JPH0682A - 安定化リボザイム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】リボザイムの触媒領域以外の部分的な領域内
で、構成するモノリボヌクレオチドの１又は２以上が、
それに相当するモノデオキシリボヌクレオチドに置換さ
れて成り、かつ、リボザイムの触媒領域を含む部分的な
領域内で、リボザイムのリン酸エステル結合〔−Ｏ−Ｐ
（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−〕の１又は２以上が、チオリン
酸エステル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−又は
−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕である、安定化リボ
ザイム。 【効果】従来のリボザイムと同様にＲＮＡ分解活性を維
持しながら、かつＲＮＡ分解酵素等に対して抵抗性を有
する、新規な安定化リボザイムを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、安定化リボザイムに関
するものであり、更に詳しくは、標的ＲＮＡを特異的に
切断するリボザイムの機能は維持したまま、リボザイム
を人為的に改変して安定化分子もしくは構造とした安定
化リボザイムに関するものであり、これは医薬、動物
薬、農薬あるいは試薬等に有効に利用されうるものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】従来、すべての酵素はタンパク質から構
成されていると確信されていたが、１９８１年に酵素活
性を有するＲＮＡ分子、すなわちリボザイムが発見さ
れ、従来の酵素に関する概念は打ち破られた。この画期
的発見はコロラド大学のチェック（T. Chech）らによっ
てなされたもので、原生動物のテトラヒメナのリボソー
ムＲＮＡ（ｒＲＮＡ）前駆体はタンパク質の力を借りず
に、遺伝情報を伝達する上で不必要なイントロン（ＩＶ
Ｓ）をセルフスプライシングで取り除くことが証明され
た（Cell ,Vol.31, p.147-157(1982);Nature ,Vol.308,
p.820-825(1984))。その後、ホスホジエステル結合を
セルフスプライシングする触媒機能を有するＲＮＡ分子
が次々と見出されているほか、他のＲＮＡ分子を切断す
るＲＮＡ分子(リボザイム)も見つかっている。

【０００３】このような中で、最近、ハセロフ（J. Has
eloff）とジャーラック（W.L.Gerlach）は、数種の植物
ウイルスのリボザイムの間で共通に保存されている塩基
配列に着目し、標的ＲＮＡ結合領域を除くリボザイム分
子の大きさがわずか２４塩基で構成された短鎖リボザイ
ムを、遺伝子操作技術及び酵素の手法を用いて構築する
ことに成功した（Nature ,Vol.334,p.585-591(1988)；
特表平3-502638号公報）。また、大塚らは非自己のＲＮ
Ａ分子の切断を触媒する活性な短鎖リボザイムを化学合
成で調製している（特開平２−１９５８８３号公報）。

【０００４】図１は短鎖リボザイムの構造と作用部位を
説明するものである。リボザイムは、標的であるＲＮＡ
分子の塩基配列を認識して塩基対を形成する結合領域Ｃ
と、２４個の特定の塩基配列を有する領域Ｂ（Ａ、Ｇ又
はＵを丸印で囲った触媒活性部位を含む）から構成され
ており、標的ＲＮＡは標的ＲＮＡ中のＡ領域（ＧＵＣ）
に隣接する位置（図１中、矢印で示す）で切断される。
なお、このＡ領域の配列はＧＵＣのみではなく、他の配
列でも切断されることが知られている。

