ES2924771T3 - Compuestos de polimetino con desplazamientos de Stokes largos y su uso como marcas fluorescentes - Google Patents

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Abstract

La presente descripción se refiere a nuevos compuestos y su uso como etiquetas fluorescentes. Los compuestos pueden usarse como etiquetas fluorescentes para nucleótidos en aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos. Las etiquetas son ventajosas debido a sus largos turnos de Stokes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos de polimetino con desplazamientos de Stokes largos y su uso como marcas fluorescentes
La presente divulgación se refiere a nuevos compuestos de polimetino y a su uso como marcadores fluorescentes. En particular, los compuestos pueden usarse como marcas fluorescentes para nucleótidos en aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos.
Antecedentes
En la presente solicitud se hace referencia a varias publicaciones y documentos de patente con el fin de describir más exhaustivamente el estado de la técnica a la que pertenece la presente divulgación.
La detección no radiactiva de ácidos nucleicos utilizando marcas fluorescentes es una tecnología importante en biología molecular. Anteriormente, numerosos procedimientos empleados en tecnología de ADN recombinante dependían en gran medida del uso de nucleótidos o polinucleótidos marcados radiactivamente, por ejemplo, con 32P. Los compuestos radioactivos permiten la detección sensible de ácidos nucleicos y otras moléculas de interés. Sin embargo, existen graves limitaciones en el uso de isótopos radiactivos tales como su coste, vida útil limitada y, más importante, consideraciones de seguridad. Eliminar la necesidad de marcas radiactivas mejora la seguridad mientras reduce el impacto medioambiental y los costes asociados, por ejemplo, al desecho de reactivos. Los métodos susceptibles de detección fluorescente no radiactiva incluyen, a modo de ejemplo no limitante, secuenciación de ADN automatizada, métodos de hibridación, detección en tiempo real de productos de reacción en cadena de polimerasa e inmunoensayos.
Para numerosas aplicaciones, es deseable emplear múltiples marcas fluorescentes espectralmente distinguibles con el fin de conseguir la detección independiente de una pluralidad de analitos espacialmente superpuestos. En tales métodos múltiples, el número de recipientes de reacción puede reducirse, simplificando los protocolos experimentales y facilitando la producción de kits de reactivos de aplicación específica. Por ejemplo, en secuenciación de ADN automatizada de múltiples colores, la detección fluorescente múltiple permite el análisis de múltiples bases nucleotídicas en un único carril de electroforesis, aumentando de ese modo el rendimiento con respecto a métodos de un único color y reduciendo la incertidumbre asociada a las variaciones de movilidad electroforética entre carriles.
Sin embargo, la detección fluorescente múltiple puede ser problemática y existe una diversidad de factores importantes que restringen la selección de marcas fluorescentes. En primer lugar, puede ser difícil encontrar compuestos colorantes cuyos espectros de emisión se resuelvan espectralmente de forma adecuada en una aplicación dada. Además, cuando se usan conjuntamente varios colorantes fluorescentes, puede ser difícil generar señales de fluorescencia en regiones espectrales distinguibles por excitación simultánea debido a que las bandas de absorción de los colorantes que podrían usarse para este fin están habitualmente muy separadas, de modo que es difícil conseguir una eficacia de excitación de fluorescencia más o menos igual, incluso para dos colorantes. Numerosos métodos de excitación usan fuentes luminosas de alta potencia tales como láseres y, por tanto, el colorante debe tener suficiente fotoestabilidad para soportar tal excitación. Una consideración final, de particular importancia en métodos de biología molecular, es la medida en que los colorantes fluorescentes deben ser compatibles con la química de los reactivos usados tales como, por ejemplo, disolventes y reactivos, tampones, enzimas polimerasa y enzimas ligasa para síntesis de ADN.
A medida que avanza la tecnología de secuenciación, ha surgido la necesidad de compuestos colorantes fluorescentes adicionales, sus conjugados de ácido nucleico y conjuntos de colorantes que satisfagan todas las restricciones indicadas anteriormente y, particularmente, que sean susceptibles de métodos moleculares de alto rendimiento, tales como secuenciación en fase sólida y similares.
Las moléculas colorantes fluorescentes con propiedades mejoradas de fluorescencia, tales como intensidad de fluorescencia, forma y máximo de longitud de onda de la banda de fluorescencia, pueden mejorar la velocidad y precisión de la secuenciación de ácidos nucleicos. Una señal de fluorescencia fuerte es especialmente importante cuando se realizan medidas en tampones biológicos basados en agua y a temperatura elevada, dado que la intensidad de fluorescencia de la mayoría de los colorantes es significativamente inferior en tales condiciones. Además, la naturaleza de la base a la que está unida un colorante también afecta al máximo de fluorescencia, intensidad de fluorescencia y otras propiedades espectrales del colorante. Las interacciones específicas de secuencia entre las nucleobases y los colorantes fluorescentes pueden ajustarse a medida por diseño específico de los colorantes fluorescentes. La optimización de la estructura de los colorantes fluorescentes puede mejorar la eficacia de incorporación de nucleótidos, reducir el nivel de errores de secuenciación y disminuir el uso de reactivos en, y por tanto el coste de, la secuenciación de ácidos nucleicos.
Las mejoras en la detección, en particular de múltiples marcas fluorescentes, pueden conseguirse usando colorantes fluorescentes con desplazamientos de Stokes diferentes y, en especial, mayores de lo habitual.
El desplazamiento de Stokes es la diferencia entre la longitud de onda del máximo de absorción y la longitud de onda del máximo de emisión para la misma transición electrónica.
Figure imgf000003_0001
En la región visible, la mayoría de los colorantes fluorescentes tienen un desplazamiento de Stokes de menos de 40 nm, lo que significa que la longitud de onda de excitación más eficaz y el máximo de la longitud de onda de emisión están relativamente cerca. Los compuestos con desplazamiento de Stokes más largo tienen una mejor relación señal ruido, dado que las longitudes de onda de emisión y excitación están más separadas. Los colorantes con desplazamiento de Stokes largo también permiten que se detecten por separado dos marcas diferentes usando el mismo canal de emisión, pero con diferentes longitudes de onda de excitación. Por ejemplo, una medida de detección puede registrarse entre, digamos, 550-570 nm, y pueden detectarse señales que surjan de una primera marca con un desplazamiento de Stokes corto que se excita a 532 nm, y una segunda marca que tiene un desplazamiento de Stokes largo y se excita a, digamos, 450 nm.
En el presente documento se describen constructos de polimetino mejorados que tienen desplazamientos de Stokes largos, y su uso como marcas biomoleculares, en particular como marcas para nucleótidos usados en secuenciación de ácidos nucleicos. Las mejoras particulares pueden observarse en la eficacia de incorporación de nucleótidos marcados y la longitud de lectura de secuenciación obtenible usando los nuevos constructos fluorescentes cuando se detectan mediciones en un único canal de detección.
Los documentos de Patente WO2014/135221, US2006/269926, US2009/017441 y US2007/021621 desvelan compuestos útiles como marcas fluorescentes para moléculas diana.
Sumario
La invención se define mediante las reivindicaciones. La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (II) o formas mesómeras del mismo:
Figure imgf000004_0001
m es un número entero 0-3;
cada n es independientemente 0-6;
Raí es H, SO3-, sulfonamida, halógeno, o un anillo adicional condensado a un átomo de carbono adyacente donde el anillo puede contener sustituyentes SO3', sulfonamida, halógeno;
Rbí es SO3', sulfonamida, halógeno, COOH o una amida o éster de los mismos y Rbí(n) es 0-3; y
X es OH, O' o un éster o amida.
De acuerdo con un primer aspecto, la presente divulgación proporciona compuestos de fórmula (I) o formas mesómeras de los mismos:
Figure imgf000004_0002
m es un número entero 0-3;
Raí es H, SO3-, sulfonamida, halógeno, hidroxi, alcoxi, amino o un anillo adicional condensado a un átomo de carbono adyacente donde el anillo puede contener sustituyentes SO3-, sulfonamida, halógeno;
Rbí es SO3-, sulfonamida, halógeno, hidroxi, alcoxi, amino, COOH o una amida o éster de los mismos y n es 0-3; cada uno de Rcí y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido;
cada uno de Rdí y Rd2 es independientemente H, alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido; y
Reí es alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido; en donde Rcí, Rbí o Reí contiene un COOH o COO‘ o una amida o éster de los mismos.
La presente divulgación proporciona compuestos de fórmula (I') o formas mesómeras de los mismos:
Figure imgf000005_0001
en donde mCat+ o mAn- es un contraión orgánico o inorgánico cargado positiva/negativamente y
m es un número entero 0-3;
x es un número entero 0-2;
Ra1 es H, SO3-, sulfonamida, halógeno, hidroxi, alcoxi, amino o un anillo adicional condensado a un átomo de carbono adyacente donde el anillo puede contener sustituyentes SO3', sulfonamida, halógeno;
Rb1 es SO3', sulfonamida, halógeno, hidroxi, alcoxi, amino, COOH o una amida o éster de los mismos y n es 0-3; cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido;
cada uno de Rd1 y Rd2 es independientemente H, alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido; y
Reí es alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido; en donde Rci, Rbi o Reí contiene un COOH o COO‘ o una amida o éster de los mismos.
En ciertos ejemplos donde Reí es alquilo, Rbi, Rci puede ser COOH o COO’ o una amida o éster de los mismos. En ciertos ejemplos, n puede ser 0, de modo que el grupo fenilo está sin sustituir, y Reí contiene un COOH o COO‘ o una amida o éster de los mismos.
En otra realización, los compuestos de la presente divulgación pueden estar conjugados con una diversidad de restos de sustrato tales como, por ejemplo, nucleósidos, nucleótidos, polinucleótidos, polipéptidos, carbohidratos, ligandos, partículas, células, superficies semisólidas (por ejemplo, geles) y superficies sólidas. La conjugación puede realizarse mediante el grupo carboxi o sulfónico de Rci, Reí o Rbi que puede convertirse en una amida, sulfonamida o éster.
Por tanto, de acuerdo con un aspecto adicional de la divulgación, se proporcionan compuestos colorantes que comprenden grupos conectores que permiten, por ejemplo, la unión covalente a tales restos de sustrato tales como nucleótidos.
De acuerdo con un aspecto adicional, la divulgación proporciona un compuesto de nucleósido, nucleótido u oligonucleótido definido por la fórmula: N-L-Colorante, en donde N es un nucleótido, L es un resto conector opcional y Colorante es un compuesto fluorescente de acuerdo con la presente divulgación.
