CN107835809A - 具有长斯托克斯位移的多次甲基化合物及其作为荧光标记物的用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及新化合物及其作为荧光标记物的用途。这些化合物可以在核酸测序应用中作为核苷酸的荧光标记物。这些标记物是有利的，因为其具有长斯托克斯位移(Stokes shift)。

Description

具有长斯托克斯位移的多次甲基化合物及其作为荧光标记物 的用途
本申请涉及新的多次甲基化合物及其作为荧光标记物的用途。特别地，这些化合物可以在核酸测序应用中作为核苷酸的荧光标记物。
背景技术
在本申请中引用若干出版物和专利文献，以便更充分地描述本申请所属领域的状况。这些出版物和文献的每一个公开的内容均通过引用并入本申请。
利用荧光标记物的核酸的非放射性检测是分子生物学中的重要的技术。在重组DNA技术中采用的很多程序此前主要依赖于用例如32P放射性标记的核苷酸或多核苷酸的使用。放射性化合物使得能够对核酸和其他感兴趣的分子进行灵敏的检测。然而，在放射性同位素的使用中存在严重的限制，例如其费用、有限的储存期以及更重要的是安全考量。消除对放射性标记物的需求增强了安全性，同时降低了与例如试剂处理相关的环境影响和成本。适合用于非放射性荧光检测的方法以非限制性实例的方式包括自动DNA测序、杂交法、聚合酶链反应产物的实时检测以及免疫测定。
对于很多应用来说，所希望的是，采用多重光谱可区别的荧光标记物以便实现多个空间上重叠的分析物的独立检测。在此类多重方法中，可以减少反应容器的数目，这简化了实验方案并且有助于生产特定应用的试剂盒。在多色自动DNA测序中，例如，多重荧光检测允许在单电泳泳道中分析多核苷酸碱基，从而使总处理能力(throughput)增加超过单色方法并且降低与泳道之间的电泳迁移率变化有关的不确定性。
然而，多重荧光检测可能是有问题的并且存在限制荧光标记物选择的许多重要因素。首先，可能难以发现发射光谱在给定应用中被适宜地光谱分辨的染料化合物。此外，当将若干荧光染料一起使用时，通过同时激发在可区别光谱区中产生荧光信号可能是困难的，因为对此可能是可用的染料吸收带通常宽泛地分开，所以甚至对于两种染料而言都难以实现几乎相等的荧光激发效率。许多激发方法使用高功率光源，如激光器，并且因此染料必须具有充分的光稳定性以经受这样的激发。分子生物学方法中特别重要的最终考量是荧光染料必须与使用的试剂化学药品(例如，DNA合成溶剂和试剂、缓冲剂、聚合酶以及连接酶)达到相容的程度。
随着测序技术的发展，需要开发满足上述所有限制并且特别适于高通量分子方法(如固相测序等)的其他荧光染料化合物、其核酸缀合物和染料集合。
具有改进的荧光性质如荧光带的荧光强度、形状和波长最大值的荧光染料分子可以改进核酸测序的速度和准确度。当在基于水的生物缓冲剂中并且在较高温度下做出测量时，强荧光信号是尤其重要的，因为大部分染料的荧光强度在此类条件下是显著降低的。而且，附接染料的碱基的性质也影响荧光最大值、荧光强度和其他光谱染料性质。核碱基与荧光染料之间序列特异性的相互作用可以通过对荧光染料的特异性设计来定制。对荧光染料结构的优化可以改进核苷酸掺入效率、降低测序误差水平并且减少核酸测序中试剂的使用，并且因此降低核酸测序的成本。
可以使用具有不同的并且特别是具有大于普通斯托克斯位移的荧光染料实现对(特别是多个荧光标记的)检测的改进。
斯托克斯位移是相同电子跃迁的最大吸收波长与最大发射波长之差。
在可见区的大多数荧光染料的斯托克斯位移小于40nm，这表明最有效激发波长与最大发射波长相对接近。因为发射和激发波长进一步分开，使得具有较长斯托克斯位移的化合物具有更好的信噪比。长斯托克斯位移染料还能够使用相同发射通道但不同的激发波长分别检测两个不同的标记物。例如，可以在550-570nm之间记录检测测量并且可以检测来自在532nm处激发的具有较短斯托克斯位移的第一标记物的信号和在450nm处激发的具有较长斯托克斯位移的第二标记物的信号。
本申请描述了具有长斯托克斯位移的改进的多次甲基构建体，及其作为生物分子标记物的用途，特别是作为在核酸测序中使用的核苷酸的标记物的用途。可以看到当在单一检测通道中进行检测测量时使用新荧光构建体获得的在标记核苷酸掺入效率和测序读取长度方面的具体改进。
发明概述
根据第一个方面，本申请提供了式(I)化合物或其内消旋体形式：
其中mCat+或mAn-是有机或无机带正电荷/负电荷的反离子，且
m是整数0-3；
Ra1是H、SO3 -、磺酰胺、卤素、羟基、烷氧基、氨基或与相邻的碳原子稠合的另外的环，其中所述环可以含有SO3 -、磺酰胺、卤素取代基；
Rb1是SO3 -、磺胺、卤素、羟基、烷氧基、氨基、COOH或其酰胺或酯且n是0-3；
Rc1和Rc2的每一个独立地是烷基或取代的烷基；
Rd1和Rd2的每一个独立地是H、烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；以及
Re1是烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；其中Rc1、Rb1或Re1含有COOH或COO-或者其酰胺或酯。
本申请提供了式(I’)化合物或其内消旋体形式：
其中mCat+或mAn-是有机或无机带正电荷/负电荷的反离子，且
m是整数0-3；
x是整数0-2；
Ra1是H、SO3 -、磺酰胺、卤素、羟基、烷氧基、氨基或与相邻的碳原子稠合的另外的环，其中所述环可以含有SO3 -、磺酰胺、卤素取代基；
Rb1是SO3 -、磺胺、卤素、羟基、烷氧基、氨基、COOH或其酰胺或酯且n是0-3；
Rc1和Rc2的每一个独立地是烷基或取代的烷基；
Rd1和Rd2的每一个独立地是H、烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；以及
Re1是烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；其中Rc1、Rb1或Re1含有COOH或COO-或者其酰胺或酯。
在某些实例中，其中Re1是烷基，Rb1、Rc1可以是COOH或COO-或者其酰胺或酯。
在某些实例中，n可以是0，以使得苯基是未取代的，以及Re1含有COOH或COO-或者其酰胺或酯。
在另一个实施方式中，本申请的化合物可以与多种底物部分缀合物，如核苷、核苷酸、多核苷酸、多肽、碳水化合物、配体、颗粒、细胞、半固体表面(例如，凝胶)以及固体表面。缀合可以通过Rc1、Re1或Rb1上的羧基或磺酸基进行，其可以变成酰胺、磺酰胺或酯。
因此，根据本申请进一步的方面，提供了包含接头基团的染料化合物，所述接头基团能够例如共价附接至此类底物部分(如核苷酸)。
根据进一步的方面，本申请提供了由式N-L-染料定义的核苷、核苷酸或寡核苷酸，其中N是核苷酸，L是任选的接头部分和染料是根据本申请的荧光化合物。
核苷酸可以是核苷酸5-三磷酸酯。
在进一步的方面，本申请提供了使用本申请的染料化合物测序的方法。
根据进一步的方面，本申请还提供了包含染料化合物(游离的或缀合形式的)的试剂盒，可以将所述试剂盒用于各种免疫测定、寡核苷酸和核酸标记以及用于通过合成的DNA测序。在又一个方面中，本申请提供了包含染料“集合”的试剂盒，该试剂盒特别适合于在自动仪器平台上进行通过合成的测序循环。
本申请进一步的方面是本申请化合物的化学制备。
发明详述
本申请提供新的化合物，其特别适合于荧光检测和通过合成测序的方法。相比于N-烷基类似物，具有N-苯基吲哚部分的新化合物在荧光最大位置、其强度和光稳定性方面是有利的，并且因此改进了某些核酸测序应用。
根据第一个方面，本申请提供了式(I)化合物或其内消旋体形式：
其中mCat+或mAn-是有机或无机带正电荷/带负电荷的反离子，且
m是整数0-3；
Ra1是H、SO3 -、磺酰胺、卤素或与相邻的碳原子稠合的另外的环，其中所述环可以含有SO3 -、磺酰胺、卤素取代基；
Rb1是SO3 -、磺胺、卤素、COOH或其酰胺或酯且n是0-3；
Rc1和Rc2的每一个独立地是烷基或取代的烷基；