【０００５】リボザイムは、リボザイムの核酸塩基配列
に基づいてリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡを合成
し、これをプラスミドに挿入し、更にこの組換えプラス
ミドを形質転換して得られるクローンを適当な制限酵素
で切断してリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を
取得し、これを鋳型としてイン・ビトロ（in vitro）で
転写することにより、あるいは化学的合成法によってリ
ボヌクレオチドを順次連結することにより得られること
は前記の文献中に記載されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】自然界にはＲＮＡ分解
酵素が広く分布している。リボザイムはこのＲＮＡ分解
酵素によって容易に分解を受け失活するので、安定性に
問題がある。本発明は、リボザイムの特異的なＲＮＡ分
解活性を維持したままで、ＲＮＡ分解酵素の攻撃に対し
抵抗性を有する安定な修飾リボザイム、すなわち安定化
リボザイムを提供し、医薬、動物薬、農薬あるいは試薬
等に有効に利用することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明者らはリボザイムを安定化する種々の修飾方
法を検討した結果、リボザイムのリン酸エステル結合
〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−〕の一又は二以上
を、チオリン酸エステル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（Ｏ
Ｈ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕とす
ることにより、あるいはそれに加えて、リボザイムを構
成する分子もしくは構造の非触媒領域（図１において、
Ａ、Ｇ又はＵを丸印で囲った部位以外の領域）内で、構
成するモノリボヌクレオチドの一又は二以上を、それに
相当するモノデオキシリボヌクレオチドに置換すること
により、リボザイムはその特異的なＲＮＡ分解活性を維
持したままで、ＲＮＡ分解酵素の攻撃に対して抵抗性を
有する安定な修飾リボザイム、すなわち安定化リボザイ
ムとなることを見出し、本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は下記の（１）〜（６）
に関するものである。 （１）リボザイムの触媒領域以外の部分的な領域内で、
構成するモノリボヌクレオチドの１又は２以上が、それ
に相当するモノデオキシリボヌクレオチドに置換されて
成り、かつ、リボザイムの触媒領域を含む部分的な領域
内で、リボザイムのリン酸エステル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝
Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−〕の１又は２以上が、チオリン酸エ
ステル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−又は−Ｏ
−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕である、安定化リボザイ
ム。

【０００９】（２）次式（Ｉ）で表される安定化リボザ
イム。

【化３】 （式（Ｉ）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＵはそれぞれアデニン
モノリボヌクレオチド、グアニンモノリボヌクレオチ
ド、シトシンモノリボヌクレオチド、ウラシルモノリボ
ヌクレオチドを表し、網掛けのＡ、網掛けのＧ及び網掛
けのＣはそれぞれアデニンモノデオキシリボヌクレオチ
ド、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド、シトシン
モノデオキシリボヌクレオチドを表し、網掛けのＸはア
デニンモノデオキシリボヌクレオチド、グアニンモノデ
オキシリボヌクレオチド、シトシンモノデオキシリボヌ
クレオチド、チミンモノデオキシリボヌクレオチドのい
ずれか任意のモノデオキシリボヌクレオチドを表し、ｓ
はチオリン酸エステル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）
−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕を表し、
ｍ及びｎはそれぞれ異ってもよい１又は２以上の以上の
整数を表し、*は相補的なヌクレオチド間の塩基対を表
す。）

【００１０】（３）次式（II）で表される安定化リボザ
イム。

【化４】 （式（II）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、網掛けのＡ、網掛けの
Ｇ、網掛けのＣ、網掛けのＸ、ｓ、ｍ、ｎ及び* は式
（Ｉ）と同じ意味を表す。）

【００１１】（５）核酸塩基の活性基及び５'−水酸基
が保護基で保護され、３'−水酸基は架橋構造を介して
担体に結合しているモノデオキシリボヌクレオシド（固
相）から、（ａ）５'−水酸基の保護基をはずしたの
ち、固相を洗浄し、（ｂ）核酸塩基の活性基並びに２'
−及び５'−水酸基が保護基で保護されたリボヌクレオ
シド−３'−Ｏ−（β−シアノエチル）ホスホアミダイ
ト又は核酸塩基の活性基並びに５'−水酸基が保護基で
保護されたデオキシリボヌクレオシド−３'−Ｏ−（β
−シアノエチル）ホスホアミダイトを反応させ、次いで
固相を洗浄し、（ｃ）未反応の５'−水酸基をアセチル
化したのち固相を洗浄する工程、及び酸化剤で酸化した
のち固相を洗浄する工程を、任意の順序で行い、（ｄ）
以下、（ａ）〜（ｃ）を繰り返し、（ｅ）固相をアルカ
リ処理して、３'−水酸基と担体のあいだの結合を切
り、（ｆ）他の保護基をはずす、ことを特徴とする上記
（１）又は（２）のいずれかの安定化リボザイムの製造
方法。

