KR20230123871A - 핵산 서열분석을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 실시 형태는 청색 및 자색 광 여기(예를 들어, 각각 450 내지 460 nm 및 400 내지 405 nm의 레이저)를 사용하는 2-채널 핵산 서열분석을 위한 방법, 키트 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 뉴클레오티드는 청색 염료, 자색 염료, 또는 청색 염료와 자색 염료 둘 모두로 직접 표지될 수 있다. 대안적으로, 도입을 위한 하나 이상의 뉴클레오티드가 표지되지 않을 수 있고, 청색 염료, 자색 염료, 또는 청색 염료와 자색 염료 둘 모두를 함유하는 친화성 시약이 사용되어 도입된 각각의 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합할 수 있다.

Description

핵산 서열분석을 위한 방법 및 조성물
본 발명은 대체적으로 핵산 서열분석 응용을 위한 방법, 시스템, 키트 및 조성물에 관한 것이다.
DNA 서열분석의 경우, 복수의 공간적으로 중첩된 분석물의 독립적인 검출을 달성하기 위해 다수의 스펙트럼적으로 구별가능한 형광 표지를 사용하는 것이 바람직하다. 그러한 멀티플렉스 방법에서는, 반응 베셀(reaction vessel)의 수를 감소시켜, 실험 프로토콜을 간소화하고 응용-특이적 시약 키트의 생성을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 다색 자동화 DNA 서열분석 시스템에서, 멀티플렉스 형광 검출은 단일 전기영동 레인(lane)에서의 다수의 뉴클레오티드 염기의 분석을 가능하게 하며, 그럼으로써 단색 방법에 비해 처리량을 증가시키고, 레인간 전기영동 이동도 변동과 관련된 불확정성을 감소시킨다.
그러나, 멀티플렉스 형광 검출은 문제가 될 수 있으며, 적절한 형광 표지의 선택을 제한하는 다수의 중요한 인자가 있다. 첫째, 주어진 응용에서 실질적으로 해상되는(resolved) 흡수 및 방출 스펙트럼을 갖는 염료 화합물을 찾는 것이 어려울 수 있다. 게다가, 몇몇 형광 염료들이 함께 사용될 때, 동시 여기에 의해 구별가능한 스펙트럼 영역들에서 형광 신호들을 생성하는 것이 복잡할 수 있는데, 그 이유는, 염료들의 흡수 밴드들이 통상 폭넓게 떨어져 있으며, 이에 따라 심지어 2개의 염료에 대해서조차도 비견되는 형광 여기 효율을 달성하는 것이 어렵다. 많은 여기 방법은 레이저와 같은 고전력 광원을 사용하고, 따라서, 염료는 이러한 여기를 견디기에 충분한 광안정성을 가져야 한다. 분자 생물학 방법에 대해 특히 중요한 최종 고려사항은 형광 염료가, 예를 들어 DNA 합성 용매 및 시약, 완충액, 폴리머라제 효소, 및 리가제 효소와 같은 시약 화학물질과 상용성이 있어야 한다는 것이다.
적합한 형광 강도, 형상, 및 형광 밴드의 파장 최대치와 같은 개선된 형광 특성을 갖는 형광 염료 분자는 핵산 서열분석의 속도 및 정확도를 개선할 수 있다. 강한 형광 신호는 수계 생물학적 완충액 중에서 그리고 더 높은 온도에서 측정이 이루어질 때 특히 중요한데, 그 이유는, 대부분의 유기 염료의 형광 강도는 그러한 조건 하에서 상당히 더 낮기 때문이다. 더욱이, 염료가 부착된 염기의 성질이 또한 형광 최대치, 형광 강도, 및 다른 스펙트럼 염료 특성에 영향을 준다. 핵염기와 형광 염료 사이의 서열-특이적 상호작용은 형광 염료의 특수 설계에 의해 조정될 수 있다. 형광 염료의 구조의 최적화는 뉴클레오티드 도입의 효율을 개선하고, 서열분석 오류의 수준을 감소시키고, 핵산 서열분석에서의 시약의 사용을 감소시키고, 이에 따라 핵산 서열분석의 비용을 감소시킨다.
일부 광학적 및 기술적 개발은 이미 이미지 품질을 크게 개선해 왔지만, 궁극적으로 불량한 광학 해상도에 의해 제한되었다. 광학 해상도는 아베 법칙(Abbe's law)에 따른다. 일반적으로, 광학 현미경법의 광학 해상도는 사용되는 광의 파장의 대략 절반에서 이격된 물체들로 제한된다. 실제적인 관점에서, 단지 매우 멀리 떨어져서(적어도 200 내지 350 nm) 놓여 있는 물체들만이 광학 현미경법에 의해 해상될 수 있다. 이미지 해상도를 개선하고 표면적 단위당 해상가능한 물체들의 수를 증가시키는 한 가지 방법은 더 짧은 파장의 여기 광을 사용하는 것이다. 예를 들어, 동일한 광학계를 사용하여 광 파장이 Δλ가 약 100 nm만큼 단축되는 경우, 해상도는 더 우수할 것이고(약 Δ 50 nm/(약 15%)), 덜 왜곡된 이미지가 기록될 것이고, 인식가능한 영역 상의 물체들의 밀도는 약 35%로 증가될 것이다.
그러나, 광범위한 레이저 조사, 특히 청색 또는 자색 영역의 더 짧은 파장은 형광 염료를 표백시키고 용액 중/플로우셀(flow-cell) 표면 상의 뉴클레오티드 샘플 또는 형광 염료가 접합된 것들을 손상시킬 수 있다. 광에 대한 그러한 노출은 또한 DNA 샘플 손상을 야기할 수 있다. 광표백 및 광손상의 유형 및 정도는, 예를 들어 화합물들의 화학 구조, 및 산화환원 전위와 같은 일부 그들의 물리적-화학적 특성, 특정 바이오-표지의 여기 스펙트럼, 특정 광원 조사의 강도, 및 특정 측정에서의 노출 시간에 따라 달라질 수 있다. 더 낮은 파장 광원이 더 높은 에너지 광자를 전달하고 있기 때문에, 더 짧은 파장을 갖는 자색 LED/레이저가 염료의 광표백 및 DNA 손상을 야기할 가능성이 더 크다. 형광 검출에서 조사 동안 핵산 손상이 일어날 수 있는 다수의 화학 경로가 존재한다. 예를 들어, 자외선(UV) 방사선에 대한 노출은 티민 또는 시토신의 직접 광화학적 [2+2] 광부가환화 반응을 통해 DNA 손상을 야기하여, 사이클로부탄 함유 융합된 피리미딘 이량체, 예컨대 TT, TC, 및 CC를 제공할 수 있는 것으로 나타나 있다. 그러한 직접 광부가환화 반응은 약 100 nm에서 약 315 nm까지 연장되는 UV B 및 UV C 영역에서 발생할 수 있다. 약 315 nm부터 약 500 nm까지에 걸쳐 있는, 가시 영역의 일부분을 통한 UV A 영역에서는, 간접 기전의 복잡한 혼합물이 또한 다른 성분들의 감광화(photosensitization)를 통해 DNA 손상을 야기할 수 있다. 그러한 간접 기전은 상이한 광 유도 반응성 종, 예를 들어 반응성 산소종(ROS), 예컨대 일중항 산소, 초산화물 음이온, 및 하이드록실 라디칼과의 상호작용을 통해 산화적 DNA 변형을 가져올 수 있다.
서열분석 효율을 증가시키고 게놈당 비용을 감소시키기 위해, 더 많은 클러스터가 양호한 광학 해상도를 유지하면서 동일한 필요 표면적으로 패킹될 수 있도록 피치 밀도를 증가시키는 것이 필수적이며, 이는 더 짧은 파장을 갖는 광(예컨대, 자색 및 청색 레이저)의 사용을 필요로 한다. 핵산 서열분석 응용을 위해 파장의 매우 혼잡한 영역(청색 내지 자색 영역)에 있는 염료들의 적절한 세트를 선택하고 더 짧은 파장 여기에 의해 야기되는 DNA 손상을 완화시키는 것에 대한 과제가 남아 있다.
본 발명은 청색 및 자색 광 여기(예를 들어, 450 내지 460 nm 및 400 내지 405 nm의 레이저)를 사용하는 2-채널 핵산 서열분석 응용을 위한 방법, 키트 및 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일부 태양은 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법에 관한 것으로서, 본 방법은,
(a) 프라이머 폴리뉴클레오티드를 제1 유형의 뉴클레오티드, 제2 유형의 뉴클레오티드, 제3 유형의 뉴클레오티드, 및 제4 유형의 뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계 - 프라이머 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적임 -;
(b) 혼합물로부터의 하나의 유형의 뉴클레오티드를 프라이머 폴리뉴클레오티드로 도입하여 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계;
(c) 제1 여기 광원을 사용하여 제1 이미징 이벤트를 수행하고 제1 방출 필터를 이용하여 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드로부터 제1 방출 신호를 수집하는 단계; 및
(d) 제2 여기 광원을 사용하여 제2 이미징 이벤트를 수행하고 제2 방출 필터를 이용하여 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드로부터 제2 방출 신호를 수집하는 단계를 포함하고;
제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 중 하나는 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 중 다른 하나는 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고;
제1 방출 필터 및 제2 방출 필터 중 하나는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖고, 제1 방출 필터 및 제2 방출 필터 중 다른 하나는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 유형, 제2 유형 및 제3 유형 각각의 뉴클레오티드는 검출가능한 표지로 표지된다. 다른 실시 형태에서, 제1 유형, 제2 유형 및 제3 유형의 뉴클레오티드 중 하나 이상은 표지되지 않고, 본 방법은 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체 내로 도입되는 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 친화성 시약의 사용을 수반하는 제2 표지화 단계를 이용한다. 추가의 실시 형태에서, 제4 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 제1 이미징 이벤트 및 제2 이미징 이벤트 동안 어떠한 신호도 방출하지 않는다.
본 발명의 일부 태양은 서열분석 응용을 위한 키트에 관한 것으로서, 키트는,
제1 검출가능한 표지로 표지된 제1 유형의 뉴클레오티드;
제2 검출가능한 표지로 표지된 제2 유형의 뉴클레오티드;
제1 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드; 및
제2 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드를 포함하고;
제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 서로 스펙트럼적으로 구별가능하고, 제1 검출가능한 표지는 제1 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능하고, 제2 검출가능한 표지는 제2 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능하고;
제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 중 하나는 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 중 다른 하나는 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고;
제1 방출 필터 및 제2 방출 필터 중 하나는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖고, 제1 방출 필터 및 제2 방출 필터 중 다른 하나는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는다.
본 발명의 일부 태양은 서열분석 응용을 위한 키트에 관한 것으로서, 키트는,
제1 검출가능한 표지로 표지된 제1 유형의 뉴클레오티드;
제2 검출가능한 표지로 표지된 제2 유형의 뉴클레오티드;
제3 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드; 및
제4 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드를 포함하고;
제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 서로 스펙트럼적으로 구별가능하고, 제1 검출가능한 표지는 제1 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능하고, 제2 검출가능한 표지는 제2 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능하고;
제3 검출가능한 표지 및 제4 검출가능한 표지는 서로 스펙트럼적으로 구별가능하고, 제3 검출가능한 표지는 제1 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능하고, 제4 검출가능한 표지는 제2 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능하고;
제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 중 하나는 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 중 다른 하나는 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고;
제1 방출 필터 및 제2 방출 필터 중 하나는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖고, 제1 방출 필터 및 제2 방출 필터 중 다른 하나는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는다.
본 발명의 일부 다른 태양은 서열분석 응용을 위한 키트에 관한 것으로서, 키트는,
제1 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드;
제2 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드;
제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드; 및
친화성 시약의 세트를 포함하고, 친화성 시약의 세트는,
제1 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1 친화성 시약; 및
제2 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2 친화성 시약을 포함하고;
제1 친화성 시약은 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 제2 친화성 시약은 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하고, 제1 검출가능한 표지는 제2 검출가능한 표지로부터 스펙트럼적으로 구별가능하고;
제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 중 하나는 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 중 다른 하나는 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고;
제1 방출 필터 및 제2 방출 필터 중 하나는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖고, 제1 방출 필터 및 제2 방출 필터 중 다른 하나는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 친화성 시약 및 제2 친화성 시약 둘 모두는 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합한다. 다른 실시 형태에서, 친화성 시약의 세트는 제3 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제3 친화성 시약을 추가로 포함하고, 제3 친화성 시약은 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제3 검출가능한 표지, 및 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제4 검출가능한 표지를 포함한다.
본 발명의 일부 다른 태양은 서열분석 응용을 위한 키트에 관한 것으로서, 키트는,
제1 검출가능한 표지로 표지되거나 표지되지 않은 제1 유형의 뉴클레오티드;
제2 검출가능한 표지로 표지되거나 표지되지 않은 제2 유형의 뉴클레오티드 - 제1 유형의 뉴클레오티드 및 제2 유형의 뉴클레오티드 중 하나는 표지되지 않음 -;
제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드, 및 제1 또는 제2 유형의 뉴클레오티드와 동일한 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드 - 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 서로 스펙트럼적으로 구별가능하고, 제1 검출가능한 표지는 제1 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능하고, 제2 검출가능한 표지는 제2 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능함 -; 및
제1 유형의 뉴클레오티드가 표지되지 않은 경우 제1 유형의 뉴클레오티드 및 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1 친화성 시약, 또는 제2 유형의 뉴클레오티드가 표지되지 않은 경우 제2 유형의 뉴클레오티드 및 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2 친화성 시약을 포함하는 친화성 시약 - 제1 친화성 시약은 하나 이상의 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 제2 친화성 시약은 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함함 - 을 포함하고;
제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 중 하나는 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 중 다른 하나는 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고;
제1 방출 필터 및 제2 방출 필터 중 하나는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖고, 제1 방출 필터 및 제2 방출 필터 중 다른 하나는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는다.
도 1은 시간의 함수로서 자색 광 노출에 의해 야기된 DNA 광손상을 예시하는 선도표이다.
도 2는 실시예 2에 기재된 합성 방법에 의한 2차 표지화 서열분석으로 얻어진 산점도이다.
본 발명은 청색 및 자색 광 여기(예를 들어, 450 내지 460 nm 및 400 내지 405 nm의 레이저) 및 약 415 내지 450 nm 및 약 480 내지 525 nm의 필터 대역을 사용하는 2-채널 검출을 사용하는 핵산 서열분석 응용, 특히, 합성에 의한 서열분석을 위한 방법, 시스템, 키트 및 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 방법, 키트 및 조성물은 청색 및 자색 염료를 포함하는 염료 세트(즉, 청색 광 및 자색 광 영역에서 흡수 최대치를 갖는 염료)를 사용한다. 본 방법은 청색 및 자색 여기에 의해 야기된 DNA 손상 및 광표백을 감소시키기 위해 친화성 시약을 추가로 이용한다. 더 짧은 파장 광원을 이용하는 본 명세서에 기재된 서열분석 방법은 적색/녹색 광원 여기 또는 녹색/청색 광원 여기를 사용하는 Illumina의 MiniSeq®, NextSeq®, 및 NovaSeq® 시스템에 사용된 현재의 2-채널 서열분석과 비교하여 패턴화된 어레이 또는 플로우 셀에서 피치 또는 클러스터 밀도를 증가시킬 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "피치"는 패턴화된 고체 지지체 상의 2개의 나노패턴들 사이의 거리(예를 들어, 패턴화된 플로우셀 상의 2개의 나노웰(nanowell)들 사이의 거리)를 지칭한다. 적색/녹색 광원 여기를 사용하는 Illumina의 2-채널 서열분석에 대한 상세한 설명은 미국 특허 출원 공개 제2013/0079232호에 개시되어 있으며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 예를 들어, 녹색/적색 또는 청색/녹색 여기를 사용하는 시스템에서, 광학 해상도는 (예를 들어, 녹색/적색 시스템의 경우 약 715 nm 및 청색/녹색 시스템의 경우 약 590 nm의) 적색 형광 염료 또는 녹색 형광 염료 방출에 의해 각각 제한된다. 자색/청색 광 여기를 사용함으로써, 광학 해상도는 청색 염료 방출(즉, 480 내지 525 nm)에 의해 제한된다. 이와 같이, 본 발명의 방법 및 시스템은 피치 밀도가 최대 50% 증가를 제공할 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함하다", "포함한다", 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 용어 "갖는"뿐만 아니라 "갖다", "갖는다", 및 "가진"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 청구항의 전제부에서든 또는 본문에서든, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 개방형(open-ended) 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 어구 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는"과 동의어로 해석되어야 한다. 예를 들어, 공정과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 공정이 적어도 언급된 단계들을 포함하지만, 추가의 단계들을 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 화합물, 조성물 또는 장치가 적어도 언급된 특징부들 또는 구성요소들을 포함하지만, 또한 추가의 특징부들 또는 구성요소들을 포함할 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 통상의 유기물 약어는 하기와 같이 정의된다:
℃ 섭씨 온도
dATP 데옥시아데노신 트라이포스페이트
dCTP 데옥시시티딘 트라이포스페이트
dGTP 데옥시구아노신 트라이포스페이트
dTTP 데옥시티미딘 트라이포스페이트
ddNTP 다이데옥시뉴클레오티드 트라이포스페이트
ffA 완전 작용화된 A 뉴클레오티드
ffC 완전 작용화된 C 뉴클레오티드
ffG 완전 작용화된 G 뉴클레오티드
ffN 완전 작용화된 뉴클레오티드
ffT 완전 작용화된 T 뉴클레오티드
LED 발광 다이오드
SBS 합성에 의한 서열분석
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "어레이"는 상이한 프로브 분자들이 상대 위치에 따라 서로 구별될 수 있도록 하나 이상의 기재에 부착되는 상이한 프로브 분자들의 집단을 지칭한다. 어레이는 기재 상의 상이한 어드레스가능한 위치들에 각각 위치된 상이한 프로브 분자들을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 어레이는, 각각 상이한 프로브 분자를 갖는 별개의 기재들을 포함할 수 있으며, 여기서 상이한 프로브 분자들은 기재들이 부착된 표면 상의 기재들의 위치에 따라 또는 액체 중에서의 기재들의 위치에 따라 확인될 수 있다. 별개의 기재가 표면 상에 위치되는 예시적인 어레이는, 제한 없이, 예를 들어, 미국 특허 제6,355,431 B1호, 미국 특허 출원 공개 제2002/0102578호 및 PCT 공개 WO 00/63437호에 기재된 바와 같이 웰 내에 비드들을 포함하는 것들을 포함한다. 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류기(fluorescent activated cell sorter, FACS)와 같은 마이크로유체 장치를 사용하여 액체 어레이에서 비드들을 구별하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 예시적인 형식은, 예를 들어, 미국 특허 제6,524,793호에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 어레이의 추가 예는, 제한 없이, 미국 특허 제5,429,807호; 제5,436,327호; 제5,561,071호; 제5,583,211호; 제5,658,734호; 제5,837,858호; 제5,874,219호; 제5,919,523호; 제6,136,269호; 제6,287,768호; 제6,287,776호; 제6,288,220호; 제6,297,006호; 제6,291,193호; 제6,346,413호; 제6,416,949호; 제6,482,591호; 제6,514,751호 및 제6,610,482호; 및 국제 특허 출원 공개 WO 93/17126호; WO 95/11995호; WO 95/35505호; EP 0 742 287호; 및 EP 0 799 897호에 기재된 것들을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "공유적으로 부착된" 또는 "공유 결합된"은 원자들 사이에 전자쌍을 공유하는 것을 특징으로 하는 화학 결합의 형성을 지칭한다. 예를 들어, 공유적으로 부착된 중합체 코팅은, 다른 수단, 예를 들어 접착 또는 정전기 상호작용을 통한 표면에 대한 부착과 비교하여, 기재의 작용화된 표면과 화학 결합을 형성하는 중합체 코팅을 지칭한다. 표면에 공유적으로 부착된 중합체는 또한 공유 부착 이외의 수단을 통해 결합될 수 있음이 이해될 것이다.
