JP6514364B2

JP6514364B2 - 長ストークスシフトを有するポリメチン化合物と、蛍光標識としてのその使用

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Publication number: JP6514364B2
Application number: JP2017560787A
Authority: JP
Inventors: ロマノフニコライ; ウーシャオリン
Original assignee: イルミナケンブリッジリミテッド
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2016-05-23
Publication date: 2019-05-15
Anticipated expiration: 2036-05-23
Also published as: CN107835809B; AU2016266981B2; WO2016189287A1; CA2986659C; JP2018525322A; ES2924771T3; KR20180012785A; HK1248692A1; US20180111957A1; EP3297997A1; EP3297997B1; US10239909B2; CN107835809A; CA2986659A1; GB201508858D0; KR102036430B1; AU2016266981A1

Description

本開示は、新規のポリメチン化合物および蛍光マーカとしてのその使用に関する。特に、前記化合物は、核酸シーケンシング用途においてヌクレオチド向けの蛍光標識として用いることができる。

幾つかの刊行物および特許文献を、本開示が関与する技術の水準についてより完全に記載するために、本出願において参照する。これらの刊行物および文献のそれぞれの開示内容は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。

蛍光標識を利用した核酸の非放射性検出は、分子生物学において重要な技術である。組換えＤＮＡ技術で用いられる多くの手順は、これまで、例えば^３２Ｐで放射的に標識したヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用に依存するところが大きかった。放射性化合物により、対象の核酸および他の分子の高感度の検出が可能になる。しかしながら、放射性アイソトープの使用には、費用、限られた貯蔵寿命、およびより重要なことには安全性事項などの重大な制約がある。放射性標識の必要性を無くすと、安全性が高まると同時に、例えば試薬の処分に関する環境影響およびコストが減少する。非放射性蛍光検出に適した方法としては、非限定的な例として、自動化ＤＮＡシーケンシング、ハイブリダイズ法、ポリメラーゼ連鎖反応産物のリアルタイム検出、およびイムノアッセイが挙げられる。

多くの用途では、複数の部分的にオーバーラップした分析物の独立した検出を達成するために、多数のスペクトル的に識別可能な蛍光標識を用いることが望ましい。このような多重法では、反応容器の数を減らして実験プロトコルを単純化し、用途に特異的な試薬キットの生成を容易にすることができる。例えば、多色自動化ＤＮＡシーケンシングは、多重蛍光検出により単一電気泳動レーンにおける多数のヌクレオチド塩基の解析を可能にし、それにより処理量は単色法より増加し、レーン間の電気泳動移動度の変動に関連する不確実性は低減する。

しかしながら、多重蛍光検出は問題をはらみ得、蛍光標識の選択を制限するいくつかの重要な要因が存在する。第１に、発光スペクトルが所与の用途において適切にスペクトル分解される色素化合物を見つけることは難しい場合がある。加えて、いくつかの蛍光色素を一緒に用いる場合、同時励起により識別可能なスペクトル領域で蛍光シグナルを生成することは、難しい場合がある。これは、それに使用可能であり得る色素の吸収バンドが通常は大きく分離しており、そのため、２色素でさえ、程度の差はあれ等しい蛍光励起効率を達成することが難しいためである。多くの励起方法ではレーザのような高出力の光源を用い、そのため、色素はそのような励起に耐えるに十分な光安定性を有さなければならない。分子生物学の方法において、特に重要な最終の配慮事項は、どの程度蛍光色素が、例えばＤＮＡ合成溶媒および試薬、緩衝剤、ポリメラーゼ酵素、ならびにリガーゼ酵素などの使用試薬の化学反応に適合しなければならないかである。

シーケンシング技術が進歩するにつれ、上記の制約全てを満たし、固相シーケンシング等のハイスループット分子法に特に適したさらなる蛍光色素化合物、その核酸コンジュゲート、および色素セットに対するニーズが高まっている。

蛍光バンドの蛍光強度、形、および波長最大値などの蛍光特性を改善した蛍光色素分子は、核酸シーケンシングのスピードおよび正確性を改善し得る。強蛍光シグナルは、水性生化学用緩衝剤において、高温で測定を行う場合は特に重要である。これは、大部分の色素の蛍光強度は、そのような条件では著しく低いためである。さらに、色素が付着する塩基の性質も、蛍光最大値、蛍光強度、および他のスペクトル色素特性に影響を与える。ヌクレオ塩基と蛍光色素の間の配列特異的相互作用は、蛍光色素の特異的設計により調整することが可能である。蛍光色素の構造の最適化は、ヌクレオチドの組み込みの効率性を高め、シーケンシングエラーのレベルを下げ、核酸シーケンシングにおける試薬の使用を減少させ、そのため核酸シーケンシングのコストを低減させ得る。

特に多数の蛍光標識の検出の改善は、異なる、特に、通常よりも大きいストークスシフトを有する蛍光色素を用いて達成することが可能である。

ストークスシフトとは、同じ電子遷移についての吸収最大波長と発光最大波長の差である。

可視領域にある大多数の蛍光色素は、４０ｎｍ未満のストークスシフトを有し、これは、最も効率的な励起波長と発光波長の最大値が比較的共に近くにあることを意味する。より長いストークスシフトを有する化合物は、発光波長と励起波長がさらに離れていることから、シグナル対ノイズの比率がより良好である。長ストークスシフト色素は、また、２つの異なる標識を、同一だが異なる励起波長を有する発光チャネルを用いて、別個に検出することも可能にする。例えば、検出測定は、例えば５５０〜５７０ｎｍの間で記録され得、５３２ｎｍで励起する短ストークスシフトを有する第１標識から生じるシグナルと、長ストークスシフトを有し、例えば４５０ｎｍで励起する第２標識から生じるシグナルを検出することが可能である。

本明細書に記載するのは、長ストークスシフトを有する改善されたポリメチン構造体、および、その生物分子標識としての、特に、核酸シーケンシングで用いるヌクレオチド向けの標識としての使用である。特別な改善が、単一検出チャネルにおいて測定を検出する際の、標識化ヌクレオチドの組み込みの効率性と、新規の蛍光構造体を用いて得られるシーケンシングリードの長さに見られる。

第１態様により、本開示は式（Ｉ）の化合物またはそのメソメリー型を提供する。

式中、ｍＣａｔ＋またはｍＡｎ−は、有機または無機の、正電荷／負電荷の対イオンであって、ｍは０〜３の整数であり；
Ｒａ_１は、Ｈ、ＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノであるか、または、隣接する炭素原子に縮合し、ＳＯ_３ ⁻置換基、スルホンアミド置換基、ハロゲン置換基を含有し得るさらなる環であり；
Ｒｂ_１はＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、ＣＯＯＨ、またはそのアミドもしくはエステルであって、ｎは０〜３であり；
Ｒｃ_１およびＲｃ_２はそれぞれ独立してアルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒｄ_１およびＲｄ_２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；
Ｒｅ_１はアルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールであり；
Ｒｃ_１、Ｒｂ_１、またはＲｅ_１の何れかは、ＣＯＯＨまたはＣＯＯ⁻またはそのアミドもしくはエステルを含有する。

本開示は、式（Ｉ’）の化合物またはそのメソメリー型を提供する。

式中、ｍＣａｔ＋またはｍＡｎ−は、有機または無機の、正電荷／負電荷の対イオンであって、ｍは０〜３の整数であり；
ｘは０〜２の整数であり；
Ｒａ_１は、Ｈ、ＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノであるか、または、隣接する炭素原子に縮合し、ＳＯ_３ ⁻置換基、スルホンアミド置換基、ハロゲン置換基を含有し得るさらなる環であり；
Ｒｂ_１はＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、ＣＯＯＨ、またはそのアミドもしくはエステルであって、ｎは０〜３であり；
Ｒｃ_１およびＲｃ_２はそれぞれ独立してアルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒｄ_１およびＲｄ_２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；
Ｒｅ_１はアルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールであり；
Ｒｃ_１、Ｒｂ_１、またはＲｅ_１の何れかは、ＣＯＯＨまたはＣＯＯ⁻またはそのアミドもしくはエステルを含有する。

Ｒｅ_１がアルキルである、ある例では、Ｒｂ_１、Ｒｃ_１はＣＯＯＨまたはＣＯＯ⁻またはそのアミドもしくはエステルであり得る。

ｎが０であり、その結果フェニル基が非置換である、ある例では、Ｒｅ_１はＣＯＯＨまたはＣＯＯ⁻またはそのアミドもしくはエステルを含有する。

別の実施形態では、本開示の化合物は、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、カルボハイドレート、リガンド、粒子、細胞、半固体表面（例えば、ゲル）、および固体表面などの種々の基質部分とコンジュゲートし得る。コンジュゲートは、Ｒｃ_１、Ｒｅ_１、またはＲｂ_１のカルボキシ基またはスルホン基を介して行われ、これはアミド、スルホンアミド、またはエステルになり得る。

そのため、本開示のさらなる態様によると、例えば、ヌクレオチドなどの基質部分への共有結合を可能にするリンカー基を含む色素化合物を提供する。

さらなる態様により、本開示は、式：Ｎ−Ｌ−色素（式中、Ｎはヌクレオチドであり、Ｌはオプション的なリンカー部分であり、色素は本開示に従う蛍光化合物である）により定義される、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの化合物を提供する。

ヌクレオチドは、ヌクレオチド５−三リン酸であり得る。

さらなる態様において、本開示は、本開示の色素化合物を用いたシーケンシング法を提供する。

さらなる態様により、本開示は、また、種々の免疫アッセイ、オリゴヌクレオチドおよび核酸の標識化、ならびにＤＮＡのシーケンシング・バイ・シンセシスに用いることができる、色素化合物（遊離したまたはコンジュゲート型の）を含むキットも提供する。さらに別の態様では、本開示は、自動化機器プラットフォームにおけるシーケンシング・バイ・シンセシスのサイクルに特に適した色素「セット」を含むキットを提供する。

本開示のさらなる態様は、本開示の化合物の化学的調製である。

本開示は、蛍光検出法およびシーケンシング・バイ・シンセシスに特に適した新規の化合物を提供する。Ｎ−フェニルインドール部分を有する新規の化合物は、Ｎ−アルキル類似体と比較し、蛍光の最大位置、その強度および光安定性において有利であり、そのため、ある核酸シーケンシング用途を改善する。

