CN113281313B - 实时定量细胞核内rna输出的生物荧光探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种实时定量细胞核内RNA输出的生物荧光探针及其制备方法，涉及生物荧光探针技术领域，本发明所述探针具有吖啶基团，类似于普通核RNA染料通过氢键和π‑π键相互作用达到细胞核的定位及特异性识别RNA的能力；本发明所述AD‑N3一旦遇到核内固有的典型浓度范围为的H2S，‑N3基团立即转化为伯胺，生成氨基吖啶(AD‑NH2)，将非发射性的AD‑N3转化为活细胞核RNA的高荧光标记，阻止荧光探针回到细胞核，使实时定量核RNA输出成为可能。

Description

实时定量细胞核内RNA输出的生物荧光探针及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物荧光探针技术领域，具体涉及一种实时定量细胞核内RNA输出的生物荧光探针及其制备方法，该生物荧光探针不仅与H2S具有较高的专一响应性，又可以同时靶向细胞核，从而达到实时定量细胞核内RNA输出的效果。
背景技术：
核RNA输出到细胞质是蛋白质表达实现生物学功能的关键步骤之一。目前，核RNA输出分析是通过从细胞裂解液中分离细胞核和细胞质，并量化细胞质RNA水平。另一种被广泛接受的方法是测量转录本对应的蛋白质，一种间接测量。这些方法的一个普遍和基本的局限性是无法跟踪RNA输出的快速动态，更不用说空间信息的丢失了。
为了解决这一问题，近年来人们制造了多种RNA荧光染料来标记活细胞中的核RNA。这些染料通常是明亮的和可激活的结合RNA，但仍然不能定量测量核RNA输出。这是因为当荧光标记的核RNA进入细胞质并最终被降解时，释放的染料分子由于优先的核定位而返回到细胞核，这种循环过程扭曲了染料的核-细胞质分布。
尽管核酸染料的广泛应用，跟踪和量化活细胞中高度动态的RNA输出过程是具有挑战性的。当染料标记的RNA进入细胞质时，染料分子在RNA降解后被释放出来，允许它们重新进入细胞核。因此，无法确定随RNA进入细胞质的染料与留在细胞核内的染料的比例。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种实时定量细胞核内RNA输出的生物荧光探针，当加入到细胞中时，该探针能迅速与活细胞中的核RNA结合，并与内部的H2S发生反应，这种反应不仅激活荧光以跟踪RNA，而且改变探针的结构，从而改变其细胞内定位；探针与细胞质中输出的RNA分离后，优先进入溶酶体而不是细胞核，实现了核RNA输出的实时定量测量。利用该探针，本发明成功地评估了激素和抗癌药物对活细胞核RNA输出的影响，并且发现抑制RNA输出的激素可以部分抵消化疗的作用。
本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：
一种生物荧光探针，简记为AD-N3，结构式如下：
Figure BDA0003023860170000021
所述生物荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)向圆底烧瓶中加入N-苯基邻氨基苯甲酸和三氯氧磷，在水浴中缓慢加热，然后转移到油浴中升温反应，将反应液冷却至室温，经减压浓缩后加入氨水溶液中，调节pH，析出固体，过滤，得到中间体AD-Cl；
(2)向避光的圆底烧瓶中加入中间体AD-Cl，然后加入四氢呋喃，搅拌均匀，再滴加叠氮化钠的水溶液，升温反应，将反应液加入水中，析出固体，过滤得到粗产品，经柱色谱得到产品AD-N3。
所述N-苯基邻氨基苯甲酸、三氯氧磷的摩尔用量比为1:(5-10)。
所述AD-Cl、叠氮化钠的摩尔用量比为1:(1-3)。
所述柱色谱的洗脱剂为石油醚。
本发明合成路线如下：
Figure BDA0003023860170000022
所述生物荧光探针在实时定量细胞核内RNA输出过程中作为生物探针的用途。
所述生物荧光探针与H2S有专一的响应性且具有细胞核的靶向性。
本发明的有益效果是：
(1)本发明所述探针具有吖啶基团，类似于普通核RNA染料通过氢键和π-π键相互作用达到细胞核的定位及特异性识别RNA的能力；