본 명세서에 기재된 화합물의 단일 메소머 형태가 나타나 있는 각각의 경우에, 대안적인 메소머 형태가 동일하게 고려된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "뉴클레오티드"는 질소 함유 헤테로사이클릭 염기, 당, 및 하나 이상의 포스페이트 기를 포함한다. 이들은 핵산 서열의 단량체 단위이다. RNA에서, 당은 리보스이고, DNA에서는 데옥시리보스, 즉 리보스에 존재하는 하이드록실 기가 결여되어 있는 당이다. 질소 함유 헤테로사이클릭 염기는 퓨린, 데아자퓨린 또는 피리미딘 염기일 수 있다. 퓨린 염기는 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 이들의 변형된 유도체 또는 유사체, 예컨대 7-데아자 아데닌 또는 7-데아자 구아닌을 포함한다. 피리미딘 염기는 시토신(C), 티민(T), 및 우라실(U), 및 이들의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다. 일부 예에서, 용어 "뉴클레오티드"는 또한, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 절단 링커를 통해, 형광 모이어티로 표지된 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 접합체를 포괄할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "표지되지 않은 뉴클레오티드"는 형광 모이어티를 포함하지 않는 뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 예에서, 표지되지 않은 뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 친화성 시약에 결합할 수 있게 하는 작용성 모이어티(예를 들어, 합텐) 및/또는 절단가능한 링커를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 표지되지 않은 뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 친화성 시약에 결합할 수 있게 하는 작용성 모이어티 또는 절단가능한 링커를 갖지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "뉴클레오시드"는 뉴클레오티드와 구조적으로 유사하지만 포스페이트 모이어티가 누락되어 있다. 뉴클레오시드 유사체의 한 예는 표지가 염기에 연결되어 있고 당 분자에 부착된 포스페이트 기가 없는 것일 것이다. 용어 "뉴클레오시드"는 당업자에게 명백한 이의 통상적인 의미로 본 명세서에 사용된다. 예에는 리보스 모이어티를 포함하는 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보스 모이어티를 포함하는 데옥시리보뉴클레오시드가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 변형된 펜토스 모이어티는 산소 원자가 탄소로 치환되고/되거나 탄소가 황 또는 산소 원자로 치환된 펜토스 모이어티이다. "뉴클레오시드"는 치환된 염기 및/또는 당 모이어티를 가질 수 있는 단량체이다. 추가적으로, 뉴클레오시드는 더 큰 DNA 및/또는 RNA 중합체 및 올리고머 내로 도입될 수 있다.
용어 "퓨린 염기"는 당업자에게 명백한 이의 통상적인 의미로 본 명세서에 사용되며, 이의 호변이성질체를 포함한다. 유사하게, 용어 "피리미딘 염기"는 당업자에게 명백한 이의 통상적인 의미로 본 명세서에 사용되며, 이의 호변이성질체를 포함한다. 선택적으로 치환된 퓨린-염기의 비제한적인 목록은 퓨린, 아데닌, 구아닌, 데아자퓨린, 7-데아자 아데닌, 7-데아자 구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, 알록잔틴, 7-알킬구아닌(예를 들어, 7-메틸구아닌), 테오브로민, 카페인, 요산 및 아이소구아닌을 포함한다. 피리미딘 염기의 예에는 시토신, 티민, 우라실, 5,6-다이하이드로우라실 및 5-알킬시토신(예를 들어, 5-메틸시토신)이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에 기재된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 "포함하는" 것으로 기재될 때, 그것은 본 명세서에 기재된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 공유 결합을 형성한다는 것을 의미한다. 유사하게, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부로서 기재될 때, 예컨대 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 "내로 도입된" 것으로 기재될 때, 그것은 본 명세서에 기재된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 공유 결합을 형성한다는 것을 의미한다. 일부 그러한 실시 형태에서, 공유 결합은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 3' 탄소 원자와 뉴클레오티드의 5' 탄소 원자 사이의 포스포다이에스테르 결합으로서, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 3' 하이드록시 기와 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드의 5' 포스페이트 기 사이에 형성된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "절단가능한 링커"는 전체 링커가 제거될 것이 요구되는 것을 내포하는 것으로 의미되지 않는다. 절단 부위는 링커의 일부가 절단 후 검출가능한 표지 및/또는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 모이어티에 부착된 채로 남아 있는 것을 보장하는 링커 상의 위치에 위치될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유도체" 및 "유사체"는 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 갖는 합성 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유도체를 의미한다. 그러한 유도체 및 유사체는, 예를 들어 문헌[Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley & Son, 1980)] 및 문헌[Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990]에 논의되어 있다. 뉴클레오티드 유사체는 또한, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 알킬-포스포네이트, 포스포르아닐리데이트 및 포스포르아미데이트 결합을 포함한 변형된 포스포다이에스테르 결합을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유도체", "유사체" 및 "변형된"은 상호교환 가능하게 사용될 수 있으며, 본 명세서에 정의된 용어 "뉴클레오티드" 및 "뉴클레오시드"에 의해 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포스페이트"는 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 이의 통상적인 의미로 사용되고, 이의 양성자화 형태(예를 들어, 및 )를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "모노포스페이트", "다이포스페이트", 및 "트라이포스페이트"는 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 이들의 통상적인 의미로 사용되고, 양성자화 형태를 포함한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드와 같은 화합물은, 예를 들어 -CO2 -, -SO3 - 또는 -O-를 함유하는 이온화된 형태로 존재할 수 있다. 화합물이 양으로 또는 음으로 하전된 치환기를 함유하는 경우, 그것은 또한, 화합물이 전체적으로 중성이 되게 하는 음으로 또는 양으로 하전된 반대이온을 함유할 수 있다. 다른 태양에서, 화합물은 염 형태로 존재할 수 있으며, 여기서는 반대이온이 짝산 또는 짝염기에 의해 제공된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "위상화(phasing)"는 SBS에서의 현상을 지칭하는 것으로, 이 현상은 3' 종결자 및 형광단의 불완전한 제거에 의해 야기되고/되거나, 주어진 서열분석 사이클에서 폴리머라제에 의한 클러스터 내로의 DNA 가닥의 일부분의 도입을 완료하지 못한다. 전위상화(prephasing)는 효과적인 3' 종결자를 갖지 않는 뉴클레오티드의 도입에 의해 야기되는데, 여기서는 이러한 도입 사건이 종결 실패로 인해 1 사이클 먼저 앞서 간다. 위상화 및 전위상화는 특정 사이클에 대해 측정된 신호 강도가 현재 사이클로로부터의 신호뿐만 아니라 선행 사이클 및 후행 사이클로부터의 잡음으로 이루어지게 한다. 사이클 횟수가 증가함에 따라, 위상화 및 전위상화에 의해 영향을 받는 클러스터당 서열의 분율이 증가하여, 올바른 염기의 확인을 방해한다. 전위상화는 합성에 의한 서열분석(SBS) 동안 미량의 보호되지 않거나 블록킹되지 않은 3'-OH 뉴클레오티드의 존재에 의해 야기될 수 있다. 보호되지 않은 3'-OH 뉴클레오티드는 제조 공정 동안 또는 가능하게는 저장 및 시약 취급 과정 동안 생성될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "스펙트럼적으로 구별가능한 형광 염료"는 2개 이상의 그러한 염료가 하나의 샘플 내에 존재할 때 형광 검출 장비에 의해 구별될 수 있는 파장에서 형광 에너지를 방출하는 형광 염료를 지칭한다.
청색/자색 2-채널 서열분석 방법
본 발명의 일부 태양은 표적 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드)의 서열을 결정하는 방법에 관한 것으로서, 본 방법은,
(a) 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체를 제1 유형의 뉴클레오티드, 제2 유형의 뉴클레오티드, 제3 유형의 뉴클레오티드, 및 제4 유형의 뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계 - 프라이머 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적임 -;
(b) 혼합물로부터의 하나의 유형의 뉴클레오티드를 프라이머 폴리뉴클레오티드로 도입하여 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드(즉, 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체)를 생성하는 단계;
(c) 제1 여기 광원을 사용하여 제1 이미징 이벤트를 수행하고 제1 방출 필터를 이용하여 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체로부터 제1 방출 신호를 수집하는 단계; 및
(d) 제2 여기 광원을 사용하여 제2 이미징 이벤트를 수행하고 제2 방출 필터를 이용하여 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체로부터 제2 방출 신호를 수집하는 단계를 포함하고;
제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 중 하나는 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 중 다른 하나는 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고;
제1 방출 필터 및 제2 방출 필터 중 하나는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖고, 제1 방출 필터 및 제2 방출 필터 중 다른 하나는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는다.
본 명세서에 기술된 방법의 일부 실시 형태에서, 제1 여기 광원은 약 350 nm 내지 약 410 nm(예를 들어, 약 405 nm)의 파장을 갖고, 제1 방출 필터는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖는다. 제2 여기 광원은 약 450 nm 내지 약 460 nm(예를 들어, 약 460 nm)의 파장을 갖고, 제2 방출 필터는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는다. 일부 다른 실시 형태에서, 제1 여기 광원은 약 450 nm 내지 약 460 nm(예를 들어, 약 460 nm)의 파장을 갖고, 제1 방출 필터는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는다. 제2 여기 광원은 약 350 nm 내지 약 410 nm(예를 들어, 약 405 nm)의 파장을 갖고, 제2 방출 필터는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖는다.
도입 혼합물 내의 표지된 뉴클레오티드
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시 형태에서, 도입 혼합물 내의 각각의 유형의 뉴클레오티드가 표지된다. 일부 그러한 실시 형태에서, 제1 유형의 뉴클레오티드는 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능한 제1 검출가능한 표지로 표지된다. 일부 추가의 실시 형태에서, 제2 유형의 뉴클레오티드는 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 제2 검출가능한 표지로 표지되고, 제2 유형의 검출가능한 표지는 제1 유형의 검출가능한 표지로부터 스펙트럼적으로 구별가능하다. 일부 추가의 실시 형태에서, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지 둘 모두로 표지되고, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 둘 모두에 의해 여기가능하다. 일부 다른 실시 형태에서, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제3 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드와 제4 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드의 혼합물을 포함하고, 제3 표지는 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능하고, 제4 표지는 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능하다. 추가의 실시 형태에서, 제4 유형의 뉴클레오티드는 표지되거나, 제1 또는 제2 이미징 이벤트 하에서 어떠한 방출도 갖지 않는 형광 모이어티로 표지된다. 일부 예에서, 제4 유형의 뉴클레오티드는 G 염기(예를 들어, dGTP)를 함유한다.
뉴클레오티드의 유형이 2개의 상이한 표지로 표지된 것으로 기술되는 경우, 이는 하기 2개의 시나리오를 포함한다. 제1 시나리오에서, 뉴클레오티드는 제1 표지로 표지된 뉴클레오티드와 제2 표지로 표지된 동일한 유형의 뉴클레오티드의 혼합물이다. 제2 시나리오에서, 뉴클레오티드는 이에 공유적으로 부착된 제1 표지 및 제2 표지 둘 모두(즉, 동일한 분자 상의 2개의 표지)를 갖는다. 추가적으로, 제1 및 제2 표지로 표지된 것으로 기술된 뉴클레오티드의 유형은 또한 제1 표지 및 제2 표지와는 상이한 하나 이상의 추가적인 검출가능한 표지를 포함할 수 있다.
제1 예로서, 제1 유형의 뉴클레오티드는 제1 염료로 표지될 수 있는데, 제1 염료는 약 450 내지 460 nm의 청색 광원에 의해 여기가능하고(즉, 제1 염료는 청색 염료임) 480 내지 525 nm 범위의 방출 파장을 갖는다. 제2 유형의 뉴클레오티드는 제2 염료로 표지될 수 있는데, 제2 염료는 약 400 내지 405 nm의 자색 광원에 의해 여기되고(즉, 제2 염료는 자색 염료임) 415 내지 450 nm 범위의 방출 파장을 갖는다. 제3 유형의 뉴클레오티드는 제1 염료로 표지된 제3 뉴클레오티드와 제2 염료로 표지된 제3 뉴클레오티드의 혼합물일 수 있다. 제4 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않는다. 제1 이미징 이벤트는 약 450 내지 460 nm의 파장을 갖는 청색 광원을 사용하고, 제1 유형 및 제3 유형의 뉴클레오티드 둘 모두는 480 내지 525 nm를 포괄하는 필터 대역을 갖는 방출 필터에 의해 검출되거나 수집될 수 있는 신호를 방출할 것이다. 제2 이미징 이벤트는 약 400 내지 405 nm의 파장을 갖는 자색 광원을 사용하고, 제2 유형 및 제3 유형의 뉴클레오티드 둘 모두는 415 내지 450 nm를 포괄하는 필터 대역을 갖는 방출 필터에 의해 검출되거나 수집될 수 있는 신호를 방출할 것이다. 제4 유형의 뉴클레오티드가 표지되지 않기 때문에, 제1 또는 제2 이미징 이벤트 하에서 신호가 검출되지 않을 것이다. 본 명세서에 기재된 신호 검출 패턴에 기초하여, 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체 내의 도입된 뉴클레오티드의 정체(identity)가 결정될 수 있다. 추가의 실시 형태에서, 도입 혼합물은 하기를 포함한다: 청색 염료 A로 표지된 dATP, 자색 염료 B로 표지된 dTTP, 청색 염료 A로 표지된 dCTP, 자색 염료 B로 표지된 dCTP, 및 표지되지 않은 dGTP(암색 G). 일 실시 형태에서, 청색 염료로 표지된 dATP는 하기 구조를 가질 수 있다:
.
이러한 A 뉴클레오티드 염료 접합체는 또한, 완전 작용화된 A 뉴클레오티드(ffA)로 지칭된다.
제2 예로서, 제1 유형의 표지된 뉴클레오티드, 제2 유형의 표지된 뉴클레오티드 및 제4 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드는 제1 예에 설명된 것과 동일하다. 제3 유형의 뉴클레오티드는 제3 염료 및 제4 염료 둘 모두(예를 들어, 제3 염료로 표지된 제3 유형 뉴클레오티드와 제4 염료로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드의 혼합물)로 표지될 수 있다. 제3 염료는 제1 염료와 유사한 형광 프로파일(즉, 흡수 및 방출 스펙트럼)을 갖지만, 방출 강도의 관점에서 상이할 수 있다. 제4 염료는 제2 염료와 유사한 형광 프로파일(즉, 흡수 및 방출 스펙트럼)을 갖지만, 방출 강도의 관점에서 상이할 수 있다. 추가의 실시 형태에서, 도입 혼합물은 하기를 포함한다: 청색 염료 A로 표지된 dATP, 자색 염료 B로 표지된 dTTP, 청색 염료 C로 표지된 dCTP, 자색 염료 D로 표지된 dCTP, 및 표지되지 않은 dGTP(암색 G).
자색 염료
약 350 내지 405 nm의 파장을 갖는 자색 광원에 의해 여기가능한 형광 염료는 본 명세서에 기재된 제1 또는 제2 검출가능한 표지로서 사용될 수 있다. 추가의 실시 형태에서, 특히 유용한 자색 염료는 410 내지 460 nm 또는 415 내지 450 nm 범위의 방출 스펙트럼을 가질 수 있다. 자색 염료의 비제한적인 예는 하기를 포함한다:
(Actinomycin D), BD Horizon™ V450, 및 BD Horizon™ V500.