El nucleótido puede ser un 5-trifosfato de nucleótido.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona métodos de secuenciación que usan los compuestos colorantes de la presente divulgación.
De acuerdo con un aspecto adicional, la divulgación también proporciona kits que comprenden compuestos colorantes (libres o en forma conjugada) que pueden usarse en diversos ensayos inmunológicos, marcado de oligonucleótidos y ácidos nucleicos y para secuenciación de ADN por síntesis. En otro aspecto más, la divulgación proporciona kits que comprenden "conjuntos" de colorantes particularmente adecuados para ciclos de secuenciación por síntesis en una plataforma instrumental automatizada.
Un aspecto adicional de la divulgación es la preparación química de los compuestos de la divulgación.
Descripción detallada
La presente divulgación proporciona nuevos compuestos particularmente adecuados para métodos de detección por fluorescencia y secuenciación por síntesis. Los nuevos compuestos que tienen un resto de /V-fenilindol son ventajosos en posición del máximo de fluorescencia, su intensidad y fotoestabilidad en comparación con análogos de N-alquilo y, por tanto, mejoran ciertas aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos.
La invención se define mediante las reivindicaciones. La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (II) o formas mesómeras del mismo:
Figure imgf000006_0001
m es un número entero 0-3;
cada n es independientemente 0-6;
Ra1 es H, SO3-, sulfonamida, halógeno, o un anillo adicional condensado a un átomo de carbono adyacente donde el anillo puede contener sustituyentes SO3', sulfonamida, halógeno;
Rb1 es SO3', sulfonamida, halógeno, COOH o una amida o éster de los mismos y Rbí(n) es 0-3; y
X es OH, O' o un éster o amida.
De acuerdo con un primer aspecto, la divulgación proporciona compuestos de fórmula (I) o formas mesómeras de los mismos:
Figure imgf000006_0002
m es un número entero 0-3;
Raí es H, SO3-, sulfonamida, halógeno, o un anillo adicional condensado a un átomo de carbono adyacente donde el anillo puede contener sustituyentes SO3-, sulfonamida, halógeno;
Rbí es SO3-, sulfonamida, halógeno, COOH o una amida o éster de los mismos y n es 0-3;
cada uno de Rcí y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido;
cada uno de Rdí y Rd2 es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; y
Reí es alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido; en donde Rbí o Reí contiene un COOH o COO‘ o una amida o éster de los mismos.
La presente divulgación proporciona compuestos de fórmula (I) o formas mesómeras de los mismos:
Figure imgf000007_0001
en donde mCat+ o mAn- es un contraion orgánico o inorgánico cargado positiva/negativamente y
m es un número entero 0-3;
x es un número entero 0-2;
Ra1 es H, SO3-, sulfonamida, halógeno, hidroxi, alcoxi, amino o un anillo adicional condensado a un átomo de carbono adyacente donde el anillo puede contener sustituyentes SO3 ', sulfonamida, halógeno;
Rb1 es SO3 ', sulfonamida, halógeno, hidroxi, alcoxi,
amino, COOH o una amida o éster de los mismos y n es 0-3; cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido;
cada uno de Rd1 y Rd2 es independientemente H, alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido; y
Reí es alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido; en donde Rc-i , Rbi o Reí contiene un COOH o COO' o una amida o éster de los mismos.
La longitud de la cadena x puede ser 0, 1 o 2. La cadena puede tener un carbono y un doble enlace, tres carbonos y dos dobles enlaces o cinco carbonos y tres dobles enlaces. X puede ser 1, de modo que la cadena contenga tres grupos CH.
Las moléculas pueden contener un resto de sulfonamida o SO3- en posición Ra. Ra1 puede ser sulfonamida. La sulfonamida puede ser SO2 NH2 o SO2 NHR, donde R es un grupo alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido. Ra1 puede ser H. Ra1 puede ser SO3- . Ra1 puede ser un anillo adicional condensado a un átomo de carbono adyacente. El Anillo puede estar sustituido o sin sustituir. El anillo puede estar sustituido con uno o más grupos sulfonamida o SO3-. La sulfonamida puede ser SO2 NH2 o SO2 NHR, donde R es un grupo alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido.
Ra1 puede ser un anillo alifático, aromático o heterocíclico adicional condensado a carbonos adyacentes al anillo de indol. Por ejemplo, en tales casos donde un anillo aromático está condensado, el grupo terminal del colorante puede representar una estructura de tipo
Figure imgf000007_0002
donde Rf puede ser H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, halógeno, carboxi, sulfonamida, o ácido sulfónico. En tales estructuras, Rf puede aparecer múltiples veces, por ejemplo, Rf puede ser tanto H como SO3-, o puede ser múltiples grupos SO3-.
De ese modo, los colorantes de la divulgación pueden describirse mediante la Fórmula (1A) o (1A'):
Figure imgf000008_0001
en donde mCat+ o mAn- es un contraión orgánico o inorgánico cargado positiva/negativamente y
m es un número entero 0-3;
x es un número entero 0-2;
Rb1 es SO3-, sulfonamida, halógeno, COOH o una amida o éster de los mismos y n es 0-3;
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido;
cada uno de Rd1 y Rd2 es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;
Re1 es alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido; en donde Rb1 o Re1 contiene un COOH o COO' o una amida o éster de los mismos; y
donde Rf puede ser uno o más de H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, halógeno, carboxi, sulfonamida, o ácido sulfónico.
De ese modo, los colorantes de la divulgación pueden describirse mediante la Fórmula (IB) o (IB'):
Figure imgf000009_0001
m es un número entero 0-3;
x es un número entero 0-2;
Rbi es SO3-, sulfonamida, halógeno, COOH o una amida o éster de los mismos y n es 0-3;
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido;
cada uno de Rd1 y Rd2 es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;
Re1 es alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido; en donde Rb1 o Re1 contiene un COOH o COO- o una amida o éster de los mismos.
De ese modo, los colorantes de la divulgación pueden describirse mediante la Fórmula (IC) o (IC'):
Figure imgf000010_0001
m es un número entero 0-3;
x es un número entero 0-2;
Rbi es SO3-, sulfonamida, halógeno, COOH o una amida o éster de los mismos y n es 0-3;
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido;
cada uno de Rd1 y Rd2 es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;
Re1 es alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido; en donde Rb1 o Re1 contiene un COOH o COO- o una amida o éster de los mismos.
De ese modo, los colorantes de la divulgación pueden describirse mediante la Fórmula (ID) o (ID'):
Figure imgf000011_0001
en donde mCat+ o mAn- es un contraión orgánico o inorgánico cargado positiva/negativamente y
m es un número entero 0-3;
x es un número entero 0-2;
q es 1-6;
Rbi es SO3-, sulfonamida, halógeno, COOH o una amida o éster de los mismos y n es 0-3;
Rc2 es alquilo o alquilo sustituido;
cada uno de Rd1 y Rd2 es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;
Re1 es alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido; en donde Rb1 o Re1 contiene un COOH o COO' o una amida o éster de los mismos.
De ese modo, los colorantes de la divulgación pueden describirse mediante la Fórmula (IE) o (IE'):
Figure imgf000012_0001
m es un número entero 0-3;
x es un número entero 0-2;
q es 1-6;
Rbi es SO3-, sulfonamida o halógeno, y n es 0-3;
RC2 es alquilo o alquilo sustituido;
cada uno de Rd1 y Rd2 es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;
Re1 es alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido; y
X es OH, O' o un éster o amida.
El grupo carboxi o sus derivados está unido en posición Rbi Reí o Re-i. Cuando está unido a Rbi, Reí puede ser alquilo sin sustituir, o alquilo con uno o más sustituyentes. El grupo COOH puede actuar como resto de unión para unión adicional o está unido a una molécula adicional. Una vez se ha producido la conjugación, el COOH o COO‘ se convierte en una amida o éster.
Alternativamente, Rci puede contener un grupo carboxi. El grupo carboxi puede estar unido a través de un conector alquilo sustituido, por ejemplo, una cadena alquilo de longitud q, donde q es 1-6 átomos de carbono o heteroátomos. La cadena puede ser (CH2)q donde q es 1-6. El grupo puede ser (CH2)4COOH.
Alternativamente, Reí puede contener un grupo carboxi. El grupo carboxi puede estar unido a través de un conector alquilo sustituido, por ejemplo, una cadena alquilo de longitud n, donde n es 1-5 átomos de carbono o heteroátomos. La cadena puede ser (CH2)n donde n es 1-5. El grupo puede ser (CH2)sCOOH. Alternativamente, puede haber un grupo arilo como parte de Re1. Re1 puede ser cualquier grupo arilo que tenga un carboxi unido directamente, o a través de una cadena alquilo adicional. Re1 puede ser un grupo arilo sustituido con CH2COOH o C^CO O ’ o una amida o éster de los mismos. En cualquier fórmula descrita en el presente documento, el resto
Figure imgf000013_0001
puede tomar la forma de
Figure imgf000013_0002
en donde cada uno de Rdi y Rd2 es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;
cada n es independientemente 0-6; y
X es OH, O- o un éster o amida.
Cuando el grupo carboxi está unido a Reí , n puede ser 0. Alternativamente, pueden estar presentes uno o más grupos en el anillo, por ejemplo, n puede ser 1 y Rbí puede ser halógeno, sulfonamida o SO3". Generalmente, los compuestos no tendrán grupos carboxi en ambas posiciones Rbí y Reí simultáneamente, ya que no podrían producirse las reacciones de conjugación mediante múltiples restos COOH.
Cada Rcí y Rc2 puede estar sustituido independientemente con grupos carboxi, amino, amido, sulfo o sulfonamido. Las moléculas pueden contener uno o más restos alquil-sulfonato en posición Rc. Rcí y/o Rc2 pueden ser alquilo-SO3". Los otros Rc (Rcí o Rc2) pueden ser independientemente alquilo o alquilo sustituido. Rcí y Rc2 pueden ser metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo o (CH2)qSO3H, donde q es í-6. q puede ser í-4. q puede ser 4. Rcí y Rc2 pueden ser un grupo alquilo sustituido. Rcí y Rc2 pueden contener un resto COOH o -SO3H o sus derivados de éster o amida.
