JPH09224673A - 一対のミニリボザイム、ミニリボザイム・ダイマー、それらによる標的ｒｎａの切断・不活化方法及び薬剤 - Google Patents

一対のミニリボザイム、ミニリボザイム・ダイマー、それらによる標的ｒｎａの切断・不活化方法及び薬剤

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JPH09224673A
JPH09224673A JP8034898A JP3489896A JPH09224673A JP H09224673 A JPH09224673 A JP H09224673A JP 8034898 A JP8034898 A JP 8034898A JP 3489896 A JP3489896 A JP 3489896A JP H09224673 A JPH09224673 A JP H09224673A
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dimer
target rna
miniribozyme
minizyme
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Kazumasa Tahira
和誠 多比良
Satoshi Nishikawa
諭 西川
Akira Yamada
亮 山田
Kazunori Hanada
和紀 花田
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Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Resonac Corp
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Agency of Industrial Science and Technology
Hitachi Chemical Co Ltd
Taisho Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】一対のミニザイムを混合して形成される活
性リボザイムであって、標的ＲＮＡに対しては二箇所の
領域で結合することのできるミニザイム・ダイマー。 【効果】標的ＲＮＡの結合領域中に５’−ＮＵＸ−３’
配列がなくとも、標的ＲＮＡの他の箇所にＮＵＸ配列が
あれば標的ＲＮＡを特異的によく切断・失活させること
のできる優れた機能をもつミニザイムを提供できた。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子疾患の治療
や診断に有用な一対のミニリボザイム、ミニリボザイム
・ダイマー、それらによる標的ＲＮＡの切断・不活化方
法及び薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】チェック（T. Chech）は、酵素活性を有
するＲＮＡ分子、すなわちリボザイムを１９８１年に初
めて発見した。また、ハセロフ（J. Haseloff）とジャ
ーラック（W. L. Gerlach）は、数種の植物ウィルスの
リボザイムの間で共通に保存されている塩基配列に着目
し、リボザイム分子の大きさがわずか２２ヌクレオチド
（但し、標的ＲＮＡ結合領域を除く。）で構成された短
鎖リボザイム（ハセロフとジャーラックのリボザイム
（Haseloff-Gerlach ribozyme）、又はハンマーヘッド
型リボザイムという。）を作製することに成功した（Na
ture, Vol.334, p.585-591(1988)；特表平３−５０２６
３８号公報）。
【０００３】図１は、ハンマーヘッド型リボザイムとそ
の系統的番号付け、基質（標的ＲＮＡ）／リボザイム複
合体、標的ＲＮＡの切断部位、分子内部位の名称等を示
す模式図である。リボザイムは、標的であるＲＮＡ分子
の塩基配列を認識して塩基対を形成する結合領域（ヘリ
ックスＩ及びヘリックスIII）と、触媒活性部位及びヘ
リックスIIを有する領域から構成されており、標的ＲＮ
Ａは標的ＲＮＡ中のＧＵＣの３’側（図１中、矢印で示
す。）で切断される。なお、標的ＲＮＡが切断される部
位ＧＵＣ配列は、他の配列（ＮＵＸ；但し、ＮはＡ、
Ｕ、Ｇ及びＣのいずれでもよく、ＸはＡ、Ｕ又はＣを示
す。）でも切断されることが知られている（いわゆる、
ＮＵＸルールと呼ばれる。）。
【０００４】一方、リボザイムの活性を維持させたまま
で、ハンマーヘッド型リボザイムよりも更に短いリボザ
イムが得られれば、リボザイムの基礎研究及び応用面で
有用であるため、その研究・開発が盛んになされてい
る。例えば、マッコール（M. J. McCall）らは、ハンマ
ーヘッド型リボザイムのステムIIを完全に欠いても、４
又は５個のヌクレオチド（３個以下のヌクレオチドでは
活性が著しく低い。また、ヌクレオチドはＲＮＡよりも
ＤＮＡがほうが好ましい。）から成るループ構造があれ
ば、ハンマーヘッド型リボザイムと同様の活性があると
報告している（Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5710-
5714,1992）。 また、トシュル（T. Tuschl）らは、ル
ープIIの長さを４塩基とし、ステムIIの長さ及びループ
IIの塩基配列の相違がリボザイム活性にどう影響するか
を検討した結果、ステムIIは２塩基対まで短くすること
ができたが、１塩基対又はそれ以下にするとリボザイム
活性は著しく減少すること、リボザイムの活性の発揮に
Ｇ（10.1）＊Ｃ（11.1）塩基対は必須であること、更に
このときの活性リボザイムの大きさは最小のもので１８
ヌクレオチド（但し、標的ＲＮＡ結合領域を除く。）で
あることを報告している（Pro. Natl. Acad. Sci. USA,
90, 6991-6994,1993）。
【０００５】しかし、前記マッコールら及びトシュルら
の報告したミニザイムは、その切断活性が一般に知られ
ているハンマーヘッド型リボザイムの活性に比べて著し
く低い。これに対し、本発明者らは、従来のミニザイム
の中でヌクレオチド鎖長が最も短く、かつ一般に知られ
ているハンマーヘッド型リボザイムと殆ど同レベルの切
断活性を示すリボザイム（ミニリボザイム又はミニザイ
ム）を開発した。本発明者らは、このミニザイム（モノ
マー）が標的ＲＮＡと結合するときの２次構造を、先
に、図２のように推定した。ミニザイムが図２に示され
るような２次構造をとると推定すると、このミニザイム
にはループII構造もステムII構造も無く、このようなミ
ニザイムがなぜ標的ＲＮＡ切断能を有するのか、理由は
よく分からなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】このミニザイムについ
ての基礎的課題は、主として次の２点であった。 １．図２に示されるような、ループII構造もステムII構
造も欠くミニザイムが標的ＲＮＡを切断する機作の解
