ES2620423T3 - Compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes - Google Patents

Abstract

Un compuesto de la fórmula (I) o formas mesoméricas del mismo:**Fórmula** en la que mCat+ o mAn- es un contraión cargado positiva/negativamente inorgánico u orgánico y m es un entero de 0 a 3; cada uno de Ra1 y Ra2 es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halógeno, o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente; Rb es alquilo o alquilo sustituido con un grupo carboxi o un sulfónico o derivados del mismo; cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido; y cualquiera de Rb o uno de Rc1 o Rc2 contiene un grupo funcional de enlace para adhesión adicional o se une a una molécula adicional.

Description

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DESCRIPCION

Compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes

La presente divulgacion se relaciona con nuevos compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes. En particular los compuestos se pueden utilizar como marcadores fluorescentes para nucleotidos en aplicaciones de secuenciacion de acidos nucleicos.

Antecedentes

Se mencionan diversas publicaciones y documentos de patente en esta solicitud con el fin de describir mas completamente el estado de la tecnica a la cual pertenece esta divulgacion. La divulgacion de cada una de estas publicaciones y documentos se incorpora mediante referencia aqrn.

La deteccion no radiactiva de acidos nucleicos que utilizan marcadores fluorescentes es una tecnologfa importante en biologfa molecular. Muchos de los procedimientos empleados en la tecnologfa de ADN recombinante antes se basaban en gran medida en el uso de nucleotidos o polinucleotidos marcados radiactivamente, por ejemplo con 32P. Los compuestos radiactivos permiten la deteccion sensible de acidos nucleicos y otras moleculas de interes. Sin embargo, existen serias limitaciones en el uso de isotopos radiactivos tales como su coste, vida util limitada y lo mas importante consideraciones de seguridad. Al eliminar la necesidad de marcadores radiactivos se mejora la seguridad mientras que se reduce el impacto ambiental y los costes asociados con, por ejemplo, la eliminacion de reactivos. Los metodos susceptibles de deteccion fluorescente no radiactiva incluyen a modo de ejemplo no limitante, secuenciacion automatica de ADN, metodos de hibridacion, deteccion en tiempo real de productos de reaccion en cadena de polimerasa e inmunoensayos.

Para muchas aplicaciones, es deseable emplear multiples marcadores fluorescentes espectralmente distinguibles con el fin de lograr deteccion independiente de una pluralidad de analitos espacialmente superpuestos. En dichos metodos multiples el numero de recipientes de reaccion se puede reducir simplificando los protocolos experimentales y facilitando la produccion de kits de reactivos espedficos a aplicacion. En la secuenciacion del ADN automatizada de multiples colores por ejemplo, la deteccion fluorescente multiple permite el analisis de multiples bases de nucleotidos en un solo carril de electroforesis aumentando de esta manera el rendimiento sobre los metodos de un solo color y reduciendo las incertidumbres asociadas con variaciones de movilidad electroforetica entre carriles.

Sin embargo, la deteccion fluorescente multiplex puede ser problematica y se presenta una serie de factores importantes que restringen la seleccion de marcadores fluorescentes. En primer lugar, puede ser diffcil encontrar compuestos colorantes cuyos espectros de emision esten resueltos espectralmente de forma conveniente en una aplicacion dada. Adicionalmente, cuando se utilizan diversos colorantes fluorescentes, para generar senales de fluorescencia en regiones espectrales distinguibles mediante excitacion simultanea puede ser diffcil ya que las bandas de absorcion de colorantes, que se podffan utilizar para esto usualmente estan ampliamente separadas, por lo que es diffcil de lograr mas o menor eficiencia de excitacion de fluorescencia igual incluso para dos colorantes. Muchos metodos de excitacion utilizan fuentes de luz de alta energfa como laser y, por lo tanto, el colorante debe tener suficiente fotoestabilidad para resistir dicha excitacion. Una consideracion final de particular importancia en los metodos de biologfa molecular es el grado en el que los colorantes fluorescentes deben ser compatibles con la qrnmica de los reactivos utilizados, como por ejemplo solventes y reactivos de smtesis de ADN, reguladores, enzimas de polimerasa y enzimas de ligasa.

A medida que la tecnologfa de secuenciacion avanza se ha desarrollado una necesidad de mas compuestos colorantes fluorescentes, sus conjugados de acidos nucleicos y grupos de colorantes que cumplen todas las restricciones anteriores y que sean susceptibles particularmente a metodos moleculares de alto rendimiento, tales como secuenciacion en fase solida y similares.

Las moleculas de colorantes fluorescentes con propiedades de fluorescencia mejoradas tales como intensidad de fluorescencia, forma y longitud de onda maxima de banda de fluorescencia pueden mejorar la velocidad y precision de la secuenciacion del acido nucleico. La senal de fluorescencia fuerte es especialmente importante cuando se realizan mediciones en reguladores biologicos una base de agua y a mayor temperatura ya que la intensidad de fluorescencia de la mayoffa de los colorantes es significativamente mas baja en dichas condiciones. Mas aun, la naturaleza de la base a la que se adhiere el colorante tambien afecta la fluorescencia maxima, intensidad de fluorescencia y otras propiedades de colorante espectral. Las interacciones espedficas de secuencia entre las nucleobases y los colorantes fluorescentes se pueden adaptar mediante diseno espedfico de colorantes fluorescentes. La optimizacion de la estructura de los colorantes fluorescentes puede mejorar la eficiencia de incorporacion de nucleotidos, reducir el nivel de errores de secuenciacion y reducir el uso de reactivos en, y por lo tanto los costes de secuencia de acidos nucleicos.

Se describen aqrn construcciones de polimetina mejoradas y su uso como marcadores de biomoleculas, particularmente como marcadores para los nucleotidos utilizados en la secuenciacion de acidos nucleicos. Se pueden ver mejoras

particulares en la eficiencia de incorporacion de nucleotidos marcados y la longitud de la secuenciacion le^da obtenible utilizando nuevas construcciones fluorescentes.

Resumen

De acuerdo con un primer aspecto esta divulgacion proporciona compuestos colorantes de polimetina de la formula (I) o 5 formas mesomericas de los mismos:

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en la que mCat+ o mAn- es un contraion cargado positiva/negativamente inorganico u organico y m es un entero de 0 a 3;

cada uno de Rai y Ra2 es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halogeno, o un anillo adicional fusionado a un 10 atomo de carbono adyacente;

Rb es arilo opcionalmente sustituido o alquilo opcionalmente sustituido;

cada uno de Rci y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido; y

cualquiera de Rb o uno de Rci o Rc2 contiene un grupo funcional de enlace para adhesion adicional o enlace a una molecula adicional.

15 En otra realizacion los compuestos de la presente divulgacion se pueden conjugar con una variedad de unidades estructurales tales como, por ejemplo, nucleosidos, nucleotidos, polinucleotidos, polipeptidos, carbohidratos, ligandos, partmulas, celulas, superficies semisolidas (por ejemplo geles) y superficies solidas.

De acuerdo con un aspecto adicional de la divulgacion por lo tanto, se proporcionan compuestos colorantes que comprenden grupos de enlace para permitir, por ejemplo, adhesion covalente a dichas unidades estructurales de 20 sustrato.

De acuerdo con un aspecto adicional la divulgacion proporciona un compuesto de nucleosido o nucleotido definido por la formula: N-L-Dye, en la que N es un nucleotido, L es un grupo funcional enlazador opcional y Dye es un compuesto fluorescente de acuerdo con la presente divulgacion.

En un aspecto adicional la divulgacion proporciona metodos de secuenciacion utilizando los compuestos colorantes de 25 la presente divulgacion.

De acuerdo con un aspecto adicional la divulgacion tambien proporciona kits que comprenden compuestos colorantes (libres o en forma conjugada) que se pueden utilizar en diversos ensayos inmunologicos, marcado de oligonucleotidos y acidos nucleicos y para secuenciacion de ADN mediante smtesis. En aun otro aspecto la divulgacion proporciona kits que comprenden 'grupos' de colorante particularmente adecuados a ciclos de secuenciacion mediante smtesis sobre 30 una plataforma de instrumentos automatizada.

Un aspecto adicional de la divulgacion es la preparacion qmmica de compuestos de la divulgacion.

Descripcion detallada

Esta divulgacion proporciona compuestos colorantes de polimetina novedosos particularmente adecuados para metodos de deteccion de fluorescencia y secuenciacion mediante smtesis.

De acuerdo con un primer aspecto la divulgacion proporciona compuestos colorantes de polimetina de la formula (I) o 5 forma mesomerica de los mismos:

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en la que mCat+ o mAn- es un contraion cargado positiva/negativamente inorganico u organico y m es un entero de 0 a 3;

cada uno de Rai y Ra2 es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halogeno, o un anillo adicional fusionado a un 10 atomo de carbono adyacente;

Rb es arilo opcionalmente sustituido o alquilo opcionalmente sustituido;

cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido; y

cualquiera de Rb o uno de Rci o Rc2 contiene un grupo funcional de enlace para adhesion adicional o se une a una molecula adicional.

15 Cada Rai o Ra2 puede ser independientemente H, SO3-, sulfonamida, halogeno, o un anillo adicional fusionado a un atomo de carbono adyacente. Rai o Ra2 puede ser H. Rai o Ra2 pueden ser SO3 -. Rai puede ser diferente de Ra2, por ejemplo la estructura puede tener un grupo de acido sulfonico sencillo en Rai, y H como Ra2. Rai o Ra2 puede ser sulfonamida. La sulfonamida puede ser SO2NH2 o SO2NHR, en el que R es un grupo alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido

20 Rai o Ra2 puede ser un anillo alifatico, aromatico o heterodclico adicional fusionado a un carbono adyacente del anillo

indol. Por ejemplo, en dichos casos, cuando se fusiona un anillo aromatico el grupo de extremo colorante puede representar una estructura de tipo

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De esta manera los colorantes de la divulgacion se pueden describir por la Formula (1A), (IB) o (IC):

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En la formula (IA), (IB) y (IC) uno o ambos anillos adicionales fusionados a atomos de carbono adyacentes del anillo indol se pueden sustituir opcionalmente, por ejemplo con acido sulfonico o sulfonamida.

