JP2001025400A - 生細胞の細胞質内標的核酸を検出する方法 - Google Patents
生細胞の細胞質内標的核酸を検出する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生細胞の細胞質内標的核酸を検出する。
【解決手段】 細胞質内に標的核酸が存在する生細胞の
細胞質に、核膜透過阻害分子がリンカーを介して結合さ
れ、さらに前記標的核酸にハイブリダイズ可能な塩基配
列を有する、蛍光色素で標識された検出用プローブを導
入し、該標的核酸と前記プローブとのハイブリッド体形
成に基づく前記蛍光色素の蛍光変化を測定することによ
り、前記標的核酸を検出する。
細胞質に、核膜透過阻害分子がリンカーを介して結合さ
れ、さらに前記標的核酸にハイブリダイズ可能な塩基配
列を有する、蛍光色素で標識された検出用プローブを導
入し、該標的核酸と前記プローブとのハイブリッド体形
成に基づく前記蛍光色素の蛍光変化を測定することによ
り、前記標的核酸を検出する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生細胞の細胞質内
に存在する標的核酸を検出する方法に関する。さらに詳
しくは、本発明は、蛍光色素で標識されたプローブを用
いて、生細胞の細胞質内に存在する標的核酸をハイブリ
ダイゼーションにより検出する方法に関する。
に存在する標的核酸を検出する方法に関する。さらに詳
しくは、本発明は、蛍光色素で標識されたプローブを用
いて、生細胞の細胞質内に存在する標的核酸をハイブリ
ダイゼーションにより検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】特定の塩基配列を有する核酸（以下、標
的核酸という）を検出するための方法の１つとしてハイ
ブリダイズ法が知られている。この方法では、検出用プ
ローブとして該標的核酸とハイブリダイズ可能な塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブ
リッド体を形成し、該ハイブリッド体を種々の検出方法
を用いて検出することにより標的核酸の検出を行う。
的核酸という）を検出するための方法の１つとしてハイ
ブリダイズ法が知られている。この方法では、検出用プ
ローブとして該標的核酸とハイブリダイズ可能な塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブ
リッド体を形成し、該ハイブリッド体を種々の検出方法
を用いて検出することにより標的核酸の検出を行う。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
ハイブリダイズ法は、以下のような問題点があるため、
生細胞において細胞質内の標的核酸を検出するために用
いることが難しい。すなわち、細胞質内へ導入された検
出用プローブはすみやかに細胞核内へ移動してしまうの
で、細胞質内に存在する標的核酸とハイブリッド体を形
成させることが困難であることと、細胞質内へ導入され
た検出用プローブ（または検出用プローブと標的核酸と
のハイブリッド体）が細胞質内に存在する種々の核酸分
解酵素によりすみやかに分解され検出することが困難で
あることである。
ハイブリダイズ法は、以下のような問題点があるため、
生細胞において細胞質内の標的核酸を検出するために用
いることが難しい。すなわち、細胞質内へ導入された検
出用プローブはすみやかに細胞核内へ移動してしまうの
で、細胞質内に存在する標的核酸とハイブリッド体を形
成させることが困難であることと、細胞質内へ導入され
た検出用プローブ（または検出用プローブと標的核酸と
のハイブリッド体）が細胞質内に存在する種々の核酸分
解酵素によりすみやかに分解され検出することが困難で
あることである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、特定の構造
を有する検出用プローブが、生細胞の細胞質内へ導入さ
れてもすみやかに細胞核内へ移動せず、また核酸分解酵
素により容易に分解されないことを見出し本発明を完成
した。すなわち、特定の構造を有する検出用プローブを
細胞質内に導入することにより、該プローブが細胞核内
へは容易に移動せず、また核酸分解酵素により容易に分
解もされずに細胞質内に存在する標的核酸とハイブリッ
ド体を形成し、さらに該ハイブリッド体が核酸分解酵素
による分解を受けることなく検出可能となる。従って、
このような検出用プローブを用いると、生細胞の細胞質
内に存在する標的核酸を検出する方法（以下、本発明の
検出方法という）が達成される。
を有する検出用プローブが、生細胞の細胞質内へ導入さ
れてもすみやかに細胞核内へ移動せず、また核酸分解酵
素により容易に分解されないことを見出し本発明を完成
した。すなわち、特定の構造を有する検出用プローブを
細胞質内に導入することにより、該プローブが細胞核内
へは容易に移動せず、また核酸分解酵素により容易に分
解もされずに細胞質内に存在する標的核酸とハイブリッ
ド体を形成し、さらに該ハイブリッド体が核酸分解酵素
による分解を受けることなく検出可能となる。従って、
このような検出用プローブを用いると、生細胞の細胞質
内に存在する標的核酸を検出する方法（以下、本発明の
検出方法という）が達成される。
【０００５】換言すれば、本発明の検出方法で用いる検
出用プローブは、標的核酸の特定の塩基配列とハイブリ
ダイズ可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプロ
ーブであって、核膜孔を通じる細胞核内への移動およ
び、好ましくは核酸分解酵素による分解を阻害する分子
を有し、さらに、標的核酸とのハイブリッド体のみを検
出可能とするための蛍光標識を有することを特徴とする
ものである。
出用プローブは、標的核酸の特定の塩基配列とハイブリ
ダイズ可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプロ
ーブであって、核膜孔を通じる細胞核内への移動およ
び、好ましくは核酸分解酵素による分解を阻害する分子
を有し、さらに、標的核酸とのハイブリッド体のみを検
出可能とするための蛍光標識を有することを特徴とする
ものである。
【０００６】また、本発明の検出方法で用いる好ましい
検出用プローブは、標的核酸とのハイブリッド体のみを
検出可能とするため、蛍光共鳴エネルギー移動（以下、
ＦＲＥＴともいう）を生じるようにエネルギードナー蛍
光色素（以下、ドナー蛍光色素、または単にドナーとも
いう）およびエネルギーアクセプター蛍光色素（以下、
アクセプター蛍光色素、または単にアクセプターともい
う）を結合した２種類のオリゴヌクレオチドプローブか
らなる１組のプローブであり、かつそれぞれのプローブ
が標的核酸と隣接してハイブリダイズしてハイブリッド
体を形成することが可能な塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドプローブである。
検出用プローブは、標的核酸とのハイブリッド体のみを
検出可能とするため、蛍光共鳴エネルギー移動（以下、
ＦＲＥＴともいう）を生じるようにエネルギードナー蛍
光色素（以下、ドナー蛍光色素、または単にドナーとも
いう）およびエネルギーアクセプター蛍光色素（以下、
アクセプター蛍光色素、または単にアクセプターともい
う）を結合した２種類のオリゴヌクレオチドプローブか
らなる１組のプローブであり、かつそれぞれのプローブ
が標的核酸と隣接してハイブリダイズしてハイブリッド
体を形成することが可能な塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドプローブである。
【０００７】すなわち、本発明は、かかる特定の構造を
有する検出用プローブを用いることを特徴とするもので
あり、本発明に従えば、以下の検出方法が提供される。
有する検出用プローブを用いることを特徴とするもので
あり、本発明に従えば、以下の検出方法が提供される。
【０００８】生細胞の細胞質内に存在する標的核酸を検
出する方法であって、前記細胞質に、核膜透過阻害分子
がリンカーを介して結合され、さらに前記標的核酸にハ
イブリダイズ可能な塩基配列を有する、蛍光色素で標識
された検出用プローブを導入し、該標的核酸と前記プロ
ーブとのハイブリッド体を形成させ、さらに前記ハイブ
リッド体形成に基づく前記蛍光色素の蛍光変化を測定す
ることを特徴とする前記検出方法。
出する方法であって、前記細胞質に、核膜透過阻害分子
がリンカーを介して結合され、さらに前記標的核酸にハ
イブリダイズ可能な塩基配列を有する、蛍光色素で標識
された検出用プローブを導入し、該標的核酸と前記プロ
ーブとのハイブリッド体を形成させ、さらに前記ハイブ
リッド体形成に基づく前記蛍光色素の蛍光変化を測定す
ることを特徴とする前記検出方法。
【０００９】さらに、本発明は、前記検出用プローブ
が、第１のプローブおよび第２のプローブからなり、前
記第１のプローブと、前記第２のプローブとは、前記標
的核酸に互いに隣接してハイブリダイズ可能な塩基配列
を有し、該第１のプローブがエネルギードナー蛍光色素
で標識され、そして該第２のプローブがエネルギーアク
セプター蛍光色素で標識され、前記蛍光色素の蛍光変化
が、該第１のプローブの蛍光色素から該第２のプローブ
の蛍光色素への蛍光共鳴エネルギー移動であることを特
徴とする、上記生細胞の細胞質内に存在する標的核酸を
検出する方法を提供する。
が、第１のプローブおよび第２のプローブからなり、前
記第１のプローブと、前記第２のプローブとは、前記標
的核酸に互いに隣接してハイブリダイズ可能な塩基配列
を有し、該第１のプローブがエネルギードナー蛍光色素
で標識され、そして該第２のプローブがエネルギーアク
セプター蛍光色素で標識され、前記蛍光色素の蛍光変化
が、該第１のプローブの蛍光色素から該第２のプローブ
の蛍光色素への蛍光共鳴エネルギー移動であることを特
徴とする、上記生細胞の細胞質内に存在する標的核酸を
検出する方法を提供する。
【００１０】また、核膜透過阻害分子としては、好まし
くは核膜孔の通過を阻害する十分な大きさを有するタン
パク質、糖、ビーズ、および金属粒子からなる群より選
ばれる少なくとも１つであることを特徴とする、上記検
出方法を提供する。特に好ましくは、タンパク質として
ストレプトアビジン、アビジンが含まれる。また、糖と
してデキストランが含まれる。
くは核膜孔の通過を阻害する十分な大きさを有するタン
パク質、糖、ビーズ、および金属粒子からなる群より選
ばれる少なくとも１つであることを特徴とする、上記検
出方法を提供する。特に好ましくは、タンパク質として
ストレプトアビジン、アビジンが含まれる。また、糖と
してデキストランが含まれる。
【００１１】上記の検出方法において、検出用プローブ
がさらにリンカーを介して該検出用プローブに結合され
た核酸分解酵素阻害分子を有していてもよい。ここで、
前記核酸分解酵素阻害分子が核膜透過阻害分子と同一で
あることが好ましい。これは、本発明に用いられる核膜
透過阻害分子が核酸分解酵素阻害分子としての機能を備
え持つことを意味する。
がさらにリンカーを介して該検出用プローブに結合され
た核酸分解酵素阻害分子を有していてもよい。ここで、
前記核酸分解酵素阻害分子が核膜透過阻害分子と同一で
あることが好ましい。これは、本発明に用いられる核膜
透過阻害分子が核酸分解酵素阻害分子としての機能を備
え持つことを意味する。
【００１２】核酸分解酵素阻害分子としては、好ましく
は核酸分解酵素による分解反応を立体障害により阻害す
るタンパク質、糖、ビーズ、金属粒子からなる群より選
ばれる少なくとも１つであることを特徴とする、上記検
出方法を提供する。特に好ましくは、タンパク質として
ストレプトアビジン、アビジンが含まれる。また、糖と
してデキストランが含まれる。
は核酸分解酵素による分解反応を立体障害により阻害す
るタンパク質、糖、ビーズ、金属粒子からなる群より選
ばれる少なくとも１つであることを特徴とする、上記検
出方法を提供する。特に好ましくは、タンパク質として
ストレプトアビジン、アビジンが含まれる。また、糖と
してデキストランが含まれる。
【００１３】上記の検出方法において、好ましくは検出
用プローブが１０乃至２０塩基からなるオリゴヌクレオ
チドである。
用プローブが１０乃至２０塩基からなるオリゴヌクレオ
チドである。
【００１４】さらに、上記の検出方法において、好まし
くは検出されるべき標的核酸がメッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）である。
くは検出されるべき標的核酸がメッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）である。
【００１５】以下、本発明を実施の形態に即して詳細に
説明する。
説明する。
【００１６】
【発明の実施の形態】（本発明の検出方法の概要）本発
明の検出方法の一例として、生細胞内で特定の種類のｍ
ＲＮＡを可視化して検出するための好ましい手順を以下
説明する。
明の検出方法の一例として、生細胞内で特定の種類のｍ
ＲＮＡを可視化して検出するための好ましい手順を以下
説明する。
【００１７】まず、図１で模式的に示したように、検出
用の２種類のプローブを用意し、これらを混合して一組
として使用する。各プロ−ブは、１．標的ｍＲＮＡにハ
イブリダイズするオリゴヌクレオチド、２．細胞内にお
いて、核膜を透過しない大きさをもつ分子、３．両者を
つなぐリンカー、の３つにより構成されるものとする。
第１のプローブと第２のプローブを構成する各オリゴヌ
クレオチドの塩基配列は、２つのプローブが検出対象の
ｍＲＮＡの特定の部位に互いに隣接してハイブリダイズ
することが可能な塩基配列とする。
用の２種類のプローブを用意し、これらを混合して一組
として使用する。各プロ−ブは、１．標的ｍＲＮＡにハ
イブリダイズするオリゴヌクレオチド、２．細胞内にお
いて、核膜を透過しない大きさをもつ分子、３．両者を
つなぐリンカー、の３つにより構成されるものとする。
第１のプローブと第２のプローブを構成する各オリゴヌ
クレオチドの塩基配列は、２つのプローブが検出対象の
ｍＲＮＡの特定の部位に互いに隣接してハイブリダイズ
することが可能な塩基配列とする。
【００１８】一般に、ｍＲＮＡはそれ自体で複雑な立体
構造をとっていると考えられる。このため、オリゴヌク
レオチドがｍＲＮＡのある部位と相補的な塩基配列を有
していても、その部位で立体構造的にハイブリダイゼー
ションに障害が生じることがある。従って、オリゴヌク
レオチドが標的ｍＲＮＡにハイブリダイズするｍＲＮＡ
上の部位を選択する必要がある。特定部位の選択法は例
えば、以下のようにして可能である。まず、ｍＲＮＡの
２次構造をシミュレーションする。これは例えば、ＤＩ
ＮｓｉｓなどのＲＮＡの２次構造予測用の市販のコンピ
ュータープログラムを使用することにより可能である。
得られた２次構造図のなかで、ＲＮＡが一本鎖構造（ル
ープ）をとっている部位を中心に３０−４０塩基の部位
を選択する。その部位を２つに分割し（各１５−２０塩
基）、それぞれの部位に相補的な塩基配列をもつオリゴ
ヌクレオチドを合成する。これら２つの断片を第１およ
び第２のオリゴヌクレオチドとする。
構造をとっていると考えられる。このため、オリゴヌク
レオチドがｍＲＮＡのある部位と相補的な塩基配列を有
していても、その部位で立体構造的にハイブリダイゼー
ションに障害が生じることがある。従って、オリゴヌク
レオチドが標的ｍＲＮＡにハイブリダイズするｍＲＮＡ
上の部位を選択する必要がある。特定部位の選択法は例
えば、以下のようにして可能である。まず、ｍＲＮＡの
２次構造をシミュレーションする。これは例えば、ＤＩ
ＮｓｉｓなどのＲＮＡの２次構造予測用の市販のコンピ
ュータープログラムを使用することにより可能である。
得られた２次構造図のなかで、ＲＮＡが一本鎖構造（ル
ープ）をとっている部位を中心に３０−４０塩基の部位
を選択する。その部位を２つに分割し（各１５−２０塩
基）、それぞれの部位に相補的な塩基配列をもつオリゴ
ヌクレオチドを合成する。これら２つの断片を第１およ
び第２のオリゴヌクレオチドとする。
【００１９】さらに、第１および第２のオリゴヌクレオ
チドをそれぞれ異なる種類の蛍光色素で標識する。これ
らの２種類の蛍光色素は、お互いが適当な距離に存在す
ると（８ｎｍ以下）ＦＲＥＴをおこす組み合わせとする
（一方の色素をドナー、他方をアクセプターと表記す
る）。それぞれの蛍光色素のオリゴヌクレオチド上の標
識位置は、２種類のプローブと標的ｍＲＮＡの３者がハ
イブリッド体を形成したときに、２種類の蛍光色素がＦ
ＲＥＴをおこす距離に位置するような立体構造をとる位
置とする。実際には、ハイブリッド体において２つの蛍
光色素が２０塩基以内の距離に位置するときにこの条件
を満たすが、より具体的には２−４塩基とすればＦＲＥ
Ｔが効率よく起こることがモデル実験から確かめられて
いる。一般的なＦＲＥＴの解説については、Lakowicz，
J．R．“Principles of Fluorescence Spectroscopy”
（1983），Plenum Press，New Yorkを参照。
チドをそれぞれ異なる種類の蛍光色素で標識する。これ
らの２種類の蛍光色素は、お互いが適当な距離に存在す
ると（８ｎｍ以下）ＦＲＥＴをおこす組み合わせとする
（一方の色素をドナー、他方をアクセプターと表記す
る）。それぞれの蛍光色素のオリゴヌクレオチド上の標
識位置は、２種類のプローブと標的ｍＲＮＡの３者がハ
イブリッド体を形成したときに、２種類の蛍光色素がＦ
ＲＥＴをおこす距離に位置するような立体構造をとる位
置とする。実際には、ハイブリッド体において２つの蛍
光色素が２０塩基以内の距離に位置するときにこの条件
を満たすが、より具体的には２−４塩基とすればＦＲＥ
Ｔが効率よく起こることがモデル実験から確かめられて
いる。一般的なＦＲＥＴの解説については、Lakowicz，
J．R．“Principles of Fluorescence Spectroscopy”
（1983），Plenum Press，New Yorkを参照。
【００２０】このようにして合成した第１および第２の
蛍光標識オリゴヌクレオチドを混合して蛍光スペクトル
を測定する。次に、標的ｍＲＮＡをこの溶液に添加し
て、蛍光スペクトルの変化を観察する。これら３者でハ
イブリッド体が形成されれば２種類の蛍光色素間でＦＲ
ＥＴがおこり、その結果、ドナーの蛍光強度が減少し、
アクセプターの蛍光強度が増大した蛍光スペクトルが得
られる。
蛍光標識オリゴヌクレオチドを混合して蛍光スペクトル
を測定する。次に、標的ｍＲＮＡをこの溶液に添加し
て、蛍光スペクトルの変化を観察する。これら３者でハ
イブリッド体が形成されれば２種類の蛍光色素間でＦＲ
ＥＴがおこり、その結果、ドナーの蛍光強度が減少し、
アクセプターの蛍光強度が増大した蛍光スペクトルが得
られる。
【００２１】ｍＲＮＡの２次構造図上で選択した何種類
かの各部位について上記の作業を行い、蛍光スペクトル
変化量を比較して、スペクトル変化量の大きい部位を選
択することが好ましい。上記の測定に使用するｍＲＮＡ
は、対応するｃＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡを
用いてインビトロ転写反応により合成することができ
る。
かの各部位について上記の作業を行い、蛍光スペクトル
変化量を比較して、スペクトル変化量の大きい部位を選
択することが好ましい。上記の測定に使用するｍＲＮＡ
は、対応するｃＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡを
用いてインビトロ転写反応により合成することができ
る。
【００２２】また、各部位の標的ｍＲＮＡへのハイブリ
ダイゼーションの効率を正確に評価するためには、各蛍
光標識オリゴヌクレオチドと標的ｍＲＮＡを水溶液中で
混合し反応させた後、高速液体クロマトグラフィ−によ
り、ｍＲＮＡとハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド
とハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドとを分
離する。それぞれのピークの蛍光強度の面積比より、ハ
イブリダイズしたオリゴヌクレオチドの比率を求める。
ダイゼーションの効率を正確に評価するためには、各蛍
光標識オリゴヌクレオチドと標的ｍＲＮＡを水溶液中で
混合し反応させた後、高速液体クロマトグラフィ−によ
り、ｍＲＮＡとハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド
とハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドとを分
離する。それぞれのピークの蛍光強度の面積比より、ハ
イブリダイズしたオリゴヌクレオチドの比率を求める。
【００２３】また、生細胞の中での各オリゴヌクレオチ
ドの標的ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションの確認・
評価を、in situ 転写法により行うことも可能である。
すなわち、生細胞に前記蛍光標識オリゴヌクレオチドを
取り込ませる。これは例えば、細胞を培養している培地
中に蛍光標識オリゴヌクレオチドを添加してしかるべき
時間インキュベートすることにより可能である。その
後、細胞を固定処理する。固定処理した細胞に対して、
該オリゴヌクレオチドの位置をプライマーの起点として
逆転写反応を行う。該オリゴヌクレオチドが標的ｍＲＮ
Ａにハイブリダイズしていれば、反応がおこり、標的ｍ
ＲＮＡに対するｃＤＮＡが生産される。そこで合成され
たｃＤＮＡを検出する。
ドの標的ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションの確認・
評価を、in situ 転写法により行うことも可能である。
すなわち、生細胞に前記蛍光標識オリゴヌクレオチドを
取り込ませる。これは例えば、細胞を培養している培地
中に蛍光標識オリゴヌクレオチドを添加してしかるべき
時間インキュベートすることにより可能である。その
後、細胞を固定処理する。固定処理した細胞に対して、
該オリゴヌクレオチドの位置をプライマーの起点として
逆転写反応を行う。該オリゴヌクレオチドが標的ｍＲＮ
