JP3735695B2 - ミニリボザイム、安定化ミニリボザイム、それらを用いる標的rnaの切断方法及び薬剤 - Google Patents
ミニリボザイム、安定化ミニリボザイム、それらを用いる標的rnaの切断方法及び薬剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3735695B2 JP3735695B2 JP01579095A JP1579095A JP3735695B2 JP 3735695 B2 JP3735695 B2 JP 3735695B2 JP 01579095 A JP01579095 A JP 01579095A JP 1579095 A JP1579095 A JP 1579095A JP 3735695 B2 JP3735695 B2 JP 3735695B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- monoribonucleotide
- miniribozyme
- monodeoxyribonucleotide
- guanine
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 0 *CC*(CC(O)=O)C(CC(F)(F)F)=O Chemical compound *CC*(CC(O)=O)C(CC(F)(F)F)=O 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
【産業上の利用分野】
本発明は、リボザイムの活性を維持したまま、標的RNAを特異的に切断できる超短鎖ミニリボザイム(超ミニザイム)、この安定性を高めた安定化ミニリボザイム、それらを用いる標的RNAの切断方法、及びそれらを有効成分とする医療用、動物用もしくは農薬用薬剤に関する。
【0002】
【従来の技術】
チェック(T. Chech)は、酵素活性を有するRNA分子、すなわちリボザイムを1981年に初めて発見した。
また、ハセロフ(J. Haseloff)とジャーラック(W. L. Gerlach)は、数種の植物ウィルスのリボザイムの間で共通に保存されている塩基配列に着目し、リボザイム分子の大きさがわずか22ヌクレオチド(但し、標的RNA結合領域を除く。)で構成された短鎖リボザイム(ハセロフとジャーラックのリボザイム(Haseloff−Gerlach ribozyme)、又はハンマーヘッド型リボザイムという。)を作製することに成功した(Nature, Vol.334, p.585−591(1988);特表平3−502638号公報)。
【0003】
図1はハンマーヘッド型リボザイムの2次構造と作用部位、分子内領域の最近の命名法と番号付けシステムを説明する図である。リボザイムは、標的であるRNA分子の塩基配列を認識して塩基対を形成する結合領域(ヘリックスI及びヘリックスIII)と、触媒活性部位及びヘリックスIIを有する領域から構成されており、標的RNAは標的RNA中のGUCの3’側(図1中、矢印で示す。)で切断される。なお、標的RNAが切断される部位GUC配列は、他の配列(NUZ;但し、NはA、U、G又はCを示し、ZはA、U又はCを示す。)でも切断されることが知られている。
【0004】
一方、リボザイムの活性を維持させたままで、ハセロフとジャーラックのリボザイムよりも更に短いリボザイムが得られれば、リボザイムの基礎研究及び応用面で有用であるため、その研究・開発が盛んになされている。
例えば、マッコール(M. J. McCall)らは、ハンマーヘッド型リボザイムのステムIIを完全に欠いても、4又は5個のヌクレオチド(3個以下のヌクレオチドでは活性が著しく低い。また、ヌクレオチドはRNAよりもDNAがほうが好ましい。)から成るループ構造があれば、ハンマーヘッド型リボザイムと同様の活性があると報告している(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5710−5714,1992)。すなわち、マッコール(M. J. McCall)らが作製したミニリボザイム(minimized ribozyme)、いわゆる、ミニザイム(minizyme)の大きさは、最小のもので14ヌクレオチド(但し、標的RNA結合領域を除く。)で構成されている。しかし、マッコール(M. J. McCall)らの作製したリボザイムは、すべてRNAから成る天然型リボザイムではその活性が著しく低く、またロング(D. M. Long)らは、ステムIIの代わりに4塩基置換したミニザイムの切断活性は低いと報告している(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6977−6981, 1994)。
【0005】
また、トシュル(T. Tuschl)らは、ループIIの長さを4塩基とし、ステムIIの長さ及びループIIの塩基配列の相違がリボザイム活性にどう影響するかを検討した結果、ステムIIは2塩基対まで短くすることができたが、1塩基対又はそれ以下にするとリボザイム活性は著しく減少すること、リボザイムの活性の発揮にG(10.1)*C(11.1)塩基対は必須であること、更にこのときの活性なリボザイムの大きさは最小のもので18ヌクレオチド(但し、標的RNA結合領域を除く。)であることを報告している(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6991−6994, 1993)。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