El compuesto puede ser en el que uno de los grupos Ra es un anillo fusionado adicional que forma una estructura de la 5 formula (II):

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en el que Ra3 es H, SO3-, sulfonamida o halogeno; y Rci es alquilo o alquilo sustituido.

Rb puede ser arilo opcionalmente sustituido o alquilo opcionalmente sustituido. Rb puede ser alquilo. Rb puede ser 10 metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o hexilo. La cadena alquilo se puede sustituir adicionalmente, por ejemplo con grupos carboxi o sulfonico. El Rb se puede utilizar para conjugacion adicional. Por ejemplo si el Rb contiene un grupo funcional COOH, esto se puede conjugar con moleculas adicionales con el fin de adherir el marcador. En el caso de biomolecula, protema, marcado de ADN y cosas por el estilo, la conjugacion se puede llevar a cabo a traves de Rb. El Rb puede formar derivados de amida o ester, una vez se ha producido la conjugacion. El compuesto se puede adherir a un

nucleotido u oligonucleotido a traves de Rb.

Rb puede ser arilo o arilo sustituido. Rb puede ser fenilo.

Cada Rc1 y Rc2 puede ser independientemente alquilo o alquilo sustituido. Rc1 y Rc2 puede ser metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo o (CH2)qSO3H, en el que q es 1 a 6. q puede ser 1-3. Rc1 y Rc2 puede ser un grupo alquilo 5 sustituido. Rci y Rc2 pueden contener un grupo funcional COOH o -SO3H o sus derivados de ester o amida.

Cualquiera de Rb o Rci o Rc2 contiene un grupo funcional de enlace para adhesion adicional o se une a una molecula adicional. Rb o Rci o Rc2 puede contener un grupo funcional carboxi o carboxilato (COOH o COO-). Una vez ha ocurrido la conjugacion, Rb o Rci o Rc2 puede contener una amida o ester.

Ejemplos de compuestos incluyen: o

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o sales de los mismos.

Un compuesto particularmente util es un nucleotido u oligonucleotido marcado con un colorante como se describe aqrn. El nucleotido u oligonucleotido marcado puede tener el marcador adherido a traves del grupo alquilo sustituido Rb o Rci o Rc2. El nucleotido u oligonucleotido marcado puede tener el marcador adherido a la posicion C5 de una base de pirimidina o la posicion C7 de una base de 7-deaza purina a traves de un grupo funcional enlazador.

El nucleotido u oligonucleotido marcado tambien puede tener un grupo de bloqueo unido covalentemente al azucar de ribosa o desoxirribosa del nucleotido. El grupo de bloqueo se puede adherir en cualquier posicion sobre el azucar de ribosa o desoxirribosa. En realizaciones particulares, el grupo de bloqueo esta en la posicion 3' OH del azucar de ribosa o desoxirribosa del nucleotido.

Se proporcionan aqrn kits que incluyen dos o mas nucleotidos en los que por lo menos un nucleotido es un nucleotido marcado con un compuesto de la presente divulgacion. El kit puede incluir dos o mas nucleotido marcados. Los nucleotidos se pueden marcar con dos o mas marcadores fluorescentes. Se pueden excitar dos o mas de los marcadores utilizando una fuente de excitacion que puede ser un laser. Por ejemplo, las bandas de excitacion para las dos o mas marcadores por lo menos se pueden superponer parcialmente de tal manera que la excitacion en la region de superposicion del espectro provoca que ambas marcadores emitan fluorescencia. En realizaciones particulares, la emision de las dos o mas marcadores puede ocurrir en diferentes regiones del espectro de tal manera que se puede determinar la presencia de por lo menos una de los marcadores al distinguir opticamente la emision.

El kit puede contener cuatro nucleotidos marcados, en los que el primero de cuatro nucleotidos se marca con un compuesto como se divulga aqrn. En dicho kit, el segundo, tercero, y cuarto nucleotidos cada uno se puede marcar con un compuesto que es opcionalmente diferente del marcador sobre el primer nucleotido y opcionalmente diferente de los marcadores sobre los otros. De esta manera, uno o mas de los compuestos pueden tener un maximo de absorbancia distinto y/o maximo de emision de tal manera que los compuesto(s) se pueden distinguir de otros compuestos. Por ejemplo, cada compuesto puede tener un maximo de absorbancia distinto y/o maximo de emision de tal manera que cada uno de los compuestos se puede distinguir de los otros tres compuestos. Se entendera que las partes del espectro de absorbancia y/o espectro de emision diferentes de la maxima pueden diferir y aquellas diferencias se pueden explotar para distinguir los compuestos. El kit puede ser de tal manera que dos o mas de los compuestos tienen un maximo de absorbancia distinto por encima de 600 nm.

Los compuestos, nucleotidos o kits que se exponen aqrn se pueden utilizar para detectar, medir o identificar un sistema biologico (que incluye, por ejemplo, procesos o componentes de los mismos). Las tecnicas de ejemplo que pueden emplear los compuestos, nucleotidos o kits incluyen secuenciacion, analisis de expresion, analisis de hibridacion, analisis genetico, analisis de ARN, ensayo celular (por ejemplo, union celular o analisis de funcion de celula), o ensayo de protemas (por ejemplo, ensayo de union de protema o ensayo de actividad de protema). El uso puede ser sobre un instrumento automatizado para llevar a cabo una tecnica particular, tal como un instrumento de secuenciacion automatizado. El instrumento de secuenciacion puede contener dos laseres que operan a diferentes longitudes de onda.

Se describe aqrn un metodo para sintetizar compuestos de la divulgacion. Un compuesto de la formula (X) y/o (X1), (X2) o una sal del mismo se puede utilizar como material de partida para la smtesis de colorantes de polimetina asimetricos o no asimetricos:

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en los que Ra es H, SO3-, sulfonamida, halogeno, o un anillo adicional fusionado a un atomo de carbono adyacentes;

Rb es arilo opcionalmente sustituido o alquilo opcionalmente sustituido; y Rc es alquilo o alquilo sustituido.

Como se utiliza aqrn, el termino "alquilo" se refiere a hidrocarburos C1-C20 y puede incluir anillos carbodclicos no aromaticos C3-C10. En realizaciones particulares, los grupos alquilo son alquilo C1-C6 que se refieren a radicales saturados, hidrocarburos de cadena lineal o ramificada que contienen entre uno y seis atomos de carbono, respectivamente. Los grupos alquilo pueden incluir uno o mas grupos insaturados, y por lo tanto incluir alquenilo y alquinilo.

El termino "halogeno" como se utiliza aqrn se refiere a fluoro (en lo sucesivo designado como F), cloro (en lo sucesivo designado como Cl), bromo (en lo sucesivo designado como Br) o yodo (en lo sucesivo designado como I), y usualmente se relaciona con la sustitucion de un atomo de hidrogeno en un compuesto organico, esta sustitucion es opcionalmente una sustitucion completa para el hidrogeno.

El termino "alquilo sustituido", se refiere a grupos alquilo, alquenilo o alquinilo como se definio anteriormente en el que pueden estar opcionalmente sustituidos adicionalmente con, pero no limitado a, halo, ciano, SO3-, Sra, ORa, NRbRc, oxo, CONRbRc, COOH y COORb. Ra, Rb y Rc se pueden seleccionar cada uno independientemente de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. Adicionalmente, dicho alquilo sustituido, alquenilo sustituido y alquinilo sustituido se puede interrumpir opcionalmente por lo menos mediante un heteroatomo o grupo seleccionado entre O, NRb, S(O)t, donde t es 0 a 2, y similares. El alquilo sustituido tambien cubre grupos tal como bencilo donde los grupos alquilo comprenden un arilo adicional o un grupo funcional de arilo sustituido.

Los colorantes de acuerdo con la presente divulgacion se pueden sintetizar a partir de una variedad de diferentes materiales de partida, que incluyen indoles N-fenilo. Los colorantes se pueden hacer de forma simetrica, de tal manera que el mismo es indol esta en ambos extremos de la cadena de trimetino o asimetricamente de tal manera que diferentes indoles estan en cada extremo del cromoforo. Los metodos para preparar colorantes de polimetina son bien conocidos en la tecnica.

De acuerdo con un aspecto de la descripcion, se proporcionan compuestos de colorantes adecuados para la union a grupos funcionales de sustrato, particularmente que comprenden grupos de enlace para permitir la union a grupos funcionales de sustrato. Las unidades estructurales de sustrato pueden ser practicamente cualquier molecula o sustancia a la que se pueden conjugar los colorantes de la divulgacion y, a modo de ejemplo no limitante, pueden incluir nucleosidos, nucleotidos, polinucleotidos, carbohidratos, ligandos, partfculas, superficies solidas, polfmeros organicos e

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inorganicos, cromosomas, nucleos, celulas vivas y combinaciones o asociaciones de los mismos. Los colorantes se pueden conjugar mediante un enlazador opcional por una variedad de medios, que incluyen atraccion hidrofoba, atraccion ionica y union covalente. Particularmente los colorantes se conjugan con el sustrato mediante union covalente. Mas particularmente, la union covalente es a traves de un grupo enlazador.