明。 ２．ミニザイムの作用を最大限に発揮させる核酸配列の
設計と安定化。
【０００７】いっぽう、ハンマーヘッド型リボザイム等
の従来型リボザイムが、標的ＲＮＡを認識してこれを切
断・失活させる条件は、標的ＲＮＡの結合領域中に５’
−ＮＵＸ−３’配列が必ず含まれていること（ＮＵＸル
ール）であった。換言すれば、その結合領域中に５’−
ＮＵＸ−３’配列がなければリボザイムで切断・失活さ
せることは不可能であった。もし、標的ＲＮＡの結合領
域中に５’−ＮＵＸ−３’配列がなくとも、リボザイム
により特異的に標的ＲＮＡを切断・失活させることがで
きるならば、遺伝子疾患の診断、治療薬等へのリボザイ
ムの応用範囲は格段に広がるものと期待される。本発明
は、前述の基礎的課題の解決と相俟って、標的ＲＮＡの
結合領域中に５’−ＮＵＸ−３’配列がなくとも、（標
的ＲＮＡの他の箇所にＮＵＸ配列があれば）標的ＲＮＡ
を特異的によく切断・失活させることのできる優れた機
能のミニリボザイム、すなわち一対のミニザイムもしく
はミニザイム・ダイマーを提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らはミニザイム
についての基礎的課題を種々検討しているうちに、次の
ようなことが分かってきた。すなわち、（ａ）ミニザイ
ム２分子が比較的高濃度に存在する場合は、図２に示さ
れるような構造をとるのではなく、図３に示されるよう
にダイマーを形成して標的ＲＮＡを認識し切断するこ
と、（ｂ）形成されたミニザイム・ダイマーの２次構造
は、ハンマーヘッド型リボザイムと類似する構造をもつ
こと、（ｃ）しかし、形成されたミニザイム・ダイマー
はハンマーヘッド型リボザイムとは異なり、標的ＲＮＡ
との結合領域がダイマー中に２箇所存在すること、等で
ある。本発明は、以上の知見を基礎とし、これを発展さ
せ完成したものである。
【０００９】なお、本明細書において用いた記号・略号
は下記の意味である。 Ａ：アデニンモノリボヌクレオチド Ｇ：グアニンモノリボヌクレオチド Ｃ：シトシンモノリボヌクレオチド Ｕ：ウラシルモノリボヌクレオチド ｄＡ：アデニンモノデオキシリボヌクレオチド ｄＧ：グアニンモノデオキシリボヌクレオチド ｄＣ：シトシンモノデオキシリボヌクレオチド ｄＴ：チミンモノデオキシリボヌクレオチド ＊：ワトソン−クリック型塩基対 ┬：チオリン酸エステル結合
【００１０】本発明は、先ず、 次の配列（Ｉ）で表されるミニザイム
【化５】 15.3 15.2 15.1 14 13 12 2.1 2.2 3'-Ｑ1n…Ｑ12 Ｑ11 Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｌ Ｖ Ｑ21 Ｑ22…Ｑ2m-5' （Ｉ） と、次の配列（II）で表されるミニザイム
【化６】 15.3 15.2 9 8 7 6 5 4 3 2.1 2.2 3'-Ｒ1n…Ｒ12 Ｒ11 Ｗ Ｍ Ａ Ｇ Ｙ Ａ Ｇ Ｕ Ｃ Ｒ21 Ｒ22…Ｒ2m-5'（II） との組合せからなる、一対のミニザイムである。
【００１１】但し、配列（Ｉ）及び（II）中、Ａはアデ
ニンモノリボヌクレオチド、Ｇはグアニンモノリボヌク
レオチド、Ｃはシトシンモノリボヌクレオチド、Ｕはウ
ラシルモノリボヌクレオチドを示し、Ｙは、Ａ、Ｇ、
Ｃ、Ｕのいずれか任意のモノリボヌクレオチドを示し、
Ｌ及びＭは、Ｌが (3')-Ｃ-(5')であるときＭは(3')-Ｇ
-(5')であるか、Ｌが(3')-ＣＮp-(5')であるときＭは
(3')-Ｎ'pＧ-(5')である、いずれかの配列から選ばれ、
ここでＮはＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかを示し、Ｎ'はＮ
に相補的なヌクレオチドを示し、ｐは１〜１０の整数
で、Ｎp及びＮ'pはそれぞれ異なってもよいＮのｐ個の
ヌクレオチド配列及びＮ'のｐ個のヌクレオチド配列を
示し、Ｖ及びＷは、Ｖが(3')-ＡＧＹＡＧＵＣ-(5')であ
るときＷは(3')-ＡＡＧ-(5')であり、Ｖがヌクレオチド
無し、すなわち単なる結合手であるときＷも結合手であ
る、いずれかの配列又は結合手から選ばれ、Ｑ及びＲ
は、標的ＲＮＡの核酸塩基に相補するモノヌクレオチド
もしくはモノヌクレオチド類似体であって、Ａ、Ｇ、
Ｃ、Ｕ、アデニンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄ
Ａ）、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄ
Ｇ）、シトシンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＣ）
及びチミンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＴ）から
選ばれるモノヌクレオチドで、それらの類似体でもよ
く、配列Ｑ1n…Ｑ12 Ｑ11と配列Ｒ1n…Ｒ12 Ｒ11、及び
配列Ｑ21 Ｑ22…Ｑ2mと配列Ｒ21 Ｒ22…Ｒ2mは、互いに
同じであっても異なっていてもよく、ｍ及びｎは、整数
を示し、配列（Ｉ）及び（II）中の上段の数字は、ミニ
リボザイム中のモノヌクレオチドの位置を示す系統的番
号であり、また3'-Ｑ1n…Ｑ12Ｑ11Ａ と Ｑ21Ｑ22…Ｑ
2m-5'の配列、及び3'-Ｒ1n…Ｒ12Ｒ11と Ｒ21Ｒ22…Ｒ
2m-5'の配列は、標的ＲＮＡとの結合領域である。
【００１２】ここで、配列（Ｉ）、（II）においてＬが
(3')-Ｃ-(5')、Ｍが(3')-Ｇ-(5')、Ｖが(3')-ＡＧＹＡ
ＧＵＣ-(5')、Ｗが(3')-ＡＡＧ-(5')ある場合、一対の
ミニザイムは次の配列（Ｉ−ａ）及び（II−ａ）で表さ
れる。
【化７】 15.3 15.2 15.1 14 13 12 11 9 8 7 6 5 4 3 2.1 2.2 3'-Ｑ1n…Ｑ12 Ｑ11 Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ａ Ｇ Ｙ Ａ Ｇ Ｕ Ｃ Ｑ21 Ｑ22… Ｑ2m-5' （Ｉ−ａ）
【化８】 15.3 15.2 14 13 12 11 9 8 7 6 5 4 3 2.1 2.2 3'-Ｒ1n…Ｒ12 Ｑ11 Ａ Ａ Ｇ Ｇ Ａ Ｇ Ｙ Ａ Ｇ Ｕ Ｃ Ｒ21 Ｒ22… Ｒ2m-5' （II−ａ）
【００１３】配列（Ｉ）、（II）において、Ｌが(3')-
ＣＮp-(5')、Ｍが(3')-Ｎ'pＧ-(5')、ｐが１（すなわ
ち、Ｌが(3')-ＣＮ-(5')でＭが(3')-Ｎ'Ｇ-(5')）で、
ＮがＧ、Ｎ'がＣであり、Ｖが(3')-ＡＧＹＡＧＵＣ-
(5')、Ｗが(3')-ＡＡＧ-(5')の場合、一対のミニザイム
は次の配列（Ｉ−ｂ）及び（II−ｂ）で表される。
【化９】 15.3 15.2 15.1 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2.1 2.2 3'-Ｑ1n…Ｑ12 Ｑ11 Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｇ Ａ Ｇ Ｙ Ａ Ｇ Ｕ Ｃ Ｑ21 Ｑ22… Ｑ2m-5' （Ｉ−ｂ）