청색 염료
약 450 내지 460 nm의 파장을 갖는 청색 광원에 의해 여기가능한 형광 염료는 본 명세서에 기재된 제1 또는 제2 검출가능한 표지로서 사용될 수 있다. 추가의 실시 형태에서, 특히 유용한 청색 염료는 475 내지 530 nm 또는 480 내지 525 nm 범위의 방출 스펙트럼을 가질 수 있다. 청색 염료의 비제한적인 예는 미국 특허 출원 공개 제2018/0094140 A1호, 제2018/0201981 A1호, 제2020/0277529 A1호 및 제2020/0277670 A1호에 개시된 쿠마린 염료를 포함하며, 이들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 실시 형태에서, 비제한적인 예시적인 청색 염료는 하기를 포함한다:
, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 및 . 일 예에서, 서열분석 방법에 사용되는 청색 염료는 이다. 추가의 예시적인 염료 화합물은 미국 특허 출원 제17/385232호에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다.
산화방지제/라디칼 스캐빈저(Radical Scavenger)
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 청색 및 자색 여기에 의해 야기되는 광손상을 감소시키기 위해 하나 이상의 산화방지제/라디칼 스캐빈저를 포함하는 스캔 믹스(scan mix)를 이용한다. 특히, 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체는 제1 이미징 이벤트 및 제2 이미징 이벤트 동안 하나 이상의 산화방지제를 포함하는 완충 용액 중에 있다. 유용한 산화방지제는 사이클로옥타테트라엔(COT), 탁시폴린, 퀘르세틴, 알릴 티오우레아, 다이메틸 티오우레아, 실리비닌, 아스코르브산 또는 이의 염(예컨대, 아스코르브산나트륨), 폴리페놀 화합물(예컨대, 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산(Trolox), 갈산 및 이의 저급 알킬 에스테르, 이의 모노메틸 에테르, 및 이의 저급 알킬 에스테르와 모노메틸 에테르의 조합, 피로갈롤, 및 하이드로퀴논, 예컨대 t-부틸 하이드로퀴논(TBHQ), 2,4,5-트라이하이드록시부티로페논(THBP)), 및 이들의 선택적으로 치환된 유도체 및 조합을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 일부 추가의 실시 형태에서, 조성물은 사이클로옥타테트라엔 및 퀘르세틴, 및 이들의 선택적으로 치환된 유도체 및 조합을 포함한다.
대안적으로, 본 명세서에 기재된 청색/자색 염료는 또한 사이클로옥타테트라엔 광-보호 모이어티에 공유 결합될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 청색 또는 자색 염료에 공유 결합될 수 있는 COT 모이어티는 하기 구조를 포함할 수 있다: , 여기서 각각의 R1A 및 R2A는 독립적으로 H, 하이드록실, 할로겐, 아지도, 티올, 니트로, 시아노, 선택적으로 치환된 아미노, 카르복실, -C(O)OR5A, -C(O)NR6AR7A, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 C1-6 알콕시, 선택적으로 치환된 C1-6 할로알킬, 선택적으로 치환된 C1-6 할로알콕시, 선택적으로 치환된 C2-6 알케닐, 선택적으로 치환된 C2-6 알키닐, 선택적으로 치환된 C6-10 아릴, 선택적으로 치환된 C7-14 아르알킬, 선택적으로 치환된 C3-7 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이고;
X1 및 Y1은 각각 독립적으로 결합, -O-, -S-, -NR3A-, -C(=O)-, -C(=O)-O-, -C(=O)-NR4A-, -S(O)2-, -NR3A-C(=O)-NR4A, -NR3A-C(=S)-NR4A-, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬렌, 또는 적어도 하나의 탄소 원자가 O, S, 또는 N으로 대체되는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌이고;
Z는 부재하거나, 선택적으로 치환된 C2-6 알케닐렌, 또는 선택적으로 치환된 C2-6 알키닐렌이고;
각각의 R3A 및 R4A는 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 또는 선택적으로 치환된 C6-10 아릴이고;
R5A는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 C6-10 아릴, 선택적으로 치환된 C7-14 아르알킬, 선택적으로 치환된 C3-7 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 5원 내지 10원 헤테로아릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이고;
각각의 R6A 및 R7A는 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 C6-10 아릴, 선택적으로 치환된 C7-14 아르알킬, 선택적으로 치환된 C3-7 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 5원 내지 10원 헤테로아릴, 또는 선택적으로 치환된 3원 내지 10원 헤테로사이클릴이고;
에서 R1A 및 R2A가 부착되어 있는 탄소 원자는 O, S, 또는 N으로 선택적으로 대체되되, 단 상기 탄소 원자가 O 또는 S로 대체될 때, R1A 및 R2A는 둘 모두 부재하고; 상기 탄소 원자가 N으로 대체된 경우, R2A는 부재하고; m은 0 내지 10의 정수임. 일부 실시 형태에서, X 및 Y는 둘 모두 결합은 아니다.
일부 실시 형태에서, 사이클로옥타테트라엔 모이어티는 구조 , , , 또는 를 포함한다. 일부 그러한 실시 형태에서, R1A 및 R2A 중 적어도 하나는 수소이다. 일부 추가의 실시 형태에서, R1A 및 R2A 둘 모두는 수소이다. 일부 다른 실시 형태에서, R1A는 H이고, R2A는 선택적으로 치환된 아미노, 카르복실 또는 -C(O)NR6AR7A이다. 일부 실시 형태에서, m은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고, 각각의 R1A 및 R2A는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 아미노, 카르복실, -C(O)NR6AR7A, 또는 이들의 조합이다. 일부 추가의 실시 형태에서, m이 2, 3, 4, 5, 또는 6인 경우, 하나의 R1A는 아미노, 카르복실, 또는 -C(O)NR6AR7A이고, 나머지 R1A 및 R2A는 수소이다. 일부 실시 형태에서, 에서 R1A및 R2A가 부착되어 있는 적어도 하나의 탄소 원자는 O, S, 또는 N으로 대체된다. 일부 그러한 실시 형태에서, 에서 하나의 탄소 원자는 산소 원자로 대체되고, 상기 대체된 탄소 원자에 부착된 R1A 및 R2A 둘 모두는 부재한다. 일부 다른 실시 형태에서, 에서의 하나의 탄소 원자가 질소 원자로 대체될 때, 상기 대체된 탄소 원자에 부착된 R2A가 부재하고, 상기 대체된 탄소 원자에 부착된 R1A는 수소 또는 C1-6 알킬이다. R1A 및 R2A의 임의의 실시 형태에서, R1A 또는 R2A가 -C(O)NR6AR7A인 경우, R6A 및 R7A는 독립적으로 H, C1-6 알킬 또는 치환된 C1-6 알킬(예를 들어, -CO2H, -NH2, -SO3H, 또는 -SO3 -로 치환된 C1-6 알킬)일 수 있다.
일부 추가의 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 형광 염료는 하기 구조의 사이클로옥타테트라엔 모이어티를 포함한다:
, , , , , , , 또는 . 본 명세서에 기재된 COT 모이어티는 본 명세서에 기재된 형광 염료의 작용기(예를 들어, 카르복실 기)와 COT 유도체의 아미노 기 사이의 반응에 기인하여 아미드 결합을 형성할 수 있다(여기서 아미드 결합의 카르보닐 기는 도시되어 있지 않음). SBS 화학에서 사용된 COT 관련 산화방지제에 대한 추가 개시내용은 미국 특허 출원 공개 제2021/0155983 A1호에서 찾을 수 있으며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
친화성 시약과 조합한 도입 혼합물 내의 표지되지 않은 뉴클레오티드
상기 기재된 실시 형태에 대한 대안으로서, 본 명세서에 기재된 서열분석 방법의 제2 태양은 청색/자색 여기에 의해 야기되는 염료의 DNA 손상 및 광표백을 감소시키기 위해 이용될 수 있는 2차 표지화 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 2차 표지화는, 표지되지 않은 뉴클레오티드가 프라이머 폴리뉴클레오티드에 먼저 도입된 다음, 도입된 표지되지 않은 뉴클레오티드가 도입된 뉴클레오티드의 유형에 특이적인 친화성 시약에 결합하고, 친화성 시약이 청색 또는 자색 광에 의해 여기될 수 있고 방출 검출 채널에 의해 검출될 수 있는 신호를 방출할 수 있는 하나 이상의 검출가능한 표지를 함유하는, 표준 서열분석 방법에 대한 변형을 지칭한다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 친화성 시약의 크기는 ROS로부터 DNA를 차폐시킬 수 있고, 따라서 청색/자색 광에 의해 야기되는 광손상을 감소시키거나 완화시킬 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시 형태에서, 제1 유형, 제2 유형 및 제3 유형의 뉴클레오티드 중 하나 이상은 표지되지 않을 수 있다. 일 실시 형태에서, 도입 혼합물 내의 제1 유형, 제2 유형 및 제3 유형 각각의 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 본 방법은 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체를 제1 이미징 이벤트 전에 친화성 시약의 세트와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 세트 내의 적어도 하나의 친화성 시약은 도입된 제1 유형, 제2 유형, 또는 제3 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합한다. 일부 그러한 실시 형태에서, 친화성 시약의 세트는 제1 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1 친화성 시약, 제2 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2 친화성 시약을 포함한다. 일부 추가의 실시 형태에서, 제1 친화성 시약은 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 제2 친화성 시약은 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하고, 제1 검출가능한 표지는 제2 검출가능한 표지로부터 스펙트럼적으로 구별가능하다. 일부 그러한 실시 형태에서, 제1 친화성 시약 및 제2 친화성 시약 둘 모두는 제3 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합한다. 다른 실시 형태에서, 친화성 시약의 세트는 제3 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제3 친화성 시약을 추가로 포함하고, 제3 친화성 시약은 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제3 검출가능한 표지, 및 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제4 검출가능한 표지를 포함한다. 제3 염료는 제1 염료와 유사한 형광 프로파일(즉, 흡수 및 방출 스펙트럼)을 갖지만, 방출 강도의 관점에서 상이할 수 있다. 제4 염료는 제2 염료와 유사한 형광 프로파일(즉, 흡수 및 방출 스펙트럼)을 갖지만, 방출 강도의 관점에서 상이할 수 있다.
검출가능한 표지(들)를 함유하는 친화성 시약이 도입된 뉴클레오티드에 결합할 때, 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체는 제1 및/또는 제2 이미징 이벤트에서 검출될 수 있는 표지된 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체가 된다. 본 명세서에 기재된 자색 염료 및 청색 염료는 본 명세서에 기재된 변형된 방법의 임의의 실시 형태에서 사용될 수 있다. 추가적으로, 표지된 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체는 본 명세서에 기재된 산화방지제 및 ROS 스캐빈저 중 하나 이상을 포함하는 스캔 혼합물에 존재할 수 있다. 친화성 시약(들) 내의 검출가능한 표지는 또한 본 명세서에 기재된 공유 결합된 광-보호 모이어티를 함유할 수 있다.
친화성 시약
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "친화성 시약"은 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체 내의 도입된 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 거대분자, 예컨대 단백질 또는 항체를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 친화성 시약은 단백질 태그, 항체(항체의 결합 단편, 단일 사슬 항체, 이중특이적 항체 등 포함하지만 이에 제한되지 않음), 압타머, 노틴, 아피머, 또는 적합한 특이성 및 친화성으로 도입된 뉴클레오티드를 결합시키는 임의의 다른 공지된 제제를 포함한다. 본 명세서에 기재된 각각의 친화성 시약은 다른 유형의 뉴클레오티드보다 특정 유형의 뉴클레오티드에 대해 실질적으로 더 높은 친화성을 가질 수 있다. 또한, 친화성 시약은, DNA 사슬 상의 다른 곳에 있는 뉴클레오티드가 아닌, 성장하는 DNA 사슬의 3' 말단에서의 도입된 뉴클레오티드(즉, 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드)에 결합하여야 한다. 본 명세서에 기재된 친화성 시약은 본 명세서에 기재된 청색 염료 및 자색 염료와 같은 하나 이상의 검출가능한 표지로 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 검출가능한 표지는 절단가능한 링커를 통해 친화성 시약에 공유적으로 부착된다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시 형태에서, 제1 유형의 뉴클레오티드는 제1 합텐을 포함하고, 제1 친화성 시약은 제1 합텐에 특이적으로 결합하는 제1 합텐-결합 파트너를 포함한다. 일부 그러한 실시 형태에서, 제2 유형의 뉴클레오티드는 제2 합텐을 포함하고, 제2 친화성 시약은 제2 합텐에 특이적으로 결합하는 제2 합텐-결합 파트너를 포함한다. 제1 합텐 및 제2 합텐 각각은 비오틴, 디곡시게닌, 다이니트로페놀 또는 클로로알킬 기를 포함하거나, 이들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 친화성 시약 각각은 하나 이상의 형광 모이어티와 접합된 항-햅텐 항체일 수 있는 특이적 합텐-결합 파트너를 포함한다. 일부 추가의 실시 형태에서, 제1 합텐은 비오틴 모이어티를 포함하고, 제1 합텐-결합 파트너는 스트렙타비딘을 포함하며, 스트렙타비딘은 하나 이상의 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 추가의 실시 형태에서, 제2 합텐은 클로로알킬 기를 포함하고, 제2 합텐-결합 파트너는 HaloTag®를 포함하며, HaloTag®는 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 제1 또는 제2 검출가능한 표지는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 절단가능한 링커를 통해 친화성 시약(예를 들어, 합텐-결합 파트너)에 접합될 수 있다. 일부 그러한 실시 형태에서, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제1 합텐 및 제2 합텐 둘 모두를 포함하여(예를 들어, 제1 합텐을 포함하는 제3 유형의 뉴클레오티드와 제2 합텐을 포함하는 제3 유형의 뉴클레오티드의 혼합물), 제1 친화성 시약 및 제2 친화성 시약 둘 모두가 제3 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합할 수 있게 한다.
다른 실시 형태에서, 친화성 시약 세트가 제3 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제3 친화성 시약을 추가로 포함하는 경우, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제3 합텐을 포함할 수 있고, 제3 친화성 시약은 제3 합텐-결합 파트너를 포함한다. 제3 친화성 시약은 제3 합텐-결합 파트너 및 하나 이상의 제3 검출가능한 표지를 포함하는 제3 친화성 시약과, 제3 합텐-결합 파트너 및 하나 이상의 제4 검출가능한 표지를 포함하는 제3 친화성 시약의 혼합물일 수 있다.
예를 들어, 제1 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드가 비오틴 모이어티를 포함하는 제1 합텐을 함유할 수 있는 반면, 제1 친화성 시약은 약 450 내지 460 nm의 청색 광원에 의해 여기가능하고(즉, 제1 염료는 청색 염료임) 480 내지 525 nm 범위의 방출 파장을 갖는 청색 염료인 하나 이상의 제1 검출가능한 표지와 접합된 스트렙타비딘을 포함할 수 있다, 제2 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드가 클로로알킬 기(예를 들어, -(CH2)6Cl)를 포함하는 제2 합텐을 함유할 수 있는 반면, 제2 친화성 시약은 약 400 내지 405 nm의 자색 광원에 의해 여기가능하고 415 내지 450 nm 범위의 방출 파장을 갖는 자색 염료인 하나 이상의 제2 검출가능한 표지와 접합된 HaloTag®를 포함할 수 있다. 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드는 제1 친화성 시약 및 제2 친화성 시약 둘 모두에 결합하는 제1 합텐 및 제2 합텐 둘 모두를 함유할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제4 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 어떠한 친화성 시약에도 결합하지 않는다. 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 뉴클레오티드 복합체를 친화성 시약의 세트와 접촉시킨 후, 결합되지 않은 친화성 시약은 세척된다. 제1 이미징 이벤트는 약 450 내지 460 nm의 파장을 갖는 청색 광원을 사용하고, 제1 유형 및 제3 유형의 뉴클레오티드 둘 모두는 480 내지 525 nm를 포괄하는 필터 대역을 갖는 방출 필터에 의해 검출되거나 수집될 수 있는 신호를 방출할 것이다. 제2 이미징 이벤트는 약 400 내지 405 nm의 파장을 갖는 자색 광원을 사용하고, (친화성 시약과 접합된 검출가능한 표지를 통해) 제2 유형 및 제3 유형의 뉴클레오티드 둘 모두는 415 내지 450 nm를 포괄하는 필터 대역을 갖는 방출 필터에 의해 검출되거나 수집될 수 있는 신호를 방출할 것이다. 제4 유형의 뉴클레오티드에 대한 제1 또는 제2 이미징 이벤트 하에서 신호는 검출되지 않을 것이다. 본 명세서에 기재된 신호 검출 패턴에 기초하여, 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드 내의 도입된 뉴클레오티드의 정체가 결정될 수 있다. 추가의 실시 형태에서, 도입 혼합물은 하기를 포함한다: 클로로알킬 기를 포함하는 dATP, 비오틴 모이어티를 포함하는 dTTP, 비오틴 모이어티를 포함하는 dCTP, 클로로알킬 기를 포함하는 dCTP, 및 표지되지 않은 dGTP(암색 G). 예시적인, 비오틴 모이어티를 포함하는 ffC 및 클로로알킬 기를 포함하는 ffA는 하기를 포함한다:
, 여기서 n은 1, 2 또는 3임.