リボザイム活性を維持したまま、更にヌクレオチド鎖の短いリボザイムを得ることは、前記したように基礎研究、すなわち、リボザイムの活性発現に必要な構造解明や作用メカニズム等の研究に役立つばかりではなく、ヌクレオチド鎖が短かければ化学合成時の高収量が期待できるし、また細胞内への取り込みの容易さやヌクレアーゼに対する安定性も期待でき、医療用途で大きな利点がある。本発明の目的は、リボザイム活性を維持したまま、従来のリボザイムよりも更に小さいリボザイム(超ミニリボザイム又は超ミニザイム)を提供することである。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本明細書において用いた記号・略号は下記の意味である。
A:アデニンモノリボヌクレオチド
G:グアニンモノリボヌクレオチド
C:シトシンモノリボヌクレオチド
U:ウラシルモノリボヌクレオチド
dA:アデニンモノデオキシリボヌクレオチド
dG:グアニンモノデオキシリボヌクレオチド
dC:シトシンモノデオキシリボヌクレオチド
dT:チミンモノデオキシリボヌクレオチド
*:ワトソン−クリック型塩基対
┬:チオリン酸エステル結合
【0008】
本発明者らは、活性をもつリボザイムであって、従来知られているリボザイムよりも更に短いリボザイム、あるいはその安定化リボザイムを得るため種々検討し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、下記の(1)〜(5)の超ミニリボザイム(ミニザイム)である。
(1)次の配列(I)を含むミニリボザイム。
【化2】
〔(I)中、Aはアデニンモノリボヌクレオチド、Gはグアニンモノリボヌクレオチドは、Cはシトシンモノリボヌクレオチド、Uはウラシルモノリボヌクレオチドを示し、
Xは標的RNAの配列に相補的な配列から選ばれるモノヌクレオチドであって、アデニンモノリボヌクレオチド(A)、グアニンモノリボヌクレオチド(G)、シトシンモノリボヌクレオチド(C)、ウラシルモノリボヌクレオチド(U)、アデニンモノデオキシリボヌクレオチド(dA)、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド(dG)、シトシンモノデオキシリボヌクレオチド(dC)、又はチミンモノデオキシリボヌクレオチド(dT)を示し、
mは、2以上の整数を示し、
nは、3以上の整数を示し、
Yは、アデニンモノリボヌクレオチド(A)、グアニンモノリボヌクレオチド(G)、シトシンモノリボヌクレオチド(C)、ウラシルモノリボヌクレオチド(U)のいずれか任意のモノリボヌクレオチドを示し、
塩基配列上段の数字は、リボザイム中のモノヌクレオチドの位置を示す番号である。〕
【0009】
(2)第7番のYがウラシルモノリボヌクレオチド(U)である上記(1)のミニリボザイム、すなわち、下記配列(II)のミニリボザイム。
【化3】
〔(II)におけるX、m及びnは、(I)中における意味と同じである。〕
(3)第7番のYがグアニンモノリボヌクレオチド(G)又はアデニンモノリボヌクレオチド(A)である上記(1)のミニリボザイム、すなわち、下記配列(III)又は(III')のミニリボザイム。
【化4】
〔(III)及び(III')におけるX、m及びnは、(I)中における意味と同じである。〕
【0010】
(4)Xが、アデニンモノリボヌクレオチド(A)、グアニンモノリボヌクレオチド(G)、シトシンモノリボヌクレオチド(C)又はウラシルモノリボヌクレオチド(U)である、上記(1)〜(3)のいずれかのミニリボザイム。
(5)Xが、アデニンモノデオキシリボヌクレオチド(dA)、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド(dG)、シトシンモノデオキシリボヌクレオチド(dC)、又はチミンモノデオキシリボヌクレオチド(dT)である、上記(1)〜(3)のいずれかミニリボザイム。
【0011】
また本発明は、安定で、かつ活性を維持している下記(6)〜(8)の安定化ミニリボザイムである。
(6)上記(1)〜(5)のミニリボザイム中のモノヌクレオチドであって、その活性に影響を及ぼさないモノヌクレオチドのリン酸エステル基又はリボース部分の水酸基が他の安定な基で置き換わってなる、安定化ミニリボザイム。
【0012】
(7)一つ又は複数のXのリン酸エステル基〔−O−P(=O)(OH)−O−〕が、チオリン酸エステル基〔−O−P(=S)(OH)−O−又は−O−P(=O)(SH)−O−〕で置き換わってなる、上記(6)の安定化ミニリボザイム。
【0013】
(8)第3番のC、第4番のU、又は第7番のYのモノリボヌクレオチドのうちの少なくとも一の3’側のリン酸エステル基〔−O−P(=O)(OH)−O−〕が、チオリン酸エステル基〔−O−P(=S)(OH)−O−又は−O−P(=O)(SH)−O−〕で置き換わってなる、上記(6)の安定化ミニリボザイム。
【0014】
更にまた、本発明は、
(9)標的RNAを上記(1)〜(5)のいずれかのミニリボザイム、又は上記(6)〜(8)のいずれかの安定化ミニリボザイムと反応させることを特徴とする標的RNAの切断又は不活化方法、である。
【0016】