Ａにハイブリダイズしていれば、反応がおこり、標的ｍ
ＲＮＡに対するｃＤＮＡが生産される。そこで合成され
たｃＤＮＡを検出する。
【００２４】次に、それぞれのオリゴヌクレオチドにリ
ンカ−を介して核膜を透過しない大きさを有する分子を
結合させる。例えば、核膜を透過しない大きさを有する
分子としてタンパク質の一種であるストレプトアビジン
を使用し、リンカーとしてオリゴヌクレオチドを使用す
ることが可能である。このときには、標的ｍＲＮＡとハ
イブリダイズさせる部位の蛍光標識オリゴヌクレオチド
と、リンカーとしての機能をもたせるオリゴヌクレオチ
ドを一つのオリゴヌクレオチドとして合成することが好
ましい。オリゴヌクレオチドの一端にビオチンを結合さ
せる。蛍光色素およびビオチンで標識されたオリゴヌク
レオチドをストレプトアビジンと水溶液中で混合して、
両者を結合させる。ストレプトアビジンはビオチンへの
結合に対して４価であるため、１分子のストレプトアビ
ジンに複数分子の蛍光標識オリゴヌクレオチドが結合す
ることを防ぐために、混合比はストレプトアビジンを過
剰とする。実際的にはモル比で、オリゴヌクレオチド：
ストレプトアビジン＝１：４程度が望ましい。また、ド
ナープローブおよびアクセプタープローブをともにスト
レプトアビジンと結合させた形態として使用するため、
同一のストレプトアビジン分子にドナーオリゴヌクレオ
チドとアクセプターオリゴヌクレオチドの両者が結合す
ることは避けなければならない（両者が結合するとＦＲ
ＥＴがおこる）。オリゴヌクレオチドとストレプトアビ
ジンとの結合反応は、ドナーオリゴヌクレオチド、アク
セプターオリゴヌクレオチドそれぞれについてストレプ
トアビジン過剰の条件で行い、すべてのオリゴヌクレオ
チドをストレプトアビジンに結合させる。すなわち、ス
トレプトアビジンと予め混合したドナーオリゴヌクレオ
チドがストレプトアビジンと予め混合したアクセプター
オリゴヌクレオチドと混合されるとき、遊離の（自由
な）オリゴヌクレオチドは存在しない。
ンカ−を介して核膜を透過しない大きさを有する分子を
結合させる。例えば、核膜を透過しない大きさを有する
分子としてタンパク質の一種であるストレプトアビジン
を使用し、リンカーとしてオリゴヌクレオチドを使用す
ることが可能である。このときには、標的ｍＲＮＡとハ
イブリダイズさせる部位の蛍光標識オリゴヌクレオチド
と、リンカーとしての機能をもたせるオリゴヌクレオチ
ドを一つのオリゴヌクレオチドとして合成することが好
ましい。オリゴヌクレオチドの一端にビオチンを結合さ
せる。蛍光色素およびビオチンで標識されたオリゴヌク
レオチドをストレプトアビジンと水溶液中で混合して、
両者を結合させる。ストレプトアビジンはビオチンへの
結合に対して４価であるため、１分子のストレプトアビ
ジンに複数分子の蛍光標識オリゴヌクレオチドが結合す
ることを防ぐために、混合比はストレプトアビジンを過
剰とする。実際的にはモル比で、オリゴヌクレオチド：
ストレプトアビジン＝１：４程度が望ましい。また、ド
ナープローブおよびアクセプタープローブをともにスト
レプトアビジンと結合させた形態として使用するため、
同一のストレプトアビジン分子にドナーオリゴヌクレオ
チドとアクセプターオリゴヌクレオチドの両者が結合す
ることは避けなければならない（両者が結合するとＦＲ
ＥＴがおこる）。オリゴヌクレオチドとストレプトアビ
ジンとの結合反応は、ドナーオリゴヌクレオチド、アク
セプターオリゴヌクレオチドそれぞれについてストレプ
トアビジン過剰の条件で行い、すべてのオリゴヌクレオ
チドをストレプトアビジンに結合させる。すなわち、ス
トレプトアビジンと予め混合したドナーオリゴヌクレオ
チドがストレプトアビジンと予め混合したアクセプター
オリゴヌクレオチドと混合されるとき、遊離の（自由
な）オリゴヌクレオチドは存在しない。
【００２５】リンカーの長さは、細胞内での前記プロー
ブの標的ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションが効率よ
くおこるように立体障害の緩和が有効におこればよい。
実際的には２０塩基以下が望ましい。リンカ−部の塩基
配列については特に制限はないが、標的ｍＲＮＡの他の
部位へのハイブリダイゼ−ションあるいは他の種類のｍ
ＲＮＡへのハイブダイゼーションがおこる可能性のある
配列は避ける。また、リンカ−部の骨格はＳ−オリゴ
（デオキシスルフォネート オリゴヌクレオチド）など
ヌクレアーゼ耐性が高いものを用いてもよい。
ブの標的ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションが効率よ
くおこるように立体障害の緩和が有効におこればよい。
実際的には２０塩基以下が望ましい。リンカ−部の塩基
配列については特に制限はないが、標的ｍＲＮＡの他の
部位へのハイブリダイゼ−ションあるいは他の種類のｍ
ＲＮＡへのハイブダイゼーションがおこる可能性のある
配列は避ける。また、リンカ−部の骨格はＳ−オリゴ
（デオキシスルフォネート オリゴヌクレオチド）など
ヌクレアーゼ耐性が高いものを用いてもよい。
【００２６】作製した２種類のプローブを混合し、細胞
内に導入する。例えば、マイクロインジェクションによ
り細胞質にプローブを注入する。
内に導入する。例えば、マイクロインジェクションによ
り細胞質にプローブを注入する。
【００２７】細胞の蛍光像を測定する。細胞の蛍光像は
通常の落射型蛍光顕微鏡で観察する。励起フィルター、
ダイクロイックミラー、蛍光用フィルターをそれぞれド
ナー色素、アクセプタ−色素の波長に適切にセットする
ことにより、ドナープローブの細胞内での分布、アクセ
プタープローブの細胞内での分布、およびそれらの時間
変化を観察することが可能である。細胞は顕微鏡のステ
ージ上でインキュベートする。必要に応じて培養液を循
環させるなどの方法により温度などを制御する。
通常の落射型蛍光顕微鏡で観察する。励起フィルター、
ダイクロイックミラー、蛍光用フィルターをそれぞれド
ナー色素、アクセプタ−色素の波長に適切にセットする
ことにより、ドナープローブの細胞内での分布、アクセ
プタープローブの細胞内での分布、およびそれらの時間
変化を観察することが可能である。細胞は顕微鏡のステ
ージ上でインキュベートする。必要に応じて培養液を循
環させるなどの方法により温度などを制御する。
【００２８】細胞内でのＦＲＥＴの測定は、２つの波長
域での蛍光強度の比率を求めることにより行うことが可
能である。すなわち、細胞内のある任意の位置における
ＦＲＥＴの効率を求めるときには、その位置における、
ドナー色素の励起波長域の光を細胞に照射したときのド
ナーの蛍光波長域における蛍光強度（Ｉｄ値）とアクセ
プターの蛍光波長域における蛍光強度（Ｉａ値）を測定
し、Ｉｄ値とＩａ値の比率（Ｉａ／Ｉｄ）を求めればよ
い。Ｉａ／Ｉｄの値はＦＲＥＴの効率をあらわす。
域での蛍光強度の比率を求めることにより行うことが可
能である。すなわち、細胞内のある任意の位置における
ＦＲＥＴの効率を求めるときには、その位置における、
ドナー色素の励起波長域の光を細胞に照射したときのド
ナーの蛍光波長域における蛍光強度（Ｉｄ値）とアクセ
プターの蛍光波長域における蛍光強度（Ｉａ値）を測定
し、Ｉｄ値とＩａ値の比率（Ｉａ／Ｉｄ）を求めればよ
い。Ｉａ／Ｉｄの値はＦＲＥＴの効率をあらわす。
【００２９】２つの波長域での蛍光像、すなわち、ドナ
ー色素の励起波長域の光を細胞に照射してドナーの蛍光
波長域において撮像した蛍光像（以下、ＤＤ像という）
とアクセプターの蛍光波長域において撮像した蛍光像
（以下、ＤＡ像という）を取得すれば、ＤＤ像とＤＡ像
とで画像間の割り算を行った像（ＤＡ／ＤＤ像、以下
「比画像」ともいう）を得ることにより、細胞内でのＦ
ＲＥＴのイメージングが可能となる。図面において、特
記のない場合、蛍光像は比画像を表わす。
ー色素の励起波長域の光を細胞に照射してドナーの蛍光
波長域において撮像した蛍光像（以下、ＤＤ像という）
とアクセプターの蛍光波長域において撮像した蛍光像
（以下、ＤＡ像という）を取得すれば、ＤＤ像とＤＡ像
とで画像間の割り算を行った像（ＤＡ／ＤＤ像、以下
「比画像」ともいう）を得ることにより、細胞内でのＦ
ＲＥＴのイメージングが可能となる。図面において、特
記のない場合、蛍光像は比画像を表わす。
【００３０】また、細胞内でのＦＲＥＴの測定は、蛍光
の時間分解測定によっても可能である。すなわち、ドナ
ー色素の励起波長域の光を細胞にパルス的に照射し、ド
ナーの蛍光波長域またはアクセプターの蛍光波長域にお
ける蛍光強度の減衰カーブを測定する。ＦＲＥＴがおき
るとドナーの蛍光減衰は速くなり、アクセプターの蛍光
減衰は遅くなる。顕微鏡下での蛍光減衰の速さの測定
は、例えば、時間ゲート機能付きのカメラを使用して、
蛍光減衰がおきている時間内に２つの測定時間域を設定
し、各時間域での蛍光強度を測定してその蛍光強度比を
求めることにより行うことができる。時間分解測定によ
り、ハイブリッド体形成を有効に検出するときには、使
用する蛍光標識オリゴヌクレオチドは特許PCT/JP97/034
38に開示されている条件を満たすものを使用すればよ
い。
の時間分解測定によっても可能である。すなわち、ドナ
ー色素の励起波長域の光を細胞にパルス的に照射し、ド
ナーの蛍光波長域またはアクセプターの蛍光波長域にお
ける蛍光強度の減衰カーブを測定する。ＦＲＥＴがおき
るとドナーの蛍光減衰は速くなり、アクセプターの蛍光
減衰は遅くなる。顕微鏡下での蛍光減衰の速さの測定
は、例えば、時間ゲート機能付きのカメラを使用して、
蛍光減衰がおきている時間内に２つの測定時間域を設定
し、各時間域での蛍光強度を測定してその蛍光強度比を
求めることにより行うことができる。時間分解測定によ
り、ハイブリッド体形成を有効に検出するときには、使
用する蛍光標識オリゴヌクレオチドは特許PCT/JP97/034
38に開示されている条件を満たすものを使用すればよ
い。
【００３１】以下、本発明の検出方法をさらに、詳細に
説明する。
説明する。
【００３２】（標的核酸）本発明の検出方法を用いて検
出可能な細胞質内核酸の種類には特に制限はなく、従来
のハイブリダイズ法で検出可能なすべての種類の核酸、
またはその誘導体を含むものである。具体的には、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡが挙げられる。特に、前記ＲＮＡにはｍＲＮ
Ａが含まれる。
出可能な細胞質内核酸の種類には特に制限はなく、従来
のハイブリダイズ法で検出可能なすべての種類の核酸、
またはその誘導体を含むものである。具体的には、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡが挙げられる。特に、前記ＲＮＡにはｍＲＮ
Ａが含まれる。
【００３３】さらに、本発明の検出方法を用いて検出可
能な標的核酸の有する構造にも特に制限はなく、従来の
ハイブリダイズ法が適用可能な構造を一部に有するもの
であればよい。すなわち、標的核酸の少なくとも一部の
塩基配列が知られているものである。また、塩基配列が
知られていない標的核酸についても、通常公知の種々の
塩基配列決定方法を用いて一部若しくは全部の塩基配列
を容易に決定することができる。かかる塩基配列に対し
て以下説明する検出用プローブが相補的にハイブリダイ
ズする。該塩基配列の塩基数には特に制限はなく、従来
のハイブリダイズ法で知られている条件を参照して容易
に選択することが可能である。
能な標的核酸の有する構造にも特に制限はなく、従来の
ハイブリダイズ法が適用可能な構造を一部に有するもの
であればよい。すなわち、標的核酸の少なくとも一部の
塩基配列が知られているものである。また、塩基配列が
知られていない標的核酸についても、通常公知の種々の
塩基配列決定方法を用いて一部若しくは全部の塩基配列
を容易に決定することができる。かかる塩基配列に対し
て以下説明する検出用プローブが相補的にハイブリダイ
ズする。該塩基配列の塩基数には特に制限はなく、従来
のハイブリダイズ法で知られている条件を参照して容易
に選択することが可能である。
【００３４】また、本発明の検出方法で検出可能な標的
核酸は、検出用プローブを細胞質内へ導入した際にすで
に細胞質内に存在するものに限定されない。検出用プロ
ーブを細胞質内へ導入した後に、細胞質内で生成され、
存在する核酸も検出可能である。
核酸は、検出用プローブを細胞質内へ導入した際にすで
に細胞質内に存在するものに限定されない。検出用プロ
ーブを細胞質内へ導入した後に、細胞質内で生成され、
存在する核酸も検出可能である。
【００３５】（検出用プローブ）本発明の検出方法で使
用可能な検出用プローブは少なくとも以下の特徴を有す
る。すなわち、(1)従来のハイブリダイズ法と同様に、
標的核酸の少なくとも一部の塩基配列とハイブリダイズ
可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド構造である
こと、(2)標的核酸とハイブリダイズして形成されるハ
イブリッド体のみを検出可能な標識分子を有すること、
(3)細胞核膜孔の透過を阻害する核膜透過阻害分子を有
すること、さらに好ましくは(4)核酸分解酵素による分
解反応を阻害する核酸分解酵素阻害分子を有することで
ある。従って、上記の特徴を有するオリゴヌクレオチド
プローブであれば特に制限なく使用可能である。以下、
これらの特徴をより詳しく説明する。
用可能な検出用プローブは少なくとも以下の特徴を有す
る。すなわち、(1)従来のハイブリダイズ法と同様に、
標的核酸の少なくとも一部の塩基配列とハイブリダイズ
可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド構造である
こと、(2)標的核酸とハイブリダイズして形成されるハ
イブリッド体のみを検出可能な標識分子を有すること、
(3)細胞核膜孔の透過を阻害する核膜透過阻害分子を有
すること、さらに好ましくは(4)核酸分解酵素による分
解反応を阻害する核酸分解酵素阻害分子を有することで
ある。従って、上記の特徴を有するオリゴヌクレオチド
プローブであれば特に制限なく使用可能である。以下、
これらの特徴をより詳しく説明する。
【００３６】（１）オリゴヌクレオチド構造 （ａ）上で説明した標的核酸の少なくとも一部の塩基配
列とハイブリダイズ可能な塩基配列の種類、また塩基数
については特に制限はなく、通常のハイブリダイズ法で
用いられる条件が好ましく適用できる。標的核酸の特定
の塩基配列に基づいてそれらと相補的な塩基配列を選択
することは容易である。さらに、ハイブリダイズ条件に
より上記相補性についても適宜選択することが可能であ
る。
列とハイブリダイズ可能な塩基配列の種類、また塩基数
については特に制限はなく、通常のハイブリダイズ法で
用いられる条件が好ましく適用できる。標的核酸の特定
の塩基配列に基づいてそれらと相補的な塩基配列を選択
することは容易である。さらに、ハイブリダイズ条件に
より上記相補性についても適宜選択することが可能であ
る。
【００３７】本発明の検出用プローブにおいては、試料
の温度や試料中に存在する標的核酸の濃度等により最適
のハイブリダイズ条件を設定し、それに基づいて塩基数
を選択すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドプロー
ブと標的ＲＮＡとで形成されるハイブリッド体の融点
は、プローブの塩基数が増すほど上昇する。室温では、
プローブの塩基数が１５あれば十分に高い効率でハイブ
リッド体が形成されるが、３７℃ではハイブリッドの形
成率は低い。従って、３７℃で検出を行うためには２０
塩基以上の長さをもつオリゴヌクレオチドをプローブと
して使用することが望ましい。一方、オリゴヌクレオチ
ドプローブの塩基数が長くなるほど、標的ＲＮＡとハイ
ブリッドを形成する反応速度は遅くなる。例えば、室温
において、２０塩基のＤＮＡプローブと標的ＲＮＡとの
ハイブリダイゼーション反応が終了するのに要する時間
は、１５塩基のＤＮＡプローブを使用したときと比べて
数倍長い。これらの要件から、使用するオリゴヌクレオ
チドプローブの塩基数は、１０−５０塩基の範囲である
ことが好ましく、より好ましくは１５−２０塩基の範囲
である。かかる範囲より塩基数が少ない場合は十分安定
なハイブリッド体を形成することが困難となり、またか
かる範囲より多い場合には検出用プローブの調製、安定
性、ハイブリッド形成に要する時間の点で問題となる場
合がある。また、検出用プローブと標的ＲＮＡとの塩基
配列の相補性については、最も好ましくは完全な相補性
を有する配列である。塩基配列が一部相補性をもたない
検出用オリゴヌクレオチドプローブは、標的ＲＮＡとの
ハイブリッド体の融点が完全相補性のものよりも下が
る。
の温度や試料中に存在する標的核酸の濃度等により最適
のハイブリダイズ条件を設定し、それに基づいて塩基数
を選択すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドプロー
ブと標的ＲＮＡとで形成されるハイブリッド体の融点
は、プローブの塩基数が増すほど上昇する。室温では、
プローブの塩基数が１５あれば十分に高い効率でハイブ
リッド体が形成されるが、３７℃ではハイブリッドの形
成率は低い。従って、３７℃で検出を行うためには２０
塩基以上の長さをもつオリゴヌクレオチドをプローブと
して使用することが望ましい。一方、オリゴヌクレオチ
ドプローブの塩基数が長くなるほど、標的ＲＮＡとハイ
ブリッドを形成する反応速度は遅くなる。例えば、室温
において、２０塩基のＤＮＡプローブと標的ＲＮＡとの
ハイブリダイゼーション反応が終了するのに要する時間
は、１５塩基のＤＮＡプローブを使用したときと比べて
数倍長い。これらの要件から、使用するオリゴヌクレオ
チドプローブの塩基数は、１０−５０塩基の範囲である
ことが好ましく、より好ましくは１５−２０塩基の範囲
である。かかる範囲より塩基数が少ない場合は十分安定
なハイブリッド体を形成することが困難となり、またか
かる範囲より多い場合には検出用プローブの調製、安定
性、ハイブリッド形成に要する時間の点で問題となる場
合がある。また、検出用プローブと標的ＲＮＡとの塩基
配列の相補性については、最も好ましくは完全な相補性
を有する配列である。塩基配列が一部相補性をもたない
検出用オリゴヌクレオチドプローブは、標的ＲＮＡとの
ハイブリッド体の融点が完全相補性のものよりも下が
る。
【００３８】（ｂ）、（ａ）で説明した塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチド構造を有する検出用プローブの他
の構造についても特に制限はない。
るオリゴヌクレオチド構造を有する検出用プローブの他
の構造についても特に制限はない。
【００３９】（ｃ）検出用プローブは、必要ならば標的
核酸の複数の位置でハイブリッド体を形成するように使
用することも可能である。例えば標的核酸の末端付近の
位置、中間付近の位置、若しくは他の末端付近の位置等
である。
核酸の複数の位置でハイブリッド体を形成するように使
用することも可能である。例えば標的核酸の末端付近の
位置、中間付近の位置、若しくは他の末端付近の位置等
である。
【００４０】（２）標識分子 本発明の検出方法は、標的核酸と検出用プローブとのハ
イブリッド体を検出することにより細胞質内の標的核酸
を検出するものである。また、本発明においては、特に
生細胞の細胞質内に存在する標的核酸を検出可能とする
ものであることから、生成するハイブリッド体を分離す
ることなく、ハイブリッド体のみ検出可能とすることが
好ましい。従って、ハイブリッド体を検出するための標
識分子は、標的核酸に隣接してハイブリッドすることに
よりのみ生じる現象を利用したものであることが好まし
い。かかる現象については特に制限はなく、従来公知の
種々の現象が利用できる。特に本発明においては、高い
検出感度、および容易な測定手段等の観点から蛍光現象
を利用することが好ましい。具体的には、ハイブリッド
することによりのみ生じる蛍光現象として、ＦＲＥＴの
現象を利用したものであることが好ましい。かかる蛍光
による標識は１組の一本鎖のオリゴヌクレオチドプロー
ブに、エネルギードナー蛍光色素と、エネルギーアクセ
プター蛍光色素を標識することにより可能となる。ここ
でＦＲＥＴが可能なドナー分子と、アクセプター分子と
しては特に制限されないが、すでに知られた蛍光色素の
組み合わせを適宜選択することは当業者にとり容易であ
る。具体的には、ドナーとしてはBodipy系（4,4-difluo
ro-4-bora-3a,4a-diaza-S-indacene, Molecular Probes
Inc.)、フルオレセイン系、ローダミン系の蛍光色素が
挙げられ、またアクセプターとしてはインドシアニン
系、ローダミン系が挙げられる。特に本発明において好
ましく使用可能なドナー／アクセプター分子の組み合わ
せとしては、Bodipy系／インドシアニン系が挙げられ
る。特に、好ましい個別の蛍光色素は、ドナーとしてBo
dipy493/503であり、アクセプターとしてCy5である。こ
れは前者の蛍光スペクトルと後者の蛍光スペクトルが波
長の上で、ほぼ分離されているからである。
イブリッド体を検出することにより細胞質内の標的核酸
を検出するものである。また、本発明においては、特に
生細胞の細胞質内に存在する標的核酸を検出可能とする
ものであることから、生成するハイブリッド体を分離す
ることなく、ハイブリッド体のみ検出可能とすることが
好ましい。従って、ハイブリッド体を検出するための標
識分子は、標的核酸に隣接してハイブリッドすることに
よりのみ生じる現象を利用したものであることが好まし
い。かかる現象については特に制限はなく、従来公知の
種々の現象が利用できる。特に本発明においては、高い
検出感度、および容易な測定手段等の観点から蛍光現象
を利用することが好ましい。具体的には、ハイブリッド
することによりのみ生じる蛍光現象として、ＦＲＥＴの
現象を利用したものであることが好ましい。かかる蛍光
による標識は１組の一本鎖のオリゴヌクレオチドプロー
ブに、エネルギードナー蛍光色素と、エネルギーアクセ
プター蛍光色素を標識することにより可能となる。ここ
でＦＲＥＴが可能なドナー分子と、アクセプター分子と
しては特に制限されないが、すでに知られた蛍光色素の
組み合わせを適宜選択することは当業者にとり容易であ
る。具体的には、ドナーとしてはBodipy系（4,4-difluo