Los colorantes de acuerdo con la presente divulgacion pueden incluir un grupo de enlace reactivo en una de las posiciones de los sustituyentes para la union covalente del colorante a otra molecula. Los grupos de enlace reactivos son unidades estructurales capaces de formar un enlace (por ejemplo, un enlace covalente o no covalente). En una realizacion particular, el enlazador puede ser un enlazador divisible. El uso del termino "enlazador divisible" no pretende dar a entender que se requiere que todo el enlazador sea eliminado. El sitio de division se puede situar en una posicion sobre el enlazador que resulta en parte del enlazador que permanece unido al colorante y/o unidad estructural de sustrato despues de division. Los enlaces divisibles pueden ser, a modo de ejemplo no limitante, enlaces divisibles electrofflicamente, enlaces divisibles enzimaticamente, enlaces divisibles nucleofilamente, enlazadores fotodivisibles, divisible bajo condiciones de reduccion (por ejemplo enlaces que contienen disulfuro o azida), condiciones oxidantes, divisibles mediante el uso de enlaces de captura-seguridad y divisible por mecanismos de eliminacion. El uso de un enlazador divisible para unir el compuesto colorante a un grupo funcional de sustrato proporciona la opcion de eliminar el marcador, por ejemplo despues de deteccion, evitando de este modo cualquier senal de interferencia en las etapas posteriores.

Los grupos enlazadores utiles se pueden encontrar en el numero de publicacion PCT WO2004/018493 (incorporado aqrn mediante referencia) cuyos ejemplos incluyen enlazadores que, se pueden dividir utilizando fosfinas solubles en agua o catalizadores de metales de transicion solubles en agua formados a partir de un metal de transicion y ligandos por lo menos parcialmente solubles en agua. En solucion acuosa los ultimos forman complejos de metales de transicion por lo menos parcialmente solubles en agua. Dichos enlaces divisibles se pueden utilizar para conectar bases de nucleotidos a marcadores tales como los colorantes establecidos aqrn.

Los enlazadores particulares se pueden encontrar en el numero de publicacion PCT WO2004/018493 (incorporada aqrn mediante referencia), tales como los que incluyen las unidades estructurales de la formula:

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(en la que X se selecciona del grupo que comprende O, S, NH y NQ en el que Q es un grupo alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido, Y se selecciona del grupo que comprende O, S, NH y N(alilo), T es hidrogeno o un grupo alquilo C1-C10

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sustituido o no sustituido y * indica donde se conecta el grupo funcional al resto del nucleotido o nucleosido).

En realizaciones particulares, se puede alterar la longitud del enlazador entre un colorante fluorescente (fluoroforo) y una base guanina, por ejemplo, mediante la introduccion de un grupo separador de polietilenglicol, aumentando de esta manera la intensidad de fluorescencia en comparacion con el mismo fluoroforo unido a la base guanina a traves de otros enlaces conocidos en la tecnica. Los ejemplos de enlazadores y sus propiedades se exponen en el numero de solicitud de patente GB 0517097.2, publicado como WO07020457, (incorporado aqrn por referencia). El diseno de enlazadores, y especialmente de su mayor longitud, pueden permitir mejoras en el brillo de los fluoroforos unidos a las bases de guanina de nucleotidos de guanosina cuando se incorporan a polinucleotidos tales como ADN. Por lo tanto, cuando el colorante es para uso en cualquier metodo de analisis que emplea deteccion de un marcador de colorante fluorescente unido a un nucleotido que contiene guanina, puede ser ventajoso utilizar un enlazador que tiene un grupo separador de formula -((CH2)2O)n- en la que n es un entero entre 2 y 50, por ejemplo, como se describe en el documento WO07020457.

La presente divulgacion proporciona adicionalmente conjugados de nucleosidos y nucleotidos marcados con uno o mas de los colorantes establecidos aqrn (nucleotidos modificados). Los nucleosidos y nucleotidos marcados son utiles para marcar polinucleotidos formados por smtesis enzimatica, tal como, a modo de ejemplo no limitante, en amplificacion de PCR, amplificacion isotermica, amplificacion de fase solida, secuenciacion de polinucleotidos (por ejemplo secuenciacion en fase solida), reacciones de traduccion de mella y similares.

Los nucleosidos y nucleotidos se pueden marcar en sitios sobre el azucar o nucleobase. Como se conoce en la tecnica, un "nucleotido" se compone de una base nitrogenada, un azucar, y uno o mas grupos fosfato. En el ARN el azucar es ribosa y en el ADN es una desoxirribosa, es decir, un azucar que carece de un grupo hidroxilo que esta presente en la ribosa. La base nitrogenada es un derivado de purina o pirimidina. Las purinas pueden ser adenina (A) o guanina (G), y las pirimidinas pueden ser citosina (C), timina (T) o en el contexto del ARN, uracilo (U). El atomo de C-1 de la desoxirribosa se une al N-1 de una pirimidina o N-9 de una purina. Un nucleotido es tambien un ester de fosfato de un nucleosido, con esterificacion que ocurre sobre el grupo hidroxilo unido al C-3 o C-5 del azucar. Los nucleotidos son generalmente mono, di o trifosfato.

Un "nucleosido" es estructuralmente similar a un nucleotido, pero carece de las unidades estructurales de fosfato. Un ejemplo de un analogo de nucleosido sena uno en el que el marcador se une a la base y no existe ningun grupo fosfato unido a la molecula de azucar.

Aunque la base se refiere usualmente como una purina o pirimidina, el experto apreciara que estan disponibles derivados y analogos que no alteran la capacidad del nucleotido o nucleosido para someterse a emparejamiento de base Watson-Crick. "Derivado" o "analogo" significa un compuesto o molecula cuya estructura central es la misma que, o que se asemeja cercanamente a la de un compuesto original, pero que tiene una modificacion qmmica o ffsica, tal como, por ejemplo, un grupo lateral diferente o adicional, que permite que el nucleotido o nucleosido derivado se ligue a otra molecula. Por ejemplo, la base puede ser una desazapurina. En realizaciones particulares, los derivados son capaces de experimentar emparejamiento de Watson-Crick. El "derivado" y "analogo" tambien incluye, por ejemplo, un nucleotido o nucleosido sintetico derivado que tiene unidades estructurales de base modificadas y/o unidades estructurales de azucar modificadas. Dichos derivados y analogos se discuten en, por ejemplo, Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) and Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Los nucleotidos analogos tambien pueden tener enlaces de fosfodiester modificados que incluyen fosforotioato, fosforoditioato, alquilo-fosfonato, fosforanilidato, fosforamidato y similares.

Un colorante se puede unir a cualquier posicion en una base de nucleotidos, por ejemplo, a traves de un enlazador. En realizaciones particulares el emparejamiento de base Watson-Crick aun se puede llevar a cabo para el analogo resultante. Los sitios de marcado de nucleobases particulares incluyen la posicion C5 de una base de pirimidina o la posicion C7 de una base 7-desaza purina. Como se describio anteriormente se puede utilizar un grupo de enlace para unir covalentemente un colorante al nucleosido o nucleotido.

En realizaciones particulares, el nucleotido o nucleosido marcado puede ser enzimaticamente incorporable y enzimaticamente extensible. De acuerdo con lo anterior un grupo funcional de enlazador puede tener una longitud suficiente para conectar el nucleotido al compuesto de tal manera que el compuesto no interfiere significativamente con reconocimiento y union general del nucleotido por una enzima de replicacion de acido nucleico. Por lo tanto, el enlazador tambien puede comprender una unidad separadora. El separador separa, por ejemplo, la base de nucleotido de un sitio de division o marcador.

Los nucleosidos o nucleotidos marcados con colorantes de la divulgacion puede tener la formula:

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En la que Dye es un compuesto colorante de acuerdo con la presente divulgacion, B es una nucleobase, tal como, por ejemplo uracilo, timina, citosina, adenina, guanina y similares y L es un grupo ligador opcional que puede o no puede estar presente. R' puede ser H, monofosfato, difosfato, trifosfato, tiofosfato, un analogo de ester de fosfato, - O- unido a un grupo que contiene fosforo reactivo o -O- protegido por un grupo de bloqueo. R" puede ser H, OH, una fosforamidita o un grupo de bloqueo 3'OH y R'" es H o OH.

Cuando R" es fosforamidita, R' es un grupo protector hidroxilo divisible en acido que permite acoplamiento de monomero posterior bajo condiciones de smtesis automatizada.

En una realizacion particular el grupo de bloqueo es separado e independiente del compuesto colorante, es decir no directamente unido a este. En una realizacion alternativa el colorante puede comprender todo o parte del grupo de bloqueo 3'OH. De esta manera R" puede ser un grupo de bloqueo 3'OH que puede o no puede comprender un compuesto colorante divulgado aqrn.

En aun todavfa otra realizacion alternativa no existe grupo de bloqueo sobre el carbono 3' del azucar pentosa y el colorante (o colorante y construccion de enlazador) unido a la base, por ejemplo, puede tener un tamano o estructura suficiente para actuar como un bloque para la incorporacion de un nucleotido adicional. De esta manera el bloque se puede deber a impedimento esterico o se puede deber a una combinacion de tamano, carga y estructura, ya sea que el colorante se una o no a la posicion 3' del azucar.

En aun todavfa otra realizacion alternativa el grupo de bloqueo esta presente sobre el carbono 2' o 4' del azucar pentosa y puede ser de un tamano o estructura suficiente para actuar como un bloqueador para la incorporacion de un nucleotido adicional.

El uso de un grupo de bloqueo permite que la polimerizacion sea controlada, tal como al detener la extension cuando se incorpora un nucleotido modificado. Si el efecto de bloqueo es reversible, por ejemplo a modo de ejemplo no limitante, al cambiar las condiciones qmmicas o mediante eliminacion de un bloque de producto qmmico, la extension se puede detener en ciertos puntos y luego se deja continuar.