【００１２】（５）酸化剤がヨウ素及び／又はテトラエ
チルチウラムジサルファイドを含むものである上記
（３）の製造方法。

【００１３】（６）標的ＲＮＡを上記（１）又は（２）
のいずれかの安定化リボザイムと反応させることを特徴
とする、標的ＲＮＡの切断又は不活化方法。

【００１４】（７）上記（１）又は（２）のいずれかの
安定化リボザイムを有効成分とする医薬、動物薬、農薬
又は試薬。

【００１５】本発明の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表され
る安定化リボザイムは、３'−又は５'−末端の水酸基が
リン酸化されたものであっても、遊離のものであっても
どちらでもよい。また、式（Ｉ）又は式（II）で表され
る安定化リボザイムのチオリン酸エステル結合には、Ｒ
型及びＳ型の立体異性体が存在するが、いずれでもよ
く、ＲＳ混合型であってもよい。本発明の安定化リボザ
イムの製造方法は、いわゆる固相化学合成法のうちの、
ベータシアノエチルホスホアミダイト法に基礎を置くも
のであるが、メチルホスホアミダイトを用いた場合もチ
オフェノールによる処理を追加するだけで同様に安定化
リボザイムの製造が可能である。

【００１６】核酸塩基の活性基としては例えばアミノ基
があり、この保護基としては例えば、ベンゾイル基、ア
ニソイル基、イソブチリル基等がある。固相から５'−
水酸基の保護基をはずすには、ジクロロ酢酸又はトリク
ロロ酢酸のジクロロメタン溶液等を用いることができ
る。２'−水酸基の保護基には例えば、ｔ−ブチルジメ
チルシリル基等があり、また５'−水酸基の保護基には
例えば、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル
基、トリチル基等がある。

【００１７】未反応の５'−水酸基のアセチル化は１−
メチルイミダゾールもしくはジメチルアミノピリジンを
含む無水酢酸等によって、行うことができる。固相の洗
浄は、通常、アセトニトリルを用いて行う。酸化剤とし
ては、リン酸エステル結合を生成させるときは、ヨウ
素、水、ピリジン及びテトラヒドロフラン含有液等を用
い、チオリン酸エステル結合を生成させるときは、テト
ラエチルチウラムジサルファイド、３Ｈ，１，２−ベン
ゾジチオール−１，１−ジオキサイド等を用いる。

【００１８】固相から目的の安定化リボザイムを切り出
すにはアルカリ溶液、例えば１５〜３０％アンモニア等
が用いられる。このようにして合成した安定化リボザイ
ムは、逆相、イオン交換等のカラムクロマトグラフィ
ー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル
電気泳動等の通常、核酸の精製によく用いられる方法の
一つ、又はそれらの組合せにより精製する。

【００１９】本発明の安定化リボザイムは標的ＲＮＡを
切断又は不活化するので、医薬、動物薬、農薬等として
有効に利用される。標的ＲＮＡとしては、種々病原性の
ウィルス由来のＲＮＡ、ガン遺伝子由来のＲＮＡ、細胞
の増殖・分化に関係する遺伝子由来のＲＮＡ等がある。
切断又は不活化の反応は、適宜好適な条件を選べばよい
が、例えば、５〜５００ｍＭのマグネシウム又はマンガ
ンイオンの存在下、ｐＨ８．０±３．０、温度２０〜７
０℃で行うとよい。

【００２０】医薬としては例えば、エイズ、白血病、各
種悪性腫瘍、流行性結膜炎等の治療用医薬がある。動物
薬としては例えば、牛、豚、ニワトリ、イヌ、ネコ等の
各種ウィルス病の治療用動物薬がある。農薬としては例
えば、タバコモザイク病、イネ萎縮病、キュウリモザイ
ク病等の各種植物ウィルス病に対する農薬等がある。試
薬としては例えば、ＲＮＡ分析用やＲＮＡプロセシシン
グ用等の研究用生化学試薬や診断薬等がある。