本発明の配列(I)のミニリボザイムが、標的RNAと塩基対を形成したときの2次構造を図2に示した。この図から分かるように、本発明のミニリボザイムは、ステムII及びループIIのいずれをも持たない特異な短鎖リボザイムである。また、このミニリボザイムは、その特定塩基配列を有する領域の大きさがわずか12ヌクレオチド(但し、標的RNA結合領域を含まない。)である。
【0017】
本発明の配列(I)のミニリボザイムは、その3'−又は5'−末端の水酸基はリン酸化されたものであっても、遊離のものであってもいずれでもよい。
【0018】
また、本発明の配列(I)のミニリボザイムにおけるmは、2以上、好ましくは3〜15、更に好ましくは4〜10の整数である。nは、3以上、好ましくは4〜15、更に好ましくは4〜10の整数である。mが2未満、及びnが3未満では、ミニリボザイムの標的RNAへの特異性が悪くなり、m及びnが20を越えると、切断反応後の標的RNAとリボザイムの解離が悪くなったり、本発明の目的であるリボザイム短鎖化に逆行し、好ましくない。
また、本発明の配列(I)のミニリボザイムにおける結合領域のヌクレオチド、すなわち、X、Xm 又はXn は、RNAであっても、あるいはDNAであってもよい。
また、Xに代えて、下記(化5)
【化5】
(化5中、Bは、アデニン、シトシン、グアニン又はチミンを示す。)のペプチド核酸(PNA)とすることもできる。
【0019】
また、本発明の配列(I)のミニリボザイムにおける第7番のYは、ハセロフとジャーラックのリボザイムに一致したUであるときに活性は最も高いが、血中に多量含まれるRNase A型のリボヌクレアーゼの攻撃から保護するため、これをG又はAとしてもよい。
【0020】
本発明の配列(I)のミニリボザイムを安定化させる手段としては、上記のように配列の一部をRNAからDNAへ替える方法が有効な手段のひとつであるが、そのような方法のほかにモノヌクレオチドのリン酸エステル基又はリボース部分の水酸基を他の安定な基に置き換えることが有効である。
具体的には、モノヌクレオチドのリン酸エステル基をチオリン酸エステル基〔−O−P(=S)(OH)−O−又は−O−P(=O)(SH)−O−〕やメチルホスホネート基〔−O−P(=O)(CH3)−O−〕等で置き換えたり、モノヌクレオチドのリボース部分の水酸基をメトキシやアリロキシ等のアルコキシ基、アミノ基、又はフッ素原子等で置き換える。
【0021】
第3番のC、第4番のU、又は第7番のCもしくはUのモノリボヌクレオチドの3'側のリン酸エステル基はRNase A型のリボヌクレアーゼにより分解を受けやすい部位なので、この部分のリン酸エステル基をチオリン酸エステル基やメチルホスホネート基等で置き換えることは、特に有効である。
【0022】
本発明のミニリボザイム又は安定化ミニリボザイムの製造は、基本的にはいわゆる固相化学合成法のうちの、ベータシアノエチルホスホアミダイト法に基礎を置く方法で合成できる。メチルホスホアミダイトを用いた場合もチオフェノールによる処理を追加するだけで、安定化ミニリボザイムの製造が可能である。
また、天然型ミニザイムは、ミニザイムRNAをコードするDNAを化学合成し、これをベクターに挿入し、転写することによっても得ることができる。
【0023】
核酸塩基の活性基としては例えばアミノ基があり、この保護基としては例えば、ベンゾイル基、アニソイル基、イソブチリル基等がある。
固相から5'−水酸基の保護基をはずすには、ジクロロ酢酸又はトリクロロ酢酸のジクロロメタン溶液等を用いることができる。
2'−水酸基の保護基には例えば、t−ブチルジメチルシリル基等があり、また5'−水酸基の保護基には例えば、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基、トリチル基等がある。
【0024】
未反応の5'−水酸基のアセチル化は1−メチルイミダゾールもしくはジメチルアミノピリジンを含む無水酢酸等によって、行うことができる。
固相の洗浄は、通常、アセトニトリルを用いて行う。
酸化剤としては、リン酸エステル結合を生成させるときは、ヨウ素、水、ピリジン及びテトラヒドロフラン含有液等を用い、チオリン酸エステル結合を生成させるときは、テトラエチルチウラムジサルファイド、3H,1,2−ベンゾジチオール−1,1−ジオキサイド等を用いる。
【0025】
固相から目的のミニリボザイム又は安定化ミニリボザイムを切り出すにはアルカリ溶液、例えば28%アンモニア水とエタノールの3:1混合溶液が用いられる。
このようにして合成したミニリボザイム又は安定化ミニリボザイムは、逆相、イオン交換等のカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等の核酸精製によく用いられる慣用の方法の一つ、又はそれらの組合せにより精製する。
【0026】
また、本発明の安定化ミニリボザイムのチオリン酸エステル結合にはR型及びS型の立体異性体が存在するが、いずれでもよく、RS混合型であってもよい。
【0027】
本発明のミニリボザイム又は安定化ミニリボザイムは標的RNAを切断又は不活化するので、医療用、動物用もしくは農薬用薬剤等として有効に利用される。
標的RNAとしては、種々病原性のウィルス由来のRNA、ガン遺伝子由来のRNA、細胞の増殖・分化に関係する遺伝子由来のRNA等がある。
切断又は不活化の反応は、適宜好適な条件を選べばよいが、例えば、5〜500mMのマグネシウム又はマンガンイオンの存在下、pH8.0±3.0、温度20〜70℃で行うとよい。
【0028】