ro-4-bora-3a,4a-diaza-S-indacene, Molecular Probes
Inc.)、フルオレセイン系、ローダミン系の蛍光色素が
挙げられ、またアクセプターとしてはインドシアニン
系、ローダミン系が挙げられる。特に本発明において好
ましく使用可能なドナー／アクセプター分子の組み合わ
せとしては、Bodipy系／インドシアニン系が挙げられ
る。特に、好ましい個別の蛍光色素は、ドナーとしてBo
dipy493/503であり、アクセプターとしてCy5である。こ
れは前者の蛍光スペクトルと後者の蛍光スペクトルが波
長の上で、ほぼ分離されているからである。
【００４１】（３）核膜透過阻害分子 上記（２）で説明した検出用プローブは、細胞内で容易
に細胞核膜孔を通じて細胞核内へ透過することを阻害す
る分子を有する。特に、拡散による核膜孔透過を阻害す
る分子として、核膜孔のサイズに基づいて十分大きな分
子を選択することができる。さらに、核膜透過阻害分子
の構成成分についても特に制限はなく、種々の生体成
分、合成成分が使用可能である。生体成分または生体成
分に基づくものとしては、たんぱく質、デキストランが
挙げられ、また合成成分としては、種々の成分からなる
ビーズ、金属粒子（例えば、金コロイド）が挙げられ
る。
に細胞核膜孔を通じて細胞核内へ透過することを阻害す
る分子を有する。特に、拡散による核膜孔透過を阻害す
る分子として、核膜孔のサイズに基づいて十分大きな分
子を選択することができる。さらに、核膜透過阻害分子
の構成成分についても特に制限はなく、種々の生体成
分、合成成分が使用可能である。生体成分または生体成
分に基づくものとしては、たんぱく質、デキストランが
挙げられ、また合成成分としては、種々の成分からなる
ビーズ、金属粒子（例えば、金コロイド）が挙げられ
る。
【００４２】また、核膜透過阻害分子を（１）で説明し
たオリゴヌクレオチドに結合する方法についても特に制
限はなく、通常公知の結合方法が適用可能である。例え
ば核膜透過阻害分子としてたんぱく質を選択する場合に
は該タンパク質内のアミノ酸残基（アミノ基、カルボン
酸基等）との反応により結合することが好ましい。ま
た、アビジンやストレプトアビジンとビオチンとの特異
的結合を利用してもよい。すなわち、オリゴヌクレオチ
ドの一端若しくは鎖内にビオチンを取り込ませたものを
合成し、これとアビジンまたはストレプトアビジンを混
合させる。この操作によりビオチンを含むオリゴヌクレ
オチドとアビジンまたはストレプトアビジンが結合す
る。ビオチンを含むオリゴヌクレオチドはＤＮＡ合成機
で容易に合成することが可能である。さらに、適当な長
さのリンカーを介して核膜透過阻害分子をオリゴヌクレ
オチドに結合する。かかるリンカーとしてはオリゴヌク
レオチド誘導体、オリゴペプチドが挙げられる。
たオリゴヌクレオチドに結合する方法についても特に制
限はなく、通常公知の結合方法が適用可能である。例え
ば核膜透過阻害分子としてたんぱく質を選択する場合に
は該タンパク質内のアミノ酸残基（アミノ基、カルボン
酸基等）との反応により結合することが好ましい。ま
た、アビジンやストレプトアビジンとビオチンとの特異
的結合を利用してもよい。すなわち、オリゴヌクレオチ
ドの一端若しくは鎖内にビオチンを取り込ませたものを
合成し、これとアビジンまたはストレプトアビジンを混
合させる。この操作によりビオチンを含むオリゴヌクレ
オチドとアビジンまたはストレプトアビジンが結合す
る。ビオチンを含むオリゴヌクレオチドはＤＮＡ合成機
で容易に合成することが可能である。さらに、適当な長
さのリンカーを介して核膜透過阻害分子をオリゴヌクレ
オチドに結合する。かかるリンカーとしてはオリゴヌク
レオチド誘導体、オリゴペプチドが挙げられる。
【００４３】（４）核酸分解酵素阻害分子 （２）説明した検出用プローブは、核酸分解酵素による
分解反応を阻害する核酸分解酵素阻害分子を有するが好
ましい。前記阻害作用については特に制限はないが、本
発明においては特に基質の立体障害に基づき酵素の基質
結合サイトへの基質の接近を阻害するような分子が好適
に使用される。さらに、核酸分解酵素阻害分子の構成成
分についても特に制限はなく、種々の生体成分、合成成
分が使用可能である。生体成分または生体成分に基づく
ものとしては、たんぱく質、デキストランが挙げられ、
また合成成分としては、種々の成分からなるビーズ、金
属粒子（例えば、金コロイド）が挙げられる。
分解反応を阻害する核酸分解酵素阻害分子を有するが好
ましい。前記阻害作用については特に制限はないが、本
発明においては特に基質の立体障害に基づき酵素の基質
結合サイトへの基質の接近を阻害するような分子が好適
に使用される。さらに、核酸分解酵素阻害分子の構成成
分についても特に制限はなく、種々の生体成分、合成成
分が使用可能である。生体成分または生体成分に基づく
ものとしては、たんぱく質、デキストランが挙げられ、
また合成成分としては、種々の成分からなるビーズ、金
属粒子（例えば、金コロイド）が挙げられる。
【００４４】また、核酸分解酵素阻害分子を（１）で説
明したオリゴヌクレオチドに結合する方法についても特
に制限はなく、通常公知の結合方法が適用可能である。
例えば、核酸分解酵素阻害分子としてたんぱく質を選択
する場合には該たんぱく質内のァミノ酸残基（アミノ
基、カルボン酸基等）との反応により結合することが好
ましい。また、アビジンやストレプトアビジンとビオチ
ンとの特異的結合を利用してもよい。すなわち、オリゴ
ヌクレオチドの一端もしくは鎖内にビオチンを取り込ま
せたものを合成し、これとアビジンまたはストレプトア
ビジンを混合させる。この操作によりビオチンを含むオ
リゴヌクレオチドとアビジンまたはストレプトアビジン
が結合する。ビオチンを含むオリゴヌクレオチドはＤＮ
Ａ合成機で容易に合成することが可能である。さらに、
必要な場合、適当な長さのリンカーを介して結合しても
よい。かかるリンカーとしてはオリゴヌクレオチド誘導
体、オリゴペプチドが挙げられる。また、ここでオリゴ
ヌクレオチドにはＤ−オリゴ（デオキシオリゴヌクレオ
チド）、Ｓ−オリゴが含まれる。
明したオリゴヌクレオチドに結合する方法についても特
に制限はなく、通常公知の結合方法が適用可能である。
例えば、核酸分解酵素阻害分子としてたんぱく質を選択
する場合には該たんぱく質内のァミノ酸残基（アミノ
基、カルボン酸基等）との反応により結合することが好
ましい。また、アビジンやストレプトアビジンとビオチ
ンとの特異的結合を利用してもよい。すなわち、オリゴ
ヌクレオチドの一端もしくは鎖内にビオチンを取り込ま
せたものを合成し、これとアビジンまたはストレプトア
ビジンを混合させる。この操作によりビオチンを含むオ
リゴヌクレオチドとアビジンまたはストレプトアビジン
が結合する。ビオチンを含むオリゴヌクレオチドはＤＮ
Ａ合成機で容易に合成することが可能である。さらに、
必要な場合、適当な長さのリンカーを介して結合しても
よい。かかるリンカーとしてはオリゴヌクレオチド誘導
体、オリゴペプチドが挙げられる。また、ここでオリゴ
ヌクレオチドにはＤ−オリゴ（デオキシオリゴヌクレオ
チド）、Ｓ−オリゴが含まれる。
【００４５】さらに、本発明においては特に、上で説明
した核膜透過阻害分子が同時に核酸分解酵素阻害分子で
もあることが好ましい。すなわち、核膜透過阻害分子が
検出用プローブの細胞核膜孔透過を阻害すると同時に、
検出用プローブ自体または検出用プローブと標的核酸と
のハイブリッド体の酵素による分解を阻害するものであ
る。かかる場合、これらの２つの阻害作用が有効に作用
する核膜透過阻害分子（同時に核酸分解酵素阻害分子）
は適当な種類、長さのリンカーを有することが好まし
い。リンカーの種類としては、具体的にはオリゴヌクレ
オチド、オリゴペプチドが挙げられ、特にオリゴヌクレ
オチドが好ましい。また、リンカーの長さがあまり長い
と酵素反応を阻害する立体障害を生じないことから、約
２０塩基より短いことが好ましい。一方、あまりにリン
カーが短い場合には、その立体障害により標的核酸と安
定なハイブリッド体形成が阻害されることとなる。従っ
て、好ましいリンカーの種類および長さは、立体分子模
型、分子モデル計算プログラム等から適宜選択すること
が可能である。
した核膜透過阻害分子が同時に核酸分解酵素阻害分子で
もあることが好ましい。すなわち、核膜透過阻害分子が
検出用プローブの細胞核膜孔透過を阻害すると同時に、
検出用プローブ自体または検出用プローブと標的核酸と
のハイブリッド体の酵素による分解を阻害するものであ
る。かかる場合、これらの２つの阻害作用が有効に作用
する核膜透過阻害分子（同時に核酸分解酵素阻害分子）
は適当な種類、長さのリンカーを有することが好まし
い。リンカーの種類としては、具体的にはオリゴヌクレ
オチド、オリゴペプチドが挙げられ、特にオリゴヌクレ
オチドが好ましい。また、リンカーの長さがあまり長い
と酵素反応を阻害する立体障害を生じないことから、約
２０塩基より短いことが好ましい。一方、あまりにリン
カーが短い場合には、その立体障害により標的核酸と安
定なハイブリッド体形成が阻害されることとなる。従っ
て、好ましいリンカーの種類および長さは、立体分子模
型、分子モデル計算プログラム等から適宜選択すること
が可能である。
【００４６】（検出方法）本発明の検出方法の一つの好
適な実施の形態に従えば、上で説明した検出用プローブ
を細胞質内へ導入し、標的核酸とハイブリダイズさせて
ハイブリッド体を形成した際、プローブに結合したドナ
ー蛍光色素の励起光を照射することにより生じるＦＲＥ
Ｔに基づくアクセプター蛍光色素からの蛍光を観測す
る。すなわち、ハイブリッド体を形成していない検出用
プローブのドナー蛍光色素も同時に励起されるが、ハイ
ブリッド体を形成していない検出用プローブのアクセプ
ター蛍光色素との間ではＦＲＥＴが生じないため、アク
セプター蛍光色素からの蛍光は観測されない。従って、
アクセプター蛍光色素からの蛍光は、ハイブリッド体の
存在を意味し、また、標的核酸の存在をも意味すること
となる。
適な実施の形態に従えば、上で説明した検出用プローブ
を細胞質内へ導入し、標的核酸とハイブリダイズさせて
ハイブリッド体を形成した際、プローブに結合したドナ
ー蛍光色素の励起光を照射することにより生じるＦＲＥ
Ｔに基づくアクセプター蛍光色素からの蛍光を観測す
る。すなわち、ハイブリッド体を形成していない検出用
プローブのドナー蛍光色素も同時に励起されるが、ハイ
ブリッド体を形成していない検出用プローブのアクセプ
ター蛍光色素との間ではＦＲＥＴが生じないため、アク
セプター蛍光色素からの蛍光は観測されない。従って、
アクセプター蛍光色素からの蛍光は、ハイブリッド体の
存在を意味し、また、標的核酸の存在をも意味すること
となる。
【００４７】さらに、本発明の検出方法に使用される検
出装置には特に制限はなく、ドナー蛍光色素を励起し、
かつアクセプター蛍光色素の蛍光を測定できるものであ
ればよい。具体的には蛍光顕微鏡の使用が挙げられる。
また、測定方法としても特に制限されず、蛍光強度測定
に基づく方法、または時間分解測定に基づく方法が挙げ
られる。
出装置には特に制限はなく、ドナー蛍光色素を励起し、
かつアクセプター蛍光色素の蛍光を測定できるものであ
ればよい。具体的には蛍光顕微鏡の使用が挙げられる。
また、測定方法としても特に制限されず、蛍光強度測定
に基づく方法、または時間分解測定に基づく方法が挙げ
られる。
【００４８】また、検出用プローブの細胞質内への導入
方法についても特に制限はなく公知の導入方法が使用可
能である。具体的にはマイクロインジェクション、リポ
フェクトアミン等のトランスフェクション試薬を担体と
した導入方法が挙げられる。
方法についても特に制限はなく公知の導入方法が使用可
能である。具体的にはマイクロインジェクション、リポ
フェクトアミン等のトランスフェクション試薬を担体と
した導入方法が挙げられる。
【００４９】以下、実際にヒトc-fos遺伝子のｍＲＮＡ
をＣｏｓ７細胞において検出した実施例に基づいて本発
明の検出方法をさらに詳細に説明するが、本発明はこの
実施例に制限されることはない。ここで、蛍光色素は、
ドナーとしてBodipy493/503を、またアクセプターとし
てCy5の組み合わせを使用した。
をＣｏｓ７細胞において検出した実施例に基づいて本発
明の検出方法をさらに詳細に説明するが、本発明はこの
実施例に制限されることはない。ここで、蛍光色素は、
ドナーとしてBodipy493/503を、またアクセプターとし
てCy5の組み合わせを使用した。
【００５０】
【実施例】（製造例１）蛍光標識オリゴデオキシヌクレ
オチドプローブの作製 １．c-fos mRNAの２次構造予測 ＤＮＡＳＩＳデータベース（日立ソフトエアーエンジニ
アリング）からヒトc-fos cDNAの塩基配列を検索した。
その塩基配列に、ポリＡテールを付加して、c-fos mRNA
の配列とした。この配列に対してＤＮＡＳＩＳソフトウ
エアー（日立ソフトエアーエンジニアリング）を用い
て、c-fos mRNAの２次構造のシミュレーションを行っ
た。得られた２次構造図において、ループ構造（一本鎖
構造）をとっている領域を４か所選択し、それぞれの領
域についてループ構造を含む40 merの部位を選択した。
これらは、それぞれ塩基番号２０６−２４５、６５７−
６９６、８９８−９３７、１６５９−１６９８の部位で
ある。
オチドプローブの作製 １．c-fos mRNAの２次構造予測 ＤＮＡＳＩＳデータベース（日立ソフトエアーエンジニ
アリング）からヒトc-fos cDNAの塩基配列を検索した。
その塩基配列に、ポリＡテールを付加して、c-fos mRNA
の配列とした。この配列に対してＤＮＡＳＩＳソフトウ
エアー（日立ソフトエアーエンジニアリング）を用い
て、c-fos mRNAの２次構造のシミュレーションを行っ
た。得られた２次構造図において、ループ構造（一本鎖
構造）をとっている領域を４か所選択し、それぞれの領
域についてループ構造を含む40 merの部位を選択した。
これらは、それぞれ塩基番号２０６−２４５、６５７−
６９６、８９８−９３７、１６５９−１６９８の部位で
ある。
【００５１】２．オリゴデオキシヌクレオチドの合成 選択した４か所の部位について、それぞれを20 merの２
つの領域に分割し、それぞれの配列に相補的な塩基配列
をもつオリゴデオキシヌクレオチド（オリゴＤＮＡ）を
合成した。 Ｄ１：２０６−２２５に相補的な配列をもつオリゴＤＮ
Ａ ５'−ＸＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＣＧＧＴＴＡ−
３' Ａ１：２２６−２４５に相補的な配列をもつオリゴＤＮ
Ａ ５'−ＴＡＧＴＣＴＧＣＧＴＴＧＡＡＧＣＹＣＣＧＡ−
３ ' Ｄ２：６５７−６７６に相補的な配列をもつオリゴＤＮ
Ａ ５'−ＸＴＣＴＡＧＴＴＧＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣ−
３' Ａ２：６７７−６９６に相補的な配列をもつオリゴＤＮ
Ａ ５'−ＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＹＡＴＣＴ−
３' Ｄ３：８９８−９１７に相補的な配列をもつオリゴＤＮ
Ａ ５'−ＸＴＣＣＧＧＧＧＴＧＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧ−
３' Ａ３：９１８−９３７に相補的な配列をもつオリゴＤＮ
Ａ ５'−ＧＧＧＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣＹＡＧＡＣ−
３' Ｄ４：１６５９−１６７８に相補的な配列をもつオリゴ
ＤＮＡ ５'−ＸＡＡＧＧＡＣＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡ−
３' Ａ４：１６７９−１６９８に相補的な配列をもつオリゴ
ＤＮＡ ５'−ＡＧＡＴＴＡＧＴＴＡＡＴＧＣＴＡＹＴＧＡＧ−
３'
つの領域に分割し、それぞれの配列に相補的な塩基配列
をもつオリゴデオキシヌクレオチド（オリゴＤＮＡ）を
合成した。 Ｄ１：２０６−２２５に相補的な配列をもつオリゴＤＮ
Ａ ５'−ＸＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＣＧＧＴＴＡ−
３' Ａ１：２２６−２４５に相補的な配列をもつオリゴＤＮ
Ａ ５'−ＴＡＧＴＣＴＧＣＧＴＴＧＡＡＧＣＹＣＣＧＡ−
３ ' Ｄ２：６５７−６７６に相補的な配列をもつオリゴＤＮ
Ａ ５'−ＸＴＣＴＡＧＴＴＧＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣ−
３' Ａ２：６７７−６９６に相補的な配列をもつオリゴＤＮ
Ａ ５'−ＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＹＡＴＣＴ−
３' Ｄ３：８９８−９１７に相補的な配列をもつオリゴＤＮ
Ａ ５'−ＸＴＣＣＧＧＧＧＴＧＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧ−
３' Ａ３：９１８−９３７に相補的な配列をもつオリゴＤＮ
Ａ ５'−ＧＧＧＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣＹＡＧＡＣ−
３' Ｄ４：１６５９−１６７８に相補的な配列をもつオリゴ
ＤＮＡ ５'−ＸＡＡＧＧＡＣＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡ−
３' Ａ４：１６７９−１６９８に相補的な配列をもつオリゴ
ＤＮＡ ５'−ＡＧＡＴＴＡＧＴＴＡＡＴＧＣＴＡＹＴＧＡＧ−
３'
【００５２】これらのオリゴＤＮＡの合成は、Perkin E
lmer社：モデル３９４、またはPerspective社：Expepti
de Model 8909を使用して、ベータシアノエチルアミダ
イト法に従い合成した。ここで、「Ｘ」は、６−（トリ
フルオロアセチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチ
ル）−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイ
ト（ＴＦＡｃヘキサノールアミンリンカー、パーキンエ
ルマージャパン：CatNo.400808）を、「Ｙ」は、Uni-Li
nk AminoModifier（CLONTECH， Code No.CL5190-1）を
表す。
lmer社：モデル３９４、またはPerspective社：Expepti
de Model 8909を使用して、ベータシアノエチルアミダ
イト法に従い合成した。ここで、「Ｘ」は、６−（トリ
フルオロアセチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチ
ル）−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイ
ト（ＴＦＡｃヘキサノールアミンリンカー、パーキンエ
ルマージャパン：CatNo.400808）を、「Ｙ」は、Uni-Li
nk AminoModifier（CLONTECH， Code No.CL5190-1）を
表す。
【００５３】得られた粗生成物をＤＥＡＥ−ＨＰＬＣで
分析し、主成分を分取した。保持時間は２０−３０分で
あった。さらに、分取液を脱塩の後、凍結乾燥した。 ＤＥＡＥ−ＨＰＬＣ（陰イオン交換）条件： 溶媒Ａ：０.２Ｍ ＨＣＯＯＮＨ4，２０％ＣＨ3ＣＮ 溶媒Ｂ：１.０Ｍ ＨＣＯＯＮＨ4，２０％ＣＨ3ＣＮ カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌＤＥＡＥ−２ＷＳ：４.６ｘ２
５０ｍｍ（東ソー） 流量：０.８ｍｌ／ｍｉｎ 温度：４０℃ Ｂグラジエント：３５−８５％（２０ｍｉｎ）
分析し、主成分を分取した。保持時間は２０−３０分で
あった。さらに、分取液を脱塩の後、凍結乾燥した。 ＤＥＡＥ−ＨＰＬＣ（陰イオン交換）条件： 溶媒Ａ：０.２Ｍ ＨＣＯＯＮＨ4，２０％ＣＨ3ＣＮ 溶媒Ｂ：１.０Ｍ ＨＣＯＯＮＨ4，２０％ＣＨ3ＣＮ カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌＤＥＡＥ−２ＷＳ：４.６ｘ２
５０ｍｍ（東ソー） 流量：０.８ｍｌ／ｍｉｎ 温度：４０℃ Ｂグラジエント：３５−８５％（２０ｍｉｎ）
【００５４】３．オリゴデオキシヌクレオチドの蛍光標
識 ３−１．Bodipy493/503の標識 Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４のオリゴＤＮＡの「Ｘ」にそれ
ぞれ蛍光色素Bodipy493/503を以下の方法で結合した。
Ｎ−ヒドロキシサルフォサクシニミドナトリウム塩２.
５ｍｇを３０μｌの滅菌水に、１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）−カルボジミドヒドロクロラ
イド５ｍｇを５０μｌの滅菌水にそれぞれ溶解した。Bo
dipy493/503プロピオン酸（Molecular Probes）１ｍｇ
を５０μｌＤＭＦに溶解したものを混合し、室温で３０
分間反応させた。得られた溶液を、乾固したオリゴＤＮ
Ａを０.５Ｍ ＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ
９.０）３００μｌに溶解したものと混合し、遮光して
一晩反応させた。反応液をゲルろ過し、未反応の色素を
除去した。逆相−ＨＰＬＣで分析し、２５−３５分のピ
ークを分取した。 逆相−ＨＰＬＣ条件 溶媒Ａ：０.０５Ｍ ＴＥＡＡ（triethylammonium aceta
te），５％ＣＨ3ＣＮ 溶媒Ｂ：０.０５Ｍ ＴＥＡＡ，４０％ＣＨ3ＣＮ カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫＣ１８６ｘ２５０ｍｍ
（資生堂） 流量：１.０ｍｌ／ｍｉｎ 温度：４０℃ Ｂグラジエント３０−８０％（２０分）
識 ３−１．Bodipy493/503の標識 Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４のオリゴＤＮＡの「Ｘ」にそれ
ぞれ蛍光色素Bodipy493/503を以下の方法で結合した。
Ｎ−ヒドロキシサルフォサクシニミドナトリウム塩２.