Rd1和Rd2的每一个独立地是H、烷基或取代的烷基；以及
Re1是烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；其中Rb1或Re1含有COOH或COO-或者其酰胺或酯。
本申请提供了式(I)化合物或其内消旋体形式：
其中mCat+或mAn-是有机或无机带正电荷/带负电荷的反离子，且
m是整数0-3；
x是整数0-2；
Ra1是H、SO3 -、磺酰胺、卤素、羟基、烷氧基、氨基或与相邻的碳原子稠合的另外的环，其中所述环可以含有SO3 -、磺酰胺、卤素取代基；
Rb1是SO3 -、磺胺、卤素、羟基、烷氧基、氨基、COOH或其酰胺或酯且n是0-3；
Rc1和Rc2的每一个独立地是烷基或取代的烷基；
Rd1和Rd2的每一个独立地是H、烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；以及
Re1是烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；其中Rc1、Rb1或Re1含有COOH或COO-或者其酰胺或酯。
链x的长度可以是0、1或2。链可以具有一个碳和一个双键，三个碳和两个双键或者五个碳和三个双键。x可以是1，以使得链含有三个CH基团。
分子可以在Ra位含有磺胺或SO3 -部分。Ra1可以是磺胺。磺胺可以是SO2NH2或SO2NHR，其中R是烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基。Ra1可以是H。Ra1可以是SO3 -。Ra1可以是与相邻的碳原子稠合的另外的环。环可以是取代的或非取代的。环可以是被一个或多个磺胺或SO3 -基团取代的。磺胺可以是SO2NH2或SO2NHR，其中R是烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基。
Ra1可以是与吲哚环相邻的碳稠合的另外的脂肪族、芳香族或杂环。例如，在此类情况下，当稠合芳环时，染料的端基可以以下述结构类型表示
其中Rf可以是H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、卤素、羧基、磺胺或磺酸。在此类结构中，Rf可以出现多次，例如Rf可以是H和SO3 -两者，或者可以是多个SO3 -基团。
因此，本申请的染料可以如式(1A)或(1A’)所示：
其中mCat+或mAn-是有机或无机带正电荷/带负电荷的反离子，且
m是整数0-3；
x是整数0-2；
Rb1是SO3 -、磺胺、卤素、COOH或者其酰胺或酯且n是0-3；
Rc1和Rc2的每一个独立地是烷基或取代的烷基；
Rd1和Rd2的每一个独立地是H、烷基或取代的烷基；
Re1是烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；其中Rb1或Re1含有COOH或COO-或者其酰胺或酯；以及
其中Rf可以是H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、卤素、羧基、磺胺或磺酸的一个或多个。
因此，本申请的染料可以如式(IB)或(IB’)所示：
其中mCat+或mAn-是有机或无机带正电荷/带负电荷的反离子，且
m是整数0-3；
x是整数0-2；
Rb1是SO3 -、磺胺、卤素、COOH或者其酰胺或酯且n是0-3；
Rc1和Rc2的每一个独立地是烷基或取代的烷基；
Rd1和Rd2的每一个独立地是H、烷基或取代的烷基；
Re1是烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；其中Rb1或Re1含有COOH或COO-或者其酰胺或酯。
因此，本申请的染料可以如式(IC)或(IC’)所示：
其中mCat+或mAn-是有机或无机带正电荷/带负电荷的反离子，且
m是整数0-3；
x是整数0-2；
Rb1是SO3 -、磺胺、卤素、COOH或者其酰胺或酯且n是0-3；
Rc1和Rc2的每一个独立地是烷基或取代的烷基；
Rd1和Rd2的每一个独立地是H、烷基或取代的烷基；
Re1是烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；其中Rb1或Re1含有COOH或COO-或者其酰胺或酯。
因此，本申请的染料可以如式(ID)或(ID’)所示：
其中mCat+或mAn-是有机或无机带正电荷/带负电荷的反离子，且
m是整数0-3；
x是整数0-2；
q是1-6；
Rb1是SO3 -、磺胺、卤素、COOH或者其酰胺或酯且n是0-3；
Rc2是烷基或取代的烷基；
Rd1和Rd2的每一个独立地是H、烷基或取代的烷基；
Re1是烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；其中Rb1或Re1含有COOH或COO-或者其酰胺或酯。
因此，本申请的染料可以如式(IE)或(IE’)所示：
其中mCat+或mAn-是有机或无机带正电荷/带负电荷的反离子，且
m是整数0-3；
x是整数0-2；
q是1-6；
Rb1是SO3 -、磺胺或卤素，且n是0-3；
Rc2是烷基或取代的烷基；
Rd1和Rd2的每一个独立地是H、烷基或取代的烷基；
Re1是烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；以及
X是OH、O-或酯或酰胺。
羰基或其衍生物被附接至Rb1、Rc1或Re1位。当附接至Rb1时，Re1可以是未取代的烷基，或者被一个或多个取代基取代的烷基。可以将COOH基团作为用于进一步附接的连接部分或者将其连接至另外的分子。一旦发生缀合，COOH或COO-变成酰胺或酯。
或者，Rc1可以含有羧基。羧基可以通过取代的烷基接头附接，例如长度为q的烷基链，其中q是1-6个碳原子或杂原子。链可以是(CH2)q，其中q是1-6。基团可以是(CH2)4COOH。
或者，Re1可以含有羧基。羧基可以通过取代的烷基接头附接，例如长度为n的烷基链，其中n是1-5个碳原子或杂原子。链可以是(CH2)n，其中n是1-5。基团可以是(CH2)5COOH。或者，可以存在作为Re1的一部分的芳基。
Re1可以是具有直接附接至或通过另外的烷基链附接至其上的羧基的芳基。
Re1可以是被CH2COOH或CH2COO-或者其酰胺或酯取代的芳基。在本申请所述的任意式中，部分
可以是下述形式
其中Rd1和Rd2的每一个独立地是H、烷基或取代的烷基；
每个n独立地是0-6；以及
X是OH、O-或者酯或酰胺。
当将羧基附接至Re1时，n可以是0。或者，在环上可以存在一个或多个基团，例如n可以是1且Rb1可以是卤素、磺酰胺或SO3 -。通常，化合物不会在Rb1位和Re1位同时具有羧基，因为缀合反应应该不能通过多个COOH部分发生。
Rc1和Rc2的每一个可以独立地被羧基、氨基、酰胺基、磺基或亚磺酰氨基取代。分子可以在Rc位含有一个或多个烷基-磺酸盐部分。Rc1和/或Rc2的每一个可以是烷基-SO3 -。其他Rc(Rc1或Rc2)可以独立地是烷基或取代的烷基。Rc1和Rc2可以是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基或(CH2)qSO3H，其中q是1-6。q可以是1-4。q可以是4。Rc1和Rc2可以是取代的烷基。Rc1和Rc2可以含有COOH或-SO3H部分或者其酯或酰胺衍生物。
Rd1和Rd2的每一个可以独立地是H或甲基。Rd1和Rd2可以是相同的或不同的。通常，Rd1和Rd2将是相同的，以避免在分子中引入不对称性。Rd1和Rd2可以均是H。Rd1和Rd2可以均是甲基。
化合物的实例包括根据式(II)的结构：
或其盐，其中mCat+或mAn-是有机或无机带正电荷/带负电荷的反离子，且
m是整数0-3；
每个n独立地是0-6；
Ra1是H、SO3 -、磺酰胺、卤素或与相邻的碳原子稠合的另外的环，其中所述环可以含有SO3 -、磺酰胺、卤素取代基；
Rb1是SO3 -、磺胺、卤素、COOH或者其酰胺或酯且n是0-3；以及