医薬としては例えば、エイズ、白血病、各種悪性腫瘍、流行性結膜炎等の治療用医薬がある。
動物薬としては例えば、牛、豚、ニワトリ、イヌ、ネコ等の各種ウィルス病の治療用動物薬がある。
農薬としては例えば、タバコモザイク病、イネ萎縮病、キュウリモザイク病等の各種植物ウィルス病に対する農薬等がある。
【0029】
【実施例】
以下実施例により、本発明を詳細に説明する。
実施例1 下記配列のミニリボザイム(配列番号:9)の合成
【化6】
【0030】
DNA/RNA合成装置(アプライドバイオシステムズ社製、380B型)にC−CPGカラム(シトシン量:1μmol)を装着した後、バージョン1.34のプログラムを用いて、以下の(1)〜(5)の手順で、配列番号:9のミニリボザイム(塩基数が22のミニザイム(Minizyme)で -G10−C11- であるところから、M22-GCとも略す。)を合成した。
【0031】
(1)2%(w/v)トリクロル酢酸のジクロルメタン溶液を1.6ml/minで50秒間カラムに流して、5'−水酸基のジメトキシトリチル基を外す。
(2)アセトニトリルでカラムを洗浄した後、5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−t−ブチルジメチルシリル−グアノシン−N2−イソブチリル−N,N’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイトのアセトニトリル溶液(77mg/ml)及び4%(w/v)テトラゾールのアセトニトリル溶液の1:1(容量比)混合液を1.5ml/minで10秒間給液したのち、10分間保持し、反応を起こさせてホスファイト結合を形成させる。
(3)アセトニトリルでカラムを洗浄後、10%(v/v)無水酢酸及び10%(v/v)2,6−ルチジンを含むテトラヒドロフラン溶液と16%(v/v)1−メチルイミダゾールを含むテトラヒドロフラン溶液の1:1(容量比)混合液を1.5ml/minで20秒間流し、未反応の5'−水酸基をアセチル化する。
(4)アセトニトリルで洗浄後、3%(w/v)ヨウ素、20%(v/v)ピリジン、及び2%(v/v)H2Oを含むテトラヒドロフラン溶液を1.6ml/minで25秒間流し、20秒間放置し、ホスファイト結合をホスフェート結合に酸化したのち、再びアセトニトリルで洗浄する。
(5)上記の(1)〜(4)の工程を、配列番号:9の3’側から数えて3番目以降の核酸塩基配列に従って繰り返す。
【0032】
ここで、手順(2)のアミダイト試薬は、
Aの場合、5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−t−ブチルジメチルシリル−アデノシン−N6−ベンゾイル−N,N’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、
Gの場合、5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−t−ブチルジメチルシリル−グアノシン−N2−イソブチリル−N,N’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、
Cの場合、5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−t−ブチルジメチルシリル−シチジン−N4−ベンゾイル−N,N’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、
Uの場合、5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−t−ブチルジメチルシリル−ウリジン−N,N’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、を用いる。
【0033】
すべてのアミダイト試薬の反応を終えた後、5'−水酸基の保護基を手順(1)と同様の方法で除去し、28%アンモニアとエタノールの3:1(容量比)混合液を18秒間流し、15分間放置したのちカラムから合成物を切り出した。この切り出しの操作は更に3回繰り返した。次に合成物を、55℃で8時間処理し、核酸塩基及びリン酸基の保護基を外した。アンモニアとエタノールを減圧して除去後、適量の水に溶解し、波長260nmの吸光度を測定し、水を減圧除去した後、1Mテトラブチルアンモニウムフルオライドのテトラヒドロフラン溶液(以下、TBAFと略す)に溶解し、室温で12時間放置し、2'−水酸基の保護基を除去した。加えたTBAFと同容量の0.1Mのトリエチルアンモニウム−酢酸緩衝液(以下、TEAAと略す)を加え、ペレット状になるまで凍結乾燥した。
【0034】
次に、このペレットをOPCカラム(アプライドバイオシステムズ社製)で精製した。すなわち、カラムを先ず、5mlのアセトニトリル、次いで5mlの2M TEAAの順で洗浄し、これに予め0.1M TEAA1mlで溶解したペレット溶解液を1〜2滴/秒の速さで流し、通過液を再び同様にカラムに流して目的物を吸着させた。5mlの0.1M TEAA、続いて10mlの脱イオン水の順でカラムを洗浄後、50%(v/v)アセトニトリル1.8mlを1〜2滴/秒で流し、目的物を溶出した。
【0035】