En otra realizacion particular un grupo de bloqueo 3'OH comprendera unidades estructurales divulgadas en el documento WO2004/018497 (incorporadas aqrn mediante referencia). Por ejemplo el grupo de bloqueo puede ser azidometil (CH2N3) o alilo.

En una realizacion particular un enlazador (entre colorante y nucleotido) y un grupo de bloqueo ambos estan presentes y son grupos funcionales separados. En realizaciones particulares el enlazador y grupo de bloqueo ambos se pueden dividir bajo condiciones sustancialmente similares. De esta manera pueden ser mas eficientes los procesos de desproteccion y desbloqueo ya que solo se requerira un unico tratamiento para eliminar el compuesto colorante y el bloqueador. Sin embargo, en algunas realizaciones un enlazador y grupo de bloqueo no necesitan ser divisibles bajo condiciones similares, en cambio se pueden dividir individualmente bajo distintas condiciones.

Esta divulgacion tambien abarca polinucleotidos que incorporan compuestos colorantes. Dichos polinucleotidos pueden ser ADN o ARN compuestos respectivamente de desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos unidos en el enlace fosfodiester. Los polinucleotidos de acuerdo con la divulgacion pueden comprender nucleotidos de origen natural, nucleotidos no de origen natural (o modificados) diferentes a los nucleotidos modificados de la divulgacion o cualquier combinacion de los mismos, en combinacion con por lo menos un nucleotido modificado (por ejemplo marcado con un compuesto colorante) establecido aqrn. Los polinucleotidos de acuerdo con la divulgacion tambien pueden incluir enlaces de estructura principal no naturales y/o modificaciones qmmicas sin nucleotidos. Tambien se contemplan las estructuras quimericas compuestas de mezclas de ribonucleotidos y desoxirribonucleotidos que comprenden por lo menos un nucleotido modificado de acuerdo con la divulgacion.

Los nucleotidos modificados (o nucleosidos) que comprenden un compuesto colorante de acuerdo con la presente divulgacion se puede utilizar en cualquier metodo de analisis tales como los metodos que incluyen deteccion de un marcador fluorescente unido a un nucleotido o nucleosido, ya sea por cuenta propia o incorporado en o asociado con una estructura molecular mas grande o conjugado. En este contexto el termino "incorporado en un polinucleotido" puede

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significar que el fosfato 5' se une en el enlace de fosfodiester el grupo hidroxilo 3' de un segundo nucleotido (modificado o no modificado), que puede en s^ mismo formar parte de una cadena de polinucleotidos mas larga. El extremo 3' de un nucleotido modificado establecido aqrn se puede o no puede unir en el enlace de fosfodiester al fosfato 5' de un nucleotido adicional (modificado o no modificado). De esta manera, en una realizacion no limitante la divulgacion proporciona un metodo para detectar un nucleotido modificado incorporado en un polinucleotido que comprende: (a) incorporar por lo menos un nucleotido modificado de la divulgacion en un polinucleotido y (b) detectar el nucleotido modificado(s) incorporado en el polinucleotido al detectar la senal fluorescente desde el compuesto colorante unido a dicho nucleotido modificado(s).

Este metodo puede incluir: una etapa de smtesis (a) en la que uno o mas nucleotidos modificados de acuerdo con la divulgacion se incorporan en un polinucleotido y una etapa de deteccion (b) en la que uno o mas nucleotidos modificado(s) incorporados en el polinucleotido se detectan al detectar o medir cuantitativamente su fluorescencia.

En una realizacion de la presente divulgacion por lo menos un nucleotido modificado se incorpora en un polinucleotido en una etapa de smtesis por la accion de una enzima de polimerasa. Sin embargo, se pueden utilizar otros metodos para unir los nucleotidos modificados a polinucleotidos, tales como por ejemplo smtesis de oligonucleotido qmmica o ligacion de oligonucleotidos marcados a oligonucleotidos no marcados. Por lo tanto, el termino "incorporar", cuando se utiliza en referencia a un nucleotido y polinucleotido, puede abarcar smtesis de polinucleotido mediante metodos qmmicos asf como tambien metodos enzimaticos.

En una realizacion espedfica se lleva a cabo una etapa de smtesis y opcionalmente puede comprender incubar una cadena de polinucleotido plantilla con una mezcla de reaccion que comprende nucleotidos modificados marcados fluorescentemente de la divulgacion. Tambien se puede proporcionar una polimerasa bajo condiciones que permiten formacion de un enlace de fosfodiester entre un grupo hidroxilo 3' libre sobre una cadena de polinucleotido hibridada a la cadena de polinucleotido plantilla y un grupo fosfato 5' sobre el nucleotido modificado. De esta manera, una etapa de smtesis puede incluir la formacion de una cadena de polinucleotido que se dirige por el emparejamiento de base complementario de nucleotidos a una cadena de plantilla.

En todas las realizaciones del metodo, la etapa de deteccion se puede llevar a cabo mientras que se hibrida la cadena de polinucleotido en la que los nucleotidos modificados se incorporan a una cadena de plantilla, o despues de una etapa de desnaturalizacion en la que se separan las dos cadenas. Las etapas adicionales, por ejemplo etapas de reaccion qmmica o enzimatica o etapas de purificacion, se pueden incluir entre una etapa de smtesis y una etapa de deteccion. En particular, la cadena objetivo que incorpora el nucleotido modificado(s) se puede aislar o purificar y luego procesar adicionalmente o utilizar en un analisis posterior. A modo de ejemplo, los polinucleotidos objetivo marcados con nucleotidos modificado(s) en una etapa de smtesis se pueden utilizar posteriormente como sondas o cebadores marcados. En otras realizaciones el producto de una etapa de smtesis establecido aqrn se puede someter a etapas de reaccion adicionales y, si se desea, el producto de estas etapas posteriores se puede purificar o aislar.

Las condiciones adecuadas para una etapa de smtesis seran bien conocidas por aquellos familiarizados con las tecnicas de biologfa molecular convencionales. En una realizacion, una etapa de smtesis puede ser analoga a una reaccion de extension de cebador estandar utilizando precursores de nucleotidos, que incluyen los nucleotidos modificados establecidos aqrn, para formar una cadena objetivo extendida complementaria a la cadena de plantilla en presencia de una enzima polimerasa adecuada. En otras realizaciones una etapa de smtesis puede en sf formar parte de una reaccion de amplificacion que produce un producto de amplificacion de doble cadena marcado compuesto de cadenas complementarias hnbridas derivadas de la copia de las cadenas de polinucleotido objetivo y plantilla. Otras etapas de smtesis de ejemplo incluyen la traduccion de muesca, polimerizacion de desplazamiento de cadena, marcado de ADN cebado aleatorio etc. Una enzima polimerasa particularmente util para una etapa de smtesis es una que es capaz de catalizar la incorporacion de uno o mas de los nucleotidos modificados establecidos aqrn. Se puede utilizar una variedad de polimerasas de origen natural o modificada. A modo de ejemplo, se puede utilizar una polimerasa termoestable para una reaccion de smtesis que se lleva a cabo utilizando condiciones de termociclado, mientras que una polimerasa termoestable puede no ser deseable para las reacciones de extension de cebador isotermicas. Las polimerasas termoestables adecuadas que son capaces de incorporar los nucleotidos modificados de acuerdo con la descripcion incluyen aquellas descritas en los documentos WO 2005/024010 o WO06120433, cada uno de los cuales se incorpora aqrn mediante referencia. En las reacciones sinteticas que se llevan a cabo a temperaturas mas bajas tales como 37°C, las enzimas de polimerasa no debe ser necesariamente polimerasas termoestables, por lo tanto, la eleccion de la polimerasa dependera de una serie de factores tales como temperatura de reaccion, pH, actividad de desplazamiento de cadena y similares.

En realizaciones espedficas no limitantes de la divulgacion se abarcan metodos de secuenciacion de acido nucleico, resecuenciacion, secuenciacion del genoma completo, puntuacion unica de polimorfismo de nucleotidos, o cualquier otra aplicacion que implique la deteccion del nucleotido o nucleosido modificado marcado con colorantes establecidos aqrn cuando se incorpora en un polinucleotido. Cualquiera de una variedad de otras aplicaciones que se benefician de la utilizacion de los polinucleotidos marcados con los nucleotidos modificados que comprenden colorantes fluorescentes pueden utilizar nucleotidos o nucleosidos modificados marcados con colorantes establecidos aqrn.

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En una realizacion particular, la divulgacion proporciona el uso de nucleotidos modificados que comprenden compuestos de colorantes de acuerdo con la divulgacion en una reaccion de polinucleotido de secuenciacion por smtesis. La secuenciacion por smtesis generalmente implica adicion secuencial de uno o mas nucleotidos u oligonucleotidos a una cadena de polinucleotido en crecimiento en la direccion 5' a 3' utilizando una polimerasa o ligasa con el fin de formar una cadena de polinucleotido extendida complementaria al acido nucleico plantilla que se va a secuenciar. La identidad de la base presente en uno o mas de los nucleotidos agregados se puede determinar en una etapa de deteccion o de "formacion de imagenes". La identidad de la base agregada se puede determinar despues de cada etapa de incorporacion de nucleotidos. La secuencia de la plantilla luego se puede deducir del uso de reglas convencionales de emparejamiento de bases de Watson-Crick. El uso de los nucleotidos modificados marcados con colorantes establecidos aqrn para la determinacion de la identidad de una sola base puede ser util, por ejemplo, en la puntuacion de polimorfismos de nucleotido unico, y tales reacciones de extension de base individuales estan dentro del alcance de esta divulgacion.

