JPH02502516A - 新規なオリゴデオキシヌクレオチド、それを使用した標的遺伝子の発現をブロックする方法、及び新規なオリゴデオキシヌクレオチド並びにそれを使用した標的遺伝子の発現を阻止する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３′−末端ホスホジエステル結合の修飾によって安定化したＤＮＡ分子とＲＮＡ 分子、及びそれらを、核酸プローブとしかつ治療剤として使用し、特異的標的と なる遺伝子の発現をブロックする方法 五豊衾 本発明は、国立予防衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏ ｆＨｅａｌｔｈ）からの補助金で進めていた研究過程で発明されたものである。

補助金番号ＨＬ−３３５５５及びＡＭ−２５２９５゜ｌ豆皮ｉ見 核酸、即ちデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮＡ）は、生体細胞に不 可欠な構成ブロックであることはよく知られている。これらの化合物は、多くの 「ヌクレオチドｊ単位から構成される高分子量ポリマーで、各ヌクレオチド単位 は塩基（プリン又はピリミジン）、糖（リボース又はデオキシリボース）、及び リン酸分子から構成されている。ＤＮＡは糖集団としてのデオキシリボースと塩 基のアデニン、グアニン、シトシン及びチミン（これらはそれぞれＡ、Ｇ、Ｃ及 びＴと表される）を含んでいる。ＲＮＡはデオキシリボースの代わりにリボース と、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）を含んでいる。

ＤＮＡ及びＲＮＡ内のヌクレオチド単位は一定の直線シーケンスで組み立てられ 、そのシーケンスが生物学的機能を決定する。正常の嘴乳類動物の細胞では、Ｄ ＮＡは自己複製し。

またＲＮＡ分子を合成する際の鋳型としても機能する。このＲＮＡ分子のヌクレ オチド・シーケンスはＤＮＡによって符号化された情報を伝える。ＲＮＡ分子は 細胞内で様々な機能を持っている。メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）はタン パク質合成を指令する。

有名なワトソンークリック・モデルによると、ＤＮＡ分子は共通軸の回りに巻か れた２本のポリヌクレオチド連鎖から構成されている。この二重らせんは、各連 鎖の相補塩基対の間の水素結合によって維持されている。水素結合はアデニン（ Ａ）とチミン（Ｔ）の間、及びグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の間にしかない 、したがって、二重らせん内ではアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）はＡ−Ｔとして 互いに結合している相補塩基のように見える。同じ事はグアニン（Ｇ）とシトシ ン（Ｃ）にも言える（Ｇ　−Ｃ）。

１本のポリヌクレオチド連鎖では任意のシーケンスのヌクレオチドが可能である 。しかし＋　ＤＮＡ分子の１本の連鎖内の塩基の順序が一旦決定されると、前述 の塩基ベアリングのためにその他の鎖のシーケンスも同時に決定する。従って。

ＤＮＡ分子の各連鎖はもう一方の補足である。ＤＮＡ複製の過程では、２本の連 鎖が相補ヌクレオチドシーケンスをもつ新しい２本の鎖を合成する際の鋳型とし て機能する。その結果、それぞれが元々の連鎖１本とそれを相補する新しく合成 された達ｊＪ１本をもつ新しいＤＮＡ分子が２個生成される。

この過程は半保守的複製と呼ばれ、ヌクレオチドシーケンスによって決定するＤ ＮＡ内に符号化された遺伝情報は、一つの世代から次の世代へと伝達される。

生物の遺伝情報はまとめてゲノムと呼ばれる。バクテリアやそれより高等な全て の種のゲノムはＤＮＡから構成されている。ウィルスのゲノムはＤＮＡ又はＲＮ Ａのいずれかである。いずれにせよ、ウィルスであれ、バクテリアであれ、また はより高等な生物であれ、特定の種のゲノムは特徴的なヌクレオチドシーケンス を持っており、それは簡単に言えば。

その種のｒ指紋」として見ることが出来る。

転写の過程でＤＮＡはＲＮＡにコピー即ち転写される１合成されるＲＮＡ分子は １本鎖である。そのヌクレオチドシーケンスはＤＮＡ分子の２本の連鎖の内１本 のセグメントを補足するもので、従って、チミンがウラシルと代わる以外は対応 する連鎖の正確なコピーである。１個のＲＮＡ分子を形成するようにコピーされ るＤＮＡの長さが１個の遺伝子である。

人間のゲノムには約５万個の遺伝子が含まれている。

メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）はタンパク質合成に必要なコーディング情 報を運ぶ、ｍＲＮａ分子内のヌクレオチドシーケンスは、そのｍ　ＲＮ　Ａが指 令する合成で出来上がるタンパク質のアミノ酸配列を指令する。ヌクレオチドが ３個配列したコドンと呼ばれる単位は、特定のアミノ酸を指定する。ｍＲＮＡが タンパク質合成を指令する過程は翻訳と呼ばれる。ｍＲＮＡの翻訳は、側腹の細 胞室内にあるリポソームで起こる。

遺伝子からタンパク質への情報の流れは次の図で表すことが出来る： 転写　　翻訳 遺伝子−−−→ｍＲＮＡ−−−→タンパク買生体で作られるそれぞれのタンパク 質にはそれに対応する遺伝子が１個存在する。

分子生物学分野では、オリゴデオキシリボヌクレオチド。

即ち指定されたｍＲＮＡの一部を補足するヌクレオチドシーケンスを持つ短い１ 本鎖ＤＮＡの２ラグメントを、対応する遺伝子の表現を抑制するために使用出来 ることは良く知られている。これは前述の塩基ベアリングの規則に従えば、オリ ゴヌクレオチドのｍＲＮＡへの雑種形成（結合）によって起こり、！２）ＲＮＡ の翻訳を防止する。この翻訳の抑制は、オリゴヌクレオチドで形成されたＲＮＡ −ＤＮＡ二重らせんにある酵素ＲＮａｓｅＨがｍ　ＲＮ　Ａを裂開することによ って起こることが最近発見された（第１図参照）、オリゴヌクレオチドのｍＲＮ Ａとの雑種形成は、一般に、それ自体では翻訳を有意に抑制するには不十分であ る。翻訳の過程でｍＲＮＡに結合しているオリゴヌクレオチドをはぎ取れること は明らかである。この結果から、修正したオリゴヌクレオチドが遺伝子の表現を 有効にブロックするには１選択したｍＲＮＡで形成された雑種がＲＮａｓｅＨに よって識別され、酵素によって裂開されなければならないことは推論できる。

第１図に概略した雑種で抑制された翻訳の過程は、治療剤としてオリゴヌクレオ チドを使用できることを明らかに示唆している。オリゴヌクレオチドはあるウィ ルス又はバクテリアの複数に不可欠な特定の遺伝子の表現を選択的にブロックす ることによって、抗菌剤として作用するであろう、同時に。

コントロール出来ない癌細胞の増殖に責任がある又は増殖に必要な遺伝子にター ゲットを合わせたヌクレオチドは、抗癌剤として有用となるだろう、また現在適 切な治療法が存在しない鎌状赤血球貧血やセラセミアといった遺伝子病の治療に も利用できる。このアプローチではどの遺伝子でもターゲットにすることが出来 る。従来の化学治療薬の開発で大きな障害となっている薬剤特異性の問題は、選 択したｍ　ＲＮ　Ａを補足する適当なオリゴヌクレオチドシーケンスを選択する ことによってすぐに解決出来る。これによって薬剤の特異性が無いために起こる 。現在ある全ての抗ウィルス剤及び抗癌剤において深刻な限界となっている毒性 の問題を回避することが出来る。

ヒトの病気を治療するために１選択した遺伝子の表現をブロックするオリゴヌク レオチドを使用することの他に、その他のアプリケーションも認識されている。

その中には、獣医学において殺虫剤又は殺菌剤としてこれらのオリゴヌクレオチ ドを使用することや、工業又は農業プロセスにおいてそのプロセスで使用する生 物によって特定の遺伝子の表現を抑制することなどがある。

治療剤としてオリゴヌクレオチドを使用することにおける大きな問題点は、血液 及び細胞内でオリゴヌクレオチドが迅速に減成することである。ＤＮＡ又はＲＮ Ａを減成する酵素はヌクレアーゼと呼ばれる。この酵素は、ＤＮＡ又はＲＮＡ鎖 内でヌクレオチドを結合しているホ、スホジエステル結合を加水分解し１分子を 小さいフラグメントに裂開する。

過去にもヌクレアーゼの減成に耐性のあるオリゴヌクレオチド類似体の開発にお いて少しの進歩があったが、特定の遺伝子の表現をブロックするためにこのよう な誘導体を使用することは成功しなかった０例えば、１９８４年９月４日発効の Ｔｓ’。