【００２１】

【実施例】以下実施例により、本発明を詳細に説明す
る。 実施例１ 次式（III）で表される安定化リボザイムの
合成

【化５】 （式（III）中、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、網掛けのＡ、網掛け
のＧ、網掛けのＣ、ｓ及び* は、式（I）と同じ意味を
示す。）

【００２２】ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（アプライドバイ
オシステムズ社製、３８０Ｂ型）にｄＣ−ＣＰＧカラム
（シトシン量:１μｍｏｌ）を装着した後、バージョン
１．３４のプログラムを用いて、以下の（1）〜（5）の
手順で、式（III）の安定化リボザイムを合成した。

【００２３】（1）２％(ｗ／ｖ)トリクロル酢酸のジク
ロルメタン溶液を１．６ｍｌ／ｍｉｎで５０秒間カラム
に流して、５'−水酸基のジメトキシトリチル基を外
す。 （2）アセトニトリルでカラムを洗浄した後、５’−Ｏ
−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−Ｎ²−イソ
ブチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノエチルホスホア
ミダイトのアセトニトリル溶液（７７／ｍｌ）及び４％
（ｗ／ｖ）テトラゾールのアセトニトリル溶液の１：１
（容量比）混合液を１．５ｍｌ／ｍｉｎで１０秒間給液
し、３０秒間保持し、縮合反応を起こさせてホスファイ
ト結合を形成させる。 （3）アセトニトリルでカラムを洗浄後、１０％（ｖ／
ｖ）無水酢酸及び１０％（ｖ／ｖ）２，６−ルチジンを
含むテトラヒドロフラン溶液と１６％（ｖ／ｖ）１−メ
チルイミダゾールを含むテトラヒドロフラン溶液の１：
１（容量比）混合液を１．５ｍｌ／ｍｉｎで２０秒間流
し、未反応の５'−水酸基をアセチル化する。 （4）アセトニトリルで洗浄後、１５％テトラエチルチ
ウラムジサルファイドを含むアセトニトリル溶液を１.
６ ml／minで２３秒間流し、１５分間放置し、ホスファ
イト結合をチオリン酸結合に酸化し、再びアセトニトリ
ルで洗浄する。 （5）上記の（1）〜（4）の工程を、式（III）に示した
３’側からの３番目以降の核酸塩基配列に従って繰り返
す。

【００２４】ここで、手順（2）のアミダイト試薬は、
Ａの場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−
ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−Ｎ⁶−ベンゾ
イル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホ
スホアミダイト、Ｇの場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシ
ン−Ｎ²−イソブチリル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルア
ミノシアノエチルホスホアミダイト、Ｃの場合、５’−
Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチ
ルシリル−シチジン−Ｎ⁴−ベンゾイル−Ｎ，Ｎ’−ジ
イソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、Ｕ
の場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ
−ブチルジメチルシリル−ウリジン−Ｎ，Ｎ’−ジイソ
プロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、網掛け
のＡの場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシア
デノシン−Ｎ⁶−ベンゾイル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピ
ルアミノシアノエチルホスホアミダイト、網掛けのＧの
場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシグアノシ
ン−Ｎ²−イソブチリル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルア
ミノシアノエチルホスホアミダイト、網掛けのＣの場
合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシシチジン−
Ｎ⁴−ベンゾイル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノシ
アノエチルホスホアミダイトを用い、アミダイト試薬の
糖部分がデオキシリボースの場合は上述と同じ条件のも
の、リボースの場合は、アミダイト試薬のアセトニトリ
ル溶液（７７ｍｇ／ｍｌ）と４％（ｗ／ｖ）テトラゾー
ルのアセトニトリル溶液の１：１（容量比）混合液を用
い、１．５ｍｌ／ｍｉｎで１０秒間給液した後、１０分
間保持して反応させた。また、チオリン酸結合ではな
く、ホスファイト結合を形成させる場合は、手順（4）
の「１５％テトラエチルチウラムジサルファイドを含む
アセトニトリル溶液を１．６ｍｌ／ｍｉｎで２３秒間流
し、１５分間放置」する代わりに、「３％（ｗ／ｖ）ヨ
ウ素、２０％(ｖ／ｖ)ピリジン、及び２％（ｖ／ｖ）Ｈ
₂Ｏを含むテトラヒドロフラン溶液を１．６ml/minで２
５秒間流し、２０秒間放置」し、ホスファイト結合をホ
スフェート結合に酸化した。

