CN102639151B - 通过针对hbf/hbg的天然反义转录物的抑制治疗血红蛋白（hbf/hbg）相关疾病 - Google Patents

Abstract

反义化合物调节珠蛋白基因的表达和/或功能。用于治疗与珠蛋白相关的疾病的方法包括给患者施用一种或多种反义化合物。

Description

通过针对HBF/HBG的天然反义转录物的抑制治疗血红蛋白 （HBF/HBG）相关疾病

发明领域

本发明的实施方案包含调节珠蛋白分子的表达和/或功能的寡核苷酸。

背景

DNA-RNA和RNA-RNA杂交对于核酸功能的许多方面是重要的，包括DNA复制、转录和翻译。杂交对于检测特定核酸或改变其表达的各种技术也是关键的。反义核苷酸例如通过与靶RNA杂交来破坏基因表达，从而干扰RNA剪接、转录、翻译和复制。反义DNA具有DNA-RNA杂交物充当用于通过核糖核酸酶H消化的底物的附加特征，这是存在于大多数细胞类型中的活性。反义分子可以递送到细胞内，如对于寡聚脱氧核苷酸（ODNs）的情况，或它们可以由内源基因作为RNA分子表达。FDA近期批准了反义药物VTTRAVENE™（用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎），反映反义具有治疗效用。

发明概述

提供这个概述以呈现本发明的概述，以简要指出本发明的性质和物质。提交该概述并且理解，它将不用于解释或限制权利要求的范围或含义。

在一个优选实施方案中，组合物包含与有义和/或反义珠蛋白多核苷酸结合的一种或多种反义寡核苷酸。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸包含一种或多种经修饰或置换的核碱基。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个经修饰的键。

在另外一个实施方案中，经修饰的核碱基包含经修饰的碱基，包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸或锁核酸（LNA）分子。优选地，经修饰的核碱基是锁核酸分子，包括α-L-LNA。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸皮下、肌内、静脉内或腹膜内施用于患者。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸在药物组合物中施用。治疗方案包含给患者施用反义化合物至少一次，然而，这种治疗可以修改为包括经过一段时间的多个剂量。治疗可以与一种或多种其他类型的疗法组合。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸装入脂质体中。

其他方面在下文描述。

附图简述

图1是实时PCR结果的曲线图，显示在HepG2细胞中的HBF mRNA水平在用针对HBF反义Hs.702397设计的2种siRNAs处理后48小时显著增加。

发明详述

本发明的几个方面在下文就用于举例说明的示例应用而言进行描述。应当理解阐述了众多具体细节、关系和方法，以提供本发明的全面理解。然而，相关领域普通技术人员将容易认识到本发明可以不连同一个或多个具体细节或连同其他方法一起实践。本发明不受动作或事件的举例说明次序限制，因为某些动作可以以不同次序和/或与其他动作或事件同时发生。此外，并非需要所有举例说明的动作或事件以实现依照本发明的方法。

定义

本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的并不预期是本发明的限制。如本文使用的，单数形式“a”、“an”和“the”也预期包括复数形式，除非上下文另有明确说明。此外，在术语“包括”、“具有”、“含有”或其变体在详述和/或权利要求中使用方面来说，此类术语预期以类似于术语“包含”的方式是包括在内的。

术语“约”或“大约”意指如通过本领域普通技术人员测定的在对于特定值的可接受的误差范围内，这将部分取决于值如何测量或测定，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在1或超过1个标准差内。可替代地，“约”可以意指直到给定值20％，优选直到10％，更优选直到5％，且更优选地直到1％的范围。可替代地，特别是就生物系统或过程而言，该术语可以意指在值的一定数量级内，优选在5倍内，且更优选在2倍内。当特定值在申请和权利要求中描述时，除非另有说明，应假定术语“约”意指在对于特定值的可接受的误差范围内。

如本文使用的，术语“mRNA”意指靶基因目前已知的一种或多种mRNA转录物，以及可以阐明的任何进一步转录物。

“反义寡核苷酸”或“反义化合物”意指与另一RNA或DNA（靶RNA、DNA）结合的RNA或DNA分子。例如，如果寡核苷酸是RNA，并且靶是RNA，那么RNA寡核苷酸借助于RNA-RNA相互作用与RNA靶结合，且改变靶RNA的活性（Eguchi等人，1991 Ann.Rev.Biochem.60，631-652）。反义寡核苷酸可以上调或下调特定多核苷酸的表达和/或功能。该定义意欲包括从治疗、诊断或其他观点来看是有用的任何外源RNA或DNA分子。此类分子包括例如反义RNA或DNA分子、干扰RNA（RNAi）、微小RNA、诱饵RNA分子、siRNA、酶促RNA、治疗编辑RNA以及激动剂和拮抗剂RNA、反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列（EGS）寡核苷酸、可变剪接子、引物、探针和与至少部分靶核酸杂交的其他寡聚化合物。像这样，这些化合物可以以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。

在本发明的背景中，术语“寡核苷酸”指核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核苷酸（DNA）或其模拟物的寡聚物或多聚物。术语“寡核苷酸”还包括天然和/或经修饰的单体或连接的线性或环状寡聚物，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α异头物形式、肽核酸（PNA）、锁核酸（LNA）、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能够通过单体与单体相互作用的常规模式与靶多核苷酸特异性结合，例如沃森-克里克类型的碱基配对、Hoogsteen或反Hoogsteen类型的碱基配对等。

反义寡核苷酸可以是“嵌合的”，即由不同区域组成。在本发明的背景中，“嵌合”化合物是寡核苷酸，其含有2个或更多个化学区域，例如，一个或多个DNA区域、一个或多个RNA区域、一个或多个PNA区域等。每个化学区域由至少一个单体单位构成，即在寡核苷酸化合物的情况下的核苷酸。这些寡核苷酸一般包含其中寡核苷酸是经修饰的至少一个区域，以便显示出一种或多种所需性质。寡核苷酸的所需性质包括但不限于例如对核酸酶降解的抗性增加、增加的细胞摄取和/或对于靶核酸的结合亲和力增加。寡核苷酸的不同区域因此可以具有不同性质。本发明的嵌合寡核苷酸可以作为2种或更多种寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或如上所述的寡核苷酸类似物的混合结构形成。

寡核苷酸可以由可以在“登记区（register）”中连接的区域组成，即当单体连续连接时，如在天然DNA中，或经由间隔物连接。间隔物预期构成在区域之间的共价“桥”，并且在优选情况下，具有不超过约100个碳原子的长度。间隔物可以携带不同功能性，例如，具有正或负电荷、携带特定核酸结合性质（嵌入剂、槽沟结合剂、毒素、荧光体等）、是亲脂的、诱导特定二级结构等，例如诱导α-螺旋的含丙氨酸的肽。

如本文使用的，“HBF/HBG1”包括HBF/HBG1基因的突变体、变体、等位基因、有义和反义多核苷酸链等在内。

如本文使用的，术语“对于……特异的寡核苷酸”或“寡核苷酸靶”指具有序列（i）能够与靶基因的部分形成稳定复合物，和（ii）能够与靶基因的mRNA转录物的部分形成稳定双链体的寡核苷酸。

如本文使用的，术语“靶核酸”且包含DNA、由此类DNA转录的RNA（包含mRNA前体和mRNA）、以及衍生自此类RNA的cDNA。寡聚化合物与其靶核酸的特定杂交干扰核酸的正常功能。靶核酸的功能通过与之特异性杂交的化合物的这种调节一般称为“反义”。待干扰的DNA功能包括例如复制和转录。待干扰的RNA功能包括所有重要功能，例如RNA易位到蛋白质翻译位点、来自RNA的蛋白质翻译、RNA的剪接以获得一个或多个mRNA种类、和可能在RNA中衔接或通过RNA促进的催化活性。对靶核酸功能的此类干扰的总体效应是所编码产物或寡核苷酸表达的调节。

RNA干扰“RNAi”通过与其“靶”核酸序列具有序列特异性同源性的双链RNA（dsRNA）分子介导（Caplen，N. J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 98:9742-9747（2001））。在本发明的某些实施方案中，RNA依赖性基因沉默的调节物是21-25核苷酸“小干扰”RNA双链体（siRNAs）。siRNAs衍生自通过称为Dicer的RNA酶的dsRNA加工（Bernstein，E.等人，Nature409:363-366（2001））。siRNA双链体产物召募到称为RISC（RNA诱导沉默复合物）的多蛋白质siRNA复合物内。不希望受任何特定理论束缚，随后认为RISC被导向靶核酸（适当地mRNA），其中siRNA双链体以序列特异性方式相互作用，以催化形式介导切割（Bernstein，E.等人，Nature 409:363-366（2001）；Boutla，A.等人，Curr.Biol. 11:1776-1780（2001））。根据本领域众所周知且是普通熟练人员熟悉的程序，可以合成且使用依照本发明可以使用的小干扰RNAs。用于在本发明的方法中使用的小干扰RNAs适当地包含约0 – 约50个核苷酸（nt）。在非限制性实施方案的例子中，siRNAs可以包含约5 - 约40 nt、约5 - 约30 nt、约10 -约30 nt、约15 - 约25 nt、或约20-25个核苷酸。

合适RNAi的选择通过使用计算机程序得到促进，所述计算机程序自动比对核酸序列且指出同一性或同源性的区域。此类程序用于比较例如通过搜索数据库例如GenBank或通过测序PCR产物获得的核酸序列。来自一系列物种的核酸序列的比较允许展示物种之间的合适程度同一性的核酸序列选择。在未测序的基因的情况下，执行DNA印迹以允许测定在靶物种和其他物种中的基因之间的同一性程度。通过以不同程度的严格性执行RNA印迹，如本领域众所周知的，可以获得同一性的近似测量。这些程序允许选择RNAi，其显示出与待控制的受试者中靶核酸序列的高度互补性和与其他物种中的相应核酸序列的更低程度互补性。本领域技术人员将认识到在选择用于在本发明中使用的基因的合适区域中存在相当大的活动余地。

“酶促RNA”意指具有酶促活性的RNA分子（Cech，1988 J.American.Med.Assoc.260，3030-3035）。酶促核酸（核酶）通过首先与靶RNA结合起作用。此类结合通过酶促核酸的靶结合部分发生，所述靶结合部分与作用于切割靶RNA的分子的酶促部分保持紧密接近。因此，酶促核酸首先识别且随后通过碱基配对结合靶RNA，并且一旦与正确位点结合，就酶促作用以切割靶RNA。

“诱饵RNA”意指模拟关于配体的天然结合结构域的RNA分子。诱饵RNA因此与天然结合靶竞争结合特异性配体。例如，已显示HIV反式激活应答（TAR）RNA的超表达可以充当“诱饵”且有效结合HIV tat蛋白质，从而阻止其与HIV RNA中编码的TAR序列结合（Sullenger等人，1990，Cell，63，601-608）。这意欲是特定例子。本领域技术人员应认识到这只是一个例子，并且其他实施方案可以使用本领域一般已知的技术容易地生成。

如本文使用的，术语“单体”一般指示通过磷酸二酯键或其类似物连接的单体，以形成大小范围为数个单体单位例如约3-4个到约数百个单体单位的寡核苷酸。磷酸二酯键的类似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯（methylphosphornates）、硒代磷酸酯（phosphoroselenoate）、氨基磷酸酯等，如下文更全面地描述的。

在本文背景中，术语“核碱基”和“核苷酸”或“核苷”在本文中可互换使用，并且该术语涵盖天然存在的核碱基以及非天然存在的核碱基。对于本领域技术人员应明确的是，先前已视为“非天然存在的”各种核碱基随后已在自然界中发现。因此，“核碱基”不仅包括已知嘌呤和嘧啶杂环，还包括杂环类似物及其互变异构体。核碱基的举例说明例子是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代- N⁶-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N⁴,N⁴-ethanocytosin、N⁶,N⁶-ethano-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-（C³-C⁶）-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶（triazolopyridin）、异胞嘧啶、异鸟嘌呤（isoguanin）、肌苷和在Benner等人，美国专利号5,432,272中描述的“非天然存在的”核碱基。术语“核碱基”意欲涵盖这些例子中的每一个和所有以及其类似物和互变异构体。特别有利的核碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶，这视为与在人中的治疗和诊断应用有关的天然存在的核碱基。核苷包括天然核苷，包括2'-脱氧和2'-羟基形式，例如如Kornberg和Baker，DNAReplication，第2版（Freeman，San Francisco，1992）中所述。

提及核苷的“类似物”包括具有经修饰的碱基部分和/或经修饰的糖部分的合成核苷，例如由Scheit，Nucleotide Analogs，John Wiley，New York，1980；Freier & Altmann，Nucl.Acid.Res.，1997，25（22），4429-4443，Toulme，J.J.，Nature Biotechnology 19:17-18（2001）；Manoharan M.，Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139（1999）；FreierS. M.，Nucleic Acid Research，25:4429-4443（1997），Uhlman，E.，Drug Discovery &Development，3: 203-213（2000），Herdewin P.，Antisense & Nucleic Acid Drug Dev.，10:297-310（2000）,）一般描述的；2'-O,3-C-连接的[3.2.0] 二环阿糖核苷（参见例如N.KChristiensen.等人，J. Am. Chem. Soc，120: 5458-5463（1998）。此类类似物包括设计为增强结合性质例如双链体或三链体稳定性、特异性等的合成核苷。

如本文使用的，“杂交”意指寡聚化合物的基本上互补链的配对。配对的一个机制涉及在寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基（核碱基）之间的氢键合，这可以是沃森-克里克、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键配对的互补核碱基。杂交可以在不同情况下发生。

