JP3240304B2 - 安定化リボザイム - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、安定化リボザイムに関
するものであり、更に詳しくは、標的ＲＮＡを特異的に
切断するリボザイムの機能は維持したまま、リボザイム
を人為的に改変して安定化分子もしくは構造としたもの
に関するものであり、これは医薬、動物薬、農薬あるい
は試薬等の分野で有効に利用されうるものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、すべての酵素はタンパク質から構
成されていると確信されていたが、１９８１年に酵素活
性を有するＲＮＡ分子、すなわちリボザイムが発見さ
れ、従来の酵素に関する概念は打ち破られた。この画期
的発見はコロラド大学のチェック（T. Chech）らによっ
てなされたもので、彼らは原生動物のテトラヒメナのリ
ボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）前駆体はタンパク質の力を
借りずに、遺伝情報を伝達する上で不必要なイントロン
（ＩＶＳ）をセルフスプライシングにより取り除くこと
を証明した（Cell ,Vol.31, p.147-157(1982);Nature ,
Vol.308, p.820-825(1984)) 。

【０００３】その後、ホスホジエステル結合をセルフス
プライシングする触媒機能を有するＲＮＡ分子が次々と
見出されているほか、他のＲＮＡ分子を切断するＲＮＡ
分子( リボザイム) も見つかっている。このような中
で、最近、ハセロフ（J. Haseloff ）とジャーラック
（W.L.Gerlach ）は、数種の植物ウイルスのリボザイム
の間で共通に保存されている塩基配列に着目し、触媒活
性部位がわずか２４塩基で構成された短鎖リボザイム
を、遺伝子操作技術及び酵素の手法を用いて構築するこ
とに成功した（Nature ,Vol.334,p.585-591(1988) ；特
表平3-502638号公報）。また、大塚らは非自己のＲＮＡ
分子の切断を触媒する活性な短鎖リボザイムを化学合成
で調製している（特開平２−１９５８８３号公報）。
図１は短鎖リボザイムの構造と作用部位を説明するもの
で、リボザイムは、標的であるＲＮＡ分子の塩基配列を
認識して塩基対を形成する結合部位Ｃと、２４個の特定
の塩基配列を有する領域Ｂ（触媒活性部位を含む）から
構成されており、標的ＲＮＡは標的ＲＮＡのＡ部分（Ｇ
ＵＣ）に隣接する位置（図１中、矢印で示す）で切断さ
れる。なお、このＡ部分の配列はＧＵＣのみでなく、他
の配列も可能である。

【０００４】リボザイムは、リボザイムの核酸塩基配列
に基づいてリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡを合成
し、これをプラスミドに挿入し、更にこの組換えプラス
ミドを形質転換して得られたクローンを適当な制限酵素
で切断してリボザイムＲＮＡをコードするＤＮＡ断片を
取得し、これを鋳型としてイン・ビトロ（in vitro）で
転写することにより、あるいは化学的合成法によってリ
ボヌクレオチドを順次連結することにより得られること
は前記の文献中に記載されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】自然界にはＲＮＡ分解
酵素が広く分布している。リボザイムはこのＲＮＡ分解
酵素によって容易に分解を受け失活するので、安定性に
問題がある。本発明は、特異的なＲＮＡ分解活性は維持
したままで、ＲＮＡ分解酵素の攻撃に対しては抵抗性を
有する安定な修飾リボザイム、すなわち安定化リボザイ
ムを提供し、医薬、動物薬、農薬あるいは試薬等の分野
に有効に利用することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
種々検討した結果、リボザイムを構成する分子もしくは
構造の非触媒領域内で、構成するモノリボヌクレオチド
の１又は２以上を、それに相当するモノデオキシリボヌ
クレオチドに置換するか、及び／又は、リボザイムのリ
ン酸エステル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−〕
の１又は２以上を、チオリン酸エステル結合〔−Ｏ−Ｐ
（＝Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）
−Ｏ−〕とするかにより、リボザイムはその特異的なＲ
ＮＡ分解活性は維持したままで、ＲＮＡ分解酵素の攻撃
に対して抵抗性を有する安定な修飾リボザイム、すなわ
ち安定化リボザイムとなることを見出し、本発明を完成
した。

【０００７】すなわち、本発明が提供する安定化リボザ
イムとしては、下記の（１）〜（１２）がある。 （１）リボザイムの部分的な領域内で、構成するモノリ
ボヌクレオチドの１又は２以上が、それに相当するモノ
デオキシリボヌクレオチドに置換されて成る、安定化リ
ボザイム。

【０００８】（２）リボザイムの部分的な領域内で、リ
ボザイムのリン酸エステル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ
Ｈ）−Ｏ−〕の１又は２以上が、チオリン酸エステル結
合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（＝
Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕である、安定化リボザイム。 （３）リボザイムの部分的な領域内で、構成するモノリ
ボヌクレオチドの１又は２以上が、それに相当するモノ
デオキシリボヌクレオチドに置換されて成り、かつ、上
記領域内で、リン酸エステル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）
（ＯＨ）−Ｏ−〕の１又は２以上が、チオリン酸エステ
ル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ
（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕である、安定化リボザイム。

【０００９】（４）リボザイムの部分的な領域がリボザ
イムの非触媒領域である、上記(１)ないし(３)のいずれ
かの安定化リボザイム。 （５）リボザイムが式（I)で表されるものである上記
(1)ないし(4)のいずれかの安定化リボザイム。

【００１０】

【化１７】

【００１１】（式（I)中、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＵはそれぞ
れアデニンモノリボヌクレオチド、グアニンモノリボヌ
クレオチド、シトシンモノリボヌクレオチド、ウラシル
モノリボヌクレオチドを表し、Ｂは０（（(Y)_P と(Y)_q
が分離した状態を意味する）、結合（(Y)_P と(Y)_q がリ
ン酸結合した状態を意味する）、又はモノリボヌクレオ
チドないしオリゴリボヌクレオチドを表し、Ｘは上記
Ａ，Ｇ，Ｃ及びＵのいずれか任意のモノリボヌクレオチ
ドを表し、Ｙは相補することのできる上記Ａ、Ｇ、Ｃ及
びＵのいずれか任意のモノリボヌクレオチドを表し、ｍ
及びｎはそれぞれ異ってもよい１以上の整数を表し、ｐ
及びｑは０以上の整数を表し、＊は相補的なリボヌクレ
オチド間の塩基対を表す。） （６）リボザイムが式(II)で表されるものである上記
(1)ないし(4)のいずれかの安定化リボザイム。

【００１２】

【化１８】

【００１３】（式(II)中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、ｍ、
ｎ、及び＊は式(I) と同じ意味を表す。） （７）リボザイムが式(III) で表されるものである上記
(1)ないし(4)のいずれかの安定化リボザイム。