【化１０】 15.3 15.2 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2.1 2.2 3'-Ｒ1n…Ｒ12 Ｒ11 Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｇ Ａ Ｇ Ｙ Ａ Ｇ Ｕ Ｃ Ｒ21 Ｒ22… Ｒ2m-5' （II−ｂ）
【００１４】配列（Ｉ）、（II）において、Ｌが(3')-
ＣＮp-(5')、Ｍが(3')-Ｎ'pＧ-(5')、ｐが３（すなわ
ち、Ｌが(3')-ＣＮＮＮ-(5')でＭが(3')-Ｎ'Ｎ'Ｎ'Ｇ-
(5')）で、ＮＮＮがＧＣＧ、Ｎ'Ｎ'Ｎ'がＣＧＣであ
り、Ｖが(3')-ＡＧＹＡＧＵＣ-(5')でＷが(3')-ＡＡＧ-
(5')の場合、一対のミニザイムは次の配列（Ｉ−ｃ）及
び（II−ｃ）で表される。
【化１１】 15.3 15.2 15.1 14 13 12 11.1 11.2 10.2 10.1 9 8 7 6 5 3'-Ｑ1n…Ｑ12 Ｑ11 Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ Ａ Ｇ Ｙ Ａ Ｇ 4 3 2.1 2.2 Ｕ Ｃ Ｑ21 Ｑ22…Ｑ2m-5' （Ｉ−ｃ）
【化１２】 15.3 15.2 14 13 12 11.1 11.2 10.2 10.1 9 8 7 6 5 3'-Ｒ1n…Ｒ12 Ｒ11 Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ Ａ Ｇ Ｙ Ａ Ｇ 4 3 2.1 2.2 Ｕ Ｃ Ｒ21 Ｒ22…Ｒ2m-5' （II−ｃ）
【００１５】本発明の一対のミニザイムの好ましいひと
つの形態は、リボザイム・ダイマーが形成されるとき、
そのダイマーの二箇所の結合領域の一方は、標的ＲＮＡ
に対し結合能を有するがその結合部位を切断しないよう
に設計され、ダイマーの二箇所の結合領域の他方は、標
的ＲＮＡに対し結合能を有すると共にその結合部位を切
断するように設計された一対のミニザイム、である。
【００１６】ミニザイム・ダイマーが認識する二箇所の
結合領域のうちの一方を、標的ＲＮＡと結合能を有する
がその結合部位を切断しないように設計する利点は、 １）リボザイムのいわゆる「ＮＵＸルール」に制約され
ることなく、この結合領域を標的ＲＮＡとリボザイムの
特異結合に利用できること、 ２）この結合部位はリボザイムで切断されないので、ダ
イマー形成が保持され、もう一つの結合部位（切断部位
でもあり、ここではＮＵＸルールが支配する）における
リボザイム本来の切断活性が亢進される、と考えられ
る。
【００１７】本発明は、また、 次のミニザイム・ダイマーである。すなわち、前記
配列（Ｉ）と前記配列（II）の一対のミニザイムを混合
して形成される活性リボザイムであって、標的ＲＮＡに
対しては配列 3'−Ｑ1n…Ｑ12Ｑ11Ａ Ｒ21Ｒ22…Ｒ2m
−5' 及び配列 5'−Ｑ2m…Ｑ22Ｑ21 Ｒ11Ｒ12…Ｒ1n
−3'の二箇所の領域で結合することができる、下記ミニ
ザイム・ダイマー（Ｉ／II）である。
【００１８】
【化１３】 〔式中、＊は相補的塩基対を示し、Ｖ及びＷは、前記と
同じであり、Ｌ＊Ｍは、次のいずれかのステム構造を示
す。〕
【００１９】
【化１４】 Ｃ＊Ｇ、 又は Ｃ ＊Ｇ すなわち Ｃ＊Ｇ Ｃ＊Ｇ Ｃ＊Ｇ … Ｃ＊Ｇ Ｎp＊Ｎ'p Ｎ＊Ｎ'、 Ｎ＊Ｎ' Ｎ＊Ｎ' Ｎ＊Ｎ' Ｎ＊Ｎ'、Ｎ＊Ｎ' Ｎ＊Ｎ' Ｎ＊Ｎ'、 Ｎ＊Ｎ' Ｎ＊Ｎ' Ｎ＊Ｎ' Ｎ＊Ｎ' Ｎ＊Ｎ' Ｎ＊Ｎ' Ｎ＊Ｎ' Ｎ＊Ｎ'
【００２０】配列（Ｉ）と配列（II）のミニザイムの配
列が全く同じであるとき、形成されるミニザイム・ダイ
マー（Ｉ／II）はホモダイマーであり、配列（Ｉ）と配
列（II）のミニザイムの配列が異なるときは、形成され
るミニザイム・ダイマー（Ｉ／II）は、ヘテロダイマー
である。
【００２１】本発明のリボザイム・ダイマーの好ましい
ひとつの形態は、ダイマーが形成されるとき、ダイマー
の二箇所の結合領域の一方は、標的ＲＮＡに対し結合能
を有するがその結合部位を切断しないように設計され、
ダイマーの二箇所の結合領域の他方は、標的ＲＮＡに対
し結合能を有すると共にその結合部位を切断するように
設計されたミニザイム・ダイマーで、その利点は前述の
とおりである。
【００２２】また、本発明は、 前記した一対のミニザイム又はミニザイム・ダイマ
ーを利用する、標的ＲＮＡの切断・不活化方法、遺伝子
疾患治療薬あるいは遺伝子疾患診断薬である。
【００２３】本発明において、配列（Ｉ）又は配列（I
I）中のｍ及びｎの数（すなわち、ミニザイムの結合領
域の長さ）は、それぞれ２以上、好ましくは３〜２０の
整数である。２未満ではミニザイムの標的ＲＮＡへの特
異性が悪くなり、必要以上に大きな数となるとリボザイ
ム自体を化学合成する際の収率が下がり好ましくない。
【００２４】配列（Ｉ）又は配列（II）のミニザイムに
おける結合領域のヌクレオチド（すなわち、ＱやＲ）配
列は、標的ＲＮＡとの特異的結合に関係しリボザイム切
断活性（触媒能）にはあまり関係がない。そのためこの
結合領域のヌクレオチドは、ＲＮＡに代えて安定なＤＮ
Ａでもよい。また、ＲＮＡやＤＮＡに代えて、下記（化
１５）
【化１５】 〔Ｂは、アデニン、シトシン、グアニン又はチミンを示
す。〕のペプチド核酸（ＰＮＡ）等とすることもでき
る。
【００２５】また、配列（Ｉ）又は配列（II）のミニザ
イムにおける第７番のＹは、Ｕであるときに活性は最も
高いが、血中に多量含まれるＲＮase Ａ型のリボヌクレ
アーゼの攻撃から保護するため、これをＧ又はＡとして
もよい。
【００２６】本発明で用いる一対のミニザイム、及びそ
れを組合せて得られるミニザイム・ダイマーを安定に長
時間保たせるため、上記のように配列の一部をＲＮＡか
らＤＮＡへ替えたり、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等へ替え
る方法は有効な手段のひとつであるが、そのような方法
のほかにモノヌクレオチドのリン酸エステル基又はリボ
ース部分の水酸基を、そのミニザイムの活性を著しく低
下させない範囲で、他の安定な基に置き換えることも有
効である。具体的には、モノヌクレオチドのリン酸エス
テル基をチオリン酸エステル基〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（Ｏ
Ｈ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−Ｏ−〕やメ
チルホスホネート基〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＣＨ3）−Ｏ
−〕等で置き換えたり、モノヌクレオチドのリボース部
分の水酸基をメトキシやアリロキシ等のアルコキシ基、