X是OH、O-或者酯或酰胺。
化合物进一步的实例包括根据式(IIIa)至(IIIc)的结构：
化合物的实例包括根据式(IV)的结构：
或其盐，其中mCat+或mAn-是有机或无机带正电荷/带负电荷的反离子，且
m是整数0-3；
Ra1是H、SO3 -、磺酰胺、卤素或与相邻的碳原子稠合的另外的环，其中所述环可以含有SO3 -、磺酰胺、卤素取代基；
Rb1是SO3 -、磺胺、卤素、或者其酰胺或酯且n是0-3；
Rc1和Rc2的每一个独立地是烷基或取代的烷基；
Rd1和Rd2的每一个独立地是H、烷基或取代的烷基；
X是OH、O-或者酯或酰胺；
Y是选自O、S或N的杂原子；以及
Rf1、Rf2、Rf3的每一个独立地是烷基或芳基。
如本申请所述的化合物具有大于50nm的斯托克斯位移。斯托克斯位移可以是大于100nm，或者甚至大于150。
特别有用的化合物是使用如本申请所述的染料标记的核苷酸或寡核苷酸。
标记的核苷酸或寡核苷酸可以具有通过羧基以形成酰胺的标记物。标记的核苷酸或寡核苷酸可以具有通过接头部分附接至嘧啶碱基的C5位或7-脱氮嘌呤碱基的C7位的标记物。
标记的核苷酸或寡核苷酸还可以具有共价附接至核苷酸的核糖或脱氧核糖的阻断基团。阻断基团可以在核糖或脱氧核糖的任何位置处被附接。在特定的实施方式中，阻断基团在核苷酸的核糖或脱氧核糖的3’OH位。
本申请提供了包含两种或多种核苷酸的试剂盒，其中至少一种核苷酸是用本申请的化合物标记的核苷酸。试剂盒可以包含两种或多种标记的核苷酸。核苷酸可以使用两种或多种荧光标记物标记。可以使用单激发光源激发两种或多种标记物，所述单激发光源可以是激光器或LED。例如，两种或多种标记物的激发带可以是至少部分重叠的，以使得在光谱的重叠区中的激发引起两种标记物均发射荧光。在特定的实施方式中，来自两种或多种标记物的发射将在光谱的不同区域中发生，以使得可以通过光学区分发射而确定至少一种标记物的存在。
可以使用两种或多种荧光标记物标记核苷酸。可以使用在不同波长下的不同激发源激发两种或多种标记物，其可以是激光器。例如，两种或多种标记物的发射带可以是至少部分重叠的，以使得在光谱的重叠区中的发射引起两种标记物在相同检测波长下均发射荧光。每个标记物仅被激发波长中的一个所激发，并且因此由于其具有不同的激发谱图，使得可以单独检测染料。在特定的实施方式中，来自两种或多种标记物的激发将在光谱的不同区域中发生，以使得可以通过光学区分激发而确定至少一种标记物的存在。
此类谱图仅可能使用具有长斯托克斯位移的标记物获得，例如使用本申请所述的化合物所描述的。
一旦两种标记物可以被区分，则可以仅使用两种标记物鉴定四种独立的核苷酸。核苷酸1可以是使用标记物1标记的，核苷酸2可以是使用标记物2标记的，核苷酸3可以是使用标记物1和标记物2两者的混合物标记的，以及核苷酸4可以是非标记的(暗)。
因此，试剂盒可以包含如本申请所述的标记的核苷酸化合物，以及在相同波长下具有发射，但是具有更短的斯托克斯位移的另外的标记核苷酸。
本申请包括包含四种核苷酸的试剂盒，其中第一核苷酸是如本申请所述的标记核苷酸，第二核苷酸是使用与第一标记核苷酸在相同波长下发射的标记物标记的，第三核苷酸是使用标记物的混合物标记的和第四核苷酸是非标记的，以使得四种标记核苷酸的每一个彼此之间相区分。
试剂盒可以含有四种标记核苷酸，其中四种核苷酸中的第一种是使用如本申请所公开的化合物标记的。在这样的试剂盒中，第二核苷酸、第三核苷酸和第四核苷酸可以各自用任选地不同于第一核苷酸上的标记物且任选地不同于彼此上的标记物的化合物标记。因而，化合物中的一种或多种可以具有不同的吸收最大值和/或发射最大值，以使得该化合物与其他化合物是可区分的。例如，每种化合物可以具有不同的吸收最大值和/或发射最大值，以使得每种化合物与其他三种化合物是可区分的。应当理解的是，除了最大值之外的吸收光谱和/或发射光谱的部分可以不同并且这些差异可以被利用以区分化合物。试剂盒可以是使得化合物中的两种或多种具有高于600nm的不同的吸收最大值。本发明的化合物通常吸收低于500nm的光，但是在大于600nm的波长下发射光。
本申请所示的化合物、核苷酸或试剂盒可以用于检测、测量或鉴定生物系统(包括例如其过程或成分)。可以使用化合物、核苷酸或试剂盒的示例性技术包括测序、表达分析、杂交分析、基因分析、RNA分析、细胞测定(例如，细胞结合或细胞功能分析)或蛋白测定(例如，蛋白结合测定或蛋白活性测定)。用途可以在用于进行特定技术的自动仪器上进行，例如自动测序仪器。测序仪器可以包括在不同的波长下操作的两种激光器。测序仪器可以具有单一发射通道，因此其可以减少或避免多多个发射滤波器的需求。检测系统可以具有设置为固定发射波长的单一检测通道。
本申请公开了一种合成所公开的化合物的方法。
根据本申请制备的是新的初始原料，例如(SM2)，其能够合成新的染料。
可以将式(X)化合物或其盐作为合成多次甲基染料初始原料：
或其盐，其中Ra1是H、SO3 -、磺酰胺、卤素或与相邻的碳原子稠合的另外的环，其中所述环可以含有SO3 -、磺酰胺、卤素取代基；
Rb1是SO3 -、磺胺、卤素或COOH且n是0-3；
Rc1和Rc2的每一个独立地是烷基或取代的烷基；以及
Rd1和Rd2的每一个独立地是H、烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基。
可以将式(X’)化合物或其盐作为合成多次甲基染料初始原料：
或其盐，其中x是0-2；Ra1是H、SO3 -、磺酰胺、卤素或与相邻的碳原子稠合的另外的环，其中所述环可以含有SO3 -、磺酰胺、卤素取代基；
Rb1是SO3 -、磺胺、卤素或COOH且n是0-3；
Rc1和Rc2的每一个独立地是烷基或取代的烷基；以及
Rd1和Rd2的每一个独立地是H、烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基。
如在本申请中使用的，术语“烷基”指的是C1-C10烃并且可以包括C3-C10非芳香族的碳环。在特定的实施方式中，烷基是C1-C6烷基，所述C1-C6烷基指的是分别包含一个至六个之间的碳原子的饱和的、直链的或支链的烃基。烷基可以包含一个或多个不饱和的基团，并且因此包括烯基和炔基。
如在本申请中使用的，“卤素”指的是氟-(下文中称为F)、氯-(下文中称为Cl)、溴-(下文中称为Br)或碘-(下文中称为I)，并且通常涉及有机化合物中氢原子的取代，此取代任选地是氢的完全取代。
术语“取代的烷基”，指的是如上文定义的烷基、烯基或炔基，其中它们可以任选地被(但不限于)卤素、氰基、SO3 -、SRa、ORa、NRbRc、氧代、CONRbRc、COOH以及COORb进一步取代。Ra、Rb和Rc可以各自独立地选自：H、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基以及取代的芳基。另外，所述取代的烷基、取代的烯基和取代的炔基可以任选地被选自：O、NRb、S(O)t(其中t是0至2)等的至少一个杂原子或基团中断。取代的烷基还包括如苄基的基团，其中烷基包含另外的芳基或取代的芳基部分。
根据本申请的染料可以从包括N-苯基吲哚在内的多种不同的起始原料合成。用于制备多次甲基染料的方法是本领域熟知的。
根据本申请的方面，提供了适合于附接至基底部分的染料化合物，所述染料化合物特别地包含能够附接至基底部分的接头基团。实际上，基底部分可以是本申请的染料可以缀合的任何分子或物质，并且通过非限制性实例的方式，基底部分可以包括核苷、核苷酸、多核苷酸、碳水化合物、配体、颗粒、固体表面、有机的和无机的聚合物、染色体、细胞核、活细胞以及其组合或集合物。染料可以通过包括疏水吸引力、离子吸引力和共价附接的多种手段被任选的接头缀合。特别地，染料通过共价附接被偶联至基底。更特别地，共价附接借助于接头基团。
染料化合物与基底的缀合可以通过Rb1或作为Re1一部分的羧基进行，其可以转变成酰胺或酯。