らの米国特許第４，４６９，８６３号；　１９８５年３月２６日発効のＭｉｌｌ ｅｒらの米国特許第４，５０７，４３３号；　１９８５年４月１６日発効のＭｉ ｌｌｅｒらの米国特許第４，５１１，７１３号を参照されたい０以上の特許は１ 選択した遺伝子の表現をブロックするという目的は共通であるが、高濃度のオリ ゴヌクレオチドが必要であり、それと比べては選択性に欠けることから判断して 、取られたアプローチは成功とは呼べないものであった０以上３点の特許で説明 されている研究では、主工立リン酸塩基がメチルリン酸塩の形に修正されたオリ ゴヌクレオチドを使用している：ここでＢ、及びＢ８は核酸塩基である（Ａ、Ｇ 、Ｃ，又Ｔ）。

米国特許第４，４６９，８６３号は、ｑオリゴヌクレオチドのメチルリン酸塩修 正を使用している。米国特許第４，５０７゜４３３号ではポリスチレン・サポー ト上にデオキシリポ核酸メチルリン酸塩を合成するというプロセスを使用してい る。また、米国特許第４，５１１，７１３号は、核酸の塩基シーケンスを判定し 。

その機能に干渉するために適切に合成したオリゴヌクレオチド・メチルリン酸塩 にそれを雑種形成するというものである。

これらの完全に修正したメチルリン酸塩類似体を使用した場合、その活性は低く 、ｍＲＮＡと雑種形成した場合。

ＲＮａｓｅＭに対して有効な基質を形成するかは疑わしい、第２例に示した結果 はこれを表している。

治療剤としてもっと利用できる新しいオリゴヌクレオチド類似体を考案しようと いう努力の中で、我々はオリゴヌクレオチドが血液及び細胞内で減成する経路を 研究した。その結果、血液中における唯一の減成経路（第３例）及び細胞内にお ける優勢な減成経路（第４図）は、ＤＮＡ鎖の３′−及び５′−末端からの連続 減成であり、１度に１個のヌクレオチドが除去されることが分かった。この減成 経路は第２図に示した。この結果は初めて、　ＲＮａｓｅＨに対する基質形成能 力を損なうことなくその減成を抑制するように修正されたオリゴヌクレオチド類 似体の考案の合理的基本となった。

その後、３′−最高（腸ｏｓｔ）ヌクレオチド間結合のみを修正したオリゴヌク レオチドが血液及び細胞内の減成から顕著に保護されることが分かった（第５例 ５第６例）、更に、この誘導体は正常の雑種形成特性を持っており、ＲＮａｓｅ Ｈによって認識・裂開されるｍ　ＲＮ　Ａと基質を形成し、それによって目標遺 伝子の表現を防止することを我々は発見した（第７例）。

減成しにくく従って治療利用時により有効となるオリゴヌクレオチドによって５ 選択した遺伝子の表現を抑制することが、この発明の主要目的である。

その他の目的としては、３′−ホスホジエステル結合を修正したオリゴヌクレオ チドの調製と、治療に適した方法で修正オリゴヌクレオチドを処方することが上 げられる。また、このように修正したＤＮＡ又はＲＮＡ分子は１診断アプリケー ションにおいて雑種形成プローブとして有用であろうことも明らかである。この 場合、３′−ヌクレオチド間結合の修正によって、検体内に存在するかもしれな いヌクレアーゼによるプローブの減成が抑制されるであろう。

図面の簡単な説明 第１図は、この発明のプロセスにより、ｍ　ＲＮ　Ａ内でオリゴヌクレオチドを その相補配列とハイブリッド形成し、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重らせんにおいて酵素Ｒ ＮａｓｅＨによりｍＲＮＡを開裂することによって１選択した遺伝子の表現がど のようにブロックされるかを示す模式図である。

第２図は、鎖の３′−〜５′−末端から一度に１個のヌクレオチドを順々に除去 するヌクレアーゼの作用による。１本鎖ＤＮＡ分子の分解を示す図である。

第３図は、ヒト血液内のＤＮＡフラグメントの唯一の分解経路が、ＤＮＡ鎖の３ ’−〜５’−末端からの外付（ｅｘｏｎｕｅｌｅｏｌｙｔｉｅ）開裂によるもの であることを示す放射能写真の図である。この実験で使用したオリゴヌクレオチ ド分子１５は、　５’−ＧＡＧＣＡＣＣムＴＧＧＴＴ丁Ｃという配列を持ってい る。レーン１〜５では”Ｐによってオリゴヌクレオチド分子の５′−末端を放射 能樺識した。

レーン６〜１０では、３′一端末のヌクレオチド間結合を■Ｐで標識した。４１ 識したオリゴヌクレオチドを３７℃のヒト血液内で培養した。示した暗闇にアリ コツトを取り出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。ゲル内 の４１２した帯は、放射能写真によって視覚化した。

第４図は、３′−最高ヌクレオチド間結合のみが修正されたオリゴヌクレオチド が、ヒト血液中における減成に完全に耐性があることを実証する放射能写真の図 である。オリゴヌクレオチドは、３′−末端ヌクレオチド間結合が２．２．２− ）−リクロロー１，１−ジメチルエチルホスホトリエステルであるＭＡ−１５の 誘導体である。レーン１は培養前のオリゴヌクレオチドである。

レーン２〜５はオリゴヌクレオチドをそれぞれ１５分、１時間、４時間、及び１ ８時間血液中で培養した後に取り出したアリコツトである０元の帯の強度が減少 したのは、オリゴヌクレオチドが分解したためと言うよりも、単に５′−末端の 標識が除去されたことによるものである。Ｐｉは無機リン酸塩である。

第５図は、３′−ヌクレオチド間結合が修正されたオリゴヌクレオチドが、ＲＮ ａｓｅＨによって作用するｍ　ＲＮ　Ａと基質を形成し、その結果ＲＮＡ−ＤＮ Ａの二重らせんにおいてｍ　ＲＮＡが開裂することを実証したノザン（Ｎｏｒｔ ｈｅｒｎ）法の放射能写真の図である。レーン１は単なるマウスのグロビンｍ　 ＲＮ　Ａである。レーン２はオリゴヌクレオチドが存在しない条件下でＲＮａｓ ｅ）Ｉによって培養したマウスのグロビンｍＲＮＡである。

レーン３はＭＡ−１５とハイブリッド形成を行うＲＮａｉｅＨによって開裂した グロビンｍ　ＲＮ　Ａである。レーン４では、ＲＮａｓｅ）ｌの基質が、３′− 末端ヌクレオチド間結合がトリクロロジメチルエチル・ホスホトリエステルであ るＭＡ−１５の誘導体によって形成されている。レーン５では、使用したオリゴ ヌクレオチドが分子の５　’−０）１基においてナフチルイソシアン酸塩によっ てさらに修飾された。サンプルは１．５％アガロースゲルで電気泳動した。電気 泳動後、ゲルを遺伝子スクリーンプラス（ＤｕＰｏｎｔ）の上にプロットし、α −グロビンｍ　ＲＮＡのプローブとして０Ｐで標識したＭＡ−１５を用いて帯の 位置をつきとめた。

又薦じ日」稔 本発明は方法、手段、及び組成物から構成されるが、これらが−緒になって３′ −末端ホスホジエステル結合において修飾され、それによって細胞及び体液内で の分解に耐性を持つことになったオリゴヌクレオチドを、特定の遺伝子の発現の 選択的ブロックに利用できるようになる。方法とは、修飾オリゴヌクレオチドを 対応するｍ　ＲＮ　Ａとハイブリッド形成し。

酵素ＲＮａｓｅＨが完全に識別できる基質を形成し、それに続いて。

標的遺伝子の表現がブロックされるようにＲＮ　Ａ　−Ｄ　Ｎ　Ａ二重らせんに おいてｍ　ＲＮ　Ａを開裂するというものである。また、この発明は、３′−末 端ホスホジエステル結合において修飾したＤＮＡ及びＲＮＡ分子を診断において 核酸プローブとして利用することについても詳しく説明いている。

目の　な 大まかに言えば１本発明の目的は、３′−末端ホスホジエステル結合において修 飾したオリゴヌクレオチドによって達成されている。これが達成される時、オリ ゴヌクレオチドは細胞及び血液内のヌクレアーゼによる分解に対し顕著な耐性が あることが発見された。このように修飾されたオリゴヌクレオチドは、ｉ常、相 補核酸配列とハイブリッド形成し、ＲＮａｓｅＨによって識別・開裂されるｍＲ ＮＡと基質を形成することも同様に重要であるｓ　ｍ　ＲＮ　Ａの開裂の結果、 対応する遺伝子の表現が選択的にブロックされる。これは様々な治療法にとって 望ましいことである。

ＤＮＡ組換え技術を採用した分子生物学の最近の進歩によって、新しい診断法及 び治療法が登場している。ＤＮＡ診断では、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブが相補核 酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）配列の検出に使用されている。この過程ではプローブの 相補配列がサンプル内に存在すれば、プローブはそれと雑種形成する。＊的配列 はバクテリア又はウィルスのＤＮＡ又はＲＮＡ分子であるかもしれないし、或い は鎌状赤血球貫血のような遺伝子異常を引き起こす変形遺伝子であるかもしれな い９分析するサンプルはしばしばニトロセルロースやナイロンメンブランといっ た固体のサポート上に固定される。プローブは放射能、蛍光又は酵素マーカーと いった椋識を持っており、検出を可能にする。ＤＮＡ診断の分野は現在非常に積 極的に研究されている最中であり、感染症、癌、及び遺伝子異常の診断に用途を 持っている。しかし、まだ臨床で広く使用されている物質はない、現在ある方法 は研究ツールとしては極めて有用であるが、多くの実際のアプリケーションに対 しては感受性を欠いており、臨床の場でルーチンに信頼性高く実行するにはしば しば余りに複雑である。

