KR102036430B1 - 긴 스토크스 이동을 갖는 폴리메틴 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 신규한 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도에 관한 것이다. 화합물은 핵산 서열분석 용도에서 뉴클레오타이드용의 형광 표지로서 사용될 수 있다. 표지는 이의 긴 스토크스 이동으로 인해 유리하다.

Description

긴 스토크스 이동을 갖는 폴리메틴 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도
본 개시내용은 신규한 폴리메틴 화합물 및 형광 마커로서의 이의 용도에 관한 것이다. 특히 화합물은 핵산 서열분석 혹은 서열결정(sequencing) 용도에서 뉴클레오타이드에 대한 형광 표지로서 사용될 수 있다.
본 개시내용이 속하는 당업계의 상황을 더욱 완전히 기술하기 위하여 여러 간행물 및 특허 문헌이 본 출원에서 참조된다. 이들 간행물 및 문헌의 각각의 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입된다.
형광 표지를 이용하는 핵산의 비방사성 검출은 분자 생물학에 중요한 기술이다. 기존에 재조합 DNA 기술에서 사용되는 많은 방법은, 예를 들어 32P로 방사성 표지된 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 사용에 크게 의존하였다. 방사성 화합물은 핵산 및 기타 관심 대상 분자의 민감한 검출을 허용한다. 그러나, 방사성 동위 원소의 사용에는, 비용, 제한된 유효 기간 및 보다 중요한 안전 고려 사항과 같은 심각한 제한이 있다. 방사성 표지에 대한 필요성을 없앰으로써, 예를 들어, 시약 처분과 연관된 환경 영향 및 비용을 줄이면서 안전성을 증대시킨다. 비방사성 형광 검출이 가능한 방법은, 비제한적인 예로서, 자동화된 DNA 서열분석, 혼성화(hybridization) 방법, 폴리머라제(polymerase) 연쇄 반응 생성물의 실시간 검출 및 면역검정을 포함한다.
많은 응용 분야에 있어서, 공간적으로 중복되는 복수의 분석물의 독립적인 검출을 달성하기 위해 다수의 스펙트럼으로 구별 가능한 형광 표지를 사용하는 것이 바람직하다. 그러나 다중 방법에서, 반응 용기의 수는 감소될 수 있으며, 실험 프로토콜을 단순화하고 용도-특정 시약 키트의 생산을 용이하게 한다. 예를 들어, 다중 색상 자동화 DNA 서열분석에서, 다중 형광 검출은 단일 전기영동 레인에서 다중 뉴클레오타이드 염기의 분석을 가능하게 하고, 이에 따라서 단일 색상 방법에 비해 처리량을 증가시키고, 레인간 전기영동 이동성 변화와 관련된 불확실성을 감소시킨다.
그러나, 다중 형광 검출은 문제가 될 수 있으며 형광 표지의 선택을 제한하는 많은 중요한 요소가 있다. 첫 번째로, 주어진 용도에서 발광 스펙트럼이 적절하게 스펙트럼으로 분해되는 염료 화합물을 찾는 것이 어려울 수 있다. 또한 여러 형광 염료가 함께 사용되는 경우, 동시 여기에 의해 구별 가능한 스펙트럼 영역에서 형광 신호를 생성하는 것이 어려울 수 있는데, 그 이유는 이 물질에 사용할 수 있는 염료의 흡수 밴드가 통상 널리 분리되어 있기 때문이고, 따라서, 두 염료에 대해서도 다소 동등한 형광 여기 효율을 달성하기 어렵다. 많은 여기 방법은 레이저와 같은 고전력 광원을 사용하므로, 염료는 그러한 여기를 견디기에 충분한 광-안정성을 가져야 한다. 분자 생물학 방법에서 특히 중요한 마지막 고려 사항은 형광 염료가 사용된 시약 화학 물질, 예를 들어 DNA 합성 용매 및 시약, 완충제, 중합 효소 및 리가제 효소와 양립해야 하는 정도이다.
서열분석 기술이 발전함에 따라, 추가의 형광 염료 화합물, 이의 핵산 접합체 및 염료 세트가 모두 상기 제약 조건을 충족시키며 특히 고체상 서열분석(solid phase sequencing) 등과 같은 고효율 분자 방법에 적합해야 할 필요성이 대두되고 있다.
형광 강도, 모양 및 형광 밴드의 최대 파장과 같은 개선된 형광 특성을 갖는 형광 염료 분자는 핵산 서열분석의 속도 및 정확도를 향상시킬 수 있다. 강한 형광 신호는, 대부분의 염료의 형광 강도가 이러한 조건에서 상당히 더 낮으므로 측정은 더 고온에서 그리고 수계 생물학적 완충액에서 행해질 때 특히 더 중요하다. 게다가, 염료가 부착된 염기의 성질은 또한 형광 최대, 형광 강도 및 기타 스펙트럼 염료 성질에 영향을 미친다. 핵염기와 형광 염료 사이의 서열 특이적 상호 작용은 형광 염료의 특정 설계에 따라서 맞춤화될 수 있다. 형광 염료의 구조의 최적화는 뉴클레오타이드 혼입(incorporation)의 효율성을 개선시키고, 서열분석 오류의 수준을 저감시키며 시약의 사용을 감소시키고, 따라서 핵산 서열분석의 비용을 감소시킬 수 있다.
특히 다수의 형광 표지의 검출의 개선점은 상이하고, 특히 통상의 스토크스 이동(Stokes shift)보다 더 큰 형광 염료를 사용하여 달성될 수 있다.
스토크스 이동은 동일한 전자 전이에 대해서 흡수 최대 파장과 방출 최대 파장 사이의 차이이다.
Figure 112018002329021-pct00001
가시 영역의 대부분의 형광 염료는 40㎚ 미만의 스토크스 이동을 갖고, 이는 가장 효율적인 여기 파장과 최대 방출 파장이 서로 상대적으로 가깝다는 것을 의미한다. 더 긴 스토크스 이동을 갖는 화합물은 방출 및 여기 파장이 더 멀리 떨어짐에 따라서 더 나은 신호 대 잡음비를 갖는다. 긴 스토크스 이동 염료는 또한 동일한 방출 채널을 사용하지만 상이한 여기 파장을 사용하여 2개의 상이한 표지가 개별적으로 검출되도록 한다. 예를 들어, 검출 측정은 550 내지 570㎚ 사이에서 기록될 수 있으며, 532㎚에서 여기되는 짧은 스토크스 이동을 갖는 제1 표지 및 긴 스토크스 이동을 갖고 450㎚에서 여기되는 제2 표지로부터 발생하는 신호를 검출할 수 있다.
본 명세서에는 긴 스토크스 이동을 갖는 개선된 폴리메틴 작제물 및 생체 분자 표지로서, 특히 핵산 서열분석에 사용되는 뉴클레오타이드에 대한 표지로서의 이의 용도가 기재되어 있다. 단일 검출 채널에서의 측정치를 검출할 때 새로운 형광 작제물을 사용하여 얻어질 수 있는 서열분석 판독치의 길이 및 표지된 뉴클레오타이드 혼입의 효율면에서 특히 개선이 보여질 수 있다.
제1 양상에 따르면, 본 개시내용은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 메소머 형태(mesomeric form)를 제공한다:
Figure 112018002329021-pct00002
식 중, mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기 양/음 하전된 상대이온이고,
m은 정수 0 내지 3이며;
Ra1은 H, SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 아미노 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이되, 여기서 고리는 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐 치환체를 함유할 수 있고;
Rb1은 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 아미노, COOH 또는 이들의 아마이드 또는 에스터이고 n은 0 내지 3이며;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고;
각각의 Rd1 및 Rd2는 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이며; 그리고
Re1은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; 여기서 Rc1, Rb1 또는 Re1 중 어느 하나는 COOH 또는 COO- 또는 이들의 아마이드 또는 에스터를 함유한다.
본 개시내용은 하기 화학식 (I')의 화합물 또는 이의 메소머 형태를 제공한다:
Figure 112018002329021-pct00003
식 중, mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기 양/음 하전된 상대이온이고,
m은 정수 0 내지 3이며;
x는 정수 0 내지 2이고;
Ra1은 H, SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 아미노 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이되, 여기서 고리는 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐 치환체를 함유할 수 있으며;
Rb1은 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 아미노, COOH 또는 이들의 아마이드 또는 에스터이고 n은 0 내지 3이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이며;
각각의 Rd1 및 Rd2는 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이고; 그리고
Re1은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; 여기서 Rc1, Rb1 또는 Re1 중 어느 하나는 COOH 또는 COO- 또는 이들의 아마이드 또는 에스터를 함유한다.
Re1이 알킬인 소정의 실시형태에 있어서, Rb1, Rc1은 COOH 또는 COO- 또는 이들의 아마이드 또는 에스터일 수 있다.
소정의 예에 있어서 n은, 페닐기기 비치환되도록 0일 수 있고, Re1은 COOH 또는 COO- 또는 이들의 아마이드 또는 에스터를 함유한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 화합물은, 예를 들어, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 탄수화물, 리간드, 입자, 세포, 반고체 표면(예컨대, 겔) 및 고체 표면과 같은 각종 기질 모이어티로 접합될 수 있다. 접합은 아마이드, 설폰아마이드 또는 에스터로 전환될 수 있는 Rc1, Re1 또는 Rb1 상의 카복시 또는 설폰산기를 통해서 수행될 수 있다.
따라서, 추가의 양상에 따르면, 예를 들어, 뉴클레오타이드와 같은 이러한 기질 모이어티에 공유 부착을 가능하게 하는 링커기를 포함하는 염료 화합물이 제공된다.
추가의 양상에 따르면, 본 개시내용은 식: N-L-염료로 정의되는 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 화합물을 제공하며, 여기서 N은 뉴클레오타이드이고, L은 선택적 링커 모이어티이며, 염료는 본 개시내용에 따른 형광 화합물이다.
뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 5- 트라이포스페이트일 수 있다.
추가의 양상에 있어서, 본 개시내용은 본 개시내용의 염료 화합물을 이용하는 서열분석 방법을 제공한다.
추가의 양상에 따르면, 본 개시내용은 또한 각종 면역 검정, 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 표지화에서 그리고 합성에 의한 DNA 서열분석에서 사용될 수 있는 염료 화합물(유리 또는 접합체 형태로)을 포함하는 키트를 제공한다. 또 다른 양상에 있어서, 본 개시내용은 자동화 기기 플랫폼 상에서의 합성에 의한 서열분석의 사이클에 특히 적합한 염료 '세트'를 포함하는 키트를 제공한다.
본 개시내용의 추가의 양상은 본 개시내용의 화합물의 화학적 제제이다.
본 개시내용은 형광 검출 및 합성에 의한 서열분석 방법에 특히 적합한 신규한 화합물을 제공한다. N-페닐 인돌 모이어티를 갖는 신규한 화합물은 N-알킬 유사체에 비해서 형광 최대 위치, 이의 강도 및 광안정성에서 유리하며, 따라서 소정의 핵산 서열분석 용도를 개선시킨다.