当化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能，以引起活性丧失，并且在其中需要特异性结合的条件下，即在体内测定或治疗性处理的情况下在生理条件下，和在体外测定的情况下在其中执行测定的条件下，存在足够程度的互补性，以避免反义化合物与非靶核酸序列的非特异性杂交时，反义化合物是“可特异性杂交的”。

如本文使用的，短语“严格杂交条件”或“严格条件”指在其下本发明的化合物将与其靶序列杂交，但与最低限度数目的其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同环境和本发明的背景中将是不同的，在其下寡聚化合物与靶序列杂交的“严格条件”通过寡聚化合物的性质和组成以及它们待在其中研究的测定进行测定。一般而言，严格杂交条件包含具有无机阳离子例如Na⁺⁺或K⁺⁺（即低离子强度）的低浓度（<0.15M）的盐，低于寡聚化合物:靶序列复合物的Tm高于20℃ - 25℃的温度，和变性剂例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）的存在。例如，杂交率对于每1％甲酰胺减少1.1％。高严格性杂交条件的例子是0.1X氯化钠-柠檬酸钠缓冲液（SSC）/0.1％（w/v）SDS，在60℃30分钟。

如本文使用的，“互补性”指在一条或两条寡聚链上的2个核碱基之间精确配对的能力。例如，如果在反义化合物的某一位置上的核碱基能够与靶核酸的某一位置上的核碱基氢键合，所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，那么在寡核苷酸和靶核酸之间的氢键合位置视为互补位置。当每种分子中足够数目的互补性位置由可彼此氢键合的核碱基占据时，寡聚化合物和进一步的DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此互补。因此，“可特异性杂交的”和“互补的”是用于指示在足够数目的核碱基上足够程度的精确配对或互补性，从而使得稳定和特异性结合在寡聚化合物和靶核酸之间发生。

本领域应当理解寡聚化合物的序列无需与其靶核酸的序列是100％互补的，以便是可特异性杂交的。此外，寡核苷酸可以在一个或多个区段上杂交，从而使得插入或相邻区段不涉及杂交事件（例如，环结构、错配或发夹结构）。本发明的寡聚化合物包含与它们靶向的靶核酸序列内的靶区域的至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％序列互补性。例如，其中反义化合物的20个核碱基中的18个与靶区域互补，并且因此将是特异性杂交的反义化合物，将代表90％互补性。在这个例子中，其余非互补核碱基可以成簇或用互补核碱基点缀，并且无需与彼此或互补核碱基邻接。像这样，其为具有4（四）个非互补核碱基的长度18个核碱基（其侧面为与靶核酸的完全互补性的2个区域）的反义化合物将与靶核酸具有77.8％总体互补性，并且因此将落入本发明的范围内。反义化合物与靶核酸区域的互补性百分比可以使用本领域已知的BLAST程序（基本局部比对搜索工具）和PowerBLAST程序常规地测定（Altschul等人，J.Mol.Biol，1990，215，403-410；Zhang和Madden，Genome Res.，1997，7，649-656）。同源性百分比，序列同一性或互补性可以通过例如Gap程序（Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，Madison Wis.）使用缺省设置进行测定，这使用Smith和Waterman的算法（Adv.Appl Math.，1981，2，482-489）。

如本文使用的，术语“热解链温度（Tm）”指在限定离子强度、pH和核酸浓度下，在其下与靶序列互补的50％寡核苷酸与靶序列平衡杂交的温度。因为靶序列一般以过量存在，所以在Tm，50％的寡核苷酸平衡占据）。一般地，严格条件将是对于短寡核苷酸（例如10 –50个核苷酸），其中在pH 7.0 - 8.3盐浓度是至少约0.01 - 1.0 M Na离子浓度（或其他盐），并且温度是至少约30℃的那些。严格条件还可以通过去稳定剂例如甲酰胺的添加来达到。

如本文使用的，“调节”意指基因表达中的增加（刺激）或减少（抑制）。

当在多核苷酸序列的背景中使用时，术语“变体”可以涵盖与野生型基因相关的多核苷酸序列。这个定义还可以包括例如“等位基因”、“剪接”、“物种”或“多态性”变体。剪接变体可以与参考分子具有显著同一性，但一般将具有更多或更少数目的多核苷酸，这是由于在mRNA加工过程中外显子的可变剪接。相应多肽可以具有另外的功能结构域或结构域的不存在。物种变体是从一个物种到另一个不同的多核苷酸序列。在本发明中特别有用的是野生型基因产物的变体。变体可以起因于核酸序列中的至少一个突变，且可以导致改变的mRNAs或其结构或功能可能改变或不改变的多肽。任何给定天然或重组基因可以具有无一、一个或许多等位基因形式。引起变体的常见突变改变一般归于核苷酸的天然缺失、添加或置换。这些类型的改变中的每一个可能单独或与其他组合、在给定序列中一次或多次发生。

所得到的多肽一般将具有相对于彼此的显著氨基酸同一性。多态性变体是在给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列中的变异。多态性变体还可以涵盖“单核苷酸多态性”（SNPs,）或其中多核苷酸序列通过一个碱基不同的单碱基突变。SNPs的存在可以指示例如具有疾病状态倾向的某些群体，即易感性与抗性比较。

衍生多核苷酸包括实施化学修饰的核酸，例如氢由烷基、芳基或氨基替换。衍生物例如衍生寡核苷酸可以包含非天然存在的部分，例如改变的糖部分或糖间连接。在这些中示例性的是硫代磷酸酯和本领域已知的其他含硫种类。衍生核酸还可以含有标记，包括放射性核苷酸、酶、荧光剂、化学发光剂、生色剂、底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。

“衍生”多肽或肽是例如通过糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、还原/烷基化、酰化、化学偶联或弱福尔马林处理进行修饰的那种。衍生物还可以直接或间接地进行修饰，以含有可检测标记，包括但不限于放射性同位素、荧光和酶标记。

如本文使用的，术语“动物”或“患者”意欲包括例如人、绵羊、麋鹿、鹿、黑尾鹿、貂、哺乳动物、猴、马、牛、猪、山羊、犬、猫、大鼠、小鼠、鸟、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蛛形类。

“哺乳动物”涵盖一般在医学护理下的温血动物（例如人和驯养动物）。例子包括猫科、犬科、马科、牛科和人，以及仅仅人。

“治疗”或“处理”涵盖哺乳动物中的疾病状态的治疗，并且包括：（a）预防疾病状态在哺乳动物中发生，特别是当此类哺乳动物倾向于疾病状态但仍未诊断为具有其时；（b）抑制疾病状态，例如阻止其发展；和/或（c）减轻疾病状态，例如引起疾病状态消退直至达到所需终点。治疗还包括疾病症状的改善（例如减轻疼痛或不适），其中此类改善可以直接影响疾病（例如原因、传播、表达等）或可以不如此。

多核苷酸和寡核苷酸组合物和分子

在一个优选实施方案中，反义寡核苷酸用于预防或治疗与异常珠蛋白基因表达或功能相关的疾病或病症。γ珠蛋白基因（HBG1和HBG2）通常在胎儿肝、脾和骨髓中表达。2条γ链连同2条α链一起构成胎儿血红蛋白（HbF），这通常在出生时由成人血红蛋白（HbA）替换。在某些β-地中海贫血和相关状况中，γ链产生继续到成人期内。2类γ链在残基136上不同，其中甘氨酸在G-γ产物（HBG2）中发现，并且丙氨酸在A-γ产物（HBG1）中发现。前者在出生时是占优势的。在β-珠蛋白簇中基因的次序是5'-ε—γ-G—γ-A—δ—β—3'。

与异常珠蛋白表达和/或功能相关的疾病或病症包括例如贫血，例如镰状细胞性贫血、地中海贫血等。镰状细胞病是由编码β珠蛋白的基因中的突变（Glu6Val）引起的全身性病症。镰状血红蛋白分子（HbS）是2条α-珠蛋白链和2条镰状β-珠蛋白链的四聚体，并且当脱氧时，具有聚合的趋势。HbS促进镰状红细胞和白细胞和内皮细胞之间的异常相互作用，这触发复杂病理生物学。这个多面性病理生理学提供在多个位点中断疾病的机会，包括HbS的聚合、红细胞密度和细胞-细胞相互作用。例如，有可能诱导更高浓度的胎儿血红蛋白，这破坏HbS聚合的病理学起始步骤。在某些实施方案中，患者的治疗包含给患者施用一种或多种反义寡核苷酸。治疗可以与一种或多种疗法组合。例如，改善镰状红细胞的水合和对抗镰状细胞病的内皮、炎性和氧化异常的试剂。

当化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能，以引起活性丧失，并且在其中需要特异性结合的条件下，存在足够程度的互补性，以避免反义化合物与非靶核酸序列的非特异性杂交时，反义化合物是可特异性杂交的。此类条件包括，即在体内测定或治疗性处理的情况下的生理条件，和在体外测定的情况下在其中执行测定的条件。

当化合物与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能，以引起效用丧失，并且在其中需要特异性结合的条件下，即在体内测定或治疗性处理的情况下在生理条件下，和在体外测定的情况下在其中执行测定的条件下，存在足够程度的互补性，以避免反义化合物与非靶序列的非特异性杂交时，反义化合物无论DNA、RNA、嵌合、取代的等是可特异性杂交的。

反义的特异性和灵敏度也通过本领域技术人员利用用于治疗用途。反义寡核苷酸已用作动物和人中的疾病状态治疗中的治疗部分。反义寡核苷酸已安全且有效地施用于人，并且众多临床试验目前在进行中。因此已确定寡核苷酸可以是有用的治疗模式，其可以配置为用于治疗方案中用于治疗细胞、组织和动物，特别是人。

在本发明的一个实施方案中，寡聚反义化合物特别是寡核苷酸与靶核酸分子结合，且调节由靶基因编码的分子的表达和/或功能。待干扰的DNA功能包含例如复制和转录。待干扰的RNA功能包含所有重要功能，例如RNA易位到蛋白质翻译位点、来自RNA的蛋白质翻译、RNA的剪接以获得一个或多个mRNA种类、和可能在RNA中衔接或通过RNA促进的催化活性。取决于所需功能，功能可以是上调或抑制的。

反义化合物包括反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列（EGS）寡核苷酸、可变剪接子、引物、探针和与至少部分靶核酸杂交的其他寡聚化合物。像这样，这些化合物可以以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。

在本发明的背景中，将反义化合物靶向特定核酸分子可以是多步过程。该过程通常从其功能待调节的靶核酸的鉴定开始。这种靶核酸可以是例如其表达与特定病症或疾病状态相关的细胞基因（或由该基因转录的mRNA），或来自感染剂的核酸分子。在本发明中，靶核酸编码HBF/HBG。

靶向过程通常还包括在靶核酸内用于反义相互作用发生的至少一个靶区域、区段或位点的测定，从而使得将产生所需效应例如表达的调节。在本发明的背景内，术语“区域”定义为具有至少一个可鉴定结构、功能或特征的靶核酸的部分。在靶核酸的区域内是区段。“区段”定义为在靶核酸内的较小区域或区域亚部分。如在本发明中使用的，“位点”定义为在靶核酸内的位置。

在一个优选实施方案中，反义寡核苷酸与HBF/HBG的天然反义序列结合且调节珠蛋白基因的表达。例如胎儿血红蛋白。例如，HBF的天然反义序列包含SEQ ID NO: 2及其变体。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸与HBF/HBG多核苷酸的一个或多个区段结合。区段包含HBF/HBG有义或反义多核苷酸的至少5个连接核碱基。

胎儿血红蛋白（HBF）是在子宫中的最后7个月发育过程中在胎儿中和在新生儿中直至约6个月大时的主要氧转运蛋白。功能上，胎儿血红蛋白与成人血红蛋白最不同之处在于，它能够以比成人形式更大的亲和力结合氧，给予发育中的胎儿对来自母亲的血流的氧的更佳接近。在新生儿中，到出生后生活的约第12周时，胎儿血红蛋白几乎完全由成人血红蛋白替换。在成人中，胎儿血红蛋白生产可以通过本文描述的组合物再激活，这在此类疾病如镰状细胞病的治疗中是有用的。

当胎儿血红蛋白生产在出生后切断时，正常儿童开始产生成人血红蛋白（HbA），但相反地，具有镰状细胞病的儿童开始产生缺陷形式的血红蛋白，称为血红蛋白S。血红蛋白的这个变种聚集，形成细丝且因此促使红细胞改变其形状从圆形到镰刀状，这具有在彼此之上叠加的更大趋势且挤满血管。这些总是导致所谓的疼痛的血管闭塞发作，这是该疾病的标志。然而，如果胎儿血红蛋白在出生后仍是占优势形式的血红蛋白，那么疼痛发作次数在具有镰状细胞性贫血的患者中减少。也用作抗癌药的羟基脲是用于镰状细胞性贫血的可行治疗，因为它促进胎儿血红蛋白产生，同时抑制由于血红蛋白S聚合的镰状化。