En una realizacion de la presente divulgacion, la secuencia de un polinucleotido plantilla se determina al detectar la incorporacion de uno o mas nucleotidos en una cadena naciente complementaria al polinucleotido plantilla que se va a secuenciar a traves de la deteccion del marcador fluorescente(s) unido al nucleotido(s) incorporado. La secuenciacion del polinucleotido plantilla se puede cebar con un cebador adecuado (o preparar como una construccion de horquilla que contendra el cebador como parte de la horquilla), y la cadena naciente se extiende de una manera escalonada mediante la adicion de nucleotidos al extremo 3' del cebador en una reaccion de polimerasa catalizada.

En realizaciones particulares de cada uno de los diferentes trifosfatos de nucleotidos (A, T, G y C) se pueden marcar con un fluoroforo unico y tambien comprende un grupo de bloqueo en la posicion 3 'para evitar la polimerizacion no controlada. Alternativamente uno de los cuatro nucleotidos se puede marcar (oscuro). La enzima polimerasa incorpora un nucleotido en la cadena naciente complementaria al polinucleotido plantilla, y el grupo de bloqueo evita incorporacion adicional de nucleotidos. Cualquier nucleotidos no incorporados se pueden lavar y la senal fluorescente de cada nucleotido incorporado se puede "leer" opticamente por medios adecuados, tales como un dispositivo acoplado por carga utilizando excitacion laser y filtros de emision adecuados. El grupo de bloqueo 3' y compuestos colorantes fluorescentes luego se pueden eliminar (desprotegido), (simultanea o secuencial) para exponer la cadena naciente para incorporacion adicional de nucleotidos. Normalmente, la identidad del nucleotido incorporado se determinara despues de cada etapa de incorporacion, pero esto no es estrictamente esencial. Del mismo modo, la Patente Estadounidense No. 5,302,509 (que se incorpora aqrn mediante referencia) describe un metodo para secuenciar polinucleotidos inmovilizados sobre un soporte solido.

El metodo, como se ejemplifico anteriormente, utiliza la incorporacion de la nucleotidos de bloqueo 3' A, G, C y T marcados fluorescentes en una cadena en crecimiento complementaria al polinucleotido inmovilizado, en presencia de polimerasa de ADN. La polimerasa incorpora una base complementaria al polinucleotido objetivo, pero se evita adicion adicional por el grupo de bloqueo 3'. Luego se puede determinar el marcador del nucleotido incorporado y el grupo de bloqueo eliminado por division qrnmica para permitir que ocurra polimerizacion adicional. La plantilla de acido nucleico que se va a secuenciar en una reaccion de smtesis mediante secuenciamiento puede ser cualquier polinucleotido que se desea secuenciar. La plantilla de acido nucleico para una reaccion de secuenciacion comprendera normalmente una region de doble cadena que tiene un grupo hidroxilo 3' libre que sirve como un cebador o punto de iniciacion para la adicion de nucleotidos adicionales en la reaccion de secuenciacion. La region de la plantilla que se va a secuenciar sobresaltara este grupo hidroxilo 3' libre sobre la cadena complementaria. La region que sobresale de la plantilla que se va a secuenciar puede ser de cadena sencilla, pero puede ser de cadena doble, dado que “se presenta una muesca” en la cadena complementaria a la cadena de plantilla que se va a secuenciar para proporcionar un grupo libre de OH 3' para la iniciacion de la reaccion de secuenciacion. En dichas realizaciones la secuenciacion puede proceder por desplazamiento de cadena. En ciertas realizaciones un cebador que lleva el grupo hidroxilo 3' libre se puede agregar como un componente separado (por ejemplo, un oligonucleotido corto) que se hibrida a una region de cadena sencilla de la plantilla que se va a secuenciar. Alternativamente, el cebador y la cadena de plantilla que se va a secuenciar puede cada una formar parte de una cadena de acido nucleico parcialmente autocomplementaria capaz de formar un duplex intramolecular, tal como por ejemplo una estructura de bucle en horquilla. Los polinucleotidos de horquilla y metodos mediante los cuales se pueden unir a soportes solidos se divulgan en los numeros de publicacion de solicitud internacional.

Documentos WO0157248 y WO2005/047301, cada una de las cuales se incorpora aqrn mediante referencia. Los nucleotidos se pueden agregar sucesivamente a un cebador creciente, lo que resulta en la smtesis de una cadena de polinucleotido en la direccion 5' a 3. La naturaleza de la base que se ha agregado se puede determinar, particularmente aunque no necesariamente despues de cada adicion de nucleotidos, proporcionando de esta manera informacion de la secuencia de la plantilla de acido nucleico. Por lo tanto, un nucleotido se incorpora en una cadena de acido nucleico (o polinucleotido) mediante union del nucleotido al grupo hidroxilo 3' libre de la cadena de acido nucleico mediante la formacion de un enlace fosfodiester con el grupo fosfato 5' del nucleotido.

La plantilla de acido nucleico que se va a secuenciar puede ser ADN o ARN, o incluso una molecula hibrida compuesta de desoxinucleotidos y ribonucleotidos. La plantilla de acido nucleico puede comprender de nucleotidos origen natural

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y/o no naturales y enlaces de de estructura principal naturales o no naturales, siempre que estos no eviten la copia de la plantilla en la reaccion de secuenciacion.

En ciertas realizaciones, la plantilla de acido nucleico que se va a secuenciar se puede unir a un soporte solido a traves de cualquier metodo de union adecuado conocido en la tecnica, por ejemplo a traves de union covalente. En ciertas realizaciones los polinucleotidos plantilla pueden estar unidos directamente a un soporte solido (por ejemplo, un soporte a base de sflice). Sin embargo, en otras realizaciones de la divulgacion la superficie del soporte solido se puede modificar de alguna manera para permitir ya sea la union covalente directa de los polinucleotidos plantilla, o para inmovilizar los polinucleotidos plantilla a traves de un hidrogel o polielectrolito de multiples capas, que puede en sf mismo no estar unido covalentemente al soporte solido.

Las matrices en las que los polinucleotidos se han unido directamente a los soportes a base de sflice son aquellos, por ejemplo, descritas en el documento WO00006770 (incorporado aqrn mediante referencia), en el que los polinucleotidos se inmovilizan sobre un soporte de vidrio mediante reaccion entre un grupo epoxido colgante en el cristal con un grupo amino interno en el polinucleotido. Adicionalmente, los polinucleotidos pueden estar unidos a un soporte solido por reaccion de un nucleofilo a base de azufre con el soporte solido, por ejemplo, como se describe en el documento WO2005/047301 (incorporado aqrn mediante referencia). Un ejemplo todavfa adicional de polinucleotidos plantilla de soporte solido es cuando los polinucleotidos plantilla se asocian a hidrogel apoyado sobre soportes a base de sflice u otros soportes solidos, por ejemplo, como se describe en los documentos WO00/31148, WO01/01143, WO02/12566, WO03/014392, patente Estadounidense No. 6,465,178 y WO00/53812, cada uno de los cuales se incorpora aqrn mediante referencia.

Una superficie particular en la que se pueden inmovilizar los polinucleotidos plantilla es un hidrogel de poliacrilamida. Los hidrogeles de poliacrilamida se describen en las referencias citadas anteriormente y en el documento WO2005/065814, que se incorpora aqrn mediante referencia.

Las moleculas de plantilla de ADN se pueden unir a perlas o micropartfculas, por ejemplo como se describe en la patente Estadounidense No. 6,172,218 (que se incorpora aqrn mediante referencia). La union a perlas o micropartfculas puede ser util para aplicaciones de secuenciacion. Las colecciones de perlas se pueden preparar, cuando cada perla contiene diferentes secuencias de ADN. Las colecciones y metodos para su creacion ejemplares se describen en Nature. 437, 376-380 (2005); Science. 309, 5741, 1728-1732 (2005), cada uno de las cuales se incorpora aqrn mediante referencia. La secuenciacion de las matrices de dichas perlas utilizando los nucleotidos establecidos aqrn se encuentra dentro del alcance de la divulgacion.

Las plantilla(s) que van a secuenciar, pueden formar parte de una "matriz" sobre un soporte solido, en cuyo caso la matriz puede tomar cualquier forma conveniente. Por lo tanto, el metodo de la divulgacion es aplicable a todos los tipos de matrices de alta densidad, que incluyen matrices de una sola molecula, matrices agrupadas y matrices de perlas. Los nucleotidos modificados marcados con los compuestos colorantes de la presente divulgacion se pueden utilizar para secuenciar plantillas sobre esencialmente cualquier tipo de matriz, que incluye pero no se limita a aquellas formadas por la inmovilizacion de moleculas de acido nucleico sobre un soporte solido.

Sin embargo, los nucleotidos modificados marcados con compuestos colorantes de la divulgacion son particularmente ventajosos en el contexto de secuenciacion de matrices agrupadas. En las matrices agrupadas, regiones distintas sobre la matriz (a menudo referidos como sitios o caractensticas) comprenden multiples moleculas de plantilla de polinucleotidos. Generalmente, las moleculas de polinucleotidos multiples no son individualmente resolubles mediante medios opticos y en cambio se detectan como un ensamble. Dependiendo de como se forma la matriz, cada sitio sobre la matriz puede comprender multiples copias de una molecula de polinucleotido individual (por ejemplo, el sitio es homogeneo para una especie de acido nucleico diferente de cadena sencilla o doble particular) o incluso copias multiples de un pequeno numero de diferentes moleculas de polinucleotidos (por ejemplo, multiples copias de dos especies de acidos nucleicos diferentes). Las matrices agrupadas de moleculas de acido nucleico se pueden producir utilizando tecnicas generalmente conocidas en la materia. A modo de ejemplo, los documentos WO 98/44151 y WO 00/18957, cada uno de los cuales se incorpora aqrn, describen metodos de amplificacion de acidos nucleicos en los que tanto la plantilla como los productos de amplificacion permanecen inmovilizados sobre un soporte solido para formar matrices compuestas de agrupaciones o "colonias" de moleculas de acidos nucleicos inmovilizados. Las moleculas de acido nucleico presentes en las matrices agrupadas preparadas de acuerdo con estos metodos son plantillas adecuadas para la secuenciacion utilizando los nucleotidos modificados marcados con los compuestos colorantes de la divulgacion.