본 명세서에 기재된 서열분석 방법의 제3 태양은 또한 친화성 시약(들)을 이용하는 2차 표지화의 사용을 수반하지만, 제1 유형, 제2 유형, 또는 제3 유형의 뉴클레오티드 중 하나만이 표지되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 제1 유형의 뉴클레오티드는 제1 검출가능한 표지로 표지되고, 제2 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제1 검출가능한 표지로 표지되고 표지되지 않은 둘 모두이고, 제1 검출가능한 표지는 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능하다. 본 방법은 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드를 제1 이미징 이벤트 전에 친화성 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 친화성 시약은 제2 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드 및/또는 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합한다. 일부 그러한 실시 형태에서, 친화성 시약은 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 추가의 실시 형태에서, 친화성 시약은 하나 이상의 제2 검출가능한 표지에 접합된 스트렙타비딘을 포함하고, 제2 유형의 뉴클레오티드 및 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드 둘 모두는 비오틴 모이어티를 포함한다. 일부 다른 실시 형태에서, 제1 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 제2 유형의 뉴클레오티드는 제2 검출가능한 표지로 표지되고, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제2 검출가능한 표지로 표지되고 표지되지 않은 둘 모두이고, 제2 검출가능한 표지는 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능하다. 본 방법은 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드를 제1 이미징 이벤트 전에 친화성 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 친화성 시약은 제1 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드 및/또는 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합한다. 일부 그러한 실시 형태에서, 친화성 시약은 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 추가의 실시 형태에서, 친화성 시약은 하나 이상의 제1 검출가능한 표지에 접합된 스트렙타비딘을 포함하고, 제1 유형의 뉴클레오티드 및 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드 둘 모두는 비오틴 모이어티를 포함한다. 임의의 그러한 실시 형태에서, 제4 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 친화성 시약과 결합하지 않거나 또는 제1 이미징 이벤트 및 제2 이미징 이벤트 동안 어떠한 신호도 방출하지 않는다.
다른 예로서, 제1 유형의 뉴클레오티드는 청색 염료로 표지되는데, 청색 염료는 약 450 내지 460 nm의 청색 광원에 의해 여기가능하고 480 내지 525 nm 범위의 방출 파장을 갖는다. 제2 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 비오틴 모이어티를 포함한다. 친화성 시약은, 약 400 내지 405 nm의 자색 광원에 의해 여기가능하고 415 내지 450 nm 범위의 방출 파장을 갖는 하나 이상의 자색 염료와 접합된 스트렙타비딘을 포함한다. 제3 유형의 뉴클레오티드는 비오틴 모이어티를 포함하는 표지되지 않은 제3 유형의 뉴클레오티드와, 제1 유형의 뉴클레오티드와 동일한 청색 염료로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드의 혼합물이다. 제4 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않고 임의의 친화성 시약과 결합하지 않거나 제1/제2 이미징 이벤트 하에서 어떠한 신호도 방출하지 않는다. 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 뉴클레오티드 복합체를 친화성 시약과 접촉시킨 후, 결합되지 않은 친화성 시약은 세척된다. 제1 이미징 이벤트는 약 450 내지 460 nm의 파장을 갖는 청색 광원을 사용하고, 제1 유형 및 제3 유형의 뉴클레오티드 둘 모두는 480 내지 525 nm를 포괄하는 필터 대역을 갖는 방출 필터에 의해 검출되거나 수집될 수 있는 신호를 방출할 것이다. 제2 이미징 이벤트는 약 400 내지 405 nm의 파장을 갖는 자색 광원을 사용하고, (스트렙타비딘에 부착된 자색 염료를 통해) 제2 유형 및 제3 유형의 뉴클레오티드 둘 모두는 415 내지 450 nm를 포괄하는 필터 대역을 갖는 방출 필터에 의해 검출되거나 수집될 수 있는 신호를 방출할 것이다. 제4 유형의 뉴클레오티드에 대한 제1 또는 제2 이미징 이벤트 하에서 신호는 검출되지 않을 것이다. 본 명세서에 기재된 신호 검출 패턴에 기초하여, 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드 내의 도입된 뉴클레오티드의 정체가 결정될 수 있다. 추가의 실시 형태에서, 도입 혼합물은 하기를 포함한다: 청색 염료로 표지된 dATP, 비오틴 모이어티를 포함하는 dTTP, 비오틴 모이어티를 포함하는 dCTP, 청색 염료로 표지된 dCTP, 및 표지되지 않은 dGTP(암색 G).
본 명세서에 기재된 서열분석 방법의 제3 태양의 대안적인 실시 형태에서, 제1 유형의 뉴클레오티드는 제1 검출가능한 표지로 표지되고, 제2 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제3 검출가능한 표지로 표지되고 표지되지 않은 둘 모두이고, 제1 및 제3 검출가능한 표지 둘 모두는 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능하다(예를 들어, 제3 표지는 제1 표지와 유사한 형광 프로파일을 갖지만 방출 강도가 상이할 수 있다). 본 방법은 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드를 제1 이미징 이벤트 전에 친화성 시약의 세트와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 적어도 하나의 친화성 시약은 제2 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, 적어도 하나의 친화성 시약은 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합한다. 일부 그러한 실시 형태에서, 제2 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 친화성 시약은 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 제3 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 친화성 시약은, 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제4 검출가능한 표지를 포함한다(예를 들어, 제4 표지는 제2 표지와 유사한 형광 프로파일을 갖지만 방출 강도가 상이할 수 있다). 일부 추가의 실시 형태에서, 친화성 시약 세트는 하나 이상의 제2 검출가능한 표지에 접합된 스트렙타비딘, 및 하나 이상의 제4 검출가능한 표지에 접합된 제2 항체/단백질을 포함할 수 있다. 제2 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드는 비오틴 모이어티를 포함하고, 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드는 제4 표지에 접합된 제2 항체/단백질에 특이적인 합텐을 포함한다.
본 명세서에 기재된 서열분석 방법의 제3 태양에 대한 다른 대안적인 실시 형태는 도입 혼합물의 사용을 수반하는데, 제1 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 제2 유형의 뉴클레오티드는 제2 검출가능한 표지로 표지되고, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제4 검출가능한 표지로 표지되고 표지되지 않은 둘 모두이고, 제2 및 제4 검출가능한 표지 둘 모두는 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능하다(예를 들어, 제3 표지는 제1 표지와 유사한 형광 프로파일을 갖지만 방출 강도가 상이할 수 있다). 본 방법은 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드를 제1 이미징 이벤트 전에 친화성 시약의 세트와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 적어도 하나의 친화성 시약은 제1 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, 적어도 하나의 친화성 시약은 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합한다. 일부 그러한 실시 형태에서, 제1 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 친화성 시약은 하나 이상의 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 제3 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 친화성 시약은 하나 이상의 제3 검출가능한 표지를 포함한다. 제1 및 제3 검출가능한 표지 둘 모두는 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능하다(예를 들어, 제3 표지는 제1 표지와 유사한 형광 프로파일을 갖지만 방출 강도가 상이할 수 있다).
본 명세서에 기재된 방법의 임의의 실시 형태에서, 단계 (a)에서의 혼합물 내의 뉴클레오티드는 4개의 상이한 유형의 뉴클레오티드(A, C, G, 및 T 또는 U), 또는 이의 비-천연 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 추가의 실시 형태에서, 4개의 상이한 유형의 뉴클레오티드는 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 또는 dUTP, 또는 이의 비-천연 뉴클레오티드 유사체이다. 일부 추가의 실시 형태에서, 4개 중 3개 유형의 뉴클레오티드는 각각 검출가능한 표지로 표지되고, 하나의 유형의 뉴클레오티드는 형광단으로 표지되지 않거나, 형광단으로 표지되지만 여기될 수 없고 제1 이미징 또는 제2 이미징 이벤트에서 신호를 방출한다. 다른 실시 형태에서, 4개 중 1개, 2개 또는 3개 유형의 뉴클레오티드에서 검출가능한 표지는 본 명세서에 기재된 2차 표지화 단계를 사용하여 부가되며, 여기서 표지되지 않은 뉴클레오티드는 먼저 프라이머 폴리뉴클레오티드로 도입되고, 이어서 뉴클레오티드 도입의 유형에 특이적인 친화성 시약이 프라이머 폴리뉴클레오티드에 도입되고, 친화성 시약은 제1 및/또는 제2 이미징 이벤트 동안 신호(들)를 방출할 수 있는 하나 이상의 검출가능한 표지를 함유한다. 추가의 실시 형태에서, 도입 혼합물 내의 4개 유형의 뉴클레오티드 각각은 3' 하이드록실 블록킹 기를 함유한다. 그러한 3' 하이드록실 블록킹 기는 단일 염기만이 프라이머 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 폴리머라제에 의해 부가될 수 있다는 것을 보장한다. 단계 (b)에서 뉴클레오티드의 도입 후, 나머지 도입되지 않은 뉴클레오티드는 세척된다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시 형태에서, 본 방법은 (e) 제2 이미징 이벤트 후, 그리고 다음 서열분석 사이클 전에 도입된 뉴클레오티드로부터 3' 하이드록실 블록킹 기를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 실시 형태에서, 도입된 뉴클레오티드에 (도입된 뉴클레오티드에 절단가능한 링커를 통해 직접적으로 또는 친화성 시약을 통해 간접적으로) 부착된 임의의 검출가능한 표지는 또한 다음 서열분석 사이클 전에 제거된다. 일부 그러한 실시 형태에서, 검출가능한 표지 및 3' 하이드록시 블록킹 기는 (예를 들어, 동일한 화학적 반응 조건 하에서) 단일 단계에서 제거된다. 다른 실시 형태에서, 표지 및 3' 하이드록시 블록킹 기는 2개의 별개의 단계에서 제거된다(예를 들어, 표지 및 3' 블록킹 기는 2개의 별개의 화학 반응 조건 하에서 제거된다). 일부 추가의 실시 형태에서, 절단 후 세척 단계가 표지 및 3' 블록킹 기가 제거된 후에 사용된다. 추가의 실시 형태에서, 단계 (a) 내지 단계 (e)는 (예를 들어, 적어도 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400 또는 500회의) 반복 사이클로 수행되고, 본 방법은 각각의 순차적으로 도입된 뉴클레오티드의 정체에 기초하여 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부의 서열을 순차적으로 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 그러한 실시 형태에서, 단계 (a) 내지 단계 (e)는 적어도 50 사이클로 반복된다. 일부 추가의 실시 형태에서, 도입 혼합물로부터의 뉴클레오티드의 도입은 폴리머라제(예를 들어, DNA 폴리머라제)에 의해 수행된다. 예시적인 폴리머라제는 Pol 812, Pol 1901, Pol 1558 또는 Pol 963을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. Pol 812, Pol 1901, Pol 1558 또는 Pol 963 DNA 폴리머라제의 아미노산 서열은, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2020/0131484 A1호 및 제2020/0181587 A1호에 기재되어 있으며, 이들 둘 모두는 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시 형태에서, 제1 이미징 이벤트에 사용되는 제1 여기 광원 및 제2 이미징 이벤트에 사용되는 제2 여기 광원 각각은 레이저, 발광 다이오드(LED), 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 제1 이미징 이벤트 및 제2 이미징 이벤트로부터의 방출 검출의 조합은 이미지 분석 소프트웨어에 의해 처리되어 각각의 고정화된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체 위치에 도입된 염기의 정체를 결정한다. 일부 그러한 실시 형태에서, 이미지 분석은 도입의 반복된 사이클 후에 (적어도 50, 100, 150, 200, 250 또는 300 실행 후에) 처리된다.
본 명세서에 기재된 방법의 임의의 실시 형태에서, 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 일부 그러한 실시 형태에서, 고체 지지체는 복수의 고정화된 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 프라이머 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적이다. 일부 그러한 실시 형태에서, 프라이머 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부에 혼성화되어 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체를 형성한다. 고체 지지체는 클러스터링된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 고체 지지체는 플로우셀, 예를 들어, 각각이 서로 분리된 복수의 나노웰을 포함하는 패턴화된 플로우셀을 포함한다. 일부 추가의 실시 형태에서, 각각의 나노웰은 그 안에 하나의 고정화된 클러스터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 패턴화된 플로우 셀 상의 나노웰의 밀도는 약 100 K/㎟ 내지 약 500 K/㎟, 약 200 K/㎟ 내지 약 400 K/㎟, 또는 약 250 K/㎟ 내지 약 350 K/㎟이다. 일부 실시 형태에서, 고체 지지체 상의 고정화된 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드(또는 프라이머 폴리뉴클레오티드와의 혼성화로부터 형성된 클러스터)의 밀도는 약 80 K/㎟ 내지 약 400 K/㎟, 약 100 K/㎟ 내지 약 300 K/㎟, 또는 약 150 K/㎟ 내지 약 250 K/㎟이다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 서열분석 방법은 유사하거나 비견되는 광학 해상도로 적색/녹색 또는 녹색/청색 여기를 사용하는 2채널 서열분석 방법과 비교하여 클러스터 밀도의 최대 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 증가를 허용한다.
본 방법의 추가의 예시적인 실시 형태가 하기에 기재된다.
특정 실시 형태에서, 합성 단계가 수행되며, 선택적으로 주형 또는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥을 본 발명의 형광 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 폴리머라제는 또한, 주형 또는 표적 폴리뉴클레오티드 가닥에 어닐링된 폴리뉴클레오티드 가닥 상의 유리 3' OH 기와 표지된 뉴클레오티드 상의 5' 포스페이트 기 사이의 포스포다이에스테르 결합의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 제공될 수 있다. 따라서, 합성 단계는 주형/표적 가닥에 대한 뉴클레오티드의 상보적 염기쌍 형성에 의해 유도된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 가닥의 형성을 포함할 수 있다.
본 방법의 모든 실시 형태에서, 검출 단계는 표지된 뉴클레오티드가 도입된 폴리뉴클레오티드 가닥이 표적 가닥에 어닐링되는 동안에, 또는 2개의 가닥이 분리되는 변성 단계 후에 수행될 수 있다. 추가의 단계, 예를 들어 화학적 또는 효소적 반응 단계 또는 정제 단계가 합성 단계와 검출 단계 사이에 포함될 수 있다. 특히, 표지된 뉴클레오티드(들)를 도입시킨 폴리뉴클레오티드 가닥은 단리되거나 정제되고, 이어서 추가로 처리되거나 후속 분석에 사용될 수 있다. 예로서, 후속으로, 합성 단계에서의 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지된 뉴클레오티드(들)를 도입시킨 폴리뉴클레오티드 가닥은 표지된 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 합성 단계의 산물은 추가의 반응 단계를 거칠 수 있으며, 필요하다면, 이들 후속 단계의 산물은 정제되거나 단리될 수 있다.
합성 단계에 적합한 조건은 표준 분자 생물학 기법에 익숙한 자들에게 잘 알려져 있을 것이다. 일 실시 형태에서, 합성 단계는, 적합한 폴리머라제 효소의 존재 하에서 표적 가닥에 상보적인 신장된 폴리뉴클레오티드 가닥(프라이머 폴리뉴클레오티드 가닥)을 형성하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지된 뉴클레오티드를 포함한 뉴클레오티드 전구체를 사용하는 표준 프라이머 신장 반응과 유사할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 합성 단계는 그 자체로서, 프라이머 표적 폴리뉴클레오티드 가닥의 카피로부터 유도되는 어닐링된 상보적 가닥들로 구성된 표지된 이중-가닥 증폭 산물을 생성하는 증폭 반응의 일부를 형성할 수 있다. 다른 예시적인 합성 단계는 닉 번역, 가닥 치환 중합, 랜덤 프라이밍된 DNA 표지화 등을 포함한다. 합성 단계에 특히 유용한 폴리머라제 효소는 본 명세서에 제시된 바와 같은 표지된 뉴클레오티드의 도입을 촉매할 수 있는 것이다. 다양한 천연 발생 또는 돌연변이/변형된 폴리머라제가 사용될 수 있다. 예로서, 열안정성 폴리머라제가 열사이클링 조건을 사용하여 수행되는 합성 반응에는 사용될 수 있는 반면, 열안정성 폴리머라제는 등온 프라이머 신장 반응에 있어서는 요구되지 않을 수 있다. 본 발명에 따른 표지된 뉴클레오티드를 도입시킬 수 있는 적합한 열안정성 폴리머라제는 국제 특허 출원 공개 WO 2005/024010호 또는 WO 06/120433호에 기재된 것들을 포함하고, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다. 37℃와 같은 더 낮은 온도에서 수행되는 합성 반응에서, 폴리머라제 효소는 반드시 열안정성 폴리머라제일 필요는 없으며, 이에 따라 폴리머라제의 선택은 반응 온도, pH, 가닥-치환 활성 등과 같은 다수의 인자에 좌우될 것이다.
구체적인 비제한적인 실시 형태에서, 본 발명은 핵산 서열분석 방법, 재서열분석 방법, 전체 게놈 서열분석 방법, 단일 뉴클레오티드 다형 점수화 방법, 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 때 본 명세서에 기재된 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 검출을 수반하는 임의의 다른 응용을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명은 합성에 의한 폴리뉴클레오티드 서열분석 반응에 있어서의 본 발명에 따른 염료 모이어티를 포함하는 표지된 뉴클레오티드의 사용을 제공한다. 합성에 의한 서열분석은 대체적으로, 서열분석하고자 하는 주형/표적 핵산에 상보적인 신장된 폴리뉴클레오티드 사슬을 형성하기 위하여 폴리머라제 또는 리가제를 사용하여 5'에서 3' 방향으로 성장하는 폴리뉴클레오티드 사슬에 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 순차적으로 부가하는 것을 수반한다. 부가된 뉴클레오티드(들) 중 하나 이상에 존재하는 염기의 정체는 검출 또는 "이미징" 단계에서 결정될 수 있다. 부가된 염기의 정체는 각각의 뉴클레오티드 도입 단계 후에 결정될 수 있다. 이어서, 주형의 서열은 통상적인 왓슨-크릭 염기쌍 형성 규칙을 사용하여 추론될 수 있다. 단일 염기의 정체의 결정을 위해 본 명세서에 기재된 염료로 표지된 뉴클레오티드의 사용은, 예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형의 점수화에 유용할 수 있으며, 그러한 단일 염기 신장 반응은 본 발명의 범주 내에 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열분석하고자 하는 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 신생(nascent) 가닥 내로의 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입을, 그러한 도입된 뉴클레오티드(들)에 부착된 형광 표지(들)의 검출을 통해 검출함으로써 결정된다. 표적 폴리뉴클레오티드의 서열분석은 적합한 프라이머를 사용하여 프라이밍될 수 있고(또는 헤어핀의 일부로서 프라이머를 함유할 헤어핀 작제물로서 제조될 수 있고), 신생 사슬은 폴리머라제-촉매 반응에서 프라이머의 3' 말단에 대한 뉴클레오티드의 부가에 의해 단계적으로 신장된다.
