CN108586448A - 一种喹啉鎓盐型化合物及其应用 - Google Patents

一种喹啉鎓盐型化合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及荧光分子技术领域，特别是一种喹啉鎓盐型化合物及其应用，尤其是与核酸和核苷酸结合的喹啉鎓盐型化合物及其应用。本发明的喹啉鎓盐型化合物用作发光型荧光分子时，能够与特定的DNA序列结合，从而识别DNA结构或核苷酸。本发明喹啉鎓盐型化合物用作荧光分子时在生理溶液中背景荧光很弱，与目标分析物反应后，荧光信号显著增强。此外，本发明的喹啉鎓盐型化合物在水性介质中具有良好的溶解性以及良好的光稳定性，可在420‑500nm波长激发，与目标分析物作用后的发射波长在550‑650nm。本发明的喹啉鎓盐型化合物可以用作凝胶电泳和活细胞成像中的染色剂。

Description

一种喹啉鎓盐型化合物及其应用
技术领域
本发明涉及荧光分子技术领域，特别是一种喹啉鎓盐型化合物及其应用，尤其是与核酸和核苷酸结合的喹啉鎓盐型化合物及其应用。
背景技术
在生物化学和临床诊断中，体外或体内目标分子的可视化具有非常重要的现实意义。目前，与目标分子的可视化相关的荧光成像技术、成像实验和分析方法均需要借助荧光分子来实现，并要求这些荧光分子具有结构简单、灵敏度高、光稳定性好、生物相容性好、易于合成以及成本低等特点。目前，对于目标分子物核酸或核苷酸，已经开发了大量的“点亮型(turn-on)”荧光分子，包括苯并咪唑型、苯并吲哚型、苯并噻唑型、黄连素型、香豆素型、花菁型，喹啉型、哌嗪型和硫黄素型。这些荧光分子自身的荧光量子产率很低，与更高阶形式的DNA结合(如G-四联体DNA结构)后，荧光量子产率急剧增加。在所报道的荧光分子中，用于检测DNA的喹啉鎓盐型荧光探针分子比较罕见。由于DNA或核苷酸残基与很多疾病息息相关，因此急需快速方便的发光型荧光探针分子，用于检测序列特异性DNA或核苷酸残基并监测其生物活性，进而开发用于诊断或治疗疾病的抑制剂。
由于其简单、成本低、灵敏度高和高通量筛选的可操作性，基于发光型荧光分子的光学方法在DNA或其它生物分子检测中具有非常大的潜力。在基于发光型荧光分子的光学方法中，通过调节激发和发射波长，可以容易地实现发光检测的选择性。此外，这种光学方法提供了快速和连续的可视化信号，允许通过显微镜实时监测并对细胞成像。另外，这种光学方法还避免了与放射成像曝光和/或放射性废物处置有关的问题。
发明内容
本发明涉及喹啉鎓盐型化合物，所述化合物能够用作发光型荧光分子。本发明的喹啉鎓盐型化合物用作发光型荧光分子时，能够与特定的DNA序列结合，从而识别DNA结构或核苷酸。在生理溶液条件下，该发光型荧光分子仅显示出弱的发射信号或无背景发射信号，而与DNA或核苷酸相互作用或结合后，在500nm的激发波长激发时，在530nm的发射波长处具有强烈的荧光信号。本发明的喹啉鎓盐型化合物是固体粉末，在干燥和室温条件下具有约两年的保质期。另外，本发明的喹啉鎓盐型化合物用作发光型探针分子时，与目标分子结合后，产物的激发波长在420-500nm之间，能够与商品化的激光器相匹配。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种化合物，具有式I所示的结构：
其中：
n可以为1-4的整数，m可以为1-4的整数；
X可以为O、S或者-N-R11；
R1、R3和R4可以为H；-O-R8；-N(R9)(R10)；C1-6直链或具有支链的饱和或不饱和烷基、任选地被含有N、O或卤素的基团取代；卤素；或者C3-10具有环结构的含有或不含有杂原子的饱和或不饱和基团、任选地被含有N、O或卤素的基团取代；
R5可以为键；或者具有1-6个碳原子的直链或具有支链的饱和或不饱和烷基，任选地被O、S或N原子间隔；
R6、R7和R11可以为H；C1-6具有直链或具有支链的饱和或不饱和烷基、任选地被含有N、O或卤素的基团取代；C1-6具有直链或具有支链的饱和或不饱和酰基、任选地被含有N、O或卤素的基团取代；或者R6和R7与其所连接的原子一起组成4-8元杂环，该杂环中还包含其它O、S、N杂原子；
R8、R9和R10可以为H；C1-6具有直链或具有支链的饱和或不饱和烷基、任选地被含有N、O或卤素的基团取代；C1-6具有直链或具有支链的饱和或不饱和酰基、任选地被含有N、O或卤素的基团取代；或者C3-10具有环结构的含有或不含有杂原子的饱和或不饱和基团、任选地被含有N、O或卤素的基团取代；
或者R9和R10与其所连接的原子一起组成4-8元杂环，该杂环中还包含其它O、S、N杂原子；
R2为任意的可以与N形成鎓盐的基团；
A-为任意阴离子。
本发明中所述的C1-6直链或具有支链的饱和或不饱和烷基、任选地被含有N、O或卤素的基团是本领域技术人员已知的基团，包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、乙烯基、丙烯基、三氟甲基、三氟乙基、1,2-二氯乙基等。