因此，在某些实施方案中，贫血的治疗包括反义寡核苷酸的施用，以升高血红蛋白F水平且促进含HbF的F细胞的发育。

因为，如本领域已知的，翻译起始密码子一般是5'-AUG（在转录的mRNA分子中；5'-ATG在相应DNA分子中），所以翻译起始密码子也称为“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。少数基因具有含RNA序列5'-GUG、5'-UUG或5'-CUG的翻译起始密码子；并且5'-AUA、5'-ACG和5'-CUG已显示在体内起作用。因此，术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可以涵盖许多密码子序列，即使在每种情况下的起始子氨基酸一般是甲硫氨酸（在真核生物中）或甲酰甲硫氨酸（在原核生物中）。真核生物和原核生物基因可以具有2个或更多个可替代起始密码子，其中任何一个可以优先用于特定细胞类型或组织中、或在特定条件组下的翻译起始。在本发明的背景中，“起始密码子”和“翻译起始密码子”指在体内用于起始由编码珠蛋白分子的基因转录的mRNA翻译的一个或多个密码子，与此类密码子的一种或多种序列无关。基因的翻译终止密码子（或“终止密码子”）可以具有3个序列之一，即5'-UAA、5'-UAG和5'-UGA（相应DNA序列分别是5'-TAA、5'-TAG和5'-TGA）。

术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”指此类mRNA或基因的部分，其涵盖从翻译起始密码子开始在任一方向（即5'或3'）中的约25 – 约50个邻接核苷酸。类似地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”指此类mRNA或基因的部分，其涵盖从翻译终止密码子开始在任一方向（即5'或3'）中的约25 – 约50个邻接核苷酸。因此，“起始密码子区”（或“翻译起始密码子区”）和“终止密码子区”（或“翻译终止密码子区”）是可以由本发明的反义化合物有效靶向的所有区域。

本领域已知指在翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域的可读框（ORF）或“编码区”也是可以有效靶向的区域。在本发明的背景内，靶向区域是涵盖基因的可读框（ORF）的翻译起始或终止密码子的基因内区域。

另一个靶区域包括5'非翻译区（5'UTR），本领域已知指从翻译起始密码子开始在5'方向中的mRNA部分，并且因此包括在mRNA（或基因上的相应核苷酸）的5'帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸。另外一个靶区域包括3'非翻译区（3'UTR），本领域已知指从翻译终止密码子开始在3'方向中的mRNA部分，并且因此包括在mRNA（或基因上的相应核苷酸）的翻译终止密码子和3'末端之间的核苷酸。mRNA的5'帽位点包含经由5'-5'三磷酸盐连接与mRNA的最5'残基邻接的N7-甲基化鸟苷残基。mRNA的5'帽区域视为包括5'帽结构自身以及与帽位点相邻的前50个核苷酸。用于本发明的另一个靶区域是5'帽区域。

尽管某些真核mRNA转录物是直接翻译的，但许多含有称为“内含子”的一个或多个区域，这在其翻译前从转录物中切除。其余（和因此翻译的）区域称为“外显子”且剪接在一起以形成连续mRNA序列。在一个实施方案中，在其中异常剪接在疾病中牵涉，或其中特定剪接产物的过生产在疾病中牵涉的情况下，靶向剪接位点即内含子-外显子连接或外显子-内含子连接是特别有用的。由于重排或缺失的异常融合物连接是靶位点的另一个实施方案。经由来自不同基因来源的2个（或更多个）mRNAs剪接过程产生的mRNA转录物称为“融合转录物”。内含子可以使用靶向例如DNA或mRNA前体的反义化合物有效靶向。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸与靶多核苷酸的编码和/或非编码区结合，并且调节靶分子的表达和/或功能。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸与天然反义多核苷酸结合，并且调节靶分子的表达和/或功能。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸与有义多核苷酸结合，并且调节靶分子的表达和/或功能。

可替代RNA转录物可以由DNA的相同基因组区域产生。这些可替代转录物一般称为“变体”。更具体而言，“mRNA前体变体”是由相同基因组DNA产生的转录物，其与由相同基因组DNA产生的其他转录物的不同之处在于它们的起始或终止位置且含有内含子和外显子序列。

在剪接过程中切除一个或多个外显子或内含子区域或其部分后，mRNA前体变体产生较小的“mRNA变体”。因此，mRNA变体是经加工的mRNA前体变体，并且由于剪接，每种独特的mRNA前体变体必须一直产生独特的mRNA变体。这些mRNA变体也称为“可变剪接变体”。如果未发生mRNA前体变体的剪接，那么mRNA前体变体等同于mRNA变体。

变体可以通过使用可替代信号以起始或终止转录而产生。mRNAs前体和mRNAs可以具有超过一个起始密码子或终止密码子。使用可替代起始密码子的源于mRNA前体或mRNA的变体称为那种mRNA前体或mRNA的“可替代起始变体”。使用可替代终止密码子的那些转录物称为那种mRNA前体或mRNA的“可替代终止变体”。一个特定类型的可替代终止变体是“多聚腺苷酸变体”，其中产生的多个转录物起因于“多聚腺苷酸终止信号”之一通过转录机制的可替代选择，从而产生在独特的多聚腺苷酸位点终止的转录物。在本发明的背景内，本文描述的变体类型也是靶核酸的实施方案。

反义化合物与之杂交的靶核酸上的位置定义为活性反义化合物靶向其的靶区域的至少5-核碱基部分。

虽然特定示例性靶区段的特定序列在本文中阐述，但本领域技术人员应认识到这些作用于举例说明且描述在本发明的范围内的特定实施方案。另外的靶区段通过本领域技术人员考虑到本公开内容可容易地鉴定。

选自举例说明的优选靶区段内包含至少五（5）个连续核碱基的段的长度5-100个核碱基的靶区段视为也适合于靶向。

靶区段可以包括DNA或RNA序列，其包含来自举例说明的优选靶区段之一的5'末端的至少5个连续核碱基（其余核碱基是相同DNA或RNA的连续段，从靶区段的5'末端紧下游开始且继续直到DNA或RNA含有约5 – 约100个核碱基）。类似优选的靶区段由DNA或RNA序列代表，其包含来自举例说明的优选靶区段之一的3'末端的至少5个连续核碱基（其余核碱基是相同DNA或RNA的连续段，从靶区段的3'末端紧下游开始且继续直到DNA或RNA含有约5 – 约100个核碱基）。无需过度实验，拥有本文举例说明的靶区段的本领域技术人员将能够鉴定进一步优选的靶区段。

一旦已鉴定了一个或多个靶区域、区段或位点，就选择与靶足够互补的反义化合物，即足够良好且具有足够特异性杂交，以给出所需效应。

在本发明的实施方案中，寡核苷酸与特定靶的反义链结合。寡核苷酸是长度至少5个核苷酸，且可以因此合成每个寡核苷酸靶重叠序列，从而使得合成寡核苷酸，以便涵盖靶多核苷酸的整个长度。靶还包括编码以及非编码区。

在一个实施方案中，优选通过反义寡核苷酸靶向特定核酸。将反义化合物靶向特定核酸是多步过程。该过程通常从其功能待调节的核酸序列的鉴定开始。这可以是例如其表达与特定病症或疾病状态相关的细胞基因（或由基因转录的mRNA），或非编码多核苷酸例如非编码RNA（ncRNA）。

RNAs可以分类成（1）翻译成蛋白质的信使RNAs（mRNAs），和（2）非蛋白质编码RNAs（ncRNAs）。ncRNAs包含微小RNAs、反义转录物和含有高密度的终止密码子且缺乏任何广泛的“可读框”的其他转录单位（TU）。许多ncRNAs看起来从蛋白质编码基因座的3'非翻译区（3'UTRs）中的起始位点开始。ncRNAs通常是罕见的，并且已通过FANTOM共同体测序的至少一半ncRNAs看起来不是多聚腺苷酸化的。由于显而易见的原因，大多数研究者已集中于经加工且输出至细胞质的多聚腺苷酸化的mRNAs。近来，显示非多聚腺苷酸化核RNAs集合可以是非常大的，并且许多此类转录物起于所谓的基因间区域（Cheng，J.等人（2005）Transcriptional maps of 10 human chromosomes at 5-nucleotide resolution.Science 308（5725），1149-1154；Kapranov，P.等人（2005）. Examples of the complexarchitecture of the human transcriptome revealed by RACE and high-densitytiling arrays. Genome Res 15（7），987-997）。ncRNAs通过其调节基因表达的最常见机制是通过与靶转录物的碱基配对。通过碱基配对起作用的RNAs可以分组成（1）在相同基因位置上编码的顺式编码的RNAs，但在与RNAs的相对链上，它们起作用且从而展示与其靶的完全互补性，和（2）在不同于RNAs的染色体位置上编码的反式编码的RNAs，它们起作用且一般不显示出与其靶的完全碱基配对潜力。

不希望受理论束缚，反义多核苷酸通过本文描述的反义寡核苷酸或RNA化合物的扰动可以改变相应有义信使RNAs的表达。然而，这种调节可以是不一致的（反义击倒导致有义转录物升高）或一致的（反义击倒导致伴随的有义转录物减少）。在这些情况下，反义寡核苷酸可以靶向反义链的重叠或非重叠部分，导致靶的击倒。编码以及非编码反义可以以等同方式靶向，并且任一范畴能够以一致或不一致方式调节相应有义转录物。在鉴定用于针对靶的使用的新寡核苷酸中采用的策略可以基于反义RNA转录物通过反义寡核苷酸或用于调节所需靶的任何其他方法的击倒。

策略1：在不一致调节的情况下，击倒反义转录物升高常规（有义）基因的表达。后面一种基因应编码已知或假定药物靶，那么其反义配对物的击倒可以想得到地模拟受体激动剂或酶刺激物的作用。

策略2：在一致调节的情况下，可以伴随地击倒反义和有义转录物，并且从而达到常规（有义）基因表达的协同减少。如果例如反义寡核苷酸用于达到击倒，那么这种策略可以用于将靶向的一种反义寡核苷酸应用于有义转录物和另一种反义寡核苷酸应用于相应反义转录物，或同时靶向重叠的有义和反义转录物的单一能量对称的反义寡核苷酸。

根据本发明，反义化合物包括反义寡核苷酸、核酶、外部指导序列（EGS）寡核苷酸、siRNA化合物、单或双链RNA干扰（RNAi）化合物例如siRNA化合物、和与靶核酸的至少部分杂交且调节其功能的其他寡聚化合物。像这样，它们可以是DNA、RNA、DNA样、RNA样或其混合物，或可以是这些中的一种或多种的模拟物。这些化合物可以是单链、双链、环状或发夹寡聚化合物，并且可以含有结构元件，例如内部或末端凸起、错配或环。反义化合物常规地线性制备，且可以连接或其他方式制备为环状和/或分支的。反义化合物可以包括构建体例如杂交的2条链，以形成完全或部分双链的化合物，或具有足够自互补性的单链，以允许杂交和形成完全或部分双链的化合物。2条链可以内部连接，留下游离3'或5'末端，或可以连接以形成连续发夹结构或环。发夹结构可以含有在5'或3'末端上的突出端，产生单链特征的延长部分。双链化合物任选地可以包括在末端上的突出端。进一步修饰可以包括与末端之一、所选择的核碱基位置、糖位置或核苷间键之一附着的缀合物基团。可替代地，2条链可以经由非核酸部分或接头基团连接。当由仅一条链形成时，dsRNA可以采取自互补发夹型分子的形式，其在自身上向后折叠以形成双链体。因此，dsRNAs可以是完全或部分双链的。基因表达的特定调节可以通过dsRNA发夹在转基因细胞系中的稳定表达来达到，然而，在某些实施方案中，基因表达或功能是上调的。当由2条链，或采取在自身上向后折叠以形成双链体的自互补发夹型分子形式的单链形成时，2条链（或单链的双链体形成区域）是以沃森-克里克形式碱基配对的互补RNA链。

一旦引入系统中，本发明的化合物可以引发一种或多种酶或结构蛋白质的作用，以实现靶核酸的切割或其他修饰，或可以经由基于占据的机制工作。一般而言，核酸（包括寡核苷酸）可以描述为“DNA样”（即，一般具有一个或多个2'-脱氧糖和一般地T而不是U碱基）或“RNA样”（即，一般具有一个或多个2'-羟基或2'-修饰的糖和一般地U而不是T碱基）。核酸螺旋可以采用超过一个类型的结构，最通常地A-和B-型。认为一般而言，具有B型样结构的寡核苷酸是“DNA样的”，并且具有A型样结构的寡核苷酸是“RNA样的”。在某些（嵌合）实施方案中，反义化合物可以含有A-和B-型区域。

在另一个优选实施方案中，所需寡核苷酸或反义化合物包含下述中的至少一种：反义RNA寡核苷酸；反义DNA寡核苷酸；嵌合反义寡核苷酸；包含经修饰的连接的反义寡核苷酸；干扰RNA（RNAi）；短干扰RNA（siRNA）；微小干扰RNA（miRNA）；小临时RNA（stRNA）；或短发夹RNA（shRNA）；小RNA诱导的基因激活（RNAa）；小激活RNAs（saRNAs）或其组合。

dsRNA还可以激活基因表达，这是已命名为“小RNA诱导的基因激活”或RNAa的机制。靶向基因启动子的dsRNAs诱导关联基因的有力转录激活。使用称为“小激活RNAs”（saRNAs）的合成dsRNAs，RNAa在人细胞中得到证实。目前未知RNAa在其他生物中是否是保守的。

小双链RNA（dsRNA）例如小干扰RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA）已发现是称为RNA干扰（RNAi）的进化保守机制的触发剂。RNAi总是经由重塑染色质导致基因沉默，以从而阻遏转录、降解互补mRNA、或阻断蛋白质翻译。dsRNAs还可以充当小激活RNAs（saRNA）。不希望受理论束缚，通过靶向基因启动子中的序列，saRNAs将在称为dsRNA诱导的转录激活（RNAa）的现象中诱导靶基因表达。