특정 실시 형태에서, 상이한 뉴클레오티드 트라이포스페이트들(A, T, G 및 C) 각각은 특유의 형광단으로 표지될 수 있으며, 또한 제어되지 않은 중합을 방지하기 위해 3' 위치에 블록킹 기를 포함한다. 대안적으로, 4개의 뉴클레오티드 중 하나는 비표지될 수 있다(암색). 폴리머라제 효소는 주형/표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 신생 사슬 내로 뉴클레오티드를 도입시키며, 블록킹 기는 뉴클레오티드의 추가 도입을 방지한다. 임의의 도입되지 않은 뉴클레오티드는 세척될 수 있고, 각각의 도입된 뉴클레오티드로부터의 형광 신호 패턴은 적합한 방출 필터 및 광 여기를 사용하는 전하 결합 장치와 같은 적합한 수단에 의해 광학적으로 "리드(read)" 될 수 있다. 이어서, 3'-블록킹 기 및 형광 염료 화합물을 (동시에 또는 순차적으로) 제거하여(절단하여) 추가의 뉴클레오티드 도입을 위해 신생 사슬을 노출시킬 수 있다. 전형적으로, 도입된 뉴클레오티드의 정체는 각각의 도입 단계 후에 결정되겠지만, 이는 엄격히 필수적인 것은 아니다. 유사하게, (본 명세서에 참고로 포함된) 미국 특허 제5,302,509호는 고체 지지체 상에 고정화된 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는 방법을 개시한다.
상기에 예시된 바와 같이, 이 방법은 DNA 폴리머라제의 존재 하에서, 고정화된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 성장 가닥 내로의 3'-블록킹된 뉴클레오티드 A, G, C, 및 T의 도입을 이용한다. 폴리머라제는 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기를 도입시키지만, 3'-하이드록실 블록킹 기에 의해 추가의 부가로부터 방지된다. 이어서, 도입된 뉴클레오티드의 표지를 결정할 수 있으며, 블록킹 기를 화학적 절단에 의해 제거하여 추가의 중합이 일어날 수 있게 할 수 있다. 합성에 의한 서열분석 반응에서 서열분석하고자 하는 핵산 주형은 서열분석이 요구되는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 서열분석 반응을 위한 핵산 주형은 전형적으로 서열분석 반응에서 추가의 뉴클레오티드의 부가를 위한 프라이머 또는 개시점으로서의 역할을 하는 유리 3' OH 기를 갖는 이중-가닥 영역을 포함할 것이다. 서열분석하고자 하는 주형의 영역은 상보적 가닥 상의 이러한 유리 3' OH 기를 오버행(overhang)할 것이다. 서열분석하고자 하는 주형의 오버행 영역은 단일-가닥일 수 있지만, 서열분석하고자 하는 표적 가닥에 상보적인 가닥 상에 "닉이 존재하여" 서열분석 반응의 개시를 위한 유리 3' OH 기를 제공한다면 이중-가닥일 수 있다. 그러한 실시 형태에서, 서열분석은 가닥 치환에 의해 진행될 수 있다. 소정 실시 형태에서, 유리 3' OH 기를 갖는 프라이머가 서열분석하고자 하는 주형의 단일-가닥 영역에 혼성화되는 별개의 성분(예를 들어, 짧은 올리고뉴클레오티드)으로서 첨가될 수 있다. 대안적으로, 프라이머 및 서열분석하고자 하는 주형 가닥은 각각, 예를 들어 헤어핀 루프 구조와 같은 분자내 이중체를 형성할 수 있는 부분적으로 자가-상보적인 핵산 가닥의 일부를 형성할 수 있다. 헤어핀 폴리뉴클레오티드 및 이들이 고체 지지체에 부착될 수 있는 방법이 국제 특허 출원 공개 WO 01/57248호 및 WO 2005/047301호에 개시되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다. 뉴클레오티드를 성장하는 프라이머에 연속적으로 첨가할 수 있으며, 그 결과 5'에서 3' 방향으로 폴리뉴클레오티드 사슬이 합성될 수 있다. 첨가된 염기의 성질은 각각의 뉴클레오티드 첨가 후에 - 특히 그러나 반드시 그러한 것은 아님 - 결정되며, 이로써 핵산 주형에 대한 서열 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 핵산 가닥(또는 폴리뉴클레오티드) 내로의 뉴클레오티드의 도입이, 뉴클레오티드의 5' 포스페이트 기와의 포스포다이에스테르 결합의 형성을 통해 핵산 가닥의 유리 3' OH 기에 뉴클레오티드를 연결함으로써 행해진다.
서열분석하고자 하는 핵산 주형은 DNA 또는 RNA, 또는 심지어 데옥시뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드로 구성된 하이브리드 분자일 수 있다. 핵산 주형은, 서열분석 반응에서 주형의 카피를 방해하지 않는 한, 천연 발생 및/또는 천연 비발생 뉴클레오티드 및 천연 또는 비천연 골격 결합을 포함할 수 있다.
소정의 실시 형태에서, 서열분석하고자 하는 표적 폴리뉴클레오티드는 당업계에 알려진 임의의 적합한 결합 방법을 통해, 예를 들어 공유 부착을 통해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체(예를 들어, 실리카-기반 지지체)에 직접 부착될 수 있다. 그러나, 본 발명의 다른 실시 형태에서, 고체 지지체의 표면은 표적 폴리뉴클레오티드의 직접 공유 부착을 가능하게 하거나, 그 자체가 고체 지지체에 비공유적으로 부착될 수 있는 하이드로겔 또는 다가전해질 다층을 통해 표적 폴리뉴클레오티드를 고정화하도록 하는 어떠한 방식으로 개질될 수 있다.
어레이에는 폴리뉴클레오티드가 지지체(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 00/06770호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 개시된 것과 같은 실리카-기반 지지체)에 직접 부착되어 있고, 여기서는 폴리뉴클레오티드가 유리 상의 펜던트 에폭사이드 기와 폴리뉴클레오티드 상의 내부 아미노 기 사이의 반응에 의해 유리 지지체 상에 고정화된다. 게다가, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO 2005/047301호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 황-기반 친핵체와 고체 지지체의 반응에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 고체-지지된 표적 폴리뉴클레오티드의 또 다른 추가의 예는 주형 폴리뉴클레오티드가 실리카-기반 또는 다른 고체 지지체 상에 지지된 하이드로겔에 부착되어 있는 경우로서, 이는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO 00/31148호, WO 01/01143호, WO 02/12566호, WO 03/014392호, WO 00/53812호, 및 미국 특허 제6,465,178호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
주형 폴리뉴클레오티드가 고정화될 수 있는 특정 표면은 폴리아크릴아미드 하이드로겔이다. 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 상기에 인용된 참고문헌에 및 국제 특허 출원 공개 WO 2005/065814호에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다. 사용될 수 있는 구체적인 하이드로겔은 국제 특허 출원 공개 WO 2005/065814호 및 미국 특허 출원 공개 제2014/0079923호에 기재된 것들을 포함한다. 일 실시 형태에서, 하이드로겔은 PAZAM(폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴아미드))이다.
DNA 주형 분자는, 예를 들어 미국 특허 제6,172,218호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 비드 또는 마이크로입자에 부착될 수 있다. 비드 또는 마이크로입자에 대한 부착은 서열분석 응용에 유용할 수 있다. 비드 라이브러리가 제조될 수 있으며, 여기서는 각각의 비드가 상이한 DNA 서열을 함유한다. 생성을 위한 방법 및 예시적인 라이브러리가 문헌[Nature, 437, 376-380 (2005); Science, 309, 5741, 1728-1732 (2005)]에 기재되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드를 사용하는 그러한 비드들의 어레이의 서열분석은 본 발명의 범주 내에 있다.
서열분석하고자 하는 주형(들)은 고체 지지체 상의 "어레이"의 일부를 형성할 수 있으며, 이 경우에 어레이는 임의의 편리한 형태를 취할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 단일-분자 어레이, 클러스터링된 어레이, 및 비드 어레이를 포함한 모든 유형의 고밀도 어레이에 적용가능하다. 본 발명의 염료 화합물로 표지된 뉴클레오티드는, 고체 지지체 상에서의 핵산 분자의 고정화에 의해 형성된 것들을 포함하지만 이로 한정되지 않는 본질적으로 임의의 유형의 어레이 상의 주형을 서열분석하는 데 사용될 수 있다.
그러나, 본 발명의 염료 화합물로 표지된 뉴클레오티드는 클러스터링된 어레이의 서열분석과 관련하여 특히 유리하다. 클러스터링된 어레이에서, 어레이 상의 별개의 영역(종종 부위 또는 특징부로 지칭됨)들은 다수의 폴리뉴클레오티드 주형 분자를 포함한다. 일반적으로, 이러한 다수의 폴리뉴클레오티드 분자는 광학적 수단에 의해 개별적으로 해상가능하지 않고 대신에 앙상블(ensemble)로서 검출된다. 어레이가 어떻게 형성되는지에 따라, 어레이 상의 각각의 부위는 하나의 개별 폴리뉴클레오티드 분자의 다수의 카피(예를 들어, 그 부위는 특정 단일- 또는 이중-가닥 핵산 종에 대해 균질함) 또는 심지어 소수의 상이한 폴리뉴클레오티드 분자들의 다수의 카피(예를 들어, 2개의 상이한 핵산 종의 다수의 카피)를 포함할 수 있다. 핵산 분자들의 클러스터링된 어레이는 당업계에서 일반적으로 알려진 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 예로서, 각각이 본 명세서에 참고로 포함되는 국제 특허 출원 공개 WO 98/44151호 및 WO 00/18957호는 핵산의 증폭 방법을 기재하는데, 여기서는 고정화된 핵산 분자들의 클러스터들 또는 "콜로니"들로 구성된 어레이를 형성하기 위하여, 주형 및 증폭 산물이 고체 지지체 상에 고정화된 채로 남아 있다. 이들 방법에 따라 제조된 클러스터링된 어레이 상에 존재하는 핵산 분자들은 본 발명의 염료 화합물로 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 서열분석하기에 적합한 주형이다.
본 발명의 염료 화합물로 표지된 뉴클레오티드는 또한 단일 분자 어레이 상의 주형의 서열분석에 유용하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단일 분자 어레이" 또는 "SMA"는 고체 지지체 위에 분포된(또는 배열된) 폴리뉴클레오티드 분자들의 집단을 지칭하며, 여기서 집단의 모든 다른 것들로부터 임의의 개별 폴리뉴클레오티드의 간격은 개별 폴리뉴클레오티드 분자들을 개별적으로 해상하는 것이 가능하도록 하는 것이다. 따라서, 고체 지지체의 표면 상에 고정화된 표적 핵산 분자는 일부 실시 형태에서 광학적 수단에 의해 해상될 수 있다. 이는, 각각의 신호가 하나의 폴리뉴클레오티드를 나타내는 하나 이상의 별개의 신호가, 사용되는 특정 이미징 장치의 해상가능한 영역 내에서 발생할 것임을 의미한다.
어레이 상의 인접한 폴리뉴클레오티드 분자들 사이의 간격이 적어도 100 nm, 더 특히 적어도 250 nm, 훨씬 더 특히 적어도 300 nm, 더욱 더 특히 적어도 350 nm인 단일 분자 검출이 달성될 수 있다. 따라서, 각각의 분자는 개별적으로 해상가능하고 단일 분자 형광점으로서 검출가능하고, 상기 단일 분자 형광점으로부터의 형광은 또한 단일 단계 광표백을 나타낸다.
용어 "개별적으로 해상된" 및 "개별 해상도"는, 시각화될 때, 어레이 상의 하나의 분자를 그의 이웃하는 분자와 구별하는 것이 가능함을 명시하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 어레이 상의 개별 분자들 사이의 분리는 개별 분자들을 해상하는 데 사용되는 특정 기법에 의해 부분적으로 결정될 것이다. 단일 분자 어레이의 일반적인 특징은 국제 특허 출원 공개 WO 00/06770호 및 WO 01/57248호를 참조함으로써 이해될 것이며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 발명의 표지된 뉴클레오티드의 한 가지 용도가 합성에 의한 서열분석 반응에 사용되는 것이지만, 그러한 뉴클레오티드의 유용성은 그러한 방법으로 제한되지 않는다. 실제로, 본 명세서에 기재된 표지된 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 내로 도입된 뉴클레오티드에 부착된 형광 표지의 검출을 필요로 하는 임의의 서열분석 방법에서 유리하게 사용될 수 있다.
키트
본 발명의 일부 태양은 본 명세서에 기재된 청색/자색 2-채널 서열분석 방법을 위한 키트에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 서열분석 응용을 위한 키트로서, 키트는
제1 검출가능한 표지로 표지된 제1 유형의 뉴클레오티드;
제2 검출가능한 표지로 표지된 제2 유형의 뉴클레오티드; 및
제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드를 포함하고;
제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 서로 스펙트럼적으로 구별가능하고, 제1 검출가능한 표지는 제1 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능하고, 제2 검출가능한 표지는 제2 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능하고;
제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 중 하나는 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 중 다른 하나는 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고;
제1 방출 필터 및 제2 방출 필터 중 하나는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖고, 제1 방출 필터 및 제2 방출 필터 중 다른 하나는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제1 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드와 제2 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드의 혼합물이다. 구체적인 예로서, 키트는 청색 염료로 표지된 dATP, 비오틴 모이어티를 포함하는 dTTP, 비오틴 모이어티를 포함하는 dCTP, 청색 염료로 표지된 dCTP, 및 표지되지 않은 dGTP(암색 G)를 포함할 수 있다.
서열분석 응용을 위한 키트의 제2 태양에서, 키트는
제1 검출가능한 표지로 표지된 제1 유형의 뉴클레오티드;
제2 검출가능한 표지로 표지된 제2 유형의 뉴클레오티드; 및
제3 검출가능한 표지 및 제4 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드를 포함하고;
제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 서로 스펙트럼적으로 구별가능하고, 제1 검출가능한 표지는 제1 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능하고, 제2 검출가능한 표지는 제2 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능하고;
제3 검출가능한 표지 및 제4 검출가능한 표지는 서로 스펙트럼적으로 구별가능하고, 제3 검출가능한 표지는 제1 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능하고, 제4 검출가능한 표지는 제2 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능하고;
제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 중 하나는 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 제1 여기 광원 및 제2 여기 광원 중 다른 하나는 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고;
제1 방출 필터 및 제2 방출 필터 중 하나는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖고, 제1 방출 필터 및 제2 방출 필터 중 다른 하나는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제3 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드와 제4 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드의 혼합물이다.
본 명세서에 기재된 키트의 제3 태양에서, 하나 이상의 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않을 수 있다. 일부 경우에, 서열분석 응용을 위한 키트로서, 키트는
제1 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드;
제2 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드;
제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드; 및
제1 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1 친화성 시약; 및 제2 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2 친화성 시약을 포함하는 친화성 시약들의 세트를 포함하고; 제1 친화성 시약은 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 제2 친화성 시약은 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하고, 제1 검출가능한 표지는 제2 검출가능한 표지로부터 스펙트럼적으로 구별가능하다. 일부 그러한 실시 형태에서, 제1 유형의 뉴클레오티드는 제1 합텐을 포함하고, 제1 친화성 시약은 제1 합텐에 특이적으로 결합하는 제1 합텐-결합 파트너를 포함한다. 추가의 실시 형태에서, 제1 합텐은 비오틴 모이어티를 포함하거나 이로 이루어지고, 제1 합텐-결합 파트너는 스트렙타비딘을 포함하거나 이로 이루어지며, 스트렙타비딘은, 선택적으로 절단가능한 링커를 통해, 하나 이상의 제1 검출가능한 표지와 접합된다. 일부 추가의 실시 형태에서, 제2 유형의 뉴클레오티드는 제2 합텐을 포함하고, 제2 친화성 시약은 제2 합텐에 특이적으로 결합하는 제2 합텐-결합 파트너를 포함한다. 추가의 실시 형태에서, 제2 합텐은 클로로알킬 기(예를 들어, -(CH2)6Cl)를 포함하고 제2 합텐-결합 파트너는 HaloTag®를 포함하거나 이로 이루어지며, HaloTag®는, 선택적으로 절단가능한 링커를 통해, 하나 이상의 제2 검출가능한 표지와 접합된다. 일부 추가의 실시 형태에서, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제1 합텐과 제2 합텐의 혼합물을 포함한다. 추가적인 합텐은 또한, 디곡시게닌 및 다이니트로페놀을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본 명세서에 기재된 표지되지 않은 뉴클레오티드에 사용될 수 있다. 대응하는 친화성 시약은 항-디곡시게닌 결합 파트너 또는 항-다이니트로페놀 결합 파트너를 함유할 것이다. 일부 실시 형태에서, 제1 친화성 시약 및 제2 친화성 시약 둘 모두는 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합한다. 다른 실시 형태에서, 친화성 시약의 세트는 제3 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제3 친화성 시약을 추가로 포함하고, 제3 친화성 시약은 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제3 검출가능한 표지, 및 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제4 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 그러한 실시 형태에서, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제1 합텐을 포함하고, 제3 친화성 시약은 제3 합텐-결합 파트너를 포함한다. 추가의 실시 형태에서, 제3 친화성 시약은 제3 합텐-결합 파트너 및 하나 이상의 제3 검출가능한 표지를 포함하는 제3 친화성 시약과, 제3 합텐-결합 파트너 및 하나 이상의 제4 검출가능한 표지를 포함하는 제3 친화성 시약의 혼합물을 포함한다.