本发明中所述的C3-10具有环结构的含有或不含有杂原子的饱和或不饱和基团是本领域技术人员已知的基团，包括但不限于环戊基、环己基、呋喃基、四氢呋喃基、环庚基、环辛基等。
本发明中所述的C1-6具有直链或具有支链的饱和或不饱和酰基是本领域技术已知的基团，包括但不限于甲酰基、乙酰基、丙酰基、N,N-2-甲基甲酰基、N,N-2-甲基乙酰基等。
优选地，其中R1、R3和R4可以为H、甲基、三氟甲基或苯基。
优选地，其中R2为甲基、乙基或丙基。
优选地，其中X为O或S。
优选地，其中X为S。
优选地，其中R5为-CH2-CH2-CH2-。
优选地，A-为氯阴离子、溴阴离子、碘阴离子、三氟甲磺酸阴离子或硫酸根离子。
优选地，R6为甲基或乙基，R7为甲基或乙基。
进一步优选地，所述化合物为：
三氟甲磺酸盐
4-[(3-(N,N-二乙基-1-胺基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓三氟甲磺酸盐，
三氟甲磺酸盐
4-[(3-(吗啉-1-基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓三氟甲磺酸盐，
三氟甲磺酸盐
4-[(3-(吡咯烷-1-基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓三氟甲磺酸盐，或者
三氟甲磺酸盐
4-[(3-(吡咯烷-1-基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1,2-二甲基喹啉鎓三氟甲磺酸盐。
式1所示的化合物的用途，所述化合物用作发光型荧光分子。
式1所示的化合物在在制备生物分子检测剂中的用途。
优选地，所述生物分子为核酸、寡核苷酸、DNA、RNA或其组合。
进一步优选地，所述生物分子是G-四联体DNA。
本发明的化合物用作发光型荧光分子时能够应用在生化或临床研究的光谱领域，包括但不限于，在基质溶液或生物分析中分析和测定DNA的组分和浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析DNA或核苷酸、在溶液或凝胶中作为荧光染色剂、细胞器的成像(特别是固定的或活细胞的细胞核或核染色体或染色质)、标记核酸或其它生物分子、用作增强特定DNA结构(如G-四联体)的稳定性的螯合剂或稳定剂。本发明的化合物用作发光型荧光分子时，能够与本发明的化合物相互作用的分析物列在表1中。
表1
本发明的有益效果：
(1)在生理溶液条件下，本发明的化合物用作荧光分子时仅显示出弱的发射信号或无背景发射信号，而与目标生物分子相互作用或结合后，在500nm的激发波长激发时，在530nm的发射波长处具有强烈的荧光信号；
(2)本发明的化合物是固体粉末，在干燥和室温条件下具有约两年的保质期；
(3)本发明的化合物用作发光型荧光分子时，与目标分子结合后，产物的激发波长在420-500nm之间，能够与商品化的激光器相匹配。
附图说明
图1是实施例3制备的4-[(3-(吡咯烷-1-基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓三氟甲磺酸盐与分析物telo21、ckit-2、pu27、ds26、ds12、4a4t、4at、dt21(0-10.25μM)在Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4 10mM)中反应后的荧光强度变化图，分析物溶解在含有60mM KCl的Tris-HCl缓冲溶液中；
图2A是实施例3制备的4-[(3-(吡咯烷-1-基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓三氟甲磺酸盐(0.25μM)与pu27(0-10μM)在Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4 10mM)中反应后的荧光强度变化图，激发波长：500nm，发射波长：530nm；其中F0代表不存在Pu27时的荧光强度，F代表存在Pu27时的荧光强度；图2B是实施例3制备的(4-[(3-(吡咯烷-1-基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓三氟甲磺酸盐(0.25μM)与pu27(0-10μM)在Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4 10mM)中反应后的线性关系图；
图3是实施例1-4制备的化合物与不同分析物反应后的荧光强度比较；柱形图从左到右依次表示ckit2、telo21、pu27、ds26、ds12、dt21、4at、4a4t以及物分析物；
图4是实施例1-4制备的化合物分别对5μM ds26、ds12、ckit2、pu27、telo21、dt21、4a4t和4at染色30分钟后的凝胶电泳图；
图5是实施例1-4制备的化合物和DAPI分别对PC3细胞染色后的荧光成像图。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明作进一步说明。