【００１４】

【化１９】

【００１５】（式(III) 中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、Ｙ、
Ｂ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及び＊は式(I)と同じ意味を表し、
Ｄは結合（(Y)_r と(Y)_s がリン酸結合した状態を意味す
る）、又はモノリボヌクレオチドで乃至オリゴリボヌク
レオチドを表し、Ｅは０（(Y)_v と(Y)_w が分離した状態
を意味する）、結合（(Y)_v と(Y)_w がリン酸結合した状
態を意味する）、又はモノリボヌクレオチド乃至オリゴ
リボヌクレオチドを表し、ｌ、ｏ、ｒ、ｓ、ｖ及びｗは
それぞれ異なってもよい０以上の整数を表す。） （８）リボザイムが式(IV)で表されるものである上記
(1)ないし(4)のいずれかの安定化リボザイム。

【００１６】

【化２０】

【００１７】（式(IV)中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、Ｙ、
Ｂ、Ｄ、Ｅ、ｍ、ｎ、ｌ、ｏ、ｒ、ｓ、ｖ及びｗは及び
＊は式(III) と同じ意味を表す。） （９）式(V) で表される安定化リボザイム。

【００１８】

【化２１】

【００１９】（式(V) 中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、ｍ、ｎ
及び＊は式(I) と同じ意味を表し、下線付きのＸは上記
Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵのいずれか任意のモノリボヌクレオチ
ドの、それぞれに相当するモノデオキシリボヌクレオチ
ドを表す。） （１０）式(VI)で表される安定化リボザイム。

【００２０】

【化２２】

【００２１】（式(VI)中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、ｍ、ｎ
及び＊は式(I)と同じ意味を表し、下線付きのＡ、Ｇ、
Ｃ、及びＸはそれぞれアデニンモノリボヌクレオチド、
グアニンモノリボヌクレオチド、シトシンモノリボヌク
レオチド及びそれらいずれかの任意のモノリボヌクレオ
チドの、それぞれに相当するモノデオキシリボヌクレオ
チドを表す。） （１１）式(VII) で表される安定化リボザイム。

【００２２】

【化２３】

【００２３】（式(VII) 中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、ｍ、
ｎ及び＊は式(I) と同じ意味を表し、網かけのＡ、Ｇ、
Ｃ、及びＸはそれぞれアデニンモノリボヌクレオチド、
グアニンモノリボヌクレオチド、シトシンモノリボヌク
レオチド及び任意のモノリボヌクレオチドのリン酸エス
テル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−〕が、チオ
リン酸エステル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−
又は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕であるものを表
す。） （１２）式(VIII)で表される安定化リボザイム。

【００２４】

【化２４】

【００２５】（式(VIII)中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、ｍ、
ｎ及び＊は式(I)と同じ意味を表し、二重下線のＡ、
Ｇ、Ｃ、及びＸはそれぞれアデニンモノリボヌクレオチ
ド、グアニンモノリボヌクレオチド、シトシンモノリボ
ヌクレオチド及びそれらいずれか任意のモノリボヌクレ
オチドの、それぞれに相当するモノデオキシリボヌクレ
オチドであり、かつ、そのリン酸エステル結合〔−Ｏ−
Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−〕がチオリン酸エステル結合
〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（＝
Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕であるものを表す。） 本発明において、式（I)〜式(VIII)で表されるリボザイ
ム又は安定化リボザイムの３' 又は５' 末端の水酸基は
リン酸化されたものであっても、遊離のものであっても
どちらでもよい。

【００２６】本発明におけるリボザイムとしては、天然
のリボザイム、天然のリボザイム中の塩基対を形成する
結合部位Ｃ及び特定の塩基配列を有する領域から構築し
た短鎖リボザイム、更には短鎖リボザイムの３' 末端又
は３' 、５' 両末端がヘアピン構造をとるようにリボヌ
クレオチドが付加されたＲＮＡ分子等があるが、ＲＮＡ
分子の大きさは合成の容易さ、医薬等への応用を考慮す
るとできるだけ小さいほうがよい。 これらリボザイム
の更に具体的なものとしては、テトラヒメナのｒＲＮＡ
の自己切断部位から設計された（標的ＲＮＡを切断する
ことのできる）ＲＮＡ、アボガドサンブロッチウイロイ
ドＲＮＡやイモリのサテライトＤＮＡ由来ＲＮＡの自己
切断部位から設計された（標的ＲＮＡを切断することの
できる）ＲＮＡ、タバコリングスポットウイルスのサテ
ライトＲＮＡの自己切断部位から設計された（標的ＲＮ
Ａを切断することのできる）ＲＮＡ、デルタ肝炎ウイル
スのゲノムＲＮＡの自己切断部位から設計された（標的
ＲＮＡを切断することのできる）ＲＮＡ等を挙げること
ができる。

【００２７】リボザイムを構成するモノリボヌクレオチ
ドは通常、それぞれアデニン、シトシン、グアニン及び
ウラシルを塩基としてもつアデニンモノリボヌクレオチ
ド、シトシンモノリボヌクレオチド、グアニンモノリボ
ヌクレオチド及びウラシルモノリボヌクレオチドであ
る。本発明において、構成するモノリボヌクレオチドに
相当するモノデオキシリボヌクレオチドとは、アデニン
モノリボヌクレオチドに対しては２'−デオキシアデニ
ンモノリボヌクレオチドのことであり、シトシンモノリ
ボヌクレオチド対しては２'−デオキシシトシンモノリ
ボヌクレオチドのことであり、グアニンモノリボヌクレ
オチド対しては２' −デオキシグアニンモノリボヌクレ
オチドのことであり、ウラシルモノリボヌクレオチド対
しては２'−デオキシチミンモノリボヌクレオチド又は
２'−デオキシウラシルモノリボヌクレオチドのことで
ある。

【００２８】本発明において、リボザイムの部分的な領
域とは、リボザイム分子全体をさすのではなく、それを
構成するモノリボヌクレオチドの１又は２以上が連結し
たある部分の領域を指し、このような領域はリボザイム
内に１又は２か所以上存在する。リボザイムの構造はそ
の機能の面から、ＲＮＡ切断活性に直接関与する触媒部
位（図１においては、Ｂで表される領域の中の丸印で示
した部分）、標的ＲＮＡと相補的塩基対を形成する結合
部位（図１においては、Ｃで表される部位）及びその他
の領域（図１においては、Ｂで表される領域から触媒部
位を除いた部位）に分けられる。ＲＮＡ切断活性に直接
関与する触媒部位以外の標的ＲＮＡと相補的塩基対を形
成する結合部位及びその他の領域を、本発明ではリボザ
イムの非触媒領域という。