서열분석 응용을 위한 키트의 제4 태양에서, 키트는
제1 검출가능한 표지로 표지되거나 표지되지 않은 제1 유형의 뉴클레오티드;
제2 검출가능한 표지로 표지되거나 표지되지 않은 제2 유형의 뉴클레오티드 - 제1 유형의 뉴클레오티드 및 제2 유형의 뉴클레오티드 중 하나는 표지되지 않음 -;
제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드, 및 제1 또는 제2 유형의 뉴클레오티드와 동일한 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드 - 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 서로 스펙트럼적으로 구별가능하고, 제1 검출가능한 표지는 제1 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능하고, 제2 검출가능한 표지는 제2 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능함 -; 및
제1 유형의 뉴클레오티드가 표지되지 않은 경우 제1 유형의 뉴클레오티드 및 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1 친화성 시약, 또는 제2 유형의 뉴클레오티드가 표지되지 않은 경우 제2 유형의 뉴클레오티드 및 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2 친화성 시약을 포함하는 친화성 시약 - 제1 친화성 시약은 하나 이상의 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 제2 친화성 시약은 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함함 - 을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 제2 유형의 뉴클레오티드는 제2 검출가능한 표지로 표지되고, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제2 검출가능한 표지로 표지되고 표지되지 않은 둘 모두이고, 친화성 시약은 제1 유형의 뉴클레오티드 및 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1 친화성 시약이고, 제1 친화성 시약은 하나 이상의 제1 검출가능한 표지를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 제1 유형의 뉴클레오티드는 제1 검출가능한 표지로 표지되고, 제2 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 제3 유형의 뉴클레오티드는 제2 검출가능한 표지로 표지되고 표지되지 않은 둘 모두이고, 친화성 시약은 제2 유형의 뉴클레오티드 및 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2 친화성 시약이고, 제2 친화성 시약은 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함한다. 추가의 실시 형태에서, 제1 유형 또는 제2 유형의 뉴클레오티드가 표지되지 않은 경우, 그러한 표지되지 않은 뉴클레오티드는 독립적으로 합텐을 포함한다. 추가의 실시 형태에서, 친화성 시약은 표지되지 않은 뉴클레오티드 내의 합텐에 특이적으로 결합하는 합텐-결합 파트너를 포함한다. 일례에서, 합텐은 비오틴 모이어티를 포함하고, 합텐 결합 파트너는 스트렙타비딘을 포함한다. 그러한 스트렙타비딘은, 선택적으로 절단가능한 링커를 통해, 하나 이상의 제1 검출가능한 표지와 접합된다. 다른 예에서, 합텐은 클로로알킬 기를 포함하고, 합텐 결합 파트너는 HaloTag®를 포함한다. HaloTag®는, 선택적으로 절단가능한 링커를 통해, 하나 이상의 제2 검출가능한 표지와 접합된다.
본 명세서에 기재된 키트의 제4 태양에 대한 대안으로서, 키트는
제1 검출가능한 표지로 표지되거나 표지되지 않은 제1 유형의 뉴클레오티드;
제2 검출가능한 표지로 표지되거나 표지되지 않은 제2 유형의 뉴클레오티드 - 제1 유형의 뉴클레오티드 및 제2 유형의 뉴클레오티드 중 하나는 표지되지 않음 -;
제3 유형의 뉴클레오티드 - 제3 유형의 뉴클레오티드는 (i) 제2 유형 뉴클레오티드가 표지되지 않은 경우, 제3 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드와 표지되지 않은 제3 유형의 뉴클레오티드의 혼합물; 또는 (ii) 제1 유형의 뉴클레오티드가 표지되지 않은 경우, 제4 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드와 표지되지 않은 제3 유형의 뉴클레오티드의 혼합물을 포함할 수 있고;
제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 서로 스펙트럼적으로 구별가능하고, 제1 및 제3 검출가능한 표지 둘 모두는 제1 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능하고, 제2 및 제4 검출가능한 표지 둘 모두는 제2 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능함 -; 및
친화성 시약의 세트 - 친화성 시약의 세트는 (iii) 제1 유형의 뉴클레오티드가 표지되지 않은 경우 제1 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1 친화성 시약과, 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제3 친화성 시약의 혼합물; 또는 (iv) 제2 유형의 뉴클레오티드가 표지되지 않은 경우 제2 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2 친화성 시약과, 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제3 친화성 시약의 혼합물을 포함할 수 있고;
(iii)에 기재된 혼합물에서, 제1 친화성 시약은 하나 이상의 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 제3 친화성 시약은 하나 이상의 제3 검출가능한 표지를 포함하고;
(iv)에 기재된 혼합물에서, 제2 친화성 시약은 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하고, 제3 친화성 시약은 하나 이상의 제4 검출가능한 표지를 포함함 - 를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 키트의 임의의 실시 형태에서, 키트는 제4 유형의 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있고, 제4 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않는다(암색). 추가적으로, 본 명세서에 개시된 청색 및 자색 염료 중 임의의 염료가 이 섹션에 기재된 뉴클레오티드 또는 친화성 시약의 제1 또는 제2 표지로서 사용될 수 있다.
하나의 특정 예로서, 키트는 하기의 뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있다: 청색 염료 A로 표지된 dATP, 자색 염료 B로 표지된 dTTP, 청색 염료 A로 표지된 dCTP, 자색 염료 B로 표지된 dCTP, 및 표지되지 않은 dGTP(암색 G).
다른 특정 예로서, 키트는 하기의 뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있다: 청색 염료 A로 표지된 dATP, 자색 염료 B로 표지된 dTTP, 청색 염료 C로 표지된 dCTP, 자색 염료 D로 표지된 dCTP, 및 표지되지 않은 dGTP(암색 G).
다른 특정 예로서, 키트는 하기의 뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있다: 청색 염료 A로 표지된 dATP, 비오틴 모이어티를 포함하는 dTTP, 비오틴 모이어티를 포함하는 dCTP, 청색 염료 A로 표지된 dCTP, 및 표지되지 않은 dGTP(암색 G). 추가적으로, 키트는, 선택적으로 절단가능한 링커를 통해, 하나 이상의 자색 염료 B로 표지된 스트렙타비딘을 포함하는 친화성 시약을 추가로 포함할 수 있다.
다른 특정 예로서, 키트는 하기의 뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있다: 청색 염료 A로 표지된 dATP, 비오틴 모이어티인 제1 합텐을 포함하는 dTTP, 제2 합텐 모이어티를 포함하는 dCTP, 청색 염료 B로 표지된 dCTP, 및 표지되지 않은 dGTP(암색 G). 추가적으로, 키트는, 각각이 선택적으로 절단가능한 링커를 통해, 하나 이상의 자색 염료 C와 접합된 스트렙타비딘 및 하나 이상의 자색 염료 D와 접합된 제2 합텐-결합 파트너를 포함하는 친화성 시약의 세트를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 키트는 하기의 뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있다: 클로로알킬 기(예를 들어, -(CH2)6Cl)를 포함하는 dATP, 비오틴 모이어티를 포함하는 dTTP, 비오틴 모이어티를 포함하는 dCTP, 클로로알킬 기를 포함하는 dCTP, 및 표지되지 않은 dGTP(암색 G). 키트는, 선택적으로 절단가능한 링커를 통해, 하나 이상의 자색 염료로 표지된 스트렙타비딘을 포함하는 제1 친화성 시약을 추가로 포함할 수 있다. 키트는, 선택적으로 절단가능한 링커를 통해, 하나 이상의 청색 염료로 표지된 HaloTag®를 포함하는 제2 친화성 시약을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 키트는 하기의 뉴클레오티드 세트를 포함할 수 있다: 클로로알킬 기(예를 들어, -(CH2)6Cl)를 포함하는 제1 합텐을 포함하는 dATP, 비오틴 모이어티를 포함하는 제2 합텐을 포함하는 dTTP, 제3 합텐을 포함하는 dCTP, 및 표지되지 않은 dGTP(암색 G). 키트는, 선택적으로 절단가능한 링커를 통해, 하나 이상의 자색 염료 B로 표지된 스트렙타비딘을 포함하는 제1 친화성 시약을 추가로 포함할 수 있다. 키트는, 선택적으로 절단가능한 링커를 통해, 하나 이상의 청색 염료 A로 표지된 HaloTag®를 포함하는 제2 친화성 시약을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 제3 합텐-결합 파트너 및 하나 이상의 청색 염료 C를 포함하는 제3 친화성 시약을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 제3 합텐-결합 파트너 및 하나 이상의 자색 염료 D를 포함하는 제3 친화성 시약을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 키트의 일부 실시 형태에서, 제1 여기 광원은 약 350 nm 내지 약 410 nm(예를 들어, 약 405 nm)의 파장을 갖고, 제1 방출 필터는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖는다. 제2 여기 광원은 약 450 nm 내지 약 460 nm(예를 들어, 약 460 nm)의 파장을 갖고, 제2 방출 필터는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는다. 일부 다른 실시 형태에서, 제1 여기 광원은 약 450 nm 내지 약 460 nm(예를 들어, 약 460 nm)의 파장을 갖고, 제1 방출 필터는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는다. 제2 여기 광원은 약 350 nm 내지 약 410 nm(예를 들어, 약 405 nm)의 파장을 갖고, 제2 방출 필터는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖는다.
상기 기재된 예에 더하여, 키트는 적어도 하나의 추가 성분을 함께 포함할 수 있다. 추가의 성분(들)은 본 명세서에 기재된 방법에서 또는 하기 실시예 섹션에서 확인된 성분들 중 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 키트 내로 조합될 수 있는 성분들의 일부 비제한적인 예가 하기에 기재된다. 일부 실시 형태에서, 키트는 DNA 폴리머라제(예컨대, 돌연변이 DNA 폴리머라제) 및 하나 이상의 완충 조성물을 추가로 포함한다. 키트는 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 산화방지제 및/또는 ROS 스캐빈저를 포함할 수 있다. 산화방지제 및/또는 ROS 스캐빈저는 완충 용액 또는 조성물 내에 존재할 수 있으며, 이는 DNA(표적 폴리뉴클레오티드 및/또는 프라이머 폴리뉴클레오티드) 및 염료를 검출 동안 광손상으로부터 보호하는데 사용될 수 있다. 추가의 완충 조성물은 절단가능한 링커 및/또는 3' 하이드록실 블록킹 기를 절단하기 위해 사용될 수 있는 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 팔라듐 착물과 같은, 적어도 부분적으로 수용성인 리간드 및 전이 금속으로부터 형성된 수용성 포스핀 또는 수용성 전이 금속 촉매. 키트의 다양한 성분은 농축 형태로 제공되어 사용 전에 희석될 수 있다. 그러한 실시 형태에서, 적합한 희석 완충액이 또한 포함될 수 있다. 추가의 실시 형태에서, 키트는 하나 이상의 고체 지지체를 포함할 수 있다. 일부 그러한 실시 형태에서, 고체 지지체는 그 위에 고정화된 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 고체 지지체는 플로우셀, 예를 들어, 복수의 나노웰을 포함하는 패턴화된 플로우셀을 포함한다.
본 명세서에 기재된 키트의 일부 실시 형태에서, 검출가능한 표지(예를 들어, 청색 및 자색 염료)는 뉴클레오티드 염기를 통해 뉴클레오티드에 공유적으로 부착될 수 있다. 일부 그러한 실시 형태에서, 표지된 뉴클레오티드는, 선택적으로 링커 모이어티를 통해, 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자 퓨린 염기의 C7 위치에 부착된 염료를 가질 수 있다. 예를 들어, 핵염기는 7-데아자 아데닌일 수 있고, 염료는, 선택적으로 링커를 통해, C7 위치에서 7-데아자 아데닌에 부착된다. 핵염기는 7-데아자 구아닌일 수 있고, 염료는, 선택적으로 링커를 통해, C7 위치에서 7-데아자 구아닌에 부착된다. 핵염기는 시토신일 수 있고, 염료는, 선택적으로 링커를 통해, C5 위치에서 시토신에 부착된다. 다른 예로서, 핵염기는 티민 또는 우라실일 수 있고, 염료는, 선택적으로 링커를 통해, C5 위치에서 티민 또는 우라실에 부착된다. 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 접합체의 임의의 실시 형태에서, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 접합체는 3' 하이드록실 블록킹 기를 함유할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 뉴클레오티드가 표지되지 않고 2차 표지화 방법이 사용되는 경우, 하나 이상의 청색 염료 또는 자색 염료는, 선택적으로 절단가능한 링커를 통해, 본 명세서에 기재된 친화성 시약에 접합될 수 있다. 예를 들어, 하나의 스트렙타비딘은 검출될 도입된 뉴클레오티드의 형광 강도를 증가시키기 위해 동일한 자색 염료의 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 분자로 표지될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법 및 키트의 임의의 실시 형태에서, 표지가 광원에 의해 여기가능하고 방출 필터에 의해 검출가능한 것으로 기술되는 경우, 그것은 또한 그러한 광원에 의해 여기가능하고 그러한 방출 필터에 의해 검출가능한 (친화성 시약을 통해 직접 표지화 또는 2차 표지화하는) 그러한 표지와 접합된 뉴클레오티드를 지칭한다.
3' 하이드록실 블록킹 기
본 명세서에 기재된 방법 및 키트의 임의의 실시 형태에서, 도입 혼합물에 사용되는 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당에 공유적으로 부착된 블록킹 기를 가질 수 있다. 특정 실시 형태에서, 블록킹 기는 뉴클레오티드의 데옥시리보스 당의 3' OH 위치에 있다. 다양한 3' OH 블록킹 기가 국제 특허 출원 공개 WO 2004/018497호 및 WO 2014/139596호에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다. 예를 들어, 블록킹 기는 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티의 3' 산소 원자에 연결되는 아지도메틸(-CH2N3) 또는 치환된 아지도메틸(예를 들어, -CH(CHF2)N3 또는 CH(CH2F)N3), 또는 알릴일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 3' 블록킹 기는 아지도메틸로서, 이는 리보스 또는 데옥시리보스의 3' 탄소와 함께 3'-OCH2N3를 형성한다.
일부 다른 실시 형태에서, 3' 블록킹 기와 3' 산소 원자는 리보스 또는 데옥시리보스의 3' 탄소에 공유적으로 부착된 구조 의 아세탈 기를 형성하며, 여기서
각각의 R1a 및 R1b는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알콕시, 시아노, 할로겐, 선택적으로 치환된 페닐, 또는 선택적으로 치환된 아르알킬이고;
각각의 R2a 및 R2b는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 시아노, 또는 할로겐이고;
대안적으로, R1a와 R2a는 그들이 부착되어 있는 원자와 함께, 선택적으로 치환된 5원 내지 8원 헤테로사이클릴 기를 형성하고;
RF는 H, 선택적으로 치환된 C2-C6 알케닐, 선택적으로 치환된 C3-C7 사이클로알케닐, 선택적으로 치환된 C2-C6 알키닐, 또는 선택적으로 치환된 (C1-C6 알킬렌)Si(R3a)3이고;
각각의 R3a는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 또는 선택적으로 치환된 C6-C10 아릴이다.
추가의 3' OH 블록킹 기는 미국 특허 출원 공개 제2020/0216891 A1호에 개시되어 있으며, 이는 전체적으로 참고로 포함된다. 아세탈 블록킹 기의 비제한적인 예에는 (AOM), , , , , , , 및 가 포함되며, 각각은 리보스 또는 데옥시리보스의 3' 탄소에 공유적으로 부착되어 있다.
3' 하이드록실 블록킹 기의 탈보호
일부 실시 형태에서, 아지도메틸 3' 하이드록시 보호기는 수용성 포스핀 시약을 사용함으로써 제거되거나 탈보호될 수 있다. 비제한적인 예에는 트리스(하이드록시메틸)포스핀(THMP), 트리스(하이드록시에틸)포스핀(THEP) 또는 트리스(하이드록실프로필)포스핀(THP 또는 THPP)이 포함된다. 본 명세서에 기재된 3'-아세탈 블록킹 기는 다양한 화학적 조건 하에서 제거되거나 절단될 수 있다. 비닐 또는 알케닐 모이어티를 함유하는 아세탈 블록킹 기 의 경우, 비제한적인 절단 조건은 포스핀 리간드, 예를 들어 트리스(하이드록시메틸)포스핀(THMP), 또는 트리스(하이드록실프로필)포스핀(THP 또는 THPP)의 존재 하에서 Pd(II) 착물, 예컨대 Pd(OAc)2 또는 알릴Pd(II) 클로라이드 이량체를 포함한다. 알키닐 기(예를 들어, 에티닐)를 함유하는 블록킹 기의 경우, 이들은 또한 포스핀 리간드(예를 들어, THP 또는 THMP)의 존재 하에서 Pd(II) 착물(예를 들어, Pd(OAc)2 또는 알릴 Pd(II) 클로라이드 이량체)에 의해 제거될 수 있다.