【００２５】すべてのアミダイト試薬の反応を終えた
後、５'−水酸基の保護基を手順（1）と同様の方法で除
去し、３０％アンモニアとエタノールの３：１（容量
比）混合液を１８秒間流し、１５分間放置したのちカラ
ムから合成物を切り出した。この切り出しの操作は更に
３回繰り返した。次に合成物を、５５℃で８時間処理
し、核酸塩基及びリン酸基の保護基を外した。アンモニ
アとエタノールを減圧して除去後、適当量の水に溶解
し、波長２６０ｎｍの吸光度を測定した。水を減圧除去
した後、波長２６０ｎｍの吸光度が１０となるように１
Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドのテトラヒド
ロフラン溶液（以下ＴＢＡＦと略す）に溶解し、室温で
１２時間放置し、２'−水酸基の保護基を除去した。加
えたＴＢＡＦと同容量の０．１Ｍトリエチルアンモニウ
ム−酢酸緩衝液（以下ＴＥＡＡと略す）を加え、凍結乾
燥した。

【００２６】次に、凍結乾燥物をＯＰＣカラム（アプラ
イドバイオシステムズ社製）で精製した。すなわち、カ
ラムを先ず、５ｍｌのアセトニトリル、次いで５ｍｌの
２ＭのＴＥＡＡの順で洗浄し、これに予めＴＥＡＡ１ｍ
ｌで溶解した凍結乾燥物溶解液を１〜２滴／秒の速さで
流し、通過液を再び同様にカラムに流して目的物を吸着
させた。５ｍｌのＴＥＡＡ、続いて１０ｍｌの脱イオン
水の順でカラムを洗浄後、５０％（ｖ／ｖ）アセトニト
リル１．８ｍｌを１〜２滴／秒で流し、目的物を溶出し
た。

【００２７】溶出液は更にＦＰＬＣ（ファルマシア社
製）で精製した。すなわち、カラムはＰｅｐＲＰＣ Ｈ
Ｒ１０／１０、カラム温度は４０℃、流速は２ｍｌ／ｍ
ｉｎとし、移動相は初期濃度が１０％（ｖ／ｖ）のアセ
トニトリルを含むＴＥＡＡとして、カラムに溶出液を負
荷後、移動相中のアセトニトリル濃度を１時間かけて１
０％（ｖ／ｖ）から６０％（ｖ／ｖ）に直線的に増加さ
せ、目的物を溶出した。なお、目的物の溶出位置は２５
４ｎｍの吸光度を測定し、モニターした。

【００２８】実施例２ 次式（IV）で表される安定化リ
ボザイムの合成

【化６】 （式（IV）中、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、網掛けのＡ、網掛けの
Ｇ、網掛けのＣ、ｓ及び* は、式（Ｉ）と同じ意味を示
す。）

【００２９】実施例１と同様にして、ＤＮＡ／ＲＮＡ合
成装置（アプライドバイオシステムズ社製、３８０Ｂ
型）にｄＣ−ＣＰＧカラム（シトシン量：１μｍｏｌ）
を装着し、バージョン１．３４のプログラムを用いて、
式（IV）の安定化リボザイムを合成し、ＯＰＣカラム及
びＦＰＬＣにより精製した。

【００３０】実施例３ 次式（Ｖ）で表される安定化リ
ボザイムの合成

【化７】 （式（Ｖ）中、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、網掛けのＡ、網掛けの
Ｇ、網掛けのＣ、ｓ及び* は、式（Ｉ）と同じ意味を示
す。）