Cada uno de Rdí y Rd2 puede ser independientemente H o metilo. Rdí y Rd2 pueden ser iguales o diferentes. Generalmente, Rdí y Rd2 serán iguales para evitar introducir asimetría en las moléculas. Rdí y Rd2 pueden ser ambos H. Rdí y Rd2 pueden ser ambos metilo.
Algunos ejemplos de compuestos incluyen estructuras de acuerdo con la fórmula (II):
í3
Figure imgf000014_0001
o una sal de los mismos en donde mCat+ o mAn- es un contraión orgánico o inorgánico cargado positiva/negativamente y
m es un número entero 0-3;
cada n es independientemente 0-6;
Ra1 es H, SO3-, sulfonamida, halógeno, o un anillo adicional condensado a un átomo de carbono adyacente donde el anillo puede contener sustituyentes SO3', sulfonamida, halógeno;
Rb1 es SO3', sulfonamida, halógeno, COOH o una amida o éster de los mismos y n es 0-3; y
X es OH, O' o un éster o amida.
Algunos ejemplos adicionales de compuestos incluyen estructuras de acuerdo con las fórmulas (Illa) a (IlIc):
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000015_0001
Algunos ejemplos de compuestos incluyen estructuras de acuerdo con la fórmula (IV):
Figure imgf000016_0001
o una sal de los mismos en donde mCat+ o mAn- es un contraión orgánico o inorgánico cargado positiva/negativamente y
m es un número entero 0-3;
Ra1 es H, SO3 ', sulfonamida, halógeno, o un anillo adicional condensado a un átomo de carbono adyacente donde el anillo puede contener sustituyentes SO3 ', sulfonamida, halógeno;
Rb1 es SO3 ', sulfonamida, halógeno, o una amida o éster de los mismos y n es 0-3;
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido;
cada uno de Rd1 y Rd2 es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido;
X es OH, O' o un éster o amida;
Y es un heteroátomo seleccionado entre O, S o N; y
cada uno de Rfi , Rf2 , Rf3 es independientemente grupos alquilo o arilo.
Los compuestos descritos en el presente documento tienen un desplazamiento de Stokes de más de 50 nm. El desplazamiento de Stokes puede ser mayor que 100 nm, incluso mayor que 150.
Un compuesto particularmente útil es un nucleótido u oligonucleótido marcado con un colorante descrito en el presente documento.
El nucleótido u oligonucleótido marcado puede tener la marca a través del grupo carboxi para formar una amida. El nucleótido u oligonucleótido marcado puede tener la marca unida a la posición C5 de una base de pirimidina o la posición C7 de una base de 7-desazapurina a través de un resto conector.
El nucleótido u oligonucleótido marcado también puede tener un grupo bloqueador unido covalentemente al azúcar ribosa o desoxirribosa del nucleótido. El grupo bloqueador puede estar unido en cualquier posición del azúcar ribosa o desoxirribosa. En realizaciones particulares, el grupo bloqueador está en la posición 3' OH del azúcar ribosa o desoxirribosa del nucleótido.
En el presente documento se proporcionan kits que incluyen dos o más nucleótidos en donde al menos un nucleótido es un nucleótido marcado con un compuesto de la presente divulgación. El kit puede comprender dos o más nucleótidos marcados. Los nucleótidos pueden estar marcados con dos o más marcas fluorescentes. Dos o más de las marcas pueden excitarse usando una única fuente luminosa de excitación, que puede ser un láser o LED. Por ejemplo, las bandas de excitación para las dos o más marcas pueden estar al menos parcialmente superpuestas de modo que la excitación en la región de la superposición del espectro cause que ambas marcas emitan fluorescencia. En realizaciones particulares, se producirá la emisión de las dos o más marcas en diferentes regiones del espectro de modo que pueda determinarse la presencia de al menos una de las marcas distinguiendo ópticamente la emisión.
Los nucleótidos pueden estar marcados con dos o más marcas fluorescentes. Dos o más de las marcas pueden excitarse usando una fuente de excitación diferente en longitudes de onda diferentes, que pueden ser láseres. Por ejemplo, las bandas de emisión para las dos o más marcas pueden estar al menos parcialmente superpuestas de modo que la emisión en la región de la superposición del espectro cause que ambas marcas emitan fluorescencia a la misma longitud de onda de detección. Cada marca solo se excita mediante una de las longitudes de onda de excitación y, de ese modo, los colorantes son detectables por separado debido a sus perfiles de excitación distintos. En realizaciones particulares, la excitación de las dos o más marcas se producirá en diferentes regiones del espectro de modo que pueda determinarse la presencia de al menos una de las marcas distinguiendo ópticamente la excitación.
Tal perfil solo puede realizarse usando marcas que tengan desplazamientos de Stokes largos, por ejemplo, como se describe usando los compuestos descritos en el presente documento.
Cuando pueden distinguirse dos marcas, pueden identificarse cuatro nucleótidos distintos usando solo dos marcas. El nucleótido 1 puede estar marcado con la marca 1. El nucleótido 2 puede estar marcado con la marca 2. El nucleótido 3 puede estar marcado con una mezcla de las dos marcas 1 y 2, y el nucleótido 4 puede estar sin marcar (oscuro).
De ese modo, el kit puede incluir un compuesto nucleótido marcado como se describe en el presente documento, y un nucleótido marcado adicional que tiene emisión en la misma longitud de onda, pero un desplazamiento de Stokes inferior. En el presente documento se incluye un kit que comprende cuatro nucleótidos en donde un primer nucleótido es un nucleótido marcado como se describe en el presente documento, un segundo nucleótido está marcado con una marca que emite en la misma longitud de onda que el primer nucleótido marcado, un tercer nucleótido está marcado con una mezcla de marcas y el cuarto está sin marcar de modo que cada uno de los cuatro nucleótidos marcados sean distinguibles entre sí.
El kit puede contener cuatro nucleótidos marcados, donde el primero de los cuatro nucleótidos está marcado con un compuesto como se desvela en el presente documento. En tal kit, el segundo, tercer y cuarto nucleótidos pueden estar marcados cada uno con un compuesto que es opcionalmente diferente de la marca del primer nucleótido y opcionalmente diferente de las marcas de cada uno de los demás. De ese modo, uno o más de los compuestos pueden tener un máximo de absorbancia y/o máximo de emisión distintos de modo que el compuesto o compuestos sean distinguibles de los otros compuestos. Por ejemplo, cada compuesto puede tener un máximo de absorbancia y/o máximo de emisión distintos de modo que cada uno de los compuestos sea distinguible de los otros tres compuestos. Se ha de entender que las partes del espectro de absorbancia y/o espectro de emisión distintas de los máximos pueden diferir y estas diferencias pueden aprovecharse para distinguir los compuestos. El kit puede ser tal que dos o más de los compuestos tengan un máximo de absorbancia distinto superior a 600 nm. Los compuestos de la invención absorben luz habitualmente por debajo de 500 nm, pero emiten luz a una longitud de onda superior a 600 nm.
Los compuestos, nucleótidos o kits que se exponen en el presente documento pueden usarse para detectar, medir o identificar un sistema biológico (incluyendo, por ejemplo, procesos o componentes del mismo). Algunas técnicas ejemplares que pueden emplear los compuestos, nucleótidos o kits incluyen secuenciación, análisis de expresión, análisis de hibridación, análisis genético, análisis de ARN, análisis celular (por ejemplo, unión celular o análisis de función celular), o análisis proteico (por ejemplo, ensayo de unión proteica o ensayo de actividad proteica). El uso puede ser en un instrumento automatizado para realizar una técnica particular, tal como un instrumento de secuenciación automatizado. El instrumento de secuenciación puede contener dos láseres que operan a diferentes longitudes de onda. El instrumento de secuenciación puede tener un único canal de emisión, lo que por tanto puede reducir o evitar la necesidad de múltiples filtros de emisión. El sistema de detección puede tener un único canal de detección ajustado a una longitud de onda de emisión fija.
En el presente documento se desvela un método de síntesis de los compuestos de la divulgación.
Figure imgf000018_0001
De acuerdo con la presente divulgación, se preparan nuevos materiales de partida, por ejemplo (SM2), lo que permite síntesis de nuevos colorantes.
Un compuesto de fórmula (X) o una sal del mismo puede usarse como material de partida para la síntesis de los colorantes de polimetino:
Figure imgf000018_0002
o una sal del mismo en donde Ra1 es H, SO3- , sulfonamida, halógeno, o un anillo adicional condensado a un átomo de carbono adyacente donde el anillo puede contener sustituyentes SO3- , sulfonamida, halógeno;
Rb1 es SO3- , sulfonamida, halógeno o COOH y n es 0-3; cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido; y
cada uno de Rdi y Rd2 es independientemente H, alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido.
Un compuesto de fórmula (X') o una sal del mismo puede usarse como material de partida para la síntesis de los colorantes de polimetino:
Figure imgf000019_0001
o una sal del mismo en donde x es 0-2; Ra1 es H, SO3 ', sulfonamida, halógeno, o un anillo adicional condensado a un átomo de carbono adyacente donde el anillo puede contener sustituyentes SO3", sulfonamida, halógeno;
Rb1 es SO3", sulfonamida, halógeno o COOH y n es 0-3; cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido; y
cada uno de Rd1 y Rd2 es independientemente H, alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido.
Como se usa en el presente documento, el término "alquilo" se refiere a un hidrocarburo C1-C10 y puede incluir anillos carbocíclicos no aromáticos C3-C10. En realizaciones particulares, los grupos alquilo son alquilo C1-C6 que se refiere a radicales hidrocarburo saturados de cadena lineal o ramificada que contienen entre uno y seis átomos de carbono, respectivamente. Todos los grupos alquilo pueden incluir uno o más grupos insaturados, y de ese modo incluyen alquenilo y alquinilo.
El término "halógeno", como se usa en el presente documento, se refiere a cloro-(denominado en lo sucesivo Cl), bromo-(denominado en lo sucesivo Br) o yodo-(denominado en lo sucesivo I), y habitualmente se refiere a la sustitución por un átomo de hidrógeno en un compuesto orgánico, esta sustitución es opcionalmente una sustitución total para el hidrógeno.