제1 양상에 따르면, 본 개시내용은 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 메소머 형태를 제공한다:
Figure 112018002329021-pct00004
식 중, mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기 양/음 하전된 상대이온이고,
m은 정수 0 내지 3이며;
Ra1은 H, SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이되, 여기서 고리는 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐 치환체를 함유할 수 있고;
Rb1은 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, COOH 또는 이들의 아마이드 또는 에스터이고 n은 0 내지 3이며;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고;
각각의 Rd1 및 Rd2는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며; 그리고
Re1은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; 여기서 Rb1 또는 Re1 중 어느 하나는 COOH 또는 COO- 또는 이들의 아마이드 또는 에스터를 함유한다.
본 개시내용은 하기 화학식 (I')의 화합물 또는 이의 메소머 형태를 제공한다:
Figure 112018002329021-pct00005
식 중, mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기 양/음 하전된 상대이온이고,
m은 정수 0 내지 3이며;
x는 정수 0 내지 2이고;
Ra1은 H, SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 아미노 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이되, 여기서 고리는 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐 치환체를 함유할 수 있으며;
Rb1은 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, 하이드록시, 알콕시, 아미노, COOH 또는 이들의 아마이드 또는 에스터이고 n은 0 내지 3이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이며;
각각의 Rd1 및 Rd2는 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이고; 그리고
Re1은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; 여기서 Rc1, Rb1 또는 Re1 중 어느 하나는 COOH 또는 COO- 또는 이들의 아마이드 또는 에스터를 함유한다.
사슬 x의 길이는 0, 1 또는 2일 수 있다. 사슬은 1개의 탄소 및 1개의 이중 결합, 3개의 탄소 및 2개의 이중 결합, 또는 5개의 탄소 및 3개의 이중 결합을 가질 수 있다. X는 사슬이 3개의 CH기를 함유하도록 1일 수 있다.
분자는 위치 Ra에서 설폰아마이드 또는 SO3 - 모이어티를 함유할 수 있다. Ra1은 설폰아마이드일 수 있다. 설폰아마이드는 SO2NH2 또는 SO2NHR일 수 있고, 여기서 R은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴기이다. Ra1은 H일 수 있다. Ra1은 SO3 -일 수 있다. Ra1은 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리일 수 있다. 고리는 치환될 수 있거나 또는 비치환될 수 있다. 고리는 1개 이상의 설폰아마이드 또는 SO3 - 기로 치환될 수 있다. 설폰아마이드는 SO2NH2 또는 SO2NHR일 수 있고, 여기서 R은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴기이다.
Ra1은 인돌 고리의 인접한 탄소에 융합된 추가의 지방족, 방향족 또는 복소환식 고리일 수 있다. 예를 들어, 이러한 경우에, 방향족 고리가 융합된 경우 염료말단기는 하기 유형의 구조를 나타낼 수 있다:
Figure 112018002329021-pct00006
여기서 Rf는 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 할로겐, 카복시, 설폰아마이드, 또는 설폰산일 수 있다. 이러한 구조에 있어서 Rf는 여러 번 나타날 수 있고, 예를 들어 Rf는 H 및 SO3 - 둘 다일 수 있거나, 또는 다수의 SO3 -기일 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 염료는 화학식 (1A) 또는 (1A')로 기재될 수 있다:
Figure 112018002329021-pct00007
Figure 112018002329021-pct00008
식 중, mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기 양/음 하전된 상대이온이고,
m은 정수 0 내지 3이며;
x는 정수 0 내지 2이고;
Rb1은 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, COOH 또는 이들의 아마이드 또는 에스터이고 n은 0 내지 3이며;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고;
각각의 Rd1 및 Rd2는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
Re1은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; 여기서 Rb1 또는 Re1 중 어느 하나는 COOH 또는 COO- 또는 이들의 아마이드 또는 에스터를 포함하며; 그리고
Rf는 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 할로겐, 카복시, 설폰아마이드, 또는 설폰산 중 1개 이상일 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 염료는 하기 화학식 (IB) 또는 (IB')로 기재될 수 있다:
Figure 112018002329021-pct00009
Figure 112018002329021-pct00010
식 중, mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기 양/음 하전된 상대이온이고,
m은 정수 0 내지 3이며;
x는 정수 0 내지 2이고;
Rb1은 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, COOH 또는 이들의 아마이드 또는 에스터이고 n은 0 내지 3이며;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고;
각각의 Rd1 및 Rd2는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
Re1은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이며; Rb1 또는 Re1 중 어느 하나는 COOH 또는 COO- 또는 이들의 아마이드 또는 에스터를 함유한다.
따라서, 본 개시내용의 염료는 하기 화학식 (IC) 또는 (IC')으로 기재될 수 있다:
Figure 112018002329021-pct00011
Figure 112018002329021-pct00012
식 중, mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기 양/음 하전된 상대이온이고
m은 정수 0 내지 3이며;
x는 정수 0 내지 2이고;
Rb1은 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, COOH 또는 이들의 아마이드 또는 에스터이고 n은 0 내지 3이며;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고;
각각의 Rd1 및 Rd2는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
Re1은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; 여기서 Rb1 또는 Re1 중 어느 하나는 COOH 또는 COO- 또는 이들의 아마이드 또는 에스터를 함유한다.
따라서 본 개시내용의 염료는 하기 화학식 (ID) 또는 (ID')으로 기재될 수 있다:
Figure 112018002329021-pct00013
Figure 112018002329021-pct00014
식 중, mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기 양/음 하전된 상대이온이고,
m은 정수 0 내지 3이며;
x는 정수 0 내지 2이고;
q는 1 내지 6이며;
Rb1은 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, COOH 또는 이들의 아마이드 또는 에스터이고 n은 0 내지 3이며;
Rc2는 알킬 또는 치환된 알킬이고;
각각의 Rd1 및 Rd2는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
Re1은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; 여기서 Rb1 또는 Re1 중 어느 한쪽은 COOH 또는 COO- 또는 이들의 아마이드 또는 에스터를 포함한다.
따라서 본 개시내용의 염료는 하기 화학식 (IE) 또는 (IE')에 의해 기재될 수 있다:
Figure 112018002329021-pct00015
Figure 112018002329021-pct00016
식 중, mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기 양/음 하전된 상대이온이고,
m은 정수 0 내지 3이며;
x는 정수 0 내지 2이고;
q는 1 내지 6이며;
Rb1은 SO3 -, 설폰아마이드 또는 할로겐이고, n은 0 내지 3이며;
Rc2는 알킬 또는 치환된 알킬이고;
각각의 Rd1 및 Rd2는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
Re1은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이고; 그리고
X는 OH, O- 또는 에스터 또는 아마이드이다.
카복시기 또는 이의 유도체는 위치 Rb1, Rc1 또는 Re1 중 어느 하나에 부착된다. Rb1에 부착된 경우, Re1은 비치환된 알킬, 또는 1개 이상의 치환기를 가진 알킬일 수 있다. COOH기는 추가의 부착을 위하여 연결 모이어티로서 작용할 수 있거나, 또는 일단 추가의 분자에 연결된다. 일단 접합이 일어났다면, COOH 또는 COO-는 아마이드 또는 에스터로 전환된다.
대안적으로, Rc1은 카복시기를 함유할 수 있다. 카복시기는 치환된 알킬 링커, 예를 들어, 길이 q의 알킬 사슬을 통해서 부착될 수 있고, 여기서 q는 1 내지 6개의 탄소 또는 헤테로-원자이다. 이 사슬은 (CH2)q일 수 있고, 여기서 q는 1 내지 6이다. 이 기는 (CH2)4COOH일 수 있다.
대안적으로, Re1은 카복시기를 함유할 수 있다. 카복시기는 치환된 알킬 링커, 예를 들어, 길이 n의 알킬 사슬을 통해서 부착될 수 있고, 여기서 n은 1 내지 5개의 탄소 또는 헤테로-원자이다. 이 사슬은 (CH2)n일 수 있고, 여기서 n은 1 내지 5이다. 이 기는 (CH2)5COOH일 수 있다. 대안적으로 Re1의 일부로서 아릴기가 있을 수 있다. Re1은 추가의 알킬 사슬에 또는 이를 통해서 직접 부착된 카복시를 가진 임의의 아릴기일 수 있다. Re1은 CH2COOH 또는 CH2COO- 또는 이들의 아마이드 또는 에스터로 치환된 아릴기일 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 화학식에서, 모이어티
Figure 112018002329021-pct00017
는
Figure 112018002329021-pct00018
의 형태를 취할 수 있다:
여기서, 각각의 Rd1 및 Rd2는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이고;
각각의 n은 독립적으로 0 내지 6이며; 그리고
X는 OH, O- 또는 에스터 또는 아마이드이다.
카복시기가 Re1에 부착된 경우, n은 0일 수 있다. 대안적으로 하나 이상의 기가 고리 상에 존재할 수 있고, 예를 들어 n은 1일 수 있고, Rb1은 할로겐, 설폰아마이드 또는 SO3 -일 수 있다. 일반적으로 화합물은, 접합 반응이 다수의 COOH 모이어티를 통해서 일어날 수 없으므로 두 위치 Rb1 및 Re1에서 동시에 카복시기를 갖지 않을 것이다.
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 카복시, 아미노, 아미도, 설포 또는 설폰아미도기로 치환될 수 있다. 분자는 위치 Rc에서 1개 이상의 알킬-설포네이트 모이어티를 함유할 수 있다. Rc1 및/또는 Rc2는 알킬-SO3 -일 수 있다. 다른 Rc(Rc1 또는 Rc2)는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬일 수 있다. Rc1 및 Rc2는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 또는 (CH2)qSO3H일 수 있고, 여기서 q는 1 내지 6이다. q는 1 내지 4일 수 있다. q는 4일 수 있다. Rc1 및 Rc2는 치환된 알킬기일 수 있다. Rc1 및 Rc2는 COOH 또는 -SO3H 모이어티 또는 이들의 에스터 또는 아마이드 유도체를 함유할 수 있다.
각각의 Rd1 및 Rd2는 독립적으로 H 또는 메틸일 수 있다. Rd1 및 Rd2는 동일 또는 상이할 수 있다. 일반적으로, Rd1 및 Rd2는 분자 내에 비대칭을 도입하는 것을 피하기 위하여 동일할 것이다. Rd1 및 Rd2는 둘 다 H일 수 있다. Rd1 및 Rd2는 둘 다 메틸일 수 있다.
화합물의 예는 하기 화학식(II)에 따른 구조 또는 이의 염을 포함한다:
Figure 112018002329021-pct00019
식 중, mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기 양/음 하전된 상대이온이고,
m은 정수 0 내지 3이며;
각각의 n은 독립적으로 0 내지 6이고;
Ra1은 H, SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이되, 여기서 고리는 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐 치환체를 함유할 수 있으며;
Rb1은 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, COOH 또는 이들의 아마이드 또는 에스터이고 n은 0 내지 3이고; 그리고
X는 OH, O- 또는 에스터 또는 아마이드이다.
화합물의 추가의 예는 하기 화학식(IIIa) 내지 (IIIc)에 따른 구조를 포함한다:
Figure 112018002329021-pct00020
Figure 112018002329021-pct00021
Figure 112018002329021-pct00022
화합물의 예는 하기 화학식(IV)에 따른 구조 또는 이의 염을 포함한다:
Figure 112018002329021-pct00023
식 중, mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기 양/음 하전된 상대이온이고,
m은 정수 0 내지 3이며;
Ra1은 H, SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이되, 여기서 고리는 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐 치환체를 함유할 수 있고;
Rb1은 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, 또는 이들의 아마이드 또는 에스터이고 n은 0 내지 3이며;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고;
각각의 Rd1 및 Rd2는 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;
X는 OH, O- 또는 에스터 또는 아마이드이고;
Y는 O, S 또는 N로부터 선택된 헤테로원자이며; 그리고
각각의 Rf1, Rf2, Rf3은 독립적으로 알킬 또는 아릴기이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물은 50㎚ 초과의 스토크스 이동을 갖는다. 스토크스 이동은 100㎚ 초과, 또는 심지어 150 초과일 수 있다.