Los nucleotidos modificados marcados con los compuestos colorantes de la presente divulgacion tambien son utiles en la secuenciacion de plantillas en matrices de una sola molecula. El termino "matriz de unica molecula" o "SMA" como se utiliza aqrn se refiere a una poblacion de moleculas de polinucleotidos, distribuidas (o dispuestas) sobre un soporte solido, en el que la separacion de cualquier polinucleotido individual de todos los otros de la poblacion es tal que es posible resolver de forma individual las moleculas de polinucleotidos individuales. Las moleculas de acido nucleico objetivo inmovilizadas sobre la superficie del soporte solido pueden por lo tanto ser capaces de ser resueltas por medios opticos en algunas realizaciones. Esto significa que una o mas senales distintas, cada una representando un polinucleotido, se produciran dentro del area resoluble del dispositivo de imagen utilizado en particular.

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Se puede lograr deteccion de moleculas individuales en las que la separacion entre las moleculas de polinucleotidos adyacentes en una matriz es de por lo menos 100 nm, mas particularmente por lo menos 250 nm, aun mas particularmente por lo menos 300 nm, incluso mas particularmente por lo menos 350 nm. Por lo tanto, cada molecula individual es resoluble y detectable como un unico punto fluorescente de molecula, y la fluorescencia de dicho punto de molecula fluorescente tambien exhibe solo fotoblanqueamiento de etapa.

Los terminos "resuelto individualmente" y "resolucion individual" se utilizan aqrn para especificar que, cuando se visualizan, es posible distinguir una molecula en la matriz de sus moleculas vecinas. La separacion entre las moleculas individuales sobre la matriz se determinara, en parte, por la tecnica particular utilizada para resolver las moleculas individuales. Las caractensticas generales de las matrices de una sola molecula se comprenderan por referencia a las solicitudes publicadas WO00/06770 y WO 01/57248, cada una de las cuales se incorpora aqrn mediante referencia. Aunque un uso de los nucleotidos modificados de la divulgacion es en reacciones de secuenciacion por smtesis, la utilidad de los nucleotidos modificados no se limita a dichos metodos. De hecho, los nucleotidos se pueden utilizar ventajosamente en cualquier metodo de secuenciacion que requiere la deteccion de marcadores fluorescentes unidos a nucleotidos incorporados en un polinucleotido.

En particular, los nucleotidos modificados marcados con los compuestos colorantes de la divulgacion se pueden utilizar en protocolos de secuenciacion fluorescente automatizada, secuenciacion de ciclos colorante-terminador particularmente fluorescente basado en el metodo de secuenciacion de terminacion de cadena de Sanger y colaboradores. Dichos metodos generalmente utilizan enzimas y secuenciacion de ciclos de incorporar didesoxinucleotidos marcados con fluorescencia en una reaccion de extension de secuenciacion del cebador. Los denominados metodos de secuenciacion de Sanger y protocolos relacionados (tipo Sanger), utilizan terminacion de cadena aleatoria con didesoxinucleotidos marcados.

Por lo tanto, la presente divulgacion tambien abarca nucleotidos modificados marcados con compuestos colorantes que son didesoxinucleotidos que carecen grupos hidroxilo en ambos de las posiciones 3' y 2', dichos didesoxinucleotidos modificados que son adecuados para uso en los metodos de secuenciacion tipo Sanger y similares.

Se reconoceran nucleotidos modificados marcados con compuestos colorantes de la presente divulgacion que incorporan grupos de bloqueo 3', tambien pueden ser de utilidad en metodos Sanger y protocolos relacionados debido a que el mismo efecto logrado al utilizar nucleotidos didesoxi modificado se puede lograr al utilizar nucleotidos modificados que tienen grupos de bloqueo 3'-OH: ambos evitan la incorporacion de nucleotidos subsiguientes. Cuando los nucleotidos de acuerdo con la presente divulgacion, y que tienen un grupo de bloqueo 3' se van a utilizar en los metodos de secuenciacion de tipo Sanger, se apreciara que los compuestos colorantes o marcadores detectables unidos a los nucleotidos no necesitan ser conectados a traves de conectores divisibles, ya que en cada instancia en la que se incorpora un nucleotido marcado de la divulgacion; no existen nucleotidos necesitan ser incorporadas posteriormente y por lo tanto el marcador no necesita ser retirado del nucleotido.

La presente divulgacion tambien proporciona kits que incluyen nucleosidos y/o nucleotidos marcados con colorantes modificados. Dichos kits incluiran generalmente por lo menos un nucleotido o nucleosido modificado marcado con un colorante establecido aqrn junto con por lo menos un componente adicional. El componente adicional(s) puede ser uno o mas de los componentes identificados en un metodo establecido anteriormente o en la seccion de Ejemplos a continuacion. Algunos ejemplos no limitantes de componentes que se pueden combinar en un kit de la presente divulgacion se establecen a continuacion.

En una realizacion particular, un kit puede incluir por lo menos un nucleotido modificado o nucleosido marcado con un colorante establecido aqrn junto con nucleotidos o nucleosidos modificados o no modificados. Por ejemplo, los nucleotidos modificados marcados con colorantes de acuerdo con la invencion se pueden suministrar en combinacion con nucleotidos no marcados o nativas, y/o con nucleotidos marcados fluorescentemente o cualquier combinacion de los mismos. De acuerdo con lo anterior, los kits pueden comprender nucleotidos modificados marcados con colorantes de acuerdo con la divulgacion y nucleotidos modificados marcados con otra, por ejemplo, compuestos colorantes de la tecnica anterior. Las combinaciones de nucleotidos se pueden proporcionar como componentes individuales separados (por ejemplo, un tipo de nucleotidos por recipiente o tubo) o como mezclas de nucleotidos (por ejemplo, dos o mas nucleotidos mezclados en el mismo recipiente o tubo).

Cuando los kits comprenden una pluralidad, particularmente dos, mas particularmente cuatro, nucleotidos modificados marcados con un compuesto colorante, los diferentes nucleotidos se pueden marcar con diferentes compuestos colorantes, o uno puede ser oscuro, sin compuestos colorantes. Cuando los diferentes nucleotidos se marcan con diferentes compuestos colorantes es una caractenstica de los kits que indican que dichos compuestos colorantes son colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles. Como se utiliza aqrn, el termino "colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles" se refiere a colorantes fluorescentes que emiten energfa fluorescente en longitudes de onda que se pueden distinguir por el equipo de deteccion fluorescente (por ejemplo, una plataforma de secuenciacion de ADN con base capilar comercial) cuando dos o mas de dichos colorantes estan presentes en una muestra. Cuando dos nucleotidos modificados marcados con compuestos colorantes fluorescentes se suministran en forma de kit, es una caractenstica de algunas realizaciones que los colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles pueden ser

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excitados en la misma longitud de onda, tal como, por ejemplo, mediante el mismo laser. Cuando cuatro nucleotidos modificados marcados con compuestos colorantes fluorescentes se suministran en forma de kit, es una caractenstica de algunas realizaciones que dos de los colorantes fluorescentes espectralmente distinguibles pueden ambos ser se excitados a una longitud de onda y los otros dos colorantes espectralmente distinguibles pueden ambos ser excitados a otra longitud de onda. Las longitudes de onda de excitacion particulares son 532 nm, 630 nm a 700 nm, particularmente 660 nm.

En una realizacion, un kit incluye un nucleotido modificado marcado con un compuesto de la presente divulgacion y un segundo nucleotido modificado marcado con un segundo colorante, en el que los colorantes tienen una diferencia en la absorbancia maxima de por lo menos 10 nm, especialmente 20 nm a 50 nm. Mas particularmente, los dos compuestos colorantes tienen desplazamientos de Stokes de entre 15 a 40 nm, donde el "desplazamiento de Stokes" es la distancia entre el pico de absorcion y las longitudes de onda de emision de pico.

En una realizacion adicional un kit puede incluir adicionalmente dos nucleotidos modificados marcados con colorantes fluorescentes en los que los colorantes son excitados por el mismo laser a 600 nm a 700 nm, particularmente 630 nm a 700 nm, mas particularmente 660 nm. Los colorantes pueden tener una diferencia en la absorbancia maxima de por lo menos 10 nm, particularmente 20 nm a 50 nm. Mas particularmente, los dos compuestos colorantes pueden tener desplazamientos de Stokes entre 20 a 40 nm. Aun todavfa mas particularmente los dos compuestos colorantes pueden tener una absorbancia maxima diferente por encima de 600 nm, particularmente por encima de 640 nm. Los colorantes particulares que son espectralmente distinguibles de colorantes de polimetina de la presente divulgacion y que satisfacen los criterios anteriores son analogos de polimetina como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,268,486 (por ejemplo Cy5) o WO 0226891 (Alexa 647; Molecular Probes A20106) o polimetinas asimetricas como se describe en la patente Estadounidense No. 6,924,372, cada una de las cuales se incorpora aqrn mediante referencia.