５ｍｇを３０μｌの滅菌水に、１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）−カルボジミドヒドロクロラ
イド５ｍｇを５０μｌの滅菌水にそれぞれ溶解した。Bo
dipy493/503プロピオン酸（Molecular Probes）１ｍｇ
を５０μｌＤＭＦに溶解したものを混合し、室温で３０
分間反応させた。得られた溶液を、乾固したオリゴＤＮ
Ａを０.５Ｍ ＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ
９.０）３００μｌに溶解したものと混合し、遮光して
一晩反応させた。反応液をゲルろ過し、未反応の色素を
除去した。逆相−ＨＰＬＣで分析し、２５−３５分のピ
ークを分取した。 逆相−ＨＰＬＣ条件 溶媒Ａ：０.０５Ｍ ＴＥＡＡ（triethylammonium aceta
te），５％ＣＨ3ＣＮ 溶媒Ｂ：０.０５Ｍ ＴＥＡＡ，４０％ＣＨ3ＣＮ カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫＣ１８６ｘ２５０ｍｍ
（資生堂） 流量：１.０ｍｌ／ｍｉｎ 温度：４０℃ Ｂグラジエント３０−８０％（２０分）
【００５５】これらは凍結乾燥して保存した。使用直前
にＤＥＰＣ（diethyl pyrocarbonate）水に溶解させた
後、１ｘＳＳＣ溶液に希釈して吸収スペクトルを測定し
た。２６０ｎｍの吸収値と５０４ｎｍの吸収値の比率よ
り、Bodipy493/503の標識率（Bodipy493/503／オリゴＤ
ＮＡ）を求めた。Bodipy493/503／オリゴＤＮＡ＝０.８
−０.９（モル比）であった。
にＤＥＰＣ（diethyl pyrocarbonate）水に溶解させた
後、１ｘＳＳＣ溶液に希釈して吸収スペクトルを測定し
た。２６０ｎｍの吸収値と５０４ｎｍの吸収値の比率よ
り、Bodipy493/503の標識率（Bodipy493/503／オリゴＤ
ＮＡ）を求めた。Bodipy493/503／オリゴＤＮＡ＝０.８
−０.９（モル比）であった。
【００５６】得られたBodipy493/503標識オリゴＤＮＡ
はそれぞれ以下のものである。 D1F：５'−(Bodipy493/503)ＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＧＴ
ＧＧＣＧＧＴＴＡ−３' D2F：５'−(Bodipy493/503)ＴＣＴＡＧＴＴＧＧＴＣＴ
ＧＴＣＴＣＣＧＣ−３' D3Ｆ：５'−(Bodipy493/503)ＴＣＣＧＧＧＧＴＧＧＣＡ
ＡＣＣＴＣＴＧＧ−３' D4Ｆ：５'−(Bodipy493/503)ＡＡＧＧＡＣＴＡＡＧＧＡ
ＧＡＡＡＧＡＧＡ−３'
はそれぞれ以下のものである。 D1F：５'−(Bodipy493/503)ＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＧＴ
ＧＧＣＧＧＴＴＡ−３' D2F：５'−(Bodipy493/503)ＴＣＴＡＧＴＴＧＧＴＣＴ
ＧＴＣＴＣＣＧＣ−３' D3Ｆ：５'−(Bodipy493/503)ＴＣＣＧＧＧＧＴＧＧＣＡ
ＡＣＣＴＣＴＧＧ−３' D4Ｆ：５'−(Bodipy493/503)ＡＡＧＧＡＣＴＡＡＧＧＡ
ＧＡＡＡＧＡＧＡ−３'
【００５７】３−２．Cy5の標識 Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４のオリゴＤＮＡの「Ｙ」に、Ｃ
ｙ５を以下の方法で結合した。FluoroLink Cy5 Mono Re
active Dye (Amersham Pharmacia Biotech)を滅菌水１
００μｌに溶解し、これを２００μｌの０.５Ｍ ＮａＨ
ＣＯ3／Ｎａ2ＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ９.０）に溶解させた
オリゴＤＮＡと混合して、遮光して一晩反応させた。反
応液をゲルろ過して未反応のＣｙ５を除いた後、逆相−
ＨＰＬＣで分析し、２０−２５分のピークを分取した。 逆相−ＨＰＬＣ条件 溶媒Ａ：０.０５Ｍ ＴＥＡＡ，５％ＣＨ3ＣＮ 溶媒Ｂ：０.０５Ｍ ＴＥＡＡ，４０％ＣＨ3ＣＮ カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫＣ１８６ｘ２５０ｍｍ
（資生堂） 流量：１.０ｍｌ／ｍｉｎ 温度：４０℃ Ｂグラジエント１５−６５％（２０分）
ｙ５を以下の方法で結合した。FluoroLink Cy5 Mono Re
active Dye (Amersham Pharmacia Biotech)を滅菌水１
００μｌに溶解し、これを２００μｌの０.５Ｍ ＮａＨ
ＣＯ3／Ｎａ2ＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ９.０）に溶解させた
オリゴＤＮＡと混合して、遮光して一晩反応させた。反
応液をゲルろ過して未反応のＣｙ５を除いた後、逆相−
ＨＰＬＣで分析し、２０−２５分のピークを分取した。 逆相−ＨＰＬＣ条件 溶媒Ａ：０.０５Ｍ ＴＥＡＡ，５％ＣＨ3ＣＮ 溶媒Ｂ：０.０５Ｍ ＴＥＡＡ，４０％ＣＨ3ＣＮ カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫＣ１８６ｘ２５０ｍｍ
（資生堂） 流量：１.０ｍｌ／ｍｉｎ 温度：４０℃ Ｂグラジエント１５−６５％（２０分）
【００５８】これらは凍結乾燥して保存した。使用直前
にＤＥＰＣ水に溶解させた後、１ｘＳＳ緩衝液に希釈し
て吸収スペクトルを測定した。２６０ｎｍの吸収値と６
４９ｎｍの吸収値の比率より、Ｃｙ５の標識率（Ｃｙ５
／オリゴＤＮＡ）を求めた。Ｃｙ５／オリゴＤＮＡ＝
０.９−１.０（モル比）であった。
にＤＥＰＣ水に溶解させた後、１ｘＳＳ緩衝液に希釈し
て吸収スペクトルを測定した。２６０ｎｍの吸収値と６
４９ｎｍの吸収値の比率より、Ｃｙ５の標識率（Ｃｙ５
／オリゴＤＮＡ）を求めた。Ｃｙ５／オリゴＤＮＡ＝
０.９−１.０（モル比）であった。
【００５９】得られたＣｙ５標識オリゴＤＮＡはそれぞ
れ以下のものである。 Ａ１Ｆ：５'−ＴＡＧＴＣＴＧＣＧＴＴＧＡＡＧＣ(Ｃｙ
５)ＣＣＧＡ−３' Ａ２Ｆ：５'−ＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣ (Ｃ
ｙ５)ＡＴＣＴ−３' Ａ３Ｆ：５'−ＧＧＧＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣ (Ｃ
ｙ５)ＡＧＡＣ−３' Ａ４Ｆ：５'−ＡＧＡＴＴＡＧＴＴＡＡＴＧＣＴＡ (Ｃ
ｙ５)ＴＧＡＧ−３'
れ以下のものである。 Ａ１Ｆ：５'−ＴＡＧＴＣＴＧＣＧＴＴＧＡＡＧＣ(Ｃｙ
５)ＣＣＧＡ−３' Ａ２Ｆ：５'−ＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣ (Ｃ
ｙ５)ＡＴＣＴ−３' Ａ３Ｆ：５'−ＧＧＧＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣ (Ｃ
ｙ５)ＡＧＡＣ−３' Ａ４Ｆ：５'−ＡＧＡＴＴＡＧＴＴＡＡＴＧＣＴＡ (Ｃ
ｙ５)ＴＧＡＧ−３'
【００６０】（製造例２）c-fos RNAの合成 c-fos RNAをin vitro転写反応により合成した。ヒトc-f
os DNAを、c-fosの全長cDNAが組み込まれたpSPTプラス
ミド（pSPT-cFos）として、理研ジーンバンクより入手
した。このpSPT-cFosを制限酵素EcoRIで処理してc-fos
DNA（2.1 kb）を切り出した。次に、このc-fos DNAフラ
グメントをpBluescript KII(+)プラスミド（Strategen
e）のEcoRIサイトに組み込んだプラスミド（pBluescrip
t-cFos）を作製した。pBlue-cFosを制限酵素SmaIで処理
して線状化し、in vitro転写反応の鋳型とした。in vit
ro転写反応は、T3 MEGAscript キット(Ambion)を使用
し、Ｔ３RNAポリメラーゼを作動させることにより行っ
た。反応液をフェノール／クロロフォルムにより脱タン
パク質処理して、合成されたＲＮＡを抽出した後、エタ
ノールで沈殿させて回収した。
os DNAを、c-fosの全長cDNAが組み込まれたpSPTプラス
ミド（pSPT-cFos）として、理研ジーンバンクより入手
した。このpSPT-cFosを制限酵素EcoRIで処理してc-fos
DNA（2.1 kb）を切り出した。次に、このc-fos DNAフラ
グメントをpBluescript KII(+)プラスミド（Strategen
e）のEcoRIサイトに組み込んだプラスミド（pBluescrip
t-cFos）を作製した。pBlue-cFosを制限酵素SmaIで処理
して線状化し、in vitro転写反応の鋳型とした。in vit
ro転写反応は、T3 MEGAscript キット(Ambion)を使用
し、Ｔ３RNAポリメラーゼを作動させることにより行っ
た。反応液をフェノール／クロロフォルムにより脱タン
パク質処理して、合成されたＲＮＡを抽出した後、エタ
ノールで沈殿させて回収した。
【００６１】（実施例１）溶液中における蛍光標識プロ
ーブのc-fos RNAへのハイブリダイゼーションのアッセ
イ １．蛍光標識オリゴＤＮＡプローブ（蛍光標識プロー
ブ） c-fos mRNAの２次構造予測図においてループ構造（一本
鎖構造）をとっている部位に対する蛍光標識プローブと
して、Ｄ１ＦとＡ１Ｆ、Ｄ２ＦとＡ２Ｆ、Ｄ３ＦとＡ３
Ｆ、Ｄ４ＦとＡ４Ｆ、をそれぞれ一対として使用した。
これらは、それぞれ、c-fos mRNAの２０６−２２５の部
位（Ｄ１Ｆ）と２２６−２４５の部位（Ａ１Ｆ）、６５
７−６７６の部位（Ｄ２Ｆ）と６７７−６９６の部位
（Ａ２Ｆ）、８９８−９１７の部位（Ｄ３Ｆ）と９１８
−９３７の部位（Ａ３Ｆ）、１６５９−１６７８の部位
（Ｄ４Ｆ）と１６７９−１６９８の部位（Ａ４Ｆ）、に
相補的な塩基配列をもち、ドナープローブ（Bodipy493/
503標識オリゴＤＮＡ）とアクセプタープローブ（Ｃｙ
５標識オリゴＤＮＡ）とc-fos RNAの３者でハイブリッ
ド体が形成されたとき、Bodipy493/503とＣｙ５がそれ
ぞれ結合しているヌクレオチドの間に４ヌクレオチドが
存在する形態をとる。
ーブのc-fos RNAへのハイブリダイゼーションのアッセ
イ １．蛍光標識オリゴＤＮＡプローブ（蛍光標識プロー
ブ） c-fos mRNAの２次構造予測図においてループ構造（一本
鎖構造）をとっている部位に対する蛍光標識プローブと
して、Ｄ１ＦとＡ１Ｆ、Ｄ２ＦとＡ２Ｆ、Ｄ３ＦとＡ３
Ｆ、Ｄ４ＦとＡ４Ｆ、をそれぞれ一対として使用した。
これらは、それぞれ、c-fos mRNAの２０６−２２５の部
位（Ｄ１Ｆ）と２２６−２４５の部位（Ａ１Ｆ）、６５
７−６７６の部位（Ｄ２Ｆ）と６７７−６９６の部位
（Ａ２Ｆ）、８９８−９１７の部位（Ｄ３Ｆ）と９１８
−９３７の部位（Ａ３Ｆ）、１６５９−１６７８の部位
（Ｄ４Ｆ）と１６７９−１６９８の部位（Ａ４Ｆ）、に
相補的な塩基配列をもち、ドナープローブ（Bodipy493/
503標識オリゴＤＮＡ）とアクセプタープローブ（Ｃｙ
５標識オリゴＤＮＡ）とc-fos RNAの３者でハイブリッ
ド体が形成されたとき、Bodipy493/503とＣｙ５がそれ
ぞれ結合しているヌクレオチドの間に４ヌクレオチドが
存在する形態をとる。
【００６２】２．蛍光スペクトルの測定 Ｄ１ＦとＡ１Ｆをそれぞれ１ｘ１０-6Ｍの濃度で１ｘＳ
ＳＣ緩衝液中で混合し、蛍光スペクトルを測定した。Ｆ
４５００分光蛍光光度計（日立）を使用し、４８０ｎｍ
で励起し、５００ｎｍから７５０ｎｍの範囲で蛍光スペ
クトルの測定を行った。
ＳＣ緩衝液中で混合し、蛍光スペクトルを測定した。Ｆ
４５００分光蛍光光度計（日立）を使用し、４８０ｎｍ
で励起し、５００ｎｍから７５０ｎｍの範囲で蛍光スペ
クトルの測定を行った。
【００６３】得られたスペクトルは、５１４ｎｍ付近に
ピークをもつものである。これは、Bodipy493/503の蛍
光のピークに相当する。Ｃｙ５の蛍光があらわれる６５
０−７００ｎｍには、蛍光はほとんどない。これにc-fo
s RNAを１ｘ１０-6Ｍとなるように加えた（Ｄ１Ｆ：Ａ
１Ｆ：c-fos RNA＝１：１：１（モル比））。室温で１
５分反応させた後、蛍光スペクトルを測定した。同様の
実験をＤ２ＦとＡ２Ｆ、Ｄ３ＦとＡ３Ｆ、Ｄ４ＦとＡ４
Ｆ、をそれぞれ使用して行った。Ｄ２ＦとＡ２Ｆの組の
蛍光標識プローブを使用したときは、c-fos RNAを加え
ることによりスペクトルに大きな変化があらわれた。す
なわち、５１４ｎｍのピーク（Bodipy493/503の蛍光）
が減少し６６８ｎｍにピークをもつ蛍光（Ｃｙ５の蛍
光）が新たにあらわれた。６６８ｎｍの蛍光強度と５１
４ｎｍの蛍光強度の比率は、プローブのみのときが０.
０１５、c-fos RNAを加えたときが０.５５であった。同
様の変化は、Ｄ１ＦとＡ１Ｆを使用したときにも観察さ
れたが変化量は少なかった。また、Ｄ３ＦとＡ３Ｆ、Ｄ
４ＦとＡ４Ｆを使用したときには、c-fos RNAを加えて
もスペクトルにほとんど変化はおこらなかった。これら
の結果を次の表に示す。
ピークをもつものである。これは、Bodipy493/503の蛍
光のピークに相当する。Ｃｙ５の蛍光があらわれる６５
０−７００ｎｍには、蛍光はほとんどない。これにc-fo
s RNAを１ｘ１０-6Ｍとなるように加えた（Ｄ１Ｆ：Ａ
１Ｆ：c-fos RNA＝１：１：１（モル比））。室温で１
５分反応させた後、蛍光スペクトルを測定した。同様の
実験をＤ２ＦとＡ２Ｆ、Ｄ３ＦとＡ３Ｆ、Ｄ４ＦとＡ４
Ｆ、をそれぞれ使用して行った。Ｄ２ＦとＡ２Ｆの組の
蛍光標識プローブを使用したときは、c-fos RNAを加え
ることによりスペクトルに大きな変化があらわれた。す
なわち、５１４ｎｍのピーク（Bodipy493/503の蛍光）
が減少し６６８ｎｍにピークをもつ蛍光（Ｃｙ５の蛍
光）が新たにあらわれた。６６８ｎｍの蛍光強度と５１
４ｎｍの蛍光強度の比率は、プローブのみのときが０.
０１５、c-fos RNAを加えたときが０.５５であった。同
様の変化は、Ｄ１ＦとＡ１Ｆを使用したときにも観察さ
れたが変化量は少なかった。また、Ｄ３ＦとＡ３Ｆ、Ｄ
４ＦとＡ４Ｆを使用したときには、c-fos RNAを加えて
もスペクトルにほとんど変化はおこらなかった。これら
の結果を次の表に示す。
【００６４】
【表１】 c-fos RNAの添加後におけるBodipy493/503の蛍光の減少
とＣｙ５の蛍光の増大は、２種類の蛍光標識プローブが
c-fos RNAにハイブリダイズし、Bodipy493/503からＣｙ
５にＦＲＥＴがおきたことを示している。これらの結果
にもとづき、c-fos RNAにハイブリダイズさせる領域と
して、６５７−６９６の部位（プローブ：Ｄ２Ｆ／Ａ２
Ｆ）を選択した。
とＣｙ５の蛍光の増大は、２種類の蛍光標識プローブが
c-fos RNAにハイブリダイズし、Bodipy493/503からＣｙ
５にＦＲＥＴがおきたことを示している。これらの結果
にもとづき、c-fos RNAにハイブリダイズさせる領域と
して、６５７−６９６の部位（プローブ：Ｄ２Ｆ／Ａ２
Ｆ）を選択した。
【００６５】３．ＨＰＬＣによるc-fos RNAと蛍光標識
プローブとのハイブリダイゼーションの確認 次に、Ｄ２ＦおよびＡ２Ｆがc-fos RNAとハイブリダイ
ズすることを確認するために、それぞれの蛍光標識プロ
ーブをc-fos RNAと１ｘＳＳＣ溶液中で混合した後、高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりc-fos RN
Aとハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズして
いない遊離のプローブを分離する実験を行った。Ｄ２Ｆ
またはＡ２Ｆとc-fos RNAを、１ｘＳＳＣ（ｐＨ７．
０）溶液中でモル比１：１で混合し（各２μＭ）室温で
２０分間放置した後、イオン交換カラムを用いた高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。
プローブとのハイブリダイゼーションの確認 次に、Ｄ２ＦおよびＡ２Ｆがc-fos RNAとハイブリダイ
ズすることを確認するために、それぞれの蛍光標識プロ
ーブをc-fos RNAと１ｘＳＳＣ溶液中で混合した後、高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりc-fos RN
Aとハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズして
いない遊離のプローブを分離する実験を行った。Ｄ２Ｆ
またはＡ２Ｆとc-fos RNAを、１ｘＳＳＣ（ｐＨ７．
０）溶液中でモル比１：１で混合し（各２μＭ）室温で
２０分間放置した後、イオン交換カラムを用いた高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。
【００６６】カラム：ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（東ソー） 温度：２５℃ 流速：１ｍｌ／ｍｉｎ 移動相：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ９.５、１ｍＭ
ＥＤＴＡ グラデイエント：ＮａＣｌ、０.３−１Ｍ（１０分） 検出：紫外吸収（２６０ｎｍ） 蛍光検出：励起４７５ｎｍ／蛍光５１５ｎｍ 励起６５０ｎｍ／蛍光６６７ｎｍ
ＥＤＴＡ グラデイエント：ＮａＣｌ、０.３−１Ｍ（１０分） 検出：紫外吸収（２６０ｎｍ） 蛍光検出：励起４７５ｎｍ／蛍光５１５ｎｍ 励起６５０ｎｍ／蛍光６６７ｎｍ
【００６７】遊離のプローブは３.５−４分に、c-fos R
NAは６.９−７.１分に溶出する。Ｄ２Ｆの溶出パターン
をBodipy493/503の蛍光により測定すると、遊離のオリ
ゴＤＮＡの位置とc-fos RNAの位置にピークが観察され
た。ピークの面積積分値より、c-fos RNAと共溶出され
たＤ２Ｆプローブの比率は７６％であった。また、Ａ２
Ｆの溶出パターンを同様にしてＣｙ５の蛍光により求め
たところ、４３％がc-fos RNAの位置に溶出した。これ
らの結果から、各プローブとc-fos RNAとをモル比１：
１、室温で混合したときに、Ｄ２Ｆの７６％、Ａ２Ｆの
４３％がc-fos RNAとハイブリダイズすることがわかっ
た。
NAは６.９−７.１分に溶出する。Ｄ２Ｆの溶出パターン
をBodipy493/503の蛍光により測定すると、遊離のオリ
ゴＤＮＡの位置とc-fos RNAの位置にピークが観察され
た。ピークの面積積分値より、c-fos RNAと共溶出され
たＤ２Ｆプローブの比率は７６％であった。また、Ａ２
Ｆの溶出パターンを同様にしてＣｙ５の蛍光により求め
たところ、４３％がc-fos RNAの位置に溶出した。これ
らの結果から、各プローブとc-fos RNAとをモル比１：
１、室温で混合したときに、Ｄ２Ｆの７６％、Ａ２Ｆの
４３％がc-fos RNAとハイブリダイズすることがわかっ
た。
【００６８】４．ハイブリダイゼーションに及ぼすプロ
ーブの鎖長の影響 ハイブリダイゼーション（３７℃）に対する蛍光標識プ
ローブの鎖長の影響を調べた。２０ｍｅｒであるＤ２Ｆ
とＡ２Ｆの一組、および１５ｍｅｒであるc-fos mRNAの
６６２−６７６の部位（Ｄ５Ｆ）と６７７−６９１の部
位（Ａ５Ｆ）に相補的な塩基配列をもつドナープローブ
（Bodipy493/503標識オリゴＤＮＡ）とアクセプタープ
ローブ（Ｃｙ５標識オリゴＤＮＡ）をそれぞれ一対とし
て使用した。
ーブの鎖長の影響 ハイブリダイゼーション（３７℃）に対する蛍光標識プ
ローブの鎖長の影響を調べた。２０ｍｅｒであるＤ２Ｆ
とＡ２Ｆの一組、および１５ｍｅｒであるc-fos mRNAの
６６２−６７６の部位（Ｄ５Ｆ）と６７７−６９１の部
位（Ａ５Ｆ）に相補的な塩基配列をもつドナープローブ
（Bodipy493/503標識オリゴＤＮＡ）とアクセプタープ
ローブ（Ｃｙ５標識オリゴＤＮＡ）をそれぞれ一対とし
て使用した。
【００６９】使用した蛍光標識オリゴＤＮＡは以下のも
のである。合成・精製は上記の方法により行った。 Ｄ５Ｆ：５'−(Bodipy493/503)ＴＣＴＡＧＴＴＧＧＴＣ
ＴＧＴＣ−３' Ａ５Ｆ：５'−ＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣ (Ｃｙ５)ＡＴＣ
Ｔ−３' Ｄ２ＦとＡ２Ｆの組をそれぞれ１ｘ１０-6Ｍの濃度で１
ｘＳＳＣ緩衝液中で混合し、蛍光スペクトルを測定し
た。これにc−fos RNAを１ｘ１０-6Ｍとなるように加え
た（Ｄ２Ｆ：Ａ２Ｆ：c−fos RNA＝１：１：１モル
比）。同様の実験をＤ５ＦとＡ５Ｆの組を使用して行っ
た。さらに、３７℃でこれらのハイブリダイゼーション
試験を繰り返した。すべての場合、５−１５分の間にハ
イブリダイゼーションが完了した。室温における１５分
後の蛍光スペクトルの変化は、Ｄ２ＦとＡ２Ｆを使用し
たときのほうがＤ５ＦとＡ５Ｆを使用したときより大き
かった。結果を表２に示す。
のである。合成・精製は上記の方法により行った。 Ｄ５Ｆ：５'−(Bodipy493/503)ＴＣＴＡＧＴＴＧＧＴＣ
ＴＧＴＣ−３' Ａ５Ｆ：５'−ＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣ (Ｃｙ５)ＡＴＣ
Ｔ−３' Ｄ２ＦとＡ２Ｆの組をそれぞれ１ｘ１０-6Ｍの濃度で１
ｘＳＳＣ緩衝液中で混合し、蛍光スペクトルを測定し
た。これにc−fos RNAを１ｘ１０-6Ｍとなるように加え
た（Ｄ２Ｆ：Ａ２Ｆ：c−fos RNA＝１：１：１モル
比）。同様の実験をＤ５ＦとＡ５Ｆの組を使用して行っ
た。さらに、３７℃でこれらのハイブリダイゼーション
試験を繰り返した。すべての場合、５−１５分の間にハ
イブリダイゼーションが完了した。室温における１５分
後の蛍光スペクトルの変化は、Ｄ２ＦとＡ２Ｆを使用し
たときのほうがＤ５ＦとＡ５Ｆを使用したときより大き
かった。結果を表２に示す。
【００７０】前述のとおり、６６８ｎｍの蛍光強度（Ｉ
（６６８））と５１４ｎｍの蛍光強度（Ｉ（５１４））
の比率をとると、これは蛍光標識プローブが標的核酸
（c−fos RNA）にハイブリダイズする割合を表す。プロ
ーブのハイブリダイズする割合は、Ｄ２ＦとＡ２Ｆを使
用したときのほうがＤ５ＦとＡ５Ｆを使用したときより
大きかった。また、温度を室温から３７℃まで上昇させ
ると、ハイブリダイズの割合は、両方の場合共に減少し
た。しかしながら、減少率はＤ２ＦとＡ２Ｆの場合、比
較的少なかったのに比して、Ｄ５ＦとＡ５Ｆの場合甚だ
しかった。従って、哺乳類の生細胞でハイブリダイゼー
ションプローブとして用いるには、２０ｍｅｒがより好
ましいことがわかった。
（６６８））と５１４ｎｍの蛍光強度（Ｉ（５１４））
の比率をとると、これは蛍光標識プローブが標的核酸
（c−fos RNA）にハイブリダイズする割合を表す。プロ
ーブのハイブリダイズする割合は、Ｄ２ＦとＡ２Ｆを使
用したときのほうがＤ５ＦとＡ５Ｆを使用したときより
大きかった。また、温度を室温から３７℃まで上昇させ
ると、ハイブリダイズの割合は、両方の場合共に減少し
た。しかしながら、減少率はＤ２ＦとＡ２Ｆの場合、比
較的少なかったのに比して、Ｄ５ＦとＡ５Ｆの場合甚だ
しかった。従って、哺乳類の生細胞でハイブリダイゼー
ションプローブとして用いるには、２０ｍｅｒがより好
ましいことがわかった。
【００７１】
【表２】
【００７２】（実施例２）細胞における蛍光標識プロー
ブのc-fos mRNAへのハイブリダイゼーションのアッセイ １．蛍光標識プローブの細胞へのインジェクションによ
る導入と蛍光顕微鏡による観察 Ｄ２ＦプローブとＡ２Ｆプローブを滅菌水中で各１ｘ１
０-5Ｍの濃度になるように混合し、この２種類の蛍光標
識プローブの混合液をＣｏｓ７細胞にマイクロインジェ
クションで導入した。
ブのc-fos mRNAへのハイブリダイゼーションのアッセイ １．蛍光標識プローブの細胞へのインジェクションによ
る導入と蛍光顕微鏡による観察 Ｄ２ＦプローブとＡ２Ｆプローブを滅菌水中で各１ｘ１
０-5Ｍの濃度になるように混合し、この２種類の蛍光標
識プローブの混合液をＣｏｓ７細胞にマイクロインジェ
クションで導入した。
【００７３】底面にカバーグラスを貼り付けたデイッシ
ュ（P35G-0-14-C, MatTek Corp.）にＣｏｓ７細胞をプ
レーテイングした半日後の細胞を実験に使用した。実験
直前に、培養液を取り除き、ＨＢＳＳ溶液で３回洗浄し
た後、倒立型落斜蛍光顕微鏡で観察した。顕微鏡ステー
ジ上での細胞の温度制御は、３７℃のＨＢＳＳ液を還流
させることにより行った。 顕微鏡：カール・ツアイス Axiovert135TV、対物レン
ズ：プランネオフルアール４０倍（位相差、ＮＡ＝０.