【００２９】本発明において、構成するモノリボヌクレ
オチドの１又は２以上が、それに相当するモノデオキシ
リボヌクレオチドに置換され、及び／又はリン酸エステ
ル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−〕の１又は２
以上が、チオリン酸エステル結合〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）
（ＯＨ）−Ｏ−もしくは−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ
−〕とされるリボザイムの領域は、上記でいう意味のリ
ボザイムの非触媒領域がよい。これらの置換又はチオリ
ン酸エステル化をリボザイムの触媒領域内で行わせる
と、標的ＲＮＡを切断する触媒活性が低下し、あるいは
失われる。

【００３０】また、チオリン酸エステル結合には、Ｒ型
及びＳ型の立体異性体が存在するが、いずれでもよく、
ＲＳ混合型であってもよい。本発明は下記（１３）〜
（１４）のとおり、安定化リボザイムの製造方法も提供
する。 （１３）核酸塩基の活性基並びに２'−及び５' −水酸
基は保護基で保護され、３' −水酸基は架橋構造を介し
て担体に結合しているモノリボヌクレオシド又は核酸塩
基の活性基並びに３'-及び５'-水酸基は保護基で保護さ
れ、２' −水酸基は架橋構造を介して担体に結合してい
るモノリボヌクレオシド或いはこれらの混合物、又は、
核酸塩基の活性基並びに５' −水酸基は保護され、３'
−水酸基は架橋構造を介して担体に結合しているモノデ
オキシリボヌクレオシド（固相）から、（ａ）５' −水
酸基の保護基をはずしたのち、固相を洗浄し、（ｂ）核
酸塩基の活性基並びに２' −及び５' −水酸基が保護基
で保護されたリボヌクレオシド−３' −Ｏ−（β−シア
ノエチル）ホスホアミダイト又は核酸塩基の活性基並び
に５' −水酸基が保護基で保護されたデオキシリボヌク
レオシド−３' −Ｏ−（β−シアノエチル）ホスホアミ
ダイトを反応させ、次いで固相を洗浄し、（ｃ）未反応
の５' −水酸基をアセチル化し、次いで固相を洗浄する
工程、及び酸化剤で酸化し、次いで固相を洗浄する工程
を任意の順序で行ない、（ｄ）以下、（ａ）〜（ｃ）を
繰り返し、（ｅ）固相をアルカリ処理して、２' −また
は３' −水酸基と担体のあいだの結合を切り、（ｆ）他
の保護基をはずす、ことを特徴とする上記（１）ないし
（１２）のいずれかの安定化リボザイムの製造方法。

【００３１】（１４）酸化剤がヨウ素および／またはテ
トラエチルチウラムジサルファイドを含むものである上
記（１３）の製造方法。本発明の製造方法は、いわゆる
固相化学合成法のうちの、ベータシアノエチルホスホア
ミダイト法に基礎を置くものであるが、メチルホスホア
ミダイトを用いた場合もチオフェノールによる処理を追
加するだけで同様な製造が可能である。

【００３２】核酸塩基の活性基としてはアミノ基があ
り、この保護基には例えば、ベンゾイル基、アニソイル
基、イソブチリル基等がある。固相から５' −水酸基の
保護基をはずすには、トリクロル酢酸又はジクロロ酢酸
のジクロロメタン溶液等を用いることができる。２' −
水酸基の保護基には例えば、ｔ−ブチルジメチルシリル
基等があり、また５' −水酸基の保護基には例えば、ジ
メトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基、トリチ
ル基等がある。

【００３３】未反応の５' −水酸基のアセチル化は１−
メチルイミダゾールもしくはジメチルアミノピリジンを
含む無水酢酸等によって、行うことができる。固相の洗
浄は、通常、アセトニトリルを用いて行う。酸化剤とし
ては、リン酸エステル結合を生成させるときは、ヨウ
素、水、ピリジン及びテトラヒドロフラン含有液等を用
い、チオリン酸エステル結合を生成させるときは、テト
ラエチルチウラムジサルファイド等を用いる。

【００３４】固相から目的の安定化リボザイムを切り出
すにはアルカリ溶液、例えば１５〜３０％アンモニア等
が用いられる。このようにして合成した安定化リボザイ
ムは、逆相、イオン交換等のカラムクロマトグラフィ
ー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル
電気泳動等の通常、核酸の精製によく用いられる方法の
一つ、又はそれらの組合せにより精製する。

【００３５】更に、本発明は下記（１５）及び（１６）
のとおり、安定化リボザイムの使用方法あるいは用途を
提供する。 （１５）標的ＲＮＡを上記（１）ないし（１２）のいず
れかの安定化リボザイムと反応させることを特徴とす
る、標的ＲＮＡの切断又は不活化方法。 （１６）上記（１）ないし（１２）のいずれかの安定化
リボザイム或いはその混合物を有効成分とする医薬、動
物薬、農薬又は試薬。

【００３６】標的ＲＮＡとしては、種々病原性のウィル
ス由来のＲＮＡ、ガン遺伝子由来のＲＮＡ、細胞の増殖
・分化に関係する遺伝子由来のＲＮＡ等がある。切断又
は不活化の反応の条件は５〜500 ｍＭのマグネシウム又
はマンガンイオンの存在下、ｐＨ８．０±３．０、温度
２０〜７０℃で行う。医薬としては例えば、エイズ、白
血病、各種悪性腫瘍、流行性結膜炎等の治療用医薬があ
る。

【００３７】動物薬としては例えば、牛、豚、ニワト
リ、イヌ、ネコ等の各種ウィルス病の治療用動物薬があ
る。農薬としては例えば、タバコモザイク病、イネ萎縮
病、キュウリモザイク病等の各種植物ウィルス病に対す
る農薬等がある。試薬としては例えば、ＲＮＡ分析用や
ＲＮＡプロセシシング用等の研究用生化学試薬や診断薬
等がある。

【００３８】

【実施例】以下実施例により、本発明を詳細に説明す
る。 実施例１ 式(IX)で表される安定化リボザイムの合成

【００３９】

【化２５】

【００４０】（式(IX)中、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ及び＊は式
(V) と同じ意味を示し、下線付きのＧはデオキシグアニ
ンモノリボヌクレオチド、下線付きのＣはデオキシシト
シンモノリボヌクレオチドを示す） ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（アプライドバイオシステムズ
社製、３８０Ｂ型）にｄＣ−ＣＰＧカラム（シトシン量
１μｍｏｌ）を装着したのち、バージョン１．３４の
プログラムを用いてベータシアノエチルホスホアミダイ
ト法で式(IX)の安定化リボザイムを合成した。