ＤＮＡ治療においては、対応するｍＲＮＡ内の相補配列とハイブリッド形成を行 い、ｍＲＮＡが翻訳されるのを防止することによって標的遺伝子の表現をブロッ クするためにオリゴヌクレオチドが使用されている。このようにして、その遺伝 子によって符号化されたタンパク質の合成がブロックされる。前述の特許３件で 採用されている基本的概念はこのようなものである。しかし、この発明の核心を 形成している最近の研究では、標的遺伝子の表現のブロックは、オリゴヌクレオ チドのｍＲＮＡへのハイブリッド形成のみによっておこるのではなく、このよう にして形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ二重らせんが酵素ＲＮａｓｅＨに対する基質と して機能することも必要であることが分かった。ＤＮＡ複製に必要な偏在酵素で あるＲＮａｓｅ）Ｉは、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖においてｍ　ＲＮ　Ａを消化する 。開裂するのはｍＲＮＡのみである。オリゴヌクレオチドは無傷で解放され、第 １図の点線で表したようにその他のｒｎ　ＲＮ　Ａ分子と繰り返し反応すること ができる。その際、オリゴヌクレオチドの各分子の効果は増強され７椋的遺伝子 の発現がブロックされる効率が高まる。

ＲＮａｓｅＨはＲＮＡ−ＤＮＡ二重らせんでしか作用しないが、ＲＮＡ−ＤＮＡ 二本鎖は酵素に対する基質として機能しない。

従って、治療にはＲＮＡ分子よりもオリゴ±ｉ　’Ｆ−２２シ（ヌクレオチド（ 短い一本鎖のＤＮＡフラグメント）の方が好ましい１診断用のプローブとしては ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のいずれかを使用することができる。

ＤＮＡ診断及びＤＮＡ治療において直面する唯一の問題は、プローブ又は治療剤 として使用されるＤＮＡ又はＲＮＡ分子が１体液及び組織に存在するヌクレアー ゼという加水分解酵素によって分解することである。この問題はＤＮＡ治療では 特に大きな問題である。オリゴヌクレオチドは血液内で分解し、細胞内ではさら に速い速度で分解する。その減成速度は薬剤の効果を完全になくすのに充分な程 である。ＤＮＡ診断検査用の臨床サンプルを調製するとき、混濁しているヌクオ チドを除去する努力が行われている。しかし、低レベルではあるがまだ活性は残 っていることがある。ある場合には、特に遺伝子検査に応用する場合には、検出 方法は標的配列にハイブリッド形成されるときのプローブの特異的開裂に基づく 。

プローブの非特異的減成はバックグラウンド信号を増加し。

プローブが標的を開裂したかどうかが曖昧になる。

ヌクレアーゼは鎖内でヌクレオチド単位を結合させているホスホジエステル結合 を加水分解することによって、ＤＮＡ又はＲＮＡ連鎖の減成に触媒作用を及ぼし 、その際分子を小さいフラグメントに開裂する。ハイブリッド形成プローグとし て有用なりＮＡ又はＲＮＡ分子の長さは、ヌクレオチド約１５個分から数十個以 上まで様々である。治療剤として有用なりＮＡフラグメントの長さは、ヌクレオ チド約１０個分から約７５個分まであり、特に１５から３５個分のシのが好まし ｔｌ、このように、プローブ又は治療剤として使用されるＤＮＡ又はＲＮＡ分子 は、ヌクレアーゼによる開裂が起こるかもしれないいくつかの潜在部分を持って いるといえる。

分子生物学の分野では、ヌクレアーゼによる酵素開裂が通常起こるホスホジエス テル結合は、リン酸基を補正することによって保護できることが一般に知られて いる。前述の特許３件のような今までの努力は、連鎖内の全てのリン酸基が修正 されている誘導体、又はオリゴヌクレオチドの合成後にリン酸基が無作為に大規 模に補正された誘導体に焦点を合わせたものであった〔ツリス（Ｔｕｌｌｉｓ、 　Ｒ，Ｈ，）：　Ｐ、Ｃ，ＴＪ０８３１０１４５１゜１９８３年〕、シかし、こ のような修飾はしばしばＤＮＡが標的配列とハイブリッド形成することに干渉し 、その結果１診断及び治療アプリケーションのどちらにおいてもその有用性が限 られたものになる。更に、リン酸基が大規模に修飾されたＤＮＡフラグメントは ＲＮａｓｅ）ｌに対する基質を形成しないことが分かった（第２図）、これでは 治療剤としてこれを使用することが出来ない。

どの理論にも拘束されないことを望みながらこの発明の基本にした重要な発見は 、（Ｉ）治療剤として使用されるオリゴヌクレオチドが標的遺伝子の表現をブロ ックするメカニズムは、対応するｍＲＮＡとハイブリッド形成し、　ＲＮａｓｅ Ｈに対する基質を形成し５次にｍ　ＲＮ　Ａを開裂するというものである；（２ ）血液内のオリゴヌクレオチドの減成の唯一の経路及び細胞内の減成の優勢経路 は、第２図に示したように鎖の３′−〜５′−末端からの順次減成であるという ことである。このように、ＤＮＡ分子の３７−末端から最初のヌクレオチド閲結 合のみを修飾することによって、ＤＮＡフラグメントの安定性をかなり高めるこ とが出来ることが証明された。これを行うことによって、最初のヌクレオチド単 位の開裂がブロックされ。

それ以上の減成は起こらない、以下で説明するように、３′−末端ヌクレオチド 間結合における様々な置換がこの目的を果たし、修飾する位置が重要な要素とな る。第７例で実証されているように、このように修飾された誘導体は正常のハイ ブリッド形成特性を持っており、　ＲＮａｓｅＨによって識別及び開裂されるｍ 　ＲＮ　Ａと基質を形成する。従って、このように修飾されたオリゴヌクレオチ ドは診断にも治療にも有用である。

オリゴヌクレオチドはかなりマイナスに荷電した分子であるが、測定可能速度で 細胞内に入る。これは最初ザメクニツクとステイーブンソン（Ｚａｍｅｃｎｉｋ 、　５ｔｅｐｈｅｎｓｏｎ）が実施した試験によって示唆された（米国科学アカ デミ−の議事録（１９７８年）互、２８０〜２８４ページ及び２８５〜２８８ペ ージ）、この試験では、ラウス肉腫ウィルスの５′−及び３′−反復シーケンス に相補のオリゴヌクレオチドが、ウィルスの複製及びひよこ胎芽線維芽における 細胞ウィルスタンパク質の合成を抑制することが分かった。これらの試験では、 オリゴヌクレオチドの作用メカニズムは確立されず、また観察された効果がオリ ゴヌクレオチドの産物の減成によるものである可能性が除外されていない、それ にもかかわらず、この試験やヘイキラ（Ｈｅｋｋｉｌａ）らが最近行った試験（ ネイチャー（１９８７年）史。

４４５〜４４９ページ）では、オリゴヌクレオチドは細胞内に入ることが示唆さ れた。また、ザメクニツクとステイーブンソンは、３’−ＯＨ及び５’−ＯＨ基 を非極性置換基、例えばツエルニ基。

及びナフチル基で修飾することによって、オリゴヌクレオチドの活性をかなり高 めることができることを示した。これらの大型の非極性基は細胞膜とオリゴヌク レオチドとの結合力を高め、細胞への輸送を高める。これらの基を導入すれば、 エクソヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの減成を抑制したかもしれない、 しかし、ホスホジエステル基を直接修飾することによってしか、ＤＮＡ又はＲＮ Ａ連鎖内のヌクレオチド間結合の開裂を除外することができない、天然ヌクレオ チドの減成も、修正した誘導体の減成も、この試験では研究されていない、オリ ゴヌクレオチドの減成を研究した最近の試験でさえも、減成が起こる経路につい ては全く触れていない〔ウィックストローム（Ｖｉｃｋｓｔｒｏｍ、　Ｅ、　（ １９８６年）ジャーナル・オブ・バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・ メソッド、川、９７〜１０２ページ〕。

このように１人間やその他の哺乳類動物の組織内に存在する内生的ヌクレアーゼ によるＤＮＡ及びＲＮＡの減成の研究は過去にもあったが、一本領ＤＮＡ分子の 減成が主に３′−〜５′−の外付メカニズムによって起こることは今まで認識さ れていなかった。従って、ここで請求するような修飾誘導体のユニークな価値に ついては予想できなかった。減成の経路が確立されなかったため、領内の選択し たリン酸塩基のみを修飾して安定性を高め、しかもその結果のオリゴヌクレオチ ドがＲＮａｓｅＨによって識別・開裂される基質を形成するようにｍＲＮＡとハ イブリッド形成するというＤＮＡ分子設計の基礎が存在しなかった９以上は治療 アプリケーションにおいてオリゴヌクレオチドを使用する上で必要とされている ことである。

