 선택적으로 치환된 -(CH2)m-페닐, 선택적으로 치환된 -(CH2)n-(5원 또는 6원 헤테로아릴), 선택적으로 치환된 -(CH2)k-C3-C7 카보사이클릴 또는 선택적으로 치환된 -(CH2)p-(3원 내지 7원 헤테로사이클릴)이고;
-(CH2)m-, -(CH2)n-, -(CH2)k- 및 -(CH2)p-는 각각 선택적으로 치환되고;
m, n, k 및 p는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이다. - 제19항에 있어서, R5 및 R6 중 적어도 하나는 H 또는 C1-C6 알킬인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제20항에 있어서, R5 및 R6은 각각 H인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제20항에 있어서,
R5는 H이고, R6은 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 선택적으로 치환된 -(CH2)m-페닐 또는 선택적으로 치환된 -(CH2)n-6원 헤테로아릴이며, 이때 m 및 n은 각각 0 또는 1인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드. - 제20항에 있어서, R5 및 R6은 각각 C1-C6 알킬인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제23항에 있어서, R5 및 R6은 각각 메틸인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제19항에 있어서, 3'-OH 차단기는,
및
로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 포함하는, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 검출 가능한 표지에, 선택적으로는 절단 가능한 링커(cleavable linker)를 통해, 공유 부착되어 있는, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드. - 제26항에 있어서, 검출 가능한 표지는 절단 가능한 링커를 통해 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 핵염기에 공유 부착되어 있는, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제26항에 있어서, 검출 가능한 표지는 절단 가능한 링커를 통해 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 3'-산소에 공유 부착되어 있는, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, 링커는 아지도 모이어티(moiety), -O-알릴 모이어티, 이황화물 모이어티, 아세탈 모이어티 또는 티오카바메이트 모이어티를 포함하는 절단 가능한 링커인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 3'-OH 차단기 및 절단 가능한 링커는 동일한 화학 반응 조건 하에 제거될 수 있는 것인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 2'-데옥시리보오스를 포함하는, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제31항에 있어서, 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 트리포스페이트인, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
- 서열분석 반응에서 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오티드에 상보적인 성장하는 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법으로서,
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드를 성장하는 상보성 폴리뉴클레오티드 내에 혼입하는 단계를 포함하며, 이때 뉴클레오티드의 혼입은 임의의 후속적인 뉴클레오티드가 성장하는 상보성 폴리뉴클레오티드 내에 도입되는 것을 방지하는 것인, 방법. - 제34항에 있어서, 뉴클레오티드의 혼입은 폴리머라아제, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라아제 또는 역전사 효소에 의해 달성되는 것인, 방법.
- 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법으로서,
(a) 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드를 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 적어도 일부에 상보적인 복제 폴리뉴클레오티드 가닥(copy polynucleotide strand) 내에 혼입하는 단계;
(b) 복제 폴리뉴클레오티드 가닥 내에 혼입된 뉴클레오티드의 동일성(identity)을 검출하는 단계; 및
(c) 복제 폴리뉴클레오티드 가닥 내에 혼입된 뉴클레오티드로부터의 표지 및 3'-차단기를 화학적으로 제거하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제36항에 있어서, (d) 화학적으로 제거된 표지 및 3'-차단기를 복제 폴리뉴클레오티드 가닥으로부터 세척 제거하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
- 제37항에 있어서, 주형 폴리뉴클레오티드 가닥의 일부의 서열이 결정될 때까지 단계 (a) 내지 단계 (d)를 반복하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
- 제37항에 있어서, 단계 (a) 내지 단계 (d)는 적어도 50회 반복되는 것인, 방법.
- 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 폴리뉴클레오티드 가닥 내에 혼입된 뉴클레오티드로부터의 표지 및 3'-차단기를 단일 화학 반응으로 제거하는 것인, 방법.
- 제40항에 있어서, 단계 (c)는 혼입된 뉴클레오티드를 팔라듐 촉매를 포함하는 절단 용액(cleavage solution)과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 폴리뉴클레오티드 가닥에 혼입된 뉴클레오티드로부터의 표지 및 3'-차단기를 2개의 별개의 화학 반응으로 제거하는 것인, 방법.
- 제41항에 있어서, 단계 (c)는 혼입된 뉴클레오티드를 포스핀을 포함하는 절단 용액, 및 팔라듐 촉매를 포함하는 절단 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제41항 또는 제43항에 있어서, 포스핀은 트리스(하이드록시메틸)포스핀, 트리스(하이드록시에틸)포스핀 또는 트리스(하이드록시프로필)포스핀인, 방법.