특히 유용한 화합물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 염료로 표지된 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드이다.
표지된 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드는 아마이드를 형성하기 위하여 카복시기를 통해서 표지를 가질 수 있다. 표지된 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드는 링커 모이어티를 통해서 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자 퓨린 염기의 C7 위치에 부착된 표지를 가질 수 있다.
표지된 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드는 또한 뉴클레오타이드의 리보스 또는 데옥시리보스 당에 공유 부착된 차단기(blocking group)를 가질 수 있다. 차단기는 리보스 또는 데옥시리보스 당 상의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 차단기는 뉴클레오타이드의 리보스 또는 데옥시리보스 당의 3' OH 위치에 있다.
본 명세서에서는 2종 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 키트가 제공되되, 여기서 적어도 1종의 뉴클레오타이드는 본 개시내용의 화합물로 표지된 뉴클레오타이드이다. 키트는 2종 이상의 표지된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 2개 이상의 형광 표지로 표지될 수 있다. 2개 이상의 표지는 레이저 또는 LED일 수 있는 단일의 여기 광원을 사용하여 여기될 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 표지에 대한 여기 밴드는 스펙트럼의 중첩 영역에서의 여기가 두 표지로 하여금 형광을 방출시키게끔 적어도 부분적으로 중첩될 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 2개 이상의 표지로부터의 방출은 적어도 하나의 표지의 존재가 방출을 광학적으로 구별함으로써 결정될 수 있도록 스펙트럼의 상이한 영역에서 일어날 것이다.
뉴클레오타이드는 2개 이상의 형광 표지로 표지될 수 있다. 2개 이상의 표지는, 상이한 파장에서의 상이한 여기 광원을 이용해서 여기될 수 있고, 여기서의 광원은 레이저일 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 표지에 대한 방출 밴드는 스펙트럼의 중첩 영역에서의 방출이 두 표지로 하여금 동일 검출 파장에서 형광을 방출시키게끔 적어도 부분적으로 중첩될 수 있다. 각각의 표지는 여기 파장 중 하나에 의해서 단지 여기되고, 따라서 염료는 이의 별도의 여기 프로파일로 인해 개별적으로 검출 가능하다. 특정 실시형태에 있어서, 2개 이상의 표지로부터의 여기는 표지 중 적어도 하나의 존재가 여기를 광학적으로 구별함으로써 결정될 수 있도록 스펙트럼의 상이한 영역에서 일어날 것이다.
이러한 프로파일링은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물을 이용해서 기재된 바와 같이, 긴 스토크스 이동을 가진 표지를 이용해서 단지 수행될 수 있다.
일단 두 표지가 구별될 수 있다면, 4개의 개별의 뉴클레오타이드가 단지 2개의 표지를 사용해서 확인될 수 있다. 뉴클레오타이드 1은 표지 1로 표지될 수 있다. 뉴클레오타이드 2는 표지 2로 표지될 수 있다. 뉴클레오타이드 3은 표지 1과 표지 2 둘 다의 혼합물로 표지될 수 있고, 뉴클레오타이드 4는 미표지될 수 있다(흑색)
따라서 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같이 표지된 뉴클레오타이드 화합물, 및 동일 파장에서 방출을 갖지만 더 낮은 스토크스 이동을 갖는 추가의 표지된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서는 4개의 뉴클레오타이드를 포함하는 키트가 제공되되, 여기서 제1 뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지된 뉴클레오타이드이고, 제2 뉴클레오타이드는 제1 표지된 뉴클레오타이드와 동일한 파장에서 방출되는 표지로 표지되며, 제3 뉴클레오타이드는 표지들의 혼합물로 표지되고, 제4 뉴클레오타이드는 제4 표지된 뉴클레오타이드의 각각이 서로로부터 구별 가능하게 되도록 미표지되어 있다.
키트는 4개의 표지된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있고, 여기서 4개의 뉴클레오타이드 중 제1 뉴클레오타이드는 본 명세서에 개시된 바와 같은 화합물로 표지된다. 이러한 키트에서, 제2, 제3 및 제4 뉴클레오타이드는 각각, 경우에 따라 제1 뉴클레오타이드 상의 표지와는 상이하고 경우에 따라 서로 상의 표지와는 상이한 화합물로 표지될 수 있다. 따라서, 화합물 중 1종 이상은 화합물(들)이 다른 화합물과 구별 가능하도록 개별의 흡광 최대 및/또는 방출 최대를 가질 수 있다. 예를 들어, 각각의 화합물은 각각의 화합물이 다른 3종의 화합물과 구별 가능하도록 개별의 흡광 최대 및/또는 방출 최대를 가질 수 있다. 최대 이외의 흡광 스펙트럼 및/또는 방출 스펙트럼의 일부는 상이할 수 있고 이들 차이는 화합물을 구별하는데 이용될 수 있음이 이해될 것이다. 키트는 2종 이상의 화합물이 600㎚ 초과의 개별의 흡광 최대를 갖도록 할 수 있다. 본 발명의 화합물은 전형적으로 500㎚ 미만의 광을 흡수하지만, 600㎚ 초과의 파장에서 광을 방출한다.
본 명세서에서 제시된 화합물, 뉴클레오타이드 또는 키트는 생물학적 시스템(예컨대, 이의 공정 또는 성분 포함)을 검출, 측정 또는 확인하는데 사용될 수 있다. 화합물, 뉴클레오타이드 또는 키트를 이용할 수 있는 예시적인 기술은 서열분석, 발현 분석, 혼성화 분석, 유전자 분석, RNA 분석, 세포 검정(예컨대, 세포 결합 또는 세포 기능 분석), 또는 단백질 검정(예컨대, 단백질 결합 검정 또는 단백질 활성 검정)을 포함한다. 사용은 자동화 서열분석 기기와 같은 특정 기술을 이용하기 위하여 자동화된 기기 상에서 이루어질 수 있다. 서열분석 기기는 상이한 파장에서 작동하는 2개의 레이저를 포함할 수 있다. 서열분석 기기는 단일의 방출 채널을 가질 수 있고, 따라서 다수의 방출 필터에 대한 필요성을 저감시키거나 회피할 수 있다. 검출 시스템은 고정된 방출 파장에서 설정된 단일 검출 채널을 가질 수 있다.
본 명세서에는 본 개시내용의 화합물을 합성하는 방법이 개시되어 있다.
Figure 112018002329021-pct00024
신규한 염료의 합성을 가능하게 하는, 신규한 출발 물질, 예를 들어, (SM2)는 본 개시내용에 따라서 제조된다.
하기 화학식 (X)의 화합물 또는 이의 염은 폴리메틴 염료 또는 이의 염의 합성을 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다:
Figure 112018002329021-pct00025
식 중, Ra1은 H, SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이되, 여기서 고리는 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐 치환체를 함유할 수 있고;
Rb1은 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐 또는 COOH이고 n은 0 내지 3이며;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고; 그리고
각각의 Rd1 및 Rd2는 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이다.
하기 화학식 (X')의 화합물 또는 이의 염은 폴리메틴 염료의 합성을 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다:
Figure 112018002329021-pct00026
식 중, x는 0 내지 2이고; Ra1은 H, SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이되, 여기서 고리는 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐 치환체를 함유할 수 있으며;
Rb1은 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐 또는 COOH이고, n은 0 내지 3이며;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고; 그리고
각각의 Rd1 및 Rd2는 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "알킬"은 C1-C10 탄화수소를 지칭하고 C3-C10 비방향족 탄소환식 고리를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 알킬기는 각각 1개 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 포화, 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭하는 C1-C6 알킬이다. 알킬기는 1개 이상의 불포화 기를 포함할 수 있고, 따라서 알켄일 및 알킨일을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "할로겐"은 플루오로-(이하 F로서 지칭됨), 클로로-(이하 Cl로서 지칭됨), 브로모-(이하 Br로서 지칭됨) 또는 요오도-(이하 I로서 지칭됨)를 지칭하며, 통상 유기 화합물 중 수소 원자에 대한 치환에 관련되며, 이 치환은 경우에 따라 수소에 대한 전체 치환이다.
용어 "치환된 알킬"은, 경우에 따라서, 제한 없이, 할로, 사이아노, SO3 -, SRa, ORa, NRbRc, 옥소, CONRbRc, COOH 및 COORb로 더 치환될 수 있는, 위에서 정의된 바와 같은 알킬, 알켄일 또는 알킨일기를 지칭한다. Ra, Rb 및 Rc는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 치환된 알켄일, 알킨일, 치환된 알킨일, 아릴 및 치환된 아릴로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 치환된 알킬, 치환된 알켄일 및 치환된 알킨일에는 경우에 따라 O, NRb, S(O)t(여기서 t는 0 내지 2임) 등으로부터 선택된 적어도 1개의 헤테로 원자 또는 기가 개입될 수 있다. 치환된 알킬은 또한 알킬기가 추가의 아릴 또는 치환된 아릴 모이어티를 포함하는 벤질과 같은 기를 포함한다.
본 개시내용에 따른 염료는 N-페닐 인돌을 비롯하여 다양한 상이한 출발 물질로부터 합성될 수 있다. 폴리메틴 염료를 제조하는 방법은 당업계에 충분히 공지되어 있다.
본 개시내용의 양상에 따르면, 특히 기질 모이어티에의 부착을 가능하게 하는 링커기를 포함하는, 기질 모이어티에의 부착에 적합한 염료 화합물이 제공된다. 기질 모이어티는 사실상 본 개시내용의 염료가 접합될 수 있는 임의의 분자 또는 물질일 수 있고, 비제한적인 예로서, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 탄수화물, 리간드, 입자, 고체 표면, 유기 및 무기 중합체, 염색체, 핵, 생세포 및 이들의 조합 또는 조립체를 포함할 수 있다. 염료는 소수성 인력, 이온성 인력 및 ?유 부착을 비롯한 다양한 수단에 의해 선택적 링커에 의해 접합될 수 있다. 특히 염료는 공유 부착에 의해 기질에 접합된다. 더욱 특히, 공유 부착은 링커기에 의한 것이다.
기질에 염료 화합물의 접합은 카복실기 Rb1을 통해서 또는 Re1의 일부로서 수행될 수 있고, 아마이드 또는 에스터로 전환될 수 있다.