实施例1
4-[(3-(N,N-二乙基-1-胺基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓，结构如下所示：
将4-[(3-(溴丙基)-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓(0.2mmol)与二乙胺(2mmol)溶解于二甲基亚砜(3mL)中，在40℃回流48小时。冷却至室温后，将混合物倒入乙酸乙酯(5mL)中，收集沉淀物。采用二氯甲烷/甲醇(v/v＝10：1)作为洗脱剂，通过柱色谱纯化收集的沉淀物以获得纯的产物，然后将所得化合物与三氟甲磺酸银(0.5mmol)置于二氯甲烷，得到4-[(3-(N,N-二乙基-1-胺基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓三氟甲磺酸盐。
实施例2
4-[(3-(吗啉-1-基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓，结构如下所示：
将4-[(3-(溴丙基)-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓(0.2mmol)与吗啉(2mmol)溶解于二甲基亚砜(3mL)中，在40℃回流48小时。冷却至室温后，将混合物倒入乙酸乙酯(5mL)中，收集沉淀物。采用二氯甲烷/甲醇(v/v＝10：1)作为洗脱剂，通过柱色谱纯化收集的沉淀物以获得纯的产物，然后将所得化合物与三氟甲磺酸银(0.5mmol)置于二氯甲烷，得到4-[(3-(吗啉-1-基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓三氟甲磺酸盐。
实施例3
4-[(3-(吡咯烷-1-基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓，结构如下所示：
通过以下方法制备：将将4-[(3-(溴丙基)-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓(0.2mmol)与吡咯烷(2mmol)溶解于二甲基亚砜(3mL)中，在40℃回流48小时。冷却至室温后，冷却至室温后，将混合物倒入乙酸乙酯(5mL)中，收集沉淀物。采用二氯甲烷/甲醇(v/v＝10：1)作为洗脱剂，通过柱色谱纯化收集的沉淀物以获得纯的产物，然后将所得化合物与三氟甲磺酸银(0.5mmol)置于二氯甲烷，得到4-[(3-(吡咯烷-1-基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓三氟甲磺酸盐。
实施例4
4-[(3-(吡咯烷-1-基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1,2-二甲基喹啉鎓，结构如下所示：
将4-{[3-(溴丙基)-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基]-甲基}-1,2-二甲基喹啉鎓(0.2mmol)与吡咯烷(2mmol)溶解于二甲基亚砜(3mL)中，在40℃回流48小时。采用二氯甲烷/甲醇(v/v＝10：1)作为洗脱剂，通过柱色谱纯化收集的沉淀物以获得纯的产物，然后将所得化合物与三氟甲磺酸银(0.5mmol)置于二氯甲烷，得到4-[(3-(吡咯烷-1-基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1,2-二甲基喹啉鎓三氟甲磺酸盐。
实施例5
实施例3制备的化合物与不同的分析物反应后的荧光强度变化曲线如图1所示。在Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4 10mM)中，将0.25μM的4-[(3-(吡咯烷-1-基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓碘盐与0-10.25μM的目标分子telo21、ckit-2、pu27、ds26、ds12、4a4t、4at、dt21反应，在激发光波长500nm发射光波长530nm下记录荧光强度，其中目标分子溶解在含有60mM KCl的Tris-HCl缓冲溶液中。由图1可以看出，荧光分子与ds26、ds12、telo21、pu27、ckit2反应后，能够观察到强烈的荧光信号。
实施例6
将实施例3制备的化合物溶解于10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中，制备成0.25的溶液。将Pu27溶解在10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中，制备成200μM的储备液。将750μL荧光探针分子溶液与不同量的200μM Pu27储备液(0-100μM)混合，反应后在激发波长500nm发射波长530nm记录荧光强度，结果如图2A所示，标准曲线如图2B所示。4-[(3-(吡咯烷-1-基)-丙基]-1,3-苯并噻唑-2(3H)-亚基)-甲基]-1-甲基喹啉鎓碘盐用于测定Pu27的浓度范围为0-4μM，线性方程y＝30.89x+12.3(R2＝0.9915)，检出限(LOD)为3-4nM。