在一个进一步的实施方案中，本文鉴定的“优选靶区段”可以用于筛选调节HBF/HBG多核苷酸表达的另外化合物。“调节剂”是这样的化合物，其减少或增加编码HBF/HBG的核酸分子表达，且包含与优选靶区段互补的至少5核碱基部分。筛选方法包含下列步骤：使编码HBF/HBG多核苷酸的核酸分子的优选靶区段与一种或多种候选调节剂接触，且筛选减少或增加编码HBF/HBG多核苷酸的核酸分子表达的一种或多种候选调节剂。一旦显示一种或多种候选调节剂能够调节（例如减少或增加）编码HBF/HBG多核苷酸的核酸分子的表达，调节剂随后就可以用于HBF/HBG多核苷酸功能的进一步调查研究中，或用于用作依照本发明的研究、诊断或治疗试剂。

本发明的优选靶区段还可以与本发明的其分别的互补反义化合物组合，以形成稳定的双链（双链体的）寡核苷酸。

此类双链寡核苷酸部分在本领域中已显示经由反义机制调节靶表达且调节翻译以及RNA加工。此外，可以对双链部分实施化学修饰（Fire等人，Nature，1998，391，806-811；Timmons和Fire，Nature 1998，395，854；Timmons等人，Gene，2001，263，103-112；Tabara等人，Science，1998，282，430-431；Montgomery等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，1998，95，15502-15507；Tuschl等人，Genes Dev.，1999，13，3191-3197；Elbashir等人，Nature，2001，411，494-498；Elbashir等人，Genes Dev. 2001，15，188-200）。例如，此类双链部分已显示通过双链体的反义链与靶的常规杂交抑制靶，从而触发靶的酶促降解（Tijsterman等人，Science，2002，295，694-697）。

在一个优选实施方案中，反义寡核苷酸靶向HBF/HBG多核苷酸（例如登记号NM_000559），关于其的变体、等位基因、同种型、同系物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选地，寡核苷酸是反义分子。

依照本发明的实施方案，靶核酸分子并不限于单独的HBF/HBG多核苷酸，还延伸至珠蛋白家族成员的同种型、同系物等中的任何。

在另一个优选实施方案中，RNA寡核苷酸靶向HBF/HBG多核苷酸的天然反义序列，例如如SEQ ID NO: 2所示的多核苷酸，以及关于其的任何变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的例子如SEQ ID NOS: 3 - 5所示。

在一个实施方案中，寡核苷酸与HBF/HBG反义的核酸序列互补或结合，包括但不限于与珠蛋白多核苷酸结合的非编码序列，且调节HBF/HBG多核苷酸的表达和/或功能。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸与如SEQ ID NO: 2所示的HBF/HBG天然反义的核酸序列互补或结合，并且寡核苷酸调节HBF/HBG多核苷酸的表达和/或功能。

在一个优选实施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NOS: 1 – 5的至少5个连续核碱基的序列。

多核苷酸靶包含珠蛋白基因，包括其家族成员，HBF/HBG的变体；HBF/HBG的突变体，包括SNPs；HBF/HBG的非编码序列；HBF/HBG的等位基因；剪接变体，片段等。优选地，寡核苷酸是反义分子。

在另一个优选实施方案中，与HBF/HBG多核苷酸结合的寡核苷酸包含：反义RNA、干扰RNA（RNAi）、短干扰RNA（siRNA）；微小干扰RNA（miRNA）；小临时RNA（stRNA）；或短发夹RNA（shRNA）；小RNA诱导的基因激活（RNAa）；或小激活RNAs（saRNA）。

在另一个优选实施方案中，珠蛋白多核苷酸例如SEQ ID NOS: 1 - 3，NM_001110的靶向调节这些靶的表达或功能。在一个实施方案中，表达或功能与对照比较是上调的。在另一个优选实施方案中，表达或功能与对照比较是下调的。

在另一个优选实施方案中，反义化合物包含如SEQ ID NOS: 2 - 5所示的多核苷酸。这些寡核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核碱基、较短或较长的片段、经修饰的键等。

在另一个优选实施方案中，SEQ ID NOS: 2 - 5包含一个或多个LNA核碱基。

所需靶核酸的调节可以以本领域已知的几种方式执行。例如，反义寡核苷酸、siRNA等。酶促核酸分子（例如核酶）是能够催化各种反应中的一种或多种的核酸分子，包括以核苷酸碱基序列特异性方式重复切割其他分开的核酸分子的能力。此类酶促核酸分子可以例如用于事实上靶向任何RNA转录物（Zaug等人，324，Nature 429 1986；Cech，260 JAMA3030，1988；和Jefferies等人，17 Nucleic Acids Research 1371，1989）。

由于其序列特异性，反式切割的酶促核酸分子显示作为用于人疾病的治疗试剂的希望（Usman & McSwiggen，1995 Ann. Rep. Med. Chem. 30，285-294；Christoffersen和Marr，1995 J. Med. Chem. 38，2023-2037）。酶促核酸分子可以设计为切割在细胞RNA背景内的特异性RNA靶。此类切割事件致使mRNA无功能且取消来自该RNA的蛋白质表达。以这种方式，可以选择性抑制与疾病状态有关的蛋白质合成。

一般而言，具有RNA切割活性的酶促核酸通过首先与靶RNA结合来起作用。此类结合通过酶促核酸的靶结合部分发生，所述靶结合部分与作用于切割靶RNA的分子的酶促部分保持紧密接近。因此，酶促核酸首先识别且随后通过互补碱基配对结合靶RNA，并且一旦与正确位点结合，就酶促作用以切割靶RNA。此类靶RNA的策略性切割将破坏其指导编码蛋白质合成的能力。在酶促核酸已结合且切割其RNA靶后，它从那种RNA中释放，以搜索另一个靶，且可以重复结合且切割新靶。

几种方法例如体外选择（进化）策略（Orgel，1979，Proc. R. Soc. London，B 205，435）已用于进化能够催化各种反应的新核酸催化剂，所述各种反应例如磷酸二酯键和酰胺键的切割和连接（Joyce，1989，Gene，82，83-87；Beaudry等人，1992，Science 257，635-641；Joyce，1992，Scientific American 267，90-97；Breaker等人，1994，TIBTECH 12，268；Bartel等人，1993，Science 261:1411-1418；Szostak，1993，TIBS 17，89-93；Kumar等人，1995，FASEB J.，9，1183；Breaker，1996，Curr. Op. Biotech.，7，442）。

对于催化活性最佳的核酶的开发将显著促成任何策略，其采用RNA切割的核酶用于调节基因表达的目的。锤头核酶例如在饱和（10 mM）浓度的Mg²⁺辅因子的存在下，以约1分钟^-1的催化速率（k_cat）起作用。人工“RNA连接酶”核酶已显示以约100分钟^-1的速率催化相应自修饰反应。此外，已知具有由DNA构成的底物结合臂的特定修饰的锤头核酶催化RNA切割，具有接近100分钟^-1的多重周转率。最后，在锤头的催化核心内的特定残基由某些核苷酸类似物的替换给出经修饰的核酶，其显示催化速率中的多达10倍改善。这些发现证实核酶可以促进化学转化，其催化速率明显大于通过大多数天然自切割核酶在体外展示的那些。随后可能某些自切割核酶的结构可以最佳化，以给出最大限度催化活性，或可以制备对于RNA磷酸二酯切割展示明显更快的速率的全新RNA基序。

RNA底物通过拟合“锤头”模型的RNA催化剂的分子间切割首先在1987年显示（Uhlenbeck，O. C.（1987）Nature，328: 596-600）。回收RNA催化剂且与多重RNA分子反应，证实它是真正催化的。

通过在催化RNA中做出合适的碱基改变，以维持与靶序列的必需碱基配对，基于“锤头”基序设计的催化RNAs已用于切割特定靶序列（Haseloff和Gerlach，Nature，334，585（1988）；Walbot和Bruening，Nature，334，196（1988）；Uhlenbeck，O. C.（1987）Nature，328:596-600；Koizumi，M.，Iwai，S.和Ohtsuka，E.（1988）FEBS Lett.，228: 228-230）。这已允许使用催化RNA以切割特定靶序列，且指示根据“锤头”模型设计的催化RNAs可能可以在体内切割特定底物RNAs（参见Haseloff和Gerlach，Nature，334，585（1988）；Walbot和Bruening，Nature，334，196（1988）；Uhlenbeck，O. C.（1987）Nature，328: 596-600）。

RNA干扰（RNAi）已变成用于阻断哺乳动物和哺乳动物细胞中的基因表达的有力工具。这种方法需要小干扰RNA（siRNA）作为RNA自身或作为DNA的递送，其使用表达质粒或病毒和关于加工为siRNAs的小发夹RNAs的编码序列。这个系统使得siRNAs前体能够有效转运至细胞质，在其中它们是活性的且允许使用调节和组织特异性启动子用于基因表达。

在一个优选实施方案中，寡核苷酸或反义化合物包含核糖核酸（RNA）和/或脱氧核糖核苷酸（DNA）的寡聚物或聚合物，或其模拟物、嵌合体、类似物或同系物。这个术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间（主链）键组成的寡核苷酸，以及具有类似起作用的非天然存在的部分的寡核苷酸。通常需要此类经修饰或取代的寡核苷酸超过天然形式，因为希望的性质，例如增强的细胞摄取、对于靶核酸增强的亲和力和在核酸酶的存在下增加的稳定性。

根据本发明，寡核苷酸或“反义化合物”包括反义寡核苷酸（例如，RNA、DNA、其模拟物、嵌合体、类似物或同系物）、核酶、外部指导序列（EGS）寡核苷酸、siRNA化合物、单或双链RNA干扰（RNAi）化合物例如siRNA化合物、saRNA、aRNA和与靶核酸的至少部分杂交且调节其功能的其他寡聚化合物。像这样，它们可以是DNA、RNA、DNA样、RNA样或其混合物，或可以是这些中的一种或多种的模拟物。这些化合物可以是单链、双链、环状或发夹寡聚化合物，并且可以含有结构元件，例如内部或末端凸起、错配或环。反义化合物常规地线性制备，且可以连接或其他方式制备为环状和/或分支的。反义化合物可以包括构建体例如杂交的2条链，以形成完全或部分双链的化合物，或具有足够自互补性的单链，以允许杂交和形成完全或部分双链的化合物。2条链可以内部连接，留下游离3'或5'末端，或可以连接以形成连续发夹结构或环。发夹结构可以含有在5'或3'末端上的突出端，产生单链特征的延长部分。双链化合物任选地可以包括在末端上的突出端。进一步修饰可以包括与末端之一、所选择的核碱基位置、糖位置或核苷间键之一附着的缀合物基团。可替代地，2条链可以经由非核酸部分或接头基团连接。当由仅一条链形成时，dsRNA可以采取自互补发夹型分子的形式，其在自身上向后折叠以形成双链体。因此，dsRNAs可以是完全或部分双链的。基因表达的特定调节可以通过dsRNA发夹在转基因细胞系中的稳定表达来达到（Hammond等人，Nat.Rev.Genet.，1991，2，110-119；Matzke等人，Curr.Opin.Genet.Dev.，2001，11，221-227；Sharp，Genes Dev.，2001，15，485-490）。当由2条链，或采取在自身上向后折叠以形成双链体的自互补发夹型分子形式的单链形成时，2条链（或单链的双链体形成区域）是以沃森-克里克形式碱基配对的互补RNA链。

一旦引入系统中，本发明的化合物可以引发一种或多种酶或结构蛋白质的作用，以实现靶核酸的切割或其他修饰，或可以经由基于占据的机制工作。一般而言，核酸（包括寡核苷酸）可以描述为“DNA样”（即，一般具有一个或多个2'-脱氧糖和一般地T而不是U碱基）或“RNA样”（即，一般具有一个或多个2'-羟基或2'-经修饰的糖和一般地U而不是T碱基）。核酸螺旋可以采用超过一个类型的结构，最通常地A-和B-型。认为一般而言，具有B型样结构的寡核苷酸是“DNA样的”，并且具有A型样结构的寡核苷酸是“RNA样的”。在某些（嵌合）实施方案中，反义化合物可以含有A-和B-型区域。

依照本发明的反义化合物包含长度约5 – 约80个核碱基（即约5 – 约80个连接的核碱基）的反义部分。这指反义化合物的反义链或部分的长度。换言之，本发明的单链反义化合物包含5 – 约80个核碱基，并且本发明的双链反义化合物（例如dsRNA）包含长度5 –约80个核碱基的反义链或部分。本领域普通技术人员应当理解这包含长度5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核碱基的反义部分，或其内的任何范围。

在一个实施方案中，本发明的反义化合物具有长度10 – 50个核碱基的反义部分。本领域普通技术人员应当理解这体现具有长度10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核碱基的反义部分的寡核苷酸，或其内的任何范围。在某些实施方案中，寡核苷酸长度是15个核碱基。

在一个实施方案中，本发明的反义和寡核苷酸化合物具有长度12或13 – 30个核碱基的反义部分。本领域普通技术人员应当理解这体现具有长度12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核碱基的反义部分的反义化合物，或其内的任何范围。

在一个优选实施方案中，靶向HBF/HBG的任何一种或多种多核苷酸的至少一种寡核苷酸的施用预防或治疗与HBF/HBG多核苷酸及其编码的产物的异常表达或功能相关的疾病、或其他相关疾病。可以用反义寡核苷酸治疗的疾病的例子包含地中海贫血、镰状细胞病、红细胞生成、恶性贫血、贫血、白血病等。寡核苷酸还是预防性的，因为处于发展例如地中海贫血的危险中的患者可以施用一种或多种反义多核苷酸，以预防疾病或病症。寡核苷酸还可以与其他试剂一起作为治疗的一部分施用。