- 제41항, 제43항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 팔라듐 촉매를 포함하는 절단 용액은 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 카보네이트 염, 포스페이트 염 및 보레이트 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 완충 시약을 더 포함하는 것인, 방법.
- 제45항에 있어서, 완충 시약은 에탄올아민(EA), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris), 글리신, 카보네이트 염, 포스페이트 염, 보레이트 염, 2-디메틸아미노메탄올(DMEA), 2-디에틸아미노메탄올(DEEA), N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 및 N,N,N',N'-테트라에틸에틸렌디아민(TEEDA) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함하는 키트.
- 제47항에 있어서, 효소 및 효소의 작용에 적합한 완충제를 더 포함하는, 키트.
- 제48항에 있어서, 효소는 폴리머라아제, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라아제 또는 역전사 효소인, 키트.
- 제49항에 있어서, 폴리머라아제는 DNA 폴리머라아제인, 키트.
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| CA3222797A1 (en) * | 2022-03-31 | 2023-10-05 | Ramesh NEELAKANDAN | Nucleosides and nucleotides with 3' vinyl blocking group |
| CA3223128A1 (en) | 2022-03-31 | 2023-10-05 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for improving sequencing signals |
| WO2023229884A2 (en) * | 2022-05-27 | 2023-11-30 | Illumina, Inc. | 3'-blocked nucleotides, methods of deblocking the same, and methods of synthesizing polynucleotides using the same |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5936696A (ja) * | 1982-08-20 | 1984-02-28 | Taiho Yakuhin Kogyo Kk | ２′―デオキシ―５―置換ウリジン誘導体及びそれを含有する抗腫瘍剤 |
| EP0104857A1 (en) | 1982-09-28 | 1984-04-04 | Beecham Group Plc | Deoxyuridine compounds, methods for preparing them and their use in medicine |
| US4772691A (en) | 1985-06-05 | 1988-09-20 | The Medical College Of Wisconsin, Inc. | Chemically cleavable nucleotides |
| DE3529478A1 (de) | 1985-08-16 | 1987-02-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | 7-desaza-2'desoxyguanosin-nukleotide, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung zur nukleinsaeure-sequenzierung |
| US5242796A (en) | 1986-07-02 | 1993-09-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method, system and reagents for DNA sequencing |
| GB8822228D0 (en) | 1988-09-21 | 1988-10-26 | Southern E M | Support-bound oligonucleotides |
| US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
| US5547839A (en) | 1989-06-07 | 1996-08-20 | Affymax Technologies N.V. | Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection |
| US6346413B1 (en) | 1989-06-07 | 2002-02-12 | Affymetrix, Inc. | Polymer arrays |
| DE3924454A1 (de) | 1989-07-24 | 1991-02-07 | Cornelis P Prof Dr Hollenberg | Die anwendung von dna und dna-technologie fuer die konstruktion von netzwerken zur verwendung in der chip-konstruktion und chip-produktion (dna chips) |
| US5302509A (en) | 1989-08-14 | 1994-04-12 | Beckman Instruments, Inc. | Method for sequencing polynucleotides |
| CA2044616A1 (en) | 1989-10-26 | 1991-04-27 | Roger Y. Tsien | Dna sequencing |
| ES2097925T3 (es) | 1991-09-18 | 1997-04-16 | Affymax Tech Nv | Metodo para sintetizar diversas colecciones de oligomeros. |
| JP3939338B2 (ja) | 1991-11-22 | 2007-07-04 | アフィメトリックス， インコーポレイテッド | ポリマー合成に対する組合わせの戦略 |
| DE69333650T2 (de) | 1992-02-19 | 2006-01-12 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Neue anordnungn von oligonukleotiden und ihr nutzen zum sortieren, isolieren, sequenzieren und manipulieren von nukleinsäuren |
| US5583211A (en) | 1992-10-29 | 1996-12-10 | Beckman Instruments, Inc. | Surface activated organic polymers useful for location - specific attachment of nucleic acids, peptides, proteins and oligosaccharides |
| US5472672A (en) | 1993-10-22 | 1995-12-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Apparatus and method for polymer synthesis using arrays |
| US6156501A (en) | 1993-10-26 | 2000-12-05 | Affymetrix, Inc. | Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use |
| EP0730663B1 (en) | 1993-10-26 | 2003-09-24 | Affymetrix, Inc. | Arrays of nucleic acid probes on biological chips |
| US5429807A (en) | 1993-10-28 | 1995-07-04 | Beckman Instruments, Inc. | Method and apparatus for creating biopolymer arrays on a solid support surface |
| US5807522A (en) | 1994-06-17 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for fabricating microarrays of biological samples |
| US6232465B1 (en) | 1994-09-02 | 2001-05-15 | Andrew C. Hiatt | Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides |
| US5846719A (en) | 1994-10-13 | 1998-12-08 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide tags for sorting and identification |
| US5556752A (en) | 1994-10-24 | 1996-09-17 | Affymetrix, Inc. | Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA |
| WO1996027025A1 (en) | 1995-02-27 | 1996-09-06 | Ely Michael Rabani | Device, compounds, algorithms, and methods of molecular characterization and manipulation with molecular parallelism |
| US5750341A (en) | 1995-04-17 | 1998-05-12 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions |
| US5624711A (en) | 1995-04-27 | 1997-04-29 | Affymax Technologies, N.V. | Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis |
| US5545531A (en) | 1995-06-07 | 1996-08-13 | Affymax Technologies N.V. | Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays |
| AU7398996A (en) | 1995-10-11 | 1997-04-30 | Luminex Corporation | Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and method |
| US5658734A (en) | 1995-10-17 | 1997-08-19 | International Business Machines Corporation | Process for synthesizing chemical compounds |
| US6458530B1 (en) | 1996-04-04 | 2002-10-01 | Affymetrix Inc. | Selecting tag nucleic acids |
| GB9620209D0 (en) | 1996-09-27 | 1996-11-13 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
| GB9626815D0 (en) | 1996-12-23 | 1997-02-12 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
| US6297006B1 (en) | 1997-01-16 | 2001-10-02 | Hyseq, Inc. | Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments |
| WO1998033939A1 (fr) | 1997-01-31 | 1998-08-06 | Hitachi, Ltd. | Procede pour determiner une sequence de base d'acide nucleique et appareil correspondant |
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| EP0985142A4 (en) | 1997-05-23 | 2006-09-13 | Lynx Therapeutics Inc | SYSTEM AND APPARATUS FOR THE SEQUENTIAL TREATMENT OF ANALYTES |
| US6969488B2 (en) | 1998-05-22 | 2005-11-29 | Solexa, Inc. | System and apparatus for sequential processing of analytes |
| US6465178B2 (en) | 1997-09-30 | 2002-10-15 | Surmodics, Inc. | Target molecule attachment to surfaces |
| US6485944B1 (en) | 1997-10-10 | 2002-11-26 | President And Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
| WO1999019341A1 (en) | 1997-10-10 | 1999-04-22 | President & Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
| US6087102A (en) | 1998-01-07 | 2000-07-11 | Clontech Laboratories, Inc. | Polymeric arrays and methods for their use in binding assays |
| US6287776B1 (en) | 1998-02-02 | 2001-09-11 | Signature Bioscience, Inc. | Method for detecting and classifying nucleic acid hybridization |
| JP3944996B2 (ja) | 1998-03-05 | 2007-07-18 | 株式会社日立製作所 | Ｄｎａプローブアレー |
| US6031078A (en) | 1998-06-16 | 2000-02-29 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | MTbx protein and nucleic acid molecules and uses therefor |
| US6335155B1 (en) * | 1998-06-26 | 2002-01-01 | Sunesis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapidly identifying small organic molecule ligands for binding to biological target molecules |
| DE69928265T3 (de) | 1998-07-30 | 2013-11-28 | Illumina Cambridge Ltd. | Matrizen von biomolekülen und ihre verwendung in sequenzierung |
| GB0002310D0 (en) | 2000-02-01 | 2000-03-22 | Solexa Ltd | Polynucleotide sequencing |
| AR021833A1 (es) | 1998-09-30 | 2002-08-07 | Applied Research Systems | Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico |
| US6277628B1 (en) | 1998-10-02 | 2001-08-21 | Incyte Genomics, Inc. | Linear microarrays |
| US6391937B1 (en) | 1998-11-25 | 2002-05-21 | Motorola, Inc. | Polyacrylamide hydrogels and hydrogel arrays made from polyacrylamide reactive prepolymers |
| AU3174600A (en) | 1999-03-10 | 2000-09-28 | Asm Scientific, Inc. | A method for direct nucleic acid sequencing |
| US6355431B1 (en) | 1999-04-20 | 2002-03-12 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays |
| EP1923471B1 (en) | 1999-04-20 | 2012-12-19 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
| US6664061B2 (en) | 1999-06-25 | 2003-12-16 | Amersham Biosciences Ab | Use and evaluation of a [2+2] photoaddition in immobilization of oligonucleotides on a three-dimensional hydrogel matrix |
| US6372813B1 (en) | 1999-06-25 | 2002-04-16 | Motorola | Methods and compositions for attachment of biomolecules to solid supports, hydrogels, and hydrogel arrays |