アミノ基、又はフッ素原子等で置き換えることである。
【００２７】配列（Ｉ）又は配列（II）のミニザイムの
第３番のＣ、第４番のＵ、又は第７番のＹのモノリボヌ
クレオチドの３'側のリン酸エステル基はＲＮase Ａ型
のリボヌクレアーゼにより分解を受けやすい部位なの
で、この部分のリン酸エステル基をチオリン酸エステル
基やメチルホスホネート基等で置き換えることは、特に
有効である。
【００２８】配列（Ｉ）又は配列（II）のミニザイム、
又は上記のような方法でリボヌクレアーゼ等からの攻撃
を受けにくくした安定化ミニザイム（モノマー）は、基
本的にはいわゆる固相化学合成法のうちの、ベータシア
ノエチルホスホアミダイト法に基礎を置く方法で合成で
きる。メチルホスホアミダイトを用いた場合もチオフェ
ノールによる処理を追加するだけで、安定化ミニザイム
（モノマー）を製造できる。また、全てＲＮＡから構成
されるミニザイムは、ミニザイムＲＮＡをコードするＤ
ＮＡを化学合成し、これをベクターに挿入し、転写する
ことによって得ることもできる。
【００２９】安定化ミニザイムのうち、チオリン酸エス
テル結合型のものにはＲ型及びＳ型の立体異性体が存在
するが、これらはＲ型及びＳ型のいずれを用いてもよ
く、ＲＳ混合型を用いてもよい。
【００３０】また、配列（Ｉ）又は配列（II）のミニザ
イムの、３'−又は５'−末端の水酸基はリン酸化された
もの、あるいは遊離のもののいずれであってもよい。
【００３１】配列（Ｉ）と配列（II）（ＩとIIの配列は
同じであっても異なってもよい。同じである場合に形成
されるダイマーをホモ・ダイマー、異なる場合に形成さ
れるダイマーをヘテロ・ダイマーという。)で表される
ミニザイムが、化１３又は図３で示されるような２次構
造をとってその活性を発揮していることは、後述の実施
例における結果から支持される。
【００３２】化１３又は図３で示されるようなミニザイ
ム・ダイマーの２次構造は、ハンマーヘッド型リボザイ
ム（図１）の２次構造とよく類似していることが分か
る。しかし、ミニザイム・ダイマーがハンマーヘッド型
リボザイムと決定的に異なる点は、標的ＲＮＡとの結合
領域がハンマーヘッド型リボザイムにあっては１箇所で
あるのに対して、ミニザイム・ダイマーにおいては２箇
所存在することである。
【００３３】また、ミニザイム・ヘテロダイマーにあっ
ては、化１３に示されるように一方のミニザイム（モノ
マー）における標的ＲＮＡ結合領域の一部が他方の標的
ＲＮＡ結合領域の一部と入れ替わって、別の配列を認識
できるように変化していることである。更に本発明者ら
は、ミニザイム・ダイマーが標的ＲＮＡに対して結合領
域を２箇所もつということに着目すると、従来のリボザ
イムでは必然的に伴ったＮＵＸルールにほとんど制約さ
れないことに気が付いた。
【００３４】本発明の一対のミニザイム、又はこれらを
組み合わせて形成されるミニザイム・ダイマーは標的Ｒ
ＮＡを切断又は不活化するので、ヒトの遺伝子疾患の治
療用又は遺伝子疾患の診断用として、有用に利用でき
る。ここでは、染色体転座によって引き起こされる異常
ｍＲＮＡを例にとり、異常ｍＲＮＡを標的とする「リボ
ザイムによるがんの遺伝子治療」への応用とその原理に
ついて、以下に簡単に述べる。図６は、ゲノムＤＮＡか
らｍＲＮＡへの転写と異常タンパク質の生成・発がんを
示す説明図である。ヒトのような真核細胞においては、
ＤＮＡからＲＮＡへ転写が進行する過程でイントロン
（介在配列）が除かれ、エキソンの連なった成熟ＲＮＡ
を生成する。健常人では、図６に示すようにエキソン１
−エキソン２と繋がって成熟ｍＲＮＡを生成されるとこ
ろ、急性リンパ性白血病患者等ではエキソン１−エキソ
ン３のように繋がって異常ｍＲＮＡが生成されることが
知られている。図６における正常ｍＲＮＡと異常ｍＲＮ
Ａとの違いが、ジャンクション近傍のみにあり他の配列
は同じとすると、両者をリボザイムで区別し、異常ｍＲ
ＮＡのみを切断・不活化しようとする場合、従来のリボ
ザイムでは切断部位は必然的にジャンクション近傍に求
めなければならない。ジャンクション近傍に「ＮＵＸ」
配列があれば、これを利用してリボザイムの結合領域の
配列を設計し、異常ｍＲＮＡを切断・不活化することが
できる。しかし、急性リンパ性白血病のような場合に
は、ジャンクション近傍に「ＮＵＸ」配列がなくジャン
クション部から離れたところに「ＮＵＸ」配列があっ
て、従来のリボザイムでは異常ｍＲＮＡだけを切断・不
活化することは不可能であった。
【００３５】一方、本発明の一対のミニザイム、又はこ
れらを組み合わせて形成されるミニザイム・ダイマー
は、２箇所の領域で標的ＲＮＡを認識できる。そのた
め、標的ＲＮＡの一方の領域にＮＵＸ配列が無くとも、
他方の領域にＮＵＸ配列があればその標的ＲＮＡは本発
明の一対のミニザイム又はミニザイム・ダイマーによっ
て特異的に切断・失活させることができるのである。後
述の急性リンパ性白血病のbcr-abl mRNAの例（実施例
２）は、その一例である。
【００３６】本発明の一対のミニザイム又はミニザイム
・ダイマーはヒトの遺伝子疾患の治療用又は遺伝子疾患
の診断用としてばかりでなく、動物用もしくは農薬用薬
剤等として有効に利用することができる。標的ＲＮＡと
しては、種々病原性のウィルス由来のＲＮＡ、がん遺伝
子由来のＲＮＡ、細胞の増殖・分化に関係する遺伝子由
来のＲＮＡ等がある。切断又は不活化の反応は、適宜好
適な条件を選べばよいが、例えば、５〜５００ｍＭのマ
グネシウム又はマンガンイオンの存在下、ｐＨ８．０±
３．０、温度２０〜７０℃で行うことができる。医薬と
しては例えば、エイズ、白血病、各種悪性腫瘍、流行性
結膜炎等の治療用医薬がある。動物薬としては例えば、
牛、豚、ニワトリ、イヌ、ネコ等の各種ウィルス病の治
療用動物薬がある。農薬としては例えば、タバコモザイ
ク病、イネ萎縮病、キュウリモザイク病等の各種植物ウ
ィルス病に対する農薬等がある。
【００３７】
【実施例】以下実施例により、本発明を詳細に説明す
る。 実施例１ 合成基質Ｓ１１を切断するミニザイム・ダイ
マー （１）ミニザイム設計のストラテジー 標的のモデルＲＮＡとして、配列番号７の合成基質Ｓ１
１を用いた。Ｓ１１の核酸配列は５’−ＧＣＣＧＵＣ↓
ＣＣＣＣＧ−３’（↓はミニザイムで切断される箇所）
で、５’末端は32Ｐで標識されている。図４に本発明の
ミニザイム・ヘテロダイマーで基質Ｓ１１を切断する場
合の、一対のミニザイム設計のストラテジーを示した。
図４において、（Ａ）はミニザイムＭｚＬ（ダイマーを
化１３のように表すとき、左側にくるのでＭｚＬと略記
する。）を示し、（Ｂ）はミニザイムＭｚＲ（ダイマー
を化１３のように表すとき、右側にくるのでＭｚＲと略
記する。）を示し、（Ｃ）は一対のミニザイムＭｚＬ及
びＭｚＲから形成されるヘテロ・ダイマーＭｚＬ／Ｍｚ
Ｒの２次構造、基質（Ｓ１１）及び擬似基質（５’−Ｇ
ＧＡＡＣＧＵｄＣＧＵＣＧＵＣＧ−３’。ミニザイムで
は切断されない。）との結合（２次構造）を示す。