팔라듐 절단 시약
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 3' 하이드록실 블록킹 기는 팔라듐 촉매에 의해 절단될 수 있다. 일부 그러한 실시 형태에서, Pd 촉매는 수용성이다. 일부 그러한 실시 형태에서, Pd(0) 착물(예를 들어, 트리스(3,3′,3″-포스피니딘트리스(벤젠설포네이토)팔라듐(0) 9나트륨 염 9수화물)이다. 일부 경우에, Pd(0) 착물은 알켄, 알코올, 아민, 포스핀, 또는 금속 수소화물과 같은 시약에 의해 Pd(II) 착물의 환원으로부터 계내(in situ)에서 생성될 수 있다. 적합한 팔라듐 공급원은 Na2PdCl4, Pd(CH3CN)2Cl2, (PdCl(C3H5))2, [Pd(C3H5)(THP)]Cl, [Pd(C3H5)(THP)2]Cl, Pd(OAc)2, Pd(Ph3)4, Pd(dba)2, Pd(Acac)2, PdCl2(COD), 및 Pd(TFA)2를 포함한다. 그러한 일 실시 형태에서, Pd(0) 착물은 Na2PdCl4로부터 계내에서 생성된다. 다른 실시 형태에서, 팔라듐 공급원은 알릴 팔라듐(II) 클로라이드 이량체 [(PdCl(C3H5))2]이다. 일부 실시 형태에서, Pd(0) 착물은 Pd(II) 착물을 포스핀과 혼합함으로써 수용액 중에서 생성된다. 적합한 포스핀은 수용성 포스핀, 예컨대 트리스(하이드록시프로필)포스핀(THP), 트리스(하이드록시메틸)포스핀(THMP), 1,3,5-트라이아자-7-포스파아다만탄(PTA), 비스(p-설포네이토페닐)페닐포스핀 2수화물 칼륨 염, 트리스(카르복시에틸)포스핀(TCEP), 및 트라이페닐포스핀-3,3',3"-트라이설폰산 삼나트륨 염을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Pd(0)는 계내에서 Pd(II) 착물 [(PdCl(C3H5))2]을 THP와 혼합함으로써 제조된다. Pd(II) 착물과 THP의 몰비는 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10일 수 있다. 일부 추가의 실시 형태에서, 하나 이상의 환원제가 첨가될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 아스코르브산 또는 이의 염(예를 들어, 소듐 아스코르베이트)이 있다. 일부 실시 형태에서, 절단 혼합물은 추가의 완충 시약, 예컨대 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 카르보네이트 염, 포스페이트 염, 또는 보레이트 염, 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다. 일부 추가의 실시 형태에서, 완충 시약은 에탄올아민(EA), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris), 글리신, 탄산나트륨, 인산나트륨, 붕산나트륨, 2-다이메틸에탄올아민(DMEA), 2-다이에틸에탄올아민(DEEA), N,N,N′,N′-테트라메틸에틸렌다이아민(TEMED), 또는 N,N,N′,N′-테트라에틸에틸렌다이아민(TEEDA), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일 실시 형태에서, 완충 시약은 DEEA이다. 다른 실시 형태에서, 완충 시약은 하나 이상의 무기 염, 예컨대 카르보네이트 염, 포스페이트 염, 또는 보레이트 염, 또는 이들의 조합을 함유한다. 일 실시 형태에서, 무기 염은 나트륨 염이다.
링커
형광 표지는 절단가능한 링커를 통해 뉴클레오티드에 공유 결합될 수 있다. 용어 "절단가능한 링커"의 사용은 전체 링커가 제거될 것이 요구되는 것을 내포하는 것으로 의미되지 않는다. 절단 부위는 링커의 일부가 절단 후 염료 및/또는 기질 모이어티에 부착된 채로 남아 있는 것을 보장하는 링커 상의 위치에 위치될 수 있다. 절단가능한 링커는, 비제한적인 예로서, 친전자적으로 절단가능한 링커, 친핵적으로 절단가능한 링커, 광절단성 링커일 수 있으며, 이들은 환원성 조건(예를 들어, 다이설파이드 또는 아지드 함유 링커), 산화성 조건 하에서 절단가능하고, 안전성-캐치 링커(safety-catch linker)의 사용을 통해 절단가능하고, 제거 기전에 의해 절단가능하다. 염료 화합물을 기질 모이어티에 부착하기 위한 절단가능한 링커의 사용은 표지를, 필요하다면, 검출 후에 제거하여, 하류 단계들에서 어떠한 간섭 신호도 피할 수 있음을 보장한다.
유용한 링커 기가 국제 특허 출원 공개 WO 2004/018493호(본 명세서에 참고로 포함됨)에서 찾아질 수 있으며, 이의 예에는 전이 금속 및 적어도 부분적으로 수용성인 리간드로부터 형성된 수용성 전이 금속 촉매 또는 수용성 포스핀을 사용하여 절단될 수 있는 링커를 포함한다. 수용액 중에서, 후자는 적어도 부분적으로 수용성인 전이 금속 착물을 형성한다. 그러한 절단가능한 링커는 본 명세서에 기재된 염료와 같은 표지에 뉴클레오티드의 염기를 연결하는 데 사용될 수 있다.
특정 링커는 국제 특허 출원 공개 WO 2004/018493호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 개시된 것들, 예컨대 하기 화학식의 모이어티를 포함하는 것들을 포함한다:
(상기 식에서, X는 O, S, NH 및 NQ를 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 Q는 C1-10 치환 또는 비치환된 알킬 기이고, Y는 O, S, NH 및 N(알릴)을 포함하는 군으로부터 선택되고, T는 수소 또는 C1-C10 치환 또는 비치환된 알킬 기이고, *는 모이어티가 뉴클레오티드의 나머지 부분에 연결되는 경우를 나타냄). 일부 태양에서, 링커는 뉴클레오티드의 염기를 표지에 연결한다.
링커의 추가의 예에는 미국 특허 출원 공개 제2016/0040225호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 개시된 것들, 예컨대 하기 화학식의 모이어티를 포함하는 것들이 포함된다:
(상기 식에서, *는 모이어티가 뉴클레오티드의 나머지 부분에 연결되는 경우를 나타냄). 본 명세서에 예시된 링커 모이어티는 뉴클레오티드와 표지 사이의 전체 또는 부분 링커 구조를 포함할 수 있다. 본 명세서에 예시된 링커 모이어티는 뉴클레오티드와 표지 사이의 전체 또는 부분 링커 구조를 포함할 수 있다.
링커의 추가적인 예는 하기 화학식의 모이어티를 포함한다:
, , , , , 또는, 여기서 B는 핵염기이고; Z는 -N3(아지도), -O-C1-C6 알킬, -O-C2-C6 알케닐, 또는 -O-C2-C6 알키닐이고; Fl은 염료 모이어티를 포함하며, 이는 추가의 링커 구조를 함유할 수 있다. 당업자는 본 명세서에 기재된 염료 화합물은 염료 화합물의 작용기(예를 들어, 카르복실)를 링커의 작용기(예를 들어, 아미노)와 반응시킴으로써 링커에 공유 결합됨을 이해한다. 일 실시 형태에서, 절단성 링커는 ("AOL" 링커 모이어티) (여기서, Z는 -O-알릴임)를 포함한다.
염료는, 예를 들어 링커를 통해 뉴클레오티드 염기 상의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 왓슨-크릭 염기쌍 형성은 생성된 유사체에 대해 여전히 수행될 수 있다. 특정 핵염기 표지화 부위는 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자퓨린 염기의 C7 위치를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 도입 시에 뉴클레오티드가 표지되고, 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드에 검출가능한 표지를 부가하기 위해 친화성 시약에 의존할 때, 표지되지 않은 뉴클레오티드는 합텐 부착을 위한 절단가능한 링커를 여전히 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 절단가능한 링커는 또한, 친화성 시약을 사용하여 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드/표적 폴리뉴클레오티드 복합체에 표지(들)를 부가하는 데 2차 표지화 방법이 사용될 때, 염료를 친화성 시약에 부착시키는데 사용될 수 있다.
표지된 뉴클레오티드
본 명세서에 기재된 염료로 표지된 뉴클레오티드는 하기 화학식을 가질 수 있다:
여기서 Dye는 (염료의 작용기와 링커 "L"의 작용기 사이의 공유 결합 후) 본 명세서에 기재된 염료 화합물(표지) 모이어티이고; B는 핵염기, 예컨대 우라실, 티민, 시토신, 아데닌, 7-데아자 아데닌, 구아닌, 7-데아자 구아닌 등이고; L은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 선택적인 링커이고; R'은 H일 수 있거나, -OR'은 모노포스페이트, 다이포스페이트, 트라이포스페이트, 티오포스페이트, 포스페이트 에스테르 유사체, 반응성 인-함유 기에 부착된 -O-, 또는 블록킹 기에 의해 보호된 -O-이고; R"은 H 또는 OH이고; R'''은 H, 본 명세서에 기재된 3' OH 블록킹 기이거나, -OR'''이 포스포르아미다이트를 형성한다. -OR'''이 포스포르아미다이트인 경우, R'은 산-절단가능한 하이드록실 보호기이며, 이는 자동화 합성 조건 하에서 후속 단량체 커플링을 가능하게 한다. 일부 추가의 실시 형태에서, B는 , , , , , 또는 , 또는 이들의 선택적으로 치환된 유도체 및 유사체를 포함한다. 일부 추가의 실시 형태에서, 표지된 핵염기는 구조 , , , 또는 를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 이러한 블록킹 기는 염료 화합물과 분리되어 있고 독립적이며, 즉 그것에 부착되어 있지 않다. 대안적으로, 염료는 3' OH 블록킹 기의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 따라서, R'''은 염료 화합물을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있는 3' OH 블록킹 기일 수 있다.
또 다른 대안적인 실시 형태에서, 펜토스 당의 3' 탄소 상에는 블록킹 기가 없으며, 염기에 부착된 염료(또는 염료 및 링커 작제물)는, 예를 들어, 추가의 뉴클레오티드의 도입에 대한 블록으로서 작용하기에 충분한 크기 또는 구조를 가질 수 있다. 따라서, 이러한 블록은, 염료가 당의 3' 위치에 부착되어 있든 그렇지 않든 간에, 입체 장애로 인한 것일 수 있거나 크기, 전하 및 구조의 조합으로 인한 것일 수 있다.
또 다른 대안적인 실시 형태에서, 블록킹 기는 펜토스 당의 2' 또는 4' 탄소 상에 존재하며, 추가의 뉴클레오티드의 도입에 대한 블록으로서 작용하기에 충분한 크기 또는 구조를 가질 수 있다.
일부 실시 형태에서, 링커(염료와 뉴클레오티드 사이에 존재함) 및 블록킹 기 둘 모두가 존재하며, 별개의 모이어티이다. 특정 실시 형태에서, 링커 및 블록킹 기는 둘 모두 실질적으로 유사한 조건 하에서 절단가능하다. 따라서, 염료 화합물 및 블록킹 기 둘 모두를 제거하는 데 단지 단일 처리만이 요구될 것이기 때문에 탈보호 및 탈블록킹 공정이 더 효율적일 수 있다. 그러나, 일부 실시 형태에서 링커 및 블록킹 기는 유사한 조건 하에서 절단가능할 필요가 없으며, 대신에 별개의 조건 하에서 개별적으로 절단가능하다.
본 발명은 또한 염료 화합물을 도입시킨 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 포스포다이에스테르 결합으로 연결된 데옥시리보뉴클레오티드들 또는 리보뉴클레오티드들로 각각 구성된 DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 변형된(예를 들어, 염료 화합물로 표지된) 뉴클레오티드와 조합된, 본 명세서에 기재된 표지된 뉴클레오티드 이외의 천연 발생 뉴클레오티드, 천연 비발생(또는 변형된) 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 또한 비천연 골격 결합 및/또는 비-뉴클레오티드 화학적 변형을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드의 혼합물로 구성된 키메라 구조가 또한 고려된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 비제한적인 예시적인 표지된 뉴클레오티드 접합체는 하기를 포함한다:
상기 식에서, L은 링커를 나타내고, R은 전술된 바와 같은 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티, 또는 5' 위치가 모노-, 다이- 또는 트라이-포스페이트로 치환된 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티를 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 절단가능한 링커 및 형광 모이어티를 포함하는 비제한적인 예시적인 완전 작용화된 뉴클레오티드 접합체가 하기에 제시된다:
,
,
,
,
,
,
,
,
,
상기 식에서, PG는 본 명세서에 기재된 3' OH 블록킹 기를 나타내고; p는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10의 정수이고; k는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5임. 일 실시 형태에서, -O-PG는 AOM이다. 다른 실시 형태에서, -O-PG는 -O-아지도메틸이다. 일 실시 형태에서, k는 5이다. 일부 추가의 실시 형태에서, p는 1, 2 또는 3이고; k는 5이다. 는 링커 모이어티의 아미노 기와 Dye(즉, 본 명세서에 기재된 청색 염료 또는 자색 염료)의 카르복실 기 사이의 반응의 결과로서 Dye와 절단성 링커의 연결점을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 표지된 뉴클레오티드의 임의의 실시 형태에서, 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 트라이포스페이트이다. 대안적으로, ffN이 표지되지 않은 경우, Dye 모이어티는 본 명세서에 기재된 친화성 시약과 표지되지 않은 뉴클레오티드의 결합을 가능하게 할 수 있는 작용성 모이어티(예를 들어, 합텐)로 대체될 수 있다.
실시예
추가의 실시 형태가 하기의 실시예에서 더 상세히 개시되며, 이러한 실시예는 결코 본 발명의 범주를 제한하고자 의도되지 않는다.
실시예 1. 405 nm의 자색 조사를 사용한 DNA 광손상의 평가
본 예에서, 405 nm의 자색 광에 의해 야기된 손상된 DNA를 평가하였다. 자색 염료 DY405에 공유적으로 부착되거나, 또는 완충액 중에서 DY405의 존재 하에 있는, 트리스 완충액(pH = 8, 100 mM) 중의 단일 가닥 DNA을 자색 LED 하에 2시간 동안 조사하였다. DY405가 DNA의 5' 말단에 공유적으로 부착되었을 때, 조사에 의해 야기된 DNA에 대한 광손상은 DNA가 완충 용액 중에서 DY405와 함께 혼합되었을 때와 비교하여 실질적으로 증가된 것을 관찰하였다. 결과를 도 1에 도식화하였다.
실시예 2. 청색/자색 2-채널 MiSeq® 시스템을 사용한 합성에 의한 서열분석
본 실시예에서, 합성에 의한 서열분석을 2-채널 청색/자색으로 구성된 MiSeq® 기기에서 수행하였다. 표준 서열분석 시약을 사용하였다. 표준 SBS에 대한 도입 혼합물은 표 1에 요약되어 있다. 이들 데이터에 제시된 서열분석된 라이브러리는 PhiX이다.
표준 SBS 도입 믹스의 경우, 사용된 자색 염료는 DY405이다. ffT 및 ffC 둘 모두를 DY405로 표지하였다. 청색 염료 A를 사용하여 ffA 및 ffC를 표지하였다. 사후 분석을 위해 바람직한 형상을 갖는 정사각형 산점도를 얻기 위해, 녹색 ffN을 또한 도입하여 자색 및 청색 채널에서 신호 강도를 감소시켰다. ffG는 표지하지 않았다("암색 G"). 도입 혼합물에서 뉴클레오티드의 구조는 하기에 예시된다. ffC-sPA-DY405 및 ffT-LN3-DY405 둘 모두를 표준 ffN 커플링 반응을 사용하여 pppC-sPA-NH2 또는 pppT-LN3-NH2를 Dy405-NHS(5 mg)와 반응시킴으로써 제조하였다.
[표 1]
DY405-표지된 스트렙타비딘의 제조 . 먼저, 무수 DMA 중의 TSTU 및 Hunig 염기의 존재 하에 30분 동안 N,N,N′,N′-테트라메틸-O-(N-석신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트(1.5 당량)와 DY405를 반응시켜 DY405를 DY405-NHS로 전환시켰다, 둘째, 스트렙타비딘 분말을 물 및 NaHCO3 완충액에 용해시켰다. 제1 단계로부터 제조된 DY405-NHS를 스트렙타비딘 용액 내로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 가끔 혼합하면서 인큐베이션하였다. 이어서, 5M NaCl 용액을 반응 혼합물에 첨가하였다. Thermo Fisher Dye 제거 컬럼을 사용하여 과량의 염료를 제거함으로써 반응 생성물을 정제하였다. 반응 생성물의 정량화는 최종 염료/단백질 비가 약 3.1 내지 3.4인 것을 보여주었다.
2차 표지화 SBS의 경우, 2차 표지화를 dTTP 및 dCTP에 대해 사용하였다. 2차 표지화 SBS 도입 혼합물에서, ffT는 표지되지 않고 비오틴 모이어티를 포함하였다. ffC는 청색 염료 A로 표지되고 표지되지 않은 둘 모두였고, ffA는 청색 염료 A로 표지되었다. 도입 혼합물은 표 2에 요약되어 있다. 2차 표지화 SBS에서, 표준 도입 후 서열분석 레시피에서 추가 단계가 필요하였다. 하나의 뉴클레오티드의 도입 후, DY405-표지된 스트렙타비딘의 용액을 플로우셀 상에 플러싱하고, 60℃에서 25초 동안 인큐베이션한 후, 제1 및 제2 이미징 이벤트를 수행하기 전에 완충액 세척하였다. 스트렙타비딘-DY405 용액은 5mM Tris (pH 7.5) 중에 5 ug/ml의 스트렙타비딘-DY405, NaCl, EDTA, Tween® 20(폴리소르베이트 20)를 함유하였다. 상업용 MiSeq® 플로우셀을 이 실험에서 사용하였다. 도 2는 이러한 서열분석 방법의 유용성을 입증하는, 2차 표지화 SBS로 얻어진 산점도를 예시한다.
[표 2]
[표 3]
표 3은 2차 표지화 SBS 및 표준 SBS(R1 = 2차 표지화 SBS 및 R2 = 표준 SBS) 둘 모두에 대한 1차 서열분석 메트릭을 나타낸다. 결과는 청색/자색 2-채널 서열분석이 자색 염료의 2차 표지화를 수반하는 변형된 방법과 상용성이라는 것을 보여준다.
그러나, 청색/자색(B/V) 채널을 사용한 50-사이클 실행에 대해 관찰된 %위상화 및 %신호 감쇄는 표준 청색/녹색(B/G) 서열분석의 경우보다 훨씬 더 높다(표 4).