La expresión "alquilo sustituido" se refiere a grupos alquilo, alquenilo o alquinilo, como se han definido anteriormente, donde pueden estar opcionalmente sustituidos además con, pero sin limitarse a, halo, ciano, SO3 ', SRa, ORa, NRbRc, oxo, CONRbRc, COOH y COORb. Ra, Rb y Rc pueden seleccionarse cada uno independientemente entre H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. Además, dichos alquilo sustituido, alquenilo sustituido y alquinilo sustituido pueden estar opcionalmente interrumpidos con al menos un heteroátomo o un grupo seleccionado entre O, NRb, S(O)t donde t es 0 a 2, y similar. Alquilo sustituido también cubre un grupo tal como bencilo donde el grupo alquilo está comprendido por un resto arilo o arilo sustituido adicional.
Los colorantes de acuerdo con la presente divulgación puede sintetizarse a partir de una diversidad de materiales de partida diferentes, incluyendo /V-fenilindoles. Los métodos para preparar colorantes de polimetino se conocen bien en la técnica.
De acuerdo con un aspecto de la divulgación, se proporcionan compuestos colorantes adecuados para unión a restos de sustrato, que comprenden particularmente grupos conectores para permitir la unión a los restos de sustrato. Los restos de sustrato pueden ser casi cualquier molécula o sustancia a la que puedan conjugarse los colorantes de la divulgación y, a modo de ejemplo no limitante, pueden incluir nucleósidos, nucleótidos, polinucleótidos, carbohidratos, ligandos, partículas, superficies sólidas, polímeros orgánicos e inorgánicos, cromosomas, núcleos, células vivas y combinaciones o montajes de los mismos. Los colorantes pueden estar conjugados mediante un conector opcional mediante una diversidad de medios incluyendo atracción hidrófoba, atracción iónica y unión covalente. Particularmente, los colorantes están conjugados al sustrato mediante unión covalente. Más particularmente, la unión covalente es por medio de un grupo conector.
La conjugación del compuesto colorante al sustrato de realizarse mediante un grupo carboxilo Rb1 o como parte de Re1 , que puede convertirse en una amida o éster.
Los colorantes de acuerdo con la presente divulgación pueden incluir un grupo conector reactivo en una de las posiciones de sustituyente para unión covalente del colorante a otra molécula. Los grupos conectores reactivos son restos capaces de formar un enlace (por ejemplo, un enlace covalente o no covalente). En una realización particular, el conector puede ser un conector escindible. El uso de la expresión "conector escindible" no pretende implicar que se requiera que se retire el conector completo. El sitio de escisión puede estar situado en una posición del conector que dé como resultado que parte del conector permanezca unido al colorante y/o resto de sustrato después de la escisión. Los conectores escindibles pueden ser, a modo de ejemplo no limitante, conectores escindibles electrófilamente, conectores escindibles enzimáticamente, conectores escindibles nucleófilamente, conectores fotoescindibles, escindibles en condiciones reductoras (por ejemplo, conectores que contienen disulfuro o azida), condiciones oxidantes, escindibles mediante el uso de conectores de cierre de seguridad y escindibles mediante mecanismos de eliminación. El uso de un conector escindible para unir el compuesto colorante a un resto de sustrato proporciona la opción de retirar la marca, por ejemplo después de la detección, evitando de ese modo cualquier señal de interferencia en etapas corriente abajo. Pueden encontrarse grupos conectores útiles en el documento de publicación PCT n.° WO2004/018493, cuyos ejemplos incluyen conectores que pueden escindirse usando fosfinas solubles en agua o catalizadores de metal de transición solubles en agua formados a partir de un metal de transición y ligandos al menos parcialmente solubles en agua. En solución acuosa, los últimos forman complejos de metal de transición al menos parcialmente solubles en agua. Tales conectores escindibles pueden usarse para conectar bases de nucleótidos a marcas tales como los colorantes expuestos en el presente documento.
Pueden encontrarse conectores particulares en el documento de publicación PCT n.° WO2004/018493, tales como los que incluyen los restos de fórmula:
Figure imgf000020_0001
(en donde X se selecciona entre el grupo que comprende O, S, NH y NQ en donde Q es un grupo alquilo C1-10 sustituido o sin sustituir, Y se selecciona entre el grupo que comprende O, S, NH y N(alilo), T es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C10 sustituido o sin sustituir y * indica el lugar donde el resto se conecta al resto del nucleótido o nucleósido).
En realizaciones particulares, la longitud del conector entre un colorante fluorescente (fluoróforo) y una base de guanina puede alterarse, por ejemplo, introduciendo un grupo espaciador de polietilenglicol, aumentando de ese modo la intensidad de fluorescencia en comparación con el mismo fluoróforo unido a la base de guanina a través de otros conectores conocidos en la técnica. Algunos conectores ejemplares y sus propiedades se exponen en el documento de solicitud de Patente de Gran Bretaña n.° 0517097.2, publicado como WO07020457. El diseño de conectores, y especialmente su aumento de longitud, puede permitir mejoras en el brillo de los fluoróforos unidos a las bases de guanina de nucleótidos de guanosina cuando se incorporan a polinucleótidos tales como ADN. De ese modo, cuando el colorante es para uso en cualquier método de análisis que emplee detección de una marca de colorante fluorescente unida a un nucleótido que contiene guanina, puede ser ventajoso usar un conector que tenga un grupo espaciador de fórmula -((CH2)2O)n-, en donde n es un número entero entre 2 y 50, por ejemplo, como se describe en el documento de Patente WO07020457.
La presente divulgación proporciona además conjugados de nucleósidos y nucleótidos marcados con uno o más de los colorantes expuestos en el presente documento (nucleótidos modificados). Los nucleótidos y nucleósidos marcados son útiles para marcar polinucleótidos formados por síntesis enzimática tales como, a modo de ejemplo no limitante, en amplificación por PCR, amplificación isoterma, amplificación en fase sólida, secuenciación de polinucleótidos (por ejemplo, secuenciación en fase sólida), reacciones de desplazamiento de mella y similares. Los nucleósidos y nucleótidos pueden marcarse en sitios en el azúcar o nucleobase. Como se conoce en la técnica, un "nucleótido" consiste en una base nitrogenada, un azúcar y uno o más grupos fosfato. En el ARN el azúcar es ribosa y en el ADN es desoxirribosa, es decir, un azúcar que carece de un grupo hidroxilo que está presente en la ribosa. La base nitrogenada es un derivado de purina o pirimidina. Las purinas pueden ser adenina (A) o guanina (G), y las pirimidinas pueden ser citosina (C), timina (T) o, en el contexto del ARN, uracilo (U). El átomo C-1 de la desoxirribosa está unido al N-1 de una pirimidina o al N-9 de una purina. Un nucleótido también es un éster de fosfato de un nucleósido, produciéndose la esterificación en el grupo hidroxilo unido al C-3 o C-5 del azúcar. Los nucleótidos son habitualmente mono, di o trifosfatos.
Un "nucleósido" es estructuralmente similar a un nucleótido, pero carece de los restos fosfato. Un ejemplo de un análogo de nucleósido sería uno en el que la marca está unida a la base y no hay ningún grupo fosfato unido a la molécula de azúcar.
Aunque habitualmente se hace referencia a la base como purina o pirimidina, el experto en la materia entenderá que están disponibles derivados y análogos que no alteran la capacidad del nucleótido o nucleósido para experimentar emparejamiento de bases de Watson-Crick. "Derivado" o "análogo" significa un compuesto o molécula cuya estructura central es la misma que, o se parece mucho a, la de un compuesto precursor pero que tiene una modificación química o física tal como, por ejemplo, un grupo lateral diferente o adicional, que permite que el nucleótido o nucleósido derivado se una a otra molécula. Por ejemplo, la base puede ser una desazapurina. En realizaciones particulares, los derivados son capaces de experimentar emparejamiento de Watson-Crick. "Derivado" y "análogo" también incluyen, por ejemplo, un derivado de nucleótido o nucleósido sintético que tiene restos de base modificados y/o restos de azúcar modificados. Tales derivados y análogos se discuten, por ejemplo, en Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) y Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Los análogos de nucleótido también pueden tener uniones fosfodiéster modificadas incluyendo uniones fosforotioato, fosforoditioato, alquil-fosfonato, fosforanilidato, fosforamidato y similares.
Un colorante puede estar unido a cualquier posición de una base nucleotídica, por ejemplo, a través de un conector. En realizaciones particulares, aún puede realizarse emparejamiento de bases de Watson-Crick para el análogo resultante. Los sitios de marcado de nucleobases particulares incluyen la posición C5 de una base de pirimidina y la posición C7 de una base de 7-desazapurina. Como se ha descrito anteriormente, un grupo conector puede usarse para unir covalentemente un colorante al nucleósido o nucleótido.
En realizaciones particulares, el nucleósido o nucleótido marcado puede ser enzimáticamente incorporable y enzimáticamente extensible. Por consiguiente, un resto conector puede ser de suficiente longitud para conectar el nucleótido al compuesto de modo que el compuesto no interfiera significativamente con la unión y reconocimiento generales del nucleótido por parte de una enzima de replicación de ácido nucleico. De ese modo, el conector puede comprender una unidad de espaciador. El espaciador separa, por ejemplo, la base nucleotídica de un sitio o marca escindible.
Los nucleósidos o nucleótidos marcados con colorantes de la divulgación pueden tener la fórmula:
Figure imgf000021_0001
Donde Colorante es un compuesto colorante de acuerdo con la presente divulgación, B es una nucleobase tal como, por ejemplo, uracilo, timina, citosina, adenina, guanina y similar y L es un grupo conector opcional que puede estar o no estar presente. R' puede ser H, monofosfato, difosfato, trifosfato, tiofosfato, un análogo de éster de fosfato, -O­ unido a un grupo que contiene fósforo reactivo u -O- protegido con un grupo bloqueador. R" puede ser H, OH, un fosforamidito o un grupo bloqueador de 3'OH y R"' es H u OH.
Donde R" es fosforamidito, R' es un grupo protector de hidroxilo escindible por ácido que permite que un monómero posterior se acople en condiciones de síntesis automatizada.
En una realización particular, el grupo bloqueador está separado y es independiente del compuesto colorante, es decir, no está unido directamente al mismo. En una realización alternativa, el colorante puede comprender la totalidad o parte del grupo bloqueador de 3'OH. De ese modo, R" puede ser un grupo bloqueador de 3'OH que puede comprender o no comprender un compuesto colorante desvelado en el presente documento.
En otra realización alternativa más, no hay ningún grupo bloqueador en el carbono 3' del azúcar pentosa y el colorante (o el constructo de colorante y conector) unido a la base, por ejemplo, puede ser de un tamaño o estructura suficiente para actuar como un bloqueo a la incorporación de un nucleótido adicional. De ese modo, el bloqueo puede deberse a impedimento estérico o puede deberse a una combinación de tamaño, carga y estructura, esté o no esté unido el colorante a la posición 3' del azúcar.