根据本申请的染料可以在取代位置中的一个处包含反应性接头基团，用于将染料共价附接至另一个分子。反应性连接基团是能够形成键(例如，共价键或非共价键)的部分。在特定的实施方式中，接头可以是可裂解的接头。术语“可裂解接头”的使用不意指意味着需要将整个接头除去。裂解位点可以位于使得接头的一部分在裂解之后保持附接至染料和/或基底部分的接头上的位置处。通过非限制性实例的方式，可裂解的接头可以是亲电性可裂解接头、酶促可裂解接头、亲核性可裂解接头、光可裂解接头、在还原条件(例如包含二硫化物或叠氮化物的接头)、氧化条件下可裂解的、通过使用保险栓(safety-catch)接头可裂解的以及通过消除机制可裂解的。使用可裂解的接头以将染料化合物附接至基底部分提供了除去标记物的选项(例如在检测之后)，从而避免下游步骤中的任何干扰信号。
有用的接头基团可以参见PCT公开号WO2004/018493(通过引用并入本申请)，其中包括了可以使用水溶性膦或由过渡金属和至少部分地水溶性配体形成的水溶性过渡金属催化剂裂解的接头的实例。在水溶液中，后者至少部分地形成水溶性的过渡金属络合物。可以将此类可裂解的接头用于将核苷酸的碱基连接至标记物(如本申请所示的染料)。
特定的接头可以参见PCT公开号WO2004/018493(通过引用并入本申请)，如包含下式部分的那些：
(其中X选自包括O、S、NH和NQ的基团，其中Q是C1-10取代的或未取代的烷基，Y选自包括O、S、NH和N(烯丙基)的基团，T是氢或C1-C10取代的或未取代的烷基并且*表示该部分被连接至核苷酸或核苷的剩余部分)。
在特定的实施方式中，相比于通过本领域已知的其他连接附接至鸟嘌呤碱基的相同的荧光团，荧光染料(荧光团)和鸟嘌呤碱基之间的接头的长度可以例如通过引入聚乙二醇间隔基团来改变，从而增加荧光强度。示例性接头及其性质列于公布为WO07020457的英国专利申请第0517097.2号(通过引用并入本申请)中。接头的设计以及特别是增加其长度能够使附接至鸟苷核苷酸的鸟嘌呤碱基的荧光团在掺入多核苷酸如DNA中时亮度增强。因而，当染料用于在采用附接至包含鸟嘌呤的核苷酸的荧光染料标记物的检测的任何分析方法中时，使用具有式-((CH2)2O)n -的间隔基团的接头可能是有利的，其中n是2至50之间的整数，例如，如在WO07020457中所描述的。
本申请还提供了使用本申请所示的一种或多种染料标记的核苷和核苷酸的缀合物(经修饰的核苷酸)。标记的核苷和核苷酸对于标记通过酶促合成形成的多核苷酸是有用的，例如，通过非限制性实例的方式，在PCR扩增、等温扩增、固相扩增、多核苷酸测序(例如固相测序)、切口平移反应等过程中。
核苷和核苷酸可以在糖或核碱基上的位点处被标记。如本领域已知的，“核苷酸”由含氮碱基、糖和一个或多个磷酸酯基组成。在RNA中，糖是核糖并且在DNA中糖是脱氧核糖，即缺少存在于核糖中的羟基的糖。含氮碱基是嘌呤或嘧啶的衍生物。嘌呤可以是腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)，并且嘧啶可以是胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)，或在RNA的情形下是尿嘧啶(U)。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。核苷酸还是核苷的磷酸酯，在附接至糖的C-3或C-5的羟基上发生酯化。核苷酸通常是一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。
“核苷”在结构上与核苷酸类似但没有磷酸酯部分。核苷类似物的实例将是其中标记物被连接至碱基并且不存在附接至糖分子的磷酸酯基的核苷。
虽然通常将碱基称为嘌呤或嘧啶，但技术人员将理解，不改变核苷酸或核苷经历沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick base pairing)能力的衍生物和类似物是可用的。“衍生物”或“类似物”指核心结构与母体化合物的核心结构相同或非常相似但具有化学改性或物理改性(例如，允许衍生的核苷酸或核苷连接至另一个分子的不同的或另外的侧基)的化合物或分子。例如，碱基可以是脱氮嘌呤。在特定的实施方式中，衍生物能够经历沃森-克里克配对。“衍生物”和“类似物”还包括例如具有经修饰的碱基部分和/或经修饰的糖部分的合成的核苷酸衍生物或核苷衍生物。在例如Scheit,Nucleotide analogs(John Wiley& Son,1980)和Uhlman等人，Chemical Reviews 90:543-584,1990中讨论了此类衍生物和类似物。核苷酸类似物还可以具有经修饰的磷酸二酯键，包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基磷酸酯键、磷苯酰胺键、磷酰胺键等。
染料可以例如通过接头附接至核苷酸碱基上的任何位置。在特定的实施方式中，对于所产生的类似物，沃森-克里克碱基配对仍然可以进行。特别的核碱基标记位点包括嘧啶碱基的C5位或7-脱氮嘌呤碱基的C7位。如上文所描述的，可以将接头基团用于将染料共价地附接至核苷或核苷酸。
在特定的实施方式中，标记的核苷或核苷酸可以是酶促可掺入的和酶促可延伸的。因此，接头部分可以具有充足的长度以便将核苷酸连接至化合物，使得化合物不明显地干扰核苷酸通过核酸复制酶的总体结合和识别。因此，接头还可以包含间隔基单元。例如，间隔基使核苷酸碱基远离裂解位点或标记物。
使用本申请的染料标记的核苷或核苷酸可以具有下式：
其中染料是根据本申请的染料化合物，B是核碱基，例如尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤等，并且L是可以存在或可以不存在的任选的接头基团。R’可以是H、一磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸酯类似物、附接至反应性含磷基团的-O-或被阻断基团保护的-O-。R”可以是H、OH、亚磷酰胺或3’OH阻断基团并且R”’是H或OH。
在R”是亚磷酰胺的情况下，R’是酸可裂解的羟基保护基，所述酸可裂解的羟基保护基允许在自动合成条件下的随后的单体偶联。
在特定的实施方式中，阻断基团是单独的并且独立于染料化合物，即不直接附接至染料化合物。在替代的实施方式中，染料可以包含3’OH阻断基团的全部或一部分。因此，R”可以是可以包含或可以不包含本申请公开的染料化合物的3’OH阻断基团。
在又一替代实施方式中，在戊糖的3’碳上不存在阻断基团，并且例如，附接至碱基的染料(或染料和接头构建体)可以具有足以充当另外的核苷酸掺入的阻断物的尺寸或结构。因此，阻断可能是由于立体位阻或可能是由于尺寸、电荷和结构的组合，无论染料是否被附接至糖的3’位。
在又一替代实施方式中，阻断基团存在于戊糖的2’碳或4’碳上并且可以具有足以充当另外的核苷酸掺入的阻断物的尺寸或结构。当经修饰的核苷酸掺入时，阻断基团的使用能够(如通过终止延伸)来控制聚合。如果阻断作用(例如通过非限制性实例的方式通过改变化学条件或通过除去化学阻断物)是可逆的，那么延伸可以在某些点停止并且然后能够继续。
在另一个特定的实施方式中，3’OH阻断基团将包含WO2004/018497(通过引用并入本申请)中公开的部分。例如，阻断基团可以是叠氮甲基(CH2N3)或烯丙基。
在特定的实施方案中，接头(染料与核苷酸之间)和阻断基团两者均存在并且是单独的部分。在特定的实施方式中，接头和阻断基团两者在大体上类似的条件下是可裂解的。因此，脱保护和脱阻断过程可能更有效，因为仅需要单次处理以除去染料化合物和阻断物两者。然而，在一些实施方式中，接头和阻断基团不需要是在类似的条件下可裂解的，而是在不同条件下单独可裂解的。
本申请还包括掺入染料化合物的多核苷酸。此类多核苷酸可以是分别包含以磷酸二酯键连接的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的DNA或RNA。根据本申请的多核苷酸可以包括与本申请所示的至少一种经修饰的核苷酸(例如，用染料化合物标记的)组合的天然存在的核苷酸、不同于本申请的经修饰的核苷酸的非天然存在的(或经修饰的)核苷酸或其任意组合。根据本申请的多核苷酸还可以包括非天然骨架连接和/或非核苷酸化学修饰。还预期包括包含根据本申请的至少一种经修饰的核苷酸的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物的嵌合结构。