前述のように、３′−水スホジエステル結合を正確に化学的修飾することは、正 確にこの位置で修飾することほど重要ではない０分子のその他少数の位置も、こ の発明の意図からガムることなく修飾できるかもしれない、ＤＮＡ診断の場合、 検品出来るようにするために、核酸プローブに標識を付ける必要がある。これに は放射能、蛍光、電気化学、化学ルミネセント又は酵素マーカーを使用できる。

長さがヌクレオチド約１５個分から３５個分のオリゴヌクレオチドの場合、分子 には僅か１個の！識が付けられる。プローブとして使用されるより長いＤＮＡ又 はＲＮＡ分子は、長さがヌクレオチド数千個分となることもある。このような場 合、標識は領内のヌクレオチド１５個毎に最高１個の割合で付けることができる であろう。

ＤＮＡ治療におけるアプリケーションでは、安定性を更に高め又細胞内への輸送 を容易にするために、３′−ホスホジエステル結合以外の位置でもオリゴヌクレ オチドを修飾することが出来るであろう、血漿中の鉄結合タンパク質であるトラ ンスフェリン、又は表皮成長ファクタといった細胞によって通常取り込まわるキ ャリア分子を付けることによって、標的側地へのオリゴヌクレオチドの輸送が増 大する。又は、所謂免疫毒素の場合のように、標的細胞の表面タンパク質に対す る抗体にオリゴヌクレオチドを付けることも出来る。或いは。

オリゴヌクレオチドの追加リン酸塩基を修正して分子の負の荷電を減らし、それ によって細胞膜の脂肪パイレイヤーを通過する輸送を容易にすることも出来る。

このような修飾を行うと、戻化水素鎖又は芳香基といった非極性置換基も分子内 に組み込まれ、細胞内への取り込みを更に高めることが出来る。領内の追加リン 酸塩基を修飾すると、一部の細胞内に存在する５′−〜３′−エクソヌクレアー ゼ及びエンドヌクレアーゼの活性がブロックされてオリゴヌクレオチドの安定性 が更に高まるであろう（第４例参照）、これらの経路による減成は鎖の３′−末 端からの減成よりも遅いが、二九らの活性をブロックするという追加効果、特に ５′−〜３′−外仁開裂は、多くの場合利益となるかれしれない、しかし、これ ら様々なアプリケーションでは、修飾を限られた数のホスホジエステル基に限定 することが重要である。領内にあるホスホジエステル結合の殆ど又は全てを修飾 した場合、しばしばオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成特性に干渉し、さら に重要なことには、治療剤としてこのような誘導体を使用できなくなる。

何故ならば、　ＲＮａｓｅＨによって作用する標的ｍＲＮＡと基質を形成しなく なるからである。鎖の未修飾部分の長さは最低でもヌクレオチド４個分、出来れ ばヌクレオチド７個分の長さにすることが好ましい、このようにすれば、３′− 末端ホスホジエステル結合が修飾されているためにオリゴヌクレオチドは減成せ ず、また、ｍＲＮＡとハイブリッド形成して。

ＲＮａｓａＨに対する基質を形成する。そのＲＮａｓｅＨはオリゴヌクレオチド の未修飾部分からｍ　ＲＮ　Ａを開裂する。このように。

このような誘導体は選択した遺伝子の発現をブロックする治療剤として利用する ことがでる０次に３′−ホスホジエステル結合を修飾する方法を説明する。

修飾の一部（＋１ｏｉｅｔｙ）は厳密ではない０次の機能性から選択することが できる。

これらの構造ではＲは長さが１個〜２０個分の炭ｊＦＩ原子であり、ハロゲン置 換基（第５例及び第６例のように）又はその他のへテロ原子１例えばＮ、Ｏ又は Ｓが鎖に付くことがある。

二九らの誘導体をａｍする方法は、熟練した技術を持っている人はよく知ってい る簡単な反応である１例えば以下の文献を参考されたい、これらにはここで説明 するタイプの修飾について記載されている：レシンガ（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら 、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ、（１９８２年 ）、　１０４−６８０５〜６８０６ベージ；ステック（Ｓｔｅｃ）ら、ジャーナ ル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテイ、（１９８４年）、　１０ ６．６０７７〜６０７９ページ；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、バイオケミストリ ー（１９８６年）、並、５０９２〜５０９７ベージ：Ｖフローラ−（Ｆｒｏａｈ ｌｅｒ）ら、テトラヘドロン・レターズ、（１９８６年）、互、４６９〜４７２ ページ。

最も都合のいい修飾はホスホトリエステルである。何故ならば１合成が簡単で、 しかもリン原子に付く機能基が様々であるからである。この位置に大きい疎水性 置換基を付けると。

細胞内摂取を容易にするのに利用できるであろう、この研究で実証されているよ うに、ホスホトリエステルはヌクレアーゼによる加水分解にも耐性があり、オリ ゴヌクレオチド領内の限られた数の場所に付けるだけで１分子はｍ　ＲＮ　Ａと 正常にハイブリッド形成を行い、ｍＲＮＡによって開裂される基質を形成する。

現在一般に使用されているどの方法でも、オリゴヌクレオチドは鎖の３′−〜５ ′−末端から合成されている。最初の残基は３　’−ＯＨ基を通じて、孔径がコ ントロールされたボアガラスのような固体サポートに結合される０合成を固体の サポート上でなく溶液中で行うと、最初の残基の３’−ＯＨは１合成が最高潮に 達した時に除去される保護基によってブロックされる。

通常は一度に１個のヌクレオチド単位を、成長する鎖の５′−ＯＨ基に追加する 。或いは、いくつかの残基のブロック１個を１回の反応で追加することもできる 。５’−ＯＨ基へのヌクレオチド間結合を形成する方法はいくつかある。この手 続きは次の研究論文の中で説明されている「オリゴヌレオチドの合成：実際のア プローチ」〔ゲイト（Ｇａｉｔｔ　Ｍ、Ｊ、）ら、ＩＲＬブレス・オックスフォ ード（１９８４年）〕、これは参考としてここに上げである。以下の反応図は、 現在好まれている化学作用であるリンアミド酸塩方法を図示している。

（以下余白） ＤＭＴはジメトキシトリチル保護基であり、Ｓ、Ｓ、は合成を行う固体サポート である。Ｂ、及びＢ２は核酸の塩基である（Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ）。

この反応の直接の生成物はホスホトリエステルである０合成の終わりには、ホス ホジエステル結合を作るために保護基Ｒが除去される。一般に、この目的にはβ −シアンエチル基が使用される。或いは、Ｒは除去されない基とすることも出来 る。この場合、最終生成物はホスホトリエステルで２基Ｒはリン原子に永久的に ついたままとなる。修飾されたホスホトリエステルが鎖の３′−末端から最初の ヌクレオチド間結合に取り込まれるのはこのようにしてである０本質的に同じ化 学作用によって、アルキル又はアリルリン酸塩もこの位置に特異的に導入される 。この場合、基Ｒは酸素を通してでなく直接リン原子に付けられる。同様に、リ ン酸水素塩もこの位置に付けられるかもしれない、このような誘導体を直接使用 するか又は酸化して、ホスホジエステル結合リンアミド酸塩を３′−末端ヌクレ オチド間結合に組み込むことが出来る。

以下の文献には、リン酸水素塩基の修飾について記載されている：フローラー（ Ｆｒｏｅｈｌｅｒ　Ｂ、Ｃ）、テトラヘト０ン−レターズ＋　（１９８６年）、 旦、５５７５〜５５７８ページ、リンチオン酸塩基又はリンセレン酸塩基は、リ ンアミド酸塩の方法で行った酸化をそれぞれ硫酸又はＫＳａＣＮを用いて行うこ とによって、３′−末端ヌクレオチド間結合に組み込むことが出来る。これにつ いては、ステック（Ｓｔｅｃ）ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカ ル・ソサイエテイ、（１９８４年）１里、６０７７〜６０７９ページを参照され たい０合成の終わりには全ての保護基を除去するが、そうして出来た最終産物は 直接使用することも。

或いは熟練者が良く知っているクロマトグラフィーによって精製することも出来 る。これについては、「オリゴヌクレオチドの合成二実際のアプローチ」〔ゲイ ト（Ｇａｉｔ、　Ｍ、Ｊ、）ら、工ＲＬプレス、オックスフォード（１９８４年 ）〕を参照されたい。

ここで説明した手続きは、一般に長さが最高残基約１００個分のオリゴヌクレオ チドの合成に応用できる０診断においてハイブリッド形成プローブとして使用す るために必要とされるような、３′−末端ホスホジエステル基が修飾さ九たこれ より長いＤＮＡ又はＲＮＡ分子を合成するには、化学的方法と酵素方法の組合せ を使用する。このようなシーケンスの合成を実施するには、化学的方法によって 調製した３′−末端ホスホジエステル結合が修飾された短いオリゴヌクレオチド を、長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖の３’−ＯＨ基の上に酵素によって結び付ける。