在另一个优选实施方案中，本发明的寡聚化合物还包括其中不同碱基存在于化合物中的一个或多个核苷酸位置上的变体。例如，如果第一个核苷酸是腺苷，那么可以产生在这个位置上含有胸苷、鸟苷或胞苷的变体。这可以在反义或dsRNA化合物的任何位置上完成。这些化合物随后使用本文描述的方法进行测试，以测定其抑制靶核酸表达的能力。

在某些实施方案中，在反义化合物例如SEQ ID NOS: 2 - 5与靶之间的同源性、序列同一性或互补性是约50％- 约60％。在某些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是约60％- 约70％。在某些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是约70％- 约80％。在某些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是80％- 约90％。在某些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸例如SEQ ID NOS: 3 - 5中所示的核酸分子包含一个或多个置换或修饰。在一个实施方案中，核碱基由锁核酸（LNA）置换。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸靶向靶多核苷酸的一个或多个区域。RNA寡核苷酸也靶向SEQ ID NO: 1，HBF/HBG多核苷酸的重叠区域。

本发明的某些优选寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。在本发明的背景中，“嵌合寡核苷酸”或“嵌合体”是含有2个或更多个化学上不同的区域的寡核苷酸，各由至少一个核苷酸构成。这些寡核苷酸一般含有赋予一种或多种有利性质的经修饰的核苷酸的至少一个区域（例如，增加的核酸酶抗性、增加摄取到细胞内、对于靶增加的结合亲和力），和其为关于能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交物的酶的底物的区域。例如，RNA酶H是切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。因此，RNA酶H的激活导致RNA靶的切割，从而极大增强基因表达的反义调节的效率。因此，当使用嵌合寡核苷酸时，与和相同靶区域杂交的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸比较，用更短的寡核苷酸通常可以获得相似的结果。RNA靶的切割可以通过凝胶电泳常规地检测，并且需要时，通过本领域已知的相关核酸杂交技术检测。在一个优选实施方案中，嵌合寡核苷酸包含修饰为增加靶结合亲和力的至少一个区域，和通常地，充当关于RNA酶H的底物的区域。寡核苷酸对于其靶（在这种情况下，编码ras的核酸）的亲和力通过测量寡核苷酸/靶对的T_m常规地测定，所述T_m是在其下寡核苷酸和靶解离的温度；解离通过分光光度法检测。T_m越高，寡核苷酸对于靶的亲和力越大。

本发明的嵌合反义化合物可以作为2种或更多种寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或如上所述的寡核苷酸模拟物的复合结构形成。此类化合物在本领域中也已称为杂交物或gapmers。教导此类杂交物结构的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利号5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，其各自引入本文作为参考。

在另一个优选实施方案中，经修饰的寡核苷酸的区域包含在糖的2'位置上修饰的至少一个核苷酸，最优选地2'-O-烷基、2'-O-烷基-O-烷基或2'-氟-修饰的核苷酸。在其他优选实施方案中，RNA修饰包括在RNA的3'末端上的嘧啶的核糖、脱碱基残基或倒转碱基上的2'-氟、2'-氨基和2' O-甲基修饰。此类修饰常规地掺入寡核苷酸内，并且这些寡核苷酸已显示具有针对给定靶的高于2'-脱氧寡核苷酸的T_m（即更高的靶结合亲和力）。此类增加的亲和力的效应极大增强基因表达的RNAi寡核苷酸调节。RNA酶H是切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶；这种酶的激活因此导致RNA靶的切割，并且因此可以极大增强RNAi抑制的效率。RNA靶的切割可以通过凝胶电泳常规地证实。在另一个优选实施方案中，嵌合寡核苷酸也进行修饰，以增强核酸酶抗性。细胞含有可以降解核酸的各种外切和内切核酸酶。许多核苷酸和核苷修饰已显示使得它们掺入其内的寡核苷酸对核酸酶消化比天然寡聚脱氧核苷酸更有抗性。通过使寡核苷酸与细胞提取物或分离的核酸酶溶液一起温育，且通常通过凝胶电泳测量完整寡核苷酸随着时间过去保留的程度，常规测量核酸酶抗性。已进行修饰以增强其核酸酶抗性的寡核苷酸完整存活比未经修饰的寡核苷酸更长的时间。多种寡核苷酸修饰已证实增强或赋予核酸酶抗性。含有至少一个硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸是目前更优选的。在某些情况下，增强靶结合亲和力的寡核苷酸修饰也独立地能够增强核酸酶抗性。某些希望的修饰可以在De Mesmaeker等人Acc.Chem.Res.1995，28:366-374中找到。

对于本发明设想的某些优选寡核苷酸的特定例子包括包含经修饰的主链的那些，例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键。最优选的是具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的那些，特别是CH₂-NH- O- CH₂、CH,-N（CH₃）-O-CH₂ [称为亚甲基（甲基亚氨基）或MMI主链]、CH₂ -O-N（CH₃）-CH₂、CH₂-N（CH₃）-N（CH₃）-CH₂和O-N（CH₃）-CH₂-CH₂主链，其中天然磷酸二酯主链表示为O- P-O- CH,）。由De Mesmaeker等人Acc. Chem. Res. 1995，28:366-374）公开的酰胺主链也是优选的。还优选的是具有吗啉代主链结构的寡核苷酸（Summerton和Weller，美国专利号5,034,506）。在其他优选实施方案中，例如肽核酸（PNA）主链，寡核苷酸的磷酸二酯主链由聚酰胺主链替换，核碱基与聚酰胺主链的氮杂氮原子直接或间接结合（Nielsen等人Science1991，254，1497）。寡核苷酸还可以包含一个或多个取代的糖部分。优选的寡核苷酸包含在2'位置上的下述之一：OH、SH、SCH₃、F、OCN、OCH₃ OCH₃、OCH₃ O（CH₂）_n CH₃、O（CH₂）_n NH₂或O（CH₂）_n CH₃，其中n是1 – 约10；C₁ – C₁₀低级烷基、烷氧基烷氧基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF₃ ；OCF₃；O-、S- 或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH₃；SO₂ CH₃；ONO₂；NO₂；N₃；NH₂；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报道基团；嵌入剂；用于改善寡核苷酸的药物代谢动力学性质的基团；或用于改善寡核苷酸的药效学性质的基团和具有相似性质的其他取代基。优选修饰包括2'-甲氧基乙氧基[2'-O-CH₂ CH₂ OCH₃，也称为2'-O-（2-甲氧基乙基）]（Martin等人，Helv. Chim. Acta，1995，78，486）。其他优选修饰包括2'-甲氧基（2'-O-CH₃）、2'-丙氧基（2'-OCH₂ CH₂CH₃）和2'-氟（2'-F）。类似修饰也可以在寡核苷酸上的其他位置上进行，特别是在3'末端核苷酸上的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸还可以具有糖模拟物例如环丁基代替戊呋喃糖基。

另外或可替代地，寡核苷酸还可以包括核碱基（本领域通常简称为“碱基”）修饰或置换。如本文使用的，“未经修饰的”或“天然的”核碱基包括腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）。经修饰的核碱基包括在天然核酸中仅不频繁地或暂时地发现的核碱基，例如次黄嘌呤，6-甲基腺嘌呤，5-Me嘧啶特别是5-甲基胞嘧啶（也称为5-甲基-2'脱氧胞嘧啶，且在本领域中通常称为5-Me-C）、5-羟甲基胞嘧啶（HMC）、糖基HMC和gentobiosyl HMC，以及合成核碱基，例如2-氨基腺嘌呤、2-（甲基氨基）腺嘌呤、2-（咪唑基烷基）腺嘌呤、2-（氨基烷基氨基）腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N₆（6-氨基己基）腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。Kornberg，A.，DNA Replication，W. H. Freeman & Co.，SanFrancisco，1980，第75-77页；Gebeyehu，G.,等人Nucl. Acids Res. 1987，15:4513）。可以包括本领域已知的“通用”碱基，例如肌苷。5-Me-C置换已显示使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃.（Sanghvi，Y. S.，in Crooke，S. T.和Lebleu，B.，编辑，Antisense Researchand Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，第276-278页）且是目前优选的碱基置换。

本发明的寡核苷酸的另一种修饰涉及使寡核苷酸与一种或多种部分或缀合物化学连接，这增强寡核苷酸的活性或细胞摄取。此类部分包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分、胆甾醇基部分（Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989，86，6553）、胆酸（Manoharan等人Bioorg.Med.Chem.Let.1994，4，1053）、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇（Manoharan等人Ann.N.Y.Acad.Sci.1992，660，306；Manoharan等人Bioorg.Med.Chem.Let.1993，3，2765）、巯基胆固醇（Oberhauser等人，Nucl.AcidsRes.1992，20，533）、脂肪族链例如十二烷二醇或十一基残基（Saison-Behmoaras等人EMBOJ.1991，10，111；Kabanov等人FEBS Lett.1990，259，327；Svinarchuk等人Biochimie 1993，75，49）、磷脂例如二-十六基-rac-甘油或三乙铵l,2-二-O-十六基-rac-甘油-3-H-膦酸酯（Manoharan等人Tetrahedron Lett. 1995，36，3651；Shea等人Nucl.Acids Res.1990，18，3777）、聚胺或聚乙二醇链（Manoharan等人Nucleosides & Nucleotides 1995，14，969）、或金刚烷乙酸（Manoharan等人Tetrahedron Lett. 1995，36，3651）。包含亲脂部分的寡核苷酸和用于制备此类寡核苷酸的方法是本领域已知的，例如美国专利号5,138,045、5,218,105和5,459,255。

对于在给定寡核苷酸中的所有位置不一定是一致地修饰的，并且事实上超过一种上述修饰可以掺入单个寡核苷酸中或甚至在寡核苷酸内的单个核苷内。本发明还包括其为如上文定义的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明的核酸分子与另一种部分缀合，包括但不限于无碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质或聚烃化合物。本领域技术人员将认识到这些分子可以与任何核苷酸中的一个或多个连接，包含在糖、碱基或磷酸基上的几个位置上的核酸分子。

依照本发明使用的寡核苷酸可以通过固相合成的众所周知技术方便地且常规地制备。用于此类合成的设备通过几个厂商包括Applied Biosystems销售。用于此类合成的任何其他方法也可以采用；寡核苷酸的实际合成完全在本领域普通技术人员的能力内。使用类似技术制备其他寡核苷酸例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物也是众所周知的。使用类似技术和商购可得的经修饰的amidites和可控孔度玻璃（CPG）产品合成荧光标记的、生物素化的或其他经修饰的寡核苷酸例如胆固醇修饰的寡核苷酸也是众所周知的，所述产品例如生物素、荧光素、吖啶或补骨脂素修饰的amidites和/或CPG（可从Glen Research，SterlingVA获得）。

依照本发明，使用修饰例如使用LNA单体以增强作用效力、特异性和持续时间且拓宽寡核苷酸施用途径包含目前化学例如MOE、ANA、FANA、PS等（参考：Recent advances inthe medical chemistry of antisense oligonucleotide by Uhlman，Current Opinionsin Drug Discovery & Development 2000第3卷No 2）。这可以通过经由LNA单体置换目前寡核苷酸中的某些单体来达到。LNA修饰的寡核苷酸可以具有类似于母体化合物的大小，或可以更大或优选更小。优选此类LNA修饰的寡核苷酸含有小于约70％、更优选小于约60％、最优选小于约50％LNA单体，并且其大小为约5 - 25个核苷酸、更优选为约12 - 20个核苷酸。

优选的经修饰的寡核苷酸主链包含但不限于具有正常3'-5'连接的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯包含3'烷撑膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯包含3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯（thionophosphoramidates）、硫代烷基膦酸酯（thionoalkylphosphonates）、硫代烷基磷酸三酯和硼磷酸酯，它们的2'-5'连接的类似物，和具有倒转极性的那些，其中核苷单位的相邻对是3'-5'与5'-3'或2'-5'与5'-2'连接的。还包括了各种盐、混合的盐和游离酸形式。

教导上述含磷连接的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050，其各自引入本文作为参考。

其中不包括磷原子的优选的经修饰的寡核苷酸主链具有通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一种或多种短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些包含具有吗啉代连接（在来自核苷的糖部分的部分中形成的）的那些；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；formacetyl和thioformacetyl主链；亚甲基formacetyl和thioformacetyl主链；含烯烃主链；氨基磺酸盐主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼主链；磺酸盐和磺胺主链；酰胺主链；及具有混合的N、O、S和CH₂组分部分的其他。

教导上述寡核苷酸的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，其各自引入本文作为参考。

在其他优选的寡核苷酸模拟物中，核苷酸单位的糖和核苷间键即主链由新型基团替换。碱基单位维持用于与合适的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物，已显示具有极佳杂交性质的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸（PNA）。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链由含酰胺主链特别是氨乙基甘氨酸主链替换。核碱基被保留且与主链的酰胺部分的氮杂氮原子直接或间接结合。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262，其各自引入本文作为参考。PNA化合物的进一步教导可以在o Nielsen等人，Science，1991，254，1497-1500中找到。