【００３８】（２）一対のミニザイムの合成 先ず、次の配列番号３のミニザイムＭｚＬを合成した。
【化１６】 15.1 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2.1 3'-ＣＧＧ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｇ Ａ Ｇ Ｕ Ａ Ｇ Ｕ Ｃ Ｃ ＡＧＵＡＧＣ-5' （配列番号：３） 式中、下線部は標的ＲＮＡとの結合領域示す（以下、同
じ）。
【００３９】ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（アプライドバイ
オシステムズ社製、３８０Ｂ型）にＣ−ＣＰＧカラム
（シトシン量:１μｍｏｌ）を装着した後、バージョン
１．３４のプログラムを用いて、以下の（1）〜（5）の
手順で行った。
【００４０】（1）２％(ｗ／ｖ)トリクロル酢酸のジク
ロルメタン溶液を１．６ｍｌ／ｍｉｎで５０秒間カラム
に流して、５'−水酸基のジメトキシトリチル基を外
す。 （2）アセトニトリルでカラムを洗浄した後、５’−Ｏ
−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチル
シリル−グアノシン−Ｎ2−イソブチリル−Ｎ，Ｎ’−
ジイソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイトの
アセトニトリル溶液（７７ｍｇ／ｍｌ）及び４％（ｗ／
ｖ）テトラゾールのアセトニトリル溶液の１：１（容量
比）混合液を１．５ｍｌ／ｍｉｎで１０秒間給液したの
ち、１０分間保持し、反応を起こさせてホスファイト結
合を形成させる。 （3）アセトニトリルでカラムを洗浄後、１０％（ｖ／
ｖ）無水酢酸及び１０％（ｖ／ｖ）２，６−ルチジンを
含むテトラヒドロフラン溶液と１６％（ｖ／ｖ）１−メ
チルイミダゾールを含むテトラヒドロフラン溶液の１：
１（容量比）混合液を１．５ｍｌ／ｍｉｎで２０秒間流
し、未反応の５'−水酸基をアセチル化する。 （4）アセトニトリルで洗浄後、３％（ｗ／ｖ）ヨウ
素、２０％(ｖ／ｖ)ピリジン、及び２％（ｖ／ｖ）Ｈ2
Ｏを含むテトラヒドロフラン溶液を１．６ml/minで２５
秒間流し、２０秒間放置し、ホスファイト結合をホスフ
ェート結合に酸化したのち、再びアセトニトリルで洗浄
する。 （5）上記の（1）〜（4）の工程を、配列番号：３の
３’側から数えて３番目以降の核酸塩基配列に従って繰
り返す。
【００４１】ここで、手順（2）のアミダイト試薬は、
Ａの場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−
ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−Ｎ6−ベンゾ
イル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルアミノシアノエチルホ
スホアミダイト、Ｇの場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシ
ン−Ｎ2−イソブチリル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルア
ミノシアノエチルホスホアミダイト、Ｃの場合、５’−
Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチ
ルシリル−シチジン−Ｎ4−ベンゾイル−Ｎ，Ｎ’−ジ
イソプロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、Ｕ
の場合、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ
−ブチルジメチルシリル−ウリジン−Ｎ，Ｎ’−ジイソ
プロピルアミノシアノエチルホスホアミダイト、を用い
る。
【００４２】すべてのアミダイト試薬の反応を終えた
後、５'−水酸基の保護基を手順（1）と同様の方法で除
去し、２８％アンモニアとエタノールの３：１（容量
比）混合液を１８秒間流し、１５分間放置したのちカラ
ムから合成物を切り出した。この切り出しの操作は更に
３回繰り返した。次に合成物を、５５℃で８時間処理
し、核酸塩基及びリン酸基の保護基を外した。アンモニ
アとエタノールを減圧して除去後、適量の水に溶解し、
波長２６０ｎｍの吸光度を測定し、水を減圧除去した
後、１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドのテト
ラヒドロフラン溶液（以下、ＴＢＡＦと略す）に溶解
し、室温で１２時間放置し、２'−水酸基の保護基を除
去した。加えたＴＢＡＦと同容量の０．１Ｍのトリエチ
ルアンモニウム−酢酸緩衝液（以下、ＴＥＡＡと略す）
を加え、ペレット状になるまで凍結乾燥した。
【００４３】次に、このペレットをＯＰＣカラム（アプ
ライドバイオシステムズ社製）で精製した。すなわち、
カラムを先ず、５ｍｌのアセトニトリル、次いで５ｍｌ
の２Ｍ ＴＥＡＡの順で洗浄し、これに予め０．１Ｍ Ｔ
ＥＡＡ１ｍｌで溶解したペレット溶解液を１〜２滴／秒
の速さで流し、通過液を再び同様にカラムに流して目的
物を吸着させた。５ｍｌの０．１Ｍ ＴＥＡＡ、続いて
１０ｍｌの脱イオン水の順でカラムを洗浄後、５０％
（ｖ／ｖ）アセトニトリル１．８ｍｌを１〜２滴／秒で
流し、目的物を溶出した。
【００４４】溶出液は更にＦＰＬＣ（ファルマシア社
製）で精製した。すなわち、カラムはＰｅｐＲＰＣ Ｈ
Ｒ１０／１０、カラム温度は４０℃、流速は２ｍｌ／ｍ
ｉｎとし、移動相は初期濃度が１０％（ｖ／ｖ）のアセ
トニトリルを含む０．１Ｍ ＴＥＡＡとして、カラムに
溶出液を負荷後、移動相中のアセトニトリル濃度を１時
間かけて１０％（ｖ／ｖ）から６０％（ｖ／ｖ）に直線
的に増加させ、目的物を溶出した。なお、目的物の溶出
位置は２５４ｎｍの吸光度を測定し、モニターした。
【００４５】同様にして、上記ミニザイムの相手ペアと
なる、次の配列番号４のミニザイムＭｚＲを合成した。
【化１７】 15.1 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2.1 3'-ＣＣＵＵＧ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｇ Ａ Ｇ Ｕ Ａ Ｇ Ｕ Ｃ Ｇ ＧＧＧＣ-5' （配列番号：４）
【００４６】（３）ミニザイム・ヘテロダイマーによる
基質の切断 ６本の反応容器を用意し、それぞれ次の内容物を入れ反
応させた。６本の反応容器の組成は次の通りであり、用
いた緩衝液は２５ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）である。 容器１：Ｓ１１（０．２μＭ）； 容器２：Ｓ１１（０．２μＭ）＋ＭｚＬ（１μＭ）； 容器３：Ｓ１１（０．２μＭ）＋ＭｚＬ（１μＭ）＋Ｍ