En otra realización alternativa más, el grupo bloqueador está presente en el carbono 2' o 4' del azúcar pentosa y puede ser de un tamaño o estructura suficiente para actuar como un bloqueo a la incorporación de un nucleótido adicional. El uso de un grupo bloqueador permite que se controle la polimerización, tal como deteniendo la extensión cuando se incorpora un nucleótido modificado. Si el efecto de bloqueo es reversible, por ejemplo, a modo de ejemplo no limitante, cambiando las condiciones químicas o retirando un bloqueo químico, la extensión puede detenerse en ciertos puntos y a continuación permite continuarse.
En otra realización particular, el grupo bloqueador de 3'OH comprenderá restos desvelados en el documento de Patente WO2004/018497. Por ejemplo, el grupo bloqueador puede ser azidometilo (CH2 N3) o alilo.
En una realización particular, un conector (entre colorante y nucleótido) y un grupo bloqueador están ambos presentes y son restos separados. En realizaciones particulares, el grupo conector y bloqueador son ambos escindibles en condiciones sustancialmente similares. De ese modo, los procesos de desprotección y desbloqueo pueden ser más eficaces dado que solo se requerirá un único tratamiento para retirar tanto el compuesto colorante como el bloqueo. Sin embargo, en algunas realizaciones, un grupo conector y bloqueador no necesitan escindirse en condiciones similares, siendo en su lugar escindibles individualmente en condiciones distintas.
La presente divulgación también incluye polinucleótidos que incorporan compuestos colorantes. Tales polinucleótidos pueden ser ADN o ARN comprendidos respectivamente por desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos unidos con uniones fosfodiéster. Los polinucleótidos de acuerdo con la divulgación pueden comprender nucleótidos de origen natural, nucleótidos de origen no natural (o modificados) distintos de los nucleótidos modificados de la divulgación o cualquier combinación de los mismos, en combinación con al menos un nucleótido modificado (por ejemplo, marcado con un compuesto colorante) expuesto en el presente documento. Los polinucleótidos de acuerdo con la divulgación también pueden incluir uniones de cadena principal no naturales y/o modificaciones químicas no nucleotídicas. También están contempladas estructuras quiméricas comprendidas por mezclas de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos que comprenden al menos un nucleótido modificado de acuerdo con la divulgación.
Los nucleótidos (o nucleósidos) modificados que comprenden un compuesto colorante de acuerdo con la presente divulgación pueden usarse en cualquier método de análisis, tal como métodos que incluyen detección de una marca fluorescente unida a un nucleótido o nucleósido, por sí misma o incorporada o asociada a una estructura molecular o conjugado de mayor tamaño. En este contexto, la expresión "incorporado a un polinucleótido" puede significar que el fosfato 5' está unido con unión fosfodiéster al grupo hidroxilo 3' de un segundo nucleótido (modificado o sin modificar), que puede formar parte de una cadena polinucleotídica de mayor tamaño. El extremo 3' de un nucleótido modificado expuesto en el presente documento puede estar o no estar unido con unión fosfodiéster al fosfato 5' de un nucleótido adicional (modificado o sin modificar). De ese modo, en una realización no limitante, la divulgación proporciona un método de detección de un nucleótido modificado incorporado a un polinucleótido que comprende: (a) incorporar al menos un nucleótido modificado de la divulgación a un polinucleótido y (b) detectar el nucleótido o nucleótidos modificados incorporados al polinucleótido por detección de la señal fluorescente del compuesto colorante unido a dicho nucleótido o nucleótidos modificados.
Este método puede incluir: una etapa sintética (a) en la que uno o más nucleótidos modificados de acuerdo con la divulgación se incorporan a un polinucleótido y una etapa de detección (b) en la que uno o más nucleótidos modificados incorporados al polinucleótido se detectan por detección o medición cuantitativa de su fluorescencia. En una realización de la presente divulgación, se incorpora al menos un nucleótido modificado a un polinucleótido en una etapa sintética mediante la acción de una enzima polimerasa. Sin embargo, pueden usarse otros métodos de unión de nucleótidos modificados a polinucleótidos tales como, por ejemplo, síntesis química de oligonucleótidos o ligación de oligonucleótidos marcados a oligonucleótidos sin marcar. Por tanto, el término "incorporar", cuando se usa con referencia a un nucleótido y polinucleótido, puede incluir síntesis de polinucleótidos mediante métodos químicos así como métodos enzimáticos.
En una realización específica, se realiza una etapa sintética y puede comprender opcionalmente incubar una hebra de polinucleótido plantilla con una mezcla de reacción que comprende nucleótidos modificados marcados con fluorescencia de la divulgación. También puede proporcionarse una polimerasa en condiciones que permitan la formación de una unión fosfodiéster entre un grupo hidroxilo 3' libre de una hebra de polinucleótido hibridado a la hebra de polinucleótido plantilla y un grupo fosfato 5' del nucleótido modificado. De ese modo, una etapa sintética puede incluir la formación de una hebra de polinucleótido dirigida por emparejamiento de bases complementarias de nucleótidos a una hebra plantilla.
En todas las realizaciones del método, la etapa de detección puede realizarse mientras que la hebra de polinucleótido a la que se incorporan los nucleótidos modificados se hibrida a una hebra plantilla, o después de una etapa de desnaturalización en la que se separan las dos hebras. Pueden incluirse etapas adicionales, por ejemplo, etapas de reacción química o enzimática o etapas de purificación, entre una etapa sintética y una etapa de detección. En particular, la hebra diana que incorpora el nucleótido o nucleótidos modificados puede aislarse o purificarse y a continuación procesarse adicionalmente o usarse en un análisis posterior. A modo de ejemplo, los polinucleótidos diana marcados con nucleótidos modificados en una etapa sintética pueden usarse posteriormente como sondas o cebadores marcados. En otras realizaciones, el producto de una etapa sintética expuesta en el presente documento puede someterse a etapas de reacción adicionales y, si se desea, el producto de estas etapas posteriores puede purificarse o aislarse.
Los expertos habituales en técnicas de biología molecular convencionales conocerán bien las condiciones adecuadas para una etapa sintética. En una realización, una etapa sintética puede ser análoga a una reacción de extensión de cebador convencional usando precursores nucleotídicos, incluyendo nucleótidos modificados expuestos en el presente documento, para formar una hebra diana extendida complementaria a la hebra plantilla en presencia de una enzima polimerasa adecuada. En otras realizaciones, una etapa sintética puede formar por sí misma parte de una reacción de amplificación que produce un producto de amplificación bicatenario marcado comprendido por hebras complementarias hibridadas derivadas de las copias de las hebras de polinucleótidos diana y plantilla. Otras etapas sintéticas ejemplares incluyen desplazamiento de mella, polimerización por desplazamiento de hebra, marcado de ADN cebado aleatorio, etc. Una enzima polimerasa particularmente útil para una etapa sintética es la que es capaz de catalizar la incorporación de uno o más de los nucleótidos modificados expuestos en el presente documento. Puede usarse una diversidad de polimerasas de origen natural o modificadas. A modo de ejemplo, puede usarse una polimerasa termoestable para una reacción sintética que se realiza usando condiciones de termociclado, mientras que puede no desearse una polimerasa termoestable para reacciones de extensión de cebador isotermas. Las polimerasas termoestables adecuadas que son capaces de incorporar los nucleótidos modificados de acuerdo con la presente divulgación incluyen las descritas en los documentos de Patente WO 2005/024010 o WO06120433. En reacciones sintéticas que se realizan a temperaturas inferiores, tales como 37 °C, las enzimas polimerasas no necesitan ser necesariamente polimerasas termoestables, y por tanto la elección de una polimerasa dependerá de una diversidad de factores, tales como temperatura de reacción, pH, actividad de desplazamiento de hebra y similares.
En realizaciones específicas no limitantes, la divulgación incluye métodos de secuenciación de ácidos nucleicos, resecuenciación, secuenciación del genoma completo, calificación de polimorfismo de nucleótido único, o cualquier otra aplicación que implique la detección del nucleótido o nucleósido modificado marcado con colorantes expuestos en el presente documento cuando se incorpora a un polinucleótido. Cualquiera de una diversidad de otras aplicaciones que se benefician del uso de polinucleótidos marcados con los nucleótidos modificados que comprenden colorantes fluorescentes pueden usar nucleótidos o nucleósidos modificados marcados con colorantes expuestos en el presente documento.
En una realización particular, la divulgación proporciona el uso de nucleótidos modificados que comprenden compuestos colorantes de acuerdo con la divulgación en una reacción de secuenciación por síntesis de polinucleótidos. La secuenciación por síntesis implica generalmente la adición secuencial de uno o más nucleótidos u oligonucleótidos a una cadena polinucleotídica creciente en la dirección 5' a 3' usando una polimerasa o ligasa con el fin de formar una cadena de polinucleótido extendida complementaria al ácido nucleico plantilla que se secuencia. La identidad de la base presente en uno o más de los nucleótidos añadidos puede determinarse en una etapa de detección o "formación de imágenes". La identidad de la base añadida puede determinarse después de cada etapa de incorporación de nucleótido. A continuación, puede inferirse la secuencia de la plantilla usando reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick convencionales. El uso de nucleótidos modificados marcados con colorantes expuestos en el presente documento para la determinación de la identidad de una base individual puede ser útil, por ejemplo, en la calificación de polimorfismos de nucleótido único, y tales reacciones de extensión de base individual están dentro del alcance de la presente divulgación.
En una realización de la presente divulgación, la secuencia de un polinucleótido plantilla se determina por detección de la incorporación de uno o más nucleótidos a una hebra naciente complementaria al polinucleótido plantilla que se secuencia a través de la detección de la marca o marcas fluorescentes añadidas al nucleótido o nucleótidos incorporados. La secuenciación del polinucleótido plantilla puede cebarse con un cebador adecuado (o prepararse como un constructo de horquilla que contendrá el cebador como parte de la horquilla), y la cadena naciente se extiende etapa a etapa por adición de nucleótidos al extremo 3' del cebador en una reacción catalizada por polimerasa.