En una realizacion alternativa, los kits de la divulgacion pueden contener nucleotidos, en los que la misma base se marca con dos compuestos diferentes. Un primer nucleotido se puede marcar con un compuesto de la divulgacion. Un segundo de nucleotidos se puede marcar con un compuesto espectralmente distinto, por ejemplo un colorante "rojo" que absorbe por encima de 600 nm. Un tercer nucleotido se puede marcar como una mezcla del compuesto de la divulgacion y el compuesto espectralmente distinto, y el cuarto nucleotido puede ser "oscuro" y no contiene marcador. En terminos simples, por lo tanto, los nucleotidos 1 a 4 pueden ser marcados 'verde', 'rojo', 'rojo/verde', y oscuro. Para simplificar la instrumentacion adicional, se pueden marcar cuatro nucleotidos con un dos colorantes excitados con un solo laser, y por lo tanto el marcado de los nucleotidos 1 4 puede ser 'verde 1', 'verde 2' 'verde 1/verde 2', y oscuro.

Los nucleotidos pueden contener dos colorantes de la presente divulgacion. Los colorantes en los que R1 y R4 son H absorben a una longitud de onda mas baja que en la que R1 y R4 son alquilo. Un kit puede contener dos o mas nucleotidos marcados con colorantes de la divulgacion. Un kit puede contener un nucleotido marcado con un compuesto de la divulgacion en la que R1 y R4 son H, y un segundo nucleotido marcado con un compuesto de la divulgacion en la que R1 y R4 son alquilo. Los kits pueden contener un nucleotido adicional en el que una porcion de los nucleotidos se marca con un compuesto de la divulgacion en la que R1 y R4 son H, y una segunda porcion del nucleotido marcado con un compuesto de la divulgacion en la que R1 y R4 son alquilo. Los kits pueden contener ademas un nucleotido no marcado. Aunque los kits estan ejemplificados anteriormente con respecto a las configuraciones que tienen diferentes nucleotidos que estan marcados con diferentes compuestos colorantes, se entendera que los kits pueden incluir 2, 3, 4 o mas nucleotidos diferentes que tienen el mismo compuesto colorante.

En realizaciones particulares de un kit puede incluir una enzima de polimerasa capaz de catalizar la incorporacion de los nucleotidos modificados en un polinucleotido. Otros componentes que se incluyen en dichos kits pueden incluir reguladores y similares. Los nucleotidos modificados marcados con colorantes de acuerdo con la invencion, y otros componentes de nucleotidos que incluyen mezclas de diferentes nucleotidos, se pueden proporcionar en el kit en una forma concentrada que se diluye antes de uso. En dichas realizaciones, tambien se puede incluir un regulador de dilucion. Una vez mas, uno o mas de los componentes identificados en un metodo establecido aqrn se puede incluir en un kit de la presente divulgacion.

Se observa que, cuando se utiliza en esta especificacion y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen los referentes plurales a menos que se limite expresa e inequvocamente a un referente. Sera evidente para aquellos expertos en la tecnica que se pueden realizar diversas modificaciones y variaciones a las diversas realizaciones descritas aqrn sin apartarse del espmtu o alcance de las presentes ensenanzas. Por lo tanto, se pretende que las diversas realizaciones descritas aqrn abarquen otras modificaciones y variaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.

Detalles experimentales

2,3,3-Trimetil-1-fenil-3H-indolio-5-sulfonato (1)

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2-Metileno-3,3-trimetil-1-fenil-2,3-dihidro-1H-indol (1 g, 4.25 mmol) se disolvio en 1 ml de acido sulfurico a temperature < 5°C y se agregO 1 ml de acido sulfUrico fumante (20%) con agitaciOn. La soluciOn se agito a temperatura ambiente 1 h luego se calentO a 60°C durante 3 h. El producto precipitado con eter de dietilo se lavO con acetona y etanol. 5 Rendimiento 0.7 g (52 %). La estructura se confirmO mediante RMN.

2-(2-Anilinovinil-1)-3,3-trimetil-1-fenil-3H-indolio-5-sulfonato (2-1)

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Esquema de reacciOn:

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Una mezcla de 2,3,3-trimetil-1-fenil-3H-indolio-5-sulfonato (0.63 g) y N-fenilformimidato de etilo (0.5 g) se calentO a 70°C durante 30 min. Se formO un fundido naranja. El producto se triturO con eter de dietilo y se filtrO. Rendimiento 0.7 g (84 %).

2-(2-Acetanilidovinil-1)-3,3-trimetil-1-fenil-3H-indolio-5-sulfonato (2-2)

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Esquema de reaccion:

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Una mezcla de 2,3,3-trimetil-1-fenil-3H-indolio-5-sulfonato (0.63 g), N,N'-difenilformimidina (0.5 g), acido acetico (1 ml) y 5 anlddrido acetico (2 ml) se calento a 70°C durante 3 horas y luego a 50°C durante la noche. Se formo una solucion

amarilla. El producto se filtro y se lavo con eter de dietilo. Rendimiento 0.69 g (75 %).

1,2-dimetil-1-(4-sulfonatobutil)-3-fenil-1H-benzo[e]indolio (3)

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10 Esquema de reaccion:

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Clorhidrato de N-(2-Naftilo),N-fenilhidrazina (19.51 mmol, 5.28 g), acido 5-metil-6-oxoheptanosulfonico (17.18 mmol, 3.70 g) y ZnCl2 anhidro (17.18 mmol, 2.34 g) en etanol absoluto (30 ml) se agitaron a temperatura ambiente durante 30 min, luego a 80°C durante 2 h. Se verifico el progreso de la reaccion mediante TLC (10% de H2O en CH3CN). Despues 15 de finalizacion la reaccion se enfrio y el solvente se elimino bajo vado. El residuo se disolvio en DCM y se purifico mediante columna flash sobre gel de sflice. Rendimiento: 3.06 g, 42%.

RMN de proton: (MeOH-D4) : 8.28 (0.5H, d, J = 8Hz); 8.05-8.02 (1H, m); 7.89 (0.5H, d, J = 8Hz); 7.75-7.66 (3H, m); 7.65-7.60 (1H, m); 1.49-1.43 (1.5H, m); 7.31-7.25 (2H, m); 7.16 (.5H, d, J = 9Hz); 7.07 (.5H, appt, J = 7.4Hz); 6.61 (0.5H, d, J = 8Hz); 2.85-2.35 (4H, m); 1.88 (3H, appd, J = 9Hz); 1.75-1.4 (5H, m); 1.35-1.25 (0.5H, m); 1.1-0.95 (0.5H, m); 0.8-

0.65 (0.5H, m); 0.58-0.45 (0.5H, m).

1,2-DimetiM-(3-sulfonatopropil)-3-feniMH-benzo[e]indolio (4)

imagen24

5 Esquema de reaccion:

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El compuesto del t^tulo se preparo como el compuesto previo a partir de clorhidrato N-(2-naftil)-N-fenilhidrazina y acido 4-metil-5-oxopentanesulfonico. El producto se purifico mediante columna flash sobre gel de silice. Rendimiento: 40%. Estructura confirmada por espectro de RMN.

10 2,3-Dimetil-3-(4-sulfonatobutil)-1-fenil-3H-indolio (5)

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Esquema de reaccion:

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Clorhidrato de N,N-Difenilhidrazina (0.01 mol, 2.2 g),acido 5-metil-6-oxoheptanosulfonico (0.017 mol, 3.0 g) en acido 15 acetico glacial (20 ml) se agitaron a temperatura ambiente (~20 C) durante una hora luego a 100 C durante 3 horas (verificacion TLC). La mezcla de reaccion se enfrio y el solvente se elimino bajo vado. El residuo se lavo con eter de dietilo y se purifico mediante columna flash sobre gel de sflice. Rendimiento: 2 g (56 %). Estructura confirmada por espectro de RMN.

Indocarbocianina I-2 (6)

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Nombre qmmico:

2-{(5-[1-fenil-3,3-dimetil)-1,2-dihidro-3H-indol-2-ilideno]-1-propen-1 -il}-3,3-dimetil-1-(5-carboxipentM)-indolio- 5-sulfonato

Esquema de reaccion:

5

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3,3-Dimetil-1-(5-carboxipentil-2-(4-anilinovinil)-3H-indolio-5-sulfonato (0.46 g) y perclorato de 2,3,3-Trimetil-1- fenil-3H- indolio (0.34 g) en mezcla de anlddrido acetico (2 ml) y acido acetico (1 ml) se agitaron a temperatura ambiente (~25°C) durante 0.5 hora. Luego a esta solucion se agrego piridina (0.5 ml). La mezcla de reaccion se agito a 80°C durante 3 h. La terminacion de la reaccion se verifico mediante TLC (20% de H2O en CH3CN) y mediante medicion UV. Una vez 10 finaliza la reaccion, la mezcla de color rojo se enfrio y los solventes se eliminaron bajo vado. El residuo se purifico mediante columna flash C18 (TEAB 0.1 M en agua y acetonitrilo). Rendimiento: 0.33 g (55 %).

Indocarbocianina I-4 (7)

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Nombre qmmico: 2-{(5-[(4-sulfonatobutil)-1 -fenil-3-metil)-1,2-dihidro-3H-indol-2-iMdenol-1-propen-1-il}-3,3- dimetil-1-(5- carboxipentil)-indolio-5-sulfonato de trietilamonio

5 Esquema de reaccion:

imagen31

3,3-Dimetil-1-(5-carboxipentil-2-(4-anilinovinil)-3H-indolio-5-sulfonato (0.46 g) y 2,3-dimetil-3-(4- sulfonatobutil)-1 -fenil- 3H-indolio (0.36 g) en mezcla de anhfdrido acetico (2 ml) y acido acetico (1 ml) se agitaron a temperatura ambiente (~25°C) durante 0.5 hora. Luego a esta solucion se agrego piridina (1 ml). La mezcla de reaccion se agito a 80°C 10 durante 3 h /se verifico la terminacion de la reaccion mediante TLC (20% de H2O en CH3CN)/ y mediante medicion UV). Una vez finaliza la reaccion, la mezcla de color rojo de reaccion se enfrio y la mayona de los solventes se eliminaron bajo vacfo. El residuo se purifico mediante columna flash C18 (TEAB 0.1 M en agua y acetonitrilo). Rendimiento: 0.29 g (35 %).