第１態様により、本開示は式（Ｉ）の化合物およびそのメソメリー型を提供する。

式中、ｍＣａｔ＋またはｍＡｎ−は、有機または無機の、正電荷／負電荷の対イオンであって、ｍは０〜３の整数であり；
Ｒａ_１は、Ｈ、ＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲンであるか、または、隣接する炭素原子に縮合し、ＳＯ_３ ⁻置換基、スルホンアミド置換基、ハロゲン置換基を含有し得るさらなる環であり；
Ｒｂ_１はＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、ＣＯＯＨ、またはそのアミドもしくはエステルであって、ｎは０〜３であり；
Ｒｃ_１およびＲｃ_２はそれぞれ独立してアルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒｄ_１およびＲｄ_２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒｅ_１はアルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールであり；
Ｒｂ_１またはＲｅ_１の何れかは、ＣＯＯＨまたはＣＯＯ⁻またはそのアミドもしくはエステルを含有する。

本開示は、式（Ｉ）の化合物またはそのメソメリー型を提供する。

鎖ｘの長さは０、１、または２であり得る。鎖は、１つの炭素と１つの二重結合、３つの炭素と２つの二重結合、または５つの炭素と３つの二重結合を有し得る。ｘは１であり得、その結果、鎖は３つのＣＨ基を含有する。

分子は、Ｒａ位置において、スルホンアミドまたはＳＯ_３ ⁻部分を含有し得る。Ｒａ_１はスルホンアミドであり得る。スルホンアミドは、ＳＯ_２ＮＨ_２またはＳＯ_２ＮＨＲであり得、式中、Ｒはアルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリール基である。Ｒａ_１はＨであり得る。Ｒａ_１はＳＯ_３ ⁻であり得る。Ｒａ_１は、隣接する炭素原子に縮合したさらなる環であり得る。環は置換されていても置換されていなくてもよい。環は、１つまたは複数のスルホンアミドまたはＳＯ_３ ⁻基で置換され得る。スルホンアミドは、ＳＯ_２ＮＨ_２またはＳＯ_２ＮＨＲであり得、式中、Ｒはアルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリール基である。

Ｒａ_１は隣接するインドール環の炭素と縮合する、さらなる脂肪族環、芳香族環、または複素環であり得る。例えば、芳香族環が縮合する場合、色素末端基は、以下のタイプの構造を表し得る。

式中、ＲｆはＨ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホンアミド、またはスルホン酸であり得る。このような構造において、Ｒｆは複数回現れ得、例えば、ＲｆはＨおよびＳＯ_３ ⁻の両方であり得る、または、多数のＳＯ_３ ⁻基であり得る。

したがって、本開示の色素は、式（１Ａ）または（１Ａ’）で表され得る。

または

式中、ｍＣａｔ＋またはｍＡｎ−は、有機または無機の、正電荷／負電荷の対イオンであって、ｍは０〜３の整数であり；
ｘは０〜２の整数であり；
Ｒｂ_１はＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、ＣＯＯＨ、またはそのアミドもしくはエステルであって、ｎは０〜３であり；
Ｒｃ_１およびＲｃ_２はそれぞれ独立してアルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒｄ_１およびＲｄ_２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒｅ_１はアルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールであり；
Ｒｂ_１またはＲｅ_１の何れかは、ＣＯＯＨまたはＣＯＯ⁻またはそのアミドもしくはエステルを含有し；
ＲｆはＨ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホアミド、またはスルホン酸のうち１つまたは複数であり得る。

したがって、本開示の色素は、式（ＩＢ）または（ＩＢ’）で表され得る。

または

式中、ｍＣａｔ＋またはｍＡｎ−は、有機または無機の、正電荷／負電荷の対イオンであって、ｍは０〜３の整数であり；
ｘは０〜２の整数であり；
Ｒｂ_１はＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、ＣＯＯＨ、またはそのアミドもしくはエステルであって、ｎは０〜３であり；
Ｒｃ_１およびＲｃ_２はそれぞれ独立してアルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒｄ_１およびＲｄ_２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒｅ_１はアルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールであり；
Ｒｂ_１またはＲｅ_１の何れかは、ＣＯＯＨまたはＣＯＯ⁻またはそのアミドもしくはエステルを含有する。

したがって、本開示の色素は、式（ＩＣ）または（ＩＣ’）で表され得る。

または

したがって、本開示の色素は、式（ＩＤ）または（ＩＤ’）で表され得る。

または

式中、ｍＣａｔ＋またはｍＡｎ−は、有機または無機の、正電荷／負電荷の対イオンであって、ｍは０〜３の整数であり；
ｘは０〜２の整数であり；
ｑは１〜６であり；
Ｒｂ_１はＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、ＣＯＯＨ、またはそのアミドもしくはエステルであって、ｎは０〜３であり；
Ｒｃ_２はアルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒｄ_１およびＲｄ_２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒｅ_１はアルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールであり；
Ｒｂ_１またはＲｅ_１の何れかは、ＣＯＯＨまたはＣＯＯ⁻またはそのアミドもしくはエステルを含有する。

したがって、本開示の色素は、式（ＩＥ）または（ＩＥ’）で表され得る。

または

式中、ｍＣａｔ＋またはｍＡｎ−は、有機または無機の、正電荷／負電荷の対イオンであって、ｍは０〜３の整数であり；
ｘは０〜２の整数であり；
ｑは１〜６であり；
Ｒｂ_１はＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、またはハロゲンあって、ｎは０〜３であり；
Ｒｃ_２はアルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒｄ_１およびＲｄ_２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒｅ_１は、アルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールであり；
ＸはＯＨ、Ｏ⁻、またはエステルもしくはアミドである。

カルボキシ基またはその誘導体は、Ｒｂ_１、Ｒｃ_１、またはＲｅ_１の何れかの位置に結合する。Ｒｂ_１に結合する場合、Ｒｅ_１は非置換アルキル、または１つもしくは複数の置換基を有するアルキルであり得る。ＣＯＯＨ基は、さらなる結合のための連結部分として機能し得るか、または、さらなる分子と連結する。いったんコンジュゲートが起きたら、ＣＯＯＨまたはＣＯＯ⁻はアミドまたはエステルに変わる。

あるいは、Ｒｃ_１はカルボキシ基を含有し得る。カルボキシ基は、置換アルキルリンカー、例えば、長さｑ（ｑは１〜６個の炭素またはヘテロ原子である）のアルキル鎖を介して結合し得る。鎖は、（ＣＨ_２）ｑであり得、式中ｑは１〜６である。基は（ＣＨ_２）_４ＣＯＯＨであり得る。

あるいは、Ｒｅ_１はカルボキシ基を含有し得る。カルボキシ基は、置換アルキルリンカー、例えば、長さｎ（ｎは１〜５個の炭素またはヘテロ原子である）のアルキル鎖を介して結合し得る。鎖は（ＣＨ_２）ｎであり得、式中ｎは１〜５である。基は（ＣＨ_２）_５ＣＯＯＨであってよい。あるいは、Ｒｅ_１の一部としてアリール基があり得る。Ｒｅ_１は、カルボキシが直接またはさらなるアルキル鎖を介して結合した任意のアリール基であり得る。Ｒｅ_１はＣＨ_２ＣＯＯＨまたはＣＨ_２ＣＯＯ⁻またはそのアミドもしくはエステルで置換されたアリール基であり得る。本明細書に記載の任意の式において、以下の部分
は、
の形をとり得る。

式中、Ｒｄ_１およびＲｄ_２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであり；
ｎはそれぞれ独立して０〜６であり；
ＸはＯＨ、Ｏ⁻、またはエステルもしくはアミドである。

カルボキシ基がＲｅ_１に結合する場合、ｎは０であり得る。あるいは、多くの基の１つが環に存在し得、例えば、ｎは１であり得、Ｒｂ_１はハロゲン、スルホンアミド、またはＳＯ_３ ⁻であり得る。概して、コンジュゲート反応は、多数のＣＯＯＨ部分を介して起き得るはずがないため、化合物は、Ｒｂ１およびＲｅ１の両位置で同時にカルボキシ基を有することはない。

Ｒｃ_１およびＲｃ_２は、それぞれ独立して、カルボキシ基、アミノ基、アミド基、スルホ基、またはスルホンアミド基で置換され得る。分子は、Ｒｃの位置で１つまたは複数のアルキル−スルホネート部分を含有し得る。Ｒｃ_１および／またはＲｃ_２の何れかはアルキル−ＳＯ_３ ⁻であり得る。その他のＲｃ（Ｒｃ_１またはＲｃ_２）は独立してアルキルまたは置換アルキルであり得る。Ｒｃ_１およびＲｃ_２は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、または（ＣＨ_２）_ｑＳＯ_３Ｈであり得、式中、ｑは１〜６である。ｑは１〜４でよい。ｑは４でよい。Ｒｃ_１およびＲｃ_２は置換アルキル基であり得る。Ｒｃ_１およびＲｃ_２はＣＯＯＨまたは−ＳＯ_３Ｈ部分またはそのエステルもしくはアミドの誘導体を含有し得る。

Ｒｄ_１およびＲｄ_２はそれぞれ独立してＨまたはメチルであり得る。Ｒｄ_１およびＲｄ_２は同一または異なり得る。概して、Ｒｄ_１およびＲｄ_２は、分子に非対称を導入することを避けるため、同一であるだろう。Ｒｄ_１およびＲｄ_２は、両方ともＨであり得る。Ｒｄ_１およびＲｄ_２は、両方ともメチルであり得る。

化合物の例としては、式（ＩＩ）の構造：
電荷／負電荷の対イオンであって、ｍは０〜３の整数であり；
ｎはそれぞれ独立して０〜６であり；
Ｒａ_１は、Ｈ、ＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲンであるか、または、隣接する炭素原子に縮合し、ＳＯ_３ ⁻置換基、スルホンアミド置換基、ハロゲン置換基を含有し得るさらなる環であり；
Ｒｂ_１はＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、ＣＯＯＨ、またはそのアミドもしくはエステルであって、ｎは０〜３であり；
ＸはＯＨ、Ｏ⁻、またはエステルもしくはアミドである。

化合物のさらなる例としては、式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｃ）の構造が挙げられる。

化合物の例としては、式（ＩＶ）の構造：
またはその塩が挙げられ、式中、ｍＣａｔ＋またはｍＡｎ−は、有機または無機の、正電荷／負電荷の対イオンであって、ｍは０〜３の整数であり；
Ｒａ_１は、Ｈ、ＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲンであるか、または、隣接する炭素原子に縮合し、ＳＯ_３ ⁻置換基、スルホンアミド置換基、ハロゲン置換基を含有し得るさらなる環であり；
Ｒｂ_１はＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、またはそのアミドもしくはエステルであって、ｎは０〜３であり；
Ｒｃ_１およびＲｃ_２はそれぞれ独立してアルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒｄ_１およびＲｄ_２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであり；
ＸはＯＨ、Ｏ⁻、またはエステルもしくはアミドであり；
ＹはＯ、Ｓ、またはＮから選択されるヘテロ原子であり；
Ｒｆ_１、Ｒｆ_２、Ｒｆ_３はそれぞれ独立してアルキルまたはアリール基である。