７５、品番4403519902） マイクロインジェクションは、エッペンドルフ：マイク
ロマニピュレーター 5171、またはエッペンドルフ：ト
ランスジェクター 5246Plus/BASIC、を使用し、フェム
トチップ（エッペンドルフ）を用いて行った。なお、測
定中の蛍光退色を最小にするため励起光を３％ＮＤフィ
ルターを用いて減衰させた。
ュ（P35G-0-14-C, MatTek Corp.）にＣｏｓ７細胞をプ
レーテイングした半日後の細胞を実験に使用した。実験
直前に、培養液を取り除き、ＨＢＳＳ溶液で３回洗浄し
た後、倒立型落斜蛍光顕微鏡で観察した。顕微鏡ステー
ジ上での細胞の温度制御は、３７℃のＨＢＳＳ液を還流
させることにより行った。 顕微鏡：カール・ツアイス Axiovert135TV、対物レン
ズ：プランネオフルアール４０倍（位相差、ＮＡ＝０.
７５、品番4403519902） マイクロインジェクションは、エッペンドルフ：マイク
ロマニピュレーター 5171、またはエッペンドルフ：ト
ランスジェクター 5246Plus/BASIC、を使用し、フェム
トチップ（エッペンドルフ）を用いて行った。なお、測
定中の蛍光退色を最小にするため励起光を３％ＮＤフィ
ルターを用いて減衰させた。
【００７４】励起光源：超高圧水銀ランプ（品番L400
2） フィルター： Bodipy493/503の蛍光像（ＤＤ像） 励起フィルター：BP450-490、ダイクロイックミラー：F
T510、 バリアフィルター：BP515-565 Ｃｙ５の蛍光像（ＡＡ像） 励起フィルター：BP575-625、ダイクロイックミラー：F
T645、 バリアフィルター：BP660-710 蛍光像は冷却型ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス：Ｃ４８
８０）で撮像し、画像処理・解析装置（浜松ホトニク
ス：ＡＲＧＵＳ−５０）に取り込んだ。
2） フィルター： Bodipy493/503の蛍光像（ＤＤ像） 励起フィルター：BP450-490、ダイクロイックミラー：F
T510、 バリアフィルター：BP515-565 Ｃｙ５の蛍光像（ＡＡ像） 励起フィルター：BP575-625、ダイクロイックミラー：F
T645、 バリアフィルター：BP660-710 蛍光像は冷却型ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス：Ｃ４８
８０）で撮像し、画像処理・解析装置（浜松ホトニク
ス：ＡＲＧＵＳ−５０）に取り込んだ。
【００７５】インジェクションで細胞質に導入した蛍光
標識プローブ（Ｄ２Ｆ、Ａ２Ｆ）はともに１０分後には
そのほとんどが核に移行し、集積された（図２（ａ）、
（ｂ））。
標識プローブ（Ｄ２Ｆ、Ａ２Ｆ）はともに１０分後には
そのほとんどが核に移行し、集積された（図２（ａ）、
（ｂ））。
【００７６】２．ストレプトアビジン結合オリゴＤＮＡ
の細胞内での分布 蛍光色素とビオチンで２重標識されたオリゴＤＮＡを以
下の手順で合成した。 ５'−ＸＴＣＴＡＧＴＴＧＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＶ
−３' ５'−ＷＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＹＡＴＣＴ
−３' 「Ｘ」はＴＦＡｃヘキサノールアミンリンカー（パーキ
ンエルマージャパン）、「Ｙ」はUni-Link AminoModifi
er(CLONTECH)、「Ｖ」はBiotin ON CPG (CLONTECH)、
「Ｗ」はBiotin amidite (PE Biosystems)である。合成
・精製は上記の方法により行った。「Ｘ」にBodipy493/
503を、「Ｙ」にＣｙ５を、上記の方法により結合し
て、以下の蛍光色素・ビオチン２重標識オリゴＤＮＡを
得た。 Ｄ２ＦＢ：5'-(Bodipy493/503)TCTAGTTGGTCTGTCTCCGC(B
iotin)-3' Ａ２ＦＢ：5'-(Biotin)GCAAAGCAGACTTCTC(Cy5)ATCT-3'
の細胞内での分布 蛍光色素とビオチンで２重標識されたオリゴＤＮＡを以
下の手順で合成した。 ５'−ＸＴＣＴＡＧＴＴＧＧＴＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＶ
−３' ５'−ＷＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＹＡＴＣＴ
−３' 「Ｘ」はＴＦＡｃヘキサノールアミンリンカー（パーキ
ンエルマージャパン）、「Ｙ」はUni-Link AminoModifi
er(CLONTECH)、「Ｖ」はBiotin ON CPG (CLONTECH)、
「Ｗ」はBiotin amidite (PE Biosystems)である。合成
・精製は上記の方法により行った。「Ｘ」にBodipy493/
503を、「Ｙ」にＣｙ５を、上記の方法により結合し
て、以下の蛍光色素・ビオチン２重標識オリゴＤＮＡを
得た。 Ｄ２ＦＢ：5'-(Bodipy493/503)TCTAGTTGGTCTGTCTCCGC(B
iotin)-3' Ａ２ＦＢ：5'-(Biotin)GCAAAGCAGACTTCTC(Cy5)ATCT-3'
【００７７】これらの蛍光／ビオチン標識オリゴＤＮＡ
とストレプトアビジンを結合させた。ストレプトアビジ
ン（Molecular Probes, Cat No. S-2669）１００μｇを
ＰＢＳ１０μｌに溶かした。これにＤＥＰＣ水に溶解し
たＤ２ＦＢ（１０-4Ｍ）、またはＡ２ＦＢ（１０-4Ｍ）
を、ストレプトアビジンとオリゴＤＮＡのモル比が４：
１になるように加えて、室温で１０分間放置した。その
後、Ｄ２ＦＢ／ストレプトアビジン溶液、Ａ２ＦＢ／ス
トレプトアビジン溶液を混合した。
とストレプトアビジンを結合させた。ストレプトアビジ
ン（Molecular Probes, Cat No. S-2669）１００μｇを
ＰＢＳ１０μｌに溶かした。これにＤＥＰＣ水に溶解し
たＤ２ＦＢ（１０-4Ｍ）、またはＡ２ＦＢ（１０-4Ｍ）
を、ストレプトアビジンとオリゴＤＮＡのモル比が４：
１になるように加えて、室温で１０分間放置した。その
後、Ｄ２ＦＢ／ストレプトアビジン溶液、Ａ２ＦＢ／ス
トレプトアビジン溶液を混合した。
【００７８】このストレプトアビジン結合蛍光標識オリ
ゴＤＮＡ溶液を、Ｃｏｓ７細胞にインジェクションし
た。細胞のBodipy493/503の蛍光像およびＣｙ５の蛍光
像を観察すると、Ｄ２ＦＢ／ストレプトアビジンプロー
ブ、Ａ２ＦＢ／ストレプトアビジンプローブはともに細
胞質に局在した（図２（ｃ）、（ｄ））。インジェクシ
ョンした細胞を顕微鏡のステージ上で１時間インキュベ
ートした後も、プローブの分布に変化はおこらなかっ
た。これらの結果から、ストレプトアビジンと結合させ
たオリゴＤＮＡプローブは細胞質に局在し、核へは移行
しないことがわかる。また、プローブのオリゴＤＮＡ部
が細胞内に存在するヌクレアーゼ等で分解を受けると、
蛍光標識された２０ｍｅｒ以下のオリゴＤＮＡがストレ
プトアビジンから遊離する。遊離したオリゴＤＮＡはす
みやかに核へ移行しそこで集積すると予想される。した
がって、インジェクション後１時間の間に核の蛍光強度
がほとんど変化しないことは、ストレプトアビジンに結
合したオリゴＤＮＡの分解がほとんどおきていないこと
を示している。
ゴＤＮＡ溶液を、Ｃｏｓ７細胞にインジェクションし
た。細胞のBodipy493/503の蛍光像およびＣｙ５の蛍光
像を観察すると、Ｄ２ＦＢ／ストレプトアビジンプロー
ブ、Ａ２ＦＢ／ストレプトアビジンプローブはともに細
胞質に局在した（図２（ｃ）、（ｄ））。インジェクシ
ョンした細胞を顕微鏡のステージ上で１時間インキュベ
ートした後も、プローブの分布に変化はおこらなかっ
た。これらの結果から、ストレプトアビジンと結合させ
たオリゴＤＮＡプローブは細胞質に局在し、核へは移行
しないことがわかる。また、プローブのオリゴＤＮＡ部
が細胞内に存在するヌクレアーゼ等で分解を受けると、
蛍光標識された２０ｍｅｒ以下のオリゴＤＮＡがストレ
プトアビジンから遊離する。遊離したオリゴＤＮＡはす
みやかに核へ移行しそこで集積すると予想される。した
がって、インジェクション後１時間の間に核の蛍光強度
がほとんど変化しないことは、ストレプトアビジンに結
合したオリゴＤＮＡの分解がほとんどおきていないこと
を示している。
【００７９】次に、蛍光標識プローブのc-fos RNAへの
ハイブリダイゼーションに対するストレプトアビジン結
合の効果を調べた。１ｘＳＳＣ溶液において、ストレプ
トアビジン結合蛍光標識プローブ各1x10-6 M（Ｄ２ＦＢ
／ストレプトアビジン、Ａ２ＦＢ／ストレプトアビジ
ン）とin vitro転写反応で作製したc-fos RNA 1x10-6 M
（モル比１：１）を混合し、室温で１５分間放置した
後、蛍光スペクトルを測定した。コントロール実験とし
てストレプトアビジンと結合していない蛍光標識プロー
ブ（Ｄ２Ｆ、Ａ２Ｆ）を用いて同様の測定を行った（図
３）。いずれの試料においても、c-fos RNAを加えるとB
odipy493/503の蛍光が減少しＣｙ５の蛍光が増大した。
変化量はストレプトアビジン結合蛍光標識プローブのと
きの方がやや少なかった。これは、プローブとc-fos RN
Aとのハイブリッド体形成に対して、ストレプトアビジ
ンによる立体障害が少し生じているためであると考えら
れる。
ハイブリダイゼーションに対するストレプトアビジン結
合の効果を調べた。１ｘＳＳＣ溶液において、ストレプ
トアビジン結合蛍光標識プローブ各1x10-6 M（Ｄ２ＦＢ
／ストレプトアビジン、Ａ２ＦＢ／ストレプトアビジ
ン）とin vitro転写反応で作製したc-fos RNA 1x10-6 M
（モル比１：１）を混合し、室温で１５分間放置した
後、蛍光スペクトルを測定した。コントロール実験とし
てストレプトアビジンと結合していない蛍光標識プロー
ブ（Ｄ２Ｆ、Ａ２Ｆ）を用いて同様の測定を行った（図
３）。いずれの試料においても、c-fos RNAを加えるとB
odipy493/503の蛍光が減少しＣｙ５の蛍光が増大した。
変化量はストレプトアビジン結合蛍光標識プローブのと
きの方がやや少なかった。これは、プローブとc-fos RN
Aとのハイブリッド体形成に対して、ストレプトアビジ
ンによる立体障害が少し生じているためであると考えら
れる。
【００８０】３．c-fos mRNA発現細胞の構築 pSPT-cFosを制限酵素EcoRIで処理してc-fos DNA（2.1 k
b）を切り出し、これをpME18S発現ベクターのEcoRIサイ
トへ挿入した（pME18S-cFos）。得られた発現ベクター
（pME18S-cFos）を電気穿孔法により、Ｃｏｓ７細胞に
導入した。Ｃｏｓ７細胞の培養は、10% ウシ胎児血清を
含むＤＭＥＭ培地、５％ ＣＯ2、３７℃の条件で行っ
た。Ｃｏｓ７細胞をセルクレーバーではがしてＰＢＳで
洗浄した後、細胞懸濁液（1x107 cells/ml）にpME18S-c
Fos 5μgを添加し、930Vのパルス電圧をかけた（BioRa
d: Gene PulserII）。得られた細胞懸濁液をＤＭＥＭ培
地で２０倍に希釈し、遠心ろ過で２回洗浄した。細胞を
懸濁し、ガラス底デイッシュ（P35−0−14−C，MatTe
k，Ashland）にまいて培養した。
b）を切り出し、これをpME18S発現ベクターのEcoRIサイ
トへ挿入した（pME18S-cFos）。得られた発現ベクター
（pME18S-cFos）を電気穿孔法により、Ｃｏｓ７細胞に
導入した。Ｃｏｓ７細胞の培養は、10% ウシ胎児血清を
含むＤＭＥＭ培地、５％ ＣＯ2、３７℃の条件で行っ
た。Ｃｏｓ７細胞をセルクレーバーではがしてＰＢＳで
洗浄した後、細胞懸濁液（1x107 cells/ml）にpME18S-c
Fos 5μgを添加し、930Vのパルス電圧をかけた（BioRa
d: Gene PulserII）。得られた細胞懸濁液をＤＭＥＭ培
地で２０倍に希釈し、遠心ろ過で２回洗浄した。細胞を
懸濁し、ガラス底デイッシュ（P35−0−14−C，MatTe
k，Ashland）にまいて培養した。
【００８１】４．c-fos mRNAの発現の確認 ４−１．ドットブロット 発現ベクターで処理したＣｏｓ７細胞におけるc-fos mR
NAの発現をドットブロッティングにより確認した。培養
１日後の細胞をトリプシン処理によりはがし、ＰＢＳで
洗浄した。その後、QuickPrep Total RNA Extraction K
it (PharmaciaBiotech)を用いて細胞から全ＲＮＡを抽
出した。細胞から抽出したＲＮＡ液をナイロン膜に転写
し、紫外線照射によりクロスリンク固定した（BioRad:
Gene Linker）。これにジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識c
-fos ＲＮＡ用プローブ（c-fos mRNAに相補的な配列を
もつ2.1kbのＲＮＡ）を反応させた。アルカリフォスフ
ァターゼ標識抗ＤＩＧ抗体を反応させた後、ＤＩＧ核酸
検出キット（Boehringer Mannheim）を用いて、アルカ
リフオスファターゼで触媒される４−nitroblue tetraz
oliumを生成させた。ナイロン膜上にハイブリダイズし
たc-fos RNA用プローブの量を生成された4-nitroblue t
etrazoliumの量をデンシトメータにより定量することに
より求めた。インビトロ転写反応により得られた濃度既
知のc-fos RNAを同様にブロットすることにより細胞か
ら抽出されたＲＮＡ分画に含まれるc-fos mRNA量を推定
した。前記ＤＩＧ標識c-fosＲＮＡプローブの作製は、p
Bluescript-cFosを制限酵素EcoRVで処理して線状化した
ものを鋳型としてT7 MEGAscriptキット(Ambion)を使用
して、Ｔ7RNAポリメラーゼを作動させることにより行っ
た。その結果、トランスフェクト処理後、１２、２４、
４８、７２、９６時間後においてc-fos mRNAの発現が認
められた。
NAの発現をドットブロッティングにより確認した。培養
１日後の細胞をトリプシン処理によりはがし、ＰＢＳで
洗浄した。その後、QuickPrep Total RNA Extraction K
it (PharmaciaBiotech)を用いて細胞から全ＲＮＡを抽
出した。細胞から抽出したＲＮＡ液をナイロン膜に転写
し、紫外線照射によりクロスリンク固定した（BioRad:
Gene Linker）。これにジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識c
-fos ＲＮＡ用プローブ（c-fos mRNAに相補的な配列を
もつ2.1kbのＲＮＡ）を反応させた。アルカリフォスフ
ァターゼ標識抗ＤＩＧ抗体を反応させた後、ＤＩＧ核酸
検出キット（Boehringer Mannheim）を用いて、アルカ
リフオスファターゼで触媒される４−nitroblue tetraz
oliumを生成させた。ナイロン膜上にハイブリダイズし
たc-fos RNA用プローブの量を生成された4-nitroblue t
etrazoliumの量をデンシトメータにより定量することに
より求めた。インビトロ転写反応により得られた濃度既
知のc-fos RNAを同様にブロットすることにより細胞か
ら抽出されたＲＮＡ分画に含まれるc-fos mRNA量を推定
した。前記ＤＩＧ標識c-fosＲＮＡプローブの作製は、p
Bluescript-cFosを制限酵素EcoRVで処理して線状化した
ものを鋳型としてT7 MEGAscriptキット(Ambion)を使用
して、Ｔ7RNAポリメラーゼを作動させることにより行っ
た。その結果、トランスフェクト処理後、１２、２４、
４８、７２、９６時間後においてc-fos mRNAの発現が認
められた。
【００８２】４−２．in situハイブリダイゼーション また、発現している細胞の比率を確認するために蛍光 i
n situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行った。
ＦＩＳＨは公知のプロトコールにしたがって行った。pM
E18S-cFosで処理したＣｏｓ７細胞を１日培養した後
に、細胞を4 %パラフォルムアルデヒド/PBS (pH 7.4)、
１５分間室温で固定した。固定した細胞を、ＤＩＧ標識
c-fos antisense RNAプローブで処理した。その後、細
胞をＦＩＴＣ標識抗ＤＩＧ抗体で染色し、蛍光顕微鏡で
観察した。その結果、トランスフェクト処理細胞の８０
−９０％以上において、c-fos mRNAの発現が確認され
た。
n situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行った。
ＦＩＳＨは公知のプロトコールにしたがって行った。pM
E18S-cFosで処理したＣｏｓ７細胞を１日培養した後
に、細胞を4 %パラフォルムアルデヒド/PBS (pH 7.4)、
１５分間室温で固定した。固定した細胞を、ＤＩＧ標識
c-fos antisense RNAプローブで処理した。その後、細
胞をＦＩＴＣ標識抗ＤＩＧ抗体で染色し、蛍光顕微鏡で
観察した。その結果、トランスフェクト処理細胞の８０
−９０％以上において、c-fos mRNAの発現が確認され
た。
【００８３】５．in situ転写法による生細胞内におけ
るプローブのハイブリダイゼーションの確認 上記のc-fos mRNA発現細胞において、細胞に導入する蛍
光標識プローブ（Ｄ２Ｆ、Ａ２Ｆ）がc-fos mRNAにハイ
ブリダイズすることを以下の実験により確認した。すな
わち、細胞が生きている状態においてプロ−ブを細胞内
に導入し、その後細胞を固定する。固定した細胞におい
て、導入したプローブをプライマーとする逆転写反応を
行ない、ｃＤＮＡの合成の有無を検出するものである
（in situ転写法（IST法、Politz, J.C., Taneja, K.