【００４１】合成工程は次の(1) 〜(5) のとおりであ
る。(1) ２％（ｗ／ｖ) トリクロル酢酸のジクロルメタ
ン溶液を１．６ ｍｌ／ｍｉｎで５０秒間カラムに流し
て、５' 水酸基のジメトキシトリチル基をはずし、(2)
アセトニトリルでカラムを洗浄したのち、５' −Ｏ−ジ
メトキシトリチルデオキシグアノシン−Ｎ²−イソブチ
ル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノエチルホスホアミダ
イトのアセトニトリル溶液（７７ｍｇ／ｍｌ）及び４％
（ｗ／ｖ) テトラゾールのアセトニトリル溶液の１：１
（容量比）混合液を１．５ｍｌ／ｍｉｎで１０秒間給液
したのち、３０秒間保持して、縮合反応を起こさせてホ
スファイト結合を形成させ、(3)アセトニトリルでカラ
ムを洗浄後、１０％（ｖ／ｖ）無水酢酸及び１０％（ｖ
／ｖ）２，６−ルチジンを含むテトラヒドロフラン溶液
と１６％（ｖ／ｖ）１−メチルイミダゾールを含むテト
ラヒドロフラン溶液の１：１（容量比）混合液を１．５
ｍｌ／ｍｉｎで２０秒間流し、未反応の５' 水酸基をア
セチル化し、(4) アセトニトリルで洗浄後、３％（ｗ／
ｖ) ヨウ素、２０％（ｖ／ｖ) ピリジン、及び２％（ｖ
／ｖ) Ｈ₂Ｏを含むテトラヒドロフラン溶液を１．６
ｍｌ／ｍｉｎで２５秒間流した後２０秒間放置しホスフ
ァイト結合をホスフェート結合に酸化したのち、アセト
ニトリルで洗浄し、(5) 上記の(1) 〜(4) の工程を、式
(IX)に示した３' 側からの３番目以降の核酸塩基配列に
従って繰り返す。

【００４２】ここで、工程(2) のアミダイト試薬は、Ａ
の場合、５' −Ｏ−ジメトキシトリチル−２' −Ｏ− t
−ブチルジメチルシリル−アデノシン−Ｎ⁶−ベンゾイ
ル−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルアミノシアノエチルホス
ホアミダイト、Ｇの場合、５'−Ｏ−ジメトキシトリチ
ル２' −Ｏ− t−ブチルジメチルシリル−グアノシン−
Ｎ²−イソブチリル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノシ
アノエチルホスホアミダイト、Ｃの場合、５' −Ｏ−ジ
メトキシトリチル−２' −Ｏ− t−ブチルジメチルシリ
ル−シチジン−Ｎ⁴−ベンゾイル−Ｎ，Ｎ' −ジイソプ
ロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、Ｕの場
合、５' −Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−Ｏ− t−ブ
チルジメチルシリル−ウリジン−Ｎ，Ｎ'-ジイソプロピ
ルアミノシアノエチルホスホアミダイト、下線付きＧの
場合、５' −Ｏ−ジメトキシトリチルデオキシグアノシ
ン−Ｎ²−イソブチル−Ｎ，Ｎ' −ジイソプロピルアミ
ノシアノエチルホスホアミダイト、下線付きＣの場合、
５' −Ｏ−ジメトキシトリチル−シチジン−Ｎ⁴−ベン
ゾイル−Ｎ，Ｎ' −ジイソプロピルアミノシアノエチル
ホスホアミダイトを用い、アミダイト試薬の糖部分がデ
オキシリボースの場合は上述と同じ条件のもの、リボー
スの場合は、アミダイト試薬のアセトニトリル溶液( ７
７ｍｇ／ｍｌ) と４％（ｗ／ｖ) テトラゾールのアセト
ニトリル溶液の１：１（容量比）混合液を用い、１．５
ｍｌ／ｍｉｎで１０秒間給液したのち、１０分間保持し
て反応させた。

【００４３】全てのアミダイト試薬の反応を終えた後、
５’水酸基の保護基を工程(1) と同様の方法で除去し、
３０％アンモニアとエタノールの３：１（容量比）混合
液を１８秒間流し、つづいて１５分間放置してカラムか
ら合成物を切り出し、この切り出す操作を更に３回繰り
返した。この合成物を、５５℃で８時間処理し、核酸塩
基とリン酸基の保護基をはずした．アンモニアとエタノ
ールを減圧して除去したのち、適当量の水に溶解し、波
長２６０ｎｍの吸光度を測定した。水を減圧除去したの
ち、波長２６０ｎｍの吸光度が１０となるように１Ｍテ
トラブチルアンモニウムフルオライドのテトラヒドロフ
ラン溶液（以下ＴＢＡＦと略す）に溶解し、室温で１２
時間放置し２’水酸基の保護基を除去した。次に、加え
たＴＢＡＦと同量の０．１Ｍトリエチルアンモニウム−
酢酸緩衝液（以下ＴＥＡＡと略す）を加えた後、凍結乾
燥した。

【００４４】凍結乾燥物にＴＥＡＡを１ｍｌ加えて溶解
し、ＯＰＣカラムで精製した。すなわち、まず、５ｍｌ
のアセトニトリル、次いで５ｍｌの２ＭのＴＥＡＡの順
でカラムを洗浄し、これに凍結乾燥物溶解液を１〜２滴
／秒で流し、通過液を再び同様にカラムに流して目的物
を吸着させた。５ｍｌのＴＥＡＡ、つづいて１０ｍｌの
脱イオン水の順でカラムを洗浄した。その後、５０％ア
セトニトリル１．８ｍｌを１〜２滴／秒で流し、目的物
を溶出した。

【００４５】溶出液は更にＦＰＬＣ（ファルマシア社
製）で精製した。カラムは、ＰｅｐＲＰＣ ＨＲ１０／
１０を用い、カラム温度４０℃、流速２ｍｌ／ｍｉｎで
１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含むＴＥＡＡを移動
相として用いた。粗精製物をカラムに負荷した後、移動
相中のアセトニトリル濃度を１時間かけて１０％（ｖ／
ｖ）から６０％（ｖ／ｖ）に直線的に増加させることに
よって目的物を溶出した。なお、溶出液は２５４ｎｍの
吸光度を測定して目的物の溶出位置をモニターした。

【００４６】実施例２ 式(X) で表される安定化リボザ
イムの合成

【００４７】

【化２６】

【００４８】（式(X) 中、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、下線付きの
Ａ、Ｇ、Ｃ及び＊は式(VI)と同じ意味を示す。） 核酸
塩基配列に従い、実施例１と同様の方法で式(X) で表さ
れる安定化リボザイムの合成及び精製を行った。 実施例３ 式(XI)で表される安定化リボザイムの合成