本明細書に記載の化合物は、５０ｎｍ超のストークスシフトを有する。ストークスシフトは、１００ｎｍ超、または１５０超であることもあり得る。

特に有用な化合物は、本明細書に記載の色素で標識したヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。

標識化ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アミドを形成するカルボキシ基を介して標識を有し得る。標識化ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ピリミジン塩基のＣ５位置または７−デアザプリン塩基のＣ７位置に、リンカー部分を介して結合した標識を有し得る。

標識化ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、また、ヌクレオチドのリボース糖またはデオキシリボース糖に共有結合した保護基を有し得る。保護基は、リボース糖またはデオキシリボース糖の任意の位置に結合し得る。特定の実施形態では、保護基は、ヌクレオチドのリボース糖またはデオキシリボース糖の３’ＯＨ位置にある。

本明細書で提供するのは２つ以上のヌクレオチドを含むキットであり、ここにおいて、少なくとも１つのヌクレオチドが本開示の化合物で標識したヌクレオチドである。キットは、２つ以上の標識化ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドは、２つ以上の蛍光標識で標識し得る。２つ以上の標識は、単一励起光源を用いて励起することができ、該光源はレーザまたはＬＥＤであり得る。例えば、２つ以上の標識の励起バンドは、少なくとも部分的にオーバーラップし得、その結果、スペクトルのオーバーラップ領域の励起は、両方の標識に蛍光を発光させる。特定の実施形態では、２つ以上の標識からの発光は異なるスペクトル領域から生じさせ、その結果、少なくとも１つの標識の存在は、オプション的に発光を識別することにより判断され得る。

ヌクレオチドは、２つ以上の蛍光標識で標識し得る。２つ以上の標識は、異なる励起源を異なる波長で用いて励起させることができ、該励起源はレーザであり得る。例えば、２つ以上の標識の励起バンドは、少なくとも部分的にオーバーラップし得、その結果、スペクトルのオーバーラップ領域の発光は、両方の標識に同一の検出波長で蛍光を発光させる。各標識は、励起波長の１つによって励起するだけであり、したがって、色素は、その別個の励起プロファイルにより、別々に検出可能である。特定の実施形態では、２つ以上の標識からの励起は異なるスペクトル領域で生じ、その結果、少なくとも１つの標識の存在は、オプション的に励起を識別することにより判断され得る。

このようなプロファイリングは、例えば、本明細書に記載する化合物を用いるなど、長ストークスシフトを有する標識を用いることでのみ実行可能である。

いったん２つの標識を識別することができたら、４つの別個のヌクレオチドを、２つの標識のみを用いて特定することが可能である。ヌクレオチド１は標識１で標識することが可能である。ヌクレオチド２は標識２で標識することが可能である。ヌクレオチド３は標識１および標識２の両方の混合物で標識することが可能であり、ヌクレオチド４は未標識（黒色（dark））とすることが可能である。

したがって、キットは、本明細書に記載の標識化ヌクレオチド化合物と、同一の波長で発光するがストークスシフトはより小さい、さらなる標識化ヌクレオチドを含み得る。

本明細書に含まれるのは、４つのヌクレオチドを含むキットであり、ここにおいて、第１ヌクレオチドは本明細書に記載する標識化ヌクレオチドであり、第２ヌクレオチドは第１標識化ヌクレオチドと同じ波長で発光する標識で標識し、第３ヌクレオチドは標識の混合物で標識し、第４は４つの標識化ヌクレオチドがそれぞれ互いに識別可能であるように未標識である。

キットは、４つの標識化ヌクレオチドを含有し得、ここにおいて、４つのヌクレオチドのうち第１は、本明細書に開示する化合物で標識する。このようなキットにおいて、第２、第３、および第４ヌクレオチドは、それぞれ、第１ヌクレオチドの標識とはオプションとして異なり、かつ互いの標識とはオプションとして異なる化合物で標識することが可能である。したがって、１つまたは複数の化合物は、別個の吸収最大値および／または発光最大値を有し得、その結果、該化合物は他の化合物と識別可能である。例えば、各化合物は、別個の吸収最大値および／または発光最大値を有し得、その結果、化合物はそれぞれ、その他３つの化合物と識別可能である。吸収スペクトルおよび／または発光スペクトルの最大値以外の部分が異なり、これらの差を利用して化合物を識別することが可能であることを理解されたい。キットは、２つ以上の化合物が６００ｎｍを超える別個の吸収最大値を有するものであり得る。本発明の化合物は、典型的には、５００ｎｍ未満の光を吸収するが、６００ｎｍ超の波長では光を発する。

本明細書に記載する化合物、ヌクレオチド、またはキットを用いて、生物系（例えば、プロセスまたはその構成要素を含む）を検出する、測定する、または特定することができる。化合物、ヌクレオチド、またはキットを利用し得る例示的な技法としては、シーケンシング、発現解析、ハイブリダイゼーション解析、遺伝子解析、ＲＮＡ解析、細胞アッセイ（例えば、細胞結合もしくは細胞機能解析）、またはタンパク質アッセイ（例えば、タンパク質結合アッセイもしくはタンパク質活性アッセイ）が挙げられる。自動化シーケンシング機器など、特定の技法を実行するための自動化機器において使用可能である。シーケンシング機器は、異なる波長で作動する２つのレーザを備え得る。シーケンシング機器は単一発光チャネルを有し得、そのため、該シーケンシング機器は、多数の発光フィルタの必要性を低くするまたは無くすことができる。検出系は、既定の発光波長に設定された単一検出チャネルを有し得る。

本明細書で開示するのは、本開示の化合物を合成する方法である。

本開示に従って調製するのは、新規の出発物質、例えば（ＳＭ２）であり、これは新規の色素の合成を可能にする。

式（Ｘ）の化合物またはその塩を、ポリメチン色素の合成の出発物質として用いることができ：
式中、Ｒａ_１は、Ｈ、ＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲンであるか、または、隣接する炭素原子に縮合し、ＳＯ_３ ⁻置換基、スルホンアミド置換基、ハロゲン置換基を含有し得るさらなる環であり；
Ｒｂ_１はＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、またはＣＯＯＨであって、ｎは０〜３であり；
Ｒｃ_１およびＲｃ_２はそれぞれ独立してアルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒｄ_１およびＲｄ_２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールである。

式（Ｘ’）の化合物またはその塩を、ポリメチン色素の合成の出発物質として用いることができ：
式中、ｘは０〜２であり、Ｒａ_１は、Ｈ、ＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲンであるか、または、隣接する炭素原子に縮合し、ＳＯ_３ ⁻置換基、スルホンアミド置換基、ハロゲン置換基を含有し得るさらなる環であり；
Ｒｂ_１はＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、またはＣＯＯＨであって、ｎは０〜３であり；
Ｒｃ_１およびＲｃ_２はそれぞれ独立してアルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒｄ_１およびＲｄ_２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールである。

本明細書で用いる場合、用語「アルキル」は、Ｃ_１〜Ｃ_１０の炭化水素を指し、それはＣ_３〜Ｃ_１０の非芳香族炭素環を含み得る。特定の実施形態では、アルキル基はＣ_１〜Ｃ_６アルキルであり、これは、それぞれ１〜６個の炭素原子を含有する、飽和した、直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを指す。アルキル基は、１つまたは複数の不飽和基を含み、したがって、アルケニルおよびアルキニルが含まれ得る。

用語「ハロゲン」は、本明細書で用いる場合、フルオロ−（以後、Ｆと示す）、クロロ−（以後、Ｃｌと示す）、ブロモ−（以後、Ｂｒと示す）、またはヨード−（以後、Ｉと示す）を指し、通常、有機化合物の水素原子の置換に関連し、この置換はオプションとして水素の完全な置換である。

用語「置換アルキル」は、上記で定義したアルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基を指し、ここにおいてそれらの基は、オプションとして、限定されるわけではないが、ハロ、シアノ、ＳＯ_３ ⁻、ＳＲａ、ＯＲａ、ＮＲｂＲｃ、ｏｘｏ、ＣＯＮＲｂＲｃ、ＣＯＯＨ、およびＣＯＯＲｂでさらに置換され得る。Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、および置換アリールから選択され得る。さらに、前記置換アルキル、置換アルケニル、および置換アルキニルは、オプションとして、Ｏ、ＮＲｂ、およびＳ（Ｏ）_ｔ（式中、ｔは０〜２である）などから選択される少なくとも１つのヘテロ原子または基が挿入され得る。置換アルキルは、また、アルキル基がさらなるアリールまたは置換アリール部分を含む、ベンジルなどの基を対象として含む。

本開示に従う色素は、Ｎ−フェニルインドールを含む、種々の異なる出発物質より合成することができる。ポリメチン色素を調製する方法は当技術分野で周知である。

本開示の態様により、基質部分への結合に適した、特に基質部分への結合を可能にするリンカー基を含む色素化合物を提供する。基質部分は、事実上、本開示の色素がコンジュゲートすることが可能な任意の分子または基質であり得、該基質部分としては、非限定的な例として、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、カーボンハイドレート、リガンド、粒子、固体表面、有機ポリマー、無機ポリマー、染色体、核、生細胞、およびその組み合わせまたは集合体が挙げられる。色素は、疎水性引力、イオン引力、および共有結合を含む種々の手段によって、オプションのリンカーとコンジュゲートし得る。特に、色素は、共有結合により基質にコンジュゲートする。より具体的には、共有結合は、リンカー基によってである。

色素化合物の基質へのコンジュゲートは、カルボキシル基Ｒｂ_１を介して、またはＲｅ_１の一部として行われ得、これはアミドまたはエステルになり得る。

本開示の色素には、該色素が別の分子へ共有結合するために、置換基位置の１つにおいて反応性リンカー基が含まれ得る。反応性リンカー基は、結合（例えば、共有結合または非共有結合）を形成することが可能な部分である。特定の実施形態では、リンカーは開裂可能なリンカーとすることができる。用語「開裂可能なリンカー」の使用は、全リンカーが除去される必要があることを含意することを意図するものではない。開裂部位はリンカー上のある位置にあり、リンカーの一部を、開裂後、色素および／または基質部分に結合させたままにする。開裂可能なリンカーは、非限定的な例として、求電子的に開裂可能なリンカー、酵素的に開裂可能なリンカー、求核的に開裂可能なリンカー、光開裂可能なリンカーとすることができ、還元条件下（例えば、ジスルフィドまたはアジドを含有するリンカー）、酸化条件下で開裂可能であり、セーフティキャッチリンカーの使用を介して開裂可能であり、脱離機構により開裂可能であり得る。色素化合物を基質部分に結合させるために開裂可能なリンカーを使用することは、例えば検出後に、標識を取り除くことにより、下流のステップで任意の干渉信号を防止するというオプションを提供する。