L., Singer, R.H.(1995) Nucleic Acids Research 23 4
946-4953）。pME18S-cFosでトランスフェクト処理をし
たＣｏｓ７細胞を１晩培養した。蛍光標識プローブとト
ランスフェクション試薬Trans Fast（Promega）を荷電
比１：１になるように混合し、これを無血清培地中、１
時間培養した細胞の培養液に１０μＭ（最終濃度）添加
し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄
後、4 %パラフォルムアルデヒド/PBS (pH 7.4)で室温１
５分間、処理を行い、細胞を固定した。0.5% TritonX-1
00処理（９０秒）により細胞膜の透過性を上げた後、逆
転写酵素Moloney Murine Leukemia VirusReverse Trans
criptase(RNaseH-)、０.３５ｍＭ ＤＩＧ標識ｄＵＴ
Ｐ、１ｍＭｄＮＴＰを含む転写溶液に細胞を浸して３０
℃で１.５時間インキュベートし、逆転写反応を行わせ
た。その後、細胞をＦＩＴＣ標識抗ＤＩＧ抗体で処理
し、蛍光顕微鏡で観察した。
るプローブのハイブリダイゼーションの確認 上記のc-fos mRNA発現細胞において、細胞に導入する蛍
光標識プローブ（Ｄ２Ｆ、Ａ２Ｆ）がc-fos mRNAにハイ
ブリダイズすることを以下の実験により確認した。すな
わち、細胞が生きている状態においてプロ−ブを細胞内
に導入し、その後細胞を固定する。固定した細胞におい
て、導入したプローブをプライマーとする逆転写反応を
行ない、ｃＤＮＡの合成の有無を検出するものである
（in situ転写法（IST法、Politz, J.C., Taneja, K.
L., Singer, R.H.(1995) Nucleic Acids Research 23 4
946-4953）。pME18S-cFosでトランスフェクト処理をし
たＣｏｓ７細胞を１晩培養した。蛍光標識プローブとト
ランスフェクション試薬Trans Fast（Promega）を荷電
比１：１になるように混合し、これを無血清培地中、１
時間培養した細胞の培養液に１０μＭ（最終濃度）添加
し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄
後、4 %パラフォルムアルデヒド/PBS (pH 7.4)で室温１
５分間、処理を行い、細胞を固定した。0.5% TritonX-1
00処理（９０秒）により細胞膜の透過性を上げた後、逆
転写酵素Moloney Murine Leukemia VirusReverse Trans
criptase(RNaseH-)、０.３５ｍＭ ＤＩＧ標識ｄＵＴ
Ｐ、１ｍＭｄＮＴＰを含む転写溶液に細胞を浸して３０
℃で１.５時間インキュベートし、逆転写反応を行わせ
た。その後、細胞をＦＩＴＣ標識抗ＤＩＧ抗体で処理
し、蛍光顕微鏡で観察した。
【００８４】その結果、Ｄ２Ｆをトランスフェクト処理
をした細胞に取り込ませた試料においては、細胞質全体
が強い蛍光を発していた。すなわち、細胞質においてc-
fosｃＤＮＡが合成されていた。トランスフェクト処理
を行っていないＣｏｓ７細胞にＤ２Ｆを取り込ませたと
きには細胞質に蛍光は観察されなかった。また、c-fos
mRNAの６５７−６７６の部位と同じ配列をもつオリゴＤ
ＮＡ（センスプローブ、Ｄ２Ｆと相補的な塩基配列をも
つ）をトランスフェクト処理細胞に作用させたときに
も、細胞に蛍光は観察されなかった。これらの結果か
ら、Ｄ２Ｆは、トランスフェクト処理によりc-fos mRNA
を発現しているＣｏｓ７細胞において、細胞が生状態で
c-fos mRNAにハイブリダイズすることが確認された。Ａ
２Ｆについても同様の結果が得られ、Ａ２ＦはＣｏｓ７
細胞のc-fos mRNAとハイブリダイズすることが確認され
た。
をした細胞に取り込ませた試料においては、細胞質全体
が強い蛍光を発していた。すなわち、細胞質においてc-
fosｃＤＮＡが合成されていた。トランスフェクト処理
を行っていないＣｏｓ７細胞にＤ２Ｆを取り込ませたと
きには細胞質に蛍光は観察されなかった。また、c-fos
mRNAの６５７−６７６の部位と同じ配列をもつオリゴＤ
ＮＡ（センスプローブ、Ｄ２Ｆと相補的な塩基配列をも
つ）をトランスフェクト処理細胞に作用させたときに
も、細胞に蛍光は観察されなかった。これらの結果か
ら、Ｄ２Ｆは、トランスフェクト処理によりc-fos mRNA
を発現しているＣｏｓ７細胞において、細胞が生状態で
c-fos mRNAにハイブリダイズすることが確認された。Ａ
２Ｆについても同様の結果が得られ、Ａ２ＦはＣｏｓ７
細胞のc-fos mRNAとハイブリダイズすることが確認され
た。
【００８５】実験に使用したセンスプローブの塩基配列
は以下のものである。合成・精製は上記の方法により行
った。 ６５７−６７６部位の配列をもつオリゴＤＮＡ ５'−(Bodipy493/503)ＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＣＡＡ
ＣＴＡＧＡ−３' ６７７−６９６部位の配列をもつオリゴＤＮＡ ５'−ＡＧＡＴＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴ(Cy5)ＴＴＧＣ
−３'
は以下のものである。合成・精製は上記の方法により行
った。 ６５７−６７６部位の配列をもつオリゴＤＮＡ ５'−(Bodipy493/503)ＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＣＡＡ
ＣＴＡＧＡ−３' ６７７−６９６部位の配列をもつオリゴＤＮＡ ５'−ＡＧＡＴＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴ(Cy5)ＴＴＧＣ
−３'
【００８６】６．生細胞内でのハイブリッド体形成にと
もなう蛍光像の変化 ドナープローブとしてＤ２ＦＢ／ストレプトアビジンお
よびアクセプタープローブとしてＡ２ＦＢ／ストレプト
アビジンをモル比１：１で混合した溶液（プローブ濃度
2x10-5 M、ＰＢＳ緩衝液）をＣｏｓ７細胞にインジェ
クションした。蛍光顕微鏡において、ＤＤ像（Bodipy49
3/503の蛍光）、ＡＡ像（Ｃｙ５の蛍光）に加えて、Bod
ipy493/503からＣｙ５へのＦＲＥＴを観察するためにＤ
Ａ像（Bodipy493/503の励起波長の光を照射しＣｙ５の
蛍光を撮像する）を取得した。ＤＡ像の観察は以下のフ
ィルタ−を用いて行った。励起フィルター： BP450-49
0、ダイクロイックミラー： FT510、バリアフィルタ
ー：BP660-710。ＦＲＥＴが生じると、ＤＤ像（ドナ
ー）の蛍光強度が減少し、ＤＡ像（アクセプター）の蛍
光強度が増大する。ＤＡ像とＤＤ像の蛍光強度の比率
（ＤＡ／ＤＤ、以下比画像ともいう）はＦＲＥＴの効率
を反映する。これは、以下の実験結果により確認され
た。ここで、ＤＡ像、ＤＤ像の比率を取るに際して、そ
れぞれの画像からバックグランドを差し引く処理を行っ
た。
もなう蛍光像の変化 ドナープローブとしてＤ２ＦＢ／ストレプトアビジンお
よびアクセプタープローブとしてＡ２ＦＢ／ストレプト
アビジンをモル比１：１で混合した溶液（プローブ濃度
2x10-5 M、ＰＢＳ緩衝液）をＣｏｓ７細胞にインジェ
クションした。蛍光顕微鏡において、ＤＤ像（Bodipy49
3/503の蛍光）、ＡＡ像（Ｃｙ５の蛍光）に加えて、Bod
ipy493/503からＣｙ５へのＦＲＥＴを観察するためにＤ
Ａ像（Bodipy493/503の励起波長の光を照射しＣｙ５の
蛍光を撮像する）を取得した。ＤＡ像の観察は以下のフ
ィルタ−を用いて行った。励起フィルター： BP450-49
0、ダイクロイックミラー： FT510、バリアフィルタ
ー：BP660-710。ＦＲＥＴが生じると、ＤＤ像（ドナ
ー）の蛍光強度が減少し、ＤＡ像（アクセプター）の蛍
光強度が増大する。ＤＡ像とＤＤ像の蛍光強度の比率
（ＤＡ／ＤＤ、以下比画像ともいう）はＦＲＥＴの効率
を反映する。これは、以下の実験結果により確認され
た。ここで、ＤＡ像、ＤＤ像の比率を取るに際して、そ
れぞれの画像からバックグランドを差し引く処理を行っ
た。
【００８７】すなわち、Ｄ２ＦＢ／ストレプトアビジン
およびＡ２ＦＢ／ストレプトアビジンを１ｘＳＳＣ溶液
中で各１ｘ１０-5Ｍ（モル比１：１）で混合し、これ
に、プローブに対して相補的な塩基配列をもつ４０ｍｅ
ｒのＲＮＡを0.1、 0.2、 0.5、 0.75、 1.0、 1.25の
比率になるように添加して室温で３０分間放置した後、
各々のドナープローブ／アクセプタープローブ／４０ｍ
ｅｒＲＮＡの混合液をカバーグラス上に滴下し、これら
の溶液の蛍光像（ＤＤ像、ＤＡ像）を取得した。ＤＤ像
の蛍光強度とＤＡ像の蛍光強度の比率（ＤＡ／ＤＤ）の
値を求めて、ＲＮＡとプローブの比率（ＲＮＡ／プロー
ブ）に対してプロットした（図４）。
およびＡ２ＦＢ／ストレプトアビジンを１ｘＳＳＣ溶液
中で各１ｘ１０-5Ｍ（モル比１：１）で混合し、これ
に、プローブに対して相補的な塩基配列をもつ４０ｍｅ
ｒのＲＮＡを0.1、 0.2、 0.5、 0.75、 1.0、 1.25の
比率になるように添加して室温で３０分間放置した後、
各々のドナープローブ／アクセプタープローブ／４０ｍ
ｅｒＲＮＡの混合液をカバーグラス上に滴下し、これら
の溶液の蛍光像（ＤＤ像、ＤＡ像）を取得した。ＤＤ像
の蛍光強度とＤＡ像の蛍光強度の比率（ＤＡ／ＤＤ）の
値を求めて、ＲＮＡとプローブの比率（ＲＮＡ／プロー
ブ）に対してプロットした（図４）。
【００８８】添加した４０ｍｅｒＲＮＡの量が多くなる
ほど、ＤＤ像の蛍光強度は減少し、ＤＡ像の蛍光強度は
増大した。すなわち、Ｄ２ＦＢ／ストレプトアビジン，
Ａ２ＦＢ／ストレプトアビジンと４０ｍｅｒＲＮＡによ
る３者のハイブリッド体の形成にともない、ＤＡ／ＤＤ
値は増大していく。プローブのみのとき（ＲＮＡ／プロ
ーブ＝０）にはＤＡ／ＤＤ＝０．０８であるが、ＲＮＡ
／プローブ＝１のときにはＤＡ／ＤＤ＝１．５となっ
た。
ほど、ＤＤ像の蛍光強度は減少し、ＤＡ像の蛍光強度は
増大した。すなわち、Ｄ２ＦＢ／ストレプトアビジン，
Ａ２ＦＢ／ストレプトアビジンと４０ｍｅｒＲＮＡによ
る３者のハイブリッド体の形成にともない、ＤＡ／ＤＤ
値は増大していく。プローブのみのとき（ＲＮＡ／プロ
ーブ＝０）にはＤＡ／ＤＤ＝０．０８であるが、ＲＮＡ
／プローブ＝１のときにはＤＡ／ＤＤ＝１．５となっ
た。
【００８９】Ｄ２ＦＢ／ストレプトアビジンとＡ２ＦＢ
／ストレプトアビジンの混合液をＣｏＳ７細胞にインジ
ェクションした。その直後の細胞における細胞質のＤＡ
／ＤＤ値は０.０８であり、上記数値はインジェクショ
ン液の値と同じであった。細胞を顕微鏡ステージ上で１
５分間インキュベートした後のＤＡ／ＤＤ値に変化はみ
られなかった。次に、この細胞に、c-fos mRNAの657-69
6の部位と同じ配列をもつ４０ｍｅｒＲＮＡ（2x10-5
M、ＤＥＰＣ水に溶解したもの）をインジェクションし
た。２分後の蛍光像においては、ＤＤ像の細胞質の蛍光
強度が減少し、ＤＡ像の蛍光強度が増大した（図５）。
ＤＡ／ＤＤ値は1.5であった。ＤＡ／ＤＤ値を時間に対
してプロットした結果を図７示す。
／ストレプトアビジンの混合液をＣｏＳ７細胞にインジ
ェクションした。その直後の細胞における細胞質のＤＡ
／ＤＤ値は０.０８であり、上記数値はインジェクショ
ン液の値と同じであった。細胞を顕微鏡ステージ上で１
５分間インキュベートした後のＤＡ／ＤＤ値に変化はみ
られなかった。次に、この細胞に、c-fos mRNAの657-69
6の部位と同じ配列をもつ４０ｍｅｒＲＮＡ（2x10-5
M、ＤＥＰＣ水に溶解したもの）をインジェクションし
た。２分後の蛍光像においては、ＤＤ像の細胞質の蛍光
強度が減少し、ＤＡ像の蛍光強度が増大した（図５）。
ＤＡ／ＤＤ値は1.5であった。ＤＡ／ＤＤ値を時間に対
してプロットした結果を図７示す。
【００９０】図５を参照すると、細胞質中のほぼすべて
のドナ−プローブとアクセプタープローブが４０ｍｅｒ
ＲＮＡと３者のハイブリッド体を形成したことがわか
る。コントロール実験として、c-fos mRNAの657-696部
位のアンチセンス配列をもつ４０ｍｅｒＤＮＡ（ドナ−
プローブの塩基配列とアクセプタープローブの塩基配列
を連続させたもの）をインジェクションしたときには蛍
光像の変化はおこらなかった（図６）。以上の結果か
ら、細胞質に導入したＤ２ＦＢ／ストレプトアビジンと
Ａ２ＦＢ／ストレプトアビジンは、ともに、標的ＲＮＡ
が存在するとすみやかにハイブリダイズすることが可能
な状態で存在すること(すなわち、これらのプローブは
細胞質内で束縛されずに自由に拡散されうる)、細胞質
内でドナープローブ、アクセプタープローブ、標的ＲＮ
Ａの３者によるハイブリッド体が形成されると蛍光像が
変化し、ＤＡ／ＤＤ値が上昇することがわかる。
のドナ−プローブとアクセプタープローブが４０ｍｅｒ
ＲＮＡと３者のハイブリッド体を形成したことがわか
る。コントロール実験として、c-fos mRNAの657-696部
位のアンチセンス配列をもつ４０ｍｅｒＤＮＡ（ドナ−
プローブの塩基配列とアクセプタープローブの塩基配列
を連続させたもの）をインジェクションしたときには蛍
光像の変化はおこらなかった（図６）。以上の結果か
ら、細胞質に導入したＤ２ＦＢ／ストレプトアビジンと
Ａ２ＦＢ／ストレプトアビジンは、ともに、標的ＲＮＡ
が存在するとすみやかにハイブリダイズすることが可能
な状態で存在すること(すなわち、これらのプローブは
細胞質内で束縛されずに自由に拡散されうる)、細胞質
内でドナープローブ、アクセプタープローブ、標的ＲＮ
Ａの３者によるハイブリッド体が形成されると蛍光像が
変化し、ＤＡ／ＤＤ値が上昇することがわかる。
【００９１】実験に使用したＲＮＡ、ＤＮＡの塩基配列
は以下のものであり、合成・精製は上記の方法により行
った。 c-fos mRNAの657-696の部位と同じ配列をもつ４０ｍｅ
ｒＲＮＡ 5'-GCGGAGACAGACCAACUAGAAGAUGAGAAGUCUGCUUUGC- 3' c-fos mRNAの657-696の部位と同じ配列をもつ４０ｍｅ
ｒＤＮＡ ５'-GCGGAGACAGACCAACTAGAAGATGAGAAGTCTGCTTTGC-3' c-fos mRNAの657-696の部位のアンチセンス配列をもつ
４０ｍｅｒＤＮＡ 5'-GCAAAGCAGACTTCTCATCTTCTAGTTGGTCTGTCTCCGC-3'
は以下のものであり、合成・精製は上記の方法により行
った。 c-fos mRNAの657-696の部位と同じ配列をもつ４０ｍｅ
ｒＲＮＡ 5'-GCGGAGACAGACCAACUAGAAGAUGAGAAGUCUGCUUUGC- 3' c-fos mRNAの657-696の部位と同じ配列をもつ４０ｍｅ
ｒＤＮＡ ５'-GCGGAGACAGACCAACTAGAAGATGAGAAGTCTGCTTTGC-3' c-fos mRNAの657-696の部位のアンチセンス配列をもつ
４０ｍｅｒＤＮＡ 5'-GCAAAGCAGACTTCTCATCTTCTAGTTGGTCTGTCTCCGC-3'
【００９２】７．生細胞におけるc-fos mRNAの検出 次に、ドナープローブとしてＤ２ＦＢ／ストレプトアビ
ジンおよびアクセプタープローブとしてＡ２ＦＢ／スト
レプトアビジンをモル比１：１で混合した溶液（プロー
ブ濃度 2x10-5 M、ＰＢＳ緩衝液）を、pME18S-cFosでト
ランスフェクト処理をしたＣｏｓ７細胞（c-fos mRNAを
発現している細胞）にインジェクションした。インジェ
クション２０分後においても細胞質のＤＡ／ＤＤ値の上
昇はみられなかった（図８、図１２）。この結果から細
胞質においては、オリゴＤＮＡプローブのc-fos mRNAへ
のハイブリダイゼーションに対してストレプトアジピン
が立体障害となつていることが考えられる。そこで、ハ
イブリダイゼーション用オリゴＤＮＡとストレプトアビ
ジンの間に「リンカー」を導入した形態のオリゴＤＮＡ
をプローブとして使用した。「リンカー」にもオリゴＤ
ＮＡを使用し、前記ドナープローブの３'端に１０個の
Ｃ（シトシン）を、前記アクセプタープローブの５'端
に２０個のＣを結合した。
ジンおよびアクセプタープローブとしてＡ２ＦＢ／スト
レプトアビジンをモル比１：１で混合した溶液（プロー
ブ濃度 2x10-5 M、ＰＢＳ緩衝液）を、pME18S-cFosでト
ランスフェクト処理をしたＣｏｓ７細胞（c-fos mRNAを
発現している細胞）にインジェクションした。インジェ
クション２０分後においても細胞質のＤＡ／ＤＤ値の上
昇はみられなかった（図８、図１２）。この結果から細
胞質においては、オリゴＤＮＡプローブのc-fos mRNAへ
のハイブリダイゼーションに対してストレプトアジピン
が立体障害となつていることが考えられる。そこで、ハ
イブリダイゼーション用オリゴＤＮＡとストレプトアビ
ジンの間に「リンカー」を導入した形態のオリゴＤＮＡ
をプローブとして使用した。「リンカー」にもオリゴＤ
ＮＡを使用し、前記ドナープローブの３'端に１０個の
Ｃ（シトシン）を、前記アクセプタープローブの５'端
に２０個のＣを結合した。
【００９３】実験に使用したストレプトアビジン結合オ
リゴＤＮＡプローブは以下のものであり、オリゴＤＮＡ
の合成・精製、およびストレプトアビジンとの結合は上
記の方法により行った。 リンカー導入ドナープローブ（Ｄ２ＦＢＬ）： 5'-(Bodipy493/503)ＴＣＴＡＧＴＴＧＧＴＣＴＧＴＣＴ
ＣＣＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ(Biotin)-3'−（ストレ
プトアビジン） リンカー導入アクセプタープローブ（Ａ２ＦＢＬ）： （ストレプトアビジン）−5'-(Biotin)ＣＣＣＣＣＣＣ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴ
ＴＣＴＣ(Cy5)ＡＴＣＴ-3'
リゴＤＮＡプローブは以下のものであり、オリゴＤＮＡ
の合成・精製、およびストレプトアビジンとの結合は上
記の方法により行った。 リンカー導入ドナープローブ（Ｄ２ＦＢＬ）： 5'-(Bodipy493/503)ＴＣＴＡＧＴＴＧＧＴＣＴＧＴＣＴ
ＣＣＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ(Biotin)-3'−（ストレ
プトアビジン） リンカー導入アクセプタープローブ（Ａ２ＦＢＬ）： （ストレプトアビジン）−5'-(Biotin)ＣＣＣＣＣＣＣ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴ
ＴＣＴＣ(Cy5)ＡＴＣＴ-3'
【００９４】Ｄ２ＦＢＬとＡ２ＦＢＬをモル比１：１で
混合し、pME18S-cFosでトランスフェクト処理をしたＣ
ｏｓ７細胞（c-fos mRNAを発現している細胞）にインジ
ェクションした。インジェクション５分後に、ＤＤ像、
ＤＡ像、ＡＡ像、および位相差（Ｐｈ）像をそれぞれ撮
像したものを図９に示す。ＡＡ像からはCy５の蛍光が細
胞質全体で観測されるが、特に核の近傍の特定の領域で
より強い蛍光が観測されるのが分かる。これはCy５（す
なわちアクセプタープローブＡ２ＦＢＬ）が細胞質全体
に拡散して分布しているが、核の近傍の特定の領域での
濃度が高いことを示す。ＤＤ像からBodipy493/503の蛍
光が細胞質全体で観測されるのが分かる。Cy5の蛍光分
布と同様に比較的強いBodipy493/503の蛍光が核の近傍
領域で観察されるが、ＡＡ像中ほど明瞭ではない。ＦＲ
ＥＴによる蛍光を表すＤＡ像から、ＤＤ像およびＡＡ像
で強い蛍光が観測される領域でやはり同様に強い蛍光が
観測されることが分かる。これら蛍光画像は、ドナープ
ローブとアクセプタープローブが核近傍の領域に高い濃
度で存在し、該領域でＦＲＥＴが細胞質の他の領域でよ
りもより高い効率で起こっていることを示す。さらに、
細胞内でのＦＲＥＴの効率を評価するために、インジェ
クション５分後のＤＡ／ＤＤ比画像を求め擬似色で表示
したものが図１０ａである。図１０ａによればＤＡ／Ｄ
Ｄ値は細胞中、不均一な分布をしている。核の近傍の領
域でＤＡ／ＤＤ値は、０．７−１．２であり、他の領域
で０．３−０．４であった。これらの値はいずれもイン
ジェクション液の値（０.０８）よりも大きく、ＦＲＥ
Ｔが細胞質のほとんどの領域で起こっていることを示し
ている。インジェクション２０分後のＤＡ／ＤＤ比画像
を擬似色で表示したものが図１０ｂである。蛍光の分布
のパターンは、図１０ａとほとんど変わらない。ＤＡ／
ＤＤ値は増大しており、これはプローブのc-fos mRNAへ
のハイブリダイゼーションがインジェクション後２０分
の間、進行していることを示す。図１１は、得られたＤ
Ａ／ＤＤ画像の別の例であり、蛍光像の時間変化を示し
たものである。インジェクション５分後において、細胞
質の一部においてＤＡ／ＤＤ値が上昇した。さらに、時
間とともに細胞質のＤＡ／ＤＤ値の増大が観察された。
核のＤＡ／ＤＤ値は低い値を示したままである。図１２
は、細胞質のＤＡ／ＤＤ値の平均値をインジェクション
後の時間経過に対してプロットしたものである。
混合し、pME18S-cFosでトランスフェクト処理をしたＣ
ｏｓ７細胞（c-fos mRNAを発現している細胞）にインジ
ェクションした。インジェクション５分後に、ＤＤ像、
ＤＡ像、ＡＡ像、および位相差（Ｐｈ）像をそれぞれ撮
像したものを図９に示す。ＡＡ像からはCy５の蛍光が細
胞質全体で観測されるが、特に核の近傍の特定の領域で
より強い蛍光が観測されるのが分かる。これはCy５（す
なわちアクセプタープローブＡ２ＦＢＬ）が細胞質全体
に拡散して分布しているが、核の近傍の特定の領域での
濃度が高いことを示す。ＤＤ像からBodipy493/503の蛍