(2)本发明所述AD-Cl作为母体是源于其本身与核酸特异性结合的能力比较强，且其能够在一定的条件下从核酸上解离，利于研究荧光探针出核后的变化过程；
(3)本发明所述AD-N3一旦遇到核内固有的典型浓度范围为的H2S，-N3基团立即转化为伯胺，生成氨基吖啶(AD-NH2)，这种快速而简单的反应有两个重要目的：首先，它将非发射性的AD-N3转化为活细胞核RNA的高荧光标记；其次，由于-NH2的碱性和溶酶体的酸性改变了吖啶探针从细胞核到溶酶体的亲和性，阻止荧光探针回到细胞核，使实时定量核RNA输出成为可能。
附图说明：
图1中(a)：AD-N3探测策略示意图；(b)：AD-N3(10μM)和AD-N3(10μM)与H2S(50μM)的混合物在激发波长405nm下的荧光光谱；(c)：AD-N3(10μM)和AD-NH2(10μM)在0.5mg/mL RNA存在下，在405nm激发波长下的荧光光谱，并显示AD-N3和AD-NH2与核酸的结合常数K；
图2为未处理细胞和PMA刺激细胞的荧光成像；(a)：HeLa细胞单独用AD-N3处理3min，然后与商业的核RNA染料进行共定位图；(b)：图(a)随时间变化的细胞核内外的荧光强度；(c)：HeLa细胞先用2μg/mL PMA处理1h，然后用AD-N3孵育3min；(d)：图(c)随时间变化细胞核内外的荧光强度；
图3为荧光成像观察AD-N3实时测量核RNA输出；(a)：溶酶体中AD-NH2的荧光成像，HeLa细胞用AD-NH2孵育20min，然后用溶酶商业染料共定位；(b)：分别将HeLa细胞固定、4℃处理、出核转运抑制剂处理后加入探针AD-N3和核RNA商业染料共定位；(c)：图(b)中成像结果对应的荧光强度；
图4为激素调控核RNA输出；(a)：HeLa细胞经不同激素处理后用AD-N3孵育3min成像；(b)：与图(a)中图像对应的荧光强度；(c)：HeLa细胞同时用PMA和个别激素处理后用AD-N3孵育3min成像；(d)：与图(c)中图像对应的荧光强度；(e)：流式细胞术检测PMA和单个激素同时处理下的HeLa细胞存活率；(f)：caspase-3在PMA和单个激素共同作用的HeLa细胞中的免疫荧光强度；
图5为紫杉醇在核RNA出核抑制激素存在下的抗肿瘤作用；a)：HeLa细胞同时用紫杉醇和个别激素处理后用AD-N3孵育5min成像；b)：与图(a)中图像对应的荧光强度；c)：流式细胞术检测紫杉醇和单个激素同时处理下的HeLa细胞存活率。
具体实施方式：
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和图示，进一步阐述本发明。
实施例1
探针的制备：
(1)向500mL圆底烧瓶中加入N-苯基邻氨基苯甲酸(30g,0.138mol)和三氯氧磷(170g,1.108mol)，在水浴中缓慢加热至85℃，然后转移到油浴中升温至135℃反应2h，将反应液冷却至室温，经减压浓缩至反应液原体积的5％后加入氨水溶液中，调节pH＝5，析出固体，过滤，得到灰绿色的中间体AD-Cl，产率70％。1H-NMR(400MHz)δ8.34(d,J＝8.7Hz),8.22(d,J＝8.8Hz),7.81–7.73(m),7.61–7.53(m).HR-MS(m/z,ESI)Calculated for C13H8ClNm/z＝213.0345[M+H].Found m/z＝214.0420.
(2)向50mL避光的圆底烧瓶中加入中间体AD-Cl(1g,0.047mol)，然后加入10mL四氢呋喃，搅拌均匀，再滴加叠氮化钠(0.456g,0.070mol)的水溶液(1mL水)，升温至40℃反应3h，将反应液加入水中，析出固体，过滤得到粗产品，经柱色谱得到浅黄色的产品AD-N3，产率为30％。该反应的合成过程以及提纯都需要避光操作。1H-NMR(400MHz)δ8.36(d,J＝8.8Hz),8.24(d,J＝8.8Hz),7.81(t,J＝7.7Hz),7.63–7.54(m).HR-MS(m/z,ESI)Calculated for C13H8N4 m/z＝220.0749[M+H].Found m/z＝221.0806.