溶出液は更にFPLC(ファルマシア社製)で精製した。すなわち、カラムはPepRPC HR10/10、カラム温度は40℃、流速は2ml/minとし、移動相は初期濃度が10%(v/v)のアセトニトリルを含む0.1M TEAAとして、カラムに溶出液を負荷後、移動相中のアセトニトリル濃度を1時間かけて10%(v/v)から60%(v/v)に直線的に増加させ、目的物を溶出した。なお、目的物の溶出位置は254nmの吸光度を測定し、モニターした。
【0036】
実施例2 配列(IV)の安定化ミニリボザイムの合成
【化7】
【0037】
DNA/RNA合成装置にdC−CPGカラム(シトシン量:1μmol)を装着した後、バージョン1.34のプログラムを用いて、以下の(1)〜(5)の手順で、配列(IV)の安定化ミニリボザイムを合成した。
【0038】
(1)2%(w/v)トリクロル酢酸のジクロルメタン溶液を1.6ml/minで50秒間カラムに流して、5'−水酸基のジメトキシトリチル基を外す。
(2)アセトニトリルでカラムを洗浄した後、5’−O−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−N2−イソブチル−N,N−ジイソプロピルアミノエチルホスホアミダイトのアセトニトリル溶液(77mg/ml)及び4%(w/v)テトラゾールのアセトニトリル溶液の1:1(容量比)混合液を1.5ml/minで10秒間給液し、30秒間保持し、縮合反応を起こさせてホスファイト結合を形成させる。
(3)アセトニトリルでカラムを洗浄後、10%(v/v)無水酢酸及び10%(v/v)2,6−ルチジンを含むテトラヒドロフラン溶液と16%(v/v)1−メチルイミダゾールを含むテトラヒドロフラン溶液の1:1(容量比)混合液を1.5ml/minで20秒間流し、未反応の5'−水酸基をアセチル化する。
(4)アセトニトリルで洗浄後、3%(w/v)ヨウ素、20%(v/v)ピリジン、及び2%(v/v)H2Oを含むテトラヒドロフラン溶液を1.6ml/minで25秒間流し、20秒間放置し、ホスファイト結合をホスフェート結合に酸化し、再びアセトニトリルで洗浄する。
(5)配列(IV)に示した3’側からの3番目以降の核酸塩基配列に従って、DNAの場合には上記の(1)〜(4)の工程を、RNAの場合には前記実施例1の(1)〜(4)の工程を繰り返す。
【0039】
ここで、手順(2)のアミダイト試薬は、
A、G、C及びUの場合、前記実施例1で述べたそれぞれのアミダイト試薬と同じであり、また、
dAの場合、5’−O−ジメトキシトリチルデオキシアデノシン−N6−ベンゾイル−N,N’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、
dGの場合、5’−O−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−N2−イソブチリル−N,N’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、
dCの場合、5’−O−ジメトキシトリチルデオキシシチジン−N4−ベンゾイル−N,N’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイトを、それぞれ用いた。アミダイト試薬の糖部分がデオキシリボースの場合は上記(2)に記載の方法で、リボースの場合はアミダイト試薬のアセトニトリル溶液(77mg/ml)と4%(w/v)テトラゾールのアセトニトリル溶液の1:1(容量比)混合液を用いて1.5ml/minで10秒間給液した後、10分間保持し、縮合反応を起こさせホスファイト結合を形成させた。
【0040】
すべてのアミダイト試薬の反応を終えた後、実施例1と同様な方法で、切り出し、脱保護基、凍結乾燥、OPCカラムによる精製及びFPLCによる精製を行なった。
【0041】
実施例3 配列(V)の安定化ミニリボザイムの合成
【化8】
〔(VI)中、┬はチオリン酸結合を示す。〕
【0042】
DNA/RNA合成装置にdC−CPGカラム(シトシン量:1μmol)を装着した後、バージョン1.34のプログラムを用いて、以下の(1)〜(5)の手順で、配列(V)の安定化ミニリボザイムを合成した。
【0043】
(1)2%(w/v)トリクロル酢酸のジクロルメタン溶液を1.6ml/minで50秒間カラムに流して、5'−水酸基のジメトキシトリチル基を外す。
(2)アセトニトリルでカラムを洗浄した後、5’−O−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−N2−イソブチル−N,N−ジイソプロピルアミノエチルホスホアミダイトのアセトニトリル溶液(77mg/ml)及び4%(w/v)テトラゾールのアセトニトリル溶液の1:1(容量比)混合液を1.5ml/minで10秒間給液し、30秒間保持し、縮合反応を起こさせてホスファイト結合を形成させる。
(3)アセトニトリルでカラムを洗浄後、10%(v/v)無水酢酸及び10%(v/v)2,6−ルチジンを含むテトラヒドロフラン溶液と16%(v/v)1−メチルイミダゾールを含むテトラヒドロフラン溶液の1:1(容量比)混合液を1.5ml/minで20秒間流し、未反応の5'−水酸基をアセチル化する。
(4)アセトニトリルで洗浄後、15%テトラエチルチウラムジサルファイドを含むアセトニトリル溶液を1.6 ml/minで23秒間流し、15分間放置し、ホスファイト結合をチオリン酸結合に酸化し、再びアセトニトリルで洗浄する。
(5)配列(V)に示した3’側からの3番目以降の核酸塩基配列に従い、またその配列がDNAであるかRNAであるか、及びホスフェート結合であるかチオリン酸結合であるかに対応させて、上記(1)〜(4)の工程又は実施例1もしくは2の(1)〜(4)の工程を、繰り返す。