有用なリンカー基は、国際公開第２００４／０１８４９３号（参照により本明細書に組み込まれるものとする）に見ることができ、その例としては、水溶性ホスフィンを用いて、または、遷移金属から形成される水溶性遷移金属触媒と少なくとも部分的に水溶性のリガンドを用いて開裂され得るリンカーが含まれる。水溶液において、後者は、少なくとも部分的に水溶性である遷移金属錯体を形成する。このような開裂可能なリンカーを用いて、ヌクレオチドの塩基を本明細書に記載の色素などの標識に連結させることが可能である。

以下の式の部分を含むような特定のリンカーを、国際公開第２００４／０１８４９３号（参照により本明細書に組み込まれるものとする）に見ることができる：
（式中、ｘはＯ、Ｓ、ＮＨ、およびＮＱからなる群から選択され、ＱはＣ１〜１０の置換または非置換のアルキル基であり、ＹはＯ、Ｓ、ＮＨ、およびＮ（アリル）からなる群から選択され、Ｔは水素またはＣ_１〜Ｃ_１０の置換もしくは非置換のアルキル基であり、*は部分がヌクレオチドまたはヌクレオシドの残部に連結する場所を示す）。

特定の実施形態では、蛍光色素（フルオロフォア）とグアニン塩基の間のリンカーの長さを、例えば、ポリエチレングリコールスペーサ基を導入することにより変更して、それにより、当技術分野で既知である、他の結合を介してグアニン塩基に結合した同一のフルオロフォアと比較し蛍光強度を高めることが可能である。例示的なリンカーおよびその特性は、国際公開第０７０２０４５７号として公開された英国特許出願第０５１７０９７．２号明細書（参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。リンカーの設計、特にその長さの増加は、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドに組み込まれた際、グアノシンヌクレオチドのグアニン塩基に結合したフルオロフォアの輝度を改善させることが可能である。したがって、色素を、グアニン含有ヌクレオチドに結合した蛍光色素標識の検出を利用する任意の解析法で使用する場合、式−（（ＣＨ_２）_２Ｏ）_ｎ−（式中、例えば、国際公開第０７０２０４５７号に記載されるように、ｎは２〜５０の整数である）のスペーサ基を有するリンカーを用いることが有利であり得る。

本開示は、さらに、本明細書に記載の１つまたは複数の色素で標識したヌクレオシドおよびヌクレオチドのコンジュゲートを提供する（修飾ヌクレオチド）。標識したヌクレオシドおよびヌクレオチドは、非限定的な例として、ＰＣＲ増幅、等温増幅、固相増幅、ポリヌクレオチドシーケンシング（例えば、固相シーケンシング）、およびニックトランスレーション反応などにおいて、酵素合成により形成されるポリヌクレオチドを標識するのに有用である。

ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖または核酸塩基の部位において標識され得る。当技術分野で既知のように、「ヌクレオチド」は、窒素塩基、糖、および１つまたは複数のリン酸基からなる。ＲＮＡでは、糖はリボースであり、ＤＮＡでは糖はデオキシリボース、つまり、リボースには存在するヒドロキシル基がない糖である。窒素塩基は、プリンまたはピリミジンの誘導体である。プリンはアデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）であり得、ピリミジンはシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、またはＲＮＡの文脈ではウラシル（Ｕ）であり得る。デオキシリボースのＣ−１原子は、ピリミジンのＮ−１またはプリンのＮ−９に結合する。ヌクレオチドは、また、糖のＣ−３またはＣ−５に結合したヒドロキシル基でエステル化が生じている、ヌクレオシドのリン酸エステルである。ヌクレオチドは、通常、一リン酸、二リン酸、または三リン酸である。

「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドと構造的に似ているが、リン酸部分が欠けている。ヌクレオシド類似体の一例は、標識が塩基に連結し、糖部分に結合したリン酸基がないものであろう。

塩基は、通常、プリンまたはピリミジンを指すが、当業者は、ワトソン・クリック塩基対合するヌクレオチドまたはヌクレオシドの機能を変えない誘導体および類似体が利用可能であることを理解するだろう。「誘導体」または「類似体」は、そのコア構造が親化合物のコア構造と同じかまたは良く似ているが、例えば、該誘導体ヌクレオチドまたはヌクレオシドを別の分子に連結させることを可能にする、異なるまたは追加の側基などの化学的または物理的修飾を有する化合物または分子を意味する。例えば、塩基はデアザプリンであってよい。特定の実施形態では、誘導体は、ワトソン・クリック対合することが可能である。「誘導体」および「類似体」としては、また、例えば、修飾塩基部分および／または修飾糖部分を有する合成ヌクレオチドまたはヌクレオシド誘導体も挙げられる。このような誘導体および類似体は、例えば、Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) and Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990で論じられている。ヌクレオチド類似体は、また、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキル−ホスホナート結合、ホスホラニリダート結合、およびホスホロアミダート結合などを含む修飾ホスホジエステル結合を有し得る。

色素は、ヌクレオチド塩基の任意の位置に、例えば、リンカーを介して結合し得る。特定の実施形態において、ワトソン・クリック塩基対合はなお、結果として生じる類似体で行われ得る。特定の核酸塩基標識部位としては、ピリミジン塩基のＣ５位置または７−デアザプリン塩基のＣ７位置が挙げられる。上記のように、リンカー基を用いて、色素をヌクレオシドまたはヌクレオチドに共有結合させることができる。

特定の実施形態において、標識化したヌクレオシドまたはヌクレオチドは、酵素的に組み込み可能であり、酵素的に伸長可能であり得る。したがって、リンカー部分の長さは、ヌクレオチドを化合物に連結させるのに十分であり得、その結果、該化合物は全体の結合および核酸複製酵素によるヌクレオチド認識に著しく干渉することはない。したがって、リンカーはまた、スペーサ単位を含み得る。スペーサは、例えば、ヌクレオチド塩基を開裂部位または標識から遠ざける。

本開示の色素で標識したヌクレオシドまたはヌクレオチドは以下の式を有し得る：

式中、色素は本開示の色素化合物であり、Ｂは、例えば、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、およびグアニンなどの核酸塩基であり、Ｌは存在してもしなくてもよいオプション的なリンカー基である。Ｒ’はＨ、一リン酸、二リン酸、三リン酸、チオリン酸、ホスフェートエステル類似体、反応性リン含有基に結合した−Ｏ−、または保護基により保護された−Ｏ−とすることが可能である。Ｒ’’は、Ｈ、ＯＨ、ホスホラミダイト、または３’ＯＨ保護基であり得、Ｒ’’’はＨまたはＯＨである。

Ｒ’’がホスホラミダイトである場合、Ｒ’は酸開裂可能ヒドロキシル保護基であり、これは、自動化合成条件下で後続のモノマーカップリングを可能にする。

特定の実施形態では、保護基は色素化合物から離れて独立しており、つまり、色素化合物に直接結合していない。代替的な実施形態では、色素は３’ＯＨ保護基の全てまたは一部分を含み得る。したがって、Ｒ’’は３’ＯＨ保護基であり得、これは、本明細書に開示する色素化合物を含んでいてもいなくてもよい。

さらに別の代替的な実施形態では、ペントース糖の３’炭素に保護基はなく、塩基に結合した色素（または色素およびリンカーの構造体）は、例えば、さらなるヌクレオチドの組み込みへのブロックとして機能するのに十分なサイズまたは構造であり得る。したがって、色素が糖の３’位置に結合していても結合していなくても、保護は立体障害に起因し得、または、サイズ、電荷、および構造の組み合わせに起因し得る。

さらに別の代替的な実施形態では、保護基はペントース糖の２’または４’の炭素に存在し、さらなるヌクレオチドの取り込みへのブロックとして機能するのに十分なサイズまたは構造であり得る。

保護基の使用は、修飾ヌクレオチドが組み込まれる際に伸長を止めることなどにより、重合を制御することを可能にする。例えば、非限定的な例として、化学条件を変更するまたは化学的保護の除去により保護効果が可逆的である場合、伸長をある点で停止させ、それから継続させることが可能である。

別の特定の実施形態では、３’ＯＨ保護基は、国際公開第２００４／０１８４９７号（参照により本明細書に組み込まれるものとする）で開示させる部分を含むだろう。例えば、保護基は、アジドメチル（ＣＨ_２Ｎ_３）またはアリルとすることができる。

特定の実施形態では、リンカー（色素とヌクレオチドの間）と保護基は、両方とも存在し、分離した部分である。特定の実施形態では、リンカーおよび保護基は両方とも、実質的に類似した条件下で開裂可能である。したがって、脱保護および非ブロック化プロセスは、色素化合物および保護の除去に単一処理を必要とするだけであるため、より効率的であり得る。しかしながら、一部の実施形態では、リンカーおよび保護基は、類似の条件下で開裂可能である必要はなく、代わりに、別個の条件下で個別に開裂可能である。

本開示は、また、色素化合物を組み込むポリヌクレオチドを包含する。このようなポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合したデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドをそれぞれ含むＤＮＡまたはＲＮＡとすることができる。本開示のポリヌクレオチドには、本明細書に記載の少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（例えば、色素化合物で標識した）と組み合わせた、天然に存在するヌクレオチド、本開示の修飾ヌクレオチド以外の非天然に存在する（もしくは修飾された）ヌクレオチド、または任意のその組み合わせが含まれ得る。本開示のポリヌクレオチドは、また、非天然骨格結合および／または非ヌクレオチド化学的修飾を含み得る。本開示の少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの混合物を含むキメラ構造についても考察する。

本開示の色素化合物を含む修飾ヌクレオチド（またはヌクレオシド）は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドに結合した蛍光標識を、それ自体であっても、より大きい分子構造もしくはコンジュゲートに組み込まれていても、またはより大きい分子構造もしくはコンジュゲートに関連していても、検出することを含む方法など、任意の解析法において用いることができる。この文脈では、用語「ポリヌクレオチドに組み込まれた」は、５’リン酸が、それ自体でより長いポリヌクレオチド鎖の一部を形成し得る第２（修飾または非修飾の）ヌクレオチドの３’ヒドロキシル基にホスホジエステル結合で連結することを意味する。本明細書に記載の修飾ヌクレオチドの３’末端は、さらなる（修飾または非修飾の）ヌクレオチドの５’リン酸にホスホジエステル結合で結合する場合も、しない場合もある。したがって、非限定的な一実施形態では、本開示は、ポリヌクレオチドに組み込まれた修飾ヌクレオチドを検出する方法であって：（ａ）本開示の少なくとも１つの修飾ヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込むステップと、（ｂ）前記修飾ヌクレオチドに結合した色素化合物からの蛍光シグナルを検出することにより、前記ポリヌクレオチドに組み込まれた修飾ヌクレオチドを検出するステップとを含む、方法を提供する。