ここで説明した修正オリゴヌクレオチドの処方及び投与は。

医学者ならば誰にでも明らかな゛はずである０例えば、エイビス（Ａｖｉｓ、　 Ｋ）、（１９８５年）、レミングトンズ・ファーマス−ティカル・サイエンス、 （編集者Ｇｅｎｎａｒｏ、　Ａ、Ｒ，）、１５１８〜１５４１ページ、ペンシル ベニア州イーストン、マツグ・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ ｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照されたい。

これは参考のためここに上げである。このような投与法としては、病気の状態に より局所、経口、非経口などがある。非経口投与の場合の適切な皿形剤としては 、５％デキストロース、通常の生理食塩水、リンゲル液、及びリンゲル乳酸塩が ある。材料も過程も無菌状態でなければならず、エンドトキシンが含まれていて はならない、ある場合には、生成物を凍結乾燥粉末として保管し、必要時に適当 な塩溶液を追加して元に戻すこともできる。

以下の実施例は１本発明の過程、生成物、及び医学的方法をさらに説明し、本発 明がこの分野のこれまでの方法の限界を克服したユニークなものであることを示 している。

第１例 相補オリゴヌクレオチドによる標的ｍ　ＲＮ　Ａの翻訳制御がＲＮａｓｅＨによ るｍＲＮＡの開裂に依存していることの実証 この実験では５’−ＧＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧ丁ＴＴＣ（ＭＡ−１５）及び５　’ −ＴＧＴＣＣＡＡＧＴＧＡＴＴＣＡＧＧＣＣＡＴＣＧＴＴ　（ＣＯＤＭＢ−２５ ）という２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。どちらもリンアミド酸塩の方 法を用いてベックマン自動ＤＮＡ合成器で調製した。　ＭＡ−１５はイニシェー ション・コドンをつなぐマウスα−グロビンｍＲＮＡ内のシーケンスと相補であ る。　ＣＯＤＭＢ−２５はマウスβ−グロビンｍＲＮＡのコード化領域内シーケ ンスとハイブリッド形成をする。マウスのグロビンｍ　ＲＮ　Ａは、グーセンズ とカン（Ｇｏｏｓｅｎｓ、　Ｋａｎ）が説明した方法に従って、フェニルヒドラ ジン処置によって貧血状態にしたマウスの網状赤血球から単離した〔酵素学にお ける方法、アンド二一二、ロシーベルナジ。

チアンコン（Ａｎｔｏｎｉｎｉ、　Ｅ、、　Ｒｏｓｓｉ−Ｂｅｒｎａｄｉ、　Ｌ 、、及びＣｈｉａｎｃｏｎｅ。

Ｅ、）　７６、８０５〜８１７ページ、　１９８１年）　＊　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ での翻訳反応は、ウサギの網状赤血球の溶解物システム内で行った。使用した網 状赤血球はプロメガ・バイオチック社（ＰｒｏＭｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）から購 入したもので、　ＲＮａｓｅＨを含んでいる。翻訳反応は１戸ｇの総マウス網状 赤血球ＲＮＡでプログラムした０反応は３０℃で１時間行わせた。各サンプルに は総量２５μρ中に４５μＣｉの（３＄ｓｌメチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社） が含まれていた。タンパク質合成は、１０％のトリクロロ酢酸に沈澱する材料内 に〔３″Ｓ〕メチオニンを含めることによって測定した。オリゴヌクレオチドを 含めない対照反応では、βグロビンの合成はタンノ（り質内に取り込まれた放射 能の６０％であり、またαグロビンの合成は４０％であった０反応はポリｒＡ／ オリゴｄＴは（５００μｇ／ｍｊｌ）が存在する場合と存在しない場合の両方で 行った。ポリｒＡ／オリゴｄＴはＲＮａｓｅＨの拮抗抑制因子で、使用される濃 度では酵素の活性をほぼ完全にブロックする。　ＭＡ−１５もＣＯＤＭＢ−２５ も目標ｍ　ＲＮ　Ａの翻訳を非常に効果的に抑制した（表１参照）　、　ＭＡ− １５はβグロビンｍ　ＲＮ　Ａの対応するシーケンスにある１５個の残基の内１ ２個に相補であり、従って、βグロビンの合成もある程度は抑制する。ポリｒＡ ／オリゴｄＴはオリゴヌクレオチドの抑制効果を完全にブロックする。これは翻 訳の抑制カー完全にＲＮａｓｅＨによるｍＲＮＡの開裂を媒介にしてｔすること を示唆している。

第１表　　ハイブリッド抑制翻訳におけるＲＮａｓｅＨの役割グロビン合成の抑 制％ オリゴヌクレオチド　　　−ポリｒＡ／オリゴｄＴ　　　　＋ポリｒＡ／オリゴ ｄＴＭＡ−１５（８Ｍ）　　　　　　　　　　　５１　　　　　　　　　　　３ ＣＯＤＭＢ−２５（４戸）６１５ 第２例 メチルリン酸オリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅＨに対する基質を形成しない ＲＮａｓｅＨに対する関連する２種類の基質を比較した。それはポリｒム／オリ ゴｄＴｏ−１，とポリｒＡ／オリゴｄＴ、、メチルリン酸塩（ＭＰ）である、オ リゴｄτｚｚｘａはファルマシア（Ｐｂａｒｍａｃｉａ　ＰＬＢｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌｓ）社から購入した。鎖の長さは１２〜１８個の残基テアった。オリゴｄ Ｔ、、ＭＰはリンアミド酸塩方法を用いてペックマン社の自動ＤＮＡ合成器で合 成した。５′−末端ヌクレオチド間結合は通常のホスホジエステルであり、領内 の残り１６個のリン酸塩基はメチルリン酸塩である。トリチウムで＃Ｓ識したポ リｒＡはアマ−ジャム（ムｍｅｒｓｈａｍ）社から購入した。

各反応は、ｐＨ８，０の５０ｍＭ　トリス−ＨＣｆ１緩衡液、２０ｍＭのＫＣＬ 　９１のＭｇＣＱｚ　、１　ｍＷの２−メルカプトエタノール、及び２５μｇの ウシ血清アルブミン中に、３Ｈ−ポリｒム／オリゴｄＴ、、〜８．又は１Ｈ−ポ リｒム／オリゴｄＴ１．ＭＰのいずれかの基質４４ピコモルを含んだ最終量１０ ０μにで実施した０反応は２．３ユニツトの大腸菌ＲＮａｓｅＨ、ベゼスダ・リ サーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ）社を追加することによって開始し、３７℃で３０分間持続した０反 応後、各サンプルに０．２■ΩのキャリアＤＮＡ液（サケ精液Ｄ　Ｎ　Ａｏ、５ ＋ｍｇ／■Ω、　０．１Ｍビロリン酸ナトリウム。

及び１ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸）プラス０．３ｍｆｌの１０％トリク ロロ酢酸を加えた０次に２０分間試験管を氷の上で培養し、その後１６．ＯＯＯ Ｘｇで１５分間遠心分離した。ＲＮａｓｅＨによるボ１ＪｒＡ連鎖の開裂によっ て、トリクロロ酢酸に沈澱しない小さいフラグメントが生じ、従って上澄み液に 残る。上澄み液を注意深く除去し、液体シンチレーション・カクテルと混合し。

放射能を測定した。ポリｒＡ／オリゴｄ丁との反応は１００％近く進行し、放射 能計数の８５％が可溶化された。それとは対象的に。

ポリｒム／オリゴｄＴ、、ＭＰは１％未満しか酵素によって消化されなかった。

このように、オリゴデオキシリボヌクレオチド類似体のリン酸塩バックボーンの 多く又は全てが修飾された場合、これはＲＮａｓｅＨが認識し開裂する相補ＲＮ Ａ配列と基質を形成しない。

第３例 オリゴヌクレオチドは血液内で専ら３′−〜５′−外仁括性によって減成する この試験の目的は、オリゴヌクレオチドが血液内で減成する経路を確立すること であった。驚いたことに、経路は一つしかないことが分かった。それはＤＮＡ分 子の３′−〜５′−末端からの連続減成であった。

第１例で説明したオリゴヌクレオチドＭＡ−１５は、γａｌｐ−トリリン酸アデ ノシン（γａｌｐ−ムＴＰ、（マージャム社）及び丁４ポリヌクレオチド・キナ ーゼ（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社）を用いて１分子の５７−末端部 分で２ｔｐの放射能標識を付けた： ５−’ＧＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＴにこでアスタリスクは放射能ｉｓ識を表す 、それと番士別シ；、α３２Ｐ−トリリン酸デオキシシチジン（ｄＣＴＰ）及び ＤＮＡポリメラーゼエ（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）を用し１て３′ −最高ヌクレオチド間結合に１！Ｐ−を導入した放射能標識誘導体も準備した： ５’−ＧＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＴ’ＣＤＮＡポリメラーゼエが触媒となる反 応は、５　’−ＧＡＧＣＡＣＣ＾丁ＧＧＴ丁丁とｄＣＴＰの間で起こり、鋳型と して相補ＤＮＡ連鎖を必要とする。標識した誘導体が一本鎖であることを確実に するため１反応後にＷ識しない阿ム−１５を５０倍も余分に追加した。