可以将包含根据本申请的染料化合物的经修饰的核苷酸(或核苷)用于任意分析方法，如包括检测附接至核苷酸或核苷的荧光标记物(无论以其自身或掺入较大分子结构或缀合物中或与较大分子结构或缀合物缔合)的方法。在本上下文中，术语“掺入多核苷酸中”可以意指，5’磷酸酯以磷酸二酯键连接至自身可以形成较长多核苷酸链的一部分的第二(经修饰的或未经修饰的)核苷酸的3’羟基。本申请所示的经修饰核苷酸的3’末端可以或可以不以磷酸二酯键连接至另外的(经修饰的或未经修饰的)核苷酸的5’磷酸酯。因而，在一个非限制性实施方式中，本申请提供了一种检测掺入到多核苷酸中的经修饰的核苷酸的方法，所述方法包括：(a)将本申请的至少一种经修饰的核苷酸掺入到多核苷酸中，以及(b)通过检测来自附接至所述经修饰核苷酸的染料化合物的荧光信号检测掺入到多核苷酸中的经修饰的核苷酸。
此方法可以包括：合成步骤(a)，其中将根据本申请的一种或多种经修饰的核苷酸掺入到多核苷酸中；以及检测步骤(b)，其中通过检测或定量测量其应该检测掺入到多核苷酸中的一种或多种经修饰的核苷酸。
在本申请的一个实施方式中，至少一种经修饰的核苷酸在合成步骤中通过聚合酶的作用掺入到多核苷酸中。然而，可以使用将经修饰的核苷酸连接至多核苷酸的其他方法，例如，化学寡核苷酸合成或标记的寡核苷酸与未标记的寡核苷酸的连接。因此，当用于核苷酸和多核苷酸时，术语“掺入”可以包括通过化学方法以及酶促方法的多核苷酸合成。
在特定的实施方式中，进行合成步骤并且可以任选地包括用包含本申请的荧光标记的经修饰的核苷酸的反应混合物孵育模板多核苷酸链。还可以在以下条件下提供聚合酶，所述条件允许在退火为模板多核苷酸链的多核苷酸链上的游离3’羟基和经修饰的核苷酸上的5’磷酸酯基之间形成磷酸二酯键。因而，合成步骤可以包括如通过核苷酸与模板链的互补碱基配对引导的多核苷酸链的形成。
在本方法的所有实施方式中，在将掺入经修饰核苷酸的多核苷酸链退火成模板链的同时，或在其中使两条链分开的变性步骤之后，可以进行检测步骤。可以将另外的步骤(例如化学反应步骤或酶促反应步骤或纯化步骤)包括在合成步骤和检测步骤之间。特别地，可以将掺入经修饰的核苷酸的靶链分离或纯化并且然后进一步处理或在随后的分析中使用。作为实例，可以将在合成步骤中用经修饰的核苷酸标记的靶多核苷酸在随后用作标记的探针或引物。在其他实施方式中，可以对本申请所述的合成步骤的产物进行另外的反应步骤，并且如果需要，可以将这些随后步骤的产物纯化或分离。
用于合成步骤的合适条件对于熟悉标准分子生物学技术的人员将是熟知的。在一个实施方式中，合成步骤可以类似于标准引物延伸反应，使用包括本申请所述的经修饰核苷酸的核苷酸前体，以在合适的聚合酶的存在下形成与模板链互补的延伸的靶链。在其他实施方式中，合成步骤本身可以形成产生标记双链的扩增产物的扩增反应的一部分，所述标记双链的扩增产物包括源自靶多核苷酸链和模板多核苷酸链复制退火的互补链。其他示例性合成步骤包括切口平移、链置换聚合、随机引物DNA标记等。用于合成步骤的特别有用的聚合酶是能够催化本申请所述的经修饰核苷酸中的一种或多种掺入的聚合酶。可以使用多种天然存在的或经修饰的聚合酶。作为实例，可以将热稳定聚合酶用于使用热循环条件进行的合成反应，然而热稳定聚合酶对于等温引物延伸反应可能不是理想的。能够将根据本申请的经修饰核苷酸掺入的适宜的热稳定聚合酶包括在WO 2005/024010或WO06120433中所描述的那些，其分别通过引用并入本申请。在于较低温度(如37℃)下进行的合成反应中，聚合酶不一定必需是热稳定聚合酶，因此聚合酶的选择将取决于许多因素，例如反应温度、pH、链置换活性等。
在特定的非限制性实施方式中，本申请包括核酸测序、再测序、全基因组测序、单核苷酸多态性评分的方法、或包括当掺入多核苷酸中时检测用本申请所述的染料标记的经修饰核苷酸或核苷的任何其他应用。受益于用包含荧光染料的经修饰核苷酸标记的多核苷酸的使用的多种其他应用中的任一种可以使用用本申请所述的染料标记的经修饰核苷酸或核苷。
在特定的实施方式中，本申请提供了包含根据本申请的染料化合物的经修饰核苷酸在通过合成反应的多核苷酸测序中的用途。通过合成测序通常包括使用聚合酶或连接酶在5’至3’方向上将一种或多种核苷酸或寡核苷酸相继添加至生长的多核苷酸链，以便形成与待测序的模板核酸互补的延伸的多核苷酸链。可以在“检测”或“成像”步骤中确定在一个或多个加入的核苷酸中存在的碱基的同一性。可以在每个核苷酸掺入步骤之后确定加入碱基的同一性。然后，可以使用常规的沃森-克里克碱基配对法则推断模板的序列。例如，在单核苷酸多态性评分中，使用用本申请所述染料标记的经修饰核苷酸确定单碱基的同一性可能是有用的，并且此类单碱基延伸反应在本申请的范围内。
在本申请的实施方式中，通过经由检测附接至所掺入的核苷酸的荧光标记物来检测将一种或多种核苷酸掺入到与待测序的模板多核苷酸互补的新生链中，从而确定模板多核苷酸的序列。模板多核苷酸的测序可以用合适的引物来引发(或制备为包含作为发夹一部分的引物的发夹构建体)，并且新生链通过在聚合酶催化的反应中将核苷酸添加至引物的3’末端以逐步方式延伸。
在特定的实施方式中，不同的核苷酸三磷酸酯(A、T、G和C)中的每个可以用独特的荧光团标记并且还包含在3’位的阻断基团以阻止不受控制的聚合。或者，四种核苷酸中的一种可以是未被标记(暗)。聚合酶将核苷酸掺入与模板多核苷酸互补的新生链中，并且阻断基团阻止核苷酸的进一步掺入。可以将任何未掺入的核苷酸洗去，并且可以通过合适的手段例如使用激光器激发和合适的发射滤光器的电荷耦合装置光学地“读取”来自每个掺入的核苷酸的荧光信号。然后，可以除去(脱保护)3’阻断基团和荧光染料化合物(同时或相继地)，以暴露新生链用于进一步的核苷酸掺入。通常，所掺入核苷酸的同一性将在每个掺入步骤之后确定，但这不是严格必要的。类似地，美国专利第5,302,509号(其通过引用并入本申请)公开了测序固定在固体支持物上的多核苷酸的方法。
如上文所示例的，该方法利用在DNA聚合酶的存在下将荧光标记的、3’阻断的核苷酸A、G、C和T掺入到与固定的多核苷酸互补的生长的链中。聚合酶掺入与靶多核苷酸互补的碱基，但通过3’-阻断基团来阻止进一步的添加。然后，可以确定掺入的核苷酸的标记物并且通过化学裂解将阻断基团除去以允许发生进一步的聚合。在通过合成反应的测序中待测序的核酸模板可以是需要测序的任何多核苷酸。用于测序反应的核酸模板通常包含具有游离的3’羟基的双链区，所述游离的3’羟基在测序反应中充当用于另外的核苷酸添加的引物或起始点。待测序的模板的区域将使此游离的3’羟基悬垂于互补链上。待测序的模板的悬垂区域可以是单链的，但可以是双链的，条件是，在与待测序的模板链互补的链上“存在切口”以提供用于引发测序反应的游离3’OH基团。在此类实施方式中，测序可以通过链置换进行。在某些实施方式中，可以将具有游离3’羟基的引物作为与待测序模板的单链区杂交的单独组分(例如，短寡核苷酸)添加。或者，引物和待测序的模板链可以各自形成能够形成分子内双链体(例如发夹环结构)的部分自补的核酸链的一部分。在国际申请公开号WO0157248和WO2005/047301中公开了可以附接至固体支持物的发夹多核苷酸和方法，其分别通过引用并入本申请。可以将核苷酸连续地添加至生长的引物，导致多核苷酸链在5’至3’方向上的合成。可以特别地但不是必需的在每次核苷酸添加之后确定已添加的碱基的性质，因此为核酸模板提供序列信息。因而，通过经由与核苷酸的5’磷酸酯基形成磷酸二酯键而将核苷酸连接至核酸链的游离3’羟基，将核苷酸掺入到核酸链(或多核苷酸)中。
待测序的核酸模板可以是DNA或RNA，或甚至是包括脱氧核苷酸和核糖核苷酸的杂交分子。核酸模板可以包含天然存在的和/或非天然存在的核苷酸以及天然的或非天然的骨架连接，条件是这些不阻止测序反应中的模板复制。