在本发明的另一个优选实施方案中，具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷，且特别是-CH₂-NH-O-CH₂-、-CH₂-N（CH₃）-O-CH₂-，其称为亚甲基（甲基亚氨基）或MMI主链、-CH₂-O-N（CH₃）-CH₂-、-CH₂N（CH₃）-N（CH₃）CH₂-和-O-N（CH₃）-CH₂-CH₂-，其中天然磷酸二酯主链表示为上文提及的美国专利号5,489,677的-O-P-O-CH₂-，和上文提及的美国专利号5,602,240的酰胺主链。还优选的是具有上文提及的美国专利号5,034,506的吗啉代主链结构的寡核苷酸。

经修饰的寡核苷酸还可以含有一个或多个取代的糖部分。优选的寡核苷酸包含在2'位置上的下述之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C至CO烷基或C₂至CO烯基和炔基。特别优选的是O（CH₂）_n O_mCH₃、O（CH₂）_n,OCH₃、O（CH₂）_nNH₂、O（CH₂）nCH_3、O（CH₂）_nONH₂和O（CH_2nON（CH₂）nCH₃）₂，其中n和m可以是1 – 约10。其他优选的寡核苷酸包含在2'位置上的下述之一：C至CO（低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药物代谢动力学性质的基团、或用于改善寡核苷酸的药效学性质的基团和具有相似性质的其他取代基。优选修饰包含2'-甲氧基乙氧基（2'-O-CH₂CH₂OCH₃，也称为2'-O-（2-甲氧基乙基）或2'-MOE）（Martin等人，Helv. Chim. Acta，1995，78，486-504），即烷氧基烷氧基。进一步优选的修饰包含2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即O（CH₂）₂ON（CH₃）₂基团，也称为2'-DMAOE，如本文下文实施例中所述，和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基（本领域也称为2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE），即，2'-O-CH₂-O-CH₂-N（CH₂）₂。

其他优选修饰包含2'-甲氧基（2'-O-CH₃）、2'-氨基丙氧基（2'-O CH₂CH₂CH₂NH₂）和2'-氟（2'-F）。类似修饰也可以在寡核苷酸上的其他位置上进行，特别是在3'末端核苷酸上的糖的3'位置或在2'-5'连接的寡核苷酸中和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸还可以具有糖模拟物例如环丁基部分代替戊呋喃糖基糖。教导此类经修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，其各自引入本文作为参考。

寡核苷酸还可以包含核碱基（本领域通常简称为“碱基”）修饰或置换。如本文使用的，“未经修饰的”或“天然的”核碱基包含嘌呤碱基腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G），以及嘧啶碱基胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）。经修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基，例如5-甲基胞嘧啶（5-me-C），5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶（假尿嘧啶），4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤（quanine）和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

进一步地，核碱基包含美国专利号3,687,808中公开的那些，'The ConciseEncyclopaedia of Polymer Science And Engineering'，第858-859页，Kroschwitz，J.I.，编辑John Wiley & Sons，1990中公开的那些，由Englisch等人，'Angewandle Chemie，International Edition'，1991，30，第613页公开的那些，和由Sanghvi，Y.S.，Chapter15，'Antisense Research and Applications'，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.ea.，CRC Press，1993公开的那些。这些核碱基中的某些对于增加本发明的寡聚化合物的结合亲和力是特别有用的。这些包含5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包含2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶置换已显示使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃（Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，编辑，'Antisense Research and Applications'，CRC Press，Boca Raton，1993，第276-278页）且是目前优选的碱基置换，甚至更加特别在与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。

教导上述经修饰的核碱基以及其他经修饰的核碱基的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利号3,687,808，以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,750,692,和5,681,941，其各自引入本文作为参考。

本发明的寡核苷酸的另一种修饰涉及使寡核苷酸与一种或多种部分或缀合物化学连接，这增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。

此类部分包含但不限于脂质部分例如胆固醇部分（Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989，86，6553-6556）、胆酸（Manoharan等人Bioorg.Med.Chem.Let.1994，4，1053-1060）、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇（Manoharan等人Ann.N.Y.Acad.Sci.1992，660，306-309；Manoharan等人Bioorg.Med.Chem.Let.1993，3，2765-2770）、巯基胆固醇（Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.1992，20，533-538）、脂肪族链例如十二烷二醇或十一基残基（Kabanov等人FEBS Lett.1990，259，327-330；Svinarchuk等人Biochimie1993，75，49-54）、磷脂例如二-十六基-rac-甘油或三乙铵l,2-二-O-十六基-rac-甘油-3-H-膦酸酯（Manoharan等人Tetrahedron Lett.1995，36，3651-3654；Shea等人Nucl.Acids Res.1990，18，3777-3783）、聚胺或聚乙二醇链（Manoharan等人Nucleosides & Nucleotides 1995，14，969-973）、或金刚烷乙酸（Manoharan等人Tetrahedron Lett.1995，36，3651-3654）、棕榈基部分（Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237）、或十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分（Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923-937）。

教导此类寡核苷酸缀合物的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717，5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,723；5,416,203，5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，其各自引入本文作为参考。

药物开发：本发明的化合物还可以应用于药物开发和靶确认领域。本发明包含本文鉴定的化合物和优选靶区段在药物开发努力中的使用，以阐明在珠蛋白多核苷酸和疾病状态、表型或状况之间存在的关系。这些方法包括检测或调节GLOBIN多核苷酸，包含使样品、组织、细胞或生物与本发明的化合物接触，在治疗后的某一时间测量GLOBIN多核苷酸的核酸或蛋白质水平和/或相关表型或化学终点，和任选地比较测量的值与未经处理的样品或用本发明的进一步化合物处理的样品。这些方法还可以与其他实验平行或组合执行，以测定未知基因用于靶确认过程的功能，或测定特定基因产物作为用于治疗或预防特定疾病、状况或表型的靶的有效性。

评估基因表达的上调或抑制：外源核酸转移到宿主细胞或生物内可以通过直接检测细胞或生物中核酸的存在进行评估。此类检测可以通过本领域众所周知的几种方法来达到。例如，外源核酸的存在可以通过DNA印迹或聚合酶链反应（PCR）技术进行检测，其使用特异性扩增与核酸相关的核苷酸序列的引物。外源核酸的表达还可以使用常规方法进行测量，包括基因表达分析。例如，由外源核酸产生的mRNA可以使用蛋白质印迹和逆转录PCR（RT-PCR）进行检测且定量。

来自外源核酸的RNA的表达还可以通过测量酶促活性或报道蛋白质活性进行检测。例如，反义调节活性可以作为靶核酸表达中的减少或增加间接地测量，作为外源核酸产生效应子RNA的指示。基于序列保守性，可以设计引物且用于扩增靶基因的编码区。最初，来自每种基因的最高度表达的编码区可以用于构建模型对照基因，尽管可以使用任何编码或非编码区。每种对照基因通过将每个编码区插入报道分子编码区及其多聚腺苷酸信号之间进行装配。这些质粒将产生在基因的上游部分中具有报道基因和在3'非编码区中具有潜在RNAi靶的mRNA。个别反义寡核苷酸的有效性将通过报道基因的调节进行评估。在本发明的方法中有用的报道基因包括乙酰羟酸合酶（AHAS）、碱性磷酸酶（AP）、β半乳糖苷酶（LacZ）、β葡糖醛酸酶（glucoronidase）（GUS）、氯霉素乙酰转移酶（CAT）、绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、蓝色荧光蛋白（CFP）、辣根过氧化物酶（HRP）、萤光素酶（Luc）、胭脂碱合酶（NOS）、章鱼碱合酶（OCS）及其衍生物。赋予对于下述的抗性的多重可选标记是可获得的：氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲蝶呤、膦丝菌素、嘌呤霉素和四环素。测定报道基因的调节的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于荧光法（例如荧光光谱法、荧光激活细胞分选（FACS）、荧光显微镜检查）、抗生素抗性测定。

试剂盒、研究试剂、诊断和治疗

本发明的化合物可以用于诊断、治疗和预防，且用作研究试剂和试剂盒的组分。此外，能够以强烈特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸通常由普通技术人员用于阐明特定基因的功能或区分生物学途径的各个成员的功能。

对于在试剂盒和诊断以及各种生物学系统中的使用，单独或与其他化合物或治疗剂组合，本发明的化合物作为区分和/或组合分析中的工具是有用的，以阐明在细胞和组织内表达的基因的部分或整个互补体的表达模式。

如本文使用的，术语“生物学系统”或“系统”定义为任何生物、细胞培养或组织，其表达GLOBIN家族成员基因的产物，或使得对表达GLOBIN家族成员基因的产物是感受态的。这些包括但不限于人、转基因动物、细胞、细胞培养物、组织、异种移植物、移植物及其组合。

作为一个非限制性例子，在用一种或多种反义化合物处理的细胞或组织内的表达模式与未用反义化合物处理的对照细胞或组织比较，并且就基因表达的差异水平分析产生的模式，因为它们例如涉及所检查基因的疾病相关、信号传导途径、细胞定位、表达水平、大小、结构或功能。这些分析可以对刺激或未刺激的细胞，并且在影响表达模式的其他化合物的存在或不存在下执行。

本领域已知的基因表达分析方法的例子包括DNA阵列或微阵列（Brazma和Vilo，FEBS Lett.，2000 480，17-24；Celis等人，FEBS Lett.，2000 480，2-16）、SAGE（基因表达的系列分析）（Madden等人，Drug Discov. Today，2000，5，415-425）、READS（消化cDNAs的限制性酶扩增）（Prashar和Weissman，Methods Enzymol.，1999，303，258-72）、TOGA（总基因表达分析）（Sutcliffe等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，1976-81）、蛋白质阵列和蛋白组学（Celis等人，FEBS Lett.，2000，480，2-16；Jungblut等人，Electrophoresis，1999，20，2100-10）、已表达系列标志（EST）测序（Celis等人，FEBS Lett.，2000，480，2-16；Larsson等人，J.Biotechnol，2000，80，143-57）、消减RNA指纹（SuRF）（Fuchs等人，Anal.Biochem.，2000，286，91-98；Larson等人，Cytometry，2000，41，203-208）、消减克隆、差异显示（DD）（Jurecic和Belmont，Curr.Opin.Microbiol.，2000，3，316-21）、比较基因组杂交（Carulli等人，J.Cell Biochem.Suppl.，1998，31，286-96）、FISH（荧光原位杂交）技术（Going和Gusterson，Eur.J.Cancer，1999，35，1895-904）和质谱法（To，Comb.Chem.HighThroughput Screen，2000，3，235-41）。

本发明的化合物对于研究和诊断有用，因为这些化合物与编码珠蛋白的核酸杂交。例如，以如本文公开的此类效率且在此类条件下杂交以便是有效的珠蛋白抑制剂的寡核苷酸在有利于基因扩增或检测的条件下分别是有效的引物或探针。这些引物和探针用于需要编码珠蛋白的核酸分子的特异性检测的方法中，和所述核酸分子用于检测或用于在珠蛋白的进一步研究中使用的扩增中。本发明的反义寡核苷酸特别是引物和探针与编码珠蛋白的核酸的杂交可以通过本领域已知的方法进行检测。此类方法可以包括酶与寡核苷酸的缀合，寡核苷酸的放射性标记，或任何其他合适的检测方法。还可以制备使用此类检测方法用于检测样品中的珠蛋白水平的试剂盒。

反义的特异性和灵敏度也由本领域技术人员用于治疗用途。反义化合物已用作动物包括人的疾病状态的治疗中的治疗部分。反义寡核苷酸药物已安全且有效地施用于人，并且众多临床试验目前在进行中。因此确定反义化合物可以是有用的治疗模式，其可以配置为用于治疗细胞、组织和动物特别是人的治疗方案中。

对于治疗，怀疑具有可以通过调节珠蛋白多核苷酸的表达治疗的疾病或病症的动物优选人通过施用依照本发明的反义化合物进行治疗。例如，在一个非限制性实施方案中，该方法包括给需要治疗的动物施用治疗有效量的珠蛋白抑制剂的步骤。本发明的珠蛋白例如HBF/HBG抑制剂有效抑制珠蛋白例如HBF/HBG1蛋白质的活性，或抑制珠蛋白例如HBF/HBG1蛋白质的表达。在一个实施方案中，在动物中HBF/HBG1的活性或表达被抑制约10％。优选地，在动物中HBF/HBG1的活性或表达被抑制约30％。更优选地，在动物中HBF/HBG1的活性或表达被抑制约50％或更多。因此，寡聚化合物调节HBF/HBG1 mRNA的表达至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。

例如，HBF/HBG1表达的减少可以在动物的血清、脂肪组织、肝或任何其他体液、组织或器官中进行测量。优选地，在待分析的所述流体、组织或器官内含有的细胞含有编码HBF/HBG1蛋白质的核酸分子。

通过将有效量的化合物加入合适的药学可接受的稀释剂或载体中，本发明的化合物可以用于药物组合物中。本发明的化合物和方法的使用也可以是预防上有用的。

缀合物（conjugates）

本发明的寡核苷酸的另一种修饰涉及使寡核苷酸与一种或多种部分或缀合物化学连接，这增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。这些部分或缀合物可以包括与官能团共价结合的缀合物基团，例如伯或仲羟基。本发明的缀合物基团包括嵌入剂、报道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物的药效学性质的基团、和增强寡聚物的药物代谢动力学性质的基团。一般的缀合物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸盐、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在本发明的背景中，增强药效学性质的基团包括改善摄取、增强对降解的抗性、和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明的背景中，增强药物代谢动力学性质的基团包括改善本发明的化合物的摄取、分布、代谢或排泄的基团。代表性缀合物基团公开于1992年10月23日提交的国际专利申请号PCT/US92/09196和美国专利号6,287,860，其引入本文作为参考。缀合物部分包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分、胆酸、硫醚例如己基-5-三苯甲基硫醇、巯基胆固醇、脂肪族链例如十二烷二醇或十一基残基、磷脂例如二-十六基-rac-甘油或三乙铵l,2-二-O-十六基-rac-甘油-3-H-膦酸酯、聚胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈基部分、或十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。本发明的寡核苷酸还可以与活性药物物质缀合，例如阿司匹林、华法林、苯基保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、（S）-（+）-普拉洛芬、卡洛芬、丹肌氨酸（dansylsarcosine）、2,3,5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂、吲哚美辛（indomethicin）、巴比妥酸盐、头孢菌素、磺胺药、抗糖尿病药、抗菌剂或抗生素。