| US6274320B1 (en) | 1999-09-16 | 2001-08-14 | Curagen Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
| US6770441B2 (en) | 2000-02-10 | 2004-08-03 | Illumina, Inc. | Array compositions and methods of making same |
| US7001792B2 (en) | 2000-04-24 | 2006-02-21 | Eagle Research & Development, Llc | Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same |
| GB0013276D0 (en) | 2000-06-01 | 2000-07-26 | Amersham Pharm Biotech Uk Ltd | Nucleotide analogues |
| CN100462433C (zh) | 2000-07-07 | 2009-02-18 | 维西根生物技术公司 | 实时序列测定 |
| WO2002012566A2 (en) | 2000-08-09 | 2002-02-14 | Motorola, Inc. | The use and evaluation of a [2+2] photocycloaddition in immobilization of oligonucleotides on a three-dimensional hydrogel matrix |
| AU2001296645A1 (en) | 2000-10-06 | 2002-04-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding dna and rna |
| WO2002044425A2 (en) | 2000-12-01 | 2002-06-06 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity |
| US7057026B2 (en) * | 2001-12-04 | 2006-06-06 | Solexa Limited | Labelled nucleotides |
| GB2395953A (en) | 2002-08-23 | 2004-06-09 | Solexa Ltd | Labelled nucleotides |
| WO2004018497A2 (en) * | 2002-08-23 | 2004-03-04 | Solexa Limited | Modified nucleotides for polynucleotide sequencing |
| GB0321306D0 (en) | 2003-09-11 | 2003-10-15 | Solexa Ltd | Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues |
| GB0326073D0 (en) | 2003-11-07 | 2003-12-10 | Solexa Ltd | Improvements in or relating to polynucleotide arrays |
| JP2007525571A (ja) | 2004-01-07 | 2007-09-06 | ソレクサ リミテッド | 修飾分子アレイ |
| CN101914620B (zh) | 2004-09-17 | 2014-02-12 | 加利福尼亚太平洋生命科学公司 | 核酸测序的方法 |
| EP1888743B1 (en) | 2005-05-10 | 2011-08-03 | Illumina Cambridge Limited | Improved polymerases |
| GB0514936D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Preparation of templates for nucleic acid sequencing |
| GB0517097D0 (en) | 2005-08-19 | 2005-09-28 | Solexa Ltd | Modified nucleosides and nucleotides and uses thereof |
| US7405281B2 (en) | 2005-09-29 | 2008-07-29 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor |
| EP2018622B1 (en) | 2006-03-31 | 2018-04-25 | Illumina, Inc. | Systems for sequence by synthesis analysis |
| US7754429B2 (en) | 2006-10-06 | 2010-07-13 | Illumina Cambridge Limited | Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides |
| WO2008051530A2 (en) | 2006-10-23 | 2008-05-02 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing |
| EP2653861B1 (en) | 2006-12-14 | 2014-08-13 | Life Technologies Corporation | Method for sequencing a nucleic acid using large-scale FET arrays |
| US8262900B2 (en) | 2006-12-14 | 2012-09-11 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays |
| US8349167B2 (en) | 2006-12-14 | 2013-01-08 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays |
| EP2725107B1 (en) | 2007-10-19 | 2018-08-29 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | DNA sequencing with non-fluorescent nucleotide reversible terminators and cleavable label modified ddNTPs and nucleic acid comprising inosine with reversible terminators |
| US8617811B2 (en) | 2008-01-28 | 2013-12-31 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions |
| US20100137143A1 (en) | 2008-10-22 | 2010-06-03 | Ion Torrent Systems Incorporated | Methods and apparatus for measuring analytes |
| US8951781B2 (en) | 2011-01-10 | 2015-02-10 | Illumina, Inc. | Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis |
| WO2012162429A2 (en) | 2011-05-23 | 2012-11-29 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Dna sequencing by synthesis using raman and infrared spectroscopy detection |
| EP3290528B1 (en) | 2011-09-23 | 2019-08-14 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
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| BR112015022448B1 (pt) | 2013-03-15 | 2020-12-08 | Illumina Cambridge Limited | molécula de nucleotídeo ou nucleosídeo modificado, métodos para preparar o crescimento de polinucleotídeo complementar a polinucleotídeo alvo de fita simples em reação de sequenciação e para determinar a sequência de polinucleotídeo alvo de fita simples e kit |
| GB201414098D0 (en) | 2014-08-08 | 2014-09-24 | Illumina Cambridge Ltd | Modified nucleotide linkers |
| WO2017079498A2 (en) | 2015-11-06 | 2017-05-11 | Intelligent Biosystems, Inc. | Nucleotide analogues |
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