En realizaciones particulares, cada uno de los nucleótidos trifosfatos diferentes (A, T, G y C) puede estar marcado con un único fluoróforo y también comprende un grupo bloqueador en la posición 3' para prevenir la polimerización incontrolada. Alternativamente, uno de los cuatro nucleótidos puede estar sin marcar (oscuro). La enzima polimerasa incorpora un nucleótido a la cadena naciente complementaria al polinucleótido plantilla, y el grupo bloqueador evita la incorporación adicional de nucleótidos. Cualquier nucleótido sin incorporar puede retirarse por lavado y la señal fluorescente de cada nucleótido incorporado puede "leerse" ópticamente mediante medios adecuados, tales como un dispositivo de carga acoplada usando excitación por láser y filtros de emisión adecuados. A continuación, el grupo bloqueador de 3' y los compuestos colorantes fluorescentes pueden retirarse (desprotegerse), (simultánea o secuencialmente) para exponer la cadena naciente a una incorporación de nucleótido adicional. Habitualmente, la identidad del nucleótido incorporado se determinará después de cada etapa de incorporación, pero esto no es estrictamente esencial. Del mismo modo, el documento de Patente de Estados Unidos n.° 5.302.509 desvela un método para secuenciar polinucleótidos inmovilizados sobre un soporte sólido.
El método, ejemplificado anteriormente, utiliza la incorporación de nucleótidos A, G, C y T bloqueados en 3' marcados con fluorescencia en una cadena creciente complementaria al polinucleótido inmovilizado, en presencia de ADN polimerasa. La polimerasa incorpora una base complementaria al polinucleótido diana, pero se evita la adición adicional mediante el grupo bloqueador de 3'. A continuación, la marca del nucleótido incorporado puede determinarse y el grupo bloqueador retirarse por escisión química para permitir que se produzca polimerización adicional. La plantilla de ácido nucleico que se secuencia en la reacción de secuenciación por síntesis puede ser cualquier polinucleótido que se desee secuenciar. La plantilla de ácido nucleico para una reacción de secuenciación comprenderá habitualmente una región bicatenaria que tiene un grupo hidroxilo 3' libre que sirve como cebador o punto de iniciación para la adición de nucleótidos adicionales en la reacción de secuenciación. En la región de la plantilla que se secuencia sobresaldrá este grupo hidroxilo 3' libre en la cadena complementaria. La región que sobresale de la plantilla que se secuencia puede ser monocatenaria pero puede ser bicatenaria, siempre que "esté presente una mella" en la hebra complementaria a la hebra plantilla que se secuencia para proporcionar un grupo OH 3' libre para la iniciación de la reacción de secuenciación. En tales realizaciones, la secuenciación puede transcurrir por desplazamiento de hebra. En ciertas realizaciones, un cebador que porta el grupo hidroxilo 3' libre puede añadirse como componente separado (por ejemplo, un oligonucleótido corto) que hibrida a una región bicatenaria de la plantilla que se secuencia. Alternativamente, el cebador y la hebra plantilla que se secuencia pueden formar cada uno parte de una hebra de ácido nucleico parcialmente complementaria capaz de formar un dúplex intramolecular tal como, por ejemplo, una estructura de bucle en horquilla. Se desvelan polinucleótidos de horquilla y métodos mediante los que pueden unirse a soportes sólidos en los documentos de publicación de solicitud internacional con números WO0157248 y WO2005/047301. Los nucleótidos pueden añadirse sucesivamente a un cebador creciente, dando como resultado la síntesis de una cadena polinucleotídica en la dirección 5' a 3'. La naturaleza de la base que se ha añadido puede determinarse, particularmente, pero no necesariamente, después de cada adición de nucleótido, proporcionando de ese modo la información de secuencia para la plantilla de ácido nucleico. De ese modo, un nucleótido se incorpora a una hebra de ácido nucleico (o polinucleótido) por unión del polinucleótido al grupo hidroxilo 3' libre de la hebra de ácido nucleico mediante formación de una unión fosfodiéster con el grupo fosfato 5' del nucleótido.
La plantilla de ácido nucleico que se secuencia puede ser ADN o ARN, o incluso una molécula híbrida comprendida por desoxinucleótidos y ribonucleótidos. La plantilla de ácido nucleico puede comprender nucleótidos de origen natural y/o origen no natural y uniones de cadena principal naturales o no naturales, siempre que estas no eviten la copia de la plantilla en la reacción de secuenciación.
En ciertas realizaciones, la plantilla de ácido nucleico que se secuencia puede estar unida a un soporte sólido mediante cualquier método de unión adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, mediante unión covalente. En ciertas realizaciones, los polinucleótidos plantilla pueden estar unidos directamente a un soporte sólido (por ejemplo, un soporte basado en sílice). Sin embargo, en otras realizaciones de la divulgación, la superficie del soporte sólido puede modificarse en cierto modo para permitir unión covalente directa de polinucleótidos plantilla, o para inmovilizar los polinucleótidos plantilla a través de una capa múltiple de hidrogel o polielectrolito, que puede unirse de forma no covalente al soporte sólido.
Las matrices en las que los polinucleótidos se han unido directamente a soportes basados en sílice son las desveladas, por ejemplo, en el documento de Patente WO00006770, en donde los polinucleótidos están inmovilizados sobre un soporte de vidrio por reacción entre un grupo epóxido colgante del vidrio con un grupo amino interno del polinucleótido. Además, los polinucleótidos pueden estar unidos a un soporte sólido por reacción de un nucleófilo basado en azufre con el soporte sólido, por ejemplo, como se describe en el documento de Patente WO2005/047301. Otro ejemplo adicional de polinucleótidos plantilla soportados sobre sólidos es cuando los polinucleótidos plantilla están unidos a hidrogel soportado sobre soportes basados en sílice u otros soportes, por ejemplo, como se describe en los documentos de Patente WO00/31148, WO01/01143, WO02/12566, WO03/014392, U.S. n.° 6.465.178 y WO00/53812.
Una superficie particular en la que pueden inmovilizarse polinucleótidos plantilla es un hidrogel de poliacrilamida. Se describen hidrogeles de poliacrilamida en la referencias citadas anteriormente y en el documento de Patente WO2005/065814.
Las moléculas plantilla de ADN pueden estar unidas a perlas o micropartículas, por ejemplo, como se describe en el documento de Patente de Estados Unidos n.° 6.172.218. La unión a perlas o micropartículas puede ser útil para aplicaciones de secuenciación. Pueden prepararse bibliotecas de perlas donde cada perla contiene diferentes secuencias de ADN. Se describen bibliotecas ejemplares y métodos para su creación en Nature. 437, 376-380 (2005); Science. 309, 5741, 1728-1732 (2005). La secuenciación de matrices de tales perlas usando nucleótidos expuestos en el presente documento está dentro del alcance de la divulgación.
La plantilla o plantillas que se secuencian pueden formar parte de una "matriz" sobre un soporte sólido, en cuyo caso la matriz puede tener cualquier forma conveniente. De ese modo, el método de la divulgación se aplica a todos los tipos de matrices de alta densidad, incluyendo matrices de molécula individual, matrices agrupadas y matrices de perlas. Los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la presente divulgación pueden usarse para secuenciar plantillas básicamente en cualquier tipo de matriz, incluyendo, pero sin limitación, las formadas por inmovilización de moléculas de ácido nucleico sobre un soporte sólido.
Sin embargo, los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la divulgación son particularmente ventajosos en el contexto de la secuenciación de matrices agrupadas. En las matrices agrupadas, distintas regiones de la matriz (a menudo denominadas sitios, o características) comprenden múltiples moléculas polinucleotídicas plantilla. Generalmente, las múltiples moléculas polinucleotídicas no son resolvibles individualmente mediante medios ópticos y en su lugar se detectan como un conjunto. Dependiendo de cómo esté formada la matriz, cada sitio de la matriz puede comprender múltiples copias de una molécula polinucleotídica individual (por ejemplo, el sitio es homogéneo para una especie de ácido nucleico mono o bicatenaria particular) o incluso múltiples copias de un pequeño número de moléculas polinucleotídicas diferentes (por ejemplo, múltiples copias de dos especies de ácido nucleico diferentes). Las matrices agrupadas de moléculas de ácido nucleico pueden producirse usando técnicas conocidas generalmente en la técnica. A modo de ejemplo, los documentos de Patente WO 98/44151 y WO00/18957 describen métodos de amplificación de ácidos nucleicos en donde tanto la plantilla como los productos de amplificación permanecen inmovilizados sobre un soporte sólido con el fin de formar matrices comprendidas por agrupaciones o "colonias" de moléculas de ácido nucleico inmovilizadas. Las moléculas de ácido nucleico presentes en las matrices agrupadas preparadas de acuerdo con estos métodos son plantillas adecuadas para secuenciación usando los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la divulgación.
Los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la presente divulgación también son útiles en secuenciación de plantillas en matrices de molécula individual. La expresión "matriz de molécula individual" o "SMA", como se usa en el presente documento, se refiere a una población de moléculas polinucleotídicas, distribuidas (o agrupadas) sobre un soporte sólido, en donde el espaciado de cualquier polinucleótido individual con respecto a todos los demás de la población es tal que es posible resolver individualmente las moléculas polinucleotídicas individuales. De ese modo, en algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico diana inmovilizadas sobre la superficie del soporte sólido pueden ser capaces de resolverse mediante medios ópticos. Esto significa que se producirán una o más señales distintas, cada una representando un polinucleótido, dentro del área resolvible del dispositivo de formación de imágenes particular usado.
La detección de molécula individual puede conseguirse cuando el espaciado entre moléculas polinucleotídicas adyacentes en la matriz es al menos 100 nm, más particularmente al menos 250 nm, aún más particularmente al menos 300 nm, incluso más particularmente al menos 350 nm. De ese modo, cada molécula es individualmente resolvible y detectable como un punto fluorescente de molécula individual, y la fluorescencia de dicho punto fluorescente de molécula individual también exhibe fotoblanqueo de etapa individual.
Las expresiones "resuelto individualmente" y "resolución individual" se usan en el presente documento para especificar que, cuando se visualiza, es posible distinguir una molécula de la matriz de sus moléculas vecinas. La separación entre moléculas individuales en la matriz estará determinada, en parte, por la técnica particular usada para resolver las moléculas individuales. Las características generales de las matrices de molécula individual se entenderán por referencia a los documentos de solicitud publicados WO00/06770 y WO 01/57248. Aunque un uso de los nucleótidos modificados de la divulgación es en reacciones de secuenciación por síntesis, la utilidad de los nucleótidos modificados no está limitada a tales métodos. De hecho, los nucleótidos pueden usarse ventajosamente en cualquier metodología de secuenciación que requiera detección de marcas fluorescentes unidas a nucleótidos incorporados a un polinucleótido.