본 개시내용에 따른 염료는 다른 분자에 염료의 공유 부착을 위하여 치환기 위치 중 하나에서 반응성 링커기를 포함할 수 있다. 반응성 링커기는 결합(예컨대, 공유 또는 비공유 결합)을 형성할 수 있는 모이어티이다. 특정 실시형태에 있어서, 링커는 절단 가능한 링커일 수 있다. 용어 "절단 가능한 링커"의 사용은 전체 링커가 제거될 필요가 있는 것을 나타내도록 의미하는 것은 아니다. 절단 부위는 절단 후에 염료 및/또는 기질 모이어티에 부착된 나머지 링커의 일부를 초래하는 링커 상의 위치에 위치될 수 있다. 절단 가능한 링커는, 비제한적인 예로서, 친전자적으로 절단 가능한 링커, 효소적으로 절단 가능한 링커, 친핵체적으로 절단 가능한 링커, 광절단 가능한 링커, 환원성 조건(예를 들어, 다이설파이드 또는 아자이드 함유 링커), 산화 조건 하에 절단 가능한 링커, 안전장치(safety-catch) 링커의 사용을 통해서 절단 가능한 링커 및 제거 기구에 의해 절단 가능한 링커일 수 있다. 기질 모이어티에 염료 화합물을 부착하는 절단 가능한 링커의 사용은, 예를 들어, 검출 후에, 표지를 제거하는 선택지를 제공하며, 이에 따라서 하류 단계들에서 임의의 방해 신호를 회피한다.
유용한 링커기는 링커를 포함하는 PCT 공개 번호 WO2004/018493(참고로 본 명세서에 편입됨)의 실시예에서 찾을 수 있으며, 그 예는 수용성 포스핀 또는 전이금속과 적어도 부분적으로 수용성인 리간드로부터 형성된 수용성 전이금속 촉매를 사용해서 절단될 수 있는 링커를 포함한다. 수용액에서, 후자는 적어도 부분적으로 수용성 전이금속 착물을 형성한다. 이러한 절단 가능한 링커는 본 명세서에서 제시된 염료와 같은 표지에 뉴클레오타이드의 염기를 연결하는데 사용될 수 있다.
특정 링커는 하기 화학식의 모이어티를 포함하는 것들과 같은 PCT 공개 번호 WO2004/018493(참고로 본 명세서에 편입됨)에서 찾을 수 있다:
Figure 112018002329021-pct00027
Figure 112018002329021-pct00028
(식 중 X는 O, S, NH 및 NQ를 포함하는 군으로부터 선택되되, 여기서 Q는 C1-10 치환된 또는 비치환된 알킬기이고, Y는 O, S, NH 및 N(알릴)을 포함하는 군으로부터 선택되고, T는 수소 또는 C1-C10 치환된 또는 비치환된 알킬기이며, *는 모이어티가 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드의 나머지에 연결되는 것을 나타낸다).
특정 실시형태에 있어서, 형광 염료(형광단)와 구아닌 염기 사이의 링커의 길이는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 스페이서기를 도입함으로써, 당업계에 공지된 다른 연쇄를 통해서 구아닌 염기에 부착된 동일 형광단에 비해서 형광 강도를 증가시킴으로써 변경될 수 있다. 예시적인 링커 및 이의 특성은 WO07020457로서 공개된 영국 특허 출원 제0517097.2호(참고로 본 명세서에 편입됨)에 제시되어 있다. 링커의 설계 및 특히 이의 증가된 길이는, DNA와 같은 폴리뉴클레오타이드에 혼입 시 구아노신 뉴클레오타이드의 구아닌 염기에 부착된 형광단의 밝기의 증가를 허용할 수 있다. 따라서, 염료가 구아닌-함유 뉴클레오타이드에 부착된 형광 염료 표지의 검출을 이용하는 분석의 임의의 방법에서 사용하기 위한 것일 경우, 예를 들어 WO07020457에 기재된 바와 같이, 화학식 -((CH2)2O)n-의 스페이서기를 가진 링커를 이용하는 것이 유리할 수 있으며, 여기서 n은 2 내지 50의 정수이다.
본 개시내용은 본 명세서에 제시된 하나 이상의 염료로 표지된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드의 접합체(변형된 뉴클레오타이드)를 더 제공한다. 표지된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는, 예컨대, 비제한적인 예로서, PCR 증폭, 등온 증폭, 고체상 증폭, 폴리뉴클레오타이드 서열분석(예컨대, 고체상 서열분석), 틈 번역 반응(nick translation reaction) 등에서와 같이 효소 합성에 의해 형성된 폴리뉴클레오타이드를 표지화하는데 유용하다.
뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 당 또는 핵염기 상의 부위에 표지될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, "뉴클레오타이드"는 질소성 염기, 당, 및 하나 이상의 포스페이트기로 구성된다. RNA에서, 당은 리보스이고, DNA에서는 데옥시리보스, 즉, 리보스에 존재하는 하이드록실기를 결여하는 당이다. 질소성 염기는 퓨린 또는 피리미딘의 유도체이다. 퓨린은 아데닌(A) 또는 구아닌(G)일 수 있고, 피리미딘은 시토신(C), 티민(T) 또는 RNA의 맥락에서, 유라실(U)일 수 있다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다. 뉴클레오타이드는 또한 뉴클레오사이드의 포스페이트 에스터이며, 에스터화는 당의 C-3 또는 C-5에 부착된 하이드록실기 상에서 일어난다. 뉴클레오타이드는 통상 모노-, 다이- 또는 트라이포스페이트이다.
"뉴클레오사이드"는 뉴클레오타이드와 구조적으로 유사하지만, 포스페이트 모이어티를 누락하고 있다. 뉴클레오사이드 유사체의 일례는 표지가 염기에 연결되고 당 분자에 부착된 포스페이트기가 없는 것일 것이다.
염기가 통상 퓨린 또는 피리미딘으로서 지칭되지만, 당업자라면, 왓슨-크릭 염기 짝짓기(Watson-Crick base pairing)를 거치도록 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드의 능력을 변경하지 않는 유도체 및 유사체가 이용 가능하다는 것이 이해될 것이다. "유도체" 또는 "유사체"는, 코어 구조가 모 화합물의 것과 밀접하게 닮거나 또는 동일하지만 화학적 또는 물리적 변형, 예컨대, 상이한 또는 추가의 곁 기를 갖고, 유도체 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드가 다른 분자에 연결될 수 있게 하는 화합물 또는 분자를 의미한다. 예를 들어, 염기는 데아자퓨린일 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 유도체는 왓슨-크릭 짝짓기를 거칠 수 있다. "유도체" 및 "유사체"는 또한 예를 들어, 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 갖는 합성 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 유도체를 포함한다. 이러한 유도체 및 유사체는, 예를 들어, 문헌[Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) 및 Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990]에 논의되어 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 또한 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 알킬-포스포네이트, 포스포라닐리데이트, 포스포라미데이트 연쇄 등을 비롯한 변형된 포스포다이에스터 연쇄를 가질 수 있다.
염료는, 예를 들어, 링커를 통해서 뉴클레오타이드 염기 상의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 특정 실시형태에 있어서 왓슨- 크릭 염기 짝짓기는 또한 얻어지는 유사체에 대해서 수행될 수 있다. 특정 핵염기 표지화 부위는 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자 퓨린 염기의 C7 위치를 포함한다. 위에서 논의된 바와 같이, 링커기는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드에 염료를 공유 부착시키는데 사용될 수 있다.
특정 실시형태에 있어서 표지된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 효소적으로 혼입 가능하고 효소적으로 연장 가능할 수 있다. 따라서 링커 모이어티는 화합물에 뉴클레오타이드를 연결하는 충분한 길이일 수 있으므로, 화합물은 핵산 복제 효소에 의한 뉴클레오타이드의 전체적인 결합 및 인식을 유의하게 간섭하지 않는다. 따라서, 링커는 또한 스페이서 유닛을 포함할 수 있다. 스페이서는, 예를 들어, 절단 부위 또는 표지로부터 뉴클레오타이드 염기를 이격시킨다.
본 개시내용의 염료로 표지된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 하기 화학식을 가질 수 있다:
Figure 112018002329021-pct00029
.
염료가 본 개시내용에 따른 염료 화합물인 경우, B는 핵염기, 예를 들어, 유라실, 티민, 시토신, 아데닌, 구아닌 등이고, L은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 선택적 링커기이다. R'은 H, 모노포스페이트, 다이포스페이트, 트라이포스페이트, 티오포스페이트, 스페이트 에스터 유사체, 반응성 인 함유 기에 부착된 -O- 또는 차단기에 의해 보호된 -O-일 수 있다. R''은 H, OH, 포스포라미다이트 또는 3'OH 차단기일 수 있고, R'''은 H 또는 OH이다.
R''가 포스포라미다이트인 경우, R'은 자동화 합성 조건 하에서 후속의 단량체 커플링을 허용하는 산-절단 가능한 하이드록실 보호기이다.
특정 실시형태에 있어서, 차단기는 염료 화합물과 분리되고 독립적이며, 즉, 이에 직접 부착되지 않는다. 대안적인 실시형태에 있어서, 염료는 3'OH 차단기의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 따라서, R''은 본 명세서에 개시된 염료 화합물을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있는 3'OH 차단기일 수 있다.
또 다른 대안적인 실시형태에 있어서, 오탄당의 3' 탄소 상에 차단기가 없고, 예를 들어, 염기에 부착된 염료(또는 염료 및 링커 작제물)는, 추가의 뉴클레오타이드의 혼입에 대한 차단부로서 작용하기에 충분한 크기 또는 구조일 수 있다. 따라서 차단부는 입체 장애로 인한 것일 수 있거나 또는 염료가 당의 3' 위치에 부착되든지 간에 크기, 전하 및 구조의 조합에 의한 것일 수 있다.
또 다른 대안적인 실시형태에 있어서, 차단기는 오탄당의 2' 또는 4' 탄소 상에 존재하며 추가의 뉴클레오타이드의 혼입에 대한 차단부로서 작용하기에 충분한 크기 또는 구조일 수 있다. 차단기의 사용은 변형된 뉴클레오타이드가 혼입된 경우 연장을 중지시키는 등에 의해서 중합이 제어되는 것을 가능하게 한다. 차단 효과가 예를 들어 비제한적인 예로서 화학적 조건의 변경에 의해 또는 화학적 차단부의 제거에 의해서 가역적인 경우, 연장은 소정의 지점에서 중지될 수 있고 이어서 계속되도록 허용될 수 있다.
다른 특정 실시형태에 있어서, 3'OH 차단기는 WO2004/018497(참고로 본 명세서에 편입됨)에 개시된 모이어티를 포함할 것이다. 예를 들어, 차단기는 아자이도메틸(CH2N3) 또는 알릴일 수 있다.
특정 실시형태에 있어서, (염료와 뉴클레오타이드 사이의) 링커 및 차단기는 둘 다 존재하고 개별의 모이어티이다. 특정 실시형태에 있어서, 링커 및 차단기는 둘 다 실질적으로 유사한 조건 하에서 절단 가능하다. 따라서, 탈보호 및 디블로킹(deblocking) 공정은 단지 단일 처리가 염료 화합물 및 차단부 둘 다를 제거하는데 요구될 것이므로 더욱 효과적일 수 있다. 그러나, 몇몇 실시형태에 있어서, 링커 및 차단기는, 별개의 조건 하에서 개별적으로 절단 가능한 대신에, 유사한 조건 하에서 절단 가능할 필요는 없다.