ｚＲ（１μＭ）； 容器４：Ｓ１１（０．２μＭ）＋ＭｚＲ（１μＭ）； 容器５：Ｓ１１（０．２μＭ）＋ＭｚＬ（１μＭ）＋擬
似基質（２.５μＭ）; 容器６：Ｓ１１（０．２μＭ）＋ＭｚＬ（１μＭ）＋Ｍ
ｚＲ（１μＭ）＋擬似基質（２．５μＭ）。 なお、用いた擬似基質は５’−ＧＧＡＡＣＧＵｄＣＧＵ
ＣＧＵＣＧ−３’でミニザイムでは切断されない。
【００４７】これらを３７℃で４分間反応させ、その
後、反応停止液（９Ｍ尿素、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．１％キシレンシアノール及び０．１％ブロモフェノ
ールブルーを含む）を加え、２０％ポリアクリルアミ
ド、７Ｍ尿素の変性ゲル中で電気泳動を行ない、イメー
ジアナライザを用いて分析した。電気泳動の結果を図５
に示した。図５から、基質のＳ１１は、ＭｚＬ又はＭｚ
Ｒの単独では切断されないが、ＭｚＬとＭｚＲの両者を
加えることによって良く切断されること（レーン３）、
また、Ｓ１１と共に擬似基質を加えることによって基質
Ｓ１１は更に良く切断されることが分かる（レーン
６）。
【００４８】実施例２ 異常キメラｍＲＮＡ（Bcr ex2-
Abl ex2）を切断するミニザイム・ダイマー （１）ミニザイム・ダイマー設計のストラテジー 図７に正常ｍＲＮＡ（Abl ex1-Abl ex2）を認識せず、
異常キメラｍＲＮＡ（Bcr ex2-Abl ex2）のみを認識・
切断するヘテロダイマーを設計するストラテジーを示し
た。図７において、（Ａ）はスプライシングにより生成
する正常ｍＲＮＡ（Abl ex1-Abl ex2）のジャンクショ
ン部位のＲＮＡ配列、（Ｂ）は異常キメラｍＲＮＡ（Bc
r ex2-Abl ex2）のジャンクション部位のＲＮＡ配列で
あり、（Ｃ）は後者の異常キメラｍＲＮＡのジャンクシ
ョン部位のＲＮＡ配列を特異的に認識するように設計さ
れたミニザイム・ヘテロダイマー（ＭｚＬ／ＭｚＲ）
と、異常キメラｍＲＮＡ（Bcr ex2-Abl ex2）とが形成
する基質／ミニザイム・ヘテロダイマー複合体及び基質
の切断箇所を示す。
【００４９】（２）一対のミニザイムの合成 前記ミニザイム・ダイマー設計のストラテジーに沿っ
て、次の配列番号５のミニザイムＭｚＬを合成した。
【化１８】 15.1 14 13 12 11.1 2.1 3'-ＧＧＡＧＵＣＣＣ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｕ Ａ Ｃ ＵＵＵＣＵＵＣＧＧＧＡＡ Ｇ -5' （配列番号：５）
【００５０】同様にして、上記ミニザイムの相手ペアと
なる、次の配列番号６のミニザイムＭｚＲを合成した。
【化１９】 10.1 9 8 7 6 5 4 3 2.1 3'-ＧＡＣＵＧＧＵＡＧＵＵＡＵＵ Ｇ Ａ Ｇ Ａ Ｇ Ｕ Ａ Ｇ Ｕ Ｃ Ａ ＣＵＣ ＡＣ -5' （配列番号：６）
【００５１】（３）ミニザイム・ヘテロダイマーによる
基質の切断 ６本の反応容器を用意し、それぞれ次の内容物を入れ反
応させた。６本の反応容器の組成は次の通りであり、用
いた緩衝液は２５ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）である。 容器１：基質Ｓ１６（０．２μＭ）； 容器２：基質Ｓ１６（０．２μＭ）＋ＭｚＬ（１μ
Ｍ）； 容器３：基質Ｓ１６（０．２μＭ）＋ＭｚＲ（１μ
Ｍ）； 容器４：基質Ｓ１６（０．２μＭ）＋ＭｚＬ（１μＭ）
＋ＭｚＲ（１μＭ）； 容器５：基質Ｓ１６（０．２μＭ）＋ＭｚＬ（１μＭ）
＋ＭｚＲ（１μＭ）＋Abl ex1-Abl ex2（２．５μ
Ｍ）； 容器６：基質（０．２μＭ）＋ＭｚＬ（２μＭ）＋Ｍｚ
Ｒ（１μＭ）＋Bcr ex2-Abl ex2（２．５μＭ）。 なお、用いた基質Ｓ１６は配列番号８の５’−ＣＣＵＣ
ＡＧＧＧＵＣ↓ＵＧＡＧＵＧ−３’（↓はミニザイムで
切断される箇所）で、５’末端は32Ｐで標識されてい
る。
【００５２】これらを３７℃で４分間反応させ、その
後、反応停止液（９Ｍ尿素、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．１％キシレンシアノール及び０．１％ブロモフェノ
ールブルーを含む）を加え、２０％ポリアクリルアミ
ド、７Ｍ尿素の変性ゲル中で電気泳動を行ない、イメー
ジアナライザを用いて分析した。電気泳動の結果を図８
に示した。基質はＭｚＬ又はＭｚＲの単独では切断され
ず、ＭｚＬ及びＭｚＲの両者を加えても切断されず、Ｍ
ｚＬ及びＭｚＲの両者にAbl ex1-Abl ex2が添加されて
も切断されず、ＭｚＬ及びＭｚＲの両者にBcr ex2-Abl
ex2を加えて初めて切断されること（レーン６）を、図
８は示している。これは、本発明の方法によって、正常
ｍＲＮＡ（Abl ex1-Abl ex2）と異常キメラｍＲＮＡ（B
cr ex2-Abl ex2）が区別され、異常キメラｍＲＮＡ（Bc
r ex2-Abl ex2）のみを切断、不活化できることを示す
ものである。
【００５３】実施例３ 安定化ミニザイムの合成
【化２０】 15.5 15.3 15.1 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2.1 3'-dＣ┬dＧ┬dＧ┬Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｇ Ａ Ｇ Ｇ Ａ Ｇ┬Ｕ┬Ｃ┬dＧ┬ 2.2 2.3 2.4 2.5 dＧ┬dＧ┬dＧ┬dＣ-5' （Ｖ） 〔式中、┬はチオリン酸結合を示す。〕
【００５４】ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置にｄＣ−ＣＰＧカ
ラム（シトシン量:１μｍｏｌ）を装着した後、バージ
ョン１．３４のプログラムを用いて、以下の（1）〜
（5）の手順で、安定化ミニザイムを合成した。
【００５５】（1）２％(ｗ／ｖ)トリクロル酢酸のジク
ロルメタン溶液を１．６ｍｌ／ｍｉｎで５０秒間カラム
に流して、５'−水酸基のジメトキシトリチル基を外
す。 （2）アセトニトリルでカラムを洗浄した後、５’−Ｏ
−ジメトキシトリチルデオキシグアノシン−Ｎ2−イソ
ブチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノエチルホスホア
ミダイトのアセトニトリル溶液（７７ｍｇ／ｍｌ）及び
４％（ｗ／ｖ）テトラゾールのアセトニトリル溶液の
１：１（容量比）混合液を１．５ｍｌ／ｍｉｎで１０秒
間給液し、３０秒間保持し、縮合反応を起こさせてホス
ファイト結合を形成させる。 （3）アセトニトリルでカラムを洗浄後、１０％（ｖ／
ｖ）無水酢酸及び１０％（ｖ／ｖ）２，６−ルチジンを
含むテトラヒドロフラン溶液と１６％（ｖ／ｖ）１−メ
チルイミダゾールを含むテトラヒドロフラン溶液の１：
１（容量比）混合液を１．５ｍｌ／ｍｉｎで２０秒間流
し、未反応の５'−水酸基をアセチル化する。 （4）アセトニトリルで洗浄後、１５％テトラエチルチ
ウラムジサルファイドを含むアセトニトリル溶液を１.