【００３１】実施例１と同様にして、ＤＮＡ／ＲＮＡ合
成装置（アプライドバイオシステムズ社製、３８０Ｂ
型）にｄＣ−ＣＰＧカラム（シトシン量：１μｍｏｌ）
を装着し、バージョン１．３４のプログラムを用いて、
式（Ｖ）の安定化リボザイムを合成し、ＯＰＣカラム及
びＦＰＬＣにより精製した。

【００３２】比較例 次式（VI）で表されるリボザイム
の合成

【化８】 （式（VI）中、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ及び* は、式（Ｉ）と同
じ意味を示す。）

【００３３】実施例１と同様にして、ＤＮＡ／ＲＮＡ合
成装置（アプライドバイオシステムズ社製、３８０Ｂ
型）にＣ−ＣＰＧカラム（シトシン量：１μｍｏｌ）を
装着し、バージョン１．３４のプログラムを用いて、式
（VI）の安定化リボザイムを合成し、ＯＰＣカラム及び
ＦＰＬＣにより精製した。

【００３４】試験例１ 安定化リボザイムの純度試験 実施例１、２及び３で合成した安定化リボザイム（式
（III）、（IV）及び（Ｖ）の化合物）、並びに比較の
ため合成したリボザイム（式（VI）の化合物）をそれぞ
れ０．３〜３．０μｇとり、それぞれに１０×カイネー
ションバッファー（１００ｍＭ 塩化マグネシウム及び
１００ｍＭ メルカプトエタノールを含む５００ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６）１．０μｌ、［γ
−³²Ｐ］ＡＴＰ（３７０メガベクレル／ｍｌで１８５テ
ラベクレル／ｍｍｏｌのものの５倍希釈液）０．５μ
ｌ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）０．５μ
ｌ及び精製水を加えて全量をそれぞれ１０μｌとし、３
７℃で３０分間反応させた。このようにして、５'−末
端をリン酸化して³²Ｐで標識した後、７０℃で１０分間
加熱処理して、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活さ
せた。これを２０％アクリルアミドゲル中、１８００ボ
ルトの電圧で約３時間電気泳動し、オートラジオグラフ
ィーで分析した（図２）。³²Ｐで標識した安定化リボザ
イム又は合成リボザイムは、いずれも核酸塩基配列から
計算される大きさと一致し、不純物をほとんど含まない
ことが分かった。

【００３５】試験例２ 安定化リボザイムの血清中での
安定性試験 実施例１、２及び３で合成した安定化リボザイム（式
（III）、（IV）及び（Ｖ）の化合物）、並びに比較の
ため合成したリボザイム（式（VI）の化合物）を各２．
４μｇとり、それぞれに１０×カイネーションバッファ
ー（１００ｍＭ塩化マグネシウム及び１００ｍＭ メル
カプトエタノールを含む５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液、ｐＨ７．６）６μｌ、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（３
７０メガベクレル／ｍｌで１８５テラベクレル／ｍｍｏ
ｌのものの５倍希釈液）３．０μｌ、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（宝酒造）１．０μｌ及び精製水を加え、
それぞれ全量を６０μｌとし、３７℃で３０分間反応さ
せた。このようにして、５’−末端をリン酸化して³²Ｐ
で標識した後、７０℃で１０分間加熱処理してＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを失活させた。この³²Ｐで標識し
た安定化リボザイム又は合成リボザイム溶液をそれぞれ
１０μｌとり、それぞれに反応停止液（９Ｍ尿素、５０
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％キシレンシアノール及び０．
１％ブロモフェノールブルーを含む）１０μｌを加え、
反応時間０のサンプルとした。残りの各安定化リボザイ
ム又はリボザイム溶液５０μｌに対し、精製水で１％の
濃度に希釈した牛血清５．５μｌを加えて３７℃に保温
した。保温開始後５分、１時間、３時間、６時間後にそ
れぞれ１０μｌずつをサンプリングシし、同量の反応停
止液に加え、分析するまで−８０℃に保存した。分析
時、これらのサンプルを室温で融解後、２０％ポリアク
リルアミドゲル中で電気泳動を行ない、イメージアナラ
イザを用いて分析した（図３）。