En particular, los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la divulgación pueden usarse en protocolos de secuenciación fluorescente automatizada, particularmente secuenciación de ciclo de terminador de colorante fluorescente basada en el método de secuenciación de terminación de cadena de Sanger y colaboradores. Tales métodos usan generalmente enzimas y secuenciación de ciclo para incorporar didesoxinucleótidos marcados con fluorescencia en una reacción de secuenciación de extensión de cebador. Los llamados métodos de secuenciación de Sanger, y los protocolos relacionados (de tipo Sanger), utilizan terminación de cadena aleatorizada con didesoxinucleótidos marcados.
De ese modo, la presente divulgación también incluye nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes que son didesoxinucleótidos que carecen de grupos hidroxilo en las posiciones 3' y 2', siendo adecuados tales didesoxinucleótidos modificados para uso en métodos de secuenciación de tipo Sanger y similares.
Se ha de reconocer que los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la presente divulgación que incorporan grupos bloqueadores de 3' también pueden ser de utilidad en métodos de Sanger y protocolos relacionados dado que el mismo efecto conseguido usando didesoxinucleótidos modificados puede conseguirse usando nucleótidos modificados que tienen grupos bloqueadores de 3'-OH: ambos previenen la incorporación de nucleótidos posteriores. Cuando los nucleótidos de acuerdo con la presente divulgación, y que tienen un grupo bloqueador de 3', son para usarse en métodos de secuenciación de tipo Sanger, se ha de entender que los compuestos colorantes o marcas detectables unidas a los nucleótidos no necesitan conectarse mediante conectores escindibles, dado que en cada caso, cuando se incorpora un nucleótido marcado de la divulgación, no se necesita que se incorpore posteriormente ningún nucleótido y de ese modo la marca no necesita retirarse del nucleótido.
La presente divulgación también proporciona kits que incluyen nucleósidos y/o nucleótidos modificados marcados con colorantes. Tales kits incluirán generalmente al menos un nucleótido o nucleósido modificado marcado con un colorante expuesto en el presente documento junto con al menos un componente adicional. El componente adicional puede ser uno o más de los componentes identificados en un método expuesto anteriormente o posteriormente en la sección de Ejemplos. Algunos ejemplos no limitantes de componentes que pueden combinarse en un kit de la presente divulgación se exponen posteriormente.
En una realización particular, un kit puede incluir al menos un nucleótido o nucleósido modificado marcado con un colorante expuesto en el presente documento junto con nucleótidos o nucleósidos modificados o sin modificar. Por ejemplo, pueden suministrarse nucleótidos modificados marcados con colorantes de acuerdo con la divulgación en combinación con nucleótidos sin marcar o nativos, y/o con nucleótidos marcados con fluorescencia o cualquier combinación de los mismos. Por consiguiente, los kits pueden comprender nucleótidos modificados marcados con colorantes de acuerdo con la divulgación y nucleótidos modificados marcados con otros compuestos colorantes, por ejemplo, de la técnica anterior. Las combinaciones de nucleótidos pueden proporcionarse como componentes individuales separados (por ejemplo, un tipo de nucleótido por recipiente o tubo) o como mezclas de nucleótidos (por ejemplo, dos o más nucleótidos mezclados en el mismo recipiente o tubo).
Cuando los kits comprenden una pluralidad, particularmente dos, más particularmente cuatro, nucleótidos modificados marcados con un compuesto colorante, los diferentes nucleótidos pueden estar marcados con diferentes compuestos colorantes, o uno puede ser oscuro, sin ningún compuesto colorante, o uno puede ser una mezcla de dos compuestos colorantes. Cuando los diferentes nucleótidos están marcados con diferentes compuestos colorantes, es una característica de los kits que dichos compuestos colorantes son colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles. Como se usa en el presente documento, la expresión "colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles" se refiere a colorantes fluorescentes que emiten energía fluorescente a longitudes de onda que pueden distinguirse mediante equipo de detección de fluorescencia (por ejemplo, una plataforma comercial de secuenciación de ADN basada en capilaridad) cuando dos o más de tales colorantes están presentes en una muestra. Cuando dos nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes fluorescentes se suministran en forma de kit, es una característica de algunas realizaciones que los colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles pueden excitarse a la misma longitud de onda, tal como, por ejemplo, mediante el mismo láser. Alternativamente, es una característica de algunas realizaciones que los colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles pueden excitarse a diferentes longitudes de onda, tal como, por ejemplo, mediante diferentes láseres, pero emiten a la misma longitud de onda. Cuando se suministran cuatro nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes fluorescentes en forma de kit, es una característica de alguna realizaciones que dos de los colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles pueden excitarse ambos a una longitud de onda y los otros dos colorantes espectralmente distinguibles pueden excitarse ambos a otra longitud de onda. Algunas longitudes de onda de excitación particulares son 532 nm, 630 nm a 700 nm, particularmente 660 nm.
En una realización, un kit incluye un nucleótido modificado marcado con un compuesto de la presente divulgación y un segundo nucleótido modificado marcado con un segundo colorante, en donde los colorantes tienen una diferencia en el máximo de absorbancia de al menos 100 nm. Más particularmente, uno de los compuestos colorantes tiene un desplazamiento de Stokes de 15-40 nm y un compuesto de la invención tiene un desplazamiento de Stokes de al menos 50 nm, o más de 100 nm. Los compuestos de la invención pueden tener desplazamientos de Stokes de más de 50 nm, más de 100 nm e incluso más de 150 nm.
En una realización adicional, un kit puede incluir además nucleótidos modificados marcados con colorantes fluorescentes, en donde los colorantes se excitan a, digamos, más de 600 nm. Los colorantes pueden tener una diferencia en el máximo de absorbancia de al menos 100 nm. Aún más particularmente, el segundo compuesto colorante puede tener un máximo de absorbancia diferente superior a 600 nm, particularmente superior a 630 nm. Colorantes particulares que son espectralmente distinguibles de colorantes de polimetino de la presente divulgación y que cumplen los criterios anteriores son análogos de polimetino descritos en el documento de Patente de Estados Unidos n.° 5.268.486 (por ejemplo, Cy5) o el documento de Patente WO 0226891 (Alexa 647; Molecular Probes/Life technologies A20006) o polimetinos asimétricos desvelados en el documento de Patente de Estados Unidos n.° 6.924.372.
En una realización alternativa, los kits de la divulgación pueden contener nucleótidos donde la misma base está marcada con dos compuestos diferentes. Un primer nucleótido puede estar marcado con un compuesto de la divulgación. Un segundo nucleótido puede estar marcado con un compuesto espectralmente distinto, por ejemplo, un colorante "rojo" que absorbe a más de 600 nm. Un tercer nucleótido puede estar marcado como una mezcla del compuesto de la divulgación y el compuesto espectralmente distinto, y el cuarto nucleótido puede ser "oscuro" y no contener ninguna marca. Por tanto, en términos simples, los nucleótidos 1-4 pueden estar marcados "verde", "rojo", "rojo/verde", y oscuro. Para simplificar la instrumentación adicional, pueden marcarse cuatro nucleótidos con dos colorantes excitados con un único láser, y de ese modo el marcado de los nucleótidos 1-4 puede ser "rojo 1", "rojo 2", "rojo 1/rojo 2", y oscuro.
Los nucleótidos pueden contener dos colorantes de la presente divulgación. Los colorantes donde Ra1 es un anillo aromático adicional condensado a carbonos adyacentes del anillo de indol absorben a una longitud de onda mayor que cuando los colorantes no tienen la conjugación aromática adicional. Un kit puede componer dos o más nucleótidos marcados con colorantes de la divulgación. Un kit puede contener un nucleótido marcado con un compuesto de la divulgación donde Ra1 es H, SO3', sulfonamida o halógeno, y un nucleótido marcado con un compuesto de la divulgación donde Ra1 es un anillo adicional condensado a un átomo de carbono adyacente. Los kits pueden contener un nucleótido adicional donde el nucleótido está marcado con un colorante que absorbe en la región de 520 nm a 560 nm. Los kits pueden contener además un nucleótido sin marcar.
Aunque anteriormente se han ejemplificado kits con respecto a configuraciones que tienen diferentes nucleótidos que están marcados con diferentes compuestos colorantes, se ha de entender que los kits pueden incluir 2, 3, 4 o más nucleótidos diferentes que tengan el mismo compuesto colorante.
En realizaciones particulares, un kit puede incluir una enzima polimerasa capaz de catalizar la incorporación de los nucleótidos modificados a un polinucleótido. Otros componentes que pueden incluirse en tales kits pueden incluir tampones y similares. Los nucleótidos modificados marcados con colorantes de acuerdo con la divulgación, y cualquier otro componente nucleotídico, incluyendo mezclas de diferentes nucleótidos, pueden proporcionarse en el kit en forma concentrada para diluirse antes de su uso. En tales realizaciones, también puede incluirse un tampón de dilución adecuado. De nuevo, pueden incluirse uno o más de los componentes identificados en un método expuesto en el presente documento en un kit de la presente divulgación.
Se ha de observar que, como se usa en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un", "una", "uno", "la" y "el" incluyen las referencias en plural a menos que se limite de forma expresa e inequívoca a una referencia.
Descripción de las figuras
La Figura 1 ilustra intensidades de fluorescencia de un nucleótido marcado con un nuevo colorante (NR5201s), un ejemplo del tipo desvelado en el presente documento, y un análogo estructural (NR550S0) cuando sus soluciones se excitan a 540 nm. NR550S0 (estructura mostrada posteriormente) es un colorante de polimetino que tiene un indol en ambos extremos de la cadena de polimetino, que es habitual en los colorantes fluorescentes que tienen un desplazamiento de Stokes en la región de 40-50 nm. El colorante que tiene un desplazamiento de Stokes de 40-50 nm muestra una mayor señal de fluorescencia que el colorante de desplazamiento de Stokes largo.
La Figura 2 ilustra intensidades de fluorescencia de FFN basados en el colorante nuevo (NR5201s) y su análogo estructural comercial (NR550S0) cuando sus soluciones se excitan a 460 nm. A diferencia de 540 nm, el colorante de desplazamiento de Stokes largo es más brillante cuando se excita a 460 nm. De ese modo, las dos marcas pueden diferenciarse cuando se miden a emisión de 590 nm basándose en la longitud de onda de excitación.