光が細胞質全体で観測されるのが分かる。Cy5の蛍光分
布と同様に比較的強いBodipy493/503の蛍光が核の近傍
領域で観察されるが、ＡＡ像中ほど明瞭ではない。ＦＲ
ＥＴによる蛍光を表すＤＡ像から、ＤＤ像およびＡＡ像
で強い蛍光が観測される領域でやはり同様に強い蛍光が
観測されることが分かる。これら蛍光画像は、ドナープ
ローブとアクセプタープローブが核近傍の領域に高い濃
度で存在し、該領域でＦＲＥＴが細胞質の他の領域でよ
りもより高い効率で起こっていることを示す。さらに、
細胞内でのＦＲＥＴの効率を評価するために、インジェ
クション５分後のＤＡ／ＤＤ比画像を求め擬似色で表示
したものが図１０ａである。図１０ａによればＤＡ／Ｄ
Ｄ値は細胞中、不均一な分布をしている。核の近傍の領
域でＤＡ／ＤＤ値は、０．７−１．２であり、他の領域
で０．３−０．４であった。これらの値はいずれもイン
ジェクション液の値（０.０８）よりも大きく、ＦＲＥ
Ｔが細胞質のほとんどの領域で起こっていることを示し
ている。インジェクション２０分後のＤＡ／ＤＤ比画像
を擬似色で表示したものが図１０ｂである。蛍光の分布
のパターンは、図１０ａとほとんど変わらない。ＤＡ／
ＤＤ値は増大しており、これはプローブのc-fos mRNAへ
のハイブリダイゼーションがインジェクション後２０分
の間、進行していることを示す。図１１は、得られたＤ
Ａ／ＤＤ画像の別の例であり、蛍光像の時間変化を示し
たものである。インジェクション５分後において、細胞
質の一部においてＤＡ／ＤＤ値が上昇した。さらに、時
間とともに細胞質のＤＡ／ＤＤ値の増大が観察された。
核のＤＡ／ＤＤ値は低い値を示したままである。図１２
は、細胞質のＤＡ／ＤＤ値の平均値をインジェクション
後の時間経過に対してプロットしたものである。
【００９５】コントロール実験として、同じ一組のプロ
ーブをpME18S-cFosでトランスフェクト処理をしていな
いＣｏｓ７細胞（c-fos mRNAを発現していない細胞）に
インジェクションしたときには、ＤＡ／ＤＤ値はインジ
ェクション液の値（０.０８）とほぼ同じ低い値を示し
た（図１２、図１３）。また、c-fos mRNAの６５７−６
７６部位と同じ塩基配列をもつアクセプタープローブと
６７７−６９６部位と同じ塩基配列をもつドナープロー
ブの混合液（センス配列をもつプローブ、プローブは上
記アンチセンスプローブと同様のリンカー部を含む）を
pME18S-cFosでトランスフェクト処理をしたＣｏｓ７細
胞（c-fos mRNAを発現している細胞）にインジェクショ
ンしたときにも、ＤＡ／ＤＤ値はインジェクション液の
値（０.０８）とほぼ同じ低い値を示した（図１２、図
１４）。後者のコントロール試料についてインジェクシ
ョン５分後に、ＤＤ像、ＤＡ像、ＡＡ像、および位相差
像をそれぞれ撮像したものを図１５に示す。ＤＤ像およ
びＡＡ像からBodipy493/503の蛍光もCy５の蛍光も共に
細胞質全体にわたって、一様に観察されることが分か
る。ＤＡ像では、蛍光はほとんど観測されなかった。さ
らに、図１０ａと同様に、インジェクション５分後の比
画像ＤＡ／ＤＤを求め擬似色で表示したものが図１６ａ
である。ＤＡ／ＤＤ値は約０．１であり、インジェクシ
ョン液の値（０.０８）とほぼ同じであった。また、イ
ンジェクション２０分後の比画像ＤＡ／ＤＤを求め擬似
色で表示したものが図１６ｂである。図から、蛍光の分
布およびＤＡ／ＤＤ値がインジェクション後、２０分間
変化しなかったことが分かった。これらの結果は、この
コントロールでＦＲＥＴが起こらず、従ってハイブリッ
ド体の形成もなかったことを示す。
ーブをpME18S-cFosでトランスフェクト処理をしていな
いＣｏｓ７細胞（c-fos mRNAを発現していない細胞）に
インジェクションしたときには、ＤＡ／ＤＤ値はインジ
ェクション液の値（０.０８）とほぼ同じ低い値を示し
た（図１２、図１３）。また、c-fos mRNAの６５７−６
７６部位と同じ塩基配列をもつアクセプタープローブと
６７７−６９６部位と同じ塩基配列をもつドナープロー
ブの混合液（センス配列をもつプローブ、プローブは上
記アンチセンスプローブと同様のリンカー部を含む）を
pME18S-cFosでトランスフェクト処理をしたＣｏｓ７細
胞（c-fos mRNAを発現している細胞）にインジェクショ
ンしたときにも、ＤＡ／ＤＤ値はインジェクション液の
値（０.０８）とほぼ同じ低い値を示した（図１２、図
１４）。後者のコントロール試料についてインジェクシ
ョン５分後に、ＤＤ像、ＤＡ像、ＡＡ像、および位相差
像をそれぞれ撮像したものを図１５に示す。ＤＤ像およ
びＡＡ像からBodipy493/503の蛍光もCy５の蛍光も共に
細胞質全体にわたって、一様に観察されることが分か
る。ＤＡ像では、蛍光はほとんど観測されなかった。さ
らに、図１０ａと同様に、インジェクション５分後の比
画像ＤＡ／ＤＤを求め擬似色で表示したものが図１６ａ
である。ＤＡ／ＤＤ値は約０．１であり、インジェクシ
ョン液の値（０.０８）とほぼ同じであった。また、イ
ンジェクション２０分後の比画像ＤＡ／ＤＤを求め擬似
色で表示したものが図１６ｂである。図から、蛍光の分
布およびＤＡ／ＤＤ値がインジェクション後、２０分間
変化しなかったことが分かった。これらの結果は、この
コントロールでＦＲＥＴが起こらず、従ってハイブリッ
ド体の形成もなかったことを示す。
【００９６】実験に使用したストレプトアビジン結合オ
リゴＤＮＡプローブは以下のものであり、オリゴＤＮＡ
の合成・精製、およびストレプトアビジンとの結合は上
記の方法により行った。 リンカー導入センスプローブ ６５７−６７６部位と同じ塩基配列をもつ（Ｄ２ＳＦＢ
Ｌ） ５'−（Bodipy493/503）ＡＧＡＴＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧ
ＣＴＴＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ
Ｃ(Biotin)−３'−（ストレプトアビジン） ６７７−６９６部位と同じ塩基配列をもつ（Ａ２ＳＦＢ
Ｌ） （ストレプトアビジン）−５'−(Biotin)ＣＣＣＣＣＣ
ＣＣＣＣＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＣＡＡＣ(Cy5)ＴＡ
ＧＡ−３'
リゴＤＮＡプローブは以下のものであり、オリゴＤＮＡ
の合成・精製、およびストレプトアビジンとの結合は上
記の方法により行った。 リンカー導入センスプローブ ６５７−６７６部位と同じ塩基配列をもつ（Ｄ２ＳＦＢ
Ｌ） ５'−（Bodipy493/503）ＡＧＡＴＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧ
ＣＴＴＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ
Ｃ(Biotin)−３'−（ストレプトアビジン） ６７７−６９６部位と同じ塩基配列をもつ（Ａ２ＳＦＢ
Ｌ） （ストレプトアビジン）−５'−(Biotin)ＣＣＣＣＣＣ
ＣＣＣＣＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＣＡＡＣ(Cy5)ＴＡ
ＧＡ−３'
【００９７】以上の結果は、細胞に導入したc-fos mRNA
の６５７−６７６部位に相補的な塩基配列をもつドナー
プローブと６７７−６９６部位に相補的な塩基配列をも
つアクセプタープローブが、ともにc-fos mRNAにハイブ
リダイズしたことを、顕微鏡下の蛍光像として検出でき
たことを示している。リンカ−部を有しないドナープロ
ーブとアクセプタープローブは、in vitro（水溶液中）
においてはc-fos RNAとハイブリッド体を形成する。ま
た、細胞内において相補的塩基配列をもつ４０ｍｅｒＲ
ＮＡともハイブリッド体を形成する。それにもかかわら
ず、これらのプローブをc-fos mRNAを発現している細胞
に導入したときに、細胞質におけるＦＲＥＴが観察され
なかった（ＤＡ／ＤＤ値の上昇がおこらなかった）の
は、プローブのc-fos mRNAへのハイブリダイゼーション
に対するストレプトアビジンによる立体障害の程度が、
水溶液中よりも細胞中の方がはるかに大きいことによる
と考えられる。
の６５７−６７６部位に相補的な塩基配列をもつドナー
プローブと６７７−６９６部位に相補的な塩基配列をも
つアクセプタープローブが、ともにc-fos mRNAにハイブ
リダイズしたことを、顕微鏡下の蛍光像として検出でき
たことを示している。リンカ−部を有しないドナープロ
ーブとアクセプタープローブは、in vitro（水溶液中）
においてはc-fos RNAとハイブリッド体を形成する。ま
た、細胞内において相補的塩基配列をもつ４０ｍｅｒＲ
ＮＡともハイブリッド体を形成する。それにもかかわら
ず、これらのプローブをc-fos mRNAを発現している細胞
に導入したときに、細胞質におけるＦＲＥＴが観察され
なかった（ＤＡ／ＤＤ値の上昇がおこらなかった）の
は、プローブのc-fos mRNAへのハイブリダイゼーション
に対するストレプトアビジンによる立体障害の程度が、
水溶液中よりも細胞中の方がはるかに大きいことによる
と考えられる。
【００９８】（実施例３）生細胞中のc-fos mRNAの発現
量の推定 実施例２と同様にして、リンカー導入ドナープローブ
（Ｄ２ＦＢＬ）とリンカー導入アクセプタープローブ
（Ａ２ＦＢＬ）を個々の細胞に約１０5分子づつpME18S-
cFosでトランスフェクト処理をしたＣｏｓ７細胞に、処
理後、３−５、２４、４８、７２時間後の時点でインジ
ェクションした。細胞質の全蛍光強度をＤＤ像、ＤＡ像
それぞれについて求め、個々の細胞のＤＡ／ＤＤ値を求
めた。図１７において、個々の細胞のＤＡ／ＤＤ値をプ
ロットした。また、それぞれの時間における細胞間の平
均値を示した。ＤＡ／ＤＤ値は、０．１より大きく、細
胞毎に大きく異なった値をとる。コントロール実験とし
て、実施例２と同様に、前記プローブをpME18S-cFosで
トランスフェクト処理をしていないＣｏｓ７細胞にイン
ジェクションした。また、センス配列をもつプローブ
（Ｄ２ＳＦＢＬおよびＡ２ＳＦＢＬ）をpME18S-cFosで
トランスフェクト処理をしたＣｏｓ７細胞にインジェク
ションした。インジェクションは２４時間後に行った。
コントロール試料のＤＡ／ＤＤ値は、約０．１であり、
インジェクション液の値（０.０８）とほぼ同じであっ
た。
量の推定 実施例２と同様にして、リンカー導入ドナープローブ
（Ｄ２ＦＢＬ）とリンカー導入アクセプタープローブ
（Ａ２ＦＢＬ）を個々の細胞に約１０5分子づつpME18S-
cFosでトランスフェクト処理をしたＣｏｓ７細胞に、処
理後、３−５、２４、４８、７２時間後の時点でインジ
ェクションした。細胞質の全蛍光強度をＤＤ像、ＤＡ像
それぞれについて求め、個々の細胞のＤＡ／ＤＤ値を求
めた。図１７において、個々の細胞のＤＡ／ＤＤ値をプ
ロットした。また、それぞれの時間における細胞間の平
均値を示した。ＤＡ／ＤＤ値は、０．１より大きく、細
胞毎に大きく異なった値をとる。コントロール実験とし
て、実施例２と同様に、前記プローブをpME18S-cFosで
トランスフェクト処理をしていないＣｏｓ７細胞にイン
ジェクションした。また、センス配列をもつプローブ
（Ｄ２ＳＦＢＬおよびＡ２ＳＦＢＬ）をpME18S-cFosで
トランスフェクト処理をしたＣｏｓ７細胞にインジェク
ションした。インジェクションは２４時間後に行った。
コントロール試料のＤＡ／ＤＤ値は、約０．１であり、
インジェクション液の値（０.０８）とほぼ同じであっ
た。
【００９９】それぞれの時間における細胞質内に存在す
るハイブリッド体の平均分子数を、平均ＤＡ／ＤＤ値か
ら算出した。ここで、プローブ分子の全数を１０5と仮
定した。その結果、トランスフェクション後、３−５、
２４、４８、７２時間でのインジェクションについて、
各々約１３０００、３００００、２４０００、および１
９０００という値が得られた。これらの数値は、細胞あ
たりのc-fos mRNAの発現分子数をドットブロッティング
によって求めた値とほぼ一致する（図１８）。従って、
本方法によれば、単一の細胞レベルでの遺伝子の発現
（ｍＲＮＡ）がアッセイ可能となる。
るハイブリッド体の平均分子数を、平均ＤＡ／ＤＤ値か
ら算出した。ここで、プローブ分子の全数を１０5と仮
定した。その結果、トランスフェクション後、３−５、
２４、４８、７２時間でのインジェクションについて、
各々約１３０００、３００００、２４０００、および１
９０００という値が得られた。これらの数値は、細胞あ
たりのc-fos mRNAの発現分子数をドットブロッティング
によって求めた値とほぼ一致する（図１８）。従って、
本方法によれば、単一の細胞レベルでの遺伝子の発現
（ｍＲＮＡ）がアッセイ可能となる。
【０１００】
【発明の効果】本発明の検出方法で使用する検出用プロ
ーブは(1)標的核酸の少なくとも一部の塩基配列とハイ
ブリダイズ可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を含む構造であること、(2)標的核酸とハイブリダイズ
して形成されるハイブリッド体のみを検出可能な標識分
子を有すること、(3)細胞核膜孔の透過を阻害する核膜
透過阻害分子を有すること、さらに、好適には(4)核酸
分解酵素による分解反応を阻害する核酸分解酵素阻害分
子を有するという特徴がある。
ーブは(1)標的核酸の少なくとも一部の塩基配列とハイ
ブリダイズ可能な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を含む構造であること、(2)標的核酸とハイブリダイズ
して形成されるハイブリッド体のみを検出可能な標識分
子を有すること、(3)細胞核膜孔の透過を阻害する核膜
透過阻害分子を有すること、さらに、好適には(4)核酸
分解酵素による分解反応を阻害する核酸分解酵素阻害分
子を有するという特徴がある。
【０１０１】従って、かかる特定の構造を有する検出用
プローブは生細胞の細胞質内に導入しても細胞核内へは
容易に移動せず、また核酸分解酵素により容易に分解も
されない。従って、細胞質内に存在する標的核酸とハイ
ブリッド体を形成し、該ハイブリッド体を核酸分解酵素
による分解を受けることなく検出可能とする。
プローブは生細胞の細胞質内に導入しても細胞核内へは
容易に移動せず、また核酸分解酵素により容易に分解も
されない。従って、細胞質内に存在する標的核酸とハイ
ブリッド体を形成し、該ハイブリッド体を核酸分解酵素
による分解を受けることなく検出可能とする。
【０１０２】また、本発明の検出方法は、特異性が高
く、生細胞中に多数の他の種類の核酸が存在するにも拘
わらず標的核酸のみを高感度に検出可能とする。
く、生細胞中に多数の他の種類の核酸が存在するにも拘
わらず標的核酸のみを高感度に検出可能とする。
【０１０３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>Laboratory of Molecular Biophotonics <120>Method for detecting a target nucleic acid in the cytoplasm of ａli ving cell <130>MBP-162 <160>29 <210>1 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>1 gaacatcatc gtggcggtta 20 <210>2 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>2 tagtctgcgt tgaagcccga 20 <210>3 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>3 tctagttggt ctgtctccgc 20 <210>4 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>4 gcaaagcaga cttctcatct 20 <210>5 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>5 tccggggtgg caacctctgg 20 <210>6 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>6 gggtgaaggc ctcctcagac 20 <210>7 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>7 aaggactaag gagaaagaga 20 <210>8 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>8 agattagtta atgctatgag 20 <210>9 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>9 gaacatcatc gtggcggtta 20 <210>10 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>10 tctagttggt ctgtctccgc 20 <210>11 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>11 tccggggtgg caacctctgg 20 <210>12 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>12 aaggactaag gagaaagaga 20 <210>13 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>13 tagtctgcgt tgaagcccga 20 <210>14 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>14 gcaaagcaga cttctcatct 20 <210>15 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>15 gggtgaaggc ctcctcagac 20 <210>16 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>16 agattagtta atgctatgag 20 <210>17 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>17 gcggagacag accaactaga 20 <210>18 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>18 agatgagaag tctgctttgc 20 <210>19 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>19 tctagttggt ctgtctccgc 20 <210>20 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>20 gcaaagcaga cttctcatct 20 <210>21 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>21 tctagttggt ctgtctccgc 20 <210>22 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>22 gcaaagcaga cttctcatct 20 <210>23 <211>40 <212>RNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>23 gcggagacag accaacuaga agaugagaag ucugcuuugc 40 <210>24 <211>40 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>24 gcggagacag accaactaga agatgagaag tctgctttgc 40 <210>25 <211>40 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>25 gcaaagcaga cttctcatct tctagttggt ctgtctccgc 40 <210>26 <211>30 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>26 tctagttggt ctgtctccgc cccccccccc 30 <210>27 <211>40 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>27 cccccccccc cccccccccc gcaaagcaga cttctcatct 40 <210>28 <211>30 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>28 cccccccccc gcggagacag accaactaga 30 <210>29 <211>40 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>probe <400>29 agatgagaag tctgctttgc cccccccccc cccccccccc 40
【図１】図１(a)は、本発明において使用するプローブ
の一構成例を示す。また、図１(b)は、本発明の検出方
法を説明する概略図である。
の一構成例を示す。また、図１(b)は、本発明の検出方
法を説明する概略図である。
【図２】図２は、一組の蛍光標識プローブをＣｏｓ７細