【００３６】その結果、合成リボザイムの分解（比較：
□印で示す。)は反応３時間後で約８０％、６時間後に
約９０％であるのに対し、本発明の式（III）の安定化
リボザイムの分解（△印で示す。)は、３時間後で約５
％、６時間後で約１０％であるに過ぎず、また、本発明
の式（IV）の安定化リボザイムの分解（▽印で示す。)
は、３時間後で約３５％、６時間後で約４０％で、いず
れの安定化リボザイムも牛血清に対してかなり安定であ
ることが分かった。

【００３７】試験例３ 安定化リボザイムの標的ＲＮＡ
切断活性 標的となるＲＮＡ（５’末端を³²Ｐ標識した５’−ＧＣ
ＣＧＵＣＣＣＣＣＧ−３’）１０μＭを基質とし、２５
ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）２０μｌ中、実施例１、２もしくは３で合成
した安定化リボザイム（式（III）、（IV）又は（Ｖ）
の化合物）又は比較のため合成したリボザイム（式（V
I）の化合物）を０．０５μＭの濃度で、３７℃で反応
させた。反応開始後、１０、２０、３０及び４０分後に
５μｌずつをサンプリングし、それぞれに反応停止液
（９Ｍ尿素、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％キシレンシ
アノール、及び０．１％ブロモフェノールブルーを含
む）５μｌを加えて、分析するまで−８０℃に保存し
た。分析時、これらのサンプルを室温で融解後、２０％
ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動を行ない、イメー
ジアナライザを用いて分析した（図４）。

【００３８】図４の結果から、本発明の式（III）又は
式（IV）で表される安定化リボザイム（図４中、△印又
は▽印で示す。）は、比較に用いたリボザイム（図４
中、□印で示す。）と同等もしくはそれよりもやや劣る
標的ＲＮＡ切断能を維持していることが分かる。

【００３９】

【発明の効果】本発明は、従来のリボザイムよりＲＮＡ
分解酵素等に対して抵抗性を有する、新規な安定化リボ
ザイムを提供する。また、本発明の安定化リボザイムは
配列特異的に標的ＲＮＡを切断し、不活化することがで
きるので、ＲＮＡが原因で起こる病気の治療用医薬、動
物薬あるいは農薬に広く応用される。更に、ＲＮＡを切
断する制限酵素として診断薬、生化学試薬等の試薬とし
ても応用できるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】リボザイムの２次構造と標的ＲＮＡの切断箇所
を示す模式図である。

【図２】本発明の安定化リボザイム（比較：合成リボザ
イム）のポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。

【図３】本発明の安定化リボザイム（比較：合成リボザ
イム）を牛血清とともに反応させたときの安定化リボザ
イムの経時変化を示すグラフである。

【図４】標的ＲＮＡに本発明の安定化リボザイム（比
較：合成リボザイム）を反応させたときの、標的ＲＮＡ
の経時変化を示すグラフである。

【符号の説明】

図２において、 III：式(III)の化合物 IV ：式(IV)の化合物 V ：式(V)の化合物 VI ：式(VI)の化合物 ↓ ：電気泳動方向 図３において、 △ ：式(III)の化合物 ▽ ：式(IV)の化合物 ○ ：式(V)の化合物 □ ：式(VI)の化合物 図４において、 △ ：式(III)の化合物を用いた場合 ▽ ：式(IV)の化合物を用いた場合 ○ ：式(V)の化合物を用いた場合 □ ：式(VI)の化合物を用いた場合