Figure imgf000028_0001
Estos materiales de partida se prepararon a partir de sales de pirilio (SM1) usando ortoformiato de etilo o sus derivados.
Figure imgf000028_0002
Se calentaron tetrafluoroborato de 2,4,6-trimetilpirilio (1 ekv), ortoformiato de trietilo (1,5 ekv) y N,N'-difenilformamidina (1,1.ekv) en ácido acético durante 6 h a 80 °C. La mezcla de reacción se dejó durante una noche a temperatura ambiente y el producto se retiró por filtración en forma de cristales amarillos. Rendimiento 87 %. Indopirilocianinas (X).
Figure imgf000028_0003
Estos materiales de partida se prepararon a partir de derivados de sales de pirilio (SM2) usando sales de indolio N-sustituidas.
Ejemplo 2
Figure imgf000029_0001
Se agitaron cantidades equimolares de SM2-1 y sal de /V-fenil-2,3,3-trimetMindoMo en mezcla de ácido acético, anhídrido acético y piridina (1:1:0,5) durante 3 h a 80 °C.
El producto se precipitó en éter dietílico y se purificó en columna. Rendimiento 48 %.
Indopiridocianinas
Estos colorantes se prepararon a partir de derivados de pirilio (X) usando aminas sustituidas o sus sales.
Figure imgf000029_0002
Los materiales de partida se agitaron durante 5 min en etanol y a continuación se añadió W-etil-W,A/-diisopropilamina y la agitación continuó durante 0,5 h. Después de evaporación del disolvente, el colorante se recogió, se lavó con agua. Rendimiento ~95 %.
Ejemplo 3-2
Figure imgf000029_0003
Los materiales de partida se agitaron durante 5 min en etanol y a continuación se añadió W-etil-A/,W-diisopropilamina. La agitación continuó durante 0,5 h. Después de evaporación del disolvente, el colorante se recogió, se lavó con agua. Rendimiento ~95 %.
Ejemplo 3-3
Figure imgf000030_0001
Los materiales de partida se mezclaron en etanol y a continuación se añadió W-etil-A/,W-diisopropilamina. La mezcla de reacción se agitó durante 0,5 h. Después de evaporación del disolvente, el colorante se recogió, se lavó con agua. Rendimiento ~95 %.
Síntesis de trifosfatos de nucleótido marcado con colorante Conjugado de colorante pppT-NR5201s
Figure imgf000030_0002
Preparación:
Se añadieron DMA anhidra (5 ml) y base de Hunig (0,06 ml) a la muestra seca del colorante (3-1) (80 mg). A continuación, se añadió a esto una solución de TSTU (0,25 g) en 5 ml de DMA seca. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Después de que se completara la activación (TLC: H2O al 15 % en CH3CN), esta solución se añadió a la solución de pppT-LN3 (0,23 g) en agua (7 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 3 h. La mezcla de reacción se enfrió a ~4 °C con un baño de hielo, a continuación se añadió una solución de TEAB 0,1 M (5 ml) en agua y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 min. La mezcla de reacción se aplicó a una columna con ~75 g de suspensión de resina DEAE Sephadex en solución de TEAB 0,05 M en agua y se lavó con TEAB (gradiente de concentración de 0,10 M hasta 0,75 M). Se recogieron fracciones de color rojo, el disolvente se evaporó y a continuación al residuo se coevaporó de nuevo con agua para retirar más TEAB y se realizó vacío hasta sequedad. A continuación el colorante se redisolvió en TEAB 0,1 M. Esta solución se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 nm de tamaño de poro y el producto se purificó por HPLC usando una columna de fase inversa C18 con acetonitrilo-TEAB 0,1 M. Rendimiento 78 %.
Figure imgf000031_0001
Preparación:
Se añadieron DMA anhidra (5 ml) y base de Hunig (0,06 ml) a la muestra seca del colorante (3-1) (80 mg). A continuación, se añadió a esto una solución de TSTU (0,25 g) en 5 ml de DMA seca. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Después de que se completara la activación (TLC: H2O al 15 % en CH3CN), esta solución se añadió a la solución de pppA-LN3 (0,25 g) en agua (7 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 24 h. La mezcla de reacción se enfrió a ~4 °C con un baño de hielo, a continuación se añadió una solución de TEAB 0,1 M (5 ml) en agua y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 min. La mezcla de reacción se aplicó a una columna con ~75 g de suspensión de resina DEAE Sephadex en solución de TEAB 0,05 M en agua y se lavó con TEAB (gradiente de concentración de 0,10 M hasta 0,75 M). Se recogieron fracciones de color rojo, el disolvente se evaporó y a continuación al residuo se coevaporó de nuevo con agua para retirar más TEAB y se realizó vacío hasta sequedad. A continuación el colorante se redisolvió en TEAB 0,1 M. Esta solución se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 nm de tamaño de poro y el producto se purificó por HPLC usando una columna de fase inversa C18 con acetonitrilo-TEAB 0,1 M. Rendimiento 75 %.
Propiedades de fluorescencia
La Figura 1 ilustra las intensidades de fluorescencia de un nucleótido marcado con un colorante nuevo (NR5201s), un ejemplo del tipo desvelado en el presente documento, y un análogo estructural (NR550S0) cuando sus soluciones se excitan a 540 nm. NR550S0 (estructura mostrada a continuación) es un colorante de polimetino que tiene un indol en ambos extremos de la cadena de polimetino, como es habitual en los colorantes fluorescentes que tienen un desplazamiento de Stokes en la región de 40-50 nm. El colorante que tiene el desplazamiento de Stokes de 40­ 50 nm muestra una señal de fluorescencia mayor que el colorante de desplazamiento de Stokes largo.
Figure imgf000031_0002
La Figura 2 ilustra intensidades de fluorescencia de FFN basados en el colorante nuevo (NR5201s) y su análogo estructural comercial (NR550S0) cuando sus soluciones se excitan a 460 nm. A diferencia de 540 nm, el colorante de desplazamiento de Stokes largo es más brillante cuando se excita a 460 nm. De ese modo, las dos marcas pueden diferenciarse cuando se miden a emisión de 590 nm basándose en la longitud de onda de excitación.
A partir de la comparación de las relaciones de intensidades de fluorescencia de un colorante nuevo NR5201s con desplazamiento de Stokes largo y su análogo estructural con un desplazamiento de Stokes normal, se puede ver la ventaja de usar nuevos colorantes debido a la varianza en intensidades de señal cuando las soluciones se excitan a diferentes longitudes de onda.
En los diagramas anteriores, para el colorante NR550S0 la relación de intensidades de fluorescencia a 540 nm (193,0) y a 460 nm (10,1) es 19,3 dado que el colorante no absorbe de forma eficaz a 460 nm. En las mismas condiciones, para el colorante nuevo NR5201s, la relación de intensidades de fluorescencia a 540 nm (93,0) y 460 nm (40,1) es solo aproximadamente 2 dado que el mayor desplazamiento de Stokes significa que el colorante tiene un nivel mucho mayor de absorbancia a 460 nm. Debido a estas propiedades únicas, los nuevos colorantes desvelados en el presente documento permiten análisis de datos más eficaces dado que se mejora la relación señal ruido, y permite que las plataformas de secuenciación operen usando menos de los cuatro canales de detección convencionales.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de fórmula (II) o formas mesómeras del mismo:
Figure imgf000033_0001
m es un número entero 0-3;
cada n es independientemente 0-6;
Ra1 es H, SO3', sulfonamida, halógeno, o un anillo adicional condensado a un átomo de carbono adyacente donde el anillo puede contener sustituyentes SO3', sulfonamida, halógeno;
Rb1 es SO3', sulfonamida, halógeno, COOH o una amida o éster de los mismos y Rb-i(n) es 0-3; y
X es OH, O' o un éster o amida.
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en donde Raí es H, SO2NH2 o SO3.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en donde Raí es un anillo condensado a un átomo de carbono adyacente.
4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 3 en donde el anillo contiene uno o más sustituyentes SO3' o sulfonamida.
5. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde Rbí está ausente cuando Rbí(n) es 0.
6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto es:
Figure imgf000033_0002
7. Un nucleótido u oligonucleótido marcado con un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Un nucleótido u oligonucleótido marcado de acuerdo con la reivindicación 7 en donde la marca está unida mediante una unión amida formada a partir del resto C(O)X.
9. Un nucleótido u oligonucleótido marcado de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 en donde la marca está unida a la posición C5 de una base de pirimidina o la posición C7 de una base de 7-desazapurina a través de un resto conector.
10. Un nucleótido u oligonucleótido marcado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que comprende además un grupo bloqueador de 3' OH unido covalentemente al azúcar ribosa o desoxirribosa del nucleótido.
11. Un kit que comprende dos o más nucleótidos en donde al menos un nucleótido es un nucleótido marcado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.
12. Un kit de acuerdo con la reivindicación 11 en donde dos de los nucleótidos marcados se miden por detección a la misma longitud de onda en donde el primer nucleótido marcado tiene un desplazamiento de Stokes de más de 100 nm y el segundo nucleótido marcado tiene un desplazamiento de Stokes de menos de 50 nm.
13. Un kit de acuerdo con la reivindicación 11 que comprende cuatro nucleótidos en donde un primer nucleótido es un nucleótido marcado de acuerdo con las reivindicaciones 5 a 9, un segundo nucleótido está marcado con una marca que emite a la misma longitud de onda que el primer nucleótido marcado, un tercer nucleótido está marcado con una mezcla de marcas y el cuarto está sin marcar de modo que cada uno de los cuatro nucleótidos marcados son distinguibles entre sí.
14. Uso de un nucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 o un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en secuenciación, análisis de expresión, análisis de hibridación, análisis genético, análisis de ARN o ensayos de unión proteica.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14 en un instrumento de secuenciación automatizado en donde dicho instrumento de secuenciación automatizado comprende dos láseres que operan a diferentes longitudes de onda y un sistema de detección que tiene un único canal de detección ajustado a una longitud de onda de emisión fija.
16. Un método de síntesis de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que utiliza el siguiente material de partida:
Figure imgf000034_0001
m es un número entero 0-3;
Ra1 es H, SO3-, sulfonamida, halógeno, o un anillo adicional condensado a un átomo de carbono adyacente donde el anillo puede contener sustituyentes SO3", sulfonamida, halógeno; y
Rb1 es SO3", sulfonamida, halógeno o COOH y n es 0-3.
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