教导此类寡核苷酸缀合物的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717，5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,723；5,416,203，5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。

制剂

本发明的化合物还可以与其他分子、分子结构或化合物的混合物混合、包装、缀合或以其他方式结合，如例如脂质体、受体靶向分子、经口、直肠、局部或其他制剂，用于帮助摄取、分布和/或吸收。教导此类摄取、分布和/或吸收辅助制剂的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利号5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756，其各自引入本文作为参考。

尽管反义寡核苷酸无需在载体的背景中施用，以便调节靶表达和/或功能，但本发明的实施方案涉及用于表达反义寡核苷酸的表达载体构建体，包含启动子、杂合启动子基因序列，且具有强组成型启动子活性，或可以在所需情况下诱导的启动子活性。

在一个实施方案中，本发明实践涉及用合适的核酸递送系统施用至少一种前述反义寡核苷酸。在一个实施方案中，该系统包括与多核苷酸可操作地连接的非病毒载体。此类非病毒载体的例子包括单独（例如SEQ ID NOS: 1 - 5中的任何一个或多个）或与合适蛋白质、多糖或脂质制剂组合的寡核苷酸。

另外合适的核酸递送系统包括病毒载体，一般是来自腺病毒、腺相关病毒（AAV）、辅助病毒依赖型腺病毒、逆转录病毒或日本凝血病毒-脂质体（HVJ）复合物中的至少一种的序列。优选地，病毒载体包含与多核苷酸可操作地连接的强真核启动子，例如巨细胞病毒（CMV）启动子。

另外优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一种优选的基于HIV的病毒载体包含至少2个载体，其中gag和pol基因来自HIV基因组并且env基因来自另一种病毒。DNA病毒载体是优选的。这些载体包括痘载体例如正痘或禽痘病毒载体、疱疹病毒载体例如单纯疱疹病毒（HSV）I载体[Geller，A.I.等人，J.Neurochem，64:487（1995）；Lim，F.等人，DNA Cloning:MammalianSystems，D.Glover，Ed.（Oxford Univ.Press，Oxford England）（1995）；Geller，A.I.等人，Proc Natl.Acad.Sci:U.S.A.:90 7603（1993）；Geller，A.I.等人，Proc Natl.Acad.SciUSA:87:1149（1990）]、腺病毒载体[LeGal LaSalle等人，Science，259:988（1993）；Davidson等人，Nat.Genet.3:219（1993）；Yang等人，J.Virol.69:2004（1995）]和腺相关病毒载体[Kaplitt，M.G.等人，Nat.Genet.8:148（1994）]。

本发明的反义化合物包含任何药学可接受的盐、酯或此类酯的盐、或任何其他化合物，其在施用于动物包括人后，能够提供（直接或间接地）其生物学活性代谢产物或残余物。

术语“药学可接受的盐”指本发明的化合物的生理学和药学可接受的盐：即，保留母体化合物的所需生物学活性且对其不赋予不需要的毒理学效应的盐。对于寡核苷酸，药学可接受的盐的优选例子及其用途在美国专利号6,287,860中进一步描述，其引入本文作为参考。

本发明还包括药物组合物和制剂，其包括本发明的反义化合物。本发明的药物组合物可以以许多方式进行施用，取决于需要局部还是全身性治疗、和待治疗的区域。施用可以是局部的（包括眼和粘膜包括阴道和直肠递送），肺的，例如通过粉末或气溶胶的吸入或吹入，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和经皮），经口或肠胃外。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内例如鞘内或心室内施用。具有至少一种2'-O-甲氧基乙基修饰的寡核苷酸认为对于经口施用是特别有用的。用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括经皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规药学载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是需要或希望的。包被保险套、手套等也可以是有用的。

可以以单位剂型方便地呈现的本发明的药物制剂可以根据制药工业中众所周知的常规技术进行制备。此类技术包括使活性成分与一种或多种药学载体或赋形剂达到结合的步骤。一般而言，通过使活性成分与液体载体或精细分开的固体载体或两者一致地且紧密地达到结合、且随后需要时使产物成形来制备制剂。

本发明的组合物可以配制成许多可能剂型中的任何，例如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可以配制为在水性、非水性或混合介质中的悬液。水性悬液可以进一步含有增加悬液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬液还可以含有稳定剂。

本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳状液、泡沫和含脂质体制剂。本发明的药物组合物和制剂可以包含一种或多种穿透促进剂、载体、赋形剂或其他活性或无活性成分。

乳状液一般是以直径通常超过0.1μm的小滴形式的一种液体分散在另一种中的非均质系统。乳状液可以含有除分散相外的另外组分，以及可能作为在水相、油相中的溶液或自身作为分离相存在的活性药物。包括微乳液作为本发明的一个实施方案。乳状液及其用途是本领域众所周知的，并且在美国专利号6,287,860中进一步描述。

本发明的制剂包括脂质体制剂。如本发明中使用的，术语“脂质体”意指由在一个或多个球形双层中排列的两亲脂质组成的囊泡。脂质体是单层或多层囊泡，其具有由亲脂材料形成的膜和含有待递送的组合物的水性内部。阳离子脂质体是带正电的脂质体，其认为与带负电的DNA分子相互作用，以形成稳定复合物。其为pH敏感或带负电的脂质体认为诱陷DNA而不是与之复合。阳离子和非阳离子脂质体已用于将DNA递送给细胞。

脂质体还包括“立体稳定的”脂质体，如本文使用的，指含有一种或多种专门脂质的脂质体的术语。当掺入脂质体内时，这些专门脂质导致相对于缺乏此类专门脂质的脂质体具有增强的循环寿命的脂质体。立体稳定的脂质体的例子是这样的，其中脂质体的部分囊泡形成脂质部分包含一种或多种糖脂，或由一种或多种亲水聚合物例如聚乙二醇（PEG）部分衍生。脂质体及其用途在美国专利号6,287,860中进一步描述。

本发明的药物制剂和组合物还可以包括表面活性剂。表面活性剂在药物产品、制剂和乳状液中的使用是本领域众所周知的。表面活性剂及其用途在美国专利号6,287,860中进一步描述，其引入本文作为参考。

在一个实施方案中，本发明采用各种穿透促进剂（penetration enhancer），以实现核酸特别是寡核苷酸的有效递送。除帮助非亲脂药物扩散穿过细胞膜外，穿透促进剂还增强亲脂药物的通透性。穿透促进剂可以分类为属于5个广泛范畴之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂。穿透促进剂及其用途在美国专利号6,287,860中进一步描述，其引入本文作为参考。

本领域技术人员将认识到制剂根据其预期用途即施用途径常规地设计。

用于局部施用的优选制剂包括这些，其中本发明的寡核苷酸与局部递送试剂混合，例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂。优选脂质和脂质体包括中性（例如二油酰基-磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱）阴性（例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG）和阳离子（例如二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰基-磷脂酰乙醇胺DOTMA）。

对于局部或其他施用，本发明的寡核苷酸可以装入脂质体内或可以与之形成复合物，特别是与阳离子脂质体。可替代地，寡核苷酸可以与脂质特别是阳离子脂质复合。优选的脂肪酸和酯、其药学可接受的盐、及其用途在美国专利号6,287,860中进一步描述。

用于经口施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒、微粒、纳米颗粒、在水或非水性介质中的悬液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或小片。增稠剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可以是希望的。优选的经口制剂是这样的，其中本发明的寡核苷酸与一种或多种穿透促进剂、表面活性剂和螯合剂结合施用。优选的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。优选的胆汁酸/盐和脂肪酸及其用途在美国专利号6,287,860中进一步描述，其引入本文作为参考。还优选的是穿透促进剂的组合，例如与胆汁酸/盐组合的脂肪酸/盐。特别优选的组合是月桂酸的钠盐、癸酸和UDCA。进一步的穿透促进剂包括聚氧乙烯-9-月桂醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡醚。本发明的寡核苷酸可以以颗粒形式包括喷雾干燥的颗粒经口递送，或复合以形成微或纳米颗粒。寡核苷酸络合剂及其用途在美国专利号6,287,860中进一步描述，其引入本文作为参考。

用于肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，其还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适添加剂，例如但不限于穿透促进剂、载体化合物和其他药学可接受的载体或赋形剂。

本发明的某些实施方案提供了含有一种或多种寡聚化合物和通过非反义机制起作用的一种或多种其他化学治疗剂的药物组合物。此类化学治疗剂的例子包括但不限于癌症化学治疗药物，例如柔红霉素、道诺霉素、更生霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、依索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、双氯乙基-亚硝基脲（nitrosurea）、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、光辉霉素、泼尼松、羟孕酮、睾酮、它莫西芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝基脲、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、羟基脲、喷司他丁、4-羟基过氧基环磷酰胺、5-氟尿嘧啶（5-FU）、5-氟脱氧尿苷（5-FUdR）、氨甲蝶呤（MTX）、秋水仙碱、泰素、长春新碱、长春碱、依托泊苷（VP- 16）、三甲曲沙、伊立替康、托泊替康、吉西他滨、替尼泊苷、顺铂和己烯雌酚（DES）。当与本发明的化合物一起使用时，此类化学治疗剂可以个别（例如5-FU和寡核苷酸）、顺次（例如5-FU和寡核苷酸一段时间，随后为MTX和寡核苷酸）、或与一种或多种其他此类化学治疗剂组合（例如5-FU、MTX和寡核苷酸，或5-FU、放射疗法和寡核苷酸）使用。抗炎药包括但不限于非类固醇抗炎药和皮质类固醇，和抗病毒药包括但不限于病毒唑（ribivirin）、阿糖腺苷、阿昔洛韦和更昔洛韦，也可以在本发明的组合物中组合。反义化合物和其他非反义药物的组合也在本发明的范围内。2种或更多种组合的化合物可以一起或顺次使用。

在另一个相关实施方案中，本发明的组合物可以含有靶向第一种核酸的一种或多种反义化合物，特别是寡核苷酸，和靶向第二种核酸靶的一种或多种另外的反义化合物。例如，第一种靶可以是HBF靶，并且第二种靶可以是来自另一种核苷酸序列的区域。可替代地，本发明的组合物可以含有靶向相同HBF核酸靶的不同区域的2种或更多种反义化合物。反义化合物的众多例子在本文中举例说明，并且其他可以选自本领域已知的合适化合物中。2种或更多种组合的化合物可以一起或顺次使用。

给药：治疗组合物的配制及其后续施用（给药）认为在本领域技术内。给药取决于待治疗的疾病状态的严重性和应答性，其中治疗过程从数天持续到数月，或直至实现治愈或达到疾病状态的减少。最佳给药方案可以由在患者体内药物蓄积的测量进行计算。普通技术人员可以容易地测定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可以取决于个别寡核苷酸的相对效力而改变，并且一般可以基于发现在体外和体内动物模型中有效的EC_50s进行估计。一般而言，剂量是0.01 μg - 100 g/kg体重，并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或更多次，或甚至每2 – 20年一次。基于药物在体液或组织中测量的停留时间和浓度，本领域普通技术人员可以容易地估计用于给药的重复率。在成功治疗后，可能希望使患者经历维持疗法以阻止疾病状态的复发，其中寡核苷酸以维持剂量施用，范围为0.01 μg - 100g/kg体重，每天一次或更多次，到每20年一次。

虽然本发明的各种实施方案已在上文描述，但应当理解它们仅作为例子而不是限制呈现。对于所公开的实施方案的众多改变可以依照本文公开内容做出，而不背离本发明的精神或范围。因此，本发明的宽度和范围不应受任何上述实施方案限制。

本文提及的所有文件引入本文作为参考。本申请中引用的所有出版物和专利文件为了所有目的引入作为参考，其程度与每个个别出版物或专利文件如此个别指示相同。通过其在本文件中的各种参考文献的引用，申请人不承认任何特定参考文献是其发明的“现有技术”。本发明组合物和方法的实施方案在下述实施例中举例说明。

实施例

下述非限制性实施例用于举例说明本发明的所选实施方案。应当理解在所示比例中的变动和在组分元件中的替代方案对于本领域技术人员将是显而易见的，并且在本发明的实施方案的范围内。

实施例1：珠蛋白多核苷酸的调节

材料与方法

用反义寡核苷酸处理HepG2细胞：使来自ATCC（目录# HB-8065）的HepG2细胞在生长培养基（MEM/EBSS（Hyclone 目录#SH30024，或Mediatech目录#MT-10-010-CV）+10％FBS（Mediatech目录#MT35-011-CV）+ 青霉素/链霉素（Mediatech目录#MT30-002-CI））中在37℃和5％CO₂下生长。在实验前一天，将细胞以1.5×10⁵细胞/ml的密度再铺到6孔板内，并且在37℃和5％CO₂下温育。在实验当天，将6孔板中的培养基更换为新鲜生长培养基。