Indocarbocianina I-5 (8)

imagen32

Nombre qmmico:

2-{(5-[(3-fenil-1,1-dimetil)-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol-2-ilideno]-1-propen-1-il}-3,3-dimetil-1-(5-carboxipentil)- indolio-5- sulfonato

5

Esquema de reaccion:

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3,3-Dimetil-1-(5-carboxipentil-2-(4-anilidovinil)-3H-indolio-5-sulfonato (0.46 g) y perclorato de 1,1,2-trimetil-3- fenil-3H- indolio (0.39 g) en mezcla de anhndrido acetico (1 ml) y acido acetico (1 ml) se agitaron a temperatura ambiente (~25°C) 10 durante 0.5 hora. Luego a esta solucion se agrego piridina (1 ml) La mezcla de reaccion se agito a 60°C durante 3 h /el progreso de la reaccion se verifico mediante TLC (20% en H2O en CH3CN)/ y mediante medicion UV. Una vez finaliza la reaccion, la mezcla de color rojo de reaccion se enfrio y la mayona de los solventes se eliminaron bajo vado. El residuo se purifico mediante columna flash C18 (TEAB 0.1 M en agua y acetonitrilo). Rendimiento: 0.38 g (54 %).

Conjugado de colorante (I-5-1) pppT-I-2

15

Esquema de reaccion:

5

10

15

imagen34

Se agregaron DMA anhidro (5 mL) y Base de Hunig (0.06 mL) a la muestra seca del colorante (I-2) (60 mg). Una solucion de TSTU, (0.25 g) en 5 mL de DMA seco luego se agrego a esta. Se desarrollo el color rojo del ester activado. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 h. De acuerdo con TLC (20% en H2O en CH3CN) se contemplo la activacion. Despues de que se completo la activacion esta solucion se agrego a la solucion de pppT-LN3 (0.23 g) en agua (7 mL). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente bajo atmosfera de nitrogeno durante 3 h. El progreso del acoplamiento se verifico mediante TLC (20% en H2O en acetonitrilo). La mezcla de reaccion se enfrio a ~4°C con un bano de hielo, luego se agrego una solucion de TEAB 0.1 M (5 mL) en agua y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 10 min. La mezcla de reaccion se aplico a columna con ~ 50 g de suspension de resina sephadex DEAE en solucion de TEAB 0.05 M en agua y se lavo con TEAB (gradiente de concentracion de 0.1 M hasta 0.5 M). Se recolectaron fracciones coloreadas y se evaporaron luego se coevaporaron de nuevo con agua para eliminar mas TEAB y vado hasta secado. El residuo luego se volvio a disolver en TEAB 0.1 M. Esta solucion se filtro a traves de un filtro de jeringa 0.2 nm de tamano de poro en un matraz corning y se almaceno en el congelador. El producto se purifico mediante HPLC utilizando columna de fase inversa C18 con acetonitrilo- TEAB 0.1 M. Rendimiento 67 %.

Conjugado de colorante (I-5-2) pppT-I-4

Esquema de reaccion:

5

10

15

imagen35

Se agregaron DMA anhidro (5 mL) y base de Hunig (0.06 mL) a la muestra seca del colorante (I-2) (82 mg). Una solucion de TSTU, (0.25 g) en 5 mL de DMA seco luego se agrego a esta. Se desarrollo sucesivamente color rojo del ester activado. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 h. Despues de que se completo la activacion (TLC: 15 % en H2O en CH3CN) esta solucion se agrego a la solucion de pppT-LN3 (0.23 g) en agua (7 mL). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente bajo atmosfera de nitrogeno durante 3 h. La mezcla de reaccion se enfrio a ~4°C con un bano de hielo, luego se agrego una solucion de TEAB 0.1 M (5 mL) en agua y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 10 min. La mezcla de reaccion se aplico a columna con ~75 g de suspension de resina sephadex DEAE en solucion de TEAB 0.05 M en agua y se lavo con TEAB (gradiente de concentracion de 0.10 M hasta 0.75 M). Se recolectaron fracciones coloreadas rojas, el solvente se evaporo y luego el residuo se co-evaporo de nuevo con agua para eliminar mas TEAB y vado hasta secado. El colorante luego se volvio a disolver en TEAB 0.1 M. Esta solucion se filtro a traves de un filtro de jeringa 0.2 nm de tamano de poro y el producto se purifico mediante HPLC utilizando columna de fase inversa C18 con acetonitrilo- TEAB0.1 M. Rendimiento 70%.

Tabla 1

Colorante Kd uM Vmax s-1 Eficiencia uM'V

pppT

DEG527 4.29 1.67 0.4

pppT

Dy681 0.39 0.88 2.3

pppT

I-2 0.33 1.51 4.5

La Tabla 1 demuestra que la relacion de incorporacion del trifosfato de 3-azidometiltimidina marcado con el colorante I- 2 es mas de 10 veces mas rapida en comparacion con los analogos de trifosfato de 3-azidometiltimidina marcados con colorantes alternativas.

Tabla 2

Pol 217 Kd uM Pol 957 EA Kd uM

ffT-Deg527

3.00 1.80

ffT oscuro

- 0.55

ffT-I-2

0.25 0.14

La Tabla 2 demuestra que la afinidad de union de trifosfato de 3'-azidometiltimidina marcado con el colorante I- 2 es mas de 10 veces mas eficiente en comparacion con los analogos de trifosfato de 3'-azidometiltimidina marcados con colorantes alternativos y tambien es mas eficiente que el trifosfato de 3'-azidometiltimidina no marcado.

5 Los colorantes como se muestra en el ejemplo I-2 son particularmente ventajosos para las incorporaciones eficientes de sus analogos de nucleotidos marcados. Esto se debe a su mucha mayor afinidad de union (Kd inferior) a la polimerasa. Los nucleotidos con mayor afinidad de union se pueden utilizar con la misma eficiencia de incorporacion como nucleotidos con afinidades mas bajas, pero a una concentracion mucho mas baja. Por lo tanto, se reduce la cantidad de nucleotidos requerida por ciclo de reactivo de secuenciacion, sin reducir la calidad de los datos de secuenciacion 10 obtenidos.

Claims (15)

1. Reivindicaciones

   1. Un compuesto de la formula (I) o formas mesomericas del mismo:

   imagen1

   en la que mCat+ o mAn- es un contraion cargado positiva/negativamente inorganico u organico y 5 m es un entero de 0 a 3;

   cada uno de Rai y Ra2 es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halogeno, o un anillo adicional fusionado a un atomo de carbono adyacente;

   Rb es alquilo o alquilo sustituido con un grupo carboxi o un sulfonico o derivados del mismo;

   cada uno de Rci y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido; y

   10 cualquiera de Rb o uno de Rci o Rc2 contiene un grupo funcional de enlace para adhesion adicional o se une a una molecula adicional.
2. 2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que Rci o Rc2 es metilo, etilo, propilo o -(CH2)qSO3- en el que q es 1 a 6.
3. 3. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2 en el que uno de los grupos Ra es un anillo fusionado 15 adicional que forma una estructura de la formula (II):

   imagen2

   5

   10

   15

   20

   25

   en la que Ra3 es H, SO3-, sulfonamida o halogeno; y Rci es alquilo o alquilo sustituido.
4. 4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que el grupo funcional de enlace se adhiere a Rb.
5. 5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que el compuesto se adhiere a un nucleotido u oligonucleotido a traves de Rb.
6. 6. Un nucleotido u oligonucleotido marcado con un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4.
7. 7. Un nucleotido u oligonucleotido marcado de acuerdo con la reivindicacion 6 en el que el marcador se adhiere a traves de un grupo alquilo sustituido Rb.
8. 8. Un nucleotido u oligonucleotido marcado de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7 en el que el marcador se adhiere a la posicion C5 de una base de pirimidina o la posicion C7 de una base de 7-deaza purina a traves de un grupo estructural enlazador.
9. 9. Un nucleotido u oligonucleotido marcado de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 8, que adicionalmente comprende un grupo de bloqueo 3'OH unido covalentemente al azucar de ribosa o desoxirribosa del nucleotido.
10. 10. Un kit que comprende dos o mas nucleotidos en el que por lo menos un nucleotido es un nucleotido marcado de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 9.
11. 11. Un kit de acuerdo con la reivindicacion 10 en el que un primero de cuatro nucleotidos es un nucleotido marcado de acuerdo con las reivindicaciones 7 a 10 y el segundo, tercero, y cuarto nucleotidos cada uno se marca con un compuesto diferente, en el que cada compuesto tiene un maximo de absorbancia distinto y cada uno de los compuestos se puede distinguir de los otros tres compuestos.
12. 12. Un kit de acuerdo con la reivindicacion 11 en el que un primero de cuatro nucleotidos es un nucleotido marcado de acuerdo con las reivindicaciones 7 a 10 y dos de los compuestos tienen un maximo de absorbancia distinto por encima de 600 nm.
13. 13. Uso de un nucleotido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, un oligonucleotido de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 9 o un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en secuenciacion, analisis de expresion, analisis de hibridacion, analisis genetico, analisis de ARN o ensayos de union de protema.
14. 14. Uso de acuerdo con la reivindicacion 13 sobre un instrumento de secuenciacion automatizado en el que dicho instrumento de secuenciacion automatizado comprende dos laseres que operan a diferentes longitudes de onda.
15. 15. Un metodo para sintetizar un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7 utilizando el siguiente material de partida:

    imagen3

    o una sal del mismo en La que Ra es H, SO3-, sulfonamida, halogeno, o un anillo adicional fusionado a un atomo de carbono adyacente.