６ ml／minで２３秒間流し、１５分間放置し、ホスファ
イト結合をチオリン酸結合に酸化し、再びアセトニトリ
ルで洗浄する。 （5）配列（Ｖ）に示した３’側からの３番目以降の核
酸塩基配列に従い、またその配列がＤＮＡであるかＲＮ
Ａであるか、及びホスフェート結合であるかチオリン酸
結合であるかに対応させて、上記（1）〜（4）の工程又
は実施例１（２）の（1）〜（4）の工程を、繰り返す。
【００５６】ここで、手順（2）のアミダイト試薬は、
Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵの場合、前記実施例１で述べたそれぞ
れのアミダイト試薬と同じであり、また、ｄＡ、ｄＧ及
びｄＣの場合、前記実施例2で述べたそれぞれのアミダ
イト試薬と同じである。アミダイト試薬の糖部分がデオ
キシリボースの場合は上記(2)に記載の方法で、リボー
スの場合はアミダイト試薬のアセトニトリル溶液（７７
ｍｇ／ｍｌ）と４％（ｗ／ｖ）テトラゾールのアセトニ
トリル溶液の１：１（容量比）混合液を用いて１．５ｍ
ｌ／ｍｉｎで１０秒間給液した後、１０分間保持し、縮
合反応を起こさせホスファイト結合を形成させた。
【００５７】また、チオリン酸結合ではなく、ホスフェ
ート結合を形成させる場合は、手順（4）の「１５％テ
トラエチルチウラムジサルファイドを含むアセトニトリ
ル溶液を１．６ｍｌ／ｍｉｎで２３秒間流し、１５分間
放置」する代わりに、「３％（ｗ／ｖ）ヨウ素、２０％
(ｖ／ｖ)ピリジン、及び２％（ｖ／ｖ）Ｈ2Ｏを含むテ
トラヒドロフラン溶液を１．６ml/minで２５秒間流し、
２０秒間放置」し、ホスファイト結合をホスフェート結
合に酸化した。
【００５８】すべてのアミダイト試薬の反応を終えた
後、実施例１（２）と同様な方法で、切り出し、脱保護
基、凍結乾燥、ＯＰＣカラムによる精製及びＦＰＬＣに
よる精製を行なった。
【００５９】
【発明の効果】本発明の一対のミニザイム又はミニザイ
ム・ダイマーは、以下のような利点や効果がある。 （１）標的ＲＮＡを２箇所の領域で認識・切断可能であ
る。 （２）標的ＲＮＡのリボザイム結合領域中に５’−ＮＵ
Ｘ−３’配列がなくとも、（標的ＲＮＡの他の箇所に
５’−ＮＵＸ−３’配列があれば）標的ＲＮＡを特異的
に切断・失活させることができる。 （３）標的ＲＮＡの２箇所の領域を認識してリボザイム
切断活性を発揮するので、基質特異性が高い。 （４）正常ｍＲＮＡと異常ｍＲＮＡのように両者の塩基
配列が互いに類似していてもこれを区別することができ
る。どちらか一方のみを切断・失活させ、あるいは検出
することもできる。
【００６０】
【配列表】
【００６１】配列番号：１ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＲＮＡ 配列 CGGGGCUGAU GAGGCCGAAA GGCCGAAACG GC
３２
【００６２】配列番号：２ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＲＮＡ 配列 ＣＧＧＧＧＣＵＧＡＵ ＧＡＧＣＧＡＡＡＣＧ ＧＣ
22
【００６３】配列番号：３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＲＮＡ 配列 CGAUGACCUG AUGAGCGAAA CGGC 24
【００６４】配列番号：４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＲＮＡ 配列 CGGGGCUGAU GAGCGAAACG UUCC 24
【００６５】配列番号：５ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＲＮＡ 配列 GAAGGGCUUC UUUCAUCGAA ACCCUGAGG 29
【００６６】配列番号：６ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＲＮＡ 配列 CACUCACUGA UGAGAGUUAU UGAUGGUCAG 30
【００６７】配列番号：７ 配列の長さ：１１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＲＮＡ 配列 GCCGUCCCCC G 11
【００６８】配列番号：８ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＲＮＡ 配列 CCUCAGGGUC UGAGUG 16
【図面の簡単な説明】
【図１】ハンマーヘッド型リボザイムとその系統的番号
付け、基質（標的ＲＮＡ）／リボザイム複合体及び標的
ＲＮＡの切断部位を示す模式図である。
【図２】ミニザイム（モノマー）とその系統的番号付
け、基質（標的ＲＮＡ）／ミニザイム複合体及び標的Ｒ
ＮＡの切断部位を示す模式図である。
【図３】配列番号２のミニザイムのダイマー（ホモ型）
形成とその２次構造を示す模式図である。
【図４】ミニザイム・ヘテロダイマーによる合成基質Ｓ
１１切断のストラテジーを説明する図である。（Ａ）は
ミニザイムＭｚＬ、（Ｂ）はミニザイムＭｚＲ、（Ｃ）
はミニザイムＭｚＬとミニザイムＭｚＲから形成される
ヘテロダイマーＭｚＬ／ＭｚＲ、基質及び擬似基質との
結合を示す。
【図５】ミニザイム・ヘテロダイマーＭｚＬ／ＭｚＲに
よる基質の切断と、擬似基質添加による切断活性の亢進
を示す電気泳動図である。Ｓは基質（Ｓ１１）、Ｐは分
解産物。レーン１は、基質（Ｓ１１）のみ；レーン２
は、基質（Ｓ１１）＋ＭｚＬ；レーン３は、基質（Ｓ１
１）＋ＭｚＬ＋ＭｚＲ；レーン４は、基質（Ｓ１１）＋
ＭｚＲ；レーン５は、基質（Ｓ１１）＋ＭｚＬ＋擬似基
質；レーン６は、基質（Ｓ１１）＋ＭｚＬ＋ＭｚＲ＋擬
似基質。
【図６】ゲノムＤＮＡからｍＲＮＡへの転写と異常タン
パク質の生成・発がんを模式的に示す説明図である。
【図７】正常ｍＲＮＡ（Abl ex1-Abl ex2）を認識せ
ず、異常キメラｍＲＮＡ（Bcr ex2-Abl ex2）のみを認
識・切断するミニザイム・ヘテロダイマー設計のストラ
テジーを説明する図である。（Ａ）は正常mRNA（Abl ex
1-Abl ex2）が生成するジャンクション部分のｍＲＮＡ
の塩基配列を示し、（Ｂ）は異常キメラｍＲＮＡ（Bcr
ex2-Abl ex2）が生成するジャンクション部分のｍＲＮ
Ａの塩基配列を示し、（Ｃ）は異常キメラｍＲＮＡのみ
を認識し切断するミニザイム・ヘテロダイマーとそのダ
イマーがジャンクション部分から離れた部位のＲＮＡ配
列を切断する図である。
【図８】設計されたミニザイム・ヘテロダイマーは正常
ｍＲＮＡ（Abl ex1-Abl ex2）を認識せず、異常キメラ
ｍＲＮＡ（Bcr ex2-Abl ex2）のみを認識・切断するこ
とを示す電気泳動図である。Ｓは基質（Ｓ１６）、Ｐは
分解産物。レーン１は、基質（Ｓ１６）のみ；レーン２
は、基質（Ｓ１６）＋ＭｚＬ；レーン３は、基質（Ｓ１