本方法は、本開示の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドがポリヌクレオチドに組み込まれる合成ステップ（ａ）と、前記ポリヌクレオチドに組み込まれた１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを、前記修飾ヌクレオチドの蛍光を検出または量的に測定することにより検出する検出ステップ（ｂ）を含み得る。

本開示の一実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、ポリメラーゼ酵素の作用により、合成ステップにおいてポリヌクレオチドに組み込まれる。しかしながら、例えば、化学オリゴヌクレオチド合成または標識化オリゴヌクレオチドの非標識化オリゴヌクレオチドへのライゲーションなど、修飾ヌクレオチドをポリヌクレオチドに結合させる他の方法も用いることが可能である。そのため、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに関連して用いる場合、用語「組み込み」は、化学的方法および酵素的方法によるポリヌクレオチド合成を包含し得る。

特定の実施形態では合成ステップが実行され、該合成ステップには、オプションとして、本開示の蛍光標識した修飾ヌクレオチドを含む反応混合物を用いた、鋳型ポリヌクレオチド鎖のインキュベーションが含まれ得る。ポリメラーゼは、また、鋳型ポリヌクレオチド鎖にアニールしたポリヌクレオチド鎖の遊離３’ヒドロキシル基と、修飾ヌクレオチドの５’リン酸基の間のホスホジエステル結合の形成を可能にする条件下で提供され得る。したがって、合成ステップには、ヌクレオチドの鋳型鎖への相補的な塩基対合により誘導されるポリヌクレオチド鎖の形成が含まれ得る。

本方法の全ての実施形態において、修飾ヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチド鎖が鋳型鎖にアニールされる間、または、２本の鎖を分離させる変性ステップの後に、検出ステップは実行され得る。さらなるステップ、例えば化学反応ステップ、酵素反応ステップ、または精製ステップが、合成ステップと検出ステップの間に含まれ得る。特に、修飾ヌクレオチドを組み込む標的鎖は、単離され、または精製され、次に、さらに処理されるかまたは後続の解析で用いられ得る。例として、合成ステップにおいて修飾ヌクレオチドで標識した標的ポリヌクレオチドは、標識したプローブまたはプライマーとして後から用いることができる。他の実施形態では、本明細書に記載の合成ステップの産物は、さらなる反応ステップに供し得、所望であれば、これらの後続ステップの産物を精製または単離することが可能である。

合成ステップに適切な条件は、標準分子生物学技法に通じている人にとっては周知であろう。一実施形態では、合成ステップは、本明細書に記載の修飾ヌクレオチドを含むヌクレオチド前駆体を用いて、適切なポリメラーゼ酵素の存在下で鋳型鎖に相補的な伸長標的鎖を形成する、標準プライマー伸長反応に類似し得る。他の実施形態では、合成ステップは、それ自体が、標的および鋳型ポリヌクレオチド鎖の複製に由来するアニール化相補鎖を含む標識化二重鎖増幅産物を生成する増幅反応の一部をなし得る。他の例示的な合成ステップとしては、ニックトランスレーション、鎖置換重合、ランダムプライムドＤＮＡ標識などが挙げられる。合成ステップに特に有用なポリメラーゼ酵素は、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドの組み込みを触媒することが可能なものである。種々の天然に存在するまたは修飾したポリメラーゼを用いることが可能である。例として、耐熱性ポリメラーゼは、熱サイクリング条件を用いて実行される合成反応で用いることが可能である一方、耐熱性ポリメラーゼは、等温プライマー伸長反応では望ましくない場合がある。本開示に従い修飾ヌクレオチドを組み込むことが可能な適切な耐熱性ポリメラーゼとしては、国際公開第２００５／０２４０１０号または同第０６１２０４３３号（これらの文献はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載されているものが挙げられる。３７℃などの低めの温度で実行される合成反応では、ポリメラーゼ酵素は、必ずしも耐熱性ポリメラーゼである必要はなく、そのため、ポリメラーゼの選択は、反応温度、ｐＨ、および鎖置換活性などのいくつかの因子に左右されよう。

特定の非限定的な実施形態では、本開示は、核酸シーケンシング、リシーケンシング、全ゲノムシーケンシング、一塩基多型スコアリング、または、ポリヌクレオチドに組み込まれる際に本明細書に記載の色素で標識した修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオシドの検出を伴う任意の他の用途の方法を包含する。蛍光色素を含む修飾ヌクレオチドで標識したポリヌクレオチドの使用から恩恵を受ける任意の種々の他の用途では、本明細書に記載の色素で標識した修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオシドを用いることが可能である。

特定の実施形態において、本開示は、ポリヌクレオチドシーケンシング・バイ・シンセシス反応における、本開示の色素化合物を含む修飾ヌクレオチドの使用を提供する。シーケンシング・バイ・シンセシスは、概して、シーケンシングする鋳型核酸に相補的な伸長ポリヌクレオチド鎖を形成するために、１つまたは複数のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼまたはリガーゼを用いて、成長するポリヌクレオチド鎖に５’から３’の方向で連続的に付加することを伴う。１つまたは複数の付加ヌクレオチドに存在する塩基の正体は、検出ステップまたは「イメージング」ステップで決定することが可能である。付加塩基の正体は、各ヌクレオチド組み込みステップの後、決定することができる。鋳型の配列は、次に、従来のワトソン・クリック塩基対合ルールを用いて推測することができる。単一塩基の正体を決定するために本明細書に記載の色素で標識した修飾ヌクレオチドを使用することは、例えば、一塩基多型のスコアリングにおいて有用であり得、このような単一塩基伸長反応は、本開示の範囲内にある。

本開示の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドの配列を、シーケンシングされる鋳型ポリヌクレオチドに対して相補的な新生鎖への１つまたは複数のヌクレオチドの組み込みを、組み込まれるヌクレオチドに付着させた蛍光標識の検出を介して検出することにより決定する。鋳型ポリヌクレオチドのシーケンシングは、適切なプライマーを用いて予備刺激され得（または、ヘアピンの一部としてプライマーを含有するだろうヘアピン構造として準備され得）、新生鎖は、ポリメラーゼ触媒反応においてプライマーの３’末端にヌクレオチドを付加することにより、段階的な方法で伸長する。

特定の実施形態では、異なるヌクレオチド三リン酸（Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣ）のそれぞれを特異的なフルオロフォアで標識することができ、該ヌクレオチド三リン酸は、また、３’位置に保護基を含んで非制御の重合を防ぐ。あるいは、４つのヌクレオチドのうち１つは未標識（黒色）でよい。ポリメラーゼ酵素は、鋳型ポリヌクレオチドに対し相補的な新生鎖にヌクレオチドを組み込み、保護基は、さらなるヌクレオチドの組み込みを防ぐ。任意の組み込まれなかったヌクレオチドは洗い流され、組み込まれたヌクレオチドそれぞれからの蛍光シグナルは、オプション的に、電荷結合デバイスなどの適切な手段により、レーザ励起および適切な発光フィルタを用いて「読み取る」ことが可能である。３’−保護基および蛍光色素化合物を、次に、（同時にまたは連続して）取り除いて（脱保護して）、さらなるヌクレオチド組み込みのために新生鎖をさらすことが可能である。典型的には、組み込まれたヌクレオチドの正体は、各組み込みステップの後に決定されるだろうが、これは厳密には必須ではない。同様に、米国特許第５３０２５０９号明細書（この文献は参照により組み込まれるものとする）は、固体支持体に固定されたポリヌクレオチドをシーケンシングする方法を開示する。

上記で例示するように、本方法は、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、蛍光的に標識した３’−保護ヌクレオチド、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴの、固定ポリヌクレオチドに対し相補的な成長鎖への組み込みを利用する。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドに対し相補的な塩基を組み込むが、さらなる付加は３’−保護基により妨げられる。組み込まれたヌクレオチドの標識が次に決定され、保護基は化学的開裂により取り除かれて、さらなる重合の発生を可能にする。シーケンシング・バイ・シンセシス反応においてシーケンシングされる核酸鋳型は、シーケンシングすることが望まれる任意のポリヌクレオチドとすることができる。シーケンシング反応用の核酸鋳型は、典型的には、プライマーまたはシーケンシング反応においてさらなるヌクレオチドの付加の開始点として機能する、遊離３’ヒドロキシル基を有する二重鎖領域を含むだろう。シーケンシングされる鋳型領域は、相補鎖のこの遊離３’ヒドロキシル基から突き出ているだろう。シーケンシングされる鋳型の突き出た領域は一本鎖とすることができるが、シーケンシングされる鋳型鎖に対し相補的な鎖に「ニックが存在し」て、シーケンシング反応を開始させるための遊離３’ＯＨ基が提供される場合、二重鎖とすることも可能である。このような実施形態では、シーケンシングは鎖置換により進められ得る。ある実施形態では、遊離３’ヒドロキシル基を担持するプライマーは、シーケンシングされる鋳型の一本鎖領域にハイブリダイズする別個の構成要素（例えば、短オリゴヌクレオチド）として付加され得る。あるいは、プライマーおよびシーケンシングされる鋳型鎖は、それぞれ、例えばヘアピンループ構造などの分子間重複を形成することが可能な、部分的に自己相補的な核酸鎖の一部を形成し得る。ヘアピンポリヌクレオチドおよび、該ヘアピンポリヌクレオチドを固体支持体に付着させる方法は、国際公開第０１５７２４８号および同第２００５／０４７３０１号に開示されており、これらの文献はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれるものとする。ヌクレオチドは、成長プライマーに連続的に付加され得、結果として５’から３’の方向にポリヌクレオチド鎖の合成を生じさせる。付加された塩基の性質は、必ずというわけではないが、特に、各ヌクレオチド付加の後に決定され得、したがって、核酸鋳型の配列情報が提供される。したがって、ヌクレオチドは、該ヌクレオチドを核酸鎖の遊離３’ヒドロキシル基に、ヌクレオチドの５’リン酸基とのホスホジエステル結合の形成を介して連結することにより、核酸鎖（またはポリヌクレオチド）に組み込まれる。

シーケンシングされる核酸鋳型は、ＤＮＡ、または、ＲＮＡ、またはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含むハイブリッド分子であってもよい。核酸鋳型は、天然に存在するおよび／または天然に存在しないヌクレオチド、ならびに、天然または非天然の骨格結合を含み得る。ただし、これらはシーケンシング反応において鋳型の複製を妨げない。