본 개시내용은 또한 염료 화합물을 혼입하는 폴리뉴클레오타이드를 포괄한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 포스포다이에스터 연쇄에서 연결된 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드의 각각으로 구성된 DNA 또는 RNA일 수 있다. 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드는, 본 개시내용의 변형된 뉴클레오타이드 이외의 자연 발생형 뉴클레오타이드, 비자연 발생형(또는 변형된) 뉴클레오타이드 또는 이들의 임의의 조합을, 본 명세서에 제시된 (예컨대, 염료 화합물로 표지된) 적어도 1종의 변형된 뉴클레오타이드와 조합하여 포함할 수 있다. 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오타이드는 또한 비천연 골격 연쇄 및/또는 비-뉴클레오타이드 화학적 변형을 포함할 수 있다. 본 개시내용에 따른 적어도 1종의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 리보뉴클레오타이드와 데옥시리보뉴클레오타이드의 혼합물로 구성된 키메라 구조가 또한 상정된다.
본 개시내용에 따른 염료 화합물을 포함하는 변형된 뉴클레오타이드(또는 뉴클레오사이드)는, 그 자체이든지 보다 큰 분자 구조 또는 접합체 내에 혼입되든지 또는 이와 연관되든지 간에, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드에 부착된 형광 표지의 검출을 포함하는 방법과 같은 임의의 분석 방법에서 사용될 수 있다. 이 맥락에서, 용어 "폴리뉴클레오타이드 내로 혼입된"은, 5' 포스페이트가 포스포다이에스터 연쇄를 제2 (변형된 또는 비변형된) 뉴클레오타이드의 3' 하이드록실기에 연결하는 것을 의미할 수 있고, 이것은 그 자체로 더 긴 폴리뉴클레오타이드 사슬의 일부를 형성할 수 있다. 본 명세서에 제시된 변형된 뉴클레오타이드의 3' 말단은 추가의 (변형된 또는 비변형된) 뉴클레오타이드의 5' 포스페이트에 대한 포스포다이에스터 연쇄에서 연결될 수 있거나 연결되지 않을 수 있다. 따라서, 하나의 비제한적인 실시형태에 있어서, 개시내용은 폴리뉴클레오타이드에 혼입된 변형된 뉴클레오타이드를 검출하는 방법을 제공하되, 이 방법은 (a) 폴리뉴클레오타이드에 본 개시내용의 적어도 1종의 변형된 뉴클레오타이드를 혼입시키는 단계 및 (b) 상기 변형된 뉴클레오타이드(들)에 부착된 염료 화합물로부터 형광 신호를 검출함으로써 폴리뉴클레오타이드에 혼입된 변형된 뉴클레오타이드(들)를 검출하는 단계를 포함한다.
이 방법은 본 개시내용에 따른 1종 이상의 변형된 뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드에 혼입되는 합성 단계 (a) 및 폴리뉴클레오타이드에 혼입된 1종 이상의 변형된 뉴클레오타이드(들)가 그들의 형광을 검출하거나 정량적으로 측정함으로써 검출되는 검출 단계 (b)를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 일 실시형태에 있어서, 적어도 1종의 변형된 뉴클레오타이드는 폴리머라제 효소의 작용에 의해 합성 단계에서 폴리뉴클레오타이드에 혼입된다. 그러나, 예를 들어 화학적 올리고뉴클레오타이드 합성 또는 표지된 올리고뉴클레오타이드의 비표지된 올리고뉴클레오타이드에의 결찰과 같은, 폴리뉴클레오타이드에 변형된 뉴클레오타이드를 연결하는 다른 방법이 사용될 수 있다. 따라서, 용어 "혼입하는"은, 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 사용될 경우, 효소적 방법뿐만 아니라 화학적 방법에 의한 폴리뉴클레오타이드 합성을 포괄할 수 있다.
특정 실시형태에 있어서, 합성 단계가 수행되며, 경우에 따라 본 개시내용의 형광 표지된 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물로 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥을 항온처리하는 단계를 포함할 수 있다. 폴리머라제가 또한 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥에 어닐링된 폴리뉴클레오타이드 가닥 상의 유리 3' 하이드록실기와 변형된 뉴클레오타이드 상의 5' 포스페이트기 사이에 포스포다이에스터 연쇄의 형성을 허용하는 조건 하에서 제공될 수 있다. 따라서, 합성 단계는 주형 가닥에 뉴클레오타이드의 상보적 염기-짝짓기에 의해 지향되는 바와 같이 폴리뉴클레오타이드 가닥의 형성을 포함할 수 있다.
본 방법의 모든 실시형태에 있어서, 검출 단계는 변형된 뉴클레오타이드가 혼입되는 폴리뉴클레오타이드 가닥이 주형 가닥에 어닐링되는 동안 또는 두 가닥이 분리되는 변성 단계 후에 수행될 수 있다. 추가의 단계, 예를 들어 화학적 또는 효소적 반응 단계 또는 정제 단계가 합성 단계와 검출 단계 사이에 포함될 수 있다. 특히, 변형된 뉴클레오타이드(들)를 혼입하는 표적 가닥은 단리 또는 정제될 수 있고, 이어서 더 가공처리되거나 후속의 분석에서 더 사용될 수 있다. 예로써, 합성 단계에서 변형된 뉴클레오타이드(들)로 표시된 표적 폴리뉴클레오타이드는 후속적으로 표지된 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 제시된 합성 단계의 생성물은 추가의 반응 단계를 거칠 수 있고, 필요한 경우, 이들 후속 단계의 생성물은 정제 또는 단리될 수 있다.
합성 단계용의 적합한 조건은 표준 분자 생물학 기술과 친밀한 자에게 잘 알려져 있을 것이다. 일 실시형태에 있어서, 합성 단계는, 적합한 폴리머라제 효소의 존재 중에 주형 가닥에 상보적인 연장된 표적 가닥을 형성하도록, 본 명세서에 제시된 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, 뉴클레오타이드 전구체를 이용하는 표준 프라이머 연장 반응과 유사할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 합성 단계는, 그 자체로, 표적 및 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥의 복제로부터 유래된 어닐링된 상보적인 가닥으로 구성된 표지된 이중 가닥 증폭 산물을 생성하는 증폭 반응의 일부를 형성할 수 있다. 다른 예시적인 합성 단계는 틈 번역, 가닥 교체 중합, 랜덤 프라이밍된 DNA 표지화 등을 포함한다. 합성 단계용의 특히 유용한 폴리머라제 효소는 본 명세서에 제시된 변형된 뉴클레오타이드의 1종 이상의 혼입을 촉진시킬 수 있는 것이다. 각종 자연 발생형 또는 변형된 폴리머라제가 이용될 수 있다. 예로써, 열안정성 폴리머라제는 열순환(thermocycling) 조건을 이용해서 수행되는 합성 반응을 위하여 사용될 수 있는 한편, 열안정성 폴리머라제는 등온 프라이머 연장 반응을 위하여 바람직하지 않을 수 있다. 본 개시내용에 따른 변형된 뉴클레오타이드를 혼입시킬 수 있는 적절한 열안정성 폴리머라제는 WO 2005/024010 또는 WO 06120433(각각은 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기재된 것들을 포함한다. 37℃ 등과 같은 저온에서 수행되는 합성 반응에서, 폴리머라제 효소는 반드시 열안정성 폴리머라제를 필요로 하지 않을 수 있고, 따라서 폴리머라제의 선택은 반응 온도, pH, 가닥-교체 활성 등과 같은 다수의 인자에 의존할 것이다.
특정한 비제한적인 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 핵산 서열분석 방법, 재-서열분석 방법, 전체 게놈 서열분석 방법, 단일 뉴클레오타이드 다형체 스코어링 방법, 또는 폴리뉴클레오타이드에 혼입될 때 본 명세서에 제시된 염료로 표지된 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드의 검출을 내포하는 임의의 다른 용도를 포괄한다. 형광 염료를 포함하는 변형된 뉴클레오타이드로 표지된 폴리뉴클레오타이드의 사용으로부터 유익한 다양한 기타 용도 중 임의의 것은 본 명세서에 제시된 염료로 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드를 사용할 수 있다.
특정 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 합성 반응에 의한 폴리뉴클레오타이드 서열분석에서 본 개시내용에 따른 염료 화합물을 포함하는 변형된 뉴클레오타이드의 사용을 제공한다. 합성에 의한 서열분석은 일반적으로 서열분석될 주형 핵산에 상보적인 연장된 폴리뉴클레오타이드 사슬을 형성하기 위하여 폴리머라제 또는 리가제를 사용하는 5'에서 3' 방향으로 성장하는 폴리뉴클레오타이드 사슬에 1종 이상의 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 순차적 첨가를 포함한다. 첨가된 뉴클레오타이드(들) 중 1종 이상에 존재하는 염기의 동질성이 검출 또는 "이미징"(imaging) 단계에서 결정될 수 있다. 첨가된 염기의 동질성은 각 뉴클레오타이드 혼입 단계 후에 결정될 수 있다. 주형의 서열은 이어서 통상의 왓슨-크릭 염기-짝짓기 규칙을 이용해서 추론될 수 있다. 단일 염기의 동질성의 결정을 위하여 본 명세서에 제시된 염료로 표지된 변형된 뉴클레오타이드의 사용은, 예를 들어, 단일 뉴클레오타이드 다형체의 스코어링에 유용할 수 있고, 이러한 단일 염기 연장 반응은 본 개시내용의 범위 내이다.
본 개시내용의 일 실시형태에 있어서, 주형 폴리뉴클레오타이드의 서열은 혼입된 뉴클레오타이드(들)에 부착된 형광 표지(들)의 검출을 통해서 서열분석될 주형 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 발생기 가닥 내로 1종 이상의 뉴클레오타이드의 혼입을 검출함으로써 결정된다. 주형 폴리뉴클레오타이드의 서열분석은 적합한 프라이머로 프라이밍될 수 있고(또는 헤파린의 일부로서 프라이머를 함유하게 될 헤파린 작제물로서 제조될 수 있고), 발생기 사슬은 폴리머라제-촉매화된 반응에서 프라이머의 3' 말단에 뉴클레오타이드의 첨가에 의해 단계적 방식으로 연장된다.
특정 실시형태에 있어서 상이한 뉴클레오타이드 트라이포스페이트(A, T, G 및 C)의 각각은 독특한 형광단으로 표지될 수 있고, 또한 비제어된 중합을 방지하기 위하여 3' 위치에서 차단기를 포함한다. 대안적으로 4종의 뉴클레오타이드 중 1종은 미표지될 수 있다(흑색). 폴리머라제 효소는 주형 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 발생기 사슬 내로 뉴클레오타이드를 혼입시키고, 차단기는 뉴클레오타이드의 추가의 혼입을 방지한다. 임의의 비혼입된 뉴클레오타이드는 세척 제거될 수 있고, 각 혼입된 뉴클레오타이드로부터의 형광 신호는 예컨대, 레이저 여기를 이용하는 전하-결합된 장치 및 적합한 방출 필터와 같은 적합한 수단에 의해 광학적으로 "판독"될 수 있다. 3'-차단기 및 형광 염료 화합물은 이어서 (동시에 또는 순차적으로) 제거(탈보호)되어 추가의 뉴클레오타이드 혼입을 위하여 발생기 사슬을 노출시킬 수 있다. 전형적으로 혼입된 뉴클레오타이드의 동질성은 각 혼입 단계 후에 결정될 것이지만, 이것은 엄격하게 필수는 아니다. 유사하게, 미국 특허 제5,302,509호(참고로 본 명세서에 편입됨)는 고체 지지체 상에 고정화된 폴리뉴클레오타이드를 서열분석하는 방법을 개시한다.