[표 4]
뉴클레오티드 도입 시간 및 자색 조명 시간과 관련하여 신호 감쇄의 원인을 이해하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 자색 광의 증가된 선량 및 자색 광 노출 시간의 증가 둘 모두가 신호 감쇄를 악화시키는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 뉴클레오티드 도입 시간을 증가시킴으로써, %위상화가 실질적으로 감소되었고, 그 결과, 신호 감쇄가 또한 개선되었다. 추가로, 감소된 자색 광의 손실 및 더 짧은 자색 노출 시간(예를 들어, 250ms에서 170ms까지 자색 노출 시간을 감소시킴)으로 더 밝은 플로우셀을 사용함으로써 신호 감쇄가 또한 개선되었다.

Claims (59)

  1. 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법으로서,
    (a) 프라이머 폴리뉴클레오티드를 제1 유형의 뉴클레오티드, 제2 유형의 뉴클레오티드, 제3 유형의 뉴클레오티드, 및 제4 유형의 뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 혼합물과 접촉시키는 단계 - 상기 프라이머 폴리뉴클레오티드는 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적임 -;
    (b) 상기 혼합물로부터의 하나의 유형의 뉴클레오티드를 상기 프라이머 폴리뉴클레오티드로 도입하여 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계;
    (c) 제1 여기 광원을 사용하여 제1 이미징 이벤트를 수행하고 제1 방출 필터를 이용하여 상기 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드로부터 제1 방출 신호를 수집하는 단계; 및
    (d) 제2 여기 광원을 사용하여 제2 이미징 이벤트를 수행하고 제2 방출 필터를 이용하여 상기 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드로부터 제2 방출 신호를 수집하는 단계를 포함하고;
    상기 제1 여기 광원 및 상기 제2 여기 광원 중 하나는 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 상기 제1 여기 광원 및 상기 제2 여기 광원 중 다른 하나는 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고;
    상기 제1 방출 필터 및 상기 제2 방출 필터 중 하나는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖고, 상기 제1 방출 필터 및 상기 제2 방출 필터 중 다른 하나는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 유형의 뉴클레오티드는 상기 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 상기 제1 방출 필터에 의해 검출가능한 제1 검출가능한 표지로 표지되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제2 유형의 뉴클레오티드는 상기 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 상기 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 제2 검출가능한 표지로 표지되고, 상기 제2 유형의 검출가능한 표지는 상기 제1 유형의 검출가능한 표지로부터 스펙트럼적으로 구별가능한, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 유형의 뉴클레오티드는 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지 둘 모두로 표지되고, 상기 제3 유형의 뉴클레오티드는 상기 제1 여기 광원 및 상기 제2 여기 광원 둘 모두에 의해 여기가능한, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 유형의 뉴클레오티드는 제3 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드와 제4 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드의 혼합물을 포함하고, 상기 제3 표지는 상기 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 상기 제1 방출 필터에 의해 검출가능하고, 상기 제4 표지는 상기 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 상기 제2 방출 필터에 의해 검출가능한, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1 유형, 상기 제2 유형 및 상기 제3 유형 각각의 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 상기 방법은 상기 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드를 상기 제1 이미징 이벤트 전에 친화성 시약의 세트와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 세트 내의 적어도 하나의 친화성 시약은 상기 도입된 제1 유형, 제2 유형, 또는 제3 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 친화성 시약의 세트는 상기 제1 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1 친화성 시약, 상기 제2 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2 친화성 시약을 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제1 친화성 시약은 상기 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 상기 제1 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 상기 제2 친화성 시약은 상기 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 상기 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하고, 상기 제1 검출가능한 표지는 상기 제2 검출가능한 표지로부터 스펙트럼적으로 구별가능한, 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 제1 친화성 시약 및 상기 제2 친화성 시약 둘 모두는 상기 제3 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는, 방법.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 친화성 시약의 세트는 상기 제3 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제3 친화성 시약을 추가로 포함하고, 상기 제3 친화성 시약은 상기 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 상기 제1 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제3 검출가능한 표지, 및 상기 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 상기 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제4 검출가능한 표지를 포함하는, 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유형의 뉴클레오티드는 제1 합텐을 포함하고, 상기 제1 친화성 시약은 상기 제1 합텐에 특이적으로 결합하는 제1 합텐-결합 파트너를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 합텐은 비오틴 모이어티(moiety)를 포함하고, 상기 제1 합텐-결합 파트너는 스트렙타비딘을 포함하는, 방법.
  13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 유형의 뉴클레오티드는 제2 합텐을 포함하고, 상기 제2 친화성 시약은 상기 제2 합텐에 특이적으로 결합하는 제2 합텐-결합 파트너를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제2 합텐은 클로로알킬 기를 포함하고, 상기 제2 합텐-결합 파트너는 HaloTag®를 포함하는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 제1 유형의 뉴클레오티드는 제1 검출가능한 표지로 표지되고, 상기 제2 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 상기 제3 유형의 뉴클레오티드는 상기 제1 검출가능한 표지로 표지되고 표지되지 않은 둘 모두이고, 상기 제1 검출가능한 표지는 상기 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 상기 제1 방출 필터에 의해 검출가능하고, 상기 방법은 상기 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드를 상기 제1 이미징 이벤트 전에 친화성 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 친화성 시약은 상기 제2 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드 또는 상기 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 친화성 시약은 상기 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 상기 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 친화성 시약은 스트렙타비딘을 포함하고, 상기 제2 유형의 뉴클레오티드 및 상기 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드 둘 모두는 비오틴 모이어티를 포함하는, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 제1 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 상기 제2 유형의 뉴클레오티드는 제2 검출가능한 표지로 표지되고, 상기 제3 유형의 뉴클레오티드는 상기 제2 검출가능한 표지로 표지되고 표지되지 않은 둘 모두이고, 상기 제2 검출가능한 표지는 상기 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 상기 제2 방출 필터에 의해 검출가능하고, 상기 방법은 상기 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드를 상기 제1 이미징 이벤트 전에 친화성 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 친화성 시약은 상기 제1 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드 또는 상기 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 친화성 시약은 상기 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 상기 제1 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제1 검출가능한 표지를 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 친화성 시약은 스트렙타비딘을 포함하고, 상기 제1 유형의 뉴클레오티드 및 상기 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드 둘 모두는 비오틴 모이어티를 포함하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제4 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않거나(암색), 또는 상기 제1 이미징 이벤트 또는 상기 제2 이미징 이벤트로부터 방출이 없는 형광 모이어티로 표지되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4가지 유형의 뉴클레오티드는 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 또는 dUTP, 또는 이의 비-천연 뉴클레오티드 유사체를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 혼합물 내의 상기 4가지 유형의 뉴클레오티드 각각은 3' 하이드록실 블록킹 기를 갖는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, (e) 상기 제2 이미징 이벤트 후, 그리고 다음 서열분석 사이클 전에 상기 도입된 뉴클레오티드로부터 상기 3' 하이드록실 블록킹 기를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    다수의 사이클 동안 단계 (a) 내지 단계 (e)를 반복하는 단계; 및
    순차적으로 도입된 뉴클레오티드에 기초하여 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 단계 (a) 내지 단계 (e)는 적어도 50회 사이클 동안 반복되는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 여기 광원 및 상기 제2 여기 광원 각각은 레이저, 발광 다이오드(LED), 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 여기 광원은 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 상기 제1 방출 필터는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 제2 여기 광원은 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고, 상기 제2 방출 필터는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는, 방법.
  30. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 여기 광원은 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고, 상기 제1 방출 필터는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제2 여기 광원은 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 상기 제2 방출 필터는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신장된 프라이머 폴리뉴클레오티드는 상기 제1 이미징 이벤트 및 상기 제2 이미징 이벤트 동안 하나 이상의 산화방지제를 포함하는 완충 용액 중에 있는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체에 고정화되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 고체 지지체는 복수의 고정화된 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 고체 지지체는 플로우 셀을 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 플로우 셀은 복수의 나노웰(nanowell)을 포함하는 패턴화된 플로우 셀이고, 각각의 나노웰은 하나의 고정화된 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체 상의 상기 고정화된 표적 폴리뉴클레오티드의 밀도는 약 100 k/㎟ 내지 약 300 k/㎟인, 방법.
  38. 서열분석 응용을 위한 키트로서,
    제1 검출가능한 표지로 표지된 제1 유형의 뉴클레오티드;
    제2 검출가능한 표지로 표지된 제2 유형의 뉴클레오티드;
    상기 제1 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드; 및
    상기 제2 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드를 포함하고;
    상기 제1 검출가능한 표지 및 상기 제2 검출가능한 표지는 서로 스펙트럼적으로 구별가능하고, 상기 제1 검출가능한 표지는 제1 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능하고, 상기 제2 검출가능한 표지는 제2 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능하고;
    상기 제1 여기 광원 및 상기 제2 여기 광원 중 하나는 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 상기 제1 여기 광원 및 상기 제2 여기 광원 중 다른 하나는 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고;
    상기 제1 방출 필터 및 상기 제2 방출 필터 중 하나는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖고, 상기 제1 방출 필터 및 상기 제2 방출 필터 중 다른 하나는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는, 키트.
  39. 서열분석 응용을 위한 키트로서,
    제1 검출가능한 표지로 표지된 제1 유형의 뉴클레오티드;
    제2 검출가능한 표지로 표지된 제2 유형의 뉴클레오티드;
    제3 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드; 및
    제4 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드를 포함하고;
    상기 제1 검출가능한 표지 및 상기 제2 검출가능한 표지는 서로 스펙트럼적으로 구별가능하고, 상기 제1 검출가능한 표지는 제1 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능하고, 상기 제2 검출가능한 표지는 제2 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능하고;
    상기 제3 검출가능한 표지 및 상기 제4 검출가능한 표지는 서로 스펙트럼적으로 구별가능하고, 상기 제3 검출가능한 표지는 상기 제1 광원에 의해 여기가능하고 상기 제1 방출 필터에 의해 검출가능하고, 상기 제4 검출가능한 표지는 상기 제2 광원에 의해 여기가능하고 상기 제2 방출 필터에 의해 검출가능하고;
    상기 제1 여기 광원 및 상기 제2 여기 광원 중 하나는 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 상기 제1 여기 광원 및 상기 제2 여기 광원 중 다른 하나는 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고;
    상기 제1 방출 필터 및 상기 제2 방출 필터 중 하나는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖고, 상기 제1 방출 필터 및 상기 제2 방출 필터 중 다른 하나는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는, 키트.
  40. 서열분석 응용을 위한 키트로서,
    제1 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드;
    제2 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드;
    제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드; 및
    친화성 시약의 세트를 포함하고, 상기 친화성 시약의 세트는,
    상기 제1 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1 친화성 시약; 및
    상기 제2 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2 친화성 시약을 포함하고;
    상기 제1 친화성 시약은 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 상기 제2 친화성 시약은 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하고, 상기 제1 검출가능한 표지는 상기 제2 검출가능한 표지로부터 스펙트럼적으로 구별가능하고;
    상기 제1 여기 광원 및 상기 제2 여기 광원 중 하나는 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 상기 제1 여기 광원 및 상기 제2 여기 광원 중 다른 하나는 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고;
    상기 제1 방출 필터 및 상기 제2 방출 필터 중 하나는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖고, 상기 제1 방출 필터 및 상기 제2 방출 필터 중 다른 하나는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는, 키트.
  41. 제40항에 있어서, 상기 제1 유형의 뉴클레오티드는 제1 합텐을 포함하고, 상기 제1 친화성 시약은 상기 제1 합텐에 특이적으로 결합하는 제1 합텐-결합 파트너를 포함하는, 키트.
  42. 제41항에 있어서, 상기 제1 합텐은 비오틴 모이어티를 포함하고, 상기 제1 합텐-결합 파트너는 스트렙타비딘을 포함하는, 키트.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 유형의 뉴클레오티드는 제2 합텐을 포함하고, 상기 제2 친화성 시약은 상기 제2 합텐에 특이적으로 결합하는 제2 합텐-결합 파트너를 포함하는, 키트.
  44. 제43항에 있어서, 상기 제2 합텐은 클로로알킬 기를 포함하고, 상기 제2 합텐-결합 파트너는 HaloTag®를 포함하는, 키트.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 유형의 뉴클레오티드는 제1 합텐 및 제2 합텐 둘 모두를 포함하고, 상기 제1 친화성 시약 및 상기 제2 친화성 시약 둘 모두는 상기 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는, 키트.
  46. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화성 시약의 세트는 상기 제3 유형의 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제3 친화성 시약을 추가로 포함하고, 상기 제3 친화성 시약은 상기 제1 여기 광원에 의해 여기가능하고 상기 제1 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제3 검출가능한 표지, 및 상기 제2 여기 광원에 의해 여기가능하고 상기 제2 방출 필터에 의해 검출가능한 하나 이상의 제4 검출가능한 표지를 포함하는, 키트.
  47. 서열분석 응용을 위한 키트로서,
    제1 검출가능한 표지로 표지되거나 표지되지 않은 제1 유형의 뉴클레오티드;
    제2 검출가능한 표지로 표지되거나 표지되지 않은 제2 유형의 뉴클레오티드 - 상기 제1 유형의 뉴클레오티드 및 상기 제2 유형의 뉴클레오티드 중 하나는 표지되지 않음 -;
    제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드, 및 상기 제1 또는 상기 제2 유형의 뉴클레오티드와 동일한 검출가능한 표지로 표지된 제3 유형의 뉴클레오티드 - 상기 제1 검출가능한 표지 및 상기 제2 검출가능한 표지는 서로 스펙트럼적으로 구별가능하고, 상기 제1 검출가능한 표지는 제1 광원에 의해 여기가능하고 제1 방출 필터에 의해 검출가능하고, 상기 제2 검출가능한 표지는 제2 광원에 의해 여기가능하고 제2 방출 필터에 의해 검출가능함 -; 및
    상기 제1 유형의 뉴클레오티드가 표지되지 않은 경우 상기 제1 유형의 뉴클레오티드 및 상기 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제1 친화성 시약, 또는 상기 제2 유형의 뉴클레오티드가 표지되지 않은 경우 상기 제2 유형의 뉴클레오티드 및 상기 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2 친화성 시약을 포함하는 친화성 시약 - 상기 제1 친화성 시약은 하나 이상의 제1 검출가능한 표지를 포함하고, 상기 제2 친화성 시약은 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함함 - 을 포함하고;
    상기 제1 여기 광원 및 상기 제2 여기 광원 중 하나는 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 상기 제1 여기 광원 및 상기 제2 여기 광원 중 다른 하나는 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고;
    상기 제1 방출 필터 및 상기 제2 방출 필터 중 하나는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖고, 상기 제1 방출 필터 및 상기 제2 방출 필터 중 다른 하나는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는, 키트.
  48. 제47항에 있어서, 상기 제1 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 상기 제2 유형의 뉴클레오티드는 제2 검출가능한 표지로 표지되고, 상기 제3 유형의 뉴클레오티드는 제2 검출가능한 표지로 표지되고 표지되지 않은 둘 모두이고, 상기 친화성 시약은 상기 제1 유형의 뉴클레오티드 및 상기 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 상기 제1 친화성 시약이고, 상기 제1 친화성 시약은 하나 이상의 제1 검출가능한 표지를 포함하는, 키트.
  49. 제47항에 있어서, 상기 제1 유형의 뉴클레오티드는 제1 검출가능한 표지로 표지되고, 상기 제2 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않고, 상기 제3 유형의 뉴클레오티드는 제2 검출가능한 표지로 표지되고 표지되지 않은 둘 모두이고, 상기 친화성 시약은 상기 제2 유형의 뉴클레오티드 및 상기 제3 유형의 표지되지 않은 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 상기 제2 친화성 시약이고, 상기 제2 친화성 시약은 하나 이상의 제2 검출가능한 표지를 포함하는, 키트.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유형 또는 상기 제2 유형의 뉴클레오티드가 표지되지 않은 경우, 그러한 표지되지 않은 뉴클레오티드는 독립적으로 합텐을 포함하는, 키트.
  51. 제50항에 있어서, 상기 친화성 시약은 상기 표지되지 않은 뉴클레오티드 내의 상기 합텐에 특이적으로 결합하는 합텐-결합 파트너를 포함하는, 키트.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 합텐은 비오틴 모이어티 또는 클로로알킬 기를 포함하는, 키트.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 합텐-결합 파트너는 스트렙타비딘 또는 HaloTag®를 포함하는, 키트.
  54. 제38항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 여기 광원은 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 상기 제1 방출 필터는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖고; 상기 제2 여기 광원은 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고, 상기 제2 방출 필터는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖는, 키트.
  55. 제38항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 여기 광원은 약 450 nm 내지 약 460 nm의 파장을 갖고, 상기 제1 방출 필터는 약 480 nm 내지 약 525 nm의 검출 파장을 갖고; 상기 제2 여기 광원은 약 350 nm 내지 약 410 nm의 파장을 갖고, 상기 제2 방출 필터는 약 415 nm 내지 약 450 nm의 검출 파장을 갖는, 키트.
  56. 제38항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 유형의 뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 상기 제4 유형의 뉴클레오티드는 표지되지 않은(암색), 키트.
  57. 제38항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 폴리머라제 및 하나 이상의 완충 조성물을 추가로 포함하는, 키트.
  58. 제57항에 있어서, 적어도 하나의 완충 조성물은 상기 제1 여기 광원 및/또는 상기 제2 여기 광원에 의해 야기되는 DNA 광손상을 감소시키기 위한 하나 이상의 산화방지제를 포함하는, 키트.
  59. 제38항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 고정화된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 고체 지지체를 추가로 포함하고, 상기 고체 지지체 상의 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드의 밀도는 약 100 k/㎟ 내지 약 300 k/㎟인, 키트.
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