ある実施形態では、シーケンシングされる核酸鋳型は、当技術分野で既知の任意の適切な結合方法を介して、例えば、共有結合を介して、固体支持体に付着させることができる。ある実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは固体支持体（例えば、シリカベースの支持体）に直接付着させることができる。しかしながら、本開示の他の実施形態では、固体支持体の表面は、鋳型ポリヌクレオチドの直接的な共有結合を可能にするか、または、鋳型ポリヌクレオチドを、それ自体は固体支持体に非共有結合的に付着するヒドロゲルもしくは高分子電解質の多層を介して固定することを可能にするように、何らかの方法で修飾することができる。

ポリヌクレオチドをシリカベースの支持体に直接付着させたアレイは、例えば、国際公開第００００６７７０号（参照により本明細書に組み込まれるものとする）に開示のものであり、ここにおいて、ポリヌクレオチドは、ガラス上のペンダントエポキシド基とポリヌクレオチドの内在アミノ基の間の反応によりガラス支持体に固定される。加えて、ポリヌクレオチドは、例えば、国際公開第２００５／０４７３０１号（参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載されているように、硫黄ベースの求核試薬と固体支持体の反応により固体支持体に付着させることが可能である。固体支持された鋳型ポリヌクレオチドのさらなる例では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、国際公開第００／３１１４８号、同第０１／０１１４３号、同第０２／１２５６６号、同０３／０１４３９２号、米国特許第６４６５１７８号明細書、および国際公開第００／５３８１２号（これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載されているように、シリカベースのまたは他の固体支持体に支持されたハイドロゲルに付着する。

鋳型ポリヌクレオチドが固定され得る特定の表面は、ポリアクリルアミドハイドロゲルである。ポリアクリルアミドハイドロゲルは、上記で引用した参考文献および国際公開第２００５／０６５８１４号（この文献は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。

ＤＮＡ鋳型分子は、例えば、米国特許第６１７２２１８号明細書（この文献は参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載されているように、ビーズまたはマイクロ粒子に付着させることが可能である。ビーズまたはマイクロ粒子への付着は、シーケンシング用途向けに有用であり得る。ビーズライブラリは、各ビーズが異なるＤＮＡ配列を含有するように調製することが可能である。例示的なライブラリおよびそれを生成する方法は、Nature. 437, 376-380 (2005)；Science. 309, 5741, 1728-1732 (2005)に記載されており、これらの文献はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれるものとする。本明細書に記載のヌクレオチドを用いてこのようなビーズのアレイをシーケンシングすることは、本開示の範囲内にある。

シーケンシングされる鋳型は、固体支持体上の「アレイ」の一部をなし得、この場合、アレイは任意の都合のよい形をとり得る。したがって、本開示の方法は、単一分子アレイ、クラスタ化アレイ、およびビーズアレイを含む、全てのタイプの高密度アレイに適用可能である。本開示の色素化合物で標識した修飾ヌクレオチドは、限定するわけではないが、核酸分子の固体支持体への固定により形成されるものを含む、本質的には任意のタイプのアレイにおいて、シーケンシング鋳型として用いることができる。

しかしながら、本開示の色素化合物で標識した修飾ヌクレオチドは、クラスタ化アレイをシーケンシングする文脈において、特に有利である。クラスタ化アレイでは、アレイ上の別個の領域（しばしば、部位またはフィーチャという）に、多数のポリヌクレオチド鋳型分子が含まれる。概して、多数のポリヌクレオチド分子は、光学手段によって個別に解像可能ではなく、代わりに、集合として検出される。アレイの形成方法に応じ、アレイの各部位は１つの個別ポリヌクレオチド分子の多数の複製を含むか（例えば、該部位は特定の一本鎖または二重鎖の核酸種に関して均質である）、または、少数の異なるポリヌクレオチド分子の多数の複製（例えば２つの異なる核酸種の多数の複製）を含むことさえあり得る。核酸分子のクラスタ化アレイは、当技術分野で一般的に知られている技法を用いて生成することができる。例えば、国際公開第９８／４４１５１号および同第００／１８９５７号（これらの文献はそれぞれ、本明細書に組み込まれるものとする）には、核酸の増幅方法が記載され、そこでは、鋳型および増幅産物の両方が、固定化核酸分子のクラスタまたは「コロニー」を含むアレイを形成するために、固体支持体に固定されたままである。これらの方法にしたがって調製されたクラスタ化アレイに存在する核酸分子は、本開示の色素化合物で標識した修飾ヌクレオチドを用いたシーケンシングのための、適切な鋳型である。

本開示の色素化合物で標識した修飾ヌクレオチドは、また、単一分子アレイにおいて鋳型をシーケンシングする際に有用である。用語「単一分子アレイ」または「ＳＭＡ」は、本明細書で用いる場合、固体支持体全体に分布した（または、配置された）ポリヌクレオチド分子の集合を指し、任意の個々のポリヌクレオチドと集合の他の全てとの間隔は、個々のポリヌクレオチド分子を個別に解像することを可能にするものである。したがって、固体支持体の表面に固定した標的核酸分子は、一部の実施形態において、光学手段により解像することが可能である。これは、それぞれが１ポリヌクレオチドを表す１つまたは複数の別個のシグナルが、使用した特定のイメージングデバイスの解像領域内で生じることを意味する。

単一分子の検出は、アレイ上で隣接するポリヌクレオチド分子の間の間隔が少なくとも１００ｎｍ、より具体的には少なくとも２５０ｎｍ、さらにより具体的には少なくとも３００ｎｍ、さらにより具体的には少なくとも３５０ｎｍである場合に、達成され得る。したがって、各分子は単一分子蛍光点として個別に解像可能かつ検出可能であり、前記単一分子蛍光点からの蛍光は、また、単一ステップ光退色も呈する。

用語「個別に解像される」および「個別の解像」は、本明細書では、視覚化した際に、アレイ上の１分子をその近傍の分子から識別することが可能であることを明記するために用いる。アレイ上の個々の分子間の離隔距離は、個々の分子を解像するために用いられる特定の技法により、部分的に決定されるだろう。単一分子アレイの一般的なフィーチャは、国際公開第００／０６７７０号および同第０１／５７２４８号（これらの文献はそれぞれ参照により組み込まれるものとする）を参照することにより理解されよう。本開示の修飾ヌクレオチドの１つの使途は、シーケンシング・バイ・シンセシス反応であるが、修飾ヌクレオチドの有用性は、このような方法に限定されない。実際に、ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに組み込まれるヌクレオチドに付着させた蛍光標識の検出を必要とする任意のシーケンシング方法論において、有利に用いることができる。

特に、本開示の色素化合物で標識した修飾ヌクレオチドは、自動化蛍光シーケンシングプロトコルにおいて、特に、サンガーとその共同研究者の連鎖停止シーケンシング法に基づく蛍光色素ターミネーターサイクルシーケンシングにおいて用いることができる。このような方法は、概して、酵素とサイクルシーケンシングを用いて、プライマー伸長シーケンシング反応において蛍光標識したジデオキシヌクレオチドを組み込む。いわゆるサンガーシーケンシング法および関連プロトコル（サンガータイプ）は、標識化ジデオキシヌクレオチドを用いたランダム化連鎖停止を利用する。

したがって、本開示は、また、３’位置および２’位置の両方でヒドロキシル基を欠くジデオキシヌクレオチドである色素化合物で標識した修飾ヌクレオチドを包含し、このような修飾ジデオキシヌクレオチドは、サンガータイプのシーケンシング法などで用いるのに適している。

３’保護基を組み込む、本開示の色素化合物で標識した修飾ヌクレオチドは、また、サンガー法および関連のプロトコルで有用であり得ることが認識されよう。これは、修飾ジデオキシヌクレオチドを用いることにより達成されるのと同じ効果が、３’−ＯＨ保護基を有する修飾ヌクレオチドを用いて達成され得るためである（両者とも、後続のヌクレオチドの組み込みを防ぐ）。本開示の、３’保護基を有するヌクレオチドをサンガータイプのシーケンシング法で用いる場合、ヌクレオチドに付着させた色素化合物または検出可能標識は、開裂可能なリンカーを介して結合させる必要がないことが理解されよう。これは、本開示の標識化ヌクレオチドが組み込まれる各事例において、ヌクレオチドが後で組み込まれる必要はなく、したがって、標識をヌクレオチドから取り除く必要がないためである。

本開示は、また、修飾ヌクレオシドおよび／または色素で標識したヌクレオチドを含むキットを提供する。このようなキットは、概して、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは本明細書に記載の色素で標識したヌクレオシドを、少なくとも１つのさらなる構成要素とともに含むだろう。さらなる構成要素は、上記方法または以下の実施例の欄で特定される１つまたは複数の構成要素とすることができる。本開示のキットと組み合わせることが可能な構成要素の一部の非限定的例を、以下に記載する。

特定の実施形態では、キットは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは本明細書に記載の色素で標識したヌクレオシドを、修飾または非修飾のヌクレオチドまたはヌクレオシドとともに含み得る。例えば、本開示の色素で標識した修飾ヌクレオチドは、非標識ヌクレオチド、天然ヌクレオチド、および／または、蛍光標識ヌクレオチド、またはその任意の組み合わせと組み合わせて供給され得る。したがって、キットは、本開示の色素で標識した修飾ヌクレオチド、および、他の、例えば先行技術の色素化合物で標識した修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの組み合わせは、別個の個々の構成要素（例えば、容器もしくはチューブごとに１ヌクレオチドタイプ）またはヌクレオチド混合物（例えば、同一の容器もしくはチューブ内で混ぜられた２つ以上のヌクレオチド）として提供され得る。

キットに複数の、特に２つの、より具体的には４つの色素化合物で標識した修飾ヌクレオチドが含まれる場合、異なるヌクレオチドは異なる色素化合物で標識されるか、または、１つは色素化合物がなく黒色であるか、または、１つは２つの色素化合物の混合物で標識され得る。異なるヌクレオチドを異なる色素化合物で標識する場合、前記色素化合物がスペクトル的に識別可能な蛍光色素であることがキットの特徴である。本明細書で用いる場合、用語「スペクトル的に識別可能な蛍光色素」は、そうした色素が１つのサンプルに２つ以上存在する場合、蛍光検出機器（例えば、商業的なキャピラリベースのＤＮＡシーケンシングプラットフォーム）により識別することが可能な波長で蛍光エネルギーを発する蛍光色素を指す。蛍光色素化合物で標識した２つの修飾ヌクレオチドをキットの形で供給する場合、スペクトル的に識別可能な色素が、例えば、同じレーザによるなど、同じ波長で励起し得ることが一部の実施形態の特徴である。あるいは、スペクトル的に識別可能な蛍光色素が、例えば、異なるレーザだが同じ波長を発するなど、異なる波長で励起し得ることが一部の実施形態の特徴である。蛍光色素化合物で標識した４つの修飾ヌクレオチドをキットの形で供給する場合、スペクトル的に識別可能な蛍光色素の２つが両方とも１つの波長で励起し得、その他の２つのスペクトル的に識別可能な蛍光色素が両方とも別の波長で励起し得ることが一部の実施形態の特徴である。特定の励起波長は、５３２ｎｍ、６３０ｎｍ〜７００ｎｍ、特に６６０ｎｍである。