【００４９】

【化２７】

【００５０】（式(XI)中、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、網かけＡ、
Ｇ、Ｃ及び＊は式(VII) と同じ意味を示す。） 核酸塩基配列に従い、実施例１もしくは２と同様の方法
で式(XI)で表される安定化リボザイムの合成及び精製を
行った。ただし、チオリン酸結合を形成させる反応を行
う場合には、(4) の工程においては、３％（ｗ／ｖ）ヨ
ウ素、２０％（ｖ／ｖ）ピリジン、及び２％（ｖ／ｖ）
Ｈ Ｏを含むテトラヒドロフラン溶液を１．６ ｍｌ／
ｍｉｎで２５秒間流す代わりに、１５％テトラエチルチ
ウラムジサルファイドを含むアセトニトリル溶液を１．
６ ｍｌ／ｍｉｎで２３分間流した後１５分間放置し
た。

【００５１】実施例４ 式(XII) で表される安定化リボ
ザイムの合成

【００５２】

【化２８】

【００５３】（式(XII) 中、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、２重下線
のＡ、Ｇ、Ｃ及び＊は式(VIII)と同じ意味を示す。） 核酸塩基配列に従い、実施例１もしくは２と同様の方法
で式(XII) で表される安定化リボザイムの合成及び精製
を行った。ただし、チオリン酸結合を形成させる反応を
行う場合には、(4) の工程においては、３％（ｗ／ｖ）
ヨウ素、２０％（ｖ／ｖ）ピリジン、及び２０％（ｖ／
ｖ）Ｈ Ｏを含むテトラヒドロフラン溶液を１．６ ｍ
ｌ／ｍｉｎで２５秒間流す代わりに、１５％テトラエチ
ルチウラムジサルファイドを含むアセトニトリル溶液を
１．６ ｍｌ／ｍｉｎで２３秒間流した後１５分間放置
した。

【００５４】比較例１ 式(XIII)で表されるリボザイム
の合成

【００５５】

【化２９】

【００５６】式（XIII) 中、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、及び＊は
式(I)と同じ意味を示す。） 核酸塩基配列に従い、実施例１と同様の方法で式(XIII)
で表されるリボザイムの合成及び精製を行った。 試験例１ 安定化リボザイムの純度試験 実施例１〜４で得られた安定化リボザイム( 式IX〜XII
の化合物）及び比較のためのリボザイム（式XIIIの化合
物）各０．３〜３．０μｇをとり、それぞれに１０×カ
イネーションバッファー（１００ｍＭ 塩化マグネシウ
ム及び１００ｍＭメルカプトエタノールを含む５００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６、）１μｌ、
［γ− Ｐ］ＡＴＰ（３７０メガベクレル／ｍｌで１８
５テラベクレル／ｍｍｏｌのものを５倍に希釈した）
０．５μｌ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）
０．５μｌを加え、精製水を加えて全量を１０μｌとし
た後、３７℃で３０分間反応させ、５’末端を Ｐでリ
ン酸化して標識した後、７０℃で１０分間加熱処理し、
Ｔ ポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。これを２
０％アクリルアミドゲル中、１８００ボルトの電圧で約
３時間電気泳動し、オートラジオグラフィーで分析した
（図２）。³²Ｐで標識された目的物( 式IX〜XIIの化合
物）及び比較のためのリボザイム（式XIIIの化合物）
は、いずれも核酸塩基配列から計算される大きさと一致
し、不純物をほとんど含んでいなかった。

【００５７】試験例２ 安定化リボザイムの血清中での
安定性試験 実施例１〜４で得られた安定化リボザイム( 式IX〜XII
の化合物）及び比較のためのリボザイム（式XIIIの化合
物）各１．８μｇをとり、それぞれに１０×カイネーシ
ョンバッファー（１００ｍＭ 塩化マグネシウム及び１
００ｍＭメルカプトエタノール５００ｍＭを含むＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６）６μｌ、［γ− Ｐ］
ＡＴＰ（３７０メガベクレル／ｍｌで１８５テラベクレ
ル／ｍｍｏｌのものを５倍希釈）３μｌ、Ｔ ポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造）１μｌを加え、精製水を加
えて全量を６０μｌとした後、３７℃で３０分間反応さ
せ、５’末端を Ｐで標識した後、７０℃で１０分間加
熱処理し、Ｔ ポリヌクレオチドキナーゼを失活させ
た。この各リボザイム溶液の１０μｌをとり、１０μｌ
のストップ溶液（９Ｍ 尿素、５０％シュクロース、５
０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％キシレンシアノール及び
０．１％ブロモフェノールブルーを含む）に加え、時間
０のサンプルとした。残りの各リボザイム溶液５０μｌ
に、１００倍希釈した牛血清を５．５μｌ加えて３７℃
に保温した。この後、５分、３０分、１時間、３時間、
６時間目にそれぞれ１０μｌずつをサンプリングして１
０μｌのストップ溶液に加え、−８０℃に保存した。こ
れらのサンプルは、２０％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行い、オートラジオグラフィーで分析した（図
３、図４及び図５）。

【００５８】図３、図４及び図５の結果から、比較のた
めに用いたリボザイム（式XIIIの化合物）は、反応開始
後３時間でほとんど全てが分解していたが、本発明の安
定化リボザイム（式IX〜XIIの化合物）はいずれも３時
間後では部分的に分解されるのみであり、６時間後でも
式XI〜XII 化合物の安定化リボザイムは完全には分解さ
れず、安定であることがわかる。

【００５９】試験例３ 安定化リボザイムの標的ＲＮＡ
の切断活性 実施例１〜４で得られた安定化リボザイム( 式IX〜XII
の化合物）及び比較のためのリボザイム（式XIIIの化合
物）各２ｐｍｏｌをとり、それぞれに１００ｍＭ 塩化
マグネシウム溶液１０μｌ及び２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ( ｐＨ８．０) 緩衝液１０μｌを加え、精製水を
加えて全量で３６μｌとした。予め調製しておいた、
５’末端を Ｐで標識したＲＮＡ基質（５' −ＧＣＣＧ
ＵＣＣＣＣＣＧ−３' ）の８００ｐｍｏｌ溶液４μｌを
加えて３７℃で反応を開始した。この後、０分、１０
分、２０分、４０分、８０分後にそれぞれ１０μｌずつ
をサンプリングして、１０μｌのストップ溶液に加え、
−８０℃に保存した。

【００６０】これらの保存サンプルを２０％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけ、オートラジオグラフィー
で分析した（図６、図７及び図８）。図６、図７及び図
８の結果から、本発明の安定化リボザイム（式IX〜XII
の化合物）は、比較に用いたリボザイム（式XIIIの化合
物）と同様に、標的ＲＮＡを切断する活性をもつことが
わかる。