これらの手続きはＤＮＡフラグメントの放射能標識方法として標準的である１例 えば、ここに例として上げであるマニアティス、フリッチュ、及びサンプルツク （Ｍａｎｉａｔｉｓｙτ、。

Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、及びＳａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、）の　　クローニン グ：監１先即−ニューヨーク、ゴールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ− １１１４〜１１５ページ及び１２２〜１２６ページ、１９８２年を参照されたい 。

ヘパリンを加えて抗凝固処理をした４８μΩの新鮮なヒト血液に、放射能標識を したオリゴヌクレオチド（５Ｘ１０’力ウント／分）プラス２．５ナノモルのｉ ／５ｆｆｉしないＨム−１５を追加した。

サンプルを体温と同じ３７℃で培養した。６μΩのアリコツトを１５分後、３０ 分後、１時間後、及び２時間後に取り出し、各アリコツトの一部をポリアクリル アミドゲル上に乗せて、電気泳動でサイズを基準に生成物を分離した。放射能４ １！識した生成物が見えるようにするために、ゲルを一晩Ｘｉ！フィルムに露出 した。放射能写真の図は第３に示しである。

分子の５′−末端がＳ識されたオリゴヌクレオチド（レーン１〜５）が減成する と、サイズが段々小さくなる別々の生成物が生じる。これは鎖の３′−から５′ −末端にがけての連鎖が順次外付開裂することを示唆している。開裂が連鎖の中 程で起こった場合１反応時間全体を通じて中くらいの長さの生成物が生じるであ ろう２Ｍムー１５を分子の３′−末端でｓｗｔした場合、その結果の放射能写真 （レーン６〜１０）では１時間がたつに従って完全な長さの１５−ｍａｒが消滅 し、それに対応してモノヌクレオチドｐＣが増加した。この結果は、同様に、３ ′−〜５′−外仁活性を実証してもいる。中間サイズの生成物がないことは、５ ′−〜３′−外仁活性、又は外付（内部）開裂活性が存在しないことを示してい る。

ここで説明したのと同じ方法によって、その他の哺乳類種の血液、特にマウス、 ウサギ、及び、ラットの血液でもオリゴヌクレオチドは鎖の３′−末端からのモ ノヌクレオチドの順次裂開のみによって減成することが分かった。

第４例 人間の細胞におけるオリゴヌクレオチド減成の主要経路は、鎖の３′−〜５′− 末端からの連鎖の順次外付開裂によるものである この試験の目的は、オリゴヌクレオチドが人間の細胞中に存在するヌクレアーゼ によって減少する経路を知ることであった。第３例ではＭＡ−１５の放射能＃Ａ 識誘導体を準備した。

オリゴヌクレオチドの減成は１人間の赤白止痛細胞ラインに５６２から１ｌｌｌ した抽出物で調べた。　Ｋ５６２細胞ラインは、２人のロッチオ（Ｌｏｚｚｉｏ 、　Ｃ，Ｂ、、及びＬｏｚｚｉｏ、　Ｂ、Ｂ、、血液（１９７５年）として徹底 的に研究した。細胞を１０ｍＭのトリスバッファ　（ｐ）＋７．４）、並びに５ ｍＭ　ＭｇＣ１，、１ｍＭ　ＣａＣ１，、１００ｍＮ　ＮａＣｆ１−及び０．１ ｚトリトンＸ−１００の中に懸濁し、モーター駆動の低温テフロン乳棒ホモジェ ナイザーで３０秒間均質化した。細胞膜及び細胞小器官は、さらにバイオソニッ ク超音波処理装置をフルパワーで使用して１５秒間のバースト５回による超音波 処理を行いさらに分裂させた。残った細胞破片は５分間１２．ＯＯＯＸｇの遠心 分離を行って除去した。

放射能標識したオリゴヌクレオチドは、第３例で説明したのと同じ条件でに５６ ２細胞抽出物内で培養し、減成生成物をポリアクリルアミドゲルの電気泳動で分 析した。オリゴヌクレオチドの減成は血液内よりもかなり速かった。減成の主要 経路は、やはり３′−〜５′−外仁活性であった。３′−末端ヌクレオチド間結 合の裂開の半減期は２分であった。それより遅い５′−〜３′−外仁活性も観察 さｇｚた。このメカニズムによる鎖からの５′−末端ヌクレオチド単位の裂開の 半減期は２０分であった・ 前述と同じ方法を用いて、その他の哺乳類細胞からＷｒｌＵした抽出物内でもオ リゴヌクレオチドの減成経路を調べた。それにはアフリカミドリザルの腎臓細胞 （ＣＯＳａｌｌｌｌ）やマウスの肝臓細胞がある。その結果、外付活性（連鎖の 中程での裂開）や５′−〜３′−エクソヌクレアーゼも低レベルではあるが存在 することがわかったが、これらの細胞においてもオリゴヌクレオチドの減成の主 要経路は３′−〜５′−エクソヌクレアーゼによるものであった。

第５例 ３′−末端ヌクレオチド間結合部分を修飾したオリゴヌクレオチドは、人間の血 液内での減成を完全にブロックする 分子の３′−末端から最初のヌクレオチド間結合を２．２．２−トリクロロ−１ ，１−ジメチルエチルホスホトリエステルとして修正したオリゴヌクレオチド減 成−１５の誘導体を調製した。ホスホトリエステルは対応する二塩化リンを用い て鋼内に導入した： ｉｃｅの１０％ピリジン−アセトニトリル液に溶解した２０マイクロモルの５１ −デオキシチミジンを１９マイクロモルの二塩化リンに追加した１反応は室温で ５分間行わせた。その結果の一塩化物を、孔の口径をコントロールしであるボア ガラスピーズ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ社）に付けた１マイクロ モルのデオキシシチジンに追加した。ジヌクレオチドホスホトリエステルを産出 するための結合反応は、室温で１５分間行わせた。余分な試薬及び反応の副生成 物は、無水アセトニトリルで洗い流した。ＤＮＡ連鎖の残った部分は、ベックマ ン自動ＤＮＡ合成器を用いてβシアノエチルホスホアミド法によって合成した。

３′−末端ヌクレオチド間結合のみを修飾した。鎖の中の残った１３個のリン酸 基は正常のホスホジエステルである。

修飾オリゴヌクレオチドは、第３例で説明したように。

γ３２ｐ−ムＴＰ及びＴ、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′−末端ＯＨ基 を１２Ｐで＃！識した。放射能１［したオリゴヌクレオチドを３７℃のヒト血液 内で培養した。アリコツトを様々な時間に取り出して、ポリアクリルアミドゲル 電気泳動によって分析した。ゲルの放射能写真の図を第４図に示した。１８時間 中にオリゴヌクレオチドの減成は全く起こらなかった。完全な長さの分子による 帯強度の逓減は、血液内に存在するホスファターゼによってオリゴヌクレオチド から０Ｐ標識が除去されたためであり、連鎖が開裂したためではない。

修飾オリゴヌクレオチドをマウスの血液で培養する同様の試験も行った。ここで もオリゴヌクレオチドの減成は観察されなかった。

第６例 ３′−末端ヌクレオチド間結合を修飾したオリゴヌクレオチドは、ヒト細胞に存 在するヌクレアーゼによる減成を顕著に抑制する この試験でも、第５例で説明したのと同じＭＡ−１５の誘導体、即ち３′−末端 ヌクレオチド間結合を２．２．２−トリクロロ−１，１−ジメチルエチルホスホ トリエステルとして修飾した誘導体を使用した。　Ｋ６５２細胞からの抽出物は 、第４例と同じように調製した。修飾オリゴヌクレオチドを３７℃において細胞 抽出物内で培養した。アリコツトを様々な時間に取り出し、減成生成物をポリア クリルアミドゲル電気泳動によって分析した。

細胞抽出物内に存在する速い３′−〜５′−エクソヌクレアーゼによるこの修飾 オリゴヌクレオチドの減成は、完全にブロックされた。また、天然オリゴヌクレ オチドと比較して、修飾した誘導体は安定性が顕著に高くなっていた。半減期は １０倍であった。減成はに５６２細胞抽出物内に存在する遅い５′−〜３′−外 仁活性によって起った（第４例を参照）、鎖からの５′−末端ヌクレオチドの開 裂の半減期は、約２０分間であった。

ＣｏＳ細胞（アフリカミドリザルの腎ＩＩ）及びマウスの肝１ａＩｉｉｉ胞から ｙ４製した抽出物でも、同様に修飾オリゴヌクレオチドを培養した。どちらの場 合も、３′−末端ヌクレオチド閏結合を修飾した誘導体の半減期は、未修飾オリ ゴヌクレオチドと比較して１０倍から１５倍であった。

第７例 ３′−末端ヌクレオチド間結合を修飾しオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅＨによ って開裂されるｍＲＮＡと基質を形成する マウスのグロビンｍ　ＲＮ　Ａは、第１例で説明したように、フェニルヒドラジ ンで処置した貧血のマウスから単離した。