【0044】
ここで、手順(2)のアミダイト試薬は、
A、G、C及びUの場合、前記実施例1で述べたそれぞれのアミダイト試薬と同じであり、また、
dA、dG及びdCの場合、前記実施例2で述べたそれぞれのアミダイト試薬と同じである。アミダイト試薬の糖部分がデオキシリボースの場合は上記(2)に記載の方法で、リボースの場合はアミダイト試薬のアセトニトリル溶液(77mg/ml)と4%(w/v)テトラゾールのアセトニトリル溶液の1:1(容量比)混合液を用いて1.5ml/minで10秒間給液した後、10分間保持し、縮合反応を起こさせホスファイト結合を形成させた。
【0045】
また、チオリン酸結合ではなく、ホスフェート結合を形成させる場合は、手順(4)の「15%テトラエチルチウラムジサルファイドを含むアセトニトリル溶液を1.6ml/minで23秒間流し、15分間放置」する代わりに、「3%(w/v)ヨウ素、20%(v/v)ピリジン、及び2%(v/v)H2Oを含むテトラヒドロフラン溶液を1.6ml/minで25秒間流し、20秒間放置」し、ホスファイト結合をホスフェート結合に酸化した。
【0046】
すべてのアミダイト試薬の反応を終えた後、実施例1と同様な方法で、切り出し、脱保護基、凍結乾燥、OPCカラムによる精製及びFPLCによる精製を行なった。
【0047】
試験例1 ミニリボザイムによる標的RNA切断活性
標的となるRNAのS−11(5’末端を32P標識した5’−GCCGUCCCCCG−3’)1nMの基質を含む50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)にリボザイム〔本発明のミニリボザイム(M22-GC、配列番号:9)、ハンマーヘッド型リボザイム(陽性対照、R32−GAAA、配列番号:1)、又は他のミニリボザイム、配列番号:2〜8〕を50μMの濃度で加え、90℃で1分間、加熱し、徐冷した(コンプレックスの形成)。これを37℃に保ったのち、MgCl2を25mMとなるように加えてリボザイムによる切断反応を開始させ、反応開始後、1、2、3、4、10、20、30及び60分後にサンプリングし、それぞれに反応停止液(9M尿素、100mM EDTA、0.1%キシレンシアノール、及び0.1%ブロモフェノールブルーを含む)を加えて、分析するまで−80℃に保存した。分析時、これらのサンプルを室温で融解後、20%ポリアクリルアミド、7M尿素の変性ゲル中で電気泳動を行ない、イメージアナライザを用いて分析した。
横軸に時間(min)をとり、縦軸に基質分解物の量(%)をとってプロットし、グラフから分解速度係数kobs(min-1)を求めた。図3は、M22−GCによる基質S−11の分解の時間的変化を示し、表1は種々のリボザイムの分解速度係数kobs及びこれらの相対比較値を示す。
表1から、本発明の配列番号:9のミニザイムはハンマーヘッド型リボザイム(R32-GAAA、配列番号:1)の65%の切断活性があることが分かる。
【0048】
【表1】
【0049】
【発明の効果】
本発明のミニリボザイムは、活性を保有する最小のリボザイムである。
本発明の安定化ミニリボザイムは、リボザイム活性を保持しながら種々のRNアーゼに対して安定性をもつ。
本発明のミニリボザイム又は安定化ミニリボザイムにより、RNAが原因で起こる疾患の治療用医薬、動物薬あるいは農薬に利用できる。
【0050】
【配列表】
配列番号:1
配列の長さ:32
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
配列の種類:他の核酸 合成RNA
配列
CGGGGCUGAU GAGGCCGAAA GGCCGAAACG GC 32
【0051】
配列番号:2
配列の長さ:24
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
配列の種類:他の核酸 合成RNA
配列
CGGGGCUGAU GAUGACGAAA CGGC 24
【0052】
配列番号:3
配列の長さ:24
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
配列の種類:他の核酸 合成RNA
配列
CGGGGCUGAU GAGTTCGAAA CGGC 24
【0053】
配列番号:4
配列の長さ:24
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
配列の種類:他の核酸 合成RNA
配列
CGGGGCUGAU GAGUAAGAAA CGGC 24
【0054】
配列番号:5
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
配列の種類:他の核酸 合成RNA
配列
CGGGGCUGAU GAUGAGAAAC GGC 23
【0055】
配列番号:6
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
配列の種類:他の核酸 合成RNA
配列
CGGGGCUGAU GAGCCGAAAC GGC 23
【0056】
配列番号:7
配列の長さ:22
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
配列の種類:他の核酸 合成RNA
配列
CGGGGCUGAU GACGGAAACG GC 22