实施例2
目标分子的生物学研究：
1、分别使用探针AD-N3和AD-N3与H2S反应后的产物AD-NH2进行培养细胞，然后分别用核RNA、溶酶体的商业染料进行共定位，说明本发明所述探针可以快速与核RNA结合并被H2S激活，而AD-N3与H2S反应后的产物AD-NH2，由于其碱性和溶酶体的酸性改变了吖啶探针从核到溶酶体的亲和性，这为观察细胞核内的RNA转运到细胞质内的奠定了基础。
2、分别使用不同的激素及刺激细胞凋亡的试剂培养细胞，观察在细胞凋亡过程中，细胞核内的RNA大量输出到细胞质，加入甲状腺素和肾上腺素也同样促进了核RNA输出，而其他五种激素(甲睾酮、己烯雌酚、多巴胺、胰岛素和褪黑激素)对核RNA输出没有显著作用。在这五种激素与抗癌药紫杉醇同时培养细胞时，也发现联合紫杉醇与这五激素共同使用时，降低了紫杉醇对核RNA的输出和细胞死亡率。
生物学研究结果具体见附图1-5。
附图1中的a图说明探针AD-N3在细胞内的响应过程，b图说明探针AD-N3与H2S有较好的响应性，c图说明AD-N3较AD-N3与H2S反应产物AD-NH2与RNA的结合能力强。
附图2中a和b图说明探针AD-N3可以快速与核RNA结合并被H2S激活，b图通过对比细胞核内外荧光强度说明AD-N3与H2S反应产物AD-NH2的稳定性，c图和d图说明凋亡加速了细胞核内RNA向细胞质的输出。
附图3中a图说明AD-N3与H2S反应产物AD-NH2有较强的稳定性，定位在溶酶体里不会回到细胞核里，b和c图验证了本发明所述探针从细胞核到溶酶体的细胞内迁移，可以成像和定量核RNA输出。
附图4中a和b图说明在这些激素中，甲状腺素和肾上腺素促进了核RNA输出，而其他五种激素(甲睾酮、己烯雌酚、多巴胺、胰岛素和褪黑激素)没有显著作用，c和d图说明其他5种激素抑制了核RNA输出，e图说明本发明还发现这五种激素也能有效抑制PMA诱导的细胞凋亡，f图说明这五种激素也能有效抑制细胞凋亡caspase-3的表达。
附图5中a-c图说明紫杉醇单独的使用促进了Hela细胞核RNA的输出和细胞死亡，而联合紫杉醇与这五激素共同使用，降低了紫杉醇对细胞核RNA的输出和细胞死亡。这些结果表明，化疗的抗肿瘤作用可能会被某些人类激素部分抵消，这是一种可能缓解化疗副作用的药物。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种生物荧光探针在实时定量细胞核内RNA输出过程中作为生物探针的用途，所述生物荧光探针简记为AD-N3，结构式如下：
Figure FDA0003935419200000011
2.权利要求1所述的用途，其特征在于：所述生物荧光探针的制备方法包括如下步骤：
(1)向圆底烧瓶中加入N-苯基邻氨基苯甲酸和三氯氧磷，在水浴中缓慢加热，然后转移到油浴中升温反应，将反应液冷却至室温，经减压浓缩后加入氨水溶液中，调节pH，析出固体，过滤，得到中间体AD-Cl；
(2)向避光的圆底烧瓶中加入中间体AD-Cl，然后加入四氢呋喃，搅拌均匀，再滴加叠氮化钠的水溶液，升温反应，将反应液加入水中，析出固体，过滤得到粗产品，经柱色谱得到产品AD-N3。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述N-苯基邻氨基苯甲酸、三氯氧磷的摩尔用量比为1:(5-10)。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述AD-Cl、叠氮化钠的摩尔用量比为1:(1-3)。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述柱色谱的洗脱剂为石油醚。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述生物荧光探针与H2S有专一的响应性且具有细胞核的靶向性。
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