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＤＵ 8314−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/02 (72)発明者 多比良 和誠 茨城県つくば市東１丁目１番３号工業技術 院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 西川 諭 茨城県つくば市東１丁目１番３号工業技術 院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 前田 英勝 茨城県つくば市東１丁目１番３号工業技術 院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 嶋山 隆 東京都新宿区西新宿二丁目１番１号 日立 化成工業株式会社内 (72)発明者 井筒 浩 茨城県つくば市和台48番日立化成工業株式 会社筑波開発研究所内 (72)発明者 大川 淳 兵庫県神戸市西区室谷２丁目２番３号長瀬 産業株式会社内 (72)発明者 岡部 宗一 兵庫県神戸市西区室谷２丁目２番３号長瀬 産業株式会社内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】リボザイムの触媒領域以外の部分的な領域
   内で、構成するモノリボヌクレオチドの１又は２以上
   が、それに相当するモノデオキシリボヌクレオチドに置
   換されて成り、かつ、リボザイムの触媒領域を含む部分
   的な領域内で、リボザイムのリン酸エステル結合〔−Ｏ
   −Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−〕の１又は２以上が、チオ
   リン酸エステル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−
   又は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕である、安定化
   リボザイム。
2. 【請求項２】式（Ｉ）で表される安定化リボザイム。 【化１】 （式（Ｉ）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＵはそれぞれアデニン
   モノリボヌクレオチド、グアニンモノリボヌクレオチ
   ド、シトシンモノリボヌクレオチド、ウラシルモノリボ
   ヌクレオチドを表し、網掛けのＡ、網掛けのＧ及び網掛
   けのＣはそれぞれアデニンモノデオキシリボヌクレオチ
   ド、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド、シトシン
   モノデオキシリボヌクレオチドを表し、網掛けのＸはア
   デニンモノデオキシリボヌクレオチド、グアニンモノデ
   オキシリボヌクレオチド、シトシンモノデオキシリボヌ
   クレオチド、チミンモノデオキシリボヌクレオチドのい
   ずれか任意のモノデオキシリボヌクレオチドを表し、ｓ
   はチオリン酸エステル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）
   −Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕を表し、
   ｍ及びｎはそれぞれ異ってもよい１又は２以上の整数を
   表し、*は相補的なヌクレオチド間の塩基対を表す。）
3. 【請求項３】式（II）で表される安定化リボザイム。 【化２】 （式（II）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、網掛けのＡ、網掛けの
   Ｇ、網掛けのＣ、網掛けのＸ、ｓ、ｍ、ｎ及び* は式
   （Ｉ）と同じ意味を表す。）
4. 【請求項４】核酸塩基の活性基及び５'−水酸基が保護
   基で保護され、３'−水酸基は架橋構造を介して担体に
   結合しているモノデオキシリボヌクレオシド（固相）か
   ら、（ａ）５'−水酸基の保護基をはずしたのち、固相
   を洗浄し、（ｂ）核酸塩基の活性基並びに２'−及び５'
   −水酸基が保護基で保護されたリボヌクレオシド−３'
   −Ｏ−（β−シアノエチル）ホスホアミダイト又は核酸
   塩基の活性基並びに５'−水酸基が保護基で保護された
   デオキシリボヌクレオシド−３'−Ｏ−（β−シアノエ
   チル）ホスホアミダイトを反応させ、次いで固相を洗浄
   し、（ｃ）未反応の５'−水酸基をアセチル化したのち
   固相を洗浄する工程、及び酸化剤で酸化したのち固相を
   洗浄する工程を、任意の順序で行い、（ｄ）以下、
   （ａ）〜（ｃ）を繰り返し、（ｅ）固相をアルカリ処理
   して、３'−水酸基と担体のあいだの結合を切り、
   （ｆ）他の保護基をはずす、ことを特徴とする請求項１
   又は請求項２のいずれかに記載の安定化リボザイムの製
   造方法。
5. 【請求項５】酸化剤がヨウ素及び／又はテトラエチルチ
   ウラムジサルファイドを含むものである請求項３記載の
   製造方法。
6. 【請求項６】標的ＲＮＡを請求項１又は請求項２のいず
   れかに記載の安定化リボザイムと反応させることを特徴
   とする、標的ＲＮＡの切断又は不活化方法。
7. 【請求項７】請求項１又は請求項２のいずれかに記載の
   安定化リボザイムを有効成分とする医薬、動物薬、農薬
   又は試薬。