一実施形態において、キットは、本開示の化合物で標識した修飾ヌクレオチドおよび第２色素で標識した第２修飾ヌクレオチドを含み、これらの色素には、少なくとも１００ｎｍという吸収最大値の差がある。より具体的には、色素化合物の１つは１５〜４０ｎｍのストークスシフトを有し、本発明の化合物は、少なくとも５０ｎｍ、または１００ｎｍ超のストークスシフトを有する。本発明の化合物は、５０ｎｍ超、１００ｎｍ超、または１５０ｎｍ超ものストークスシフトさえ有し得る。

さらなる実施形態では、キットはさらに、蛍光色素で標識した修飾ヌクレオチドを含み得、これらの色素は例えば６００ｎｍ超で励起する。これらの色素には、少なくとも１００ｎｍという吸収最大値の差があり得る。さらにより具体的には、第２色素化合物は、６００ｎｍ超、特に６３０ｎｍ超の異なる吸収最大値を有し得る。本開示のポリメチン色素とスペクトル的に識別可能であり、上記の基準を満たす特定の色素は、米国特許第５２６８４８６号明細書（例えば、Ｃｙ５）もしくは国際公開第０２２６８９１号（Alexa 647；Molecular Probes/Life technologies A20006）に記載されているポリメチン類似体、または、米国特許第６９２４３７２号明細書に開示の非対称ポリメチンである（これらの文献はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれるものとする）。

代替の実施形態では、本開示のキットは、同じ塩基が２つの異なる化合物で標識されているヌクレオチドを含有し得る。第１ヌクレオチドは、本開示の化合物で標識し得る。第２ヌクレオチドは、スペクトル的に別個の化合物、例えば、６００ｎｍ超で吸収する「赤い」色素で標識し得る。第３ヌクレオチドは、本開示の化合物の化合物およびスペクトル的に別個の化合物の混合物で標識し得、第４ヌクレオチドは「無職」で、標識を含まないとすることができる。そのため、簡単に言えば、ヌクレオチド１〜４は、「緑」、「赤」、「赤／緑」、および黒色で標識することができる。この計器をさらに単純化するため、４つのヌクレオチドを、単一レーザで励起する２つの色素で標識することが可能であり、したがって、ヌクレオチド１〜４の標識は、「赤１」、「赤２」、「赤１／赤２」、および黒色とすることができる。

ヌクレオチドは本開示の色素を２つ含有し得る。Ｒａ_１がインドール環の隣接する炭素に縮合したさらなる芳香族環である色素は、色素がさらなる芳香族コンジュゲートを有さない場合よりも長い波長を吸収する。キットは、本開示の色素で標識した２つ以上のヌクレオチドを含有し得る。キットは、Ｒａ_１がＨ、ＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、またはハロゲンである本開示の化合物で標識したヌクレオチドと、Ｒａ_１が隣接する炭素原子に縮合したさらなる環である本開示の化合物で標識した１つのヌクレオチドを含有し得る。キットは、ヌクレオチドを５２０ｎｍ〜５６０ｎｍの領域を吸収する色素で標識したさらなるヌクレオチドを含有し得る。キットはさらに、未標識のヌクレオチドを含有し得る。

キットについて、異なる色素化合物で標識した異なるヌクレオチドを有する構成に関して上記で例示したが、キットは同じ色素化合物を有する２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるヌクレオチドを含み得ることも理解されよう。

特定の実施形態では、キットには、修飾ヌクレオチドのポリヌクレオチドへの組み込みを触媒することが可能なポリメラーゼ酵素が含まれ得る。このようなキットに含まれる他の構成要素としては、緩衝剤などが挙げられる。本開示の色素で標識した修飾ヌクレオチドと、異なるヌクレオチドの混合物を含む他の任意のヌクレオチド構成要素を濃縮した形でキットにおいて提供し、使用前に希釈することができる。このような実施形態では、適切な希釈緩衝剤も含まれ得る。また、本明細書に記載の方法で特定した１つまたは複数の構成要素は、本開示のキットに含まれ得る。

本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「１つ（a）」、「１つ（an）」、および「その（the）」は、明示的かつ明確に１つの指示対象に限定しない限り、複数の指示対象も含むことに留意されたい。種々の変形および変更を、本教示の趣旨または範囲から逸脱することなく本明細書に記載の種々の実施形態に対し行い得ることが当業者には明らかであろう。したがって、本明細書に記載の種々の実施形態は、添付の請求項の範囲およびその均等物の範囲内の他の変形および変更を対象として含むことを意図する。

新規の色素（ＮＲ５２０ｌｓ）、本明細書に開示のタイプの例、および構造類似体（ＮＲ５５０Ｓ０）で標識したヌクレオチドの溶液を５４０ｎｍで励起した場合の蛍光強度を示す図である。ＮＲ５５０Ｓ０（以下に示す構造）は、４０〜５０ｎｍの領域でストークスシフトを有する蛍光色素によく見られるように、ポリメチン鎖の両単にインドールを有するポリメチン色素である。４０〜５０ｎｍのストークスシフトを有する色素は、長ストークスシフト色素より高い蛍光シグナルを示す。新規の色素（ＮＲ５２０ｌｓ）およびその商業的な構造類似体（ＮＲ５５０Ｓ０）に基づくＦＦＮの溶液を４６０ｎｍで励起した場合の、蛍光強度を示す図である。５４０ｎｍとは異なり、長ストークスシフト色素は、４６０ｎｍで励起した場合、より明るい。したがって、２つの標識は、励起波長に基づき５９０ｎｍ放出で測定した場合に区別することが可能である。

実験の詳細
ＳＭ２

これらの出発物質は、オルトギ酸エチルまたはその誘導体を用いてピリリウム塩（ＳＭ１）から調製した。

実施例１
ＳＭ２−１

酢酸中の２，４，６−トリメチルピリリウムテトラフルオロボラート（１ｅｋｖ）、オルトギ酸トリエチル（１．５ｅｋｖ）、およびＮ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン（１．１．ｅｋｖ)を６時間８０℃で加熱した。反応混合物を室温で一晩おき、生成物を黄色結晶として濾過した。収率８７％。

インドピリロシアニン（Ｘ）

これらの出発物質は、Ｎ−置換インドリウム塩を用いてピリリウム塩誘導体（ＳＭ２）から調製した。

実施例２
（Ｘ）−１

酢酸、無水酢酸、およびピリジン（１：１：０．５）の混合物中の等モル量のＳＭ２−１およびＮ−フェニル−２，３，３−トリメチルインドリウム塩を８０℃で３時間撹拌した。

生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、カラム精製した。収率４８％。

インドピリドシアニン
これらの色素は、置換アミンまたはその塩を用いてピリリウム誘導体（Ｘ）から調製した。

実施例３−１（ＮＲ５２０ｌｓ）

出発物質を５分間エタノール中で撹拌し、次にＮ−エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミンを加え、撹拌を０．５時間継続した。溶媒蒸発後、色素を集め、水で洗浄した。収率〜９５％。

実施例３−２

出発物質を５分間エタノール中で撹拌し、次に、Ｎ−エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミンを加えた。撹拌を０．５時間継続した。溶媒蒸発後、色素を集め、水で洗浄した。収率〜９５％。

実施例３−３

出発物質をエタノール中で混ぜ合わせ、次に、Ｎ−エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミンを加えた。反応混合物を０．５時間撹拌した。溶媒蒸発後、色素を集め、水で洗浄した。収率〜９５％。

色素標識化ヌクレオチド三リン酸の合成
色素コンジュゲートｐｐｐＴ−ＮＲ５２０ｌｓ

調製
無水ＤＭＡ（５ｍＬ）およびヒューニッヒ塩基（０．０６ｍＬ）を色素（３−１）（８０ｍｇ）の乾燥サンプルに加えた。次に、これに、５ｍＬの乾燥ＤＭＡに溶解したＴＳＴＵ（０．２５ｇ）の溶液を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。活性化を完了させた後（ＴＬＣ：Ｈ_２Ｏ中にＣＨ_３ＣＮが１５％)、この溶液をｐｐｐＴ−ＬＮ３（０．２３ｇ）の水溶液（７ｍＬ）に加えた。反応混合物を室温の窒素雰囲気下で３時間撹拌した。反応混合物を氷槽を用いて〜４℃まで冷却し、次に、０．１ＭのＴＥＡＢ水溶液（５ｍＬ）を加え、混合物を室温で１０分間撹拌した。０．０５ＭのＴＥＡＢ水溶液に溶解したＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）樹脂懸濁液を〜７５ｇ充填したカラムに反応混合物を適用し、ＴＥＡＢを用いて洗浄した（濃度勾配０．１０Ｍから最大０．７５Ｍ）。赤く色づいた留分を集め、溶媒を蒸発させ、次に、残留物を再度水とともに同時蒸発させて、より多くのＴＥＡＢを取り除き、真空にして乾燥させた。色素を次に０．１ＭのＴＥＡＢに再溶解した。この溶液を０．２ｎｍ細孔サイズのシリンジフィルタに通し、生成物を、アセトニトリル−０．１ＭのＴＥＡＢを充填したＣ１８逆相カラムを用いてＨＰＬＣにより精製した。収率７８％。