胞にマイクロインジェクションで導入した１０分後の細
胞の蛍光像を示す蛍光顕微鏡写真である。図中、（ａ）
はBodipy493/503標識オリゴＤＮＡプローブ（Ｄ２Ｆ）
を導入したときのＤＤ像を、（ｂ）はCy5標識オリゴＤ
ＮＡプローブ（Ａ２Ｆ）を導入したときのＡＡ像を、
（ｃ）はストレプトアビジンに結合させたBodipy493/50
3標識オリゴＤＮＡプローブ（Ｄ２ＦＢ／ストレプトア
ビジン）を導入したときのＤＤ像を、（ｄ）はストレプ
トアビジンに結合させたCy5標識オリゴＤＮＡプローブ
（Ａ２ＦＢ／ストレプトアビジン）を導入したときのＡ
Ａ像を示す。
胞にマイクロインジェクションで導入した１０分後の細
胞の蛍光像を示す蛍光顕微鏡写真である。図中、（ａ）
はBodipy493/503標識オリゴＤＮＡプローブ（Ｄ２Ｆ）
を導入したときのＤＤ像を、（ｂ）はCy5標識オリゴＤ
ＮＡプローブ（Ａ２Ｆ）を導入したときのＡＡ像を、
（ｃ）はストレプトアビジンに結合させたBodipy493/50
3標識オリゴＤＮＡプローブ（Ｄ２ＦＢ／ストレプトア
ビジン）を導入したときのＤＤ像を、（ｄ）はストレプ
トアビジンに結合させたCy5標識オリゴＤＮＡプローブ
（Ａ２ＦＢ／ストレプトアビジン）を導入したときのＡ
Ａ像を示す。
【図３】図３は、一組の蛍光標識プローブ溶液にc-fos
RNAを加えたときの蛍光スペクトルの変化を示すグラ
フ。図中、（ａ）はＤ２ＦとＡ２Ｆをモル比１：１で混
合したときのスペクトルを、（ｂ）はＤ２ＦとＡ２Ｆの
混合溶液にin vitro転写反応で合成したc-fos RNAを加
えて１５分間インキュベートしたときのスペクトル（Ｄ
２Ｆ：Ａ２Ｆ：c-fosRNA＝１：１：１（モル比））を、
（ｃ）はＤ２ＦＢ／ストレプトアビジンとＡ２ＦＢ／ス
トレプトアビジンをモル比１：１で混合したときのスペ
クトルを、（ｄ）はＤ２ＦＢ／ストレプトアビジンとＡ
２ＦＢ／ストレプトアビジン混合溶液にc-fos RNAを加
えて１５分間インキュベートしたときのスペクトル（Ｄ
２ＦＢ／ストレプトアビジン：Ａ２ＦＢ／ストレプトア
ビジン：c-fosRNA＝１：１：１（モル比））を示すグラ
フである。
RNAを加えたときの蛍光スペクトルの変化を示すグラ
フ。図中、（ａ）はＤ２ＦとＡ２Ｆをモル比１：１で混
合したときのスペクトルを、（ｂ）はＤ２ＦとＡ２Ｆの
混合溶液にin vitro転写反応で合成したc-fos RNAを加
えて１５分間インキュベートしたときのスペクトル（Ｄ
２Ｆ：Ａ２Ｆ：c-fosRNA＝１：１：１（モル比））を、
（ｃ）はＤ２ＦＢ／ストレプトアビジンとＡ２ＦＢ／ス
トレプトアビジンをモル比１：１で混合したときのスペ
クトルを、（ｄ）はＤ２ＦＢ／ストレプトアビジンとＡ
２ＦＢ／ストレプトアビジン混合溶液にc-fos RNAを加
えて１５分間インキュベートしたときのスペクトル（Ｄ
２ＦＢ／ストレプトアビジン：Ａ２ＦＢ／ストレプトア
ビジン：c-fosRNA＝１：１：１（モル比））を示すグラ
フである。
【図４】図４は、一組の蛍光標識プローブを蛍光顕微鏡
で測定したときに、一組のプローブと標的ＲＮＡの３者
によるハイブリッド体が形成されるのにともない、蛍光
顕微鏡像（ＤＤ像とＤＡ像）における蛍光強度の比率
（ＤＡ／ＤＤ）が変化していくことを示すグラフであ
る。ここで、Ｄ２ＦＢ／ストレプトアビジンとＡ２ＦＢ
／ストレプトアビジンをモル比１：１で混合した溶液
に、プローブに対して相補的な塩基配列をもつ４０ｍｅ
ｒＲＮＡをいろいろな比率で混合し、室温で１５分間イ
ンキュベ−トした。インキュベ−ト溶液から蛍光顕微鏡
下、ＤＤ像とＤＡ像を取得し、ＤＤ値とＤＡ値の比率
（ＤＡ／ＤＤ）をＲＮＡとプローブの比率（ＲＮＡ／プ
ローブ）に対してプロットした。
で測定したときに、一組のプローブと標的ＲＮＡの３者
によるハイブリッド体が形成されるのにともない、蛍光
顕微鏡像（ＤＤ像とＤＡ像）における蛍光強度の比率
（ＤＡ／ＤＤ）が変化していくことを示すグラフであ
る。ここで、Ｄ２ＦＢ／ストレプトアビジンとＡ２ＦＢ
／ストレプトアビジンをモル比１：１で混合した溶液
に、プローブに対して相補的な塩基配列をもつ４０ｍｅ
ｒＲＮＡをいろいろな比率で混合し、室温で１５分間イ
ンキュベ−トした。インキュベ−ト溶液から蛍光顕微鏡
下、ＤＤ像とＤＡ像を取得し、ＤＤ値とＤＡ値の比率
（ＤＡ／ＤＤ）をＲＮＡとプローブの比率（ＲＮＡ／プ
ローブ）に対してプロットした。
【図５】図５は、一組の蛍光標識プローブが導入された
細胞において、プローブの標的ＲＮＡをインジェクショ
ンで導入したときの細胞の蛍光像の変化を示す蛍光顕微
鏡写真である。ここで、Ｄ２ＦＢ／ストレプトアビジン
とＡ２ＦＢ／ストレプトアビジンをモル比１：１で混合
した溶液をＣｏｓ７細胞にマイクロインジェクションで
導入した。図中、（ａ）はＤＤ像を、（ｂ）はＤＡ像を
示す。１０分後に４０ｍｅｒの標的ＲＮＡをさらにイン
ジェクションした。（ｃ）はそのときのＤＤ像を、
（ｄ）はＤＡ像を示す。（ａ）のバーの長さは２０μｍ
をあらわす。
細胞において、プローブの標的ＲＮＡをインジェクショ
ンで導入したときの細胞の蛍光像の変化を示す蛍光顕微
鏡写真である。ここで、Ｄ２ＦＢ／ストレプトアビジン
とＡ２ＦＢ／ストレプトアビジンをモル比１：１で混合
した溶液をＣｏｓ７細胞にマイクロインジェクションで
導入した。図中、（ａ）はＤＤ像を、（ｂ）はＤＡ像を
示す。１０分後に４０ｍｅｒの標的ＲＮＡをさらにイン
ジェクションした。（ｃ）はそのときのＤＤ像を、
（ｄ）はＤＡ像を示す。（ａ）のバーの長さは２０μｍ
をあらわす。
【図６】図６は、一組の蛍光標識プローブが導入された
細胞において、プローブの非標的ＤＮＡをインジェクシ
ョンで導入したときの細胞の蛍光像の変化を示す蛍光顕
微鏡写真である。ここで、Ｄ２ＦＢ／ストレプトアビジ
ンとＡ２ＦＢ／ストレプトアビジンをモル比１：１で混
合した溶液をＣｏｓ７細胞にマイクロインジェクション
で導入した。図中、（ａ）はＤＤ像を、（ｂ）はＤＡ像
を示す。１０分後に４０ｍｅｒの非標的ＤＮＡをさらに
インジェクションした。（ｃ）はそのときのＤＤ像を、
（ｄ）はＤＡ像を示す。（ａ）のバーの長さは２０μｍ
をあらわす。
細胞において、プローブの非標的ＤＮＡをインジェクシ
ョンで導入したときの細胞の蛍光像の変化を示す蛍光顕
微鏡写真である。ここで、Ｄ２ＦＢ／ストレプトアビジ
ンとＡ２ＦＢ／ストレプトアビジンをモル比１：１で混
合した溶液をＣｏｓ７細胞にマイクロインジェクション
で導入した。図中、（ａ）はＤＤ像を、（ｂ）はＤＡ像
を示す。１０分後に４０ｍｅｒの非標的ＤＮＡをさらに
インジェクションした。（ｃ）はそのときのＤＤ像を、
（ｄ）はＤＡ像を示す。（ａ）のバーの長さは２０μｍ
をあらわす。
【図７】図７は、図５、６の実験における、細胞質のＤ
Ａ／ＤＤ値の変化を時間に対してプロットしたものであ
る。図中、（ａ）は図５の細胞を、（ｂ）は図６の細胞
を示す。
Ａ／ＤＤ値の変化を時間に対してプロットしたものであ
る。図中、（ａ）は図５の細胞を、（ｂ）は図６の細胞
を示す。
【図８】図８は、一組の蛍光標識プローブをｍＲＮＡ発
現細胞にマイクロインジェクションで導入した後の細胞
の蛍光像の時間変化を示す蛍光顕微鏡写真である。ここ
で、ストレプトアビジンに結合させたリンカ−を有さな
いプローブ（Ｄ２ＦＢ、Ａ２ＦＢ）をトランスフェクト
処理したＣｏｓ７細胞に導入した。図中、（ａ）は１分
後、（ｂ）は５分後、（ｃ）は１０分後、（ｄ）は２０
分後を示す。（ａ）のバーの長さは２０μｍをあらわ
す。
現細胞にマイクロインジェクションで導入した後の細胞
の蛍光像の時間変化を示す蛍光顕微鏡写真である。ここ
で、ストレプトアビジンに結合させたリンカ−を有さな
いプローブ（Ｄ２ＦＢ、Ａ２ＦＢ）をトランスフェクト
処理したＣｏｓ７細胞に導入した。図中、（ａ）は１分
後、（ｂ）は５分後、（ｃ）は１０分後、（ｄ）は２０
分後を示す。（ａ）のバーの長さは２０μｍをあらわ
す。
【図９】図９は、一組の蛍光標識プローブをｍＲＮＡ発
現細胞にマイクロインジェクションで導入した後の細胞
の蛍光像を示す蛍光顕微鏡写真である。ここで、ストレ
プトアビジンに結合させたリンカ−導入プローブ（Ｄ２
ＦＢＬ、Ａ２ＦＢＬ）をトランスフェクト処理したＣｏ
ｓ７細胞に導入した。 図中、（ａ）はＤＤ像、（ｂ）
はＤＡ像、（ｃ)はＡＡ像、（ｄ)は位相差像を示す。
（ａ）のバーの長さは２０μｍをあらわす。
現細胞にマイクロインジェクションで導入した後の細胞
の蛍光像を示す蛍光顕微鏡写真である。ここで、ストレ
プトアビジンに結合させたリンカ−導入プローブ（Ｄ２
ＦＢＬ、Ａ２ＦＢＬ）をトランスフェクト処理したＣｏ
ｓ７細胞に導入した。 図中、（ａ）はＤＤ像、（ｂ）
はＤＡ像、（ｃ)はＡＡ像、（ｄ)は位相差像を示す。
（ａ）のバーの長さは２０μｍをあらわす。
【図１０】図１０は、図９の実験におけるＤＡ像をＤＤ
像で割ることによって得られた比画像を擬似色で示した
ものである。図中、（ａ）は5分後、（ｂ）は２０分後
を示す。
像で割ることによって得られた比画像を擬似色で示した
ものである。図中、（ａ）は5分後、（ｂ）は２０分後
を示す。
【図１１】図１１は、一組の蛍光標識プローブをｍＲＮ
Ａ発現細胞にマイクロインジェクションで導入した後の
細胞の蛍光像の時間変化を示す蛍光顕微鏡写真である。
ここで、Ｄ２ＦＢＬとＡ２ＦＢＬをトランスフェクト処
理したＣｏｓ７細胞に導入した。図中、（ａ）は１分
後、（ｂ）は５分後、（ｃ）は１０分後、（ｄ）は２０
分後を示す。（ａ）のバーの長さは２０μｍをあらわ
す。
Ａ発現細胞にマイクロインジェクションで導入した後の
細胞の蛍光像の時間変化を示す蛍光顕微鏡写真である。
ここで、Ｄ２ＦＢＬとＡ２ＦＢＬをトランスフェクト処
理したＣｏｓ７細胞に導入した。図中、（ａ）は１分
後、（ｂ）は５分後、（ｃ）は１０分後、（ｄ）は２０
分後を示す。（ａ）のバーの長さは２０μｍをあらわ
す。
【図１２】図１２は、図８、１１、１３、１４の実験に
おいて、各細胞の細胞質のＤＡ／ＤＤ値を時間に対して
プロットしたものである。図中、（ａ）は図１１の細
胞、（ｂ）は図１３の細胞、（ｃ）は図１４の細胞、
（ｄ）は図８の細胞を示す。
おいて、各細胞の細胞質のＤＡ／ＤＤ値を時間に対して
プロットしたものである。図中、（ａ）は図１１の細
胞、（ｂ）は図１３の細胞、（ｃ）は図１４の細胞、
（ｄ）は図８の細胞を示す。
【図１３】図１３は、一組の蛍光標識をｍＲＮＡ発現細
胞にマイクロインジェクションで導入した後の細胞の蛍
光像の時間変化を示す蛍光顕微鏡写真である。ここで、
Ｄ２ＦＢＬとＡ２ＦＢＬをトランスフェクト処理してい
ないＣｏｓ７細胞に導入した。図中、（ａ）は１分後、
（ｂ）は５分後、（ｃ）は１０分後、（ｄ）は２０分後
を示す。（ａ）のバーの長さは２０μｍをあらわす。
胞にマイクロインジェクションで導入した後の細胞の蛍
光像の時間変化を示す蛍光顕微鏡写真である。ここで、
Ｄ２ＦＢＬとＡ２ＦＢＬをトランスフェクト処理してい
ないＣｏｓ７細胞に導入した。図中、（ａ）は１分後、
（ｂ）は５分後、（ｃ）は１０分後、（ｄ）は２０分後
を示す。（ａ）のバーの長さは２０μｍをあらわす。
【図１４】図１４は、一組の蛍光標識プローブをｍＲＮ
Ａ発現細胞にマイクロインジェクションで導入した後の
細胞の蛍光像の時間変化を示す蛍光顕微鏡写真である。
ここで、ストレプトアビジンに結合させたリンカ−導入
プローブ（センス配列をもつプローブ：Ｄ２ＳＦＢＬ、
Ａ２ＳＦＢＬ）をトランスフェクト処理したＣｏｓ７細
胞に導入した。図中、（ａ）は１分後、（ｂ）は５分
後、（ｃ）は１０分後、（ｄ）は２０分後を示す。
（ａ）のバーの長さは２０μｍをあらわす。
Ａ発現細胞にマイクロインジェクションで導入した後の
細胞の蛍光像の時間変化を示す蛍光顕微鏡写真である。
ここで、ストレプトアビジンに結合させたリンカ−導入
プローブ（センス配列をもつプローブ：Ｄ２ＳＦＢＬ、
Ａ２ＳＦＢＬ）をトランスフェクト処理したＣｏｓ７細
胞に導入した。図中、（ａ）は１分後、（ｂ）は５分
後、（ｃ）は１０分後、（ｄ）は２０分後を示す。
（ａ）のバーの長さは２０μｍをあらわす。
【図１５】図１５は、一組の蛍光標識プローブをｍＲＮ
Ａ発現細胞にマイクロインジェクションで導入した後の
細胞の蛍光像を示す蛍光顕微鏡写真である。ここで、Ｄ
２ＦＳＢＬとＡ２ＦＳＢＬをトランスフェクト処理した
Ｃｏｓ７細胞に導入した。図中、（a）はＤＤ像、
（ｂ）はＤＡ像、（ｃ）はＡＡ像、（ｄ）は位相差像を
示す。
Ａ発現細胞にマイクロインジェクションで導入した後の
細胞の蛍光像を示す蛍光顕微鏡写真である。ここで、Ｄ
２ＦＳＢＬとＡ２ＦＳＢＬをトランスフェクト処理した
Ｃｏｓ７細胞に導入した。図中、（a）はＤＤ像、
（ｂ）はＤＡ像、（ｃ）はＡＡ像、（ｄ）は位相差像を
示す。
【図１６】図１６は、図１５の実験におけるＤＡ像をＤ
Ｄ像で割ることによって得られた比画像を擬似色で示し
たものである。図中、（ａ）は5分後、（ｂ）は２０分
後を示す。
Ｄ像で割ることによって得られた比画像を擬似色で示し
たものである。図中、（ａ）は5分後、（ｂ）は２０分
後を示す。
【図１７】図１７は、プローブをインジェクションした
個々の細胞について、細胞質のＤＡ／ＤＤ値をプロット
したものである。個々のマーカーが個々の細胞を表わ
す。ここで、Ｄ２ＦＢＬとＡ２ＦＢＬを各１ｘ１０5分
子混合した溶液をトランスフェクト処理したＣｏｓ７細
胞にトランスフェクト後、３−５、２４、４８、７２時
間後にマイクロインジェクションで導入した。コントロ
ール実験として、Ｄ２ＦＢＬとＡ２ＦＢＬをトランスフ
ェクト処理していない細胞に（コントロール１）、Ｄ２
ＳＦＢＬとＡ２ＳＦＢＬをトランスフェクト処理した細
胞に（コントロール２）インジェクションした。
個々の細胞について、細胞質のＤＡ／ＤＤ値をプロット
したものである。個々のマーカーが個々の細胞を表わ
す。ここで、Ｄ２ＦＢＬとＡ２ＦＢＬを各１ｘ１０5分
子混合した溶液をトランスフェクト処理したＣｏｓ７細
胞にトランスフェクト後、３−５、２４、４８、７２時
間後にマイクロインジェクションで導入した。コントロ
ール実験として、Ｄ２ＦＢＬとＡ２ＦＢＬをトランスフ
ェクト処理していない細胞に（コントロール１）、Ｄ２
ＳＦＢＬとＡ２ＳＦＢＬをトランスフェクト処理した細
胞に（コントロール２）インジェクションした。
【図１８】図１８は、一細胞あたり発現されたc−fos
mRNAの平均分子数をトランスフェクション後、それぞれ
の時間においてドットブロットによって推定した結果を
示したものである。
mRNAの平均分子数をトランスフェクション後、それぞれ
の時間においてドットブロットによって推定した結果を
示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 石橋 要 静岡県浜北市平口5000番地 株式会社分子 バイオホトニクス研究所内 Ｆターム(参考） 2G054 AA08 BA01 CA30 CB02 CE02 EA03 EB01 GA04 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 CA12 HA14 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QQ53 QR32 QR43 QR48 QR51 QR56 QR63 QR66 QR67 QS02 QS03 QS34 QS36 QX02
Claims (7)
- 【請求項１】 生細胞の細胞質内に存在する標的核酸を
検出する方法であって、前記細胞質に、核膜透過阻害分
子がリンカーを介して結合され、さらに前記標的核酸に
ハイブリダイズ可能な塩基配列を有する、蛍光色素で標
識された検出用プローブを導入し、該標的核酸と前記プ
ローブとのハイブリッド体を形成させ、さらに前記ハイ
ブリッド体形成に基づく前記蛍光色素の蛍光変化を測定
することを特徴とする前記検出方法。 - 【請求項２】 前記検出用プローブが、第１のプローブ
および第２のプローブからなり、該第１のプローブと、
該第２のプローブとは、前記標的核酸に互いに隣接して
ハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該第１のプロー
ブがエネルギードナー蛍光色素で標識され、そして該第
２のプローブがエネルギーアクセプター蛍光色素で標識
され、前記蛍光色素の蛍光変化が、該第１のプローブの
エネルギードナー蛍光色素から該第２のプローブのエネ
ルギーアクセプター蛍光色素への蛍光共鳴エネルギー移
動（ＦＲＥＴ）であることを特徴とする請求項１に記載
の検出方法。 - 【請求項３】 核膜透過阻害分子が、ストレプトアビジ
ン、アビジン、デキストラン、ビーズ、および金属粒子
からなる群より選ばれる少なくとも１つであることを特
徴とする請求項１または2に記載の検出方法。 - 【請求項４】 検出用プローブが、さらにリンカーを介
して該検出用プローブに結合された核酸分解酵素阻害分
子を有していることを特徴とする請求項１〜３のいずれ
か一項に記載の検出方法。 - 【請求項５】 前記核酸分解酵素阻害分子が核膜透過阻
害分子と同一であることを特徴とする請求項４に記載の
検出方法。 - 【請求項６】 検出用プローブが１０乃至２０塩基から
なるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項
１〜５のいずれか一項に記載の検出方法。 - 【請求項７】 標的核酸がｍＲＮＡであることを特徴と
する請求項１〜６のいずれか一項に記載の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37390499A JP3513068B2 (ja) | 1999-05-12 | 1999-12-28 | 生細胞の細胞質内標的核酸を検出する方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13183899 | 1999-05-12 | ||
| JP11-131838 | 1999-05-12 | ||
| JP37390499A JP3513068B2 (ja) | 1999-05-12 | 1999-12-28 | 生細胞の細胞質内標的核酸を検出する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001025400A true JP2001025400A (ja) | 2001-01-30 |
| JP3513068B2 JP3513068B2 (ja) | 2004-03-31 |
Family
ID=26466560
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP37390499A Expired - Fee Related JP3513068B2 (ja) | 1999-05-12 | 1999-12-28 | 生細胞の細胞質内標的核酸を検出する方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3513068B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006505774A (ja) * | 2002-11-07 | 2006-02-16 | エラスムス ユニフェルシテイト ロッテルダム | 腫瘍特異的融合蛋白質の検出のための方法およびプローブ |
| JP2010133969A (ja) * | 2002-08-28 | 2010-06-17 | Carl Zeiss Surgical Gmbh | 顕微鏡システムおよび顕微鏡システムの作動方法 |
| CN113166758A (zh) * | 2018-12-03 | 2021-07-23 | 国立研究开发法人科学技术振兴机构 | 荧光发生核酸分子以及荧光标记靶rna的方法 |
| CN113281313A (zh) * | 2021-04-16 | 2021-08-20 | 安徽大学 | 实时定量细胞核内rna输出的生物荧光探针及其制备方法 |
Citations (5)
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|---|---|---|---|---|
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| JPH09500280A (ja) * | 1993-07-20 | 1997-01-14 | ユニバーシテイ・オブ・マサチユセツツ・メデイカル・センター | 核酸のインビボハイブリッド形成方法 |
| WO1997002840A1 (fr) * | 1995-07-10 | 1997-01-30 | Institut Pasteur | Immunovecteurs utilisables pour le transport intracellulaire et intranucleaire |
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| WO1999005302A1 (en) * | 1997-07-24 | 1999-02-04 | The Perkin-Elmer Corporation | Conjugates of transporter peptides and nucleic acid analogs, and their use |
-
1999
- 1999-12-28 JP JP37390499A patent/JP3513068B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| CN113281313B (zh) * | 2021-04-16 | 2023-05-09 | 安徽大学 | 实时定量细胞核内rna输出的生物荧光探针及其制备方法 |
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