この試験では１ＭＡ−１５，第５例及び第６例で使用したガム−１５の誘導体、 即ち３′−末端ヌクレオチド間結合がトリクロロジメチルエチルホスホトリエス テルとして修飾された誘導体（ＭＡ−１５−丁ＣＤＭ）、及び５′−末！１ｔＯ Ｈ基をさらにナフチルイソシアン酸塩で修飾した誘導体（ＮＰ）Ｉ−ＭＡ−１５ −ＴＣＤＭ）という３種類のオリゴヌクレオチドを比較した。マウスのグロビン ｍＲＮＡ　（２マイクログラム）を１．１ナノモルのオリゴヌクレオチドに追加 し。

１０ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファ　（ｐＨ７，５）、５ｍＭ　ＮｇＣｌ、、　 ２５ｍＭ　ＮａＣ１゜及び１ｍＭジチオスレイトールを含めて最終溶液が２２マ イクロリツトルになるようにした６反応は大腸菌ＲＮａｓｅＨを２単位追加する ことによって開始し、３７℃で３０分間行った１反応はフェノールとクロロホル ムの１：１混合物によってサンプルを抽出して終了させたｅ　ＲＮａｓｅＨによ る消化後に残ったｍＲＮＡ種は、エタノールによって沈澱させて単離し、　Ｎｏ ｒｔｈｅｒｎプロットで分析した。

ＲＮＡサンプルを、１０ｍＭのリン酸ナトリウム・バッファ（ｐ）１６．５）と ジメチルスルフオキシドとの１：１（体積二体積）混合物内でＩＭのグリオキサ ルによって５０℃で１時間反応させ。

次に１．５％アガロースゲルで電気泳動した。ＲＮＡはメーカーが説明している 方法に従った毛管吸収によって、ゲルから遺伝子スクリーンプラスフィルタ（Ｄ ｕＰｏｎｔ−ＮＨ３社）に移動した。

１％硫酸ドデシルナトリウム、　ＩＮ　ＮａＣ１，１０％硫酸デキストラン、５ ０ｍＭリン酸ナトリウム（ＰＨ６，５）の中で３５℃で２時間。

フィルターへの予備ハイブリッド形成を行った。ハイブリッド形成は、２００μ ｇ／ｍＱ変性サケ精液ＤＮＡプラス５１−末端をａｌｐで放射能標識した２　Ｘ 　１０’力ウント／分のＨム−１５を含む予備ハイブリッド形成したバッファＳ ｉ内で、３５℃で２４時間行った。ハイブリッド形成後、次の順番でフィルター を洗った：２ＸＳＳＣ（０，１５Ｍ　ＮａＣｌ　０．０１５Ｍクエン酸ナトリウ ム）、室温で５分間に１回、２ｘＳＳＣプラス１％ドデシル硫酸ナトリウム、３ ５℃で３０分間を２回、０．１　Ｘ　５ＳＣ１室温で５分間を１回、フィルター をプロットして乾燥させ、放射能写真を撮るためにコダックＸＡＲ−５フィルム に露出した。放射能写真の図は第５図に示した。

プローブとして放射能標識したガム−１５を用いたところ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎプ ロットにαグロビンｍ　ＲＮ　Ａによる一本の帯が検出された。オリゴヌクレオ チドが存在しない場合、　ＲＮａｓｅＨとの培養中にｍＲＮＡの開裂は起こらな かった（レーン２）。

ガム−１５が存在する場合の反応に関しては（レーン３）、プローブとのハイブ リッド形成部分のＲＮａｓｅ）ＩによるｒｎＲＮＡの開裂のために、αグロビン ｍ　ＲＮ　Ａの帯の強度が顕著に低下するのが観＊される。修飾したオリゴヌク レオチドの各々との反応についても（レーン４及び５）αグロビンｍ　ＲＮ　Ａ 強度の同じような低下がＩ！！祭さ九た。これは２これらもｍ　ＲＮ　Ａとハイ ブリッド形成し、　ＲＮａｓｅＨによって識別・開裂される基質を形成すること を示唆している。

第８例 ３′−末端ヌクレオチド間結合が修飾された相補オリゴヌクレオチドによるネズ ミのプラズマ細胞腫細胞ラインＭＯＰＣ３１５のＣ−ＭＹＣ腫瘍遺伝子発現の抑 制ｃ−＊ｙｃはｉｎ　ｖｉｖｏ培養と細胞内培養の両方において多くのヒト及び 動物腫瘍細胞によって異常発現される細胞腫瘍遺伝子である。ネズミのプラズマ 細胞腫細胞ラインＭＯＰＣ３］５の場合、Ｃ−ｍ）’ｅ遺伝子は染色体１５上の 正常位置から染色体重２上の免疫グロブリン座に移動しており、異常に高いレベ ルで発現される。

アミノ酸残基１９１〜１９８をコード化するｃ−ｍｙｃ　ｍ　ＲＮ　Ａのシーケ ンスと相補である２種類のオリゴヌクレオチド類似体を合成した： ５′−Ｇ″ＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＣＣＡＣＴＧＡＧＧＧＴ−Ｃ５’−（ＰＮ）− ＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＣＣＡＣＴＧＡＧＧＧＴ″にこでＣ′）はトリクロロジ メチルエチルホスホトリエステルを表し、（ＰＮ）は＝ ＴＣＤＭホスホトリエステルは例５で説明した手続きによって鋼内に組み込んだ 、未修飾ホスホジエステル基を含むシーケンスの残りの部分は、ホスホアミド法 で合成した。

５′−末端基（ＰＮ）はアプライド・バイオシステムズ（ＡＰｐｌｉｅｄＢｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ）社の試薬ムｍ１ｎｏｌｉｎｋを用いてメーカーが説明した手続 きに従って導入した。比較のために、同じ塩基シーケンスを持つ未修飾オリゴヌ クレオチド、及びヒトアルブミンｍＲＮＡの相補であるオリゴヌクレオチドも潤 製した：５’−Ｔ”ＣＣＣＴＴＣＡＴＣＣＣＧＡＡＧＴＴ″にこで（６）はやは りＴＣＤＭ基を表す。

ＭＯＰＣ３１５細胞ハ、１０％胎ＩＩＦ、ウシ血清ヲ含ｔｆＲＰＭＩ　１６４０ 培養基内で７％ＣＯ□状態３７℃で維持した。対数期のＭＯＰＣ３１５細胞を遠 心分離（２５０Ｘｇ、　１９分間、２３℃）によって収穫し、密度５ＸＩＯ’／ ｍＱのＨＢＩＯＩ無血清培養基（ＤｕＰｏｎｔ社）に再度懸濁させた。

この細胞懸濁液の１ｍＡのアリコツトをオリゴヌクレオチドなしで付随して培養 した０次に各グループの細胞を遠心分離によって収集した。総細胞ＲＮＡは、チ ャーゲイン［ＣｂｉｒｇｔｉＬ＋ら、バイオケミストリー１８．５２９４〜５２ ９９ページ（１９７９年）］が説明したとおりにｇＩｌ製し、第７例で説明した ようにＮｏｒｔｈｅｒｎプロットによって分析した。フィルターは前述の例と同 様、ポリヌクレオチドキナーゼとγ”Ｐ−ＡＴＰを用いて３２ＰでＳｇＩｔ。

たｃ−ｍｙｃｍ　ＲＮ　Ａに相補のオリゴヌクレオチドによって厳密に調べた。

３′−末端ヌクレオチド間結合をＴＣＤＭ基で修正したどちらの抗ｃ−ｍｙｃオ リゴヌクレオチドも１１度１マイクロモルにおいて、　ｃ−）ｙｃｍ　ＲＮ　Ａ レベルが７５％低下した。一方、オリゴヌクレオチドなしで培養したＭＯＰＣ３ １５細胞では、ｍＲＮＡレベルは一定であった＊　Ｃ−ｍｙｃ及び抗アルブミン オリゴヌクレオチドに対する未修飾オリゴヌクレオチドは、１又は５マイクロモ ルの濃度では、ｃ−ｍｙｃ　ｍ　ＲＮ　Ａレベルに影響がなかった。

この結果は別のリンパ細胞ラインの最近の研究結果とも一致している。この研究 では、　ｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現は、未修飾抗Ｃ−■ｙｃオリゴヌクレオチドの 濃度が１５マイクロモル以下では抑制されないことが分かった〔ヘイキラ（Ｈｅ ｉｉｋｋｉｌａ）ら、（１９８７年）、ネーチャー里、４４５〜４４９ページ〕 、ここで説明した修正誘導体は、対応する未修飾オリゴヌクレオチドと比べて、 無傷の細胞内での標的遺伝子の発現抑制において、２０倍から５０倍も効果的で ある。