将所有RNA寡核苷酸稀释至20 μΜ的浓度。将2 μl这种溶液与400 μl Opti-MEM培养基（Gibco目录#31985-070）和4 μl Lipofectamine 2000（Invitrogen目录#11668019）在室温温育20分钟，且应用于具有HepG2细胞的6孔板的每个孔。将包括2 μl水代替寡核苷酸溶液的类似混合物用于模拟转染的对照。

在37℃和5％CO₂下温育3-18小时后，将培养基更换为新鲜生长培养基。在RNA寡核苷酸添加后48小时，去除培养基，并且使用来自Promega的SV Total RNA IsolationSystem（目录#Z3105）或来自Qiagen的RNeasy Total RNA Isolation试剂盒（目录#74181），根据制造商的说明书，从细胞中提取RNA。

将600 ng RNA加入使用来自Thermo Scientific（目录#AB1453B）的Verso cDNA试剂盒执行的逆转录反应中，如制造商的方案中所述。来自这种逆转录反应的cDNA用于通过实时PCR监控基因表达，其使用ABI Taqman Gene Expression Mix（目录#4369510）和由ABI设计的引物/探针。使用下述PCR循环：50℃2分钟，95℃10分钟，（95℃15秒、60℃1分钟）的40个循环，使用Mx4000热循环仪（Stratagene）。基于在处理和模拟转染的样品之间18S标准化的dCt值中的差异，计算在用RNA寡核苷酸处理后在基因表达中的倍数改变。

结果：

实时PCR结果显示在HepG2细胞中的HBF mRNA水平在用针对HBF反义Hs.702397设计的2种寡核苷酸处理后48小时显著增加（图1）。

基因名称: HBF/HBG1（登记号: NM_000559）:

。

天然反义序列（Hs.702397）:

。

反义寡核苷酸：

HBF Hs.702397_3（SEQ ID NO: 3）:

HBF Hs.702397_2（SEQ ID NO: 4）:

HBF Hs.702397_l（SEQ ID NO: 5）:

检测探针：ABI Taqman Gene Expression Assay: Hs00361131_gl。

尽管本发明已就一个或多个实现而言进行举例说明且描述，但在阅读和理解本说明书和附图后，本领域技术人员将想到等价改变和修饰。此外，虽然本发明的特定特征可能就数个实现中的仅一个而言公开，但此类特征可以与其他实现的一个或多个其他特征组合，如对于任何给定或特定应用可能需要且有利的。

公开内容的摘要将允许读者快速确定技术公开内容的性质。它伴随它将不用于解释或限制所附权利要求的范围或含义的理解提交。

序列表

<110> CuRNA, Inc.

<120> 通过抑制针对HBF/HBG的天然反义转录物治疗血红蛋白（HBF/HBG）相关疾病

<130> HBF

<150> US61/174,719

<151> 2009-05-01

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 584

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

acactcgctt ctggaacgtc tgaggttatc aataagctcc tagtccagac gccatgggtc 60

atttcacaga ggaggacaag gctactatca caagcctgtg gggcaaggtg aatgtggaag 120

atgctggagg agaaaccctg ggaaggctcc tggttgtcta cccatggacc cagaggttct 180

ttgacagctt tggcaacctg tcctctgcct ctgccatcat gggcaacccc aaagtcaagg 240

cacatggcaa gaaggtgctg acttccttgg gagatgccac aaagcacctg gatgatctca 300

agggcacctt tgcccagctg agtgaactgc actgtgacaa gctgcatgtg gatcctgaga 360

acttcaagct cctgggaaat gtgctggtga ccgttttggc aatccatttc ggcaaagaat 420

tcacccctga ggtgcaggct tcctggcaga agatggtgac tgcagtggcc agtgccctgt 480

cctccagata ccactgagct cactgcccat gattcagagc tttcaaggat aggctttatt 540

ctgcaagcaa tacaaataat aaatctattc tgctgagaga tcac 584

<210> 2

<211> 1586

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

acactcgctt ctggaacgtc tgaggttatc aataagctcc tagtccagac gccatgggtc 60

atttcacaga ggaggacaag gctactatca caagcctgtg gggcaaggtg aatgtggaag 120

atgctggagg agaaaccctg ggaaggtagg ctctggtgac caggacaagg gagggaagga 180

aggaccctgt gcctggcaaa agtccaggtc gcttctcagg atttgtggca ccttctgact 240

gtcaaactgt tcttgtcaat ctcacaggct cctggttgtc tacccatgga cccagaggtt 300

ctttgacagc tttggcaacc tgtcctctgc ctctgccatc atgggcaacc ccaaagtcaa 360

ggcacatggc aagaaggtgc tgacttcctt gggagatgcc acaaagcacc tggatgatct 420

caagggcacc tttgcccagc tgagtgaact gcactgtgac aagctgcatg tggatcctga 480

gaacttcaag gtgagtccag gagatgtttc agccctgttg cctttagtct cgaggcaact 540

tagacaacgg agtattgatc tgagcacagc agggtgtgag ctgtttgaag atactggggt 600

tgggggtgaa gaaactgcag aggactaact gggctgagac ccagtggtaa tgttttaggg 660

cctaaggagt gcctctaaaa atctagatgg acaattttga ctttgagaaa agagaggtgg 720

aaatgaggaa aatgactttt ctttattaga ttccagtaga aagaactttc atctttccct 780

catttttgtt gttttaaaac atctatctgg aggcaggaca agtatggtcg ttaaaaagat 840

gcaggcagaa ggcatatatt ggctcagtca aagtggggaa ctttggtggc caaacataca 900

ttgctaaggc tattcctata tcagctggac acatataaaa tgctgctaat gcttcattac 960

aaacttatat cctttaattc cagatggggg caaagtatgt ccaggggtga ggaacaattg 1020

aaacatttgg gctggagtag attttgaaag tcagctctgt gtgtgtgtgt gtgtgtgcgc 1080

gcgcgcgtgt gtgtgtgtgt gtcagcgtgt gtttctttta acgtcttcag cctacaacat 1140

acagggttca tggtggcaag aagatagcaa gatttaaatt atggccagtg actagtgctt 1200

gaaggggaac aactacctgc atttaatggg aaggcaaaat ctcaggcttt gagggaagtt 1260

aacataggct tgattctggg tggaagcttg gtgtgtagtt atctggaggc caggctggag 1320

ctctcagctc actatgggtt catctttatt gtctcctttc atctcaacag ctcctgggaa 1380

atgtgctggt gaccgttttg gcaatccatt tcggcaaaga attcacccct gaggtgcagg 1440

cttcctggca gaagatggtg actgcagtgg ccagtgccct gtcctccaga taccactgag 1500

ctcactgccc atgattcaga gctttcaagg ataggcttta ttctgcaagc aatacaaata 1560

ataaatctat tctgctgaga gatcac 1586

<210> 3

<211> 570

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

tgtgatctct cagcagaata gatttattat ttgtattgct tgcagaataa agcctatcct 60

tgaaagctct gaatcatggg cagtgagctc agtggtatct ggaggacagg gcactggcca 120

ctgcagtcac catcttctgc caggaagcct gcacctcagg ggtgaattct ttgccgaaat 180

ggattgccaa aacggtcacc agcacatttc ccaggagctt gaagttctca ggatccacat 240

gcagcttgtc acagtgcagt tcactcagct gggcaaaggt gcccttgaga tcatccaggt 300

gctttgtggc atctcccaag gaagtcagca ccttcttgcc atgtgccttg actttggggt 360

tgcccatgat ggcagaggca gaggacaggt tgccaaagct gtcaaagaac ctctgggtcc 420

atgggtagac aaccaggagc cttcccaggg tttctcctcc agcatcttcc acattcacct 480

tgccccacag gcttgtgata gtagccttgt cctcctctgt gaaatgaccc atggcgtctg 540

gactaggagc ttattgataa cctcagacgt 570

<210> 4

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 4

rcrurururc rarargrgra rurargrgrc rurururaru rurcrurgrc rara 54

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 5

rcrcrurgrg rcrargrara rgrarurgrg rurgrarcru rgrcrargru rgrg 54

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 6

rgrurcrara rgrgrcrarc rarurgrgrc rarargrara rgrgrurgrc rurg 54

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 7

gtcctccaga taccactgag c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 8

tgccctgtcc tccagatacc 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 9

ggtgctgact tccttgggag a 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 10

cctgggaaat gtgctggtga c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 11

cctgggaaat gtgctggtga c 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 12

cctttgccca gctgagtga 19

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 13

gcccatgatt cagagctttc a 21

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸SEQ ID NO: 4的反向互补体

<400> 14

rgrcrargra rarurarara rgrcrcrura rurcrcruru rgraraag 48

<210> 15

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸SEQ ID NO: 5的反向互补体

<400> 15

rarcrurgrc rargrurcra rcrcrarurc rururcrurg rcrcragg 48

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸SEQ ID NO: 6的反向互补体

<400> 16

rgrcrarcrc rururcruru rgrcrcraru rgrurgrcrc rururgac 48

Claims (28)

1.对于珠蛋白多核苷酸的天然反义多核苷酸特异的SEQ ID NO：5所示的反义化合物在制备用于在体内上调患者细胞或组织中的所述珠蛋白多核苷酸的功能和/或表达的药物中的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述寡核苷酸反义化合物靶向选自SEQ ID NO：2的珠蛋白多核苷酸的天然反义序列。

3.权利要求1的用途，其中所述寡核苷酸靶向与编码和/或非编码核酸序列反义的天然反义多核苷酸。

4.权利要求1的用途，其中所述反义寡核苷酸靶向与珠蛋白多核苷酸具有重叠和/或非重叠序列的天然反义多核苷酸。

5.权利要求1的用途，其中所述反义寡核苷酸包含一种或多种修饰，所述修饰包含：经修饰的糖部分、经修饰的核苷间键、经修饰的核碱基和/或其组合。

6.权利要求5的用途，其中所述经修饰的糖部分包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2′-甲氧基修饰的糖部分、2′-O-烷基修饰的糖部分、或双环糖部分。

7.权利要求5的用途，其中所述经修饰的核苷间键包含硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、亚氨酸乙酯、羧甲基酯和/或其组合。

8.权利要求5的用途，其中任选具有至少一个经修饰的核碱基的所述寡核苷酸包含肽核酸、锁核酸(LNA)分子、其类似物或衍生物。

9.对于珠蛋白多核苷酸的天然反义多核苷酸特异的SEQ ID NO：5所示的反义化合物在制备用于在体内增加哺乳动物细胞或组织中的珠蛋白基因表达和/或功能的药物中的用途。

10.权利要求9的用途，其中所述反义寡核苷酸包含一种或多种修饰，包含：经修饰的糖部分、经修饰的核苷间键、经修饰的核碱基和/或其组合。

11.权利要求10的用途，其中所述经修饰的糖部分包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2′-甲氧基修饰的糖部分、2′-O-烷基修饰的糖部分、或双环糖部分。

12.权利要求10的用途，其中所述经修饰的核苷间键包含硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、亚氨酸乙酯、羧甲基酯和/或其组合。

13.权利要求12的用途，其中所述核苷间键包含至少一个硫代磷酸酯键。

14.权利要求10的用途，其中所述经修饰的核碱基包含肽核酸、锁核酸(LNA)分子、其类似物、衍生物或组合。

15.对于编码珠蛋白分子的多核苷酸的天然反义转录物特异的SEQ ID NO：5所示的反义化合物在制备用于在体内上调哺乳动物细胞或组织中的珠蛋白基因表达和/或功能的药物中的用途。

16.权利要求15的用途，其中所述反义寡核苷酸包含一种或多种修饰，所述修饰包含：经修饰的糖部分、经修饰的核苷间键、经修饰的核碱基和/或其组合。

17.权利要求16的用途，其中所述经修饰的糖部分包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2′-甲氧基修饰的糖部分、2′-O-烷基修饰的糖部分、或双环糖部分。

18.权利要求16的用途，其中所述经修饰的核苷间键包含硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、亚氨酸乙酯、羧甲基酯和/或其组合。

19.权利要求18的用途，其中所述核苷间键包含至少一个硫代磷酸酯键。

20.权利要求16的用途，其中所述经修饰的核碱基包含肽核酸、锁核酸(LNA)分子、其类似物或衍生物。

21.权利要求15的用途，其中使所述细胞或组织与反义化合物接触包含所述反义化合物的肠胃外施用。

22.一种包含至少一种修饰的SEQ ID NO：5所示核苷酸的合成、经修饰的寡核苷酸，其中所述修饰包含下述至少一种核苷酸间键：烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、亚氨酸乙酯、羧甲基酯或其组合，其中所述寡核苷酸是与HBF/HBG基因的天然反义多核苷酸杂交且上调其表达的反义化合物。

23.权利要求22的寡核苷酸，其包含硫代磷酸酯核苷酸间键和选自下述的至少一种核苷酸间键的组合：烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、亚氨酸乙酯、羧甲基酯和/或其组合。

24.权利要求22的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。

25.权利要求22的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键的主链。

26.权利要求22的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸任选包含至少一个经修饰的核碱基，包含肽核酸、锁核酸(LNA)分子、其类似物、衍生物和/或组合。

27.权利要求22的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含经修饰的糖部分，所述糖部分包含2′-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2′-甲氧基修饰的糖部分、2′-O-烷基修饰的糖部分、或双环糖部分。

28.一种组合物，其包含权利要求22的化合物和药学可接受的赋形剂。