【００６１】なお、本明細書において濃度を表す％は、
断らない限り重量％のことである。

【００６２】

【発明の効果】本発明は、従来のリボザイムよりＲＮＡ
分解酵素等に対して抵抗性を有する、新規な安定化リボ
ザイムを提供する。また、本発明の安定化リボザイムは
配列特異的に標的ＲＮＡを切断し、不活化することがで
きるので、ＲＮＡが原因で起こる病気の治療用医薬、動
物薬あるいは農薬に広く応用される。更に、ＲＮＡを切
断する制限酵素として、診断薬、生化学試薬等の試薬と
しても応用できるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 リボザイムの２次構造と標的ＲＮＡの切断箇
所を示す模式図である。

【図２】 本発明の安定化リボザイムの純度を示すポリ
アクリルアミドゲル電気泳動図である。

【図３】 本発明の安定化リボザイム（式IX及びXの化
合物）と血清を反応させたときの安定化リボザイムの経
時変化をみたポリアクリルアミドゲル電気泳動図であ
る。

【図４】 本発明の安定化リボザイム（式XI及びXIIの
化合物）と血清を反応させたときの安定化リボザイムの
経時変化をみたポリアクリルアミドゲル電気泳動図であ
る。

【図５】 リボザイム（式XIIIの化合物）と血清を反応
させたときのリボザイムの経時変化をみたポリアクリル
アミドゲル電気泳動図（比較実験）である。

【図６】 本発明の安定化リボザイム（式IX及びXの化
合物）と標的ＲＮＡを反応させたときの、標的ＲＮＡの
経時変化をみたポリアクリルアミドゲル電気泳動図であ
る。

【図７】 本発明の安定化リボザイム（式XI及びXIIの
化合物）と標的ＲＮＡを反応させたときの、標的ＲＮＡ
の経時変化をみたポリアクリルアミドゲル電気泳動図で
ある。

【図８】 リボザイム（式XIIIの化合物）と標的ＲＮＡ
を反応させたときの、標的ＲＮＡの経時変化をみたポリ
アクリルアミドゲル電気泳動図（比較実験）である。

【符号の説明】

IX：式IXの化合物 X：式Xの化合物 X
I：式XIの化合物 XII：式XIIの化合物 XIII：式XIIIの化合物 Ｖ ａ：反応前 ｂ：反応後５分
ｃ：反応後３０分 ｄ：反応後１時間 ｅ：反応後３時間 ０：反応後０分 １０：反応後１０分 ２
０：反応後２０分 ４０：反応後４０分 ６０：反応後６０分 ８
０：反応後８０分 ↓：電気泳動方向 →：１１塩基長さのＲＮＡの
電気泳動位置