以上をまとめると、ここで示した結果は、３′−末端ホスホジエステル結合が修 飾されたオリゴヌクレオチドは、細胞及び体液内でのヌクレアーゼ消化に対し耐 性があり、相補核酸シーケンスとの正常なハイブリッド形成特性を維持し、特別 に目標を付けたｍＲＮＡ種とハイブリッド形成すると酵素ＲＮａｓｅＨが識別・ 開裂する基質を形成するため、オリゴヌクレオチドは様ざまな治療アプリケーシ ョンで望まれている対応する遺伝子発現にブロックに使用することが出来ること を示している。

本発明の目的や精神から外れることなくオリゴヌクレオチドのその他の修飾を作 ることが出来るがもじれない０重要なことは、３′−末端ホスホジエステル結合 を修飾するだけでオリゴヌクレオチドの減成に対する耐性が顕著に増加し、又そ のような誘導体はＲＮａｓｅＨによって種別・開裂されるＲＮＡと基質を形成で きるという発見である。オリゴヌクレオチドの減成に対する安定性を高めたり、 細胞内輸送を容品にしたり。

又は診断におけるハイブリッド形成プローブとしてオリゴヌクレオチドを使用す るために放射能、経口、又は酵素マーカーといった標識を付けるために、置換基 を追加してもよい。

そのような修飾は限られた数の分子位置に制限することが重要である。鎖にある リン酸基の殆ど又は全部を修飾すると。

オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成特性に悪影響があるかもしれず、　ＲＮ ａｓｅＨによって作用するｍＲＮＡと基質を形成しない、後者の事実は、修飾し すぎたオリゴヌクレオチド類似体が標的遺伝子の表現をブロックするための治療 剤として利用できないことを意味する。

従って１本発明は少なくとも上で述べた目的の全てを達成しうると考えることが できる。

Ｆ１０＝５＝５ ＬＡＮＥ　　　　１　　　２　　　３　　　４　　　５ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＬＨＮＧＴＥ！’ １５　　　　　■■■　■■１−−■−−−−−−フ 丁ＩＭＥ（ＥＲ）　　　　　　ＯＯ＋２５　　１　　　　４　　　１８Ｅ＝−１ ０三三ノ÷ ＬＡ？ＪＥ　　　　　　　　１　　　　　２　　　　　３　　　　　４　　　　 　５■■■■ｍ　　ｗ　　−−− 巳＝−１０＝ヨー＝ 手続補正書彷式） 平成２年５月２４Ｂ。

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．３′−末端ホスホジエステル結合で選択的に修飾され、それにより、細胞及 び体液内でのヌクレアーゼ分解に対する耐性を持たせた、標的遺伝子のｍＲＮＡ に相補的なオリゴデオキシヌクレオチドを用いて、選択された遺伝子の発現をブ ロックする方法であって、 前記オリゴヌクレオチドを、標的ｍＲＮＡ内で相補配列するようにハイブリッド 形成させて、二重鎖ＲＮＡ−ＤＮＡを生成させる段階と、 ＲＮａｓｅＨにより、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重らせん内にｍＲＮＡを開裂し、対応す る遺伝子の発現をブロックさせる段階とを有する選択遺伝子の発現をブロックす る方法。
2. ２．オリゴヌクレオチドを、人間及びその他の種の治療剤として使用する請求項 １記載の方法。
3. ３．オリゴヌクレオチドを、工業又は農業プロセスの改善に使用する請求項１記 載の方法。
4. ４．オリゴヌクレオチドの長さが、約１０〜約７５個のヌクレオチドからなる請 求項１記載の方法。
5. ５．３′−末端ホスホジエステルでのオリゴヌクレオチドの修飾物が，アルキル 又はアリーホスホトリエステル、リン酸水素、アルキル又はアリールリン酸塩、 アルキル又はアリールホスホアミド酸塩、ホスホチオ酸塩、或いはホスホセレン 酸塩である請求項１記載の方法。
6. ６．３′−末端リン酸基での修飾物が、ホスホトリエステルである請求項１記載 の方法。
7. ７．３′−末端ホスホジエステル結合で修飾されるオリゴヌクレオチドが、安定 性を更に高め、しかもｍＲＮＡとまだなおハイブリッド形成し、ＲＮａｓｅＨが 識別・開裂する基質を形成できるように、限られた数の部位で更に修飾される請 求項１記載の方法。
8. ８．３′−末端ホスホジエステル結合で修飾されるオリゴヌクレオチドが、細胞 内への輸送を容易にし、しかもｍＲＭＡとまだなおハイブリッド形成し、ＲＮａ ｓｅＨが識別・開裂する基質を形成できるように、限られた数の部位で更に修飾 される請求項１記載の方法。
9. ９．オリゴヌクレオチドが、標的細胞によって取り込まれるキャリア分子を付け られ、それにより、オリゴヌクレオチドの細胞内輸送を達成する請求項８記載の 方法。
10. １０．オリゴヌクレオチドが、３′−末端ホスホジエステル結合がブロックされ ている１個のオリゴヌクレオチドを酵素で２番地のオリゴヌクレオチド鎖の３′ −ＯＨ基の連結することによって合成される請求項１記載の方法。
11. １１．３′−末端ホスホジエステル結合で修飾されるオリゴヌクレオチドを用い 、それにより生物学的標本内のヌクレアーゼ分解に耐性を持たせ、診断テストに おけるハイブリッド形成プローブとして使用する方法。
12. １２．オリゴヌクレオチドを、放射能、蛍光、電気化学、化学ルミネッセント、 又は酵素マーカー又はその他の標識基で修飾し、検出を可能にする請求項１１記 載の方法。
13. １３．安定的を更に高め、しかも診断テストで使用できるように相補核酸配列と 適切なハイブリッド形成特性を維持できるように、限られた数の部位で更に修節 すべぐ、オリゴヌクレオチドを使用する請求項１２記載の方法。
14. １４．細胞内への取り込みを高め、しかも診断テストで使用できるように相補核 酸配列と適切なハイブリッド形成特性を維持できるように、限られた数の部位で 更に修飾するべく、オリゴヌクレオチドを使用する請求項１２記載の方法。
15. １５．オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド鎖の取り込みを容易にするた めに細胞内に輸送されるキャリア分子に付けられる請求項１４記載の方法。
16. １６．３′−末端ホスホジエステル結合がブロックされているオリゴヌクレオチ ドを、ポリヌクレオチド鎖の３′−〇Ｈ基に酵素で連結することによってポリヌ クレオチドを合成し、診断テストにおけるハイブリッド形成プローブとして、長 さがヌクレオチド約７５個分以上のポリヌクレオチドを使用する請求項（１２） 乃至（１５）のいずれかに記載の方法。
17. １７．３′−末端ホスホジエステル結合で選択的に修節されるオリゴヌクレオチ ド。
18. １８．オリゴヌクレオチドの長さが、約１０〜７５個のヌクレオチドに相当する 請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
19. １９．修飾物が、アルキル又はアリールホスホトリエステル、リン酸水素、アル キル又はアリールリン酸塩、アルキル又はアリールホスホアミド酸塩、ホスホチ オ酸塩、或いはホスホセレン酸塩である請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。
20. ２０．修飾物が、ホスホトリエステルである請求項１７のオリゴヌクレオチド。
21. ２１．相補核酸配列によりハイブリッド形成を行い、ＲＮａｓｅＨが識別・開裂 するｍＲＮＡと基質を形成するように、その安定性又はその細胞内輸送を高める ために、限られた数の部位を更に修飾する請求項１７記載のオリゴヌクレオチド 。
22. ２２．細胞に取り込まれるキャリア分子を付け、それによってオリゴヌクレオチ ドの取り込みを容易にする請求項２１記載のオリゴヌクレオチド。
23. ２３．オリゴヌクレオチドを放射能、蛍光、電気化学、化学ルミネセント、又は 酵素マーカー、或いは検出に有用なその他の標識基でさらに修飾する請求項１７ 記載のオリゴヌクレオチド。
24. ２４．診断テストでの使用の際、安定性を高めたり細胞内への進入を容易にし、 しかも相補核酸配列と適切なハイブリッド形成特性を維持しうるよう、限られた 数の部位を更に修飾する請求項２３記載のオリゴヌクレオチド。
25. ２５．細胞によって取り込まれるキャリア分子を付け、それによって、オリゴヌ クレオチドの取り込みを容易にする請求項２４記載のオリゴヌクレオチド。
26. ２６．３′−末端ホスホジエステル結合が修飾されたオリゴヌクレオチドを、よ り長いポリヌクレオチド鎖の３′−ＯＨ基に酵素で連結することにより合成され たヌクレオチドの長さが約７５個分以上であるポリヌクレオチド。
27. ２７．放射能、蛍光、電気化学、化学ルミネセント、又は酵素マーカー、或いは 検出に有用なその他の標識基でさらに修飾される請求項２６記載のポリヌクレオ チド。
28. ２８．診断テストでの使用の際、安定性を高めたり細胞内への進入を容易にし、 しかも相補核酸配列と適切な雑種形成特性を維持しうるよう、限られた数の部位 を更に修飾する請求項２７記載のポリヌクレオチド。
29. ２９．細胞によって取り込まれるキャリア分子を付け、それによって、ポリヌク レオチドの取り込みを容易にする請求項２８記載のポリヌクレオチド。