위에서 예시된 바와 같은 방법은, DNA 폴리머라제의 존재 하에 고정된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 성장하는 가닥 내로 형광 표지된 3'-차단된 뉴클레오타이드 A, G, C 및 T의 혼입을 이용한다. 폴리머라제는 표적 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 염기를 혼입하지만, 3'-차단기에 의한 추가의 첨가가 방지된다. 혼입된 뉴클레오타이드의 표지는 이어서 결정될 수 있고, 차단기는 화학적 절단에 의해 제거되어 추가의 중합이 일어나게 할 수 있다. 합성 반응에 의한 서열분석에서 서열분석될 핵산 주형은 서열분석되는 것이 바람직한 임의의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 서열분석 반응을 위한 핵산 주형은 전형적으로 서열분석 반응에서 추가의 뉴클레오타이드의 첨가를 위한 프라이머 또는 개시점으로서 역할하는 유리 3' 하이드록실기를 가진 이중 가닥 영역을 포함할 것이다. 서열분석될 주형의 영역은 상보적 가닥 상에 이 유리 3' 하이드록실기를 돌출시킬 것이다. 서열분석될 주형의 돌출 영역은 단일 가닥일 수 있지만, 단, 서열분석 반응의 개시화를 위하여 유리 3' OH기를 제공하도록 서열분석될 주형 가닥에 상보적인 가닥 상에 "틈이 존재하는" 조건 하에 이중-가닥일 수 있다. 이러한 실시형태에 있어서 서열분석은 가닥 교체에 의해 진행될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 유리 3' 하이드록실기를 보유하는 프라이머는, 서열분석될 주형의 단일 가닥 영역에 혼성화되는 별도의 성분(예컨대, 짧은 올리고뉴클레오타이드)로서 첨가될 수 있다. 대안적으로, 프라이머 및 서열분석될 주형 가닥은 각각 예를 들어 헤파린 루프 구조와 같은 분자내 이중가닥을 형성할 수 있는 복수의 자체-상보적 핵산 가닥의 일부를 형성할 수 있다. 고체 지지체에 부착될 수 있는 헤파린 폴리뉴클레오타이드 및 방법은 국제 출원 공개 번호 WO0157248 및 WO2005/047301(각각은 참고로 본 명세서에 편입됨)에 개시되어 있다. 뉴클레오타이드는 성장하는 프라이머에 연속하여 첨가될 수 있고, 그 결과 5'에서 3' 방향으로 폴리뉴클레오타이드 사슬의 합성을 초래한다. 첨가된 염기의 속성은 결정될 수 있지만, 특히 각 뉴클레오타이드 첨가 후에 반드시 필요하지는 않고, 따라서 핵산 주형을 위한 서열 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 5' 포스페이트기와의 포스포다이에스터 연쇄의 형성을 통해서 핵산 가닥의 유리 3' 하이드록실기에 뉴클레오타이드를 연결함으로써 핵산 가닥(또는 폴리뉴클레오타이드)에 혼입된다.
서열분석될 핵산 주형은 DNA 또는 RNA, 또는 심지어 데옥시뉴클레오타이드와 리보뉴클레오타이드로 구성된 혼성 분자일 수 있다. 핵산 주형은 자연 발생형 및/또는 비자연 발생형 뉴클레오타이드와 자연 또는 비자연 골격 연쇄를 포함할 수 있는데, 단, 이들은 서열분석 반응에서 주형의 복제를 방지하지 않는다.
소정의 실시형태에 있어서, 서열분석될 핵산 주형은 당업계에 공지된 임의의 적합한 연쇄 방법을 통해서, 예를 들어, 공유 부착을 통해서 고체 지지체에 부착될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지체(예컨대, 실리카계 지지체)에 직접 부착될 수 있다. 그러나, 본 개시내용의 다른 실시형태에 있어서 고체 지지체의 표면은, 주형 폴리뉴클레오타이드의 직접 공유 부착을 허용하거나, 또는 자체로 고체 지지체에 비공유 부착될 수 있는 하이드로겔 또는 고분자전해질 다층을 통해서 주형 폴리뉴클레오타이드를 고정화시키기 위하여 몇몇 방법으로 변형될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드가 실리카계 지지체에 직접 부착된 어레이는, 예를 들어, WO00006770(참고로 본 명세서에 편입됨)에 개시된 바와 같으며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 상의 내부 아미노기와 함께 유리 상의 펜던트 에폭사이드기 간의 반응에 의해 유리 지지체 상에 고정된다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는, W02005/047301(참고로 본 명세서에 편입됨)에 기재된 바와 같이, 황계 친핵체와 고체 지지체의 반응에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 고체-지지된 주형 폴리뉴클레오타이드의 더욱 추가의 예는, 주형 폴리뉴클레오타이드가, 예를 들어, W000/31148, W001/01143, W002/12566, W003/014392, 미국 특허 제6,465,178호 및 W000/53812(각각은 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기재된 바와 같이, 실리카계 또는 기타 고체 지지체 상에 지지된 하이드로겔에 부착되는 경우이다.
주형 폴리뉴클레오타이드가 고정될 수 있는 특정 표면은 폴리아크릴아마이드 하이드로겔이다. 폴리아크릴아마이드 하이드로겔은 위에서 인용된 문헌에 그리고 WO2005/065814(참고로 본 명세서에 편입된)에 기재된다.
DNA 주형 분자는, 예를 들어, 미국 특허 제6,172,218호(참고로 본 명세서에 편입됨)에 기재된 바와 같이, 비드 또는 미세입자에 부착될 수 있다. 비드 또는 미세입자에의 부착은 서열분석 용도에 유용할 수 있다. 비드 라이브러리는 각 비드가 상이한 DNA 서열을 함유하는 경우 제조될 수 있다. 예시적인 라이브러리 및 이의 작성 방법은 문헌[Nature. 437, 376-380 (2005); Science. 309, 5741, 1728-1732 (2005)](각각은 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기재되어 있다. 본 명세서에 제시된 뉴클레오타이드를 이용하는 이러한 비드의 어레이의 서열분석은 본 개시내용의 범위 내이다.
서열분석될 주형(들)은 고체 지지체 상에 "어레이"의 일부를 형성할 수 있고, 이 경우에 어레이는 임의의 편리한 형태를 취할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 방법은, 단분자 어레이, 클러스터링된 어레이 및 비드 어레이를 비롯한 모든 유형의 고밀도 어레이에 적용 가능하다. 본 개시내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오타이드는 고체 지지체 상에 핵산 분자의 고정화에 의해 형성된 것들을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 본질적으로 임의의 유형의 어레이 상의 서열분석 주형에 대해서 사용될 수 있다.
그러나, 본 개시내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오타이드는 클러스터링된 어레이의 서열분석의 맥락에서 특히 유리하다. 클러스터링된 어레이에서, 어레이 상의 별도의 영역(흔히 부위 또는 특성부라 지칭됨)은 다수의 폴리뉴클레오타이드 주형 분자를 포함한다. 일반적으로, 다수의 폴리뉴클레오타이드 분자는 광학 수단에 의해 개별적으로 해상 가능하지 않고 대신에 앙상블로서 검출된다. 어레이가 형성되는 방법에 따라서, 어레이 상의 각 부위는 하나의 개별적인 폴리뉴클레오타이드 분자의 다수의 복제품(예컨대, 이 부위는 특정 단일- 또는 이중-가닥 핵산종에 대해서 균질함) 또는 소수의 상이한 폴리뉴클레오타이드 분자의 다수의 복제품(예컨대, 두 상이한 핵산종의 다수의 복제품)을 포함할 수 있다. 핵산 분자의 클러스터링된 어레이는 일반적으로 당업계에 공지된 기술을 이용해서 생산될 수 있다. 예로써, WO 98/44151 및 WO00/18957(각각은 본 명세서에 편입됨)은 핵산의 증폭 방법을 기재하며, 여기서, 주형 및 증폭 산물은 둘 다 고정된 핵산 분자의 클러스터 또는 "콜로니"로 구성된 어레이를 형성하기 위하여 고정 지지체 상에 고정된 채로 남아 있다. 이들 방법에 따라 제조된 클러스터링된 어레이 상에 존재하는 핵산 분자는 본 개시내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오타이드를 사용하는 서열분석용의 적합한 주형이다.
본 개시내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오타이드는 또한 단분자 어레이 상의 주형의 서열분석에서 유용하다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "단분자 어레이" 또는 "SMA"는 고체 지지체 위에 분포된(또는 배열된) 폴리뉴클레오타이드 분자의 집단을 지칭하며, 여기서 이 집단의 모든 다른 것으로 임의의 개별의 폴리뉴클레오타이드의 간격은 개별의 폴리뉴클레오타이드 분자를 개별적으로 분해시키는 것을 가능하게 하도록 된다. 고체 지지체의 표면 상에 고정된 표적 핵산 분자는 따라서 몇몇 실시형태에 있어서 광학 수단에 의해 분해될 수 있다. 이것은 하나 이상의 별도의 신호(각각은 하나의 폴리뉴클레오타이드를 나타냄)가 이용된 특정 이미징 장치의 해상 가능한 영역 내에서 일어날 것임을 의미한다.
단분자 검출은, 어레이 상의 인접한 폴리뉴클레오타이드 분자들 사이의 간격이 적어도 100㎚, 특히 적어도 250㎚, 더욱 특히 적어도 300㎚, 더욱더 특히 적어도 350㎚인 경우 달성될 수 있다. 따라서, 각 분자는 단분자 형광점으로서 개별적으로 분해 가능하고 검출가능하며, 상기 단분자 형광점으로부터의 형광은 또한 단일 단계 광퇴색을 나타낸다.
용어 "개별적으로 분해된" 및 "개별적 분해"는, 가시화된 경우, 이웃 분자로부터 어레이 상의 하나의 분자를 구별하는 것이 가능한 것을 특정화하기 위하여 본 명세서에서 이용된다. 어레이 상의 개별 분자들 간의 분리는, 부분적으로는, 개별의 분자를 분해시키는데 이용된 특정 기술에 의해 결정될 것이다. 단분자 어레이의 일반적인 특성은 공개된 출원 WO00/06770 및 WO 01/57248(각각은 참고로 본 명세서에 편입됨)을 참조하면 이해될 것이다. 본 개시내용의 변형된 뉴클레오타이드의 하나의 용도가 합성 반응에 의한 서열분석이더라도, 변형된 뉴클레오타이드의 이용성은 이러한 방법으로 제한되지 않는다. 사실상, 뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드에 혼입된 뉴클레오타이드에 부착된 형광 표지의 검출을 필요로 하는 임의의 서열분석 방법에서 유리하게 사용될 수 있다.
특히, 본 개시내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오타이드는 자동화된 형광 서열분석 프로토콜, 특히 생어(Sanger) 및 동료들의 사슬 종결 서열분석 방법에 기초한 형광 염료-종결자 순환 서열분석에서 사용될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 프라이머 연장 서열분석 반응에서 형광 표지된 다이데옥시뉴클레오타이드를 혼입시키기 위하여 효소 및 순환 서열분석을 이용한다. 그러한 소위 생어 서열분석 방법 및 관련된 프로토콜(생어형(Sanger-type))은, 표지된 다이데옥시뉴클레오타이드에 의한 랜덤화된 사슬 종결을 이용한다.