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 西川 諭 茨城県つくば市東１丁目１番３号 工業 技術院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 湯山 則子 茨城県つくば市東１丁目１番３号 工業 技術院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 中川 香央理 茨城県つくば市東１丁目１番３号 工業 技術院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 西川 富美子 茨城県つくば市東１丁目１番３号 工業 技術院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 前田 英勝 茨城県つくば市東１丁目１番３号 工業 技術院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 井筒 浩 茨城県つくば市和台48番 日立化成工業 株式会社 筑波開発研究所内 (72)発明者 嶋山 隆 東京都新宿区西新宿二丁目１番１号 日 立化成工業株式会社内 (72)発明者 大川 淳 兵庫県神戸市西区室谷２丁目２番３号 長瀬産業株式会社内 (72)発明者 岡部 宗一 兵庫県神戸市西区室谷２丁目２番３号 長瀬産業株式会社内 審査官 上條 肇 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 C12N 9/16 - 9/22 C12N 15/09 - 15/11 C12N 15/55 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (17)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ）ないし（IV）のいずれかで表さ
   れるリボザイムの部分的な領域内で、構成するモノリボ
   ヌクレオチドの１又は２以上が、それに相当するモノデ
   オキシリボヌクレオチドに置換されて成る、安定化リボ
   ザイム。 【化１】 （式（Ｉ）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＵはそれぞれアデニン
   モノリボヌクレオチド、グアニンモノリボヌクレオチ
   ド、シトシンモノリボヌクレオチド、ウラシルモノリボ
   ヌクレオチドを表し、Ｂは０((Y)pと(Y)qが分離した状
   態を意味する)、結合((Y)pと(Y)qがリン酸結合した状態
   を意味する)、又はモノリボヌクレオチドないしオリゴ
   リボヌクレオチドを表し、Ｘは上記Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵの
   いずれか任意のモノリボヌクレオチドを表し、Ｙは相補
   することのできる上記Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵのいずれか任意
   のモノリボヌクレオチドを表し、ｍ及びｎはそれぞれ異
   ってもよい１以上の整数を表し、ｐ及びｑは０以上の整
   数を表し、＊は相補的なリボヌクレオチド間の塩基対を
   表す。） 【化２】 （式（II）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、ｍ、ｎ、及び＊は
   式（Ｉ）と同じ意味を表す。） 【化３】 （式（III）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、Ｙ、Ｂ、ｍ、
   ｎ、ｐ、ｑ及び＊は式（Ｉ）と同じ意味を表し、Ｄは結
   合((Y)rと(Y)sがリン酸結合した状態を意味する)、又は
   モノリボヌクレオチド乃至オリゴリボヌクレオチドを表
   し、Ｅは０((Y)vと(Y)wが分離した状態を意味する)、結
   合((Y)vと(Y)wがリン酸結合した状態を意味する)、又は
   モノリボヌクレオチド乃至オリゴリボヌクレオチドを表
   し、ｌ、ｏ、ｒ、ｓ、ｖ及びｗはそれぞれ異なってもよ
   い０以上の整数を表す。） 【化４】 （式（IV）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、Ｙ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、
   ｍ、ｎ、ｌ、ｏ、ｒ、ｓ、ｖ、ｗ及び＊は式（III）と
   同じ意味を表す。）
2. 【請求項２】 式（Ｉ）ないし（IV）のいずれかで表さ
   れるリボザイムの部分的な領域内で、リボザイムのリン
   酸エステル結合〔-Ｏ-Ｐ(=Ｏ)(ＯＨ)-Ｏ-〕の１又は２
   以上が、チオリン酸エステル結合〔-Ｏ-Ｐ(=Ｓ)(ＯＨ)-
   Ｏ-又は-Ｏ-Ｐ(=Ｏ)(ＳＨ)-Ｏ-〕である、安定化リボザ
   イム。 【化５】 （式（Ｉ）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＵはそれぞれアデニン
   モノリボヌクレオチド、グアニンモノリボヌクレオチ
   ド、シトシンモノリボヌクレオチド、ウラシルモノリボ
   ヌクレオチドを表し、Ｂは０((Y)pと(Y)qが分離した状
   態を意味する)、結合((Y)pと(Y)qがリン酸結合した状態
   を意味する)、又はモノリボヌクレオチドないしオリゴ
   リボヌクレオチドを表し、Ｘは上記Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵの
   いずれか任意のモノリボヌクレオチドを表し、Ｙは相補
   することのできる上記Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵのいずれか任意
   のモノリボヌクレオチドを表し、ｍ及びｎはそれぞれ異
   ってもよい１以上の整数を表し、ｐ及びｑは０以上の整
   数を表し、＊は相補的なリボヌクレオチド間の塩基対を
   表す。） 【化６】 （式（II）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、ｍ、ｎ、及び＊は
   式（Ｉ）と同じ意味を表す。） 【化７】 （式（III）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、Ｙ、Ｂ、ｍ、
   ｎ、ｐ、ｑ及び＊は式（Ｉ）と同じ意味を表し、Ｄは結
   合((Y)rと(Y)sがリン酸結合した状態を意味する)、又は
   モノリボヌクレオチド乃至オリゴリボヌクレオチドを表
   し、Ｅは０((Y)vと(Y)wが分離した状態を意味する)、結
   合((Y)vと(Y)wがリン酸結合した状態を意味する)、又は
   モノリボヌクレオチド乃至オリゴリボヌクレオチドを表
   し、ｌ、ｏ、ｒ、ｓ、ｖ及びｗはそれぞれ異なってもよ
   い０以上の整数を表す。） 【化８】 （式（IV）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、Ｙ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、
   ｍ、ｎ、ｌ、ｏ、ｒ、ｓ、ｖ、ｗ及び＊は式（III）と
   同じ意味を表す。）
3. 【請求項３】 式（Ｉ）ないし（IV）のいずれかで表さ
   れるリボザイムの部分的な領域内で、構成するモノリボ
   ヌクレオチドの１又は２以上が、それに相当するモノデ
   オキシリボヌクレオチドに置換されて成り、かつ、上記
   領域内で、リン酸エステル結合〔-Ｏ-Ｐ(=Ｏ)(ＯＨ)-Ｏ
   -〕の１又は２以上が、チオリン酸エステル結合〔-Ｏ-
   Ｐ(=Ｓ)(ＯＨ)-Ｏ-又は-Ｏ-Ｐ(=Ｏ)(ＳＨ)-Ｏ-〕であ
   る、安定化リボザイム。 【化９】 （式（Ｉ）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＵはそれぞれアデニン
   モノリボヌクレオチド、グアニンモノリボヌクレオチ
   ド、シトシンモノリボヌクレオチド、ウラシルモノリボ
   ヌクレオチドを表し、Ｂは０((Y)pと(Y)qが分離した状
   態を意味する)、結合((Y)pと(Y)qがリン酸結合した状態
   を意味する)、又はモノリボヌクレオチドないしオリゴ
   リボヌクレオチドを表し、Ｘは上記Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵの
   いずれか任意のモノリボヌクレオチドを表し、Ｙは相補
   することのできる上記Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵのいずれか任意
   のモノリボヌクレオチドを表し、ｍ及びｎはそれぞれ異
   ってもよい１以上の整数を表し、ｐ及びｑは０以上の整
   数を表し、＊は相補的なリボヌクレオチド間の塩基対を
   表す。） 【化１０】 （式（II）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、ｍ、ｎ、及び＊は