在某些实施方式中，待测序的核酸模板可以经由本领域已知的任何合适的连接方法(例如经由共价附接)附接至固体支持物。在某些实施方式中，模板多核苷酸可以直接附接至固体支持物(例如，基于二氧化硅的支持物)。然而，在本申请的其他实施方式中，可以以某种方式对固体支持物的表面改性，以便允许模板多核苷酸的直接共价附接，或以便通过自身可以非共价附接至固体支持物的水凝胶或聚合电解质多层固定模板多核苷酸。
其中已将多核苷酸直接附接至基于二氧化硅的支持物的阵列是例如在WO00006770(通过引用并入本申请)中公开的阵列，其中通过玻璃上的下垂环氧基与多核苷酸上的内部氨基之间的反应将多核苷酸固定在玻璃支持物上。此外，可以通过基于硫的亲核试剂与固体支持物的反应将多核苷酸附接至固体支持物，例如，如在WO2005/047301(通过引用并入本申请)中描述的。固体支持的模板多核苷酸另外的实例是其中将模板多核苷酸附接至支持在基于二氧化硅或其他固体支持物上的水凝胶，例如，如在WO00/31148、WO01/01143、WO02/12566、WO03/014392、美国专利第6,465,178号和WO00/53812中描述的，其分别通过引用并入本申请。
可以固定模板多核苷酸的特定表面是聚丙烯酰胺水凝胶。在上文引用的参考文献中和在WO2005/065814(其通过引用并入本申请)中描述了聚丙烯酰胺水凝胶。
可以将DNA模板分子附接至小珠或微粒，例如，如在美国专利第6,172,218号(其通过引用并入本申请)中描述的。附接至小珠或微粒对于测序应用可能是有用的。可以制备小珠文库，其中每个小珠包含不同的DNA序列。在Nature.437,376-380(2005)；Science.309,5741,1728-1732(2005)中描述了示例性的文库和用于制备其的方法，其分别通过引用并入本申请。使用本申请所述的核苷酸的此类小珠的测定测序在本申请的范围内。
待测序的模板可以形成在固体支持物上的“阵列”的一部分，在此情况下，阵列可以采取任何便利的形式。因而，本申请的方法对于所有类型的高密度阵列，包括单分子阵列、成簇阵列和小鼠珠阵列是可应用。用本申请的染料化合物标记的经修饰核苷酸可以用于对在本质上任何类型的阵列(包括但不限于通过使核酸分子固定在固体支持物上形成的阵列)上的模板进行测序。
然而，用本申请的染料化合物标记的经修饰核苷酸在测序成簇阵列的背景下是特别有利的。在成簇阵列中，阵列上不同区域(常称为位点或特征)包含多个多核苷酸模板分子。通常，多个多核苷酸分子无法通过光学手段单独分辨，并且代替地作为总体被检测。取决于阵列是如何形成的，阵列上的每个位点可以包含一个单独多核苷酸分子的多个拷贝(例如，位点对于特定单链核酸物种或双链核酸物种是同质的)或甚至少量不同多核苷酸分子的多个拷贝(例如，两个不同核酸物种的多个拷贝)。核酸分子的成簇阵列可以使用本领域通常公知的技术产生。作为实例，WO 98/44151和WO00/18957(其分别并入本申请)描述了核酸扩增的方法，其中模板和扩增产物两者均保持固定在固体支持物上，以便形成包括固定的核酸分子的簇或“集落”的阵列。存在于根据这些方法制备的成簇阵列上的核酸分子是用于使用用申请的染料化合物标记的经修饰核苷酸测序的适宜模板。
用本申请的染料化合物标记的经修饰核苷酸在对单分子阵列上的模板的测序也是有用的。如本申请所使用的术语“单分子阵列”或“SMA”指的是分布(或排列)在固体支持物上的多核苷酸分子的群体，其中任何单独的多核苷酸与群体中的所有其他多核苷酸的间距是这样的：使得单独分辨单独的多核苷酸分子是可能的。因此，在一些实施方式中，固定至固体支持物表面上的靶核酸分子可以能够通过光学手段来分辨。这意指一个或多个不同的信号(各自代表一种多核苷酸)将出现在所使用的特定成像装置的可分辨区域内。
可以实现单分子检测，其中阵列上相邻的多核苷酸分子之间的间距是至少100nm，更特别地至少250nm，还更特别地至少300nm，甚至更特别地至少350nm。因而，每个分子作为单分子荧光点是单独可分辨的且可检测的，并且来自所述单分子荧光点的荧光还呈现单步光漂白。
本申请使用术语“单独地分辨(individually resolved)”和“单独分辨(individual resolution)”来说明，当可视化时，使阵列上的一个分子与其邻近的分子相区别是可能的。阵列上单独分子之间的分离将部分地通过用于分辨单独分子的特定技术来确定。将通过引用公开的申请WO00/06770和WO 01/57248来理解单分子阵列的一般特征，其分别通过引用并入本申请。虽然本申请的经修饰核苷酸的一种用途是用于通过合成反应测序中，但经修饰核苷酸的用途不限于此类方法。事实上，核苷酸可以有利地用于需要检测附接至掺入到多核苷酸中的核苷酸的荧光标记物的任何测序方法中。
特别地，可以将用本申请的染料化合物标记的经修饰核苷酸用于自动荧光测序方案，特别是用于基于Sanger及其合作者的链终止测序方法的荧光染料终止子循环测序中。这类方法通常使用酶和循环测序以将荧光标记的双脱氧核苷酸引入引物延伸测序反应中。所谓的Sanger测序方法以及相关方案(Sanger型)利用以标记的双脱氧核苷酸的随机化链终止。
因而，本申请还包括用染料化合物标记的经修饰核苷酸，所述经修饰核苷酸是在3’位和2’位两处均缺少羟基的双脱氧核苷酸，此类经修饰双脱氧核苷酸适合用于Sanger型测序方法以及类似方法中。
将认识到的是，还可以将掺入3’阻断基团的用本申请的染料化合物标记的经修饰核苷酸用于在Sanger法和相关方案中，因为通过使用经修饰的双脱氧核苷酸实现的相同效果可以通过使用具有3’-OH阻断基团的经修饰核苷酸来实现：两者均阻止随后核苷酸的掺入。在将根据本申请的且具有3’阻断基团的核苷酸用于Sanger型测序方法的情况下，将意识到的是，附接至核苷酸的染料化合物或可检测的标记物不需要经由可裂解的接头连接，因为在掺入本申请的标记核苷酸的每种情形下；核苷酸不需要随后掺入并且因此不需要将标记物从核苷酸中除去。
本申请还提供包含用染料标记的经修饰核苷和/或核苷酸的试剂盒。此类试剂盒将通常包含用本申请所述的染料标记的至少一种经修饰的核苷酸或核苷连同至少一种另外的组分。另外的组分可以是在上文所述的方法中或在下文实施例部分中确定的组分中的一种或多种。可以组合到本申请试剂盒中的组分的一些非限制性实例如下文所示。
在特定的实施方式中，试剂盒可以包含用本申请所述的染料标记的至少一种经修饰的核苷酸或核苷连同经修饰的或未经修饰的核苷酸或核苷。例如，用根据本申请的染料标记的经修饰核苷酸可以与未标记的或天然的核苷酸组合和/或与荧光标记的核苷酸组合或其任意组合供应。因此，试剂盒可以包含用根据本申请的染料标记的经修饰核苷酸和用其他(例如，现有技术)染料化合物标记的经修饰核苷酸。核苷酸的组合可以作为分开的单独组分(例如，每容器或管一种核苷酸类型)或作为核苷酸混合物(例如，在相同的容器或管中混合的两种或多种核苷酸)提供。
在试剂盒包含用染料化合物标记的多种、特别地两种、更特别地四种经修饰核苷酸的情况下，不同的核苷酸可以用不同的染料化合物来标记，或一种可以是暗的，不具有染料化合物，或一种可以是两种染料化合物的混合物。在用不同的染料化合物标记不同的核苷酸的情况下，试剂盒的特征是，所述染料化合物是光谱上可区分的荧光染料。如在本申请中使用的，术语“光谱上可区分的荧光染料”指的是，当两种或多种此类染料存在于一种样品中时，在可以通过荧光检测设备(例如，基于商用毛细管的DNA测序平台)区分的波长下发射荧光能量的荧光染料。当用荧光染料化合物标记的两种经修饰核苷酸以试剂盒形式供应时，一些实施方式的特征是，光谱上可区分的荧光染料可以在相同的波长下(例如通过相同的激光器)来激发。或者，一些实施方式的特征是，光谱上可区分的荧光染料可以在不同的波长下(例如通过不同的激光器)来激发，但是在相同波长下发射。当用荧光染料化合物标记的四种经修饰核苷酸以试剂盒形式供应时，一些实施方式的特征是，两种光谱上可区分的荧光染料可以均在一个波长下激发，另两种光谱上可区分的染料均在另一个波长下激发。特定的激发波长是532nm、630nm至700nm，特别是660nm。