【0057】
配列番号:8
配列の長さ:22
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
配列の種類:他の核酸 合成RNA
配列
CGGGGCUGAU GAGAGAAACG GC 22
【0058】
配列番号:9
配列の長さ:22
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
配列の種類:他の核酸 合成RNA
配列
CGGGGCUGAU GAGCGAAACG GC 22
【図面の簡単な説明】
【図1】番号付けシステムを含むリボザイムの2次構造を示す模式図である。
【図2】本発明のミニリボザイムの2次構造を示す模式図である。
【図3】基質(S−11)にミニザイムM22−GCを反応させたときの、基質分解物(5'-P)の時間的変化を示すグラフである。
Claims (9)
- 次の配列(I)を含むミニリボザイム。
Xは標的RNAの配列に相補的な配列から選ばれるモノヌクレオチドであって、アデニンモノリボヌクレオチド(A)、グアニンモノリボヌクレオチド(G)、シトシンモノリボヌクレオチド(C)、ウラシルモノリボヌクレオチド(U)、アデニンモノデオキシリボヌクレオチド(dA)、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド(dG)、シトシンモノデオキシリボヌクレオチド(dC)、又はチミンモノデオキシリボヌクレオチド(dT)を示し、
mは、5以上の整数を示し、
nは、4以上の整数を示し、
Yは、アデニンモノリボヌクレオチド(A)、グアニンモノリボヌクレオチド(G)、シトシンモノリボヌクレオチド(C)、ウラシルモノリボヌクレオチド(U)のいずれか任意のモノリボヌクレオチドを示し、
塩基配列上段の数字は、ミニリボザイム中のモノヌクレオチドの位置を示す番号である。〕 - 第7番のYがウラシルモノリボヌクレオチド(U)である、請求項1のミニリボザイム。
- 第7番のYがグアニンモノリボヌクレオチド(G)又はアデニンモノリボヌクレオチド(A)である、請求項1のミニリボザイム。
- Xが、アデニンモノリボヌクレオチド(A)、グアニンモノリボヌクレオチド(G)、シトシンモノリボヌクレオチド(C)又はウラシルモノリボヌクレオチド(U)である、請求項1〜3のいずれかのミニリボザイム。
- Xが、アデニンモノデオキシリボヌクレオチド(dA)、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド(dG)、シトシンモノデオキシリボヌクレオチド(dC)、又はチミンモノデオキシリボヌクレオチド(dT)である、請求項1〜3のいずれかのミニリボザイム。
- 請求項1〜5のミニリボザイム中のモノヌクレオチドであって、その活性に影響を及ぼさないモノヌクレオチドのリン酸エステル基又はリボース部分の水酸基が他の安定な基で置き換わってなる、安定化ミニリボザイム。
- 一つ又は複数のXのリン酸エステル基が、チオリン酸エステル基で置き換わってなる、請求項6の安定化ミニリボザイム。
- 第3番のC、第4番のU、又は第7番のYのモノリボヌクレオチドのうちの少なくとも一つの3´側のリン酸エステル基が、チオリン酸エステル基で置き換わってなる、請求項6の安定化ミニリボザイム。
- 標的RNAを請求項1〜5のいずれかのミニリボザイム、又は請求項6〜8のいずれかの安定化ミニリボザイムと、インビトロで反応させることを特徴とする、標的RNAの切断又は不活化方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP01579095A JP3735695B2 (ja) | 1995-02-02 | 1995-02-02 | ミニリボザイム、安定化ミニリボザイム、それらを用いる標的rnaの切断方法及び薬剤 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP01579095A JP3735695B2 (ja) | 1995-02-02 | 1995-02-02 | ミニリボザイム、安定化ミニリボザイム、それらを用いる標的rnaの切断方法及び薬剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH08205869A JPH08205869A (ja) | 1996-08-13 |
JP3735695B2 true JP3735695B2 (ja) | 2006-01-18 |
Family
ID=11898641
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP01579095A Expired - Lifetime JP3735695B2 (ja) | 1995-02-02 | 1995-02-02 | ミニリボザイム、安定化ミニリボザイム、それらを用いる標的rnaの切断方法及び薬剤 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3735695B2 (ja) |
-
1995
- 1995-02-02 JP JP01579095A patent/JP3735695B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH08205869A (ja) | 1996-08-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5652094A (en) | Nucleozymes | |