따라서, 본 개시내용은 또한 3' 및 2' 위치 둘 다에서 하이드록실기를 결여하는 다이데옥시뉴클레오타이드인 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오타이드를 포괄하며, 이러한 변형된 다이데옥시뉴클레오타이드 생어형 서열분석 방법 등에서 사용하는데 적합하다.
3' 차단기를 혼입하는 본 개시내용의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오타이드는, 또한 변형된 다이데옥시 뉴클레오타이드를 이용해서 달성된 동일 효과가 3'-OH 차단기를 가진 변형된 뉴클레오타이드를 사용해서 달성될 수 있으므로(이들 둘 다 후속의 뉴클레오타이드의 혼입을 방지함) 생어 방법 및 관련된 프로토콜에서 유용성이 있을 수 있음이 인지될 것이다. 본 개시내용에 따른 그리고 3' 차단기를 가진 뉴클레오타이드가 생어형 서열분석 방법에서 사용될 경우, 본 개시내용의 표지된 뉴클레오타이드가 혼입되는 각 사례에서; 뉴클레오타이드가 후속으로 혼입될 필요가 없고 따라서 표지가 뉴클레오타이드로부터 제거될 필요가 없으므로, 뉴클레오타이드에 부착된 염료 화합물 또는 검출 가능한 표지가 절단 가능한 링커를 통해서 연결될 필요가 없음이 이해될 것이다.
본 개시내용은 또한 염료로 표지된 변형된 뉴클레오사이드 및/또는 뉴클레오타이드를 포함하는 키트를 제공한다. 이러한 키트는 일반적으로 적어도 하나의 추가의 성분과 함께 본 명세서에 제시된 염료로 표지된 적어도 1종의 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드를 포함할 것이다. 추가의 성분(들)은 위에서 제시된 방법에서 또는 이하의 실시예에서 확인된 성분 중 1종 이상일 수 있다. 본 개시내용의 키트에 조합될 수 있는 성분의 몇몇 비제한적인 예가 이하에 제시된다.
특정 실시형태에 있어서, 키트는 변형된 또는 비변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드와 함께 본 명세서에 제시된 염료로 표지된 적어도 1종의 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 염료로 표지된 변형된 뉴클레오타이드는 미표지된 또는 천연 뉴클레오타이드와, 그리고/또는 표지된 뉴클레오타이드 또는 이들의 임의의 조합물과 조합하여 공급될 수 있다. 따라서, 키트는 본 개시내용에 따른 염료로 표시된 변형된 뉴클레오타이드 및 예를 들어, 다른 종래 기술의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 조합은 분리된 개별의 성분(예컨대, 용기 또는 튜브당 1종의 뉴클레오타이드 유형)으로서 또는 뉴클레오타이드 혼합물(예컨대, 동일 용기 또는 튜브에서 혼합된 2종 이상의 뉴클레오타이드)로서 제공될 수 있다.
키트가 염료 화합물로 표지된 복수, 특히 2종, 더욱 특히 4종의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 경우, 상이한 뉴클레오타이드는 상이한 염료 화합물로 표지될 수 있거나, 또는 하나는 염료 화합물이 없이 흑색일 수 있거나, 또는 하나는 2종의 염료 화합물의 혼합물일 수 있다. 상이한 뉴클레오타이드가 상이한 염료 화합물로 표지된 경우, 상기 염료 화합물이 스펙트럼으로 구별 가능한 형광 염료인 것이 키트의 특성이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "스펙트럼으로 구별 가능한 형광 염료"는, 2종 이상의 염료가 하나의 샘플에 존재할 경우 형광 검출 장비(예를 들어, 상업적 모세관 기반 DNA 서열분석 플랫폼)에 의해 구별될 수 있는 파장에서 형광 에너지를 방출하는 형광 염료를 지칭한다. 형광 염료 화합물로 표지된 2종의 변형된 뉴클레오타이드가 키트 형태로 공급될 경우, 스펙트럼으로 구별 가능한 형광 염료가 동일 파장에서, 예를 들어, 동일 레이저에 의해 여기될 수 있는 것이 몇몇 실시형태의 특성이다. 대안적으로, 스펙트럼으로 구별 가능한 형광 염료가 상이한 파장에서, 예를 들어, 상이한 레이저에 의해 여기될 수 있지만, 동일 파장에서 발광하는 것이 몇몇 실시형태의 특성이다. 형광 염료 화합물로 표지된 4종의 변형된 뉴클레오타이드가 키트 형태로 공급될 경우, 스펙트럼으로 구별 가능한 형광 염료 중 2종이 모두 하나의 파장에서 여기될 수 있고 다른 2종의 스펙트럼으로 구별 가능한 염료가 모두 또 다른 파장에서 여기될 수 있는 것이 몇몇 실시형태의 특성이다. 특히 여기 파장은 532㎚, 630㎚ 내지 700㎚, 특히 660㎚이다.
일 실시형태에 있어서 키트는 본 개시내용의 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오타이드 및 적어도 100㎚의 흡광 최대의 차이를 갖는 제2 염료로 표지된 제2 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 더욱 특히 염료 화합물 중 1종은 15 내지 40㎚의 스토크스 이동을 갖고, 본 발명의 화합물은 적어도 50㎚, 또는 100㎚ 초과의 스토크스 이동을 갖는다. 본 발명의 화합물은 50㎚ 초과, 100㎚ 초과 또는 심지어 150㎚ 초과의 스토크스 이동을 가질 수 있다.
추가의 실시형태에 있어서, 키트는 600㎚ 초과에서 여기되는 형광 염료로 표지된 변형된 뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있다. 염료는 적어도 100㎚의 흡광 최대의 차이점을 가질 수 있다. 더욱 특히, 제2 염료 화합물은 600㎚ 초과, 특히 630㎚ 초과의 상이한 흡광 최대를 가질 수 있다. 본 개시내용의 폴리메틴 염료로부터 스펙트럼으로 구별 가능하고 상기 표준을 충족시키는 특정 염료는 미국 특허 제5,268,486호(예를 들어 Cy5) 또는 WO 0226891(Alexa 647; Molecular Probes/Life technologies A20006)에 기재된 바와 같은 폴리메틴 유사체 또는 미국 특허 제6,924,372호에 개시된 바와 같은 비대칭 폴리메틴이며, 이들 문헌의 각각은 참고로 본 명세서에 편입된다
대안적인 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 키트는, 동일 염기가 2종의 상이한 화합물로 표지된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 제1 뉴클레오타이드는 본 개시내용의 화합물로 표지될 수 있다. 제2 뉴클레오타이드는 스펙트럼으로 구별되는 화합물, 예를 들어 600㎚ 초과에서 흡수하는 '적색' 염료로 표지될 수 있다. 제3 뉴클레오타이드는 본 개시내용의 화합물과 스펙드럼적으로 개별의 화합물의 혼합물로서 표지될 수 있고, 제4 뉴클레오타이드는 '흑색'일 수 있고 표지를 함유하지 않을 수 있다. 따라서 간단한 용어에서 뉴클레오타이드 1 내지 4는 '녹색', '적색', '적색/녹색'일 수 있다. 이 실행을 더욱 간략화시키기 위하여, 4종의 뉴클레오타이드는 단일 레이저로 여기된 2종의 염료로 표시될 수 있고, 따라서 뉴클레오타이드 1 내지 4의 표지화는 '적색 1', '적색 2', '적색 1/적색 2', 및 흑색일 수 있다.
뉴클레오타이드는 본 개시내용의 두 염료를 함유할 수 있다. Ra1이 인돌 고리의 인접한 탄소에 융합된 추가의 방향족 고리인 염료는, 염료가 추가의 방향족 접합을 갖지 않는 것보다 더 긴 파장에서 흡수한다. 키트는 본 개시내용의 염료로 표지된 2종 이상의 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 키트는, Ra1이 H, SO3 -, 설폰아마이드 또는 할로겐인 경우 본 개시내용의 화합물로 표지된 뉴클레오타이드, 및 Ra1이 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리인 본 개시내용의 화합물로 표지된 1종의 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 키트는 추가의 뉴클레오타이드를 함유할 수 있되, 여기서 뉴클레오타이드는 520㎚ 내지 560㎚의 영역에서 흡수되는 염료로 표지된다. 키트는 미표지된 뉴클레오타이드를 더 함유할 수 있다.
키트가 상이한 염료 화합물로 표지된 상이한 뉴클레오타이드를 가진 배치형태에 관하여 위에서 예시되어 있지만, 키트는 동일한 염료 화합물을 갖는 2, 3, 4 또는 그 이상의 상이한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 특정 실시형태에 있어서 키트는 변형된 뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드로의 혼입을 촉진시킬 수 있는 폴리머라제 효소를 포함할 수 있다. 이러한 키트에 포함될 기타 성분은 완충제 등을 포함할 수 있다. 본 개시내용에 따른 염료로 표지된 변형된 뉴클레오타이드 및 상이한 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 기타 임의의 뉴클레오타이드 성분은, 사용 전에 희석될 농축된 형태로 키트에 제공될 수 있다. 이러한 실시형태에 있어서 적합한 희석 완충액이 또한 포함될 수 있다. 재차, 본 명세서에 제시된 방법에서 확인된 1종 이상의 성분은 본 개시내용의 키트에 포함될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 명백하면서도 모호하지 않게 하나의 지시대상으로 제한되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함하는 것에 유의한다. 각종 변형 및 변화가 본 교시의 정신 및 범위로부터 벗어나는 일 없이 본 명세서에 기재된 각종 실시형태에 대해서 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 각종 실시형태는 첨부된 청구범위 및 이의 등가물의 범주 내에서 기타 변형 및 변화를 포함하는 것이 의도된다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은, 본 명세서에 개시된 유형의 일례인 신규한 염료(NR520ls) 및 구조적 유사체(NR550S0)의 용액이 540㎚에서 여기된 경우 이들 염료 및 유사체로 표지된 뉴클레오타이드의 형광 강도를 예시한다. NR550S0(이하에 도시된 구조)는 40 내지 50㎚의 범위에서 스토크스 이동을 가진 형광 염료의 전형으로서, 폴리메틴 사슬의 양 단부에서 인돌을 가진 폴리메틴 염료이다. 40 내지 50㎚의 스토크스 이동을 가진 염료는 긴 스토크스 이동 염료보다 더 높은 형광 신호를 나타낸다.
도 2는 신규한 염료(NR520ls) 및 이의 상업적 구조 유사체(NR550S0)의 용액이 460㎚에서 여기된 경우 이들 염료 및 유사체에 기초한 FFN의 형광 강도를 예시한다. 540㎚에서와 달리, 긴 스토크스 이동 염료는 460㎚에서 여기된 경우 더 밝다. 따라서, 두 표지는 여기 파장에 기초한 590㎚ 발광에서 측정된 경우 달라질 수 있다.
실험 상세
Figure 112018002329021-pct00030
이들 출발 물질은 에틸 또는 오쏘 폼에이트 또는 이의 유도체를 이용해서 피릴륨염( SM1)으로부터 제조하였다
Figure 112018002329021-pct00031
실시예 1
SM2-1
Figure 112018002329021-pct00032
아세트산 중 2,4,6-트라이메틸피릴륨 테트라플루오로보레이트(1당량), 트라이에틸오쏘폼에이트(1.5당량) 및 N,N'-다이페닐폼아미딘(1.1당량)을 80℃에서 6시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 정치시키고, 생성물을 황색 결정으로서 여과 제거하였다. 수율 87%.