色素コンジュゲートｐｐｐＡ−ＮＲ５２０ｌｓ

調製
無水ＤＭＡ（５ｍＬ）およびヒューニッヒ塩基（０．０６ｍＬ）を色素（３−１）（８０ｍｇ）の乾燥サンプルに加えた。次に、これに、５ｍＬの乾燥ＤＭＡに溶解したＴＳＴＵ（０．２５ｇ）の溶液を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。活性化を完了させた後（ＴＬＣ：Ｈ_２Ｏ中にＣＨ_３ＣＮが１５％)、この溶液をｐｐｐＡ−ＬＮ３（０．２５ｇ）の水溶液（７ｍＬ）に加えた。反応混合物を室温の窒素雰囲気下で２４時間撹拌した。反応混合物を氷槽を用いて〜４℃まで冷却し、次に、０．１ＭのＴＥＡＢ水溶液（５ｍＬ）を加え、混合物を室温で１０分間撹拌した。０．０５ＭのＴＥＡＢ水溶液に溶解したＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）樹脂懸濁液を〜７５ｇ充填したカラムに反応混合物を適用し、ＴＥＡＢを用いて洗浄した（濃度勾配０．１０Ｍから最大０．７５Ｍ）。赤く色づいた留分を集め、溶媒を蒸発させ、次に、残留物を再度水とともに同時蒸発させて、より多くのＴＥＡＢを取り除き、真空にして乾燥させた。色素を次に０．１ＭのＴＥＡＢに再溶解した。この溶液を０．２ｎｍ細孔サイズのシリンジフィルタに通し、生成物を、アセトニトリル−０．１ＭのＴＥＡＢを充填したＣ１８逆相カラムを用いてＨＰＬＣにより精製した。収率７５％。

蛍光特性
図１は、新規の色素（ＮＲ５２０ｌｓ）、本明細書に開示のタイプの例、および構造類似体（NR550S0）で標識したヌクレオチドの溶液を５４０ｎｍで励起した場合の蛍光強度を示す。ＮＲ５５０Ｓ０（以下に示す構造）は、４０〜５０ｎｍの領域でストークスシフトを有する蛍光色素によく見られるように、ポリメチン鎖の両単にインドールを有するポリメチン色素である。４０〜５０ｎｍのストークスシフトを有する色素は、長ストークスシフト色素より高い蛍光シグナルを示す。

図２は、新規の色素（ＮＲ５２０ｌｓ）およびその商業的な構造類似体（ＮＲ５５０Ｓ０）に基づくＦＦＮの溶液を４６０ｎｍで励起した場合の、蛍光強度を示す図である。５４０ｎｍとは異なり、長ストークスシフト色素は、４６０ｎｍで励起した場合、より明るい。したがって、２つの標識は、励起波長に基づいて５９０ｎｍ放射で測定した場合に区別することが可能である。

長ストークスシフトを有する新規色素ＮＲ５２０ｌｓと通常のストークスシフトを有するその構造類似体の蛍光強度比の比較より、溶液を異なる波長で励起させた場合のシグナル強度の変化を理由に、新規の色素を用いる利点を理解することが可能である。

上記のチャートでは、色素ＮＲ５５０Ｓ０については、５４０ｎでの蛍光強度（1９３．０）と４６０ｎｍでの蛍光強度（１０．１）の比は、該色素が４６０ｎｍを効率的に吸収しないことから、１９３．３である。同じ条件において、新規色素ＮＲ５２０ｌｓでは、５４０ｎｍでの蛍光強度（９３．０）と４６０ｎｍでの蛍光強度（4０．１）の比はたった約２である。これは、より長いストークスシフトは、４６０ｎｍでの色素の吸収がより高いレベルにあることを意味するからである。これらの特異的な特性により、本明細書に開示の新規色素は、ノイズに対するシグナルを改善することからより効率的なデータ解析を可能にし、従来の４検出チャネルよりも少ないチャネルを用いて操作するシーケンシングプラットフォームを可能にする。

Claims

式（Ｉ’）の化合物またはそのメソメリー型であって：
（Ｉ’）
式中、ｍＣａｔ＋またはｍＡｎ−は、有機または無機の、正電荷／負電荷の対イオンであって、ｍは０〜３の整数であり；
ｘは０〜２の整数であり；
Ｒａ_１は、Ｈ、ＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノであるか、または、隣接する炭素原子に縮合し、ＳＯ_３ ⁻置換基、スルホンアミド置換基、ハロゲン置換基を含有し得るさらなる環であり；
Ｒｂ_１はＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、又はＣＯＯＨであって、ｎは０〜３であり；
Ｒｃ_１およびＲｃ_２はそれぞれ独立してアルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒｄ_１およびＲｄ_２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；
Ｒｅ_１はアルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールであり；
Ｒｃ_１、Ｒｂ_１、またはＲｅ_１の何れかは、ＣＯＯＨまたはＣＯＯ ⁻ を含有する、化合物またはそのメソメリー型。
式（Ｉ）の請求項１に記載の化合物またはそのメソメリー型であって：
（Ｉ）
式中、ｍＣａｔ＋またはｍＡｎ−は、有機または無機の、正電荷／負電荷の対イオンであって、ｍは０〜３の整数であり；
Ｒａ_１は、Ｈ、ＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノであるか、または、隣接する炭素原子に縮合し、ＳＯ_３ ⁻置換基、スルホンアミド置換基、ハロゲン置換基を含有し得るさらなる環であり；
Ｒｂ_１はＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、又はＣＯＯＨであって、ｎは０〜３であり；
Ｒｃ_１およびＲｃ_２はそれぞれ独立してアルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒｄ_１およびＲｄ_２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；
Ｒｅ_１はアルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールであり；
Ｒｃ_１、Ｒｂ_１、またはＲｅ_１の何れかは、ＣＯＯＨまたはＣＯＯ⁻ を含有する、化合物またはそのメソメリー型。
Ｒｅ_１はアルキルであり、Ｒｂ_１はＣＯＯＨまたはＣＯＯ⁻ である、請求項１または２に記載の化合物。
Ｒｅ_１はＣＯＯＨまたはＣＯＯ⁻ で置換されたアルキル基である、請求項１または２に記載の化合物。
Ｒｅ_１はＣＯＯＨまたはＣＯＯ⁻ で置換されたアリール基である、請求項１または２に記載の化合物。
Ｒｅ_１はＣＯＯＨまたはＣＯＯ⁻ で置換されたアリール基であり、前記アリール環と前記ＣＯＯＨまたはＣＯＯ⁻ との間にアルキル基がある、請求項１または２に記載の化合物。
Ｒｅ_１はＣＨ_２ＣＯＯＨまたはＣＨ_２ＣＯＯ⁻ で置換されたアリール基である、請求項１または２に記載の化合物。
ｎは０である、請求項４〜７の何れか一項に記載の化合物。
ｎは１であり、Ｒｂ_１はＳＯ_３ ⁻またはスルホンアミドである、請求項４〜７の何れか一項に記載の化合物。
Ｒｃ_１およびＲｃ_２はそれぞれメチルである、請求項１〜９の何れか一項に記載の化合物。
Ｒｃ_１またはＲｃ_２は、メチル、エチル、プロピル、または−（ＣＨ_２）_ｑＳＯ_３ ⁻（式中、ｑは１〜６である）である、請求項１〜９の何れか一項に記載の化合物。
Ｒｃ_１またはＲｃ_２の何れかは（ＣＨ_２）_４−ＳＯ_３ ⁻である、請求項１１に記載の化合物。
Ｒａ_１はＨ、ＳＯ_２ＮＨ_２、またはＳＯ_３ ⁻である、請求項１〜１２の何れか一項に記載の化合物。
Ｒａ_１は隣接する炭素原子に縮合した環である、請求項１〜１２の何れか一項に記載の化合物。
前記環は、１つまたは複数のＳＯ_３ ⁻またはスルホンアミド置換基を含有する、請求項１４に記載の化合物。
Ｒｄ_１およびＲｄ_２はそれぞれ独立してＨまたはメチルである、請求項１〜１５の何れか一項に記載の化合物。
式（ＩＩ）：
（ＩＩ）
で表される請求項１に記載の化合物またはその塩であって、
式中、ｍＣａｔ＋またはｍＡｎ−は、有機または無機の、正電荷／負電荷の対イオンであって、ｍは０〜３の整数であり；
ｎ及びｌはそれぞれ独立して０〜６であり；
Ｒａ_１は、Ｈ、ＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲンであるか、または、隣接する炭素原子に縮合し、ＳＯ_３ ⁻置換基、スルホンアミド置換基、ハロゲン置換基を含有し得るさらなる環であり；
Ｒｂ_１はＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、又はＣＯＯＨであって、ｋは０〜３であり；
ｘはＯＨ、又はＯ⁻ である、化合物またはその塩。
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに付着している、請求項１〜１７の何れか一項に記載の化合物。
請求項１〜１７に記載の化合物で標識した、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
標識が、ＣＯＯＨ部分より形成されたアミド結合を介して付着している、請求項１８に記載の標識化ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
標識が、ピリミジン塩基のＣ５位置または７−デアザプリン塩基のＣ７位置に、リンカー部分を介して結合している、請求項１８または１９に記載の標識化ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
前記ヌクレオチドのリボースまたはデオキシリボース糖に共有結合した３’ＯＨ保護基をさらに含む、請求項１９〜２１に記載の標識化ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
２つ以上のヌクレオチドを含み、少なくとも１つのヌクレオチドが請求項１９〜２２に記載の標識化ヌクレオチドである、キット。
前記標識化ヌクレオチドの２つは同一波長での検出により測定される、請求項２２に記載のキット。
４つのヌクレオチドを含み、第１ヌクレオチドは請求項１８〜２１に記載の標識化ヌクレオチドであり、第２ヌクレオチドは前記第１標識化ヌクレオチドと同じ波長で発光する標識で標識され、第３ヌクレオチドは、標識の混合物で標識され、第４は、前記４つの標識化ヌクレオチドがそれぞれ互いに識別可能であるように未標識である、請求項２４に記載のキット。
前記第１標識化ヌクレオチドは、１００ｎｍ超のストークスシフトを有し、前記第２標識化ヌクレオチドは、５０ｎｍ未満のストークスシフトを有する、請求項２２〜２５に記載のキット。
請求項１９〜２２の何れか一項に記載のヌクレオチド、請求項１９〜２２に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項２３〜２６の何れか一項に記載のキットの、シーケンシング、発現解析、ハイブリダイゼーション解析、遺伝子解析、ＲＮＡ解析、またはタンパク質結合アッセイにおける使用。
異なる波長で作動する２つのレーザと、既定の発光波長に設定された単一検出チャネルを有する検出系とを含む自動化シーケンシング機器における、請求項２７に記載の使用。
以下の出発物質：
（Ｘ’）
またはその塩を利用した、請求項１〜１７に記載の化合物の合成法であって、
式中、ｘは０〜２であり；Ｒａ_１は、Ｈ、ＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲンであるか、または、隣接する炭素原子に縮合し、ＳＯ_３ ⁻置換基、スルホンアミド置換基、ハロゲン置換基を含有し得るさらなる環であり；
Ｒｂ_１はＳＯ_３ ⁻、スルホンアミド、ハロゲン、またはＣＯＯＨであって、ｎは０〜３であり；
Ｒｃ_１およびＲｃ_２はそれぞれ独立してアルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒｄ_１およびＲｄ_２はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールである、合成法。