在一个实施方式中，试剂盒包含用本申请的化合物标记的经修饰核苷酸和用第二染料标记的第二经修饰核苷酸，其中染料在吸收最大值上具有至少100nm的差异。更特别地，染料化合物之一具有15-40nm之间的斯托克斯位移以及本发明的化合物具有至少50nm或者大于100nm的斯托克斯位移。本发明的化合物可以具有大于50nm、大于100nm或者甚至大于150nm的斯托克斯位移。
在另外的实施方式中，试剂盒还可以包含用荧光染料标记的经修饰的核苷酸，其中染料在大于600nm下被激发。染料可以具有至少100nm的吸收最大值差异。更特别地，第二染料化合物具有大于600nm(特别是大于630nm)的不同的吸收最大值。光谱上可区别于本申请的多次甲基染料并且满足上文标准的特定染料是如在美国专利第5,268,486号(例如Cy5)或WO 0226891(Alexa647；Molecular Probes/Life technologies A20006)中描述的多次甲基类似物或如在美国专利第6,924,372号中公开的不对称多次甲基，其分别通过引用并入本申请。
在替代的实施方式中，本申请的试剂盒可以包含其中相同碱基被两种不同的化合物标记的核苷酸。可以使用本申请的化合物标记第一核苷酸。可以使用光谱上不同的化合物(例如，在大于600nm处吸收的‘红色’染料)标记第二核苷酸。可以使用本申请的化合物和光谱上不同的化合物的混合物标记第三核苷酸，以及第四核苷酸可以是‘暗’的并且不含标记物。因此，简言之，可以将核苷酸1-4标记为‘绿色’、‘红色’、‘红色/绿色’和暗。为进一步简化仪器，可以使用单激光器激发的两种染料标记四种核苷酸，并且因此核苷酸1-4的标记可以是‘红色1’、‘红色2’、‘红色1/红色2’和暗。
核苷酸可以包含本申请的两种染料。其中Ra1是与相邻的吲哚环上的碳稠合的另一芳环的染料与不具有另外的芳香缀合的染料相比在更长的波长下吸收。试剂盒可以含有用本申请的染料标记的两种或多种核苷酸。试剂盒可以含有使用其中Ra1是H、SO3 -、磺胺或卤素的本申请的化合物标记的核苷酸以及一个使用其中Ra1是与相邻的碳原子稠合的另外的环的本申请的化合物标记的核苷酸。试剂盒还可以含有核苷酸，其中核苷酸是使用在520nm至560nm的区域内吸收的染料标记的。试剂盒还可以含有未标记的核苷酸。
虽然上文用具有用不同染料化合物标记的不同核苷酸的形式举例说明了试剂盒，但将理解的是，试剂盒可以包含具有相同染料化合物的2种、3种、4种或更多种不同的核苷酸。
在特定的实施方式中，试剂盒可以包含能够催化将经修饰的核苷酸掺入到多核苷酸中的聚合酶。拟包含在此类试剂盒中的其他组分可以包括缓冲剂等。用根据本申请的染料标记的经修饰的核苷酸和包括不同核苷酸的混合物的其他任何核苷酸组分，可以以待在使用之前被稀释的浓缩的形式提供在试剂盒中。在此类实施方式中，还可以包含适宜的稀释缓冲液。再者，可以将在本申请所述的方法中鉴定的组分中的一种或多种包含在本申请的试剂盒中。
应注意，如在本说明书和所附权利要求中所使用中，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非清楚地且明确地限定了一个指示物。对本领域技术人员而言将是显而易见的是，在不脱离本教导的精神和范围的前提下，可以对本申请描述的各种实施方式作出各种修改和变型。因此，本申请描述的各种实施方式旨在覆盖在所附权利要求及其等同物的范围内的其他修改和变型。
附图说明
图1显示了当在540nm处激发其溶液时，使用新染料(NR520ls)标记的核苷酸(本申请类型的实例)及其结构类似物(NR550S0)的荧光强度。NR550S0(结构如下所示)是在多次甲基链的两个末端均具有吲哚的多次甲基染料，其是在40-50nm范围内具有斯托克斯位移的典型荧光染料。斯托克斯位移为40-50nm的染料与长斯托克斯位移染料相比具有更高的荧光信号。
图2显示了当在460nm处激发其溶液时，基于新染料的FFN(NR520ls)及其市售结构类似物(NR550S0)的荧光强度。与540nm不同，当在460nm处激发时，长斯托克斯位移染料更亮。因此，当基于该激发波长在590nm处发射测量时，这两个标记物是可以区分的。
实验细节
SM2
使用原甲酸乙酯或其衍生物由吡喃鎓盐(SM1)制备这些原料
实施例1
将2,4,6-三甲基吡啶鎓四氟硼酸盐(1ekv)、原甲酸三乙酯(1.5ekv)和N,N’-二苯基甲脒(1.1.ekv)的乙酸溶液在80℃下加热6小时。将反应混合物在室温下放置过夜并滤出产物，为黄色结晶。收率为87％。
Indopyrilocyanines(X)
使用N-取代的吲哚鎓盐由吡喃鎓盐衍生物(SM2)制备这些原料
实施例2
(X)-1
将等摩尔量的SM2-1和N-苯基-2,3,3-三甲基吲哚鎓盐在乙酸、乙酸酐和吡啶的混合物中(1:1:0.5)在80℃下搅拌3h。
使用乙醚沉淀产物并进行柱纯化。收率为48％。
Indopyridocyanines
使用取代的胺或其盐由吡喃衍生物(X)制备这些染料
实施例3-1(NR520ls)
在乙醇中将原料搅拌5min，随后加入N-乙基-N,N-二异丙基胺并且持续搅拌0.5h。将溶剂蒸发后，收集染料，使用水洗涤。收率为～95％。
实施例3-2
在乙醇中将原料搅拌5min，随后加入N-乙基-N,N-二异丙基胺。持续搅拌0.5h。将溶剂蒸发后，收集染料，使用水洗涤。收率为～95％。
实施例3-3
将原料在乙醇中混合，然后加入N-乙基-N,N-二异丙基胺。将反应混合物搅拌0.5h。将溶剂蒸发后，收集染料，使用水洗涤。收率为～95％。
染料标记的三磷酸核苷酸的合成
染料缀合物pppT-NR520ls
制备：
将无水DMA(5mL)和Hunig碱(0.06mL)加入干燥的染料(3-1)样品中(80mg)。然后，将5mL含TSTU(0.25g)的干燥DMA溶液加入其中。将反应混合物在室温下搅拌1h。活化完成后(TLC：含15％H2O的CH3CN)，将该溶液加入pppT-LN3(0.23g)的水溶液(7mL)中。将反应混合物在室温下在氮气氛下搅拌3h。使用冰浴将反应混合物冷却至～4℃，然后加入0.1M TEAB(5mL)的水溶液并将混合物在室温下搅拌10min。将反应混合物应用于具有～75g的在0.05MTEAB水溶液中的DEAE葡聚糖凝胶树脂混悬液的柱并且用TEAB(浓度梯度从0.10M至0.75M)洗涤。收集红色级分，蒸发溶剂，然后再次与水共蒸发以除去更多TEAB并且抽真空至干燥。然后，将染料重新溶解在TEAB 0.1M中。使用具有0.2nm孔径的针筒式滤器过滤该溶液并通过使用C18反相柱用乙腈-0.1M TEAB的HPLC纯化产物。收率为78％。
染料缀合物pppA-NR520ls
制备：
将无水DMA(5mL)和Hunig碱(0.06mL)加入干燥的染料(3-1)样品中(80mg)。然后，将5mL含TSTU(0.25g)的干燥DMA溶液加入其中。将反应混合物在室温下搅拌2h。活化完成后(TLC：含15％H2O的CH3CN)，将该溶液加入pppA-LN3(0.25g)的水溶液(7mL)中。将反应混合物在室温下在氮气氛下搅拌24h。使用冰浴将反应混合物冷却至～4℃，然后加入0.1M TEAB(5mL)的水溶液并将混合物在室温下搅拌10min。将反应混合物应用于具有～75g的在0.05MTEAB水溶液中的DEAE葡聚糖凝胶树脂混悬液的柱并且用TEAB(浓度梯度从0.10M至0.75M)洗涤。收集红色级分，蒸发溶剂，然后再次与水共蒸发以除去更多TEAB并且抽真空至干燥。然后，将染料重新溶解在TEAB 0.1M中。使用具有0.2nm孔径的针筒式滤器过滤该溶液并通过使用C18反相柱用乙腈-0.1M TEAB的HPLC纯化产物。收率为75％。
荧光性质
图1显示了当在540nm处激发其溶液时，使用新染料(NR520ls)标记的核苷酸(本申请类型的实例)及其结构类似物(NR550S0)的荧光强度。NR550S0(结构如下所示)是在多次甲基链的两个末端均具有吲哚的多次甲基染料，其是在40-50nm范围内具有斯托克斯位移的典型荧光染料。斯托克斯位移为40-50nm的染料与长斯托克斯位移染料相比具有更高的荧光信号。.