인도피릴로사이아닌(X).
Figure 112018002329021-pct00033
이들 출발 물질은 N-치환된 인돌륨염을 이용해서 피릴륨염 유도체( SM2 )로부터 제조하였다
실시예 2
(X)-1
Figure 112018002329021-pct00034
아세트산, 아세트산 무수물 및 피리딘(1:1:0.5)의 혼합물 중 등몰량의 SM2-1 및 N-페닐-2,3,3-트라이메틸인돌륨염을 80℃에서 3시간 동안 교반하였다.
생성물이 다이에틸 에터로 석출되었고, 칼럼 정제하였다. 수율 48%.
인도피리도사이아닌
이들 염료는 치환된 아민 또는 이의 염을 이용해서 피릴륨 유도체(X)로부터 제조하였다
Figure 112018002329021-pct00035
실시예 3-1 (NR520ls)
Figure 112018002329021-pct00036
출발 물질을 에탄올 중에서 5분 동안 교반하고, 이어서 N-에틸-N,N-다이아이소프로필아민을 첨가하고, 0.5시간 동안 계속 교반하였다. 용매 증발 후, 염료를 모아서 물로 세척하였다. 수율 대략 95%.
실시예 3-2
Figure 112018002329021-pct00037
출발 물질을 에탄올 중에서 5분 동안 교반하고, 이어서 N-에틸-N,N-다이아이소프로필아민을 첨가하였다. 0.5시간 동안 계속 교반하였다. 용매 증발 후, 염료를 모아서, 물로 세척하였다. 수율 대략 95%.
실시예 3-3
Figure 112018002329021-pct00038
출발 물질을 에탄올에서 혼합하고 이어서 N-에틸-N,N-다이아이소프로필아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0.5시간 동안 교반하였다. 용매 증발 후, 염료를 모아서, 물로 세척하였다. 수율 대략 95%.
염료 표지된 뉴클레오타이드 트라이포스페이트의 합성
염료 접합체 pppT - NR520ls
Figure 112018002329021-pct00039
제조:
무수 DMA(5㎖) 및 후니그의 염기(0.06㎖)를 염료(3-1)(80㎎)의 건조된 샘플에 첨가하였다. 이어서 이것에 5㎖의 건조 DMA 중 TSTU(0.25g)의 용액을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 활성화가 완료된 후에(TLC: CH3CN 중 15% H2O) 이 용액을 물(7㎖) 중 pppT-LN3(0.23g)의 용액에 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 질소 분위기 하에 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 빙욕 속에서 대략 4℃까지 냉각시키고, 이어서 물 중 0.1M TEAB(5㎖)의 용액을 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 물 중 0.05M TEAB 용액 중 대략 75g의 DEAE Sephadex 수지 현탁액을 가진 칼럼에 적용하고 TEAB로 세척하였다(0.10M에서 최대 0.75M까지의 농도 구배). 적색 분획을 수집하고, 용매를 증발시키고, 이어서 잔사를 재차 물로 공증발시켜서 더 많은 TEAB 및 vac를 제거하여 건조 상태로 하였다. 이어서 염료를 TEAB 0.1M에 재용해시켰다. 이 용액을 시린지 필터 0.2㎚ 기공 크기를 통해서 여과시키고, 생성물을 아세토나이트릴-0.1M TEAB를 가진 C18 역상 칼럼을 이용해서 HPLC에 의해 정제시켰다. 수율 78%.
염료 접합체 pppA - NR520ls
Figure 112018002329021-pct00040
제조:
무수 DMA(5㎖) 및 후니그의 염기(0.06㎖)를 염료(3-1)(80㎎)의 건조된 샘플에 첨가하였다. 이어서 이것에 5㎖의 건조 DMA 중 TSTU(0.25g)의 용액을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 활성화가 완료된 후에(TLC: CH3CN 중 15% H2O) 이 용액을 물(7㎖) 중 pppT-LN3(0.25g)의 용액에 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 질소 분위기 하에 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 빙욕 속에서 대략 4℃까지 냉각시키고, 이어서 물 중 0.1M TEAB(5㎖)의 용액을 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 물 중 0.05M TEAB 용액 중 대략 75g의 DEAE Sephadex 수지 현탁액을 가진 칼럼에 적용하고 TEAB로 세척하였다(0.10M에서 최대 0.75M까지의 농도 구배). 적색 분획을 수집하고, 용매를 증발시키고, 이어서 잔사를 재차 물로 공증발시켜서 더 많은 TEAB 및 vac를 제거하여 건조 상태로 하였다. 이어서 염료를 TEAB 0.1M에 재용해시켰다. 이 용액을 시린지 필터 0.2㎚ 기공 크기를 통해서 여과시키고, 생성물을 아세토나이트릴-0.1M TEAB를 가진 C18 역상 칼럼을 이용해서 HPLC에 의해 정제시켰다. 수율 75%.
형광 특성
도 1은, 본 명세서에 개시된 유형의 일례인 신규한 염료(NR520ls) 및 구조적 유사체(NR550S0)의 용액이 540㎚에서 여기된 경우 이들 염료 및 유사체로 표지된 뉴클레오타이드의 형광 강도를 예시한다. NR550S0(이하에 도시된 구조)는 40 내지 50㎚의 범위에서 스토크스 이동을 가진 형광 염료의 전형으로서, 폴리메틴 사슬의 양 단부에서 인돌을 가진 폴리메틴 염료이다. 40 내지 50㎚의 스토크스 이동을 가진 염료는 긴 스토크스 이동 염료보다 더 높은 형광 신호를 나타낸다.
Figure 112018002329021-pct00041
도 2는 신규한 염료(NR520ls) 및 이의 상업적 구조 유사체(NR550S0)의 용액이 460㎚에서 여기된 경우 이들 염료 및 유사체에 기초한 FFN의 형광 강도를 예시한다. 540㎚에서와 달리, 긴 스토크스 이동 염료는 460㎚에서 여기된 경우 더 밝다. 따라서, 두 표지는 여기 파장에 기초한 590㎚ 발광에서 측정된 경우 달라질 수 있다.
긴 스토크스 이동을 가진 신규한 염료 NR520ls 및 통상의 스토크스 이동을 가진 이의 구조 유사체의 형광 강도의 비의 비교로부터, 용액이 상이한 파장에서 여기된 경우 신호 강도의 변동으로 인해 신규한 염료를 이용하는 이점을 알 수 있다.
상기 차트에서, 염료 NR550S0에 대해서, 염료가 460㎚에서 효과적으로 흡수하지 않으므로 540㎚에서의 형광 강도(193.0)와 460㎚에서의 형광 강도(10.1)의 비는 19.3이다. 신규한 염료 NR520ls에 대해서 동일한 조건에서, 더 긴 스토크스 이동이 염료가 460㎚에서 훨씬 더 높은 수준 또는 흡광도를 갖는 것을 의미하므로, 540㎚에서의 형광 강도(93.0)와 460㎚에서의 형광 강도(40.1)의 비는 단지 약 2이다. 이들 독특한 특성으로 인해, 본 명세서에 개시된 바와 같이 신규한 염료는, 신호 대 잡음이 개선되므로 더욱 효율적인 데이터 분석을 허용하고, 그리고 통상의 4개 검출 채널보다 더 적은 것을 이용해서 서열분석 플랫폼을 작동시키는 것을 허용한다.

Claims (29)

  1. 하기 화학식 (II)로 표시되는 화합물 또는 이의 염:
    Figure 112019077889238-pct00049

    식 중, mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기 양/음 하전된 상대이온이고,
    m은 정수 0 내지 3이며;
    각각의 n은 독립적으로 0 내지 6이고;
    Ra1은 H, SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이되, 상기 고리는 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐 치환체를 함유할 수 있고;
    Rb1은 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, COOH 또는 이들의 아마이드 또는 에스터이고 n은 0 내지 3이며; 그리고
    X는 OH, O- 또는 에스터 또는 아마이드이다.
  2. 제1항에 있어서, Ra1는 H, SO2NH2 또는 SO3 -인, 화합물.
  3. 제1항에 있어서, Ra1은 인접한 탄소 원자에 융합된 고리인, 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 고리는 1개 이상의 SO3 - 또는 설폰아마이드 치환기를 함유하는, 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Rb1은 존재하지 않고, n은 0인 화합물.
  6. 제1항의 화합물로 표지된 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 표지는 COOH 모이어티로부터 형성된 아마이드 연쇄를 통해서 부착되는, 표지된 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드.
  8. 제6항에 있어서, 상기 표지는 링커 모이어티를 통해서 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자 퓨린 염기의 C7 위치에 부착되는, 표지된 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드.
  9. 제6항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드의 리보스 또는 데옥시리보스 당에 공유 부착된 3' OH 차단기(blocking group)를 더 포함하는, 표지된 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드.
  10. 2종 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 키트로서, 적어도 1종의 뉴클레오타이드는 제6항에 따른 표지된 뉴클레오타이드인, 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 표지된 뉴클레오타이드 중 2종이 동일 파장에서 검출에 의해 측정되는, 키트.
  12. 제11항에 있어서, 4종의 뉴클레오타이드를 포함하되, 제1 뉴클레오타이드는 제6항에 따른 표지된 뉴클레오타이드이고, 제2 뉴클레오타이드는 제1 표지된 뉴클레오타이드와 동일한 파장을 방출하는 표지로 표지되며, 제3 뉴클레오타이드는 표지들의 혼합물로 표지되고, 제4 뉴클레오타이드는 제4 표지된 뉴클레오타이드의 각각이 서로 구별 가능하도록 미표지된, 키트.
  13. 제11항에 있어서, 상기 제1 표지된 뉴클레오타이드는 100㎚ 초과의 스토크스 이동을 갖고, 제2 표지된 뉴클레오타이드는 50㎚ 미만의 스토크스 이동을 갖는, 키트.
  14. 서열분석, 발현 분석, 혼성화(hybridisation) 분석, 유전자 분석, RNA 분석 또는 단백질 결합 검정에서 제6항에 따른 뉴클레오타이드, 제6항에 따른 올리고뉴클레오타이드 또는 제10항에 따른 키트를 사용하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 방법은 자동화 서열분석 기기 상에서 수행되는 방법으로서, 상기 자동화 서열분석 기기는 고정된 방출 파장으로 설정된 단일 검출 채널을 가진 상이한 파장 및 검출 시스템에서 작동하는 2개의 레이저를 포함하는 것인 방법.
  16. 하기의 출발물질을 이용하여 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 합성하는 방법:
    Figure 112019077889238-pct00050

    여기서, mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기 양/음 하전된 상대이온이고,
    m은 정수 0 내지 3이며;
    각각의 n은 독립적으로 0 내지 6이고;
    Ra1은 H, SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이되, 상기 고리는 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐 치환체를 함유할 수 있고;
    Rb1은 SO3 -, 설폰아마이드, 할로겐, COOH 이고 n은 0 내지 3이다.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
KR1020177036956A 2015-05-22 2016-05-23 긴 스토크스 이동을 갖는 폴리메틴 화합물 및 형광 표지로서의 이의 용도 KR102036430B1 (ko)

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