   式（Ｉ）と同じ意味を表す。） 【化１１】 （式（III）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、Ｙ、Ｂ、ｍ、
   ｎ、ｐ、ｑ及び＊は式（Ｉ）と同じ意味を表し、Ｄは結
   合((Y)rと(Y)sがリン酸結合した状態を意味する)、又は
   モノリボヌクレオチド乃至オリゴリボヌクレオチドを表
   し、Ｅは０((Y)vと(Y)wが分離した状態を意味する)、結
   合((Y)vと(Y)wがリン酸結合した状態を意味する)、又は
   モノリボヌクレオチド乃至オリゴリボヌクレオチドを表
   し、ｌ、ｏ、ｒ、ｓ、ｖ及びｗはそれぞれ異なってもよ
   い０以上の整数を表す。） 【化１２】 （式（IV）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、Ｙ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、
   ｍ、ｎ、ｌ、ｏ、ｒ、ｓ、ｖ、ｗ及び＊は式（III）と
   同じ意味を表す。）
4. 【請求項４】 リボザイムの部分的な領域がリボザイム
   の非触媒領域である、請求項１ないし３のいずれか１項
   に記載の安定化リボザイム。
5. 【請求項５】 式（Ｖ）で表される安定化リボザイム。 【化１３】 （式（Ｖ）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、ｍ、ｎ及び＊は式
   （Ｉ）と同じ意味を表し、下線付きＸは上記Ａ、Ｇ、Ｃ
   及びＵのいずれか任意のモノリボヌクレオチドの、それ
   ぞれに相当するモノデオキシリボヌクレオチドを表
   す。）
6. 【請求項６】 式（VI）で表される安定化リボザイム。 【化１４】 （式（VI）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、ｍ、ｎ及び＊は式
   （Ｉ）と同じ意味を表し、下線付きのＡ、Ｇ、Ｃ、及び
   Ｘはそれぞれアデニンモノリボヌクレオチド、グアニン
   モノリボヌクレオチド、シトシンモノリボヌクレオチド
   及びそれらいずれか任意のモノリボヌクレオチドの、そ
   れぞれに相当するモノデオキシリボヌクレオチドを表
   す。）
7. 【請求項７】 式（VII）で表される安定化リボザイ
   ム。 【化１５】 （式（VII）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、ｍ、ｎ及び＊は
   式（Ｉ）と同じ意味を表し、網かけのＡ、Ｇ、Ｃ、及び
   Ｘはそれぞれアデニンモノリボヌクレオチド、グアニン
   モノリボヌクレオチド、シトシンモノリボヌクレオチド
   及び任意のモノリボヌクレオチドのリン酸エステル結合
   〔-Ｏ-Ｐ(=Ｏ)(ＯＨ)-Ｏ-〕が、チオリン酸エステル結
   合〔-Ｏ-Ｐ(=Ｓ)(ＯＨ)-Ｏ-又は-Ｏ-Ｐ(=Ｏ)(ＳＨ)-Ｏ
   -〕であるものを表す。）
8. 【請求項８】 式（VIII）で表される安定化リボザイ
   ム。 【化１６】 （式（VIII）中、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、Ｘ、ｍ、ｎ及び＊は
   式（Ｉ）と同じ意味を表し、二重下線のＡ、Ｇ、Ｃ、及
   びＸはそれぞれアデニンモノリボヌクレオチド、グアニ
   ンモノリボヌクレオチド、シトシンモノリボヌクレオチ
   ド及びそれらいずれか任意のモノリボヌクレオチドの、
   それぞれに相当するモノデオキシリボヌクレオチドであ
   り、かつ、そのリン酸エステル結合〔-Ｏ-Ｐ(=Ｏ)(Ｏ
   Ｈ)-Ｏ-〕がチオリン酸エステル結合〔-Ｏ-Ｐ(=Ｓ)(Ｏ
   Ｈ)-Ｏ-又は-Ｏ-Ｐ(=Ｏ)(ＳＨ)-Ｏ-〕であるものを表
   す。）
9. 【請求項９】 リボザイムの部分的な領域内の、構成す
   るモノリボヌクレオチドの１又は２以上を、それに相当
   するモノデオキシリボヌクレオチドに置換することを特
   徴とする、安定化リボザイムの製造方法。
10. 【請求項１０】 リボザイムの部分的な領域内の、リン
    酸エステル結合〔-Ｏ-Ｐ(=Ｏ)(ＯＨ)-Ｏ-〕の１又は２
    以上を、チオリン酸エステル結合〔-Ｏ-Ｐ(=Ｓ)(ＯＨ)-
    Ｏ-又は-Ｏ-Ｐ(=Ｏ)(ＳＨ)-Ｏ-〕とすることを特徴とす
    る、安定化リボザイムの製造方法。
11. 【請求項１１】 リボザイムの部分的な領域内の、構成
    するモノリボヌクレオチドの１又は２以上を、それに相
    当するモノデオキシリボヌクレオチドに置換し、かつ、
    上記領域内の、リン酸エステル結合〔-Ｏ-Ｐ(=Ｏ)(Ｏ
    Ｈ)-Ｏ-〕の１又は２以上を、チオリン酸エステル結合
    〔-Ｏ-Ｐ(=Ｓ)(ＯＨ)-Ｏ-又は-Ｏ-Ｐ(=Ｏ)(ＳＨ)-Ｏ-〕
    とすることを特徴とする、安定化リボザイムの製造方
    法。
12. 【請求項１２】 リボザイムの部分的な領域がリボザイ
    ムの非触媒領域である、請求項９ないし１１のいずれか
    １項に記載の安定化リボザイムの製造方法。
13. 【請求項１３】 核酸塩基の活性基並びに2'-及び5'-水
    酸基は保護基で保護され、3'-水酸基は架橋構造を介し
    て担体に結合しているモノリボヌクレオシド又は核酸塩
    基の活性基並びに3'-及び5'-水酸基は保護基で保護さ
    れ、2'-水酸基は架橋構造を介して担体に結合している
    モノリボヌクレオシド或いはこれらの混合物、又は、核
    酸塩基の活性基並びに5'-水酸基は保護基で保護され、
    3'-水酸基は架橋構造を介して担体に結合しているモノ
    デオキシリボヌクレオシド(固相)から、 （ａ）5'-水酸基の保護基をはずしたのち、固相を洗浄
    し、 （ｂ）核酸塩基の活性基並びに2'-及び5'-水酸基は保護
    基で保護されたリボヌクレオシド-3-Ｏ-(β-シアノエチ
    ル)ホスホアミダイト又は核酸塩基の活性基並びに5'-水
    酸基が保護基で保護されたデオキシリボヌクレオシド-3
    -Ｏ-(β-シアノエチル)ホスホアミダイトを反応させ、
    次いで固相を洗浄し、 （ｃ）未反応の5'-水酸基をアセチル化し、次いで固相
    を洗浄する工程、及び酸化剤で酸化し、次いで洗浄する
    工程を任意の順序で行い、 （ｄ）以下、（ａ）〜（ｃ）を繰り返し、 （ｅ）固相をアルカリ処理して、2'-または3'-水酸基と
    担体のあいだの結合を切り、 （ｆ）他の保護基をはずす、 ことを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記
    載の安定化リボザイムの製造方法。
14. 【請求項１４】 核酸塩基の活性基並びに2'-及び5'-水
    酸基は保護基で保護され、3'-水酸基は架橋構造を介し
    て担体に結合しているモノリボヌクレオシド又は核酸塩
    基の活性基並びに3'-及び5'-水酸基は保護基で保護さ
    れ、2'-水酸基は架橋構造を介して担体に結合している
    モノリボヌクレオシド或いはこれらの混合物、又は、核
    酸塩基の活性基並びに5'-水酸基は保護基で保護され、
    3'-水酸基は架橋構造を介して担体に結合しているモノ
    デオキシリボヌクレオシド(固相)から、 （ａ）5'-水酸基の保護基をはずしたのち、固相を洗浄
    し、 （ｂ）核酸塩基の活性基並びに2'-及び5'-水酸基は保護
    基で保護されたリボヌクレオシド-3-Ｏ-(β-シアノエチ
    ル)ホスホアミダイト又は核酸塩基の活性基並びに5'-水
    酸基が保護基で保護されたデオキシリボヌクレオシド-3
    -Ｏ-(β-シアノエチル)ホスホアミダイトを反応させ、
    次いで固相を洗浄し、 （ｃ）未反応の5'-水酸基をアセチル化し、次いで固相
    を洗浄する工程、及び酸化剤で酸化し、次いで洗浄する
    工程を任意の順序で行い、 （ｄ）以下、（ａ）〜（ｃ）を繰り返し、 （ｅ）固相をアルカリ処理して、2'-または3'-水酸基と
    担体のあいだの結合を切り、 （ｆ）他の保護基をはずす、 ことを特徴とする請求項９ないし１２のいずれか１項に
    記載の安定化リボザイムの製造方法。
15. 【請求項１５】 酸化剤がヨウ素及び／又はテトラエチ
    ルチウラムジサルファイドを含むものである請求項１３
    又は１４記載の安定化リボザイムの製造方法。
16. 【請求項１６】 標的ＲＮＡを請求項１ないし８のいず
    れか１項に記載の安定化リボザイム又は請求項９ないし
    １４のいずれか１項に記載の安定化リボザイムの製造方
    法により製造された安定化リボザイムと反応させること
    を特徴とする、標的ＲＮＡの切断又は不活化法。
17. 【請求項１７】 請求項１ないし８のいずれか１項に記
    載の安定化リボザイム又は請求項９ないし１４のいずれ
    か１項に記載の安定化リボザイムの製造方法により製造
    された安定化リボザイム若しくはそれらの混合物を有効
    成分とするＲＮＡ切断用試薬。