６）＋ＭｚＲ；レーン４は、基質（Ｓ１６）＋ＭｚＬ＋
ＭｚＲ；レーン５は、基質（Ｓ１６）＋ＭｚＬ＋ＭｚＲ
＋Abl ex1-Abl ex2；レーン６は、基質（Ｓ１６）＋Ｍ
ｚＬ＋ＭｚＲ＋Bcr ex2-Abl ex2。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/02 Ｃ０７Ｈ 21/02 21/04 21/04 Ｂ Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｎ 9/16 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ // Ａ０１Ｎ 63/00 Ａ０１Ｎ 63/00 Ｄ (72)発明者 多比良 和誠 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 西川 諭 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 山田 亮 茨城県つくば市和台48 日立化成工業株式 会社筑波開発研究所内 (72)発明者 花田 和紀 東京都豊島区高田三丁目24番１号 大正製 薬株式会社内

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の配列（Ｉ） 【化１】 15.3 15.2 15.1 14 13 12 2.1 2.2 3'-Ｑ1n…Ｑ12 Ｑ11 Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｌ Ｖ Ｑ21 Ｑ22…Ｑ2m-5' （Ｉ） で表されるミニリボザイムと、次の配列（II） 【化２】 15.2 15.1 9 8 7 6 5 4 3 2.1 2.2 3'-Ｒ1n…Ｒ12 Ｒ11 Ｗ Ｍ Ａ Ｇ Ｙ Ａ Ｇ Ｕ Ｃ Ｒ21 Ｒ22…Ｒ2m-5'（II） で表されるミニリボザイムとの組合せからなる、一対の
    ミニリボザイム。〔但し、配列（Ｉ）及び（II）中、Ａ
    はアデニンモノリボヌクレオチド、Ｇはグアニンモノリ
    ボヌクレオチド、Ｃはシトシンモノリボヌクレオチド、
    Ｕはウラシルモノリボヌクレオチドを示し、 Ｙは、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕのいずれか任意のモノリボヌクレ
    オチドを示し、 Ｌ及びＭは、Ｌが (3')-Ｃ-(5')であるときＭは(3')-Ｇ
    -(5')であるか、Ｌが(3')-ＣＮp-(5')であるときＭは
    (3')-Ｎ'pＧ-(5')である、いずれかの配列から選ばれ、
    ここでＮはＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃのいずれかを示し、Ｎ'はＮ
    に相補的なヌクレオチドを示し、ｐは１〜１０の整数
    で、Ｎp及びＮ'pはそれぞれ異なってもよいＮのｐ個の
    ヌクレオチド配列及びＮ'のｐ個のヌクレオチド配列を
    示し、 Ｖ及びＷは、Ｖが(3')-ＡＧＹＡＧＵＣ-(5')であるとき
    Ｗは(3')-ＡＡＧ-(5')であるか、Ｖが結合手であるとき
    Ｗは結合手である、いずれかの配列又は結合手から選ば
    れ、 Ｑ及びＲは、標的ＲＮＡの核酸塩基に相補するモノヌク
    レオチドもしくはモノヌクレオチド類似体であって、
    Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、アデニンモノデオキシリボヌクレオチ
    ド（ｄＡ）、グアニンモノデオキシリボヌクレオチド
    （ｄＧ）、シトシンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄ
    Ｃ）及びチミンモノデオキシリボヌクレオチド（ｄＴ）
    から選ばれるモノヌクレオチドで、それらの類似体でも
    よく、 配列Ｑ1n…Ｑ12 Ｑ11と配列Ｒ1n…Ｒ12 Ｒ11、及び配列
    Ｑ21 Ｑ22…Ｑ2mと配列Ｒ21 Ｒ22…Ｒ2mは、互いに同じ
    であっても異なっていてもよく、 ｍ及びｎは、整数を示し、 配列（Ｉ）及び（II）中の上段の数字は、ミニリボザイ
    ム中のモノヌクレオチドの位置を示す系統的番号であ
    り、また3'-Ｑ1n…Ｑ12Ｑ11Ａ と Ｑ21Ｑ22…Ｑ2m-5'
    の配列、及び3'-Ｒ1n…Ｒ12Ｒ11Ａ と Ｒ21Ｒ22…Ｒ
    2m-5'の配列は、標的ＲＮＡとの結合領域である。〕
  2. 【請求項２】請求項１の一対のミニリボザイムを混合し
    て形成される活性リボザイムであって、標的ＲＮＡに対
    しては配列 3'−Ｑ1n…Ｑ12Ｑ11Ａ Ｒ21Ｒ22…Ｒ2m−
    5' 及び配列 5'−Ｑ2m…Ｑ22Ｑ21 Ｒ11Ｒ12…Ｒ1n−
    3'の二箇所の領域で結合することができる、下記ミニリ
    ボザイム・ダイマー。 【化３】 〔式中、＊は相補的塩基対を示し、 Ｖ及びＷは、前記と同じであり、 Ｌ＊Ｍは、次のいずれかのステム構造を示す。〕 【化４】 〔但し、Ｎp及びＮ'pは前記と同じである。〕
  3. 【請求項３】請求項２のダイマーが形成されるとき、そ
    のダイマーの二箇所の結合領域の一方は、標的ＲＮＡに
    対し結合能を有するがその結合部位を切断しないように
    設計され、ダイマーの二箇所の結合領域の他方は、標的
    ＲＮＡに対し結合能を有すると共にその結合部位を切断
    するように設計された、請求項１の一対のミニリボザイ
    ム。
  4. 【請求項４】ダイマーの二箇所の結合領域の一方は、標
    的ＲＮＡに対し結合能を有するがその結合部位を切断し
    ないように設計され、ダイマーの二箇所の結合領域の他
    方は、標的ＲＮＡに対し結合能を有すると共にその結合
    部位を切断するように設計された、請求項２のミニリボ
    ザイム・ダイマー。
  5. 【請求項５】請求項１又は３のいずれか一対のミニリボ
    ザイムによる、ＲＮＡの切断・不活化方法。
  6. 【請求項６】請求項２又は４のいずれかのミニリボザイ
    ム・ダイマーによる、ＲＮＡの切断・不活化方法。
  7. 【請求項７】請求項１又は３のいずれか一対のミニリボ
    ザイムを含む、遺伝子疾患治療薬。
  8. 【請求項８】請求項２又は４のいずれかのミニリボザイ
    ム・ダイマーを有効成分とする、遺伝子疾患治療薬。
  9. 【請求項９】請求項１又は３のいずれかの一対のミニリ
    ボザイムを含む、遺伝子疾患診断薬。
  10. 【請求項１０】請求項２又は４のいずれかのミニリボザ
    イム・ダイマーを有効成分とする、遺伝子疾患診断薬。
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