图2显示了当在460nm处激发其溶液时，基于新染料的FFN(NR520ls)及其市售结构类似物(NR550S0)的荧光强度。与540nm不同，当在460nm处激发时，长斯托克斯位移染料更亮。因此，当基于该激发波长在590nm处发射测量时，这两个标记物是可以区分的。
通过比较具有长斯托克斯位移的新染料NR5201s和具有正常斯托克斯位移的其结构类似物的荧光强度比率，可以看出当在不同波长下激发溶液时使用新染料的优点，因为信号强度产生了变化。
在上面的图表中，对于染料NR550S0而言，在540nm处(193.0)与460nm处(10.1)的荧光强度比率为19.3，因为染料在460nm不能有效吸收。在相同条件下，对于新染料NR520ls而言，在540nm处(93.0)与460nm处(40.1)的荧光强度比率仅约2，因为更长的斯托克斯位移意味着染料在460nm处具有更高水平或吸收。由于这些独特的性质，使得本申请所述的新染料能够进行更有效的数据分析，因为信噪比得到了改善，并且能够使用比常规的四检测通道更少的通道操作测序平台。

Claims (29)

1.一种式(I’)化合物或其内消旋体形式：
其中mCat+或mAn-是有机或无机带正电荷/负电荷的反离子，且
m是整数0-3；
x是整数0-2；
Ra1是H、SO3 -、磺酰胺、卤素、羟基、烷氧基、氨基或与相邻的碳原子稠合的另外的环，其中所述环可以含有SO3 -、磺酰胺、卤素取代基；
Rb1是SO3 -、磺胺、卤素、羟基、烷氧基、氨基、COOH或其酰胺或酯且n为0-3；
Rc1和Rc2的每一个独立地为烷基或取代的烷基；
Rd1和Rd2的每一个独立地为H、烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；以及
Re1是烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；其中Rc1、Rb1或Re1含有COOH或COO-或者其酰胺或酯。
2.根据权利要求1所述的式(I)化合物或其内消旋体形式：
其中mCat+或mAn-是有机或无机带正电荷/负电荷的反离子，且
m是整数0-3；
Ra1是H、SO3 -、磺酰胺、卤素、羟基、烷氧基、氨基或与相邻的碳原子稠合的另外的环，其中所述环可以含有SO3 -、磺酰胺、卤素取代基；
Rb1是SO3 -、磺胺、卤素、羟基、烷氧基、氨基、COOH或其酰胺或酯且n是0-3；
Rc1和Rc2的每一个独立地是烷基或取代的烷基；
Rd1和Rd2的每一个独立地是H、烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基；以及
Re1是烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；其中Rc1、Rb1或Re1含有COOH或COO-或者其酰胺或酯。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中Re1是烷基和Rb1是COOH或COO-或者其酰胺或酯。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中Re1是被COOH或COO-或者其酰胺或酯取代的烷基。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中Re1是被COOH或COO-或者其酰胺或酯取代的芳基。
6.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中Re1是被COOH或COO-或者其酰胺或酯取代的芳基，其中在芳环与所述COOH或COO-或者其酰胺或酯之间存在烷基。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中Re1是被CH2COOH或CH2COO-或者其酰胺或酯取代的芳基。
8.根据权利要求4至7中任意一项所述的化合物，其中n是0。
9.根据权利要求4至7中任意一项所述的化合物，其中n是1且Rb1是SO3 -或磺胺。
10.根据权利要求1至9中任意一项所述的化合物，其中Rc1和Rc2的每一个是甲基。
11.根据权利要求1至9中任意一项所述的化合物，其中Rc1或Rc2是甲基、乙基、丙基或-(CH2)qSO3 -，其中q是1-6。
12.根据权利要求11所述的化合物，其中Rc1或Rc2是(CH2)4-SO3 -。
13.根据前述任意一项权利要求所述的化合物，其中Ra1是H、SO2NH2或SO3 -。
14.根据权利要求1至12中任意一项所述的化合物，其中Ra1是与相邻的碳原子稠合的环。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中所述环含有一个或多个SO3 -或磺胺取代基。
16.根据前述任意一项权利要求所述的化合物，其中Rd1和Rd2的每一个独立地是H或甲基。
17.根据权利要求1所述的化合物，所述化合物如式(II)所示：
或其盐，其中mCat+或mAn-是有机或无机带正电荷/负电荷的反离子，且
m是整数0-3；
每个n独立地是0-6；
Ra1是H、SO3 -、磺酰胺、卤素或与相邻的碳原子稠合的另外的环，其中所述环可以含有SO3 -、磺酰胺、卤素取代基；
Rb1是SO3 -、磺胺、卤素、COOH或其酰胺或酯且n是0-3；以及
X是OH、O-或者酯或酰胺。
18.根据前述任意一项权利要求所述的化合物，其中所述化合物被附接至核苷酸或寡核苷酸。
19.一种使用根据权利要求1至17所述的化合物标记的核苷酸或寡核苷酸。
20.根据权利要求18所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，其中所述标记通过从所述COOH部分形成的酰胺连接被附接。
21.根据权利要求18或19所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，其中所述标记通过接头部分被附接至嘧啶碱基的C5位或7-脱氮嘌呤碱基的C7位。
22.根据权利要求19或21所述的标记的核苷酸或寡核苷酸，还包含共价附接至所述核苷酸的核糖或脱氧核糖的3’OH阻断基团。
23.一种试剂盒，所述试剂盒包含两种或多种核苷酸，其中至少一种核苷酸是根据权利要求19至22所述的标记的核苷酸。
24.根据权利要求22所述的试剂盒，其中通过在相同波长下检测测量所述标记的核苷酸的两种。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，所述试剂盒包含四种核苷酸，其中第一核苷酸是根据权利要求18至21所述的标记的核苷酸，第二核苷酸是使用与所述第一标记核苷酸在相同波长下发射的标记物标记的，第三核苷酸是使用标记物的混合物标记的和第四核苷酸是非标记的，以使得四种标记核苷酸的每一个彼此之间相区分。
26.根据权利要求22至25所述的试剂盒，其中所述第一标记核苷酸的斯托克斯位移大于100nm和所述第二标记核苷酸的斯托克斯位移小于50nm。
27.根据权利要求19至22中任意一项所述的核苷酸，根据权利要求19至22所述的寡核苷酸或根据权利要求23至26中任意一项所述的试剂盒在测序、表达分析、杂交分析、基因分析、RNA分析或蛋白质结合测定中的用途。
28.根据权利要求27所述的用途，在自动测序仪器上进行，其中所述自动测序仪器包括在不同波长下操作的两个激光器和具有设置为固定发射波长的单个检测通道的检测系统。
29.一种合成根据权利要求1至17所述的化合物的方法，所述方法利用下述起始原料：
或其盐，其中x是0-2；Ra1是H、SO3 -、磺酰胺、卤素或与相邻的碳原子稠合的另外的环，其中所述环可以含有SO3 -、磺酰胺、卤素取代基；
Rb1是SO3 -、磺胺、卤素或COOH且n是0-3；
Rc1和Rc2的每一个独立地是烷基或取代的烷基；以及
Rd1和Rd2的每一个独立地是H、烷基、芳基、取代的烷基或取代的芳基。
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