实施例7
比较实施例1-4的化合物对不同核苷酸的识别能力。在含有0.25μM探针分子的Tris-HCl溶液中分别加入5μM的不同核苷酸，反应后激发波长在500nm发射波长530nm记录荧光强度。使用的核苷酸包括单链DNA：dt21；双链DNA：4a4t、4at、ds12和ds26；G-四联体DNA：pu27、ckit2和telo21。荧光强度是三次重复测试的平均值。
实施例8
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE,20％acrylamide in 1×TBE)分析DNA。用1μM实施例1-4制备的化合物对ds26、ds12、ckit2、pu27、telo21、dt21、4a4t和4at标记后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析。凝胶电泳用30％(29：1)聚丙烯酰胺凝胶进行，在1×TBE缓冲液(80mM Tris-硼酸盐，2mM EDTA，pH8.3)中运行具有5μM固定浓度的所选DNA，温度为20℃，电压为100V，时间为3h，结果如图4所示。由图4可以看出，本发明的发光型荧光分子是G-四联体DNA Pu27的良好染色剂，在ds26、telo21和4at带中仅可以观察到轻微的荧光，而在带dt21和4a4t中没有观察到荧光。
实施例9
在细胞染色和成像过程中，将PC3细胞在PBS中孵育。染色之前，细胞培养簇(6孔)中生长的细胞通过使用预冷的99％甲醇在-4℃固定1分钟，然后PBS洗涤5分钟。将固定的PC3细胞在室温下通过5μM实施例1-4的化合物染色20分钟，然后用PBS洗涤5分钟两次；然后使用参比探针4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，5mg/mL)对细胞核染色5分钟进行定位，再用PBS洗涤两次。在Olympus IX71倒置荧光显微镜上观察记录荧光显微镜图像，结果如图5所示。由图5可以看出，本发明的荧光分子可透过细胞膜并进入细胞核与G-四联体DNA结合，表明本发明的发光型荧光分子能够用于细胞核中G-四联体DNA的成像。

Claims (10)

1.一种化合物，具有式I所示的结构：
其中：
n可以为1-4的整数，m可以为1-4的整数；
X可以为O、S或者-N-R11；
R1、R3和R4可以为H；-O-R8；-N(R9)(R10)；C1-6直链或具有支链的饱和或不饱和烷基、任选地被含有N、O或卤素的基团取代；卤素；或者C3-10具有环结构的含有或不含有杂原子的饱和或不饱和基团、任选地被含有N、O或卤素的基团取代；
R5可以为键；或者具有1-6个碳原子的直链或具有支链的饱和或不饱和烷基，任选地被O、S或N原子间隔；
R6、R7和R11可以为H；C1-6具有直链或具有支链的饱和或不饱和烷基、任选地被含有N、O或卤素的基团取代；C1-6具有直链或具有支链的饱和或不饱和酰基、任选地被含有N、O或卤素的基团取代；或者R6和R7与其所连接的原子一起组成4-8元杂环，该杂环中还包含其它O、S、N杂原子；
R8、R9和R10可以为H；C1-6具有直链或具有支链的饱和或不饱和烷基、任选地被含有N、O或卤素的基团取代；C1-6具有直链或具有支链的饱和或不饱和酰基、任选地被含有N、O或卤素的基团取代；或者C3-10具有环结构的含有或不含有杂原子的饱和或不饱和基团、任选地被含有N、O或卤素的基团取代；
或者R9和R10与其所连接的原子一起组成4-8元杂环，该杂环中还包含其它O、S、N杂原子；
R2为任意的可以与N形成鎓盐的基团；
A-为任意阴离子。
2.如权利要求1所述的化合物，其中R1、R3和R4可以为H、甲基、三氟甲基或苯基。
3.如权利要求1所述的化合物，其中R2为甲基、乙基或丙基。
4.如权利要求1所述的化合物，其中X为O或S。
5.如权利要求1所述的化合物，其中R5为-CH2-CH2-CH2-；A-为氯阴离子、溴阴离子、碘阴离子、三氟甲磺酸阴离子或硫酸根离子；R6为甲基或乙基，R7为甲基或乙基。
6.如权利要求1所述的化合物，所述化合物为：
7.权利要求1-6中任一项化合物的用途，所述化合物用作发光型荧光分子。
8.根据权利要求1-6中任一项化合物在在制备生物分子检测剂中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述生物分子为核酸、寡核苷酸、DNA、RNA或其组合。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述生物分子是G-四联体DNA。
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