US6239272B1 (en) | 2'-O-alkylthioalkyl and 2'-c-alkylthioalkyl-containing nucleic acids | |
US5783425A (en) | Amino and peptido modified enzymatic nucleic acid | |
JP4383720B2 (ja) | オリゴヌクレオチドn3’→p5’ホスホルアミデート:合成および化合物;ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ耐性特性 | |
JP3186795B2 (ja) | 末端3′−3′または5′−5′ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチド類似体 | |
JPH10510433A (ja) | 高いキラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド | |
JPH06128284A (ja) | 合成触媒オリゴヌクレオチド構造、核酸の目標配列の切断方法、抗ウイルス治療用薬剤ならびにその製造方法、診断試薬及びその製造方法 | |
JP2000507928A (ja) | ホスホトリエステルオリゴヌクレオチド、アミダイト、およびそれらの調製法 | |
CA2186250A1 (en) | Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics | |
JPH08505396A (ja) | 酸性pHにおいて安定性を増加するよう修飾されたオリゴヌクレオチド | |
JPH06189753A (ja) | 末端3′−3′および/または5′−5′連鎖を有するオリゴリボヌクレオチドおよびリボザイム類縁体 | |
Gao et al. | Double-stranded cyclic oligonucleotides with non-nucleotide bridges | |
JPH09503494A (ja) | カーバメートヌクレオシド間結合を有するビルディングブロックおよびそれから誘導される新規なオリゴヌクレオチド | |
Gao et al. | Stabilization of double-stranded oligonucleotides using backbone-linked disulfide bridges | |
JPH09505307A (ja) | 多キラル合成フォスホネートオリゴマー類 | |
JPH10509039A (ja) | リボザイムアナログ | |
JP3735695B2 (ja) | ミニリボザイム、安定化ミニリボザイム、それらを用いる標的rnaの切断方法及び薬剤 | |
WO1996003500A1 (fr) | Substance a activite antivirale | |
JP3240304B2 (ja) | 安定化リボザイム | |
JP3103855B2 (ja) | 安定化リボザイム | |
US6509459B1 (en) | Base protecting groups and rapid process for oligonucleotide synthesis | |
JPH0682A (ja) | 安定化リボザイム | |
AU6533200A (en) | Chimeric dna/rna ribozymes containing propanediol | |
JPH09224673A (ja) | 一対のミニリボザイム、ミニリボザイム・ダイマー、それらによる標的rnaの切断・不活化方法及び薬剤 | |
Noe et al. | Chemistry of antisense oligonucleotides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20040609 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20040610 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20040715 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041005 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050215 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050414 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20050602 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050712 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050912 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20051004 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |