JP3683913B2 - Ｐｃｒによる核酸定量方法、ｐｃｒによる微生物または細胞の数、特定遺伝子数及び特定遺伝子コピー数の計測法、ならびにこれらの方法に用いる測定用キット - Google Patents
Ｐｃｒによる核酸定量方法、ｐｃｒによる微生物または細胞の数、特定遺伝子数及び特定遺伝子コピー数の計測法、ならびにこれらの方法に用いる測定用キット Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ＰＣＲ増幅産物の検出を、遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物で行う核酸の定量方法、微生物または細胞の数、特定遺伝子数及び特定遺伝子コピー数の計測法、ならびにこれら方法に用いる測定用キットに関する。この計測法は各種溶液中や土壌中の計測対象菌の菌数の測定等に利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＣＲ法は、２種のプライマーによって規定された特定配列を鋳型（テンプレート）として、酵素的にこの特定配列を増幅する方法であり、核酸の検出にも利用されるようになってきている。すなわち、検出対象としての標的核酸中の特定配列を選定し、この特定配列の増幅に必要なプライマーを用意し、標的核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅された特定配列を検出することで、標的核酸の検出が可能となる。このようにＰＣＲを用いた核酸の検出方法では、検出対象の特徴的部分である特定配列が増幅されて検出され、しかもその増幅率も大きいので、試料中における標的核酸の量が微量であっても、その検出が可能となる。例えば、数時間の反応で１００万倍程度の増幅率を得ることも可能であり、ＰＣＲ法を用いることで１分子の核酸が存在すればこの核酸の検出が可能となる場合もある。この増幅反応は鋳型核酸と２種のプライマーとの間に相補的配列がある場合のみ進行し、相補的配列がない場合には増幅産物は得られない。
【０００３】
ＰＣＲ法を用いることで核酸の検出感度は飛躍的に向上し、最近ではハイブリダイゼーション法を用いる核酸検出法に代わって種々の分野での核酸の検出に利用されるに至っている。特に、ウイルス、細菌等による感染症の臨床検査などの分野における病原体の同定、あるいは遺伝子疾患における遺伝子の解析、癌等の診断における遺伝子マーカーの検出などに広く利用されるようになってきている。
【０００４】
ＰＣＲ法の他の応用としては、ＭＰＮ（Ｍｏｓｔ Ｐｒｏｂａｂｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ）法（Ｈ．Ｏ．Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ ａｎｄ Ｎ．Ｒ．Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２５，１０１（１９３３））との組合せによる特定菌の菌数の計測が挙げられる。ＭＰＮ法は、最確値法あるいは希釈頻度法とも呼ばれ、数段階の試料希釈液を培地中に入れた多数の試験管に一定量ずつ接種して、充分な期間培養した後に菌の生育の有無を判定して、統計処理により菌数を計測する方法である（「土壌微生物実験法」、養賢堂、第４５頁）。この方法は、多くの手間と実験器具を必要とし、特に土壌微生物のような菌では、培養時間も長いという問題を有するものであった。さらに、このＭＰＮ法では、用いた培地で増殖する全ての菌についての総菌数が計測されるので、試料中に複数の菌が混在する場合における特定菌の菌数測定は不可能である。そこで培養を行わず微生物を検出する手段として検出にＤＮＡを用いＤＮＡレベルで増やすという試みがなされている。その手段としてＭＰＮ法にＰＣＲ法を組み合わせた方法が考えられている。このＰＣＲ法をＭＰＮ法に組み合わせた方法は、測定対象菌を含む試料からＤＮＡを抽出して、この試料を数段階に希釈調製した後、これに測定対象菌に特有な核酸配列を増幅するための２種のプライマーを用いたＰＣＲを行い、得られた増幅産物を検出して、その量から測定対象菌の数を求める方法である。
【０００５】
すなわち、ＰＣＲ法ではピコグラム量のＤＮＡ材料からマイクログラム量の目的ＤＮＡが短時間で得られる。そのため、ＰＣＲ法を用いてクローン化ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで迅速に大量増幅することが可能になり、ＰＣＲのクローニングや各種検出への応用がなされている。ＰＣＲ法は、目的とする２本鎖ＤＮＡを熱変性して、１本鎖とした後、鋳型となる各１本鎖にプライマーをアニーリングし、プライマーの結合位置を起点としてＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を合成する。従って、原理的には、鋳型ＤＮＡは１本存在すれば良いことになる。鋳型ＤＮＡとしてゲノムＤＮＡを扱う場合について述べると、１本の鋳型ＤＮＡでもその長さは、被検出対象の生体の種類によって大きく異る。例えば、ヒトのゲノムＤＮＡは大腸菌の１０3倍もの長さを有する。つまり、同じピコグラム量のゲノムＤＮＡとはいっても、その中に含まれるＤＮＡの本数は生物種によって桁が異るといえる。
【０００６】
そこで、このような量的な問題を、ＤＮＡの数の問題として捕らえて検出する方法が、ＭＰＮ−ＰＣＲ法である。この方法は、鋳型ＤＮＡを段階的に希釈し、最終的にそれぞれの反応系の中に１本存在するか否かまで希釈した後、ＰＣＲで増幅して、これを検出し、その結果から、確立的に鋳型ＤＮＡの試料中での個数を求める方法である。従って、このＭＰＮ−ＰＣＲ法は、菌数測定のためのＭＰＮ法の原理を利用したもので、ＭＰＮ法における菌を鋳型ＤＮＡに、または菌の増殖をＰＣＲに置き換えたものであるといえる。すなわち、ＭＰＮ法では、菌を含むサンプル溶液を段階的に、菌が１個が存在するか否かまで希釈した後、培養によってこれを増殖させて検出し、得られた結果から、確立的にサンプル溶液中の菌数を求めるものであるが、このプロセスにおける菌を鋳型ＤＮＡに、また培養をＰＣＲに置き換えたのが、ＭＰＮ−ＰＣＲ法である。従って、ＭＰＮ−ＰＣＲ法で問題とされるのは、鋳型ＤＮＡの量ではなく、分子数（個数）である。
【０００７】
従来におけるＭＰＮ−ＰＣＲ法の具体的操作の一例について以下に述べる。まず、微生物を含む試料から抽出された試料ＤＮＡを、１０倍ずつ段階的に希釈した希釈液（例えば、希釈率１、１０-1、１０-2・・・１０-9）を用意する。なお、希釈率１０-nとは、試料濃度が１／１０nに希釈されることをいう。各希釈液について（計１０個）のそれぞれについてＰＣＲを行い、検出対象としての鋳型ＤＮＡの増幅を行う。ＰＣＲ終了後、各反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、増幅産物を、バンドの有無として検出する。この時、ある希釈倍率を境に増幅産物のバンドがみられなくなる。例えば、１０ー5希釈を行ったサンプルまでは増幅産物がみられた場合には、この希釈率と、その前後の希釈率のサンプル、すなわち１０-4、１０-5、１０-6の希釈率の希釈液の各々の５サンプルずつ（計１５サンプル）について再度ＰＣＲを行い、再度アガロースゲル電気泳動で増幅産物の有無を調べる。その結果を、各希釈率での５サンプル中の増幅産物が認められたサンプル数を、後で掲載するＭＰＮ表（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２５，１０１（１９３３）の第４００頁）に当てはめて、予め確立的に求められている個数を求める。例えば、、１０-4希釈では５サンプル中全てのサンプルが陽性（増幅産物が検出）、１０-5希釈では５サンプル中３つが陽性、１０-6希釈では５サンプル中１つが陽性の場合、ＭＰＮ表のＰ1、Ｐ2、Ｐ3が、それぞれ５、３、１である場合の数値（１．１）が求められる。この数値に最初のＰＣＲで増幅産物が認められた希釈率の限界である１０ー5の逆数を乗じた値が、試料ＤＮＡ中の鋳型ＤＮＡの個数（１．１×１０5）となる。
【０００８】
標的とされた鋳型ＤＮＡが、微生物等の個体１つあたり１個存在するものであれば、このＭＰＮ−ＰＣＲ法で得られた鋳型ＤＮＡの個数が試料ＤＮＡの調製に用いた試料中に含まれる微生物等の個体数となる。ゲノム遺伝子等を標的遺伝子として用いる場合には、遺伝子によっては数コピー存在する場合もある。１コピーの場合には、上述のようにＤＮＡ数はそのまま個体数となるが、複数のコピーが存在する場合には、個体数との相関を求めておく必要がある。さらに、ＤＮＡの抽出効率も関係するので、正確な値を得たい場合には、検量線を作成することが望ましい。この方法は、癌細胞のように細胞中のある特定遺伝子のみが増幅されて多コピー存在する場合の定量にもこの方法は利用できる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の検出は、例えば、ＰＣＲ反応混合物をゲル電気泳動で展開し、増幅産物と、鋳型核酸やプライマー等の非検出対象成分とを分離した状態で、蛍光染色によって増幅産物のバンドをその分子量などから判断して特定してから、そのバンドの蛍光強度を測定することにより行われてきた。
【００１０】
しかしながら、ＰＣＲ法を用いた核酸の検出においては、反応溶液中に鋳型核酸と大過剰なプライマー等が含まれており、増幅対象の核酸配列の種類によっては、非検出対象成分と増幅産物とのゲル電気泳動による分離操作が困難な場合も多い。また、検体数が多くなると、煩雑なゲル電気泳動を行うことが多大な労力と時間の浪費を伴うことになり、効率良い検出操作を行う上での障害となっていた。特に臨床等における遺伝子解析においては、多くの検体をより短時間で効率良く処理できることが要求され、従来の方法ではこのような要求には充分対応できるものではなかった。
【００１１】
一方、ＰＣＲ法のＭＰＮ法への応用においては、より正確な菌数の推定を行うために、まず通常１０段階希釈での実験を行い、その中から増幅産物の認められる希釈を含む３段階の希釈系列で再実験を行う方法が採用されている。更に、この方法は確率論に基づいて菌数を求める方法であるので、確率的な菌数の決定に必要なサンプル数が要求されるので、ＭＰＮの表から菌数を求めるには各希釈液に対して、最低５〜１０サンプルの反応が行われるのが普通である。その結果、この方法においては、１検体について少なくとも２５程度のサンプルをＰＣＲにかけてからゲル電気泳動で評価するという多大な労力が必要とされる煩雑な作業が要求され、しかも結果を得るために長い時間が必要となる。
【００１２】
以上のように、ＰＣＲ法を利用した核酸の検出や菌数測定においては、ＰＣＲによる増幅反応後の増幅産物の検出や定量に煩雑かつ時間の要する作業が必要になる場合が多く、多検体の効率良い処理を行う上での障害となっていた。従って、ＰＣＲを利用した検出あるいは定量法においては、簡便かつ正確にＰＣＲ増幅産物を検出できる方法の確立が強く望まれていた。
【００１３】
ＰＣＲ増幅産物の検出において最も煩雑な作業は、大過剰に反応溶液中に添加されるプライマーと増幅産物とのゲル電気泳動による分離作業である。この分離作業を省略するための方法として種々の方法が検討されている。例えば、二本鎖核酸と反応したときに蛍光増大がみられる化合物、いわゆる蛍光性インターカレーターを用いた方法が注目されている。この蛍光性インターカレーターを用いた方法は、ＰＣＲで増幅された２本鎖核酸に蛍光性インターカレーターを反応させて、その際に生じる蛍光強度の増大を測定し、増幅産物を検出する方法である。この方法では、理論的には、インターカレーターがプライマー（１本鎖）と反応しても蛍光増大を生じないので、増幅産物とプライマーとの煩雑な分離操作を省略できるという利点がある。
【００１４】
例えば、特開平５−２３７０００号公報には、蛍光性インターカレーターとして知られているエチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ビスベンチイミド、ジアミノフェニルインドール、アクチノマイシン、チアゾールレンジ、クロモマイシン、及びこれらの誘導体等の色素をＰＣＲ増幅産物の検出に用いる方法が開示されている。これらの色素の中では、遊離時（２本鎖核酸と反応していない状態）に対する２本鎖核酸との反応時での蛍光増大が、紫外線励起で５０倍程度、可視光励起で２０倍程度と比較的大きいエチジウムブロマイドを好ましいものとして挙げることができる。
【００１５】
しかしながら、この特開平５−２３７０００号公報に挙げられた各色素は、遊離時においても蛍光を発するもので、測定される蛍光強度には、２本鎖核酸と未反応の色素による蛍光強度も含まれており、２本鎖核酸と色素との反応に由来する蛍光強度そのものではない。従って、測定値から未反応の色素に由来する蛍光強度をブランクとして差し引く必要がある。すなわち、この方法では蛍光強度の測定結果から単純に増幅産物の有無やその量を判定することはできず、ブランク値を差し引くという操作が必要となる。しかも、増幅産物の生成量が微量であると、ブランク値との十分な差が生じない場合もあり、高感度での検出ができない場合もある。
【００１６】
ＹＯＹＯ−１（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０（１１），２８０３〜２８１２（１９９２）は、遊離時は無蛍光で、二本鎖核酸に挿入された時に蛍光増大（３０００倍程度）を起すものでこれを利用できれば上記の測定におけるブランクが高いという問題を解消できるが、この色素は室温で分解し易く、実用的とはいえない。なお、後述するように、この色素によるＰＣＲ増幅産物の検出では、プライマー間の反応によって生じる高次構造物も検出されてしまい、正確な定量ができないという欠点がある。
【００１７】
このような観点から、上記の特開平５−２３７０００号公報では、検出対象としての標的核酸のＰＣＲ反応前の初期濃度を定量するためには、ブランク値に対して十分な蛍光強度が得られるサイクル数での増幅が行われている。すなわち、標的核酸の初期濃度が低い場合にはサイクル数が大きくなり、また標的核酸の初期濃度が高い場合にはサイクル数が小さくなる。そこで、該特許公開公報における標的核酸の定量法では、ＰＣＲ反応中における蛍光強度の変化をモニターし、蛍光強度が急激に変化する時点におけるサイクル数から標的核酸の初期濃度を求めている。
【００１８】
しかしながら、このような定量方法は、ＰＣＲ反応の各サイクルにおける蛍光強度をモニターするという煩雑な操作が必要であるという問題がある。また、蛍光強度が変化する点の判断が難しい場合もあり、感度良い標的核酸の定量を効率良く行うという点ではなお改善すべき問題を有するものといえる。
【００１９】
更に、ＰＣＲ増幅産物のエチジウムブロマイド等の色素による検出においては、理論上はプライマーと色素とが反応して蛍光が増大することはないので、増幅産物とプライマーが混在した状態でも増幅産物の検出が可能となるはずである。ところが、本発明の発明者らによる検討によれば、ＰＣＲ中にプライマー間の反応が生じて核酸の塊（３次元的な立体構造を有する高次構造物）が生じ、これもエチジウムブロマイド等によって検出されてしまうことが判明した。従って、高次構造物に対して増幅産物の量が圧倒的に多い場合は問題はないが、そうでない場合には実際に測定される蛍光増大に占める高次構造物による蛍光増大の割合が多くなり、正確な定量を行うことが不可能となる。しかも、この量は常に一定というわけではなく、増幅産物の量が圧倒的に多い場合には少なくなるが、増幅産物の量が少ない、あるいは増幅産物が生じない場合には多量に生じる傾向があり、ブランク等との比較により簡単に補正できるものではない。
【００２０】
この高次構造物の存在は、例えば、鋳型核酸を加えない系でＰＣＲ反応を行って得た反応混合物をゲル電気泳動で展開した際に、低分子量領域にエチジウムブロマイドで雲状のパターンに染色される部分が表われることから確認できる。
【００２１】
この高次構造物による測定誤差の発生という問題は、ＰＣＲ反応自体に起因する問題であり、しかも標的核酸の初期濃度が低い場合に、増幅サイクル数を増加させるほどより顕著になる傾向がある。
【００２２】
したがって、上述した従来技術による増幅産物の定量法は、より感度よい定量を行うには今だ不充分なものであった。
【００２３】
また、ＭＰＮ法にＰＣＲを組み合わせた菌数の計測方法においても、ＰＣＲを行う段階で上述のようなプライマー間の反応による高次構造物の形成は避けられず、測定誤差が大きくなることは同様である。
【００２４】
本発明の目的は、ＰＣＲ増幅産物の検出過程を簡便にし、かつ正確な定量が行える核酸の検出方法を提供することにある。本発明の他の目的は、簡便かつ正確なＰＣＲ増幅産物の検出方法を利用した被検出微生物または細胞の数、これらに含まれる特定遺伝子の数、あるいは特定遺伝子のコピー数の計測法を提供することにある。本発明の更なる目的はこれら方法に用いる測定用キットを提供することにある。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は以下の本発明によって達成することができる。本発明の核酸の定量方法は、標的核酸の特定配列領域の増幅に必要なプライマーの存在下で核酸試料に対してＰＣＲを行い、該試料中に標的核酸が存在する場合に増幅される２本鎖核酸からなる増幅産物に、遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物を反応させて得られる蛍光の強度を測定することで前記核酸試料中の標的核酸の量を求めることを特徴とする。この核酸の定量方法に利用できるキットは、ＰＣＲ用の反応領域内に、遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物の必要量を配置した反応器を有することを特徴とする。さらに、このキットは、前記反応領域内に標的核酸の特定配列領域のＰＣＲの増幅に必要なプライマーの必要量が配置されていてもよいものである。また、この核酸測定用キットは、ＰＣＲ用の反応領域と、該反応領域と隔離された試薬領域とを有し、該試薬領域に遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物の必要量が配置され、該試薬領域内の色素化合物が前記反応領域内に添加可能に設けられていることを特徴とするものであってもよく、この場合も、反応領域内に標的核酸の特定配列領域のＰＣＲの増幅に必要なプライマーの必要量を更に配置した構成をとるものであっても良い。
【００２６】
一方、本発明の微生物または細胞の数、特定遺伝子の数、あるいは特定遺伝子のコピー数を計測する方法は、被検出微生物または細胞を含む試料から核酸を抽出する過程と、得られた核酸抽出物の段階的希釈サンプルを調製する過程と、各希釈サンプルについて被検出微生物または細胞に特有の配列を増幅するためのＰＣＲを行う過程と、該ＰＣＲにより得られた２本鎖核酸からなる増幅産物に、遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物を反応させて得られる蛍光を測定し、蛍光が得られ希釈サンプルの希釈率から、被検出微生物または細胞の数、特定遺伝子の数、あるいは特定遺伝子のコピー数を求めることを特徴とする。この計測方法に利用できるキットは、多数のＰＣＲ用反応領域の各反応領域内に遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物の必要量を配置した反応器を有し、これらの反応領域を利用して被検出微生物または細胞を含む試料から抽出した核酸抽出物の段階希釈が形成可能であり、かつ各希釈において前記被検出微生物または細胞に特有の配列を増幅するためのＰＣＲを行えるようにしたことを特徴とする。このキットの各反応領域内には被検出微生物または細胞に特有な配列のＰＣＲ増幅用のプライマーが更に配置されたものであってもよい。これらの本発明は、後述するように、ＭＰＮ−ＰＣＲ法にも適用できる。
【００２７】
本発明で用いられる色素化合物は、遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発するものである。この色素化合物による２本鎖核酸との反応とは、該色素化合物が２本鎖核酸の安定な２重らせん構造の溝部内等に特異的に挿入されて結合することであり、その状態で色素化合物は励起光の照射によって蛍光を発するようになる。従って、遊離時、すなわち単独で存在する場合には励起光が照射されても蛍光を発しない。
【００２８】
この色素化合物は、プライマー間で形成される安定した２重らせん構造を形成できない短い２本鎖部分には容易に入り込むことはなく、また入り込んでも安定な２重らせん構造以外では蛍光を発しないものである。従って、この色素化合物としては、２重らせん構造の主溝、あるいは副溝に特異的に入り込んで結合し、その状態で蛍光を発するものが利用できる。このような特性を有する色素化合物を用いることで、ＰＣＲ反応液に直接（すなわち増幅産物とプライマーや鋳型核酸（テンプレート）とを分離する操作を行うことなく）該色素化合物を添加するだけで増幅産物のみが正確に検出できる。なお、この色素化合物の遊離状態での蛍光は無視できる程度に低いものであっても良い。
【００２９】
該色素化合物としては、例えば、ＤＡＰＩ（４’，６−Ｄｉａｍｉｎｏ−２−Ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（商品名）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２及び下記一般式［Ｉ］で表わされるピリリウム化合物塩またはピリリウム類似化合物塩等を挙げることができる。
【００３０】
【化２１】
上記一般式［Ｉ］において、
【００３１】
【化２２】
は、複素環を示し、ＸはＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅである。該複素環としては、ピリリウム環もしくはピリリウム類似環のような５員環及び６員環のものを挙げることができる。
【００３２】
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換アリール基、置換もしくは未置換低級アルアルキル基または置換もしくは未置換シクロアルキル基を示す。
【００３３】
Ｒ3は、−Ａまたは−Ｌ−Ａである。Ｌは、−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ4−Ｌ5−Ｌ6−であり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝ＣＨ）−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される２価の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または−ＣＨ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基を有する環構造を示す）を表わす。置換もしくは未置換アリール基から誘導される２価の基としては、例えばフェニレン基等を挙げることができ、オルト、メタ、パラのいずれの位置で結合するものでもよい。低級アルキレン基としては、炭素数が１〜４の直鎖状もしくは分岐状のアルキレン基を挙げることができ、その置換基としては、例えば−Ｌ−Ａで示される基を挙げることができる。オキソ基を有する環構造としては、複素環、芳香環、脂肪族環等で少なくともオキソ基を有するものを挙げることができる。
【００３４】
−Ｌ−としては、下記一般式［ＩＩ］、［ＩＩＩ］、［ＩＶ］、［Ｖ］または［ＶＩ］で表わされる基を好ましいものとして挙げることができる。
【００３５】
【化２３】
（上記一般式［ＩＩ］中、Ｚは水素原子または置換もしくは未置換低級アルキル基を表し、ｎは０、１または２である。）なお、Ｚがアルキル基である場合のその置換基としては、例えば上述の−Ｌ−Ａで定義される基を挙げることができる。
【００３６】
【化２４】
（上記一般式［ＩＩＩ］中、ｎは０、１または２であり、Φは置換もしくは未置換ｏ−、ｍ−またはｐ−フェニレン基を表わす。）
【００３７】
【化２５】
（上記一般式［ＩＶ］中、Φは置換もしくは未置換ｏ−、ｍ−またはｐ−フェニレン基を表わす。）
【００３８】
【化２６】
【００３９】
【化２７】
上記一般式中のフェニレン基の置換基としては先に例示したものを挙げることができる。
【００４０】
一般式［Ｉ］のＲ3におけるＡは、置換もしくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ5（Ｒ5は、置換もしくは未置換複素環、置換もしくは未置換のシクロアルキル基または置換もしくは未置換芳香環を示す）を表わす。Ｒ5の複素環としては、
【００４１】
【化２８】
（Ｍ及びＮは、それぞれ独立して酸素原子、イオウ原子または窒素原子を、Ｙ-はアニオンを表わす）等から誘導された基を挙げることができ、その置換基としては、例えば、置換もしくは未置換アリール基などを挙げることができる。また、置換もしくは未置換シクロアルキル基とは、飽和のものでも、不飽和のものでもよく、例えば
【００４２】
【化２９】
等の共鳴系を構成し得るものから誘導された基を挙げることができる。また、置換もしくは未置換芳香環としてはアズレン環を挙げることができる。これらの基の置換基としては低級アルキル基、置換もしくは未置換アリール基等を挙げることができる。
【００４３】
Ｘを含むピリリウム環もしくはその類似環のＲ1、Ｒ2、Ｒ3が結合していない炭素原子に結合している水素原子は、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換アリール基または置換もしくは未置換低級アルアルキル基で置換されていても良い。
【００４４】
Ｙ-はアニオンを示し、該アニオンとしては、例えばＢＦ4 -、過塩素酸イオン、ＨＯ3ＳＣＨ2ＣＯＯ-、あるいは塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、フッ素イオン等のハロゲンイオン、又は、脂肪族炭化水素や芳香族スルホネート等のようなアニオン機能を有する化合物、更には、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｃｏ、Ｐｄ等の遷移金属の錯体イオンなどを挙げることができる。
【００４５】
以上挙げた各種の置換基に更に置換される基がハロゲン原子の場合には、該ハロゲン原子としては、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等を挙げることができる。また、低級アルキル基は、直鎖状でも分岐状のものでもよく、その炭素数としては１〜４程度のものが好ましい。アリール基としては、例えば、フェニル基等を挙げることができる。アリール基やフェニレン基の置換基としては、例えば低級アルキル基で置換されたアミノ基（低級アルキルアミノ基）等を挙げることができる。なお、この低級アルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等がパラ位で置換しているものが好ましい。低級アルアルキル基としては、上記の置換もしくは未置換アリール基で置換された低級アルキル基を挙げることができる。
【００４６】
一般式［Ｉ］の化合物の中では、Ｘを含む複素環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上で置換されたものが好ましい。例えばＸを含む複素環が６員環の場合のそのような化合物としては、
（１）Ｘを含む６員環の２位と４位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、３位、５位及び６位のいずれかがＲ3で置換されているもの、
（２）該６員環の３位と５位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、２位、４位及６位のいずれかがＲ3で置換されているもの、
（３）該６員環の２位と６位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、３位、４位及び５位のいずれかがＲ3で置換されているもの、
などを挙げることができる。このような位置に置換もしくは未置換アリール基を導入することは、核酸塩基対へのインターカレーターとして良好な性質を得る上で好ましい。更に、Ｘを含む複素環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上に、これらの置換位置が隣合わないように置換されたものがより好ましい。
【００４７】
一般式［Ｉ］の化合物の具体例としては、例えば後述の表１に示すものを挙げることができるが、本発明においては、後述する表２及び実施例において示した化合物番号１〜４、６、９、１１及び１５〜１６の化合物が用いられる。更に、２本鎖核酸に挿入された際に発する蛍光の強度が非常に大きいことから特に好ましい化合物としては、下記一般式［ＶＩＩ］
【００４８】
【化３０】
（上記一般式［ＶＩＩ］中、ＸはＯまたはＳを表わし、Ｙ-はアニオンを表わす）で表わされる２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム塩、または２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルチオピリリウム塩を挙げることができる。
【００４９】
本発明で用いられる色素化合物は、安定な２重らせん構造と特異的に反応して蛍光を発するものであるので、これが、先に述べたようなプライマー間の反応によって生じる高次構造物に取り込まれたとしても、この高次構造物の２本鎖部分は安定な２重らせん構造ではないので、蛍光を発することはない。
【００５０】
また、一般式［Ｉ］で示された化合物は、２０〜３０塩基対に１つの割合で２重らせん構造に特異的に挿入されるので、上述のようなプライマー由来の高次構造物に取り込まれにくいという利点を有し、さらに増幅対象としての配列を有する２重らせん構造からなる２本鎖核酸断片に取込まれても、取込み密度がエチジウムブロマイド等よりも大幅に低く、一般式［Ｉ］の化合物の取込みによる２本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）の上昇は非常に少なく、ＰＣＲに与える影響が少ない。また、取込み密度が低いことから、ＰＣＲ後に反応液をゲル電気泳動で展開して増幅産物の長さ等を確認する場合にも、該化合物の取込みによる２本鎖核酸の移動度への影響がほとんどなく、正確な測定が可能である。
【００５１】
これに対して、従来の蛍光性インターカレーターであるエチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ及びＹＯＹＯ−１は数塩基対（２〜５塩基対程度）に１つの割合で２本鎖核酸に挿入されてしまうので、これらの色素を用いた場合には、上述のようなプライマーから形成される高次構造物の２本鎖部分に取込まれて所望としない蛍光増大を生じ、また増幅対象としての２本鎖核酸に取込まれた際にも、２本鎖核酸のＴｍやゲル電気泳動での移動度への影響が大きい。
【００５２】
本発明に利用される色素化合物の上述のような利点を有効に利用してより正確な定量を行うには、増幅産物が安定な２重らせん構造を形成していることが好ましい。従って、本発明は、例えば増幅産物長が１００塩基対以上である場合に好適に利用でき、また３００塩基対程度であることがより好ましい。増幅産物の上限は特に限定されないが、ＰＣＲでヌクレオチドが取り込まれる速度は、例えば７２℃で反応を行った場合、１秒間に３５〜１００ヌクレオチドといわれている。これらは、反応のｐＨ、塩濃度の他、標的核酸がどのような塩基配列を有するかといった反応条件に依存する。従って、ＰＣＲにおける各サイクルの反応時間を１分間とした時には、２０００塩基対以下が好ましい。更に増幅産物が長すぎる場合には副産物を生じ易くなるため、１０００塩基対以下がより好ましい（”ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”、Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ． Ｉｎｎｉｓ， Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊｏｈｎ Ｊ． Ｓｎｉｎｓｋｙ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ Ｊ． Ｗｈｉｔｅ， １９９０ ｂｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｆｏｒｎｉａ ９２１０１））。
【００５３】
また、ＰＣＲに用いるプライマーとしては、標的核酸中の増幅対象としての特定配列領域を規定できるものが所望に応じて用いられる。その長さとしては、鋳型核酸における増幅対象としての特定配列領域の端部の特定配列を認識するのに必要な程度な長さを有することが要求されるが、不必要に長いものであってはならない。長過ぎるとプライマー間で２本鎖部分が部分的に形成される可能性が高くなるからである。これ等の点を考慮するとプライマーの長さは、３０塩基程度以下、好ましくは２８塩基程度以下がよい。プライマー長の下限としては、特に限定されないが、増幅対象としての特定配列領域の端部を認識できる長さとされ、例えば１４塩基対以上、好ましくは１８塩基以上とされる。
【００５４】
本発明の核酸の定量方法では、まず、定量対象としての標的核酸に特徴的な配列領域を特定する。次に、この特定された配列領域（特定配列領域）の増幅に必要なプライマーと、鋳型として利用する標的核酸を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に先に述べた特性を有する色素化合物を反応させて、励起光を照射した際に発生する蛍光の強度を測定する。このとき得られる蛍光強度は、各反応成分の濃度を適切な範囲に設定すれば、鋳型の初期濃度（ＰＣＲ前の濃度）と比例するので、蛍光強度と鋳型の量との関係を予め検量線として設定しておき、未知試料に上述のＰＣＲ及び蛍光強度の測定を行って、未知試料中の標的核酸を定量することが可能となる。
【００５５】
最適条件が既に求められた反応系では上述のような検量線を用いた定量が簡便であるが、反応条件、特に標的核酸の量、プライマーの量、反応温度等は、それぞれの反応系で異り、検量線作成のための反応条件の設定が未知の場合には、検量線が書ける条件を見つけるという煩雑な作業が必要となる。
【００５６】
そのような検量線が書ける条件の設定が未だ行われていない系では、未知試料の核酸を段階的に希釈し、続いてＰＣＲ法を行い、標的核酸断片を検出する確立を得るＭＰＮ−ＰＣＲ法を利用することで、標的核酸の概量を簡単につかむことができ、それによって検量線作成条件を簡単に得ることが可能となる。例えば、先に従来技術の欄で説明した具体例では、試料中の鋳型ＤＮＡ数は１．１×１０5個であった。この時、１０ー5希釈では５サンプルのうち３サンプルが陽性であったが、１０ー4希釈よりも高濃度の場合には５サンプル全てが陽性になるはずである。この従来技術の欄の具体例では、一回目の実験で増幅産物の有無により鋳型ＤＮＡの希釈限界を含む濃度領域を限定し、その濃度領域についてさらに詳しくＭＰＮの手法での検討が加えられた。これは、アガロースゲル電気泳動では、バンドの有無というＯＮ／ＯＦＦの検出しかできない、あるいはＤＮＡのバンドを蛍光で定量するとしても煩雑な作業の割に定量性が得られないからである。これに対して、後述のＭＰＮ−ＰＣＲ法を用いる本発明の方法によれば、例えばマイクロプレートのような多数の反応領域を設定できる器具を用いて、全希釈系列について増幅産物の形成を調べることが可能となる。例えば、この本発明の方法で従来技術の欄で説明した具体例のサンプルをマイクロプレート上で処理した場合、１０ー5希釈では陽性のウエルと陰性のウエルが存在するが、１０ー4希釈より高濃度の場合には、各希釈にけるサンプル（同一希釈率のサンプル）間で同程度に増幅が行われ、色素化合物を用いた検出において、同程度の蛍光が得られるはずである。ここで、各希釈倍率における同一希釈率の５つのサンプルにおける蛍光強度の平均値を求め、希釈倍率を横軸に、蛍光強度を縦軸にプロットすると得られた値は直線にのる。その直線の領域が長ければ長い程、ＰＣＲ条件が適当であったことを意味し、逸脱が著しければ、プライマー量等の再検討が必要であることを意味する。
【００５７】
ここで、蛍光強度と希釈率との間に直線的関係が得られれば、このＭＰＮ−ＰＣＲ法ではすでに鋳型ＤＮＡの個数は求められているので、これを検量線として利用して蛍光強度から鋳型ＤＮＡの個数や量（個数×分子量）の定量が可能となる。
【００５８】
このように本発明の方法によれば、色素化合物を反応液に添加して増幅産物と色素化合物との反応によってのみ得られる蛍光が直接測定される。すなわち、ＰＣＲ後にプライマーや鋳型と増幅産物とを分離する必要もなく、更にプライマー間の反応により高次構造物が形成されても、それによる測定結果への影響を回避できる。従って、反応液に色素化合物を添加して得られる蛍光をそのまま定量値の計算に用いることができ、正確な定量が行える。なお、エチジウムブロマイドのように遊離の状態でも蛍光を発生するものでは、蛍光強度の実測値からブランクを差し引いた値をもとに定量値が求められる。しかしながら、ブランクの値は測定条件によって変化する場合が多く、各測定条件ごとに実測値に対するブランク値の相対的関係を考慮して定量操作条件を設定するという煩雑な作業が必要となる。これに対して、本発明の方法では、色素化合物が遊離の状態では無蛍光か、あるいは無視できる程度の極僅かな蛍光しか発しないものであるので、エチジウムブロマイドにおけるようにブランクを考慮する必要がなく、ブランク値を考慮した定量操作条件の設定という煩雑な作業は不用となる。また、特開平５−２３７０００号公報におけるようなＰＣＲ過程での蛍光強度のモニターも必要ない。
【００５９】
更に、本発明において、検出時にマイクロプレートを用いれば、ＰＣＲ後反応容器から反応液をマイクロプレートに移してマイクロプレート用蛍光検出器で蛍光の測定を行うことで、試薬の量が少量ですみ、また測定時間が短いので便利である。なお、ＰＣＲ反応そのものをマイクロプレート上で行うとより簡便な定量操作が行なえる。
【００６０】
従って、例えばマイクロプレートのような反応領域としてのウエルを多数有する反応器の各反応領域内に、本発明で利用する色素化合物の必要量を予め塗布、蒸発乾燥等の方法により配置したものは、核酸定量用のキットとして利用できる。この構成は、この色素化合物が室温でも安定であるので可能となる構成である。
【００６１】
また、ＰＣＲ用の反応領域と隔離された試薬領域を設け、この試薬領域に本発明で利用する色素化合物を配置しておいて、ＰＣＲを行う時に、反応領域に添加できる構成としてもよい。試薬領域に色素化合物を配置する場合には、これを溶液として配置することができる。この化合物が水溶性の場合には、適当な緩衝液等に溶解させて配置し、また有機溶剤に対して溶解性を有するものである場合には、適当な溶剤に溶解させて配置することができる。
【００６２】
また、この試薬領域には、ＰＣＲに必要な緩衝液、ヌクレオチド、酵素等も、この色素化合物とともに配置しても良い。これらを全て含む水溶液を調製する場合に、色素化合物が水に不溶性の場合には、この色素化合物の溶解に用いる溶剤は該水溶液に対して１％以下であることが好ましい。この試薬領域にＰＣＲ用の試薬及び色素化合物を一緒に配置する構成は、この色素化合物が増幅産物の２本鎖核酸断片に取込まれても取込み密度がエチジウムブロマイド等よりも大幅に低く、それによる融解温度（Ｔｍ）の上昇が非常に少なく、ＰＣＲ反応効率に与える影響が極めて少ないことから可能となる構成である。
【００６３】
このような反応器を有するキットの構成の一例を図９に示す。この反応器は、反応領域５を形成できる適当な容器１内にプライマー３を塗布等の方法で配置し、更に、適当な壁材、例えば、パラフィンをコートした紙等の液密に仕切った容器を形成できるものによって構成した容器２内にＰＣＲ用の酵素、ヌクレオチド、緩衝液等の必要量を含む溶液をパックし、これを容器１内に配置して、試薬領域としたものである（図９（Ａ）、（Ｂ）参照）。これを用いてＰＣＲを行うには、ピペットマン等の適当な手段で鋳型核酸の溶液を反応領域５に注入する際に、試薬領域を構成する容器２を破壊して、容器２内の成分も反応領域５に移行させて、これらを混合してＰＣＲを行うことができる（図９（Ｃ）参照）。増幅産物の検出に用いる色素化合物は、ＰＣＲ後に反応領域に添加してもよいし、予め反応領域５内に配置しておいてもよい。あるいは、この色素化合物を、試薬領域２内の溶液中に含有させておいてもよい。
【００６４】
更に、複数の試薬領域を設けて、試薬領域に配置べき各成分を複数の試薬領域に分配配置してもよい。
【００６５】
色素化合物は、上述のようにＰＣＲを行わせる反応領域内に予め添加されていてもよいし、またＰＣＲ後に反応領域内に添加されても良い。ＰＣＲ後に反応領域内に添加する場合にも、反応領域と別に色素化合物の必要量を配置した試薬領域を設けておき、ＰＣＲ後に試薬領域から反応領域に色素化合物を添加するようにしても良い。なお、一般式［Ｉ］の化合物で水不溶性のものは、反応領域にこれを配置しておいても、ＰＣＲ中は反応液内に溶け出さず、ＰＣＲ後に適当な溶剤を反応領域に添加することで該化合物と増幅産物との反応を行うことが可能となる。従って、一般式［Ｉ］の化合物を用いることで、該化合物によるＰＣＲへは少ないものの、該化合物が水不溶性であることからＰＣＲへの影響を確実に排除することが可能となる。このような溶剤としては、アセトニトリル、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が挙げられる。このキットの反応領域内にプライマーの所定量を、塗布、あるいは粉末として反応器内に隔離して配置するなどの方法によって予め配置しておけば、ＰＣＲを反応領域内で行わせる場合における操作の簡便化が計れる。
【００６６】
一方、本発明における色素化合物によるＰＣＲ増幅産物の検出は、ＭＰＮ法にＰＣＲを応用した方法（ＭＰＮ−ＰＣＲ法）に好適に利用できる。この方法を用いることで、微生物、動物細胞、ヒト細胞、植物細胞等の個体数（細胞数、菌数、菌糸数等）の計測、これらが有する特定遺伝子の数の計測あるいは特定遺伝子のコピー数の計測等が行え、これらの操作の大幅な簡便化が計れる。
【００６７】
このＭＰＮ−ＰＣＲ法の操作の一例として、土壌からの被検出微生物の個体数（菌数）を計測する場合について以下に説明する。
【００６８】
先ず、土壌試料に、土壌試料中に含まれる微生物の核酸を抽出するための処理を行う。例えば、サンプル土壌（１ｇ）にリン酸緩衝液（１ｍｌ）を加え、２０秒間ずつ２回ボルテックスをかける。更に、１０％ＳＤＳを１／１０容加え、再びボルテックスをかけ、７０℃で１時間保温し、土壌中の菌を溶菌させる。遠心操作により土壌を除き、核酸画分を上清として回収する。７．５Ｍ酢酸ナトリウムを１／５容加え、混合し４℃に５分間放置する。上清を回収し（１ｍｌ）、４／５容のイソプロパノールを加え、核酸画分を遠心により回収する。０．１ｍｌのＴＥ緩衝液にこれを溶解し、その後ＲＮａｓｅ処理により、ＤＮＡを回収する。
【００６９】
回収したＤＮＡの一部を１００倍に希釈し、更にその一部を希釈して、希釈系列を１０-1〜１０-8まで作成する。図４に示すマイクロプレートのサンプルＡのブロックに、これらを配置する。つまり、土壌から回収されたＤＮＡ溶液（既に１００倍に希釈）の１０ー1希釈溶液がＡ１〜Ａ５に、１０ー2希釈溶液がＢ１〜Ｂ５に配置され、１０ー8希釈液がＨ１〜Ｈ５に配置されるまで、各希釈液について同様に配置する。ここで、ブランクを含めた全てのウエルにＰＣＲに必要な試薬（ヌクレオチド、プライマー塩、Ｔａｑポリメラーゼ等）を含む反応用溶液を加え、ＰＣＲを行う。反応後、上述した色素化合物を用いて各ウエルの蛍光強度を測定して、例えば、ブランクに対して２倍以上の蛍光強度のウエルを陽性として、陽性があらわれる希釈限界を求める。例えば、１０-4、１０-5及び１０-6において、各希釈液における５サンプル中の陽性サンプル数（陽性サンプル数／各希釈での試験サンプル数）が、１０-4希釈で５／５、１０-5希釈で３／５、１０-6希釈で０／５とすると、陽性が現れる希釈限界は、１０-5となる。そこで、これらの希釈率での陽性サンプルの数（５、３、０）を以下に示すＭＰＮ表（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２５，１０１（１９３３）の第４００頁の「ＩＩＩ．ＭＰＮ（Ｍｏｓｔ Ｐｒｏｂａｂｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ）表、１０倍希釈 ５連の場合」から部分的に引用）のＰ1、Ｐ2、Ｐ3に当てはめると、Ｐ1＝５、Ｐ2＝３、Ｐ3＝０の場合の数値として、０．７９が得られる。これはこのサンプル中に含まれる鋳型ＤＮＡの確立統計的に求められた個数である。そこで、上記の限界希釈倍率の逆数をこれに乗じ、さらに最初のサンプルの希釈率を考慮すれば、土壌中に含まれた鋳型ＤＮＡの個数は、０．７９×１０5×１０2＝０．７９×１０7個となる。この鋳型ＤＮＡが土壌中の検出対象としての微生物に特有のものであり、また、該微生物１個について１つ存在するものであれば、ここで得られた鋳型ＤＮＡの個数がそのまま土壌試料（１ｇ）中の微生物の個体数（菌数）となる。当然この場合、、全てのウエルが蛍光を放出する希釈系列では、その蛍光量は鋳型ＤＮＡの個数を反映したものであるので、これを基に蛍光量（蛍光強度）と鋳型ＤＮＡの個数（微生物の個体数）の検量線を作成できる。
【００７０】
【表１】
表１において、括弧で示してあるものは、信頼性の高いもの（確立Ｌが０．０５以上のものである。括弧で示されていないコードが出現した場合には、実験手法を再確認する必要がある。この表１として引用したＭＰＮ表は上記の文献のＭＰＮ表の一部であり、この部分以外の部分に係る結果が得られた場合は、適宜上記文献のＭＰＮ表の対応部分を参照すればよい。また、この文献には各種条件のＭＰＮ表があるので、所望とする試験条件等に応じてそれらを利用すればよい。
【００７１】
なお、先に述べた従来の技術の欄で述べたＰＣＲとアガロースゲル電気泳動を組み合わせたＭＰＮ−ＰＣＲ法では、陽性が現れる希釈限界を求める第１回目のＰＣＲと、得られた希釈限界付近を更に詳細に調べて、具体的な個数をＭＰＮ表から求めるための第２回目のＰＣＲが行われている。例えば、上記の土壌試料（１ｇ）から同様にＤＮＡを回収し、上記のように希釈せずに、その１０-1〜１０-9希釈まで段階希釈を調製して、従来の方法に適用し、各希釈液について、第１回目のＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動で増幅産物の有無を検出すると、１０-7希釈まで陽性となる。ここで、１０-6、１０-7、１０-8の３つの希釈について各々５サンプルずつ再度ＰＣＲを行い、各希釈での５サンプル中の陽性のサンプル数を求めると、１０-6希釈で５／５、１０-7希釈で３／５、１０-8希釈で０／５となり、上記と同様にＭＰＮ表から０．７９という値が得られ、これに陽性が現れる限界希釈の希釈率の逆数を乗じた値（０．７９×１０7）が土壌中の鋳型ＤＮＡの個数となる。しかしながら、この方法は、ＰＣＲと電気泳動とを含む操作を２回繰返すもので、操作が非常に煩雑である。これに対して、発明の方法では、１回のＰＣＲで直接結果を得ることが可能であり、また電気泳動操作が省略できる。従って、計測操作を大幅に簡便化できる。
【００７２】
このＭＰＮ−ＰＣＲ法でのＰＣＲにおける増幅産物の先に説明した色素化合物による検出は、先のＰＣＲ増幅産物の定量方法で用いた各操作及びその条件、あるいはキット等が利用できる。
【００７３】
また、このＭＰＮ−ＰＣＲ法では多段階の希釈サンプルを統計的処理のために同時に処理することが必要とされるので、マイクロプレート等の多数の反応領域（ウエル）を有する器具を用いることが好ましい。ＰＣＲ反応を別の容器内で行った場合でも、増幅産物の色素化合物による検出はマイクロプレートのような器具で行うことが好ましい。
【００７４】
この鋳型ＤＮＡ数の測定法は、例えば、各種溶液中や土壌中の計測対象菌の菌数の測定、各種試料中の微生物の菌数の測定、各種試料中の細胞数の測定、各種組織中の細胞数の測定、あるいは各種生体試料中の特定遺伝子の数やそのコピー数の測定に有効に利用できる。例えば、通常、鋳型ＤＮＡの濃度は、光吸収強度等の測定からグラム量で見積もられることが一般的であるが、例えば癌細胞の場合のようにコピー数（特定遺伝子の数）が問題になる場合も多い。そのような場合に本発明の方法は有効である。この本発明の方法により組織中の特定遺伝子のコピー数を知る場合には、すべてに共通な遺伝子について上述の方法によりその数を求め、次に癌遺伝子等特定遺伝子の数を求め、正常細胞と癌細胞について共通遺伝子と特定遺伝子の比を求めることにより、核酸を抽出する細胞の量に関係なく特定遺伝子のコピー数を得ることができる。
【００７５】
また、あるヒト組織中に癌細胞が存在するかどうかの判定にもこの方法は有用である。例えば、ある組織を構成する細胞に共通の特定遺伝子の数をこの方法により求め、次に、検出対象としての癌細胞に特定の遺伝子の数を同一組織試料についてこの方法により求める。
【００７６】
【実施例】
参考例１
無水酢酸１００ｍｌと濃硫酸３０ｍｌとを冷却しながら混合し、得られた混合液をウォーターバスで８０℃に保ちながら３時間加温した。そこに無水酢酸２０ｍｌ、ｐ−ジメチルアミノアセトフェノン３０ｍｌを室温下で加え、その後４５℃に温度を上昇させて２４時間攪拌し反応させた。この反応液に等量のエタノールを加え、冷却し、更にヨウ化カリウム水溶液を加えると粗結晶が析出した。この粗結晶を濾過により回収し、エタノール／エーテルの混合系（容量比、１：４）で再結晶させて、２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム アイオダイド（表２の化合物１（ただしＹはＩである））の緑色の結晶を得た。
得られた化合物１（Ｙ：Ｉ）の分析結果
融点：２５４〜２５７℃
ＵＶ／可視（ＣＨ3ＣＮ ε×１０-4）λmax ：４４４ｎｍ（２．４３）、５５０ｎｍ（８．２４）
ＮＭＲ（1Ｈ、DMSO）δｐｐｍ：８．３７３７（１Ｈ、ｓ）、８．２７２９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、８．１７９５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、７．８８６４（１Ｈ、ｓ）、６．９１１７（４Ｈ、ｔ、ＪAB＝ＪBC＝９．７７）、３．１８２９（６Ｈ、ｓ）、３．１３４０（６Ｈ、ｓ）、２．６８０９（３Ｈ、ｓ）
ＦＡＢ ｍａｓｓ ｍ／ｚ ３３３
ＩＲ（ＫＢｒ）νｃｍ-1：１６４５、１６１０（ｓｈ）、１５８０（ｓ）、１４９０（ｓ）、１２７０、１２００、１１６０
更に、ヨウ化カリウム水溶液の代わりに過塩素酸水溶液を用いる以外は上記と同様にして２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムの過塩素酸塩（化合物１（Ｙ：ＣＩＯ4））を得た。
【００７７】
参考例２
硫化ナトリウム９水和物２０ｇをイオン交換水に溶解させ全量を５０ｍｌとした。この溶液に炭酸水素ナトリウム７ｇを加え溶解させた後、氷冷下、５０ｍｌのエタノールを更に加えてから、室温で３０分間攪拌した。析出した炭酸ナトリウムを濾別し、２５ｍｌのエタノールで洗浄し、濾液と洗液を合わせ、約１２５ｍｌの水硫化ナトリウムの水・エタノール溶液を得た。
【００７８】
次に、参考例１で得た２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム アイオダイドの０．９２ｇを２０ｍｌのＤＭＳＯに溶解させ、得られた溶液に先に調製した水硫化ナトリウムの水・エタノール溶液の５ｍｌを加え、室温下で５分間攪拌した。攪拌後、ヨウ化水素酸０．７５ｍｌを加え、更に５分間攪拌した。以下、常法に従って、ジクロロメタン抽出、シリカゲルカラム精製を行った後、エタノール／エーテル混合液（容量比、１：４）で再結晶させて、０．７ｇの２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チオピリリウム アイオダイドの結晶（表２の化合物２（ただし、ＹはＩである））を得た。
得られた化合物２（Ｙ：Ｉ）の分析結果
融点：２４６〜２４８℃
ＵＶ／可視（ＣＨ3ＣＮ ε×１０-4）λmax ：４９５ｎｍ（２．５０）、５８７ｎｍ（４．９５）
ＮＭＲ（1Ｈ、DMSO）δｐｐｍ：８．５６７９（１Ｈ、ｓ）、８．４３２３（１Ｈ、ｓ）、８．２４３６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２７Ｈｚ）、７．９７８６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２８）、６．８９５９（４Ｈ、ｔ、ＪAB＝ＪBC＝９．２８）、３．１７５６（６Ｈ、ｓ）、３．１１５７（６Ｈ、ｓ）、２．８３２３（３Ｈ、ｓ）
ＦＡＢ ｍａｓｓ ｍ／ｚ ３４９
ＩＲ（ＫＢｒ）νｃｍ-1：１６００（ｓ）、１５６０（ｓ）、１４６０（ｓ）、１４３０（ｓ）、１３７０（ｓ）、１２６０（ｓ）、１１６０（ｓ）
更に、ヨウ化水素酸の代わりに過塩素酸水溶液を用いる以外は上記と同様にして２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チオピリリウムの過塩素酸塩（化合物２（Ｙ：ＣＩＯ4））を得た。
参考例３
下記の表２に示す化合物３〜５５をそれぞれ用意した。表２において、Φはｐ−フェニレン基：
【００７９】
【化３１】
またはフェニル基を表わす。
【００８０】
【表２】
【００８１】
【表３】
【００８２】
【表４】
【００８３】
【表５】
【００８４】
【表６】
【００８５】
【表７】
【００８６】
【表８】
【００８７】
【表９】
【００８８】
【表１０】
【００８９】
【表１１】
【００９０】
【表１２】
【００９１】
【表１３】
【００９２】
【表１４】
【００９３】
【表１５】
【００９４】
【表１６】
【００９５】
【表１７】
【００９６】
【表１８】
【００９７】
【表１９】
【００９８】
【表２０】
なお、これらの化合物は以下の公知の方法により合成した。なお、具体的な反応操作は常法に従った。
【００９９】
化合物７は、W.Foerstらの「New Methods of Preparative Organic Chemistry」、Acad. Press（1964）に記載の方法に従って、化合物［ｉ］
【０１００】
【化３２】
を合成した後、これと
【０１０１】
【化３３】
（ｐ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンズアルデヒド）とを反応させて得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させて得た。化合物１７は、化合物［ｉ］と
【０１０２】
【化３４】
（ｐ−ジエチルアミノスチリルベンツアルデヒド）とを反応させて得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させて得た。また、化合物［ｉ］を水硫化ナトリウムと反応させることにより化合物［ｉｉ］
【０１０３】
【化３５】
を得た後、この化合物［ｉｉ］を化合物７、１７と同様にして化合物８、１８を合成した。
【０１０４】
R. WizingerらのHelv. chim. Acta、39、217 (1956)に記載の方法に従い、アセトフェノンとアセトアルデヒドから以下に示すルート
【０１０５】
【化３６】
を経て、化合物［ｉｉｉ］
【０１０６】
【化３７】
を合成した。この化合物［ｉｉｉ］を原料として、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドとの反応から得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させて化合物５を、ｐ−ジエチルアミノスチリルベンツアルデヒドとの反応から同様にして化合物１５を、ｐ−ジメチルアミノ桂皮アルデヒドとの反応から同様にして化合物９を、
【０１０７】
【化３８】
との反応から同様にして化合物１１をそれぞれ得た。また、化合物［ｉｉｉ］を水硫化ナトリウムと反応させることにより化合物［ｉｖ］
【０１０８】
【化３９】
を得た後、化合物［ｉｉｉ］に代えて化合物［ｉｖ］を用いる以外は、化合物５、１５、９及び１１の合成の場合と同様の方法で、化合物６、１６、１０及び１２をそれぞれ得た。
【０１０９】
更に、原料のアセトアルデヒドをｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドに代える以外は、化合物［ｉｉｉ］の合成の場合と同様にして、化合物３のカチオン部分を得た後、これに水硫化ナトリウムを反応させて得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させ、化合物４を得た。また、同様にしてｐ−メチルベンズアルデヒとアセトフェノンから化合物［ｖ］
【０１１０】
【化４０】
を得た後、それを水硫化ナトリウムと反応させて化合物［ｖｉ］
【０１１１】
【化４１】
を得た。更に、化合物［ｖ］及び［ｖｉ］をそれぞれｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドと反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させて化合物１３及び１４を得た。
【０１１２】
化合物１９、２０及び２１は、化合物［ｉ］または［ｉｉ］と、化合物１または２のカチオン部分とを
【０１１３】
【化４２】
と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させて得た。化合物２２、２３及び２４は、化合物［ｉ］または［ｉｉ］と化合物１または２のカチオン部分とを、
【０１１４】
【化４３】
と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させて得た。化合物２５及び２６は、化合物［ｉ］または［ｉｉ］を
【０１１５】
【化４４】
と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させて得た。化合物２７、２８及び２９は、化合物［ｉ］または［ｉｉ］と化合物１または２のカチオン部分とを、オルトギ酸エチル［ＨＣ（ＯＣ2Ｈ5）3］と反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させることにより合成した。化合物３０、３１及び３２は化合物［ｉｉｉ］または［ｉｖ］と、［ｉｉｉ］と［ｉｖ］と同様の方法によりｐ−ジメチルアミノアセトフェノンから合成した化合物［ｉｉｉ］と［ｉｖ］のジメチルアミノ誘導体と、オルトギ酸エチルとを反応させ、得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させることにより合成した。
【０１１６】
化合物３３〜５５は以下の各反応によりそれぞれ合成した。
化合物３３の合成
【０１１７】
【化４５】
化合物３４の合成
【０１１８】
【化４６】
化合物３５の合成
【０１１９】
【化４７】
化合物３６の合成
【０１２０】
【化４８】
化合物３７の合成
【０１２１】
【化４９】
化合物３８の合成
【０１２２】
【化５０】
化合物３９の合成
【０１２３】
【化５１】
化合物４０は、化合物３６の合成で原料を
【０１２４】
【化５２】
から
【０１２５】
【化５３】
に変更して合成した。
【０１２６】
化合物４１は、化合物３７の合成で原料を
【０１２７】
【化５４】
から
【０１２８】
【化５５】
に変更して合成した。
【０１２９】
化合物４２は、化合物３８の合成で原料を
【０１３０】
【化５６】
から
【０１３１】
【化５７】
に変更して合成した。
【０１３２】
化合物４３は、化合物３９の合成で原料を
【０１３３】
【化５８】
から
【０１３４】
【化５９】
に変更して合成した。
化合物４４の合成
【０１３５】
【化６０】
化合物４５の合成
【０１３６】
【化６１】
化合物４６の合成
【０１３７】
【化６２】
化合物４７の合成
【０１３８】
【化６３】
化合物４８は、化合物４４の合成で原料を
【０１３９】
【化６４】
から
【０１４０】
【化６５】
に変更して合成した。
化合物４９は、化合物４５の合成で原料を
【０１４１】
【化６６】
から
【０１４２】
【化６７】
に変更して合成した。
化合物５０は、化合物４６の合成で原料を
【０１４３】
【化６８】
から
【０１４４】
【化６９】
に変更して合成した。
化合物５１は、化合物４７の合成で原料を
【０１４５】
【化７０】
から
【０１４６】
【化７１】
に変更して合成した。
化合物５２の合成
【０１４７】
【化７２】
化合物５３の合成
【０１４８】
【化７３】
化合物５４の合成
【０１４９】
【化７４】
化合物５５の合成
【０１５０】
【化７５】
参考例４
参考例１で得た化合物１を１０％アセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、化合物１の最終濃度が３×１０-5Ｍになるように調整してサンプルＩとした。このサンプルＩの一部を用いてその吸収スペクトルを分光光度計を用いて常法により測定した。
【０１５１】
次に、Salmon sparm DNA （Sigma社製）をＴＥ緩衝液（10mM Tris-1mM EDTA）に溶解し、フェノール抽出により精製した。取扱を容易にするために、この精製物を更に制限酵素ＥｃｏＲＩで消化処理し、得られた処理液をＤＮＡ溶液とした。このＤＮＡ溶液の一部とサンプルＩの一部とを混合して、ＤＮＡの最終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるように調整し、更に、化合物１の最終濃度が３×１０-5Ｍになるように調整して、サンプルＩＩとした。このサンプルＩＩの一部を用いてその吸収スペクトルを常法により測定した。その結果、該化合物の吸収のピークは、ＤＮＡとの相互作用により長波長側に２０〜３０ｎｍシフトした。これは、典型的なインターカレーターの性質である。
【０１５２】
サンプルＩの一部を用いてその蛍光スペクトルを常法により測定したところ、ＤＮＡ非存在下では５５０ｎｍで励起した場合、６５０ｎｍ付近に弱いピークが検出された。次にサンプルＩＩの一部を用いて同様にして蛍光スペクトルを測定したところ、サンプルＩＩ中では、同じ波長での励起で、ＤＮＡ非存在下における場合の約１００倍の蛍光強度のピークが６５０ｎｍ付近に検出された。以上の結果は、化合物１が強力なインターカレーターであることを示している。
【０１５３】
次に、先に調製したＤＮＡ溶液と、化合物１と、１０％アセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸緩衝液を用いて、化合物１を５×１０-6Ｍの濃度で含み、かつＤＮＡ濃度が異なる溶液を調製した。得られた各溶液の蛍光強度を常法により測定して、ＤＮＡ濃度に対する蛍光強度の変化を求めた。蛍光強度はＤＮＡ濃度が増加するに従って増大し、最大で、ＤＮＡ非存在下の時の蛍光強度の約４００倍増大した。なお、励起光としては、Ｘｅランプを光源とし４８０ｎｍのローカットフィルターにより紫外光を除去したものを用いた。更に、表２の化合物について上記と同様の蛍光強度等についての測定を行った。その代表例について表３に示す。
【０１５４】
【表２１】
実施例１［２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム塩を用いた核酸の定量方法］
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの１６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ遺伝子（以下１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と略記）をターゲットとしたＰＣＲを行い、その増幅産物を２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム塩を用いて検出した。
【０１５５】
まず、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの全ＤＡＮを以下の様にして調製した。２×ＹＴ培地で終夜培養した菌体２ｍｌを遠心分離により集菌し、０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）の０．５ｍｌに懸濁させた。得られた懸濁液に１０％ＳＤＳ溶液の０．０５ｍｌを加え、十分に混合の後、７０℃で１時間保温した。この懸濁液をボルテックスミキサーで攪拌し、菌体を完全に溶菌した。この溶菌液に等量のフェノール／クロロホルムを加え、混合、遠心分離の後、上層を分取し、２倍量のエタノールを加え、ＤＮＡを沈澱物として回収した。これを１００μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。
【０１５６】
ＰＣＲ用プライマーとしては以下の２本のものを用いた。
プライマー１ ５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧ ３’（配列番号：１）
プライマー２ ５’ＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＣＡＣＧＡＣＡＣ ３’（配列番号：２）
これらのプライマーは、ＡＢＩ社製のＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ３８１Ａを用いて合成した。合成に必要な試薬、手法などはＡＢＩ社のプロトコルに拠った。
これらの鋳型ＤＮＡ及びプライマーを用いて以下の条件でのＰＣＲを行った。
ＰＣＲの条件：
反応溶液組成（全容量５０μｌ）
５μｌ １０×ｂｕｆｆｅｒ
５μｌ ｄＮＴＰｓ
プライマー１及び２ それぞれ１０ｐｍｏｌ
Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ ０．５単位
鋳型ＤＮＡ
５００ｐｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇまたは１０ｆｇ
各成分を加えて全容量を滅菌水を加えて５０μｌとし、Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ チューブ（全容量０．５ｍｌ、宝酒造社製）内で反応を行わせた。鋳型ＤＮＡを含まない以外は上記と同様の組成のサンプルをブランクとして調製した。ここで、１０×ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓはポリメラーゼに添付のものをそのまま使用した。
反応サイクル
９２℃、５分間のプレインキュベーション
９２℃、４５秒／５５℃、６０秒／７２℃、９０秒を３０サイクル
最後に７２℃、５分間のインキュベーション
ここで、ＰＣＲ装置はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社のＧｅｎｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９６００を用いた。増幅産物の検出は以下のようにして行った。反応が終了した各サンプルを９６ウエル・マイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製Ｆａｌｃｏｎアセイプレート３９１１（Ｕ底））に総量５０μｌになるようにＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ）で２倍、１０倍、２０倍に希釈した（図１参照）。次に、各ウエルに１５０μｇ／ｍｌの２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム アイオダイドのアセトニトリル溶液１μｌを加え、ピペッティングにより十分に混合した。このマイクロプレートをミリポア蛍光装置（サイトフロー２３５０）にセットし、励起光側に５９０ｎｍ、放射光側に６４５ｎｍの光を透過するフィルターをそれぞれ用いて、励起光の照射と、蛍光の測定を行った。その結果得られた反応液の各希釈における測定された蛍光強度（６４５ｎｍ）と鋳型ＤＮＡ量との関係を図２に示す。また、ブランクのサンプルにおいては、蛍光は観測されなかった。図２の結果では、蛍光強度は各希釈サンプルにおいて、鋳型ＤＮＡ量と比例して増加し、蛍光強度から鋳型ＤＡＮの量が定量できることが示された。なお、鋳型ＤＮＡが１００ｆｇ、１０ｆｇの場合にはＰＣＲ増幅産物は検出されなかった。
【０１５７】
以上と同様の操作を行い、各ウエルの反応液への２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム塩の添加は行わずに、各反応液を５μｌ分取し、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（以下ＥＢという）より染色し、バンドの濃さによりＰＣＲ増幅産物の量を調べた。その結果、鋳型ＤＡＮが５００ｐｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇでは明確なバンドが、１ｐｇではわずかにバンドが観測され、１００ｆｇ、１０ｆｇではＰＣＲ増幅産物は観測されなかった。また、５００ｐｇでは蛍光強度が飽和して、１００ｐｇとほとんど変わらなかった。更に、ゲル上にＰＣＲ増幅産物のバンドの他に、プライマー間の反応生成物である高次構造物と思われる蛍光が低分子量領域に観察された。
【０１５８】
比較例１［ＥＢを用いたＰＣＲ増幅産物の検出］
２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム塩の代わりに、ＥＢと以下の操作条件を用いる以外は、実施例１と同様の操作を行った。ＥＢは２５０μｇ／ｍｌの溶液として、その１μｌを各ウエルに添加し、ピペティングにより十分に混合し、５分間室温に放置した。ミリポア蛍光装置の励起光側に４８５ｎｍ、放射光側に６２０ｎｍの光を透過するフィルターをセットして蛍光強度の測定を行った。その結果、ブランクのサンプルのウエルを含む各ウエル内の反応溶液はいずれも赤く蛍光を発した。しかも、鋳型ＤＡＮの入ったサンプルにおける蛍光強度と、鋳型ＤＡＮが入っていないサンプルの蛍光強度に差はなく、定量は不可能であった。これは、鋳型ＤＮＡの入っていないサンプル（ブランク）においてプライマー間の反応でＥＢの蛍光増大を引き起こす高次構造物が生じたためである。
【０１５９】
比較例２［ＹＯＹＯ−１を用いたＰＣＲ増幅産物の検出］
２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム塩の代わりに、ＹＯＹＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）と以下の操作条件を用いる以外は、実施例１と同様の操作を行った。ＹＯＹＯ−１は１ｍＭの溶液を１２０倍に希釈し、その１μｌを各ウエルに添加し、ピペティングにより十分に混合し、５分間室温に放置した。ミリポア蛍光装置の励起光側に４８５ｎｍ、放射光側に５３０ｎｍの光を透過するフィルターをセットして蛍光強度の測定を行った。得られた結果を図３に示す。図３の結果では、鋳型ＤＡＮの量に比例して蛍光強度の増加が認められたが、増加率は低い。更に、ブランクにおいては鋳型ＤＡＮが含まれたサンプルと同程度の蛍光強度が観察された。このブランクにける蛍光もプライマー間の反応生成物である高次構造物に起因するものと考えられる。従って、この色素を用いた定量では、ブランクとの差が低く、しかも鋳型ＤＮＡの量に比例した蛍光強度の増加率も低いので定量性が良くないことがわかる。
【０１６０】
以上の実施例１及び比較例１、２の結果から、２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム アイオダイドを用いた蛍光による定量では、プライマー間の反応生成物である高次構造物の影響を受けることなく正確な定量が行えることがわかった。この結果は、実施例１の各反応液のアガロースゲル電気泳動でのＥＢによる染色での結果を反映している。また、このＥＢでのアガロースゲル染色では、５００ｐｇと１００ｐｇとでは蛍光が飽和してしまう結果増幅産物量はみかけ上同じになるが、２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム塩による検出においてはＥＢで蛍光が飽和してしまうサンプルにおいても蛍光強度の飽和はなく定量が可能であった。
【０１６１】
実施例２［マイクロプレートを用いたＰＣＲ法による土壌中の菌数測定］
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株の終夜培養液（２×ＹＴ培地）を混入させた土壌からＤＮＡを常法により回収し、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとしたＰＣＲを行い、ＰＣＲ−ＭＰＮ法により菌数を測定した。
【０１６２】
Ｅ．ｃｏｌｉは、土壌１ｇ当り約１０7、約１０6、約１０5、約１０4の菌数（それぞれ図４に示すサンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）になるように加え、攪拌した。大腸菌を加えた各土壌１ｇを０．１Ｍりん酸ナトリム緩衝液（ｐＨ８．０）の０．５ｍｌに懸濁させた。この懸濁液に１０％ＳＤＳ溶液の０．０５ｍｌを加え、十分に混合の後、７０℃で１時間保温した。この懸濁液をボルテックスミキサーで攪拌し、菌体を完全に溶菌した。この溶菌液に等量のフェノール／クロロホルムを加え、混合、遠心分離の後、上層を分取し、２倍量のエタノールを加え、ＤＮＡを沈澱物として回収した。これを１００μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。
【０１６３】
ＰＣＲ用プライマーはＥ．ｃｏｌｉの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に対するもので、以下の２本のものを用いた。
プライマー１ ５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ ３’（配列番号：３）
プライマー２ ５’ＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＣＡＣＧＡＣＡＣ ３’（配列番号：４）
これらのプライマーは、ＡＢＩ社製のＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ３８１Ａを用いて合成した。合成に必要な試薬、手法などはＡＢＩ社のプロトコルに拠った。
【０１６４】
これらの鋳型ＤＮＡ及びプライマーを用いて実施例１と同様の条件でのＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９６ウエル・マイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製Ｆａｌｃｏｎアセイプレート３９１１（Ｕ底））の各ウエル内で行った。また、このマイクロプレートは、各ウエル内には予め実施例１と同様の濃度の２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム アイオダイドのアセトニトリル溶液１μｌを塗布し、乾燥保存したものである。鋳型ＤＮＡは図４のように段階的に１０倍希釈系列を縦の列に８段階作成し、横の５列には同じサンプルを準備し、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ装置としては、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．のＭｏｄｅｌ ＰＴＣ−１００−９６を用いた。
【０１６５】
ＰＣＲ反応終了後マイクロプレートの各ウエル内にアセトニトリルを５μｌ加え、よく攪拌した後、５分間放置した。その後、ミリポア蛍光装置（サイトフロー２３５０）にセットし、実施例１と同様なフィルターを用いて蛍光を測定した。その結果、図５のような結果が得られた。ここで、ブランクの２倍以上の蛍光をもつものをＰＣＲ増幅産物ができたものとみなした（斜線で塗り潰したウエル）。この結果を、ＭＰＮ法で用いられる表に当てはめて計算すると、それぞれの土壌から得られた大腸菌の菌数は４．９×１０6、７．９×１０5、２．２×１０5、７．９×１０3となった。
【０１６６】
比較例３
実施例２で調製したＥ．ｃｏｌｉを異る濃度で混入させた各土壌サンプルに含まれるＥ．ｃｏｌｉの個数を、Ｅ．ｃｏｌｉ用の培養プレートにサンプルの所定量を接種して培養した後に表われるコロニー数から菌数を求めるプレートカウント法により求めた。得られた結果と、実施例２で得られた結果との相関を見ると、図６のように非常によく一致した。
以上の実施例２と比較例３の結果から、本発明のＰＣＲを利用する菌数の測定法によれば、簡便な操作で菌数の計測を行うことができ、得られた結果も従来法であるプレートカウント法と非常に良く一致した。
【０１６７】
実施例３［マイクロプレートを用いたＰＣＲ法による鋳型ＤＮＡの定量］
実施例２で用いたのと同様のマイクロプレートの各ウエルに実施例２で用いたのと同様の、２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム アイオダイドのアセトニトリル溶液１μｌ、及びプライマー（２種、各々１０ｐｍｏｌｅ）を塗布し、乾燥保存した。
一方、一夜培養した大腸菌の培養液２ｍｌから実施例２と同様の方法により大腸菌のＤＮＡを抽出し、それを１００倍に希釈してて鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【０１６８】
次に、この鋳型ＤＮＡ溶液の希釈系列を実施例２と同様に作成し、図５と同様に１μｌずつマイクロプレートに加えた。次に、Ａｍｐｌｉ Ｗａｘ ＰＣＲ Ｇｅｍ １００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）１個及び以下の組成分を含むＰＣＲ用反応溶液を各ウエルに加えた。
【０１６９】
５μｌ １０×ｂｕｆｆｅｒ
５μｌ ｄＮＴＰｓ
Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ ０．５単位
更に、各ウエルに滅菌水を加えて全量を５０μｌとして、ＰＣＲを行わせた。ここで、ＰＣＲ装置は、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．のＭｏｄｅｌ ＰＴＣ−１００−９６を用いた。ＰＣＲの反応条件は実施例１と同様である。
【０１７０】
ＰＣＲ後のマイクロプレートの各ウエルにアセトニトリル５μｌ加え、よく攪拌した後、５分間放置した。その後、ミリポア蛍光装置（サイトフロー２３５０）にセットし、実施例１と同様なフィルターを用いて評価した。その結果、図７のような結果を得た。ここでブランクの２倍以上の蛍光をもつものをＰＣＲ増幅産物がきたものとみなし、斜線で塗りつぶした。この結果を、ＭＰＮ法で用いられる表に当てはめるて計算すると、鋳型ＤＮＡの分子数は３．５×１０7であることがわかった。最初に１００倍希釈を行っていることを考えると、鋳型ＤＮＡの分子数は、３．５×１０9個であるといえる。
【０１７１】
比較例４
実施例３で用いたＥ．ｃｏｌｉの培養液２ｍｌ中の菌数をコロニーカウントプレート法により求めたところ、４×１０9個であり、実施例３で得られた結果とほぼ一致する。
【０１７２】
実施例２及び３から鋳型ＤＮＡの希釈とＭＰＮ法による検出に望ましい濃度範囲を知ることができ、またサンプルの濃度を設定することができる。その結果、個体数、コピー数、鋳型ＤＮＡの量を求める検量線を設定することが可能となる。
【０１７３】
実施例４［癌特異遺伝子のＰＣＲによる検出キット］
（１）ｍＲＮＡの抽出
大腸癌の疑われる組織２か所からそれぞれ５ｍｍ角のサイズでサンプルをバイオプシーで患者から採取した（これを組織Ａ、Ｂとする）。この組織からｍＲＮＡを常法（新生化学実験講座２、核酸Ｉ、第４８頁）により抽出した。つまり、各組織にそれぞれ２ｍｌのＤ液［４Ｍグアニジンチオシアネート；２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）；０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム；及び０．１Ｍ２−メルカプトエタノール］を加え、素早くホモジナイズした。ホモジナイズは滅菌管中ポリトロンで１０秒間を３回行った。これに０．２ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、２ｍｌの水飽和フェノール、０．４ｍｌのクロロホルム−イソペンチルアルコール（４９：１、ｖ／ｖ）を加えた。各試薬を加える度によく攪拌した。１０秒間ボルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ）ミキサーで振とう後、１５分間氷中で冷却した。４℃、１００００×ｇで２０分間遠心後、水層に等量のイソプロプロピルアルコールを加えて、−２０℃で一晩放置した。４℃、１００００×ｇで２０分間遠心後沈澱に０．６ｍｌの割合でＤ液を加え、５０℃で溶解した。等量のイソプロピルアルコールを加え、−２０℃で１時間冷却後、４℃、１００００×ｇで２０分間遠心し、沈澱を７５％エタノールに懸濁後、４℃、１００００×ｇで再び２０分間遠心し、沈澱を乾燥して粗ＲＮＡ画分とした。粗ＲＮＡ画分を６５℃で５分間加熱し、室温まで急冷し、等量の２倍濃度のＴＮＥＬ緩衝液［２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）；０．５Ｍ塩化ナトリウム；１ｍＭ ＥＤＴＡ及び；０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム］で洗った。ＴＮＥＬ緩衝液で平衡化したオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に粗ＲＮＡ画分をかけ、その後、抽出用溶液（ＴＮＥＬ緩衝液から０．５Ｍ塩化ナトリウムを除いたもの）でｍＲＮＡを溶出した。
【０１７４】
（２）ｃＤＮＡの調製
上記のｍＲＮＡから２本鎖ｃＤＮＡの作成には、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＴｉｍｅＳａｖｅｒTM ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いた。
（３）定量キットの構成
大腸癌検出用のプライマーとして、以下の配列のオリゴヌクレオチドを用いた。
プライマー１：５’ＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＧＡＧＡＡＴＣＡＴＡ ３’（配列番号：５）
プライマー２：５’ＡＴＣＣＡＡＴＣＡＣＣＣＡＣＡＴＧＣＡＴＴ ３’（配列番号：６）
図９に示す容器１としてのエッペンドルフの底に、プライマー１及び２の溶液を、それぞれの量が１０ｐｍｏｌとなるように塗布し、さらに容器２をパラフィンコートした紙で作成し、この中に以下の成分をパックした。
ｄＮＴＰ・・・５μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ・・・０．５ユニット
１５０μｇ／ｍｌの２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム アイオダイドのアセトニトリル溶液・・・１μｌ
１０×ｂｕｆｆｅｒ・・・５μｌ
蒸留水・・・３９μｌ
（冷凍保存）
この容器２を図９の（Ｂ）に示すように容器１内にセットして、キットを得た。次に、それぞれの組織Ａ、Ｂから先に述べた操作により得られたｃＤＮＡサンプルの段階希釈（１（希釈なし）、１／２、１／１０、１／５０、１／１００、１／１０００、１／１００００希釈）を調製し、希釈していないサンプルと各希釈液を個々に上記の構成のキットに、ピペットマンで容器１の底の部分に注入した。その際、容器２の部分のパラフィンコート紙を破いた。ｃＤＮＡ注入後、各容器を遠心処理し、容器２の部分内の成分をプライマーのある反応領域５に移行させた。完全に移行したことを確認後、試薬が入っていた容器２を容器１から取り除き、そこにＡｍｐｌｉ Ｗａｘ ＰＣＲ Ｇｅｎ １００ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）１個ずつそれぞれ加えた。
（４）ＰＣＲ反応及び検出
【０１７５】
実施例１と同様の条件で、ＰＣＲを行い、さらに各容器内のサンプルを希釈せずに蛍光強度の測定を行った。組織Ａについての結果を図８に示す。組織Ａでは標的遺伝子が増幅していることがわかる。また、鋳型となったＤＮＡの希釈率に対応して定量的に増幅産物ができていることがわかる。一方、組織Ｂでは、蛍光は認められなかった。
（５）電気泳動での分析
検出後の試料からのｃＤＮＡをエタノール沈澱により回収後、アガロースゲル電気泳動で調べた。組織Ａからの鋳型として利用されたｃＤＮＡについては、その量が１（希釈せず）、１／２〜１／１０００希釈までは３１７ｂｐ部分にバンドが認められたが、１／１００００希釈、ｃＤＮＡを加えずにプライマーのみで反応させた場合、及び組織Ｂからのものではバンドが見られなかった。
【０１７６】
比較例５
実施例４で採取した組織Ａ、Ｂについて従来法である培養法により評価した。組織Ａでは増殖が認められ、悪性癌と判断された。組織Ｂでは増殖は認められず、良性のポリープと判断された。
【０１７７】
【発明の効果】
本発明によれば、２本鎖核酸と特異的に反応する色素化合物をＰＣＲ増幅産物の検出に用いるので、ＰＣＲを利用する各種の検出、定量あるいは菌数の計測における操作の大幅な簡便化が計れ、しかも正確な測定や定量が行える。
【０１７８】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：ＰＣＲ用プライマー
配列
AGAGTTTGAT CATGGCTCAG 20
【０１７９】
配列番号：２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：ＰＣＲ用プライマー
配列
AACCCAACAT CTCACGACAC 20
【０１８０】
配列番号：３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：ＰＣＲ用プライマー
配列
AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG 20
【０１８１】
配列番号：４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：ＰＣＲ用プライマー
配列
AACCCAACAT CTCACGACAC 20
【０１８２】
配列番号：５
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：ＰＣＲ用プライマー
配列
GACTCTGGAG TGAGAATCAT A 21
【０１８３】
配列番号：６
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：ＰＣＲ用プライマー
配列
ATCCAATCAC CCACATGCAT T 21
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において調製した各サンプルのマイクロプレート上での配置を示す図である。
【図２】実施例１で得られた蛍光強度と鋳型ＤＮＡ（テンプレート）量との関係を示す図である。
【図３】比較例２で得られた蛍光強度と鋳型ＤＮＡ（テンプレート）量との関係を示す図である。
【図４】実施例２において調製した各サンプルのマイクロプレート上での配置を示す図である。
【図５】実施例２においてマイクロプレートで調製した各サンプルでのＰＣＲ増幅産物の形成状態を示す図であり、斜線部は蛍光強度がブランクの２倍以上のウエルを示す。
【図６】実施例２と比較例３で得られた菌数の相関関係を示す図である。
【図７】実施例３においてブランクの２倍以上の蛍光強度を示すウエルの位置を示す図である。
【図８】実施例４における組織Ａからのサンプルでの結果を示す図である。
【図９】本発明の核酸検出用のキットの一例の構成及び使用方法を示す図である。
【符号の説明】
１ 容器
２ 試薬領域を構成する容器
３ プライマー
４ ピペット先端部
５ 反応領域
【産業上の利用分野】
本発明は、ＰＣＲ増幅産物の検出を、遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物で行う核酸の定量方法、微生物または細胞の数、特定遺伝子数及び特定遺伝子コピー数の計測法、ならびにこれら方法に用いる測定用キットに関する。この計測法は各種溶液中や土壌中の計測対象菌の菌数の測定等に利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＣＲ法は、２種のプライマーによって規定された特定配列を鋳型（テンプレート）として、酵素的にこの特定配列を増幅する方法であり、核酸の検出にも利用されるようになってきている。すなわち、検出対象としての標的核酸中の特定配列を選定し、この特定配列の増幅に必要なプライマーを用意し、標的核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅された特定配列を検出することで、標的核酸の検出が可能となる。このようにＰＣＲを用いた核酸の検出方法では、検出対象の特徴的部分である特定配列が増幅されて検出され、しかもその増幅率も大きいので、試料中における標的核酸の量が微量であっても、その検出が可能となる。例えば、数時間の反応で１００万倍程度の増幅率を得ることも可能であり、ＰＣＲ法を用いることで１分子の核酸が存在すればこの核酸の検出が可能となる場合もある。この増幅反応は鋳型核酸と２種のプライマーとの間に相補的配列がある場合のみ進行し、相補的配列がない場合には増幅産物は得られない。
【０００３】
ＰＣＲ法を用いることで核酸の検出感度は飛躍的に向上し、最近ではハイブリダイゼーション法を用いる核酸検出法に代わって種々の分野での核酸の検出に利用されるに至っている。特に、ウイルス、細菌等による感染症の臨床検査などの分野における病原体の同定、あるいは遺伝子疾患における遺伝子の解析、癌等の診断における遺伝子マーカーの検出などに広く利用されるようになってきている。
【０００４】
ＰＣＲ法の他の応用としては、ＭＰＮ（Ｍｏｓｔ Ｐｒｏｂａｂｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ）法（Ｈ．Ｏ．Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ ａｎｄ Ｎ．Ｒ．Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２５，１０１（１９３３））との組合せによる特定菌の菌数の計測が挙げられる。ＭＰＮ法は、最確値法あるいは希釈頻度法とも呼ばれ、数段階の試料希釈液を培地中に入れた多数の試験管に一定量ずつ接種して、充分な期間培養した後に菌の生育の有無を判定して、統計処理により菌数を計測する方法である（「土壌微生物実験法」、養賢堂、第４５頁）。この方法は、多くの手間と実験器具を必要とし、特に土壌微生物のような菌では、培養時間も長いという問題を有するものであった。さらに、このＭＰＮ法では、用いた培地で増殖する全ての菌についての総菌数が計測されるので、試料中に複数の菌が混在する場合における特定菌の菌数測定は不可能である。そこで培養を行わず微生物を検出する手段として検出にＤＮＡを用いＤＮＡレベルで増やすという試みがなされている。その手段としてＭＰＮ法にＰＣＲ法を組み合わせた方法が考えられている。このＰＣＲ法をＭＰＮ法に組み合わせた方法は、測定対象菌を含む試料からＤＮＡを抽出して、この試料を数段階に希釈調製した後、これに測定対象菌に特有な核酸配列を増幅するための２種のプライマーを用いたＰＣＲを行い、得られた増幅産物を検出して、その量から測定対象菌の数を求める方法である。
【０００５】
すなわち、ＰＣＲ法ではピコグラム量のＤＮＡ材料からマイクログラム量の目的ＤＮＡが短時間で得られる。そのため、ＰＣＲ法を用いてクローン化ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで迅速に大量増幅することが可能になり、ＰＣＲのクローニングや各種検出への応用がなされている。ＰＣＲ法は、目的とする２本鎖ＤＮＡを熱変性して、１本鎖とした後、鋳型となる各１本鎖にプライマーをアニーリングし、プライマーの結合位置を起点としてＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を合成する。従って、原理的には、鋳型ＤＮＡは１本存在すれば良いことになる。鋳型ＤＮＡとしてゲノムＤＮＡを扱う場合について述べると、１本の鋳型ＤＮＡでもその長さは、被検出対象の生体の種類によって大きく異る。例えば、ヒトのゲノムＤＮＡは大腸菌の１０3倍もの長さを有する。つまり、同じピコグラム量のゲノムＤＮＡとはいっても、その中に含まれるＤＮＡの本数は生物種によって桁が異るといえる。
【０００６】
そこで、このような量的な問題を、ＤＮＡの数の問題として捕らえて検出する方法が、ＭＰＮ−ＰＣＲ法である。この方法は、鋳型ＤＮＡを段階的に希釈し、最終的にそれぞれの反応系の中に１本存在するか否かまで希釈した後、ＰＣＲで増幅して、これを検出し、その結果から、確立的に鋳型ＤＮＡの試料中での個数を求める方法である。従って、このＭＰＮ−ＰＣＲ法は、菌数測定のためのＭＰＮ法の原理を利用したもので、ＭＰＮ法における菌を鋳型ＤＮＡに、または菌の増殖をＰＣＲに置き換えたものであるといえる。すなわち、ＭＰＮ法では、菌を含むサンプル溶液を段階的に、菌が１個が存在するか否かまで希釈した後、培養によってこれを増殖させて検出し、得られた結果から、確立的にサンプル溶液中の菌数を求めるものであるが、このプロセスにおける菌を鋳型ＤＮＡに、また培養をＰＣＲに置き換えたのが、ＭＰＮ−ＰＣＲ法である。従って、ＭＰＮ−ＰＣＲ法で問題とされるのは、鋳型ＤＮＡの量ではなく、分子数（個数）である。
【０００７】
従来におけるＭＰＮ−ＰＣＲ法の具体的操作の一例について以下に述べる。まず、微生物を含む試料から抽出された試料ＤＮＡを、１０倍ずつ段階的に希釈した希釈液（例えば、希釈率１、１０-1、１０-2・・・１０-9）を用意する。なお、希釈率１０-nとは、試料濃度が１／１０nに希釈されることをいう。各希釈液について（計１０個）のそれぞれについてＰＣＲを行い、検出対象としての鋳型ＤＮＡの増幅を行う。ＰＣＲ終了後、各反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、増幅産物を、バンドの有無として検出する。この時、ある希釈倍率を境に増幅産物のバンドがみられなくなる。例えば、１０ー5希釈を行ったサンプルまでは増幅産物がみられた場合には、この希釈率と、その前後の希釈率のサンプル、すなわち１０-4、１０-5、１０-6の希釈率の希釈液の各々の５サンプルずつ（計１５サンプル）について再度ＰＣＲを行い、再度アガロースゲル電気泳動で増幅産物の有無を調べる。その結果を、各希釈率での５サンプル中の増幅産物が認められたサンプル数を、後で掲載するＭＰＮ表（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２５，１０１（１９３３）の第４００頁）に当てはめて、予め確立的に求められている個数を求める。例えば、、１０-4希釈では５サンプル中全てのサンプルが陽性（増幅産物が検出）、１０-5希釈では５サンプル中３つが陽性、１０-6希釈では５サンプル中１つが陽性の場合、ＭＰＮ表のＰ1、Ｐ2、Ｐ3が、それぞれ５、３、１である場合の数値（１．１）が求められる。この数値に最初のＰＣＲで増幅産物が認められた希釈率の限界である１０ー5の逆数を乗じた値が、試料ＤＮＡ中の鋳型ＤＮＡの個数（１．１×１０5）となる。
【０００８】
標的とされた鋳型ＤＮＡが、微生物等の個体１つあたり１個存在するものであれば、このＭＰＮ−ＰＣＲ法で得られた鋳型ＤＮＡの個数が試料ＤＮＡの調製に用いた試料中に含まれる微生物等の個体数となる。ゲノム遺伝子等を標的遺伝子として用いる場合には、遺伝子によっては数コピー存在する場合もある。１コピーの場合には、上述のようにＤＮＡ数はそのまま個体数となるが、複数のコピーが存在する場合には、個体数との相関を求めておく必要がある。さらに、ＤＮＡの抽出効率も関係するので、正確な値を得たい場合には、検量線を作成することが望ましい。この方法は、癌細胞のように細胞中のある特定遺伝子のみが増幅されて多コピー存在する場合の定量にもこの方法は利用できる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
ＰＣＲ法によって得られた増幅産物の検出は、例えば、ＰＣＲ反応混合物をゲル電気泳動で展開し、増幅産物と、鋳型核酸やプライマー等の非検出対象成分とを分離した状態で、蛍光染色によって増幅産物のバンドをその分子量などから判断して特定してから、そのバンドの蛍光強度を測定することにより行われてきた。
【００１０】
しかしながら、ＰＣＲ法を用いた核酸の検出においては、反応溶液中に鋳型核酸と大過剰なプライマー等が含まれており、増幅対象の核酸配列の種類によっては、非検出対象成分と増幅産物とのゲル電気泳動による分離操作が困難な場合も多い。また、検体数が多くなると、煩雑なゲル電気泳動を行うことが多大な労力と時間の浪費を伴うことになり、効率良い検出操作を行う上での障害となっていた。特に臨床等における遺伝子解析においては、多くの検体をより短時間で効率良く処理できることが要求され、従来の方法ではこのような要求には充分対応できるものではなかった。
【００１１】
一方、ＰＣＲ法のＭＰＮ法への応用においては、より正確な菌数の推定を行うために、まず通常１０段階希釈での実験を行い、その中から増幅産物の認められる希釈を含む３段階の希釈系列で再実験を行う方法が採用されている。更に、この方法は確率論に基づいて菌数を求める方法であるので、確率的な菌数の決定に必要なサンプル数が要求されるので、ＭＰＮの表から菌数を求めるには各希釈液に対して、最低５〜１０サンプルの反応が行われるのが普通である。その結果、この方法においては、１検体について少なくとも２５程度のサンプルをＰＣＲにかけてからゲル電気泳動で評価するという多大な労力が必要とされる煩雑な作業が要求され、しかも結果を得るために長い時間が必要となる。
【００１２】
以上のように、ＰＣＲ法を利用した核酸の検出や菌数測定においては、ＰＣＲによる増幅反応後の増幅産物の検出や定量に煩雑かつ時間の要する作業が必要になる場合が多く、多検体の効率良い処理を行う上での障害となっていた。従って、ＰＣＲを利用した検出あるいは定量法においては、簡便かつ正確にＰＣＲ増幅産物を検出できる方法の確立が強く望まれていた。
【００１３】
ＰＣＲ増幅産物の検出において最も煩雑な作業は、大過剰に反応溶液中に添加されるプライマーと増幅産物とのゲル電気泳動による分離作業である。この分離作業を省略するための方法として種々の方法が検討されている。例えば、二本鎖核酸と反応したときに蛍光増大がみられる化合物、いわゆる蛍光性インターカレーターを用いた方法が注目されている。この蛍光性インターカレーターを用いた方法は、ＰＣＲで増幅された２本鎖核酸に蛍光性インターカレーターを反応させて、その際に生じる蛍光強度の増大を測定し、増幅産物を検出する方法である。この方法では、理論的には、インターカレーターがプライマー（１本鎖）と反応しても蛍光増大を生じないので、増幅産物とプライマーとの煩雑な分離操作を省略できるという利点がある。
【００１４】
例えば、特開平５−２３７０００号公報には、蛍光性インターカレーターとして知られているエチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ビスベンチイミド、ジアミノフェニルインドール、アクチノマイシン、チアゾールレンジ、クロモマイシン、及びこれらの誘導体等の色素をＰＣＲ増幅産物の検出に用いる方法が開示されている。これらの色素の中では、遊離時（２本鎖核酸と反応していない状態）に対する２本鎖核酸との反応時での蛍光増大が、紫外線励起で５０倍程度、可視光励起で２０倍程度と比較的大きいエチジウムブロマイドを好ましいものとして挙げることができる。
【００１５】
しかしながら、この特開平５−２３７０００号公報に挙げられた各色素は、遊離時においても蛍光を発するもので、測定される蛍光強度には、２本鎖核酸と未反応の色素による蛍光強度も含まれており、２本鎖核酸と色素との反応に由来する蛍光強度そのものではない。従って、測定値から未反応の色素に由来する蛍光強度をブランクとして差し引く必要がある。すなわち、この方法では蛍光強度の測定結果から単純に増幅産物の有無やその量を判定することはできず、ブランク値を差し引くという操作が必要となる。しかも、増幅産物の生成量が微量であると、ブランク値との十分な差が生じない場合もあり、高感度での検出ができない場合もある。
【００１６】
ＹＯＹＯ−１（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０（１１），２８０３〜２８１２（１９９２）は、遊離時は無蛍光で、二本鎖核酸に挿入された時に蛍光増大（３０００倍程度）を起すものでこれを利用できれば上記の測定におけるブランクが高いという問題を解消できるが、この色素は室温で分解し易く、実用的とはいえない。なお、後述するように、この色素によるＰＣＲ増幅産物の検出では、プライマー間の反応によって生じる高次構造物も検出されてしまい、正確な定量ができないという欠点がある。
【００１７】
このような観点から、上記の特開平５−２３７０００号公報では、検出対象としての標的核酸のＰＣＲ反応前の初期濃度を定量するためには、ブランク値に対して十分な蛍光強度が得られるサイクル数での増幅が行われている。すなわち、標的核酸の初期濃度が低い場合にはサイクル数が大きくなり、また標的核酸の初期濃度が高い場合にはサイクル数が小さくなる。そこで、該特許公開公報における標的核酸の定量法では、ＰＣＲ反応中における蛍光強度の変化をモニターし、蛍光強度が急激に変化する時点におけるサイクル数から標的核酸の初期濃度を求めている。
【００１８】
しかしながら、このような定量方法は、ＰＣＲ反応の各サイクルにおける蛍光強度をモニターするという煩雑な操作が必要であるという問題がある。また、蛍光強度が変化する点の判断が難しい場合もあり、感度良い標的核酸の定量を効率良く行うという点ではなお改善すべき問題を有するものといえる。
【００１９】
更に、ＰＣＲ増幅産物のエチジウムブロマイド等の色素による検出においては、理論上はプライマーと色素とが反応して蛍光が増大することはないので、増幅産物とプライマーが混在した状態でも増幅産物の検出が可能となるはずである。ところが、本発明の発明者らによる検討によれば、ＰＣＲ中にプライマー間の反応が生じて核酸の塊（３次元的な立体構造を有する高次構造物）が生じ、これもエチジウムブロマイド等によって検出されてしまうことが判明した。従って、高次構造物に対して増幅産物の量が圧倒的に多い場合は問題はないが、そうでない場合には実際に測定される蛍光増大に占める高次構造物による蛍光増大の割合が多くなり、正確な定量を行うことが不可能となる。しかも、この量は常に一定というわけではなく、増幅産物の量が圧倒的に多い場合には少なくなるが、増幅産物の量が少ない、あるいは増幅産物が生じない場合には多量に生じる傾向があり、ブランク等との比較により簡単に補正できるものではない。
【００２０】
この高次構造物の存在は、例えば、鋳型核酸を加えない系でＰＣＲ反応を行って得た反応混合物をゲル電気泳動で展開した際に、低分子量領域にエチジウムブロマイドで雲状のパターンに染色される部分が表われることから確認できる。
【００２１】
この高次構造物による測定誤差の発生という問題は、ＰＣＲ反応自体に起因する問題であり、しかも標的核酸の初期濃度が低い場合に、増幅サイクル数を増加させるほどより顕著になる傾向がある。
【００２２】
したがって、上述した従来技術による増幅産物の定量法は、より感度よい定量を行うには今だ不充分なものであった。
【００２３】
また、ＭＰＮ法にＰＣＲを組み合わせた菌数の計測方法においても、ＰＣＲを行う段階で上述のようなプライマー間の反応による高次構造物の形成は避けられず、測定誤差が大きくなることは同様である。
【００２４】
本発明の目的は、ＰＣＲ増幅産物の検出過程を簡便にし、かつ正確な定量が行える核酸の検出方法を提供することにある。本発明の他の目的は、簡便かつ正確なＰＣＲ増幅産物の検出方法を利用した被検出微生物または細胞の数、これらに含まれる特定遺伝子の数、あるいは特定遺伝子のコピー数の計測法を提供することにある。本発明の更なる目的はこれら方法に用いる測定用キットを提供することにある。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は以下の本発明によって達成することができる。本発明の核酸の定量方法は、標的核酸の特定配列領域の増幅に必要なプライマーの存在下で核酸試料に対してＰＣＲを行い、該試料中に標的核酸が存在する場合に増幅される２本鎖核酸からなる増幅産物に、遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物を反応させて得られる蛍光の強度を測定することで前記核酸試料中の標的核酸の量を求めることを特徴とする。この核酸の定量方法に利用できるキットは、ＰＣＲ用の反応領域内に、遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物の必要量を配置した反応器を有することを特徴とする。さらに、このキットは、前記反応領域内に標的核酸の特定配列領域のＰＣＲの増幅に必要なプライマーの必要量が配置されていてもよいものである。また、この核酸測定用キットは、ＰＣＲ用の反応領域と、該反応領域と隔離された試薬領域とを有し、該試薬領域に遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物の必要量が配置され、該試薬領域内の色素化合物が前記反応領域内に添加可能に設けられていることを特徴とするものであってもよく、この場合も、反応領域内に標的核酸の特定配列領域のＰＣＲの増幅に必要なプライマーの必要量を更に配置した構成をとるものであっても良い。
【００２６】
一方、本発明の微生物または細胞の数、特定遺伝子の数、あるいは特定遺伝子のコピー数を計測する方法は、被検出微生物または細胞を含む試料から核酸を抽出する過程と、得られた核酸抽出物の段階的希釈サンプルを調製する過程と、各希釈サンプルについて被検出微生物または細胞に特有の配列を増幅するためのＰＣＲを行う過程と、該ＰＣＲにより得られた２本鎖核酸からなる増幅産物に、遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物を反応させて得られる蛍光を測定し、蛍光が得られ希釈サンプルの希釈率から、被検出微生物または細胞の数、特定遺伝子の数、あるいは特定遺伝子のコピー数を求めることを特徴とする。この計測方法に利用できるキットは、多数のＰＣＲ用反応領域の各反応領域内に遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物の必要量を配置した反応器を有し、これらの反応領域を利用して被検出微生物または細胞を含む試料から抽出した核酸抽出物の段階希釈が形成可能であり、かつ各希釈において前記被検出微生物または細胞に特有の配列を増幅するためのＰＣＲを行えるようにしたことを特徴とする。このキットの各反応領域内には被検出微生物または細胞に特有な配列のＰＣＲ増幅用のプライマーが更に配置されたものであってもよい。これらの本発明は、後述するように、ＭＰＮ−ＰＣＲ法にも適用できる。
【００２７】
本発明で用いられる色素化合物は、遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発するものである。この色素化合物による２本鎖核酸との反応とは、該色素化合物が２本鎖核酸の安定な２重らせん構造の溝部内等に特異的に挿入されて結合することであり、その状態で色素化合物は励起光の照射によって蛍光を発するようになる。従って、遊離時、すなわち単独で存在する場合には励起光が照射されても蛍光を発しない。
【００２８】
この色素化合物は、プライマー間で形成される安定した２重らせん構造を形成できない短い２本鎖部分には容易に入り込むことはなく、また入り込んでも安定な２重らせん構造以外では蛍光を発しないものである。従って、この色素化合物としては、２重らせん構造の主溝、あるいは副溝に特異的に入り込んで結合し、その状態で蛍光を発するものが利用できる。このような特性を有する色素化合物を用いることで、ＰＣＲ反応液に直接（すなわち増幅産物とプライマーや鋳型核酸（テンプレート）とを分離する操作を行うことなく）該色素化合物を添加するだけで増幅産物のみが正確に検出できる。なお、この色素化合物の遊離状態での蛍光は無視できる程度に低いものであっても良い。
【００２９】
該色素化合物としては、例えば、ＤＡＰＩ（４’，６−Ｄｉａｍｉｎｏ−２−Ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（商品名）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２及び下記一般式［Ｉ］で表わされるピリリウム化合物塩またはピリリウム類似化合物塩等を挙げることができる。
【００３０】
【化２１】
【００３１】
【化２２】
【００３２】
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換アリール基、置換もしくは未置換低級アルアルキル基または置換もしくは未置換シクロアルキル基を示す。
【００３３】
Ｒ3は、−Ａまたは−Ｌ−Ａである。Ｌは、−Ｌ1−、−Ｌ2−Ｌ3−または−Ｌ4−Ｌ5−Ｌ6−であり、Ｌ1〜Ｌ6はそれぞれ独立して、−（ＣＨ＝ＣＨ）−、置換もしくは未置換アリール基から誘導される２価の基、置換もしくは未置換低級アルキレン基または−ＣＨ＝Ｒ4−（Ｒ4はオキソ基を有する環構造を示す）を表わす。置換もしくは未置換アリール基から誘導される２価の基としては、例えばフェニレン基等を挙げることができ、オルト、メタ、パラのいずれの位置で結合するものでもよい。低級アルキレン基としては、炭素数が１〜４の直鎖状もしくは分岐状のアルキレン基を挙げることができ、その置換基としては、例えば−Ｌ−Ａで示される基を挙げることができる。オキソ基を有する環構造としては、複素環、芳香環、脂肪族環等で少なくともオキソ基を有するものを挙げることができる。
【００３４】
−Ｌ−としては、下記一般式［ＩＩ］、［ＩＩＩ］、［ＩＶ］、［Ｖ］または［ＶＩ］で表わされる基を好ましいものとして挙げることができる。
【００３５】
【化２３】
【００３６】
【化２４】
【００３７】
【化２５】
【００３８】
【化２６】
【化２７】
【００４０】
一般式［Ｉ］のＲ3におけるＡは、置換もしくは未置換アリール基、−ＣＨ＝Ｒ5（Ｒ5は、置換もしくは未置換複素環、置換もしくは未置換のシクロアルキル基または置換もしくは未置換芳香環を示す）を表わす。Ｒ5の複素環としては、
【００４１】
【化２８】
【００４２】
【化２９】
【００４３】
Ｘを含むピリリウム環もしくはその類似環のＲ1、Ｒ2、Ｒ3が結合していない炭素原子に結合している水素原子は、ハロゲン原子、スルホネート基、アミノ基、スチリル基、ニトロ基、ヒドロシル基、カルボキシル基、シアノ基、置換もしくは未置換低級アルキル基、置換もしくは未置換アリール基または置換もしくは未置換低級アルアルキル基で置換されていても良い。
【００４４】
Ｙ-はアニオンを示し、該アニオンとしては、例えばＢＦ4 -、過塩素酸イオン、ＨＯ3ＳＣＨ2ＣＯＯ-、あるいは塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、フッ素イオン等のハロゲンイオン、又は、脂肪族炭化水素や芳香族スルホネート等のようなアニオン機能を有する化合物、更には、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｃｏ、Ｐｄ等の遷移金属の錯体イオンなどを挙げることができる。
【００４５】
以上挙げた各種の置換基に更に置換される基がハロゲン原子の場合には、該ハロゲン原子としては、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等を挙げることができる。また、低級アルキル基は、直鎖状でも分岐状のものでもよく、その炭素数としては１〜４程度のものが好ましい。アリール基としては、例えば、フェニル基等を挙げることができる。アリール基やフェニレン基の置換基としては、例えば低級アルキル基で置換されたアミノ基（低級アルキルアミノ基）等を挙げることができる。なお、この低級アルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等がパラ位で置換しているものが好ましい。低級アルアルキル基としては、上記の置換もしくは未置換アリール基で置換された低級アルキル基を挙げることができる。
【００４６】
一般式［Ｉ］の化合物の中では、Ｘを含む複素環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上で置換されたものが好ましい。例えばＸを含む複素環が６員環の場合のそのような化合物としては、
（１）Ｘを含む６員環の２位と４位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、３位、５位及び６位のいずれかがＲ3で置換されているもの、
（２）該６員環の３位と５位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、２位、４位及６位のいずれかがＲ3で置換されているもの、
（３）該６員環の２位と６位が置換もしくは未置換アリール基で置換され、３位、４位及び５位のいずれかがＲ3で置換されているもの、
などを挙げることができる。このような位置に置換もしくは未置換アリール基を導入することは、核酸塩基対へのインターカレーターとして良好な性質を得る上で好ましい。更に、Ｘを含む複素環が、置換もしくは未置換アリール基の２以上に、これらの置換位置が隣合わないように置換されたものがより好ましい。
【００４７】
一般式［Ｉ］の化合物の具体例としては、例えば後述の表１に示すものを挙げることができるが、本発明においては、後述する表２及び実施例において示した化合物番号１〜４、６、９、１１及び１５〜１６の化合物が用いられる。更に、２本鎖核酸に挿入された際に発する蛍光の強度が非常に大きいことから特に好ましい化合物としては、下記一般式［ＶＩＩ］
【００４８】
【化３０】
【００４９】
本発明で用いられる色素化合物は、安定な２重らせん構造と特異的に反応して蛍光を発するものであるので、これが、先に述べたようなプライマー間の反応によって生じる高次構造物に取り込まれたとしても、この高次構造物の２本鎖部分は安定な２重らせん構造ではないので、蛍光を発することはない。
【００５０】
また、一般式［Ｉ］で示された化合物は、２０〜３０塩基対に１つの割合で２重らせん構造に特異的に挿入されるので、上述のようなプライマー由来の高次構造物に取り込まれにくいという利点を有し、さらに増幅対象としての配列を有する２重らせん構造からなる２本鎖核酸断片に取込まれても、取込み密度がエチジウムブロマイド等よりも大幅に低く、一般式［Ｉ］の化合物の取込みによる２本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）の上昇は非常に少なく、ＰＣＲに与える影響が少ない。また、取込み密度が低いことから、ＰＣＲ後に反応液をゲル電気泳動で展開して増幅産物の長さ等を確認する場合にも、該化合物の取込みによる２本鎖核酸の移動度への影響がほとんどなく、正確な測定が可能である。
【００５１】
これに対して、従来の蛍光性インターカレーターであるエチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ及びＹＯＹＯ−１は数塩基対（２〜５塩基対程度）に１つの割合で２本鎖核酸に挿入されてしまうので、これらの色素を用いた場合には、上述のようなプライマーから形成される高次構造物の２本鎖部分に取込まれて所望としない蛍光増大を生じ、また増幅対象としての２本鎖核酸に取込まれた際にも、２本鎖核酸のＴｍやゲル電気泳動での移動度への影響が大きい。
【００５２】
本発明に利用される色素化合物の上述のような利点を有効に利用してより正確な定量を行うには、増幅産物が安定な２重らせん構造を形成していることが好ましい。従って、本発明は、例えば増幅産物長が１００塩基対以上である場合に好適に利用でき、また３００塩基対程度であることがより好ましい。増幅産物の上限は特に限定されないが、ＰＣＲでヌクレオチドが取り込まれる速度は、例えば７２℃で反応を行った場合、１秒間に３５〜１００ヌクレオチドといわれている。これらは、反応のｐＨ、塩濃度の他、標的核酸がどのような塩基配列を有するかといった反応条件に依存する。従って、ＰＣＲにおける各サイクルの反応時間を１分間とした時には、２０００塩基対以下が好ましい。更に増幅産物が長すぎる場合には副産物を生じ易くなるため、１０００塩基対以下がより好ましい（”ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”、Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ． Ｉｎｎｉｓ， Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊｏｈｎ Ｊ． Ｓｎｉｎｓｋｙ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ Ｊ． Ｗｈｉｔｅ， １９９０ ｂｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｆｏｒｎｉａ ９２１０１））。
【００５３】
また、ＰＣＲに用いるプライマーとしては、標的核酸中の増幅対象としての特定配列領域を規定できるものが所望に応じて用いられる。その長さとしては、鋳型核酸における増幅対象としての特定配列領域の端部の特定配列を認識するのに必要な程度な長さを有することが要求されるが、不必要に長いものであってはならない。長過ぎるとプライマー間で２本鎖部分が部分的に形成される可能性が高くなるからである。これ等の点を考慮するとプライマーの長さは、３０塩基程度以下、好ましくは２８塩基程度以下がよい。プライマー長の下限としては、特に限定されないが、増幅対象としての特定配列領域の端部を認識できる長さとされ、例えば１４塩基対以上、好ましくは１８塩基以上とされる。
【００５４】
本発明の核酸の定量方法では、まず、定量対象としての標的核酸に特徴的な配列領域を特定する。次に、この特定された配列領域（特定配列領域）の増幅に必要なプライマーと、鋳型として利用する標的核酸を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に先に述べた特性を有する色素化合物を反応させて、励起光を照射した際に発生する蛍光の強度を測定する。このとき得られる蛍光強度は、各反応成分の濃度を適切な範囲に設定すれば、鋳型の初期濃度（ＰＣＲ前の濃度）と比例するので、蛍光強度と鋳型の量との関係を予め検量線として設定しておき、未知試料に上述のＰＣＲ及び蛍光強度の測定を行って、未知試料中の標的核酸を定量することが可能となる。
【００５５】
最適条件が既に求められた反応系では上述のような検量線を用いた定量が簡便であるが、反応条件、特に標的核酸の量、プライマーの量、反応温度等は、それぞれの反応系で異り、検量線作成のための反応条件の設定が未知の場合には、検量線が書ける条件を見つけるという煩雑な作業が必要となる。
【００５６】
そのような検量線が書ける条件の設定が未だ行われていない系では、未知試料の核酸を段階的に希釈し、続いてＰＣＲ法を行い、標的核酸断片を検出する確立を得るＭＰＮ−ＰＣＲ法を利用することで、標的核酸の概量を簡単につかむことができ、それによって検量線作成条件を簡単に得ることが可能となる。例えば、先に従来技術の欄で説明した具体例では、試料中の鋳型ＤＮＡ数は１．１×１０5個であった。この時、１０ー5希釈では５サンプルのうち３サンプルが陽性であったが、１０ー4希釈よりも高濃度の場合には５サンプル全てが陽性になるはずである。この従来技術の欄の具体例では、一回目の実験で増幅産物の有無により鋳型ＤＮＡの希釈限界を含む濃度領域を限定し、その濃度領域についてさらに詳しくＭＰＮの手法での検討が加えられた。これは、アガロースゲル電気泳動では、バンドの有無というＯＮ／ＯＦＦの検出しかできない、あるいはＤＮＡのバンドを蛍光で定量するとしても煩雑な作業の割に定量性が得られないからである。これに対して、後述のＭＰＮ−ＰＣＲ法を用いる本発明の方法によれば、例えばマイクロプレートのような多数の反応領域を設定できる器具を用いて、全希釈系列について増幅産物の形成を調べることが可能となる。例えば、この本発明の方法で従来技術の欄で説明した具体例のサンプルをマイクロプレート上で処理した場合、１０ー5希釈では陽性のウエルと陰性のウエルが存在するが、１０ー4希釈より高濃度の場合には、各希釈にけるサンプル（同一希釈率のサンプル）間で同程度に増幅が行われ、色素化合物を用いた検出において、同程度の蛍光が得られるはずである。ここで、各希釈倍率における同一希釈率の５つのサンプルにおける蛍光強度の平均値を求め、希釈倍率を横軸に、蛍光強度を縦軸にプロットすると得られた値は直線にのる。その直線の領域が長ければ長い程、ＰＣＲ条件が適当であったことを意味し、逸脱が著しければ、プライマー量等の再検討が必要であることを意味する。
【００５７】
ここで、蛍光強度と希釈率との間に直線的関係が得られれば、このＭＰＮ−ＰＣＲ法ではすでに鋳型ＤＮＡの個数は求められているので、これを検量線として利用して蛍光強度から鋳型ＤＮＡの個数や量（個数×分子量）の定量が可能となる。
【００５８】
このように本発明の方法によれば、色素化合物を反応液に添加して増幅産物と色素化合物との反応によってのみ得られる蛍光が直接測定される。すなわち、ＰＣＲ後にプライマーや鋳型と増幅産物とを分離する必要もなく、更にプライマー間の反応により高次構造物が形成されても、それによる測定結果への影響を回避できる。従って、反応液に色素化合物を添加して得られる蛍光をそのまま定量値の計算に用いることができ、正確な定量が行える。なお、エチジウムブロマイドのように遊離の状態でも蛍光を発生するものでは、蛍光強度の実測値からブランクを差し引いた値をもとに定量値が求められる。しかしながら、ブランクの値は測定条件によって変化する場合が多く、各測定条件ごとに実測値に対するブランク値の相対的関係を考慮して定量操作条件を設定するという煩雑な作業が必要となる。これに対して、本発明の方法では、色素化合物が遊離の状態では無蛍光か、あるいは無視できる程度の極僅かな蛍光しか発しないものであるので、エチジウムブロマイドにおけるようにブランクを考慮する必要がなく、ブランク値を考慮した定量操作条件の設定という煩雑な作業は不用となる。また、特開平５−２３７０００号公報におけるようなＰＣＲ過程での蛍光強度のモニターも必要ない。
【００５９】
更に、本発明において、検出時にマイクロプレートを用いれば、ＰＣＲ後反応容器から反応液をマイクロプレートに移してマイクロプレート用蛍光検出器で蛍光の測定を行うことで、試薬の量が少量ですみ、また測定時間が短いので便利である。なお、ＰＣＲ反応そのものをマイクロプレート上で行うとより簡便な定量操作が行なえる。
【００６０】
従って、例えばマイクロプレートのような反応領域としてのウエルを多数有する反応器の各反応領域内に、本発明で利用する色素化合物の必要量を予め塗布、蒸発乾燥等の方法により配置したものは、核酸定量用のキットとして利用できる。この構成は、この色素化合物が室温でも安定であるので可能となる構成である。
【００６１】
また、ＰＣＲ用の反応領域と隔離された試薬領域を設け、この試薬領域に本発明で利用する色素化合物を配置しておいて、ＰＣＲを行う時に、反応領域に添加できる構成としてもよい。試薬領域に色素化合物を配置する場合には、これを溶液として配置することができる。この化合物が水溶性の場合には、適当な緩衝液等に溶解させて配置し、また有機溶剤に対して溶解性を有するものである場合には、適当な溶剤に溶解させて配置することができる。
【００６２】
また、この試薬領域には、ＰＣＲに必要な緩衝液、ヌクレオチド、酵素等も、この色素化合物とともに配置しても良い。これらを全て含む水溶液を調製する場合に、色素化合物が水に不溶性の場合には、この色素化合物の溶解に用いる溶剤は該水溶液に対して１％以下であることが好ましい。この試薬領域にＰＣＲ用の試薬及び色素化合物を一緒に配置する構成は、この色素化合物が増幅産物の２本鎖核酸断片に取込まれても取込み密度がエチジウムブロマイド等よりも大幅に低く、それによる融解温度（Ｔｍ）の上昇が非常に少なく、ＰＣＲ反応効率に与える影響が極めて少ないことから可能となる構成である。
【００６３】
このような反応器を有するキットの構成の一例を図９に示す。この反応器は、反応領域５を形成できる適当な容器１内にプライマー３を塗布等の方法で配置し、更に、適当な壁材、例えば、パラフィンをコートした紙等の液密に仕切った容器を形成できるものによって構成した容器２内にＰＣＲ用の酵素、ヌクレオチド、緩衝液等の必要量を含む溶液をパックし、これを容器１内に配置して、試薬領域としたものである（図９（Ａ）、（Ｂ）参照）。これを用いてＰＣＲを行うには、ピペットマン等の適当な手段で鋳型核酸の溶液を反応領域５に注入する際に、試薬領域を構成する容器２を破壊して、容器２内の成分も反応領域５に移行させて、これらを混合してＰＣＲを行うことができる（図９（Ｃ）参照）。増幅産物の検出に用いる色素化合物は、ＰＣＲ後に反応領域に添加してもよいし、予め反応領域５内に配置しておいてもよい。あるいは、この色素化合物を、試薬領域２内の溶液中に含有させておいてもよい。
【００６４】
更に、複数の試薬領域を設けて、試薬領域に配置べき各成分を複数の試薬領域に分配配置してもよい。
【００６５】
色素化合物は、上述のようにＰＣＲを行わせる反応領域内に予め添加されていてもよいし、またＰＣＲ後に反応領域内に添加されても良い。ＰＣＲ後に反応領域内に添加する場合にも、反応領域と別に色素化合物の必要量を配置した試薬領域を設けておき、ＰＣＲ後に試薬領域から反応領域に色素化合物を添加するようにしても良い。なお、一般式［Ｉ］の化合物で水不溶性のものは、反応領域にこれを配置しておいても、ＰＣＲ中は反応液内に溶け出さず、ＰＣＲ後に適当な溶剤を反応領域に添加することで該化合物と増幅産物との反応を行うことが可能となる。従って、一般式［Ｉ］の化合物を用いることで、該化合物によるＰＣＲへは少ないものの、該化合物が水不溶性であることからＰＣＲへの影響を確実に排除することが可能となる。このような溶剤としては、アセトニトリル、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が挙げられる。このキットの反応領域内にプライマーの所定量を、塗布、あるいは粉末として反応器内に隔離して配置するなどの方法によって予め配置しておけば、ＰＣＲを反応領域内で行わせる場合における操作の簡便化が計れる。
【００６６】
一方、本発明における色素化合物によるＰＣＲ増幅産物の検出は、ＭＰＮ法にＰＣＲを応用した方法（ＭＰＮ−ＰＣＲ法）に好適に利用できる。この方法を用いることで、微生物、動物細胞、ヒト細胞、植物細胞等の個体数（細胞数、菌数、菌糸数等）の計測、これらが有する特定遺伝子の数の計測あるいは特定遺伝子のコピー数の計測等が行え、これらの操作の大幅な簡便化が計れる。
【００６７】
このＭＰＮ−ＰＣＲ法の操作の一例として、土壌からの被検出微生物の個体数（菌数）を計測する場合について以下に説明する。
【００６８】
先ず、土壌試料に、土壌試料中に含まれる微生物の核酸を抽出するための処理を行う。例えば、サンプル土壌（１ｇ）にリン酸緩衝液（１ｍｌ）を加え、２０秒間ずつ２回ボルテックスをかける。更に、１０％ＳＤＳを１／１０容加え、再びボルテックスをかけ、７０℃で１時間保温し、土壌中の菌を溶菌させる。遠心操作により土壌を除き、核酸画分を上清として回収する。７．５Ｍ酢酸ナトリウムを１／５容加え、混合し４℃に５分間放置する。上清を回収し（１ｍｌ）、４／５容のイソプロパノールを加え、核酸画分を遠心により回収する。０．１ｍｌのＴＥ緩衝液にこれを溶解し、その後ＲＮａｓｅ処理により、ＤＮＡを回収する。
【００６９】
回収したＤＮＡの一部を１００倍に希釈し、更にその一部を希釈して、希釈系列を１０-1〜１０-8まで作成する。図４に示すマイクロプレートのサンプルＡのブロックに、これらを配置する。つまり、土壌から回収されたＤＮＡ溶液（既に１００倍に希釈）の１０ー1希釈溶液がＡ１〜Ａ５に、１０ー2希釈溶液がＢ１〜Ｂ５に配置され、１０ー8希釈液がＨ１〜Ｈ５に配置されるまで、各希釈液について同様に配置する。ここで、ブランクを含めた全てのウエルにＰＣＲに必要な試薬（ヌクレオチド、プライマー塩、Ｔａｑポリメラーゼ等）を含む反応用溶液を加え、ＰＣＲを行う。反応後、上述した色素化合物を用いて各ウエルの蛍光強度を測定して、例えば、ブランクに対して２倍以上の蛍光強度のウエルを陽性として、陽性があらわれる希釈限界を求める。例えば、１０-4、１０-5及び１０-6において、各希釈液における５サンプル中の陽性サンプル数（陽性サンプル数／各希釈での試験サンプル数）が、１０-4希釈で５／５、１０-5希釈で３／５、１０-6希釈で０／５とすると、陽性が現れる希釈限界は、１０-5となる。そこで、これらの希釈率での陽性サンプルの数（５、３、０）を以下に示すＭＰＮ表（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２５，１０１（１９３３）の第４００頁の「ＩＩＩ．ＭＰＮ（Ｍｏｓｔ Ｐｒｏｂａｂｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ）表、１０倍希釈 ５連の場合」から部分的に引用）のＰ1、Ｐ2、Ｐ3に当てはめると、Ｐ1＝５、Ｐ2＝３、Ｐ3＝０の場合の数値として、０．７９が得られる。これはこのサンプル中に含まれる鋳型ＤＮＡの確立統計的に求められた個数である。そこで、上記の限界希釈倍率の逆数をこれに乗じ、さらに最初のサンプルの希釈率を考慮すれば、土壌中に含まれた鋳型ＤＮＡの個数は、０．７９×１０5×１０2＝０．７９×１０7個となる。この鋳型ＤＮＡが土壌中の検出対象としての微生物に特有のものであり、また、該微生物１個について１つ存在するものであれば、ここで得られた鋳型ＤＮＡの個数がそのまま土壌試料（１ｇ）中の微生物の個体数（菌数）となる。当然この場合、、全てのウエルが蛍光を放出する希釈系列では、その蛍光量は鋳型ＤＮＡの個数を反映したものであるので、これを基に蛍光量（蛍光強度）と鋳型ＤＮＡの個数（微生物の個体数）の検量線を作成できる。
【００７０】
【表１】
【００７１】
なお、先に述べた従来の技術の欄で述べたＰＣＲとアガロースゲル電気泳動を組み合わせたＭＰＮ−ＰＣＲ法では、陽性が現れる希釈限界を求める第１回目のＰＣＲと、得られた希釈限界付近を更に詳細に調べて、具体的な個数をＭＰＮ表から求めるための第２回目のＰＣＲが行われている。例えば、上記の土壌試料（１ｇ）から同様にＤＮＡを回収し、上記のように希釈せずに、その１０-1〜１０-9希釈まで段階希釈を調製して、従来の方法に適用し、各希釈液について、第１回目のＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動で増幅産物の有無を検出すると、１０-7希釈まで陽性となる。ここで、１０-6、１０-7、１０-8の３つの希釈について各々５サンプルずつ再度ＰＣＲを行い、各希釈での５サンプル中の陽性のサンプル数を求めると、１０-6希釈で５／５、１０-7希釈で３／５、１０-8希釈で０／５となり、上記と同様にＭＰＮ表から０．７９という値が得られ、これに陽性が現れる限界希釈の希釈率の逆数を乗じた値（０．７９×１０7）が土壌中の鋳型ＤＮＡの個数となる。しかしながら、この方法は、ＰＣＲと電気泳動とを含む操作を２回繰返すもので、操作が非常に煩雑である。これに対して、発明の方法では、１回のＰＣＲで直接結果を得ることが可能であり、また電気泳動操作が省略できる。従って、計測操作を大幅に簡便化できる。
【００７２】
このＭＰＮ−ＰＣＲ法でのＰＣＲにおける増幅産物の先に説明した色素化合物による検出は、先のＰＣＲ増幅産物の定量方法で用いた各操作及びその条件、あるいはキット等が利用できる。
【００７３】
また、このＭＰＮ−ＰＣＲ法では多段階の希釈サンプルを統計的処理のために同時に処理することが必要とされるので、マイクロプレート等の多数の反応領域（ウエル）を有する器具を用いることが好ましい。ＰＣＲ反応を別の容器内で行った場合でも、増幅産物の色素化合物による検出はマイクロプレートのような器具で行うことが好ましい。
【００７４】
この鋳型ＤＮＡ数の測定法は、例えば、各種溶液中や土壌中の計測対象菌の菌数の測定、各種試料中の微生物の菌数の測定、各種試料中の細胞数の測定、各種組織中の細胞数の測定、あるいは各種生体試料中の特定遺伝子の数やそのコピー数の測定に有効に利用できる。例えば、通常、鋳型ＤＮＡの濃度は、光吸収強度等の測定からグラム量で見積もられることが一般的であるが、例えば癌細胞の場合のようにコピー数（特定遺伝子の数）が問題になる場合も多い。そのような場合に本発明の方法は有効である。この本発明の方法により組織中の特定遺伝子のコピー数を知る場合には、すべてに共通な遺伝子について上述の方法によりその数を求め、次に癌遺伝子等特定遺伝子の数を求め、正常細胞と癌細胞について共通遺伝子と特定遺伝子の比を求めることにより、核酸を抽出する細胞の量に関係なく特定遺伝子のコピー数を得ることができる。
【００７５】
また、あるヒト組織中に癌細胞が存在するかどうかの判定にもこの方法は有用である。例えば、ある組織を構成する細胞に共通の特定遺伝子の数をこの方法により求め、次に、検出対象としての癌細胞に特定の遺伝子の数を同一組織試料についてこの方法により求める。
【００７６】
【実施例】
参考例１
無水酢酸１００ｍｌと濃硫酸３０ｍｌとを冷却しながら混合し、得られた混合液をウォーターバスで８０℃に保ちながら３時間加温した。そこに無水酢酸２０ｍｌ、ｐ−ジメチルアミノアセトフェノン３０ｍｌを室温下で加え、その後４５℃に温度を上昇させて２４時間攪拌し反応させた。この反応液に等量のエタノールを加え、冷却し、更にヨウ化カリウム水溶液を加えると粗結晶が析出した。この粗結晶を濾過により回収し、エタノール／エーテルの混合系（容量比、１：４）で再結晶させて、２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム アイオダイド（表２の化合物１（ただしＹはＩである））の緑色の結晶を得た。
得られた化合物１（Ｙ：Ｉ）の分析結果
融点：２５４〜２５７℃
ＵＶ／可視（ＣＨ3ＣＮ ε×１０-4）λmax ：４４４ｎｍ（２．４３）、５５０ｎｍ（８．２４）
ＮＭＲ（1Ｈ、DMSO）δｐｐｍ：８．３７３７（１Ｈ、ｓ）、８．２７２９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、８．１７９５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、７．８８６４（１Ｈ、ｓ）、６．９１１７（４Ｈ、ｔ、ＪAB＝ＪBC＝９．７７）、３．１８２９（６Ｈ、ｓ）、３．１３４０（６Ｈ、ｓ）、２．６８０９（３Ｈ、ｓ）
ＦＡＢ ｍａｓｓ ｍ／ｚ ３３３
ＩＲ（ＫＢｒ）νｃｍ-1：１６４５、１６１０（ｓｈ）、１５８０（ｓ）、１４９０（ｓ）、１２７０、１２００、１１６０
更に、ヨウ化カリウム水溶液の代わりに過塩素酸水溶液を用いる以外は上記と同様にして２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウムの過塩素酸塩（化合物１（Ｙ：ＣＩＯ4））を得た。
【００７７】
参考例２
硫化ナトリウム９水和物２０ｇをイオン交換水に溶解させ全量を５０ｍｌとした。この溶液に炭酸水素ナトリウム７ｇを加え溶解させた後、氷冷下、５０ｍｌのエタノールを更に加えてから、室温で３０分間攪拌した。析出した炭酸ナトリウムを濾別し、２５ｍｌのエタノールで洗浄し、濾液と洗液を合わせ、約１２５ｍｌの水硫化ナトリウムの水・エタノール溶液を得た。
【００７８】
次に、参考例１で得た２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）ピリリウム アイオダイドの０．９２ｇを２０ｍｌのＤＭＳＯに溶解させ、得られた溶液に先に調製した水硫化ナトリウムの水・エタノール溶液の５ｍｌを加え、室温下で５分間攪拌した。攪拌後、ヨウ化水素酸０．７５ｍｌを加え、更に５分間攪拌した。以下、常法に従って、ジクロロメタン抽出、シリカゲルカラム精製を行った後、エタノール／エーテル混合液（容量比、１：４）で再結晶させて、０．７ｇの２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チオピリリウム アイオダイドの結晶（表２の化合物２（ただし、ＹはＩである））を得た。
得られた化合物２（Ｙ：Ｉ）の分析結果
融点：２４６〜２４８℃
ＵＶ／可視（ＣＨ3ＣＮ ε×１０-4）λmax ：４９５ｎｍ（２．５０）、５８７ｎｍ（４．９５）
ＮＭＲ（1Ｈ、DMSO）δｐｐｍ：８．５６７９（１Ｈ、ｓ）、８．４３２３（１Ｈ、ｓ）、８．２４３６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２７Ｈｚ）、７．９７８６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２８）、６．８９５９（４Ｈ、ｔ、ＪAB＝ＪBC＝９．２８）、３．１７５６（６Ｈ、ｓ）、３．１１５７（６Ｈ、ｓ）、２．８３２３（３Ｈ、ｓ）
ＦＡＢ ｍａｓｓ ｍ／ｚ ３４９
ＩＲ（ＫＢｒ）νｃｍ-1：１６００（ｓ）、１５６０（ｓ）、１４６０（ｓ）、１４３０（ｓ）、１３７０（ｓ）、１２６０（ｓ）、１１６０（ｓ）
更に、ヨウ化水素酸の代わりに過塩素酸水溶液を用いる以外は上記と同様にして２−メチル−４，６−ビス−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）チオピリリウムの過塩素酸塩（化合物２（Ｙ：ＣＩＯ4））を得た。
参考例３
下記の表２に示す化合物３〜５５をそれぞれ用意した。表２において、Φはｐ−フェニレン基：
【００７９】
【化３１】
【００８０】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【００９９】
化合物７は、W.Foerstらの「New Methods of Preparative Organic Chemistry」、Acad. Press（1964）に記載の方法に従って、化合物［ｉ］
【０１００】
【化３２】
【０１０１】
【化３３】
【０１０２】
【化３４】
【０１０３】
【化３５】
【０１０４】
R. WizingerらのHelv. chim. Acta、39、217 (1956)に記載の方法に従い、アセトフェノンとアセトアルデヒドから以下に示すルート
【０１０５】
【化３６】
【０１０６】
【化３７】
【０１０７】
【化３８】
【０１０８】
【化３９】
【０１０９】
更に、原料のアセトアルデヒドをｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドに代える以外は、化合物［ｉｉｉ］の合成の場合と同様にして、化合物３のカチオン部分を得た後、これに水硫化ナトリウムを反応させて得られた化合物に更に所望のアニオンを反応させ、化合物４を得た。また、同様にしてｐ−メチルベンズアルデヒとアセトフェノンから化合物［ｖ］
【０１１０】
【化４０】
【０１１１】
【化４１】
【０１１２】
化合物１９、２０及び２１は、化合物［ｉ］または［ｉｉ］と、化合物１または２のカチオン部分とを
【０１１３】
【化４２】
【０１１４】
【化４３】
【０１１５】
【化４４】
【０１１６】
化合物３３〜５５は以下の各反応によりそれぞれ合成した。
化合物３３の合成
【０１１７】
【化４５】
【０１１８】
【化４６】
【０１１９】
【化４７】
【０１２０】
【化４８】
【０１２１】
【化４９】
【０１２２】
【化５０】
【０１２３】
【化５１】
【０１２４】
【化５２】
【０１２５】
【化５３】
【０１２６】
化合物４１は、化合物３７の合成で原料を
【０１２７】
【化５４】
【０１２８】
【化５５】
【０１２９】
化合物４２は、化合物３８の合成で原料を
【０１３０】
【化５６】
【０１３１】
【化５７】
【０１３２】
化合物４３は、化合物３９の合成で原料を
【０１３３】
【化５８】
【０１３４】
【化５９】
化合物４４の合成
【０１３５】
【化６０】
【０１３６】
【化６１】
【０１３７】
【化６２】
【０１３８】
【化６３】
【０１３９】
【化６４】
【０１４０】
【化６５】
化合物４９は、化合物４５の合成で原料を
【０１４１】
【化６６】
【０１４２】
【化６７】
化合物５０は、化合物４６の合成で原料を
【０１４３】
【化６８】
【０１４４】
【化６９】
化合物５１は、化合物４７の合成で原料を
【０１４５】
【化７０】
【０１４６】
【化７１】
化合物５２の合成
【０１４７】
【化７２】
【０１４８】
【化７３】
【０１４９】
【化７４】
【０１５０】
【化７５】
参考例１で得た化合物１を１０％アセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、化合物１の最終濃度が３×１０-5Ｍになるように調整してサンプルＩとした。このサンプルＩの一部を用いてその吸収スペクトルを分光光度計を用いて常法により測定した。
【０１５１】
次に、Salmon sparm DNA （Sigma社製）をＴＥ緩衝液（10mM Tris-1mM EDTA）に溶解し、フェノール抽出により精製した。取扱を容易にするために、この精製物を更に制限酵素ＥｃｏＲＩで消化処理し、得られた処理液をＤＮＡ溶液とした。このＤＮＡ溶液の一部とサンプルＩの一部とを混合して、ＤＮＡの最終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるように調整し、更に、化合物１の最終濃度が３×１０-5Ｍになるように調整して、サンプルＩＩとした。このサンプルＩＩの一部を用いてその吸収スペクトルを常法により測定した。その結果、該化合物の吸収のピークは、ＤＮＡとの相互作用により長波長側に２０〜３０ｎｍシフトした。これは、典型的なインターカレーターの性質である。
【０１５２】
サンプルＩの一部を用いてその蛍光スペクトルを常法により測定したところ、ＤＮＡ非存在下では５５０ｎｍで励起した場合、６５０ｎｍ付近に弱いピークが検出された。次にサンプルＩＩの一部を用いて同様にして蛍光スペクトルを測定したところ、サンプルＩＩ中では、同じ波長での励起で、ＤＮＡ非存在下における場合の約１００倍の蛍光強度のピークが６５０ｎｍ付近に検出された。以上の結果は、化合物１が強力なインターカレーターであることを示している。
【０１５３】
次に、先に調製したＤＮＡ溶液と、化合物１と、１０％アセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸緩衝液を用いて、化合物１を５×１０-6Ｍの濃度で含み、かつＤＮＡ濃度が異なる溶液を調製した。得られた各溶液の蛍光強度を常法により測定して、ＤＮＡ濃度に対する蛍光強度の変化を求めた。蛍光強度はＤＮＡ濃度が増加するに従って増大し、最大で、ＤＮＡ非存在下の時の蛍光強度の約４００倍増大した。なお、励起光としては、Ｘｅランプを光源とし４８０ｎｍのローカットフィルターにより紫外光を除去したものを用いた。更に、表２の化合物について上記と同様の蛍光強度等についての測定を行った。その代表例について表３に示す。
【０１５４】
【表２１】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの１６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ遺伝子（以下１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と略記）をターゲットとしたＰＣＲを行い、その増幅産物を２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム塩を用いて検出した。
【０１５５】
まず、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの全ＤＡＮを以下の様にして調製した。２×ＹＴ培地で終夜培養した菌体２ｍｌを遠心分離により集菌し、０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）の０．５ｍｌに懸濁させた。得られた懸濁液に１０％ＳＤＳ溶液の０．０５ｍｌを加え、十分に混合の後、７０℃で１時間保温した。この懸濁液をボルテックスミキサーで攪拌し、菌体を完全に溶菌した。この溶菌液に等量のフェノール／クロロホルムを加え、混合、遠心分離の後、上層を分取し、２倍量のエタノールを加え、ＤＮＡを沈澱物として回収した。これを１００μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。
【０１５６】
ＰＣＲ用プライマーとしては以下の２本のものを用いた。
プライマー１ ５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧ ３’（配列番号：１）
プライマー２ ５’ＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＣＡＣＧＡＣＡＣ ３’（配列番号：２）
これらのプライマーは、ＡＢＩ社製のＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ３８１Ａを用いて合成した。合成に必要な試薬、手法などはＡＢＩ社のプロトコルに拠った。
これらの鋳型ＤＮＡ及びプライマーを用いて以下の条件でのＰＣＲを行った。
ＰＣＲの条件：
反応溶液組成（全容量５０μｌ）
５μｌ １０×ｂｕｆｆｅｒ
５μｌ ｄＮＴＰｓ
プライマー１及び２ それぞれ１０ｐｍｏｌ
Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ ０．５単位
鋳型ＤＮＡ
５００ｐｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇまたは１０ｆｇ
各成分を加えて全容量を滅菌水を加えて５０μｌとし、Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ チューブ（全容量０．５ｍｌ、宝酒造社製）内で反応を行わせた。鋳型ＤＮＡを含まない以外は上記と同様の組成のサンプルをブランクとして調製した。ここで、１０×ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓはポリメラーゼに添付のものをそのまま使用した。
反応サイクル
９２℃、５分間のプレインキュベーション
９２℃、４５秒／５５℃、６０秒／７２℃、９０秒を３０サイクル
最後に７２℃、５分間のインキュベーション
ここで、ＰＣＲ装置はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社のＧｅｎｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９６００を用いた。増幅産物の検出は以下のようにして行った。反応が終了した各サンプルを９６ウエル・マイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製Ｆａｌｃｏｎアセイプレート３９１１（Ｕ底））に総量５０μｌになるようにＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ）で２倍、１０倍、２０倍に希釈した（図１参照）。次に、各ウエルに１５０μｇ／ｍｌの２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム アイオダイドのアセトニトリル溶液１μｌを加え、ピペッティングにより十分に混合した。このマイクロプレートをミリポア蛍光装置（サイトフロー２３５０）にセットし、励起光側に５９０ｎｍ、放射光側に６４５ｎｍの光を透過するフィルターをそれぞれ用いて、励起光の照射と、蛍光の測定を行った。その結果得られた反応液の各希釈における測定された蛍光強度（６４５ｎｍ）と鋳型ＤＮＡ量との関係を図２に示す。また、ブランクのサンプルにおいては、蛍光は観測されなかった。図２の結果では、蛍光強度は各希釈サンプルにおいて、鋳型ＤＮＡ量と比例して増加し、蛍光強度から鋳型ＤＡＮの量が定量できることが示された。なお、鋳型ＤＮＡが１００ｆｇ、１０ｆｇの場合にはＰＣＲ増幅産物は検出されなかった。
【０１５７】
以上と同様の操作を行い、各ウエルの反応液への２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム塩の添加は行わずに、各反応液を５μｌ分取し、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（以下ＥＢという）より染色し、バンドの濃さによりＰＣＲ増幅産物の量を調べた。その結果、鋳型ＤＡＮが５００ｐｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇでは明確なバンドが、１ｐｇではわずかにバンドが観測され、１００ｆｇ、１０ｆｇではＰＣＲ増幅産物は観測されなかった。また、５００ｐｇでは蛍光強度が飽和して、１００ｐｇとほとんど変わらなかった。更に、ゲル上にＰＣＲ増幅産物のバンドの他に、プライマー間の反応生成物である高次構造物と思われる蛍光が低分子量領域に観察された。
【０１５８】
比較例１［ＥＢを用いたＰＣＲ増幅産物の検出］
２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム塩の代わりに、ＥＢと以下の操作条件を用いる以外は、実施例１と同様の操作を行った。ＥＢは２５０μｇ／ｍｌの溶液として、その１μｌを各ウエルに添加し、ピペティングにより十分に混合し、５分間室温に放置した。ミリポア蛍光装置の励起光側に４８５ｎｍ、放射光側に６２０ｎｍの光を透過するフィルターをセットして蛍光強度の測定を行った。その結果、ブランクのサンプルのウエルを含む各ウエル内の反応溶液はいずれも赤く蛍光を発した。しかも、鋳型ＤＡＮの入ったサンプルにおける蛍光強度と、鋳型ＤＡＮが入っていないサンプルの蛍光強度に差はなく、定量は不可能であった。これは、鋳型ＤＮＡの入っていないサンプル（ブランク）においてプライマー間の反応でＥＢの蛍光増大を引き起こす高次構造物が生じたためである。
【０１５９】
比較例２［ＹＯＹＯ−１を用いたＰＣＲ増幅産物の検出］
２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム塩の代わりに、ＹＯＹＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）と以下の操作条件を用いる以外は、実施例１と同様の操作を行った。ＹＯＹＯ−１は１ｍＭの溶液を１２０倍に希釈し、その１μｌを各ウエルに添加し、ピペティングにより十分に混合し、５分間室温に放置した。ミリポア蛍光装置の励起光側に４８５ｎｍ、放射光側に５３０ｎｍの光を透過するフィルターをセットして蛍光強度の測定を行った。得られた結果を図３に示す。図３の結果では、鋳型ＤＡＮの量に比例して蛍光強度の増加が認められたが、増加率は低い。更に、ブランクにおいては鋳型ＤＡＮが含まれたサンプルと同程度の蛍光強度が観察された。このブランクにける蛍光もプライマー間の反応生成物である高次構造物に起因するものと考えられる。従って、この色素を用いた定量では、ブランクとの差が低く、しかも鋳型ＤＮＡの量に比例した蛍光強度の増加率も低いので定量性が良くないことがわかる。
【０１６０】
以上の実施例１及び比較例１、２の結果から、２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム アイオダイドを用いた蛍光による定量では、プライマー間の反応生成物である高次構造物の影響を受けることなく正確な定量が行えることがわかった。この結果は、実施例１の各反応液のアガロースゲル電気泳動でのＥＢによる染色での結果を反映している。また、このＥＢでのアガロースゲル染色では、５００ｐｇと１００ｐｇとでは蛍光が飽和してしまう結果増幅産物量はみかけ上同じになるが、２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム塩による検出においてはＥＢで蛍光が飽和してしまうサンプルにおいても蛍光強度の飽和はなく定量が可能であった。
【０１６１】
実施例２［マイクロプレートを用いたＰＣＲ法による土壌中の菌数測定］
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株の終夜培養液（２×ＹＴ培地）を混入させた土壌からＤＮＡを常法により回収し、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとしたＰＣＲを行い、ＰＣＲ−ＭＰＮ法により菌数を測定した。
【０１６２】
Ｅ．ｃｏｌｉは、土壌１ｇ当り約１０7、約１０6、約１０5、約１０4の菌数（それぞれ図４に示すサンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）になるように加え、攪拌した。大腸菌を加えた各土壌１ｇを０．１Ｍりん酸ナトリム緩衝液（ｐＨ８．０）の０．５ｍｌに懸濁させた。この懸濁液に１０％ＳＤＳ溶液の０．０５ｍｌを加え、十分に混合の後、７０℃で１時間保温した。この懸濁液をボルテックスミキサーで攪拌し、菌体を完全に溶菌した。この溶菌液に等量のフェノール／クロロホルムを加え、混合、遠心分離の後、上層を分取し、２倍量のエタノールを加え、ＤＮＡを沈澱物として回収した。これを１００μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。
【０１６３】
ＰＣＲ用プライマーはＥ．ｃｏｌｉの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に対するもので、以下の２本のものを用いた。
プライマー１ ５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ ３’（配列番号：３）
プライマー２ ５’ＡＡＣＣＣＡＡＣＡＴＣＴＣＡＣＧＡＣＡＣ ３’（配列番号：４）
これらのプライマーは、ＡＢＩ社製のＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ３８１Ａを用いて合成した。合成に必要な試薬、手法などはＡＢＩ社のプロトコルに拠った。
【０１６４】
これらの鋳型ＤＮＡ及びプライマーを用いて実施例１と同様の条件でのＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９６ウエル・マイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製Ｆａｌｃｏｎアセイプレート３９１１（Ｕ底））の各ウエル内で行った。また、このマイクロプレートは、各ウエル内には予め実施例１と同様の濃度の２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム アイオダイドのアセトニトリル溶液１μｌを塗布し、乾燥保存したものである。鋳型ＤＮＡは図４のように段階的に１０倍希釈系列を縦の列に８段階作成し、横の５列には同じサンプルを準備し、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ装置としては、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．のＭｏｄｅｌ ＰＴＣ−１００−９６を用いた。
【０１６５】
ＰＣＲ反応終了後マイクロプレートの各ウエル内にアセトニトリルを５μｌ加え、よく攪拌した後、５分間放置した。その後、ミリポア蛍光装置（サイトフロー２３５０）にセットし、実施例１と同様なフィルターを用いて蛍光を測定した。その結果、図５のような結果が得られた。ここで、ブランクの２倍以上の蛍光をもつものをＰＣＲ増幅産物ができたものとみなした（斜線で塗り潰したウエル）。この結果を、ＭＰＮ法で用いられる表に当てはめて計算すると、それぞれの土壌から得られた大腸菌の菌数は４．９×１０6、７．９×１０5、２．２×１０5、７．９×１０3となった。
【０１６６】
比較例３
実施例２で調製したＥ．ｃｏｌｉを異る濃度で混入させた各土壌サンプルに含まれるＥ．ｃｏｌｉの個数を、Ｅ．ｃｏｌｉ用の培養プレートにサンプルの所定量を接種して培養した後に表われるコロニー数から菌数を求めるプレートカウント法により求めた。得られた結果と、実施例２で得られた結果との相関を見ると、図６のように非常によく一致した。
以上の実施例２と比較例３の結果から、本発明のＰＣＲを利用する菌数の測定法によれば、簡便な操作で菌数の計測を行うことができ、得られた結果も従来法であるプレートカウント法と非常に良く一致した。
【０１６７】
実施例３［マイクロプレートを用いたＰＣＲ法による鋳型ＤＮＡの定量］
実施例２で用いたのと同様のマイクロプレートの各ウエルに実施例２で用いたのと同様の、２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム アイオダイドのアセトニトリル溶液１μｌ、及びプライマー（２種、各々１０ｐｍｏｌｅ）を塗布し、乾燥保存した。
一方、一夜培養した大腸菌の培養液２ｍｌから実施例２と同様の方法により大腸菌のＤＮＡを抽出し、それを１００倍に希釈してて鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【０１６８】
次に、この鋳型ＤＮＡ溶液の希釈系列を実施例２と同様に作成し、図５と同様に１μｌずつマイクロプレートに加えた。次に、Ａｍｐｌｉ Ｗａｘ ＰＣＲ Ｇｅｍ １００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）１個及び以下の組成分を含むＰＣＲ用反応溶液を各ウエルに加えた。
【０１６９】
５μｌ １０×ｂｕｆｆｅｒ
５μｌ ｄＮＴＰｓ
Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ ０．５単位
更に、各ウエルに滅菌水を加えて全量を５０μｌとして、ＰＣＲを行わせた。ここで、ＰＣＲ装置は、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．のＭｏｄｅｌ ＰＴＣ−１００−９６を用いた。ＰＣＲの反応条件は実施例１と同様である。
【０１７０】
ＰＣＲ後のマイクロプレートの各ウエルにアセトニトリル５μｌ加え、よく攪拌した後、５分間放置した。その後、ミリポア蛍光装置（サイトフロー２３５０）にセットし、実施例１と同様なフィルターを用いて評価した。その結果、図７のような結果を得た。ここでブランクの２倍以上の蛍光をもつものをＰＣＲ増幅産物がきたものとみなし、斜線で塗りつぶした。この結果を、ＭＰＮ法で用いられる表に当てはめるて計算すると、鋳型ＤＮＡの分子数は３．５×１０7であることがわかった。最初に１００倍希釈を行っていることを考えると、鋳型ＤＮＡの分子数は、３．５×１０9個であるといえる。
【０１７１】
比較例４
実施例３で用いたＥ．ｃｏｌｉの培養液２ｍｌ中の菌数をコロニーカウントプレート法により求めたところ、４×１０9個であり、実施例３で得られた結果とほぼ一致する。
【０１７２】
実施例２及び３から鋳型ＤＮＡの希釈とＭＰＮ法による検出に望ましい濃度範囲を知ることができ、またサンプルの濃度を設定することができる。その結果、個体数、コピー数、鋳型ＤＮＡの量を求める検量線を設定することが可能となる。
【０１７３】
実施例４［癌特異遺伝子のＰＣＲによる検出キット］
（１）ｍＲＮＡの抽出
大腸癌の疑われる組織２か所からそれぞれ５ｍｍ角のサイズでサンプルをバイオプシーで患者から採取した（これを組織Ａ、Ｂとする）。この組織からｍＲＮＡを常法（新生化学実験講座２、核酸Ｉ、第４８頁）により抽出した。つまり、各組織にそれぞれ２ｍｌのＤ液［４Ｍグアニジンチオシアネート；２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）；０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム；及び０．１Ｍ２−メルカプトエタノール］を加え、素早くホモジナイズした。ホモジナイズは滅菌管中ポリトロンで１０秒間を３回行った。これに０．２ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、２ｍｌの水飽和フェノール、０．４ｍｌのクロロホルム−イソペンチルアルコール（４９：１、ｖ／ｖ）を加えた。各試薬を加える度によく攪拌した。１０秒間ボルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ）ミキサーで振とう後、１５分間氷中で冷却した。４℃、１００００×ｇで２０分間遠心後、水層に等量のイソプロプロピルアルコールを加えて、−２０℃で一晩放置した。４℃、１００００×ｇで２０分間遠心後沈澱に０．６ｍｌの割合でＤ液を加え、５０℃で溶解した。等量のイソプロピルアルコールを加え、−２０℃で１時間冷却後、４℃、１００００×ｇで２０分間遠心し、沈澱を７５％エタノールに懸濁後、４℃、１００００×ｇで再び２０分間遠心し、沈澱を乾燥して粗ＲＮＡ画分とした。粗ＲＮＡ画分を６５℃で５分間加熱し、室温まで急冷し、等量の２倍濃度のＴＮＥＬ緩衝液［２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）；０．５Ｍ塩化ナトリウム；１ｍＭ ＥＤＴＡ及び；０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム］で洗った。ＴＮＥＬ緩衝液で平衡化したオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に粗ＲＮＡ画分をかけ、その後、抽出用溶液（ＴＮＥＬ緩衝液から０．５Ｍ塩化ナトリウムを除いたもの）でｍＲＮＡを溶出した。
【０１７４】
（２）ｃＤＮＡの調製
上記のｍＲＮＡから２本鎖ｃＤＮＡの作成には、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＴｉｍｅＳａｖｅｒTM ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いた。
（３）定量キットの構成
大腸癌検出用のプライマーとして、以下の配列のオリゴヌクレオチドを用いた。
プライマー１：５’ＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＧＡＧＡＡＴＣＡＴＡ ３’（配列番号：５）
プライマー２：５’ＡＴＣＣＡＡＴＣＡＣＣＣＡＣＡＴＧＣＡＴＴ ３’（配列番号：６）
図９に示す容器１としてのエッペンドルフの底に、プライマー１及び２の溶液を、それぞれの量が１０ｐｍｏｌとなるように塗布し、さらに容器２をパラフィンコートした紙で作成し、この中に以下の成分をパックした。
ｄＮＴＰ・・・５μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ・・・０．５ユニット
１５０μｇ／ｍｌの２，４−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）−６−メチルピリリウム アイオダイドのアセトニトリル溶液・・・１μｌ
１０×ｂｕｆｆｅｒ・・・５μｌ
蒸留水・・・３９μｌ
（冷凍保存）
この容器２を図９の（Ｂ）に示すように容器１内にセットして、キットを得た。次に、それぞれの組織Ａ、Ｂから先に述べた操作により得られたｃＤＮＡサンプルの段階希釈（１（希釈なし）、１／２、１／１０、１／５０、１／１００、１／１０００、１／１００００希釈）を調製し、希釈していないサンプルと各希釈液を個々に上記の構成のキットに、ピペットマンで容器１の底の部分に注入した。その際、容器２の部分のパラフィンコート紙を破いた。ｃＤＮＡ注入後、各容器を遠心処理し、容器２の部分内の成分をプライマーのある反応領域５に移行させた。完全に移行したことを確認後、試薬が入っていた容器２を容器１から取り除き、そこにＡｍｐｌｉ Ｗａｘ ＰＣＲ Ｇｅｎ １００ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）１個ずつそれぞれ加えた。
（４）ＰＣＲ反応及び検出
【０１７５】
実施例１と同様の条件で、ＰＣＲを行い、さらに各容器内のサンプルを希釈せずに蛍光強度の測定を行った。組織Ａについての結果を図８に示す。組織Ａでは標的遺伝子が増幅していることがわかる。また、鋳型となったＤＮＡの希釈率に対応して定量的に増幅産物ができていることがわかる。一方、組織Ｂでは、蛍光は認められなかった。
（５）電気泳動での分析
検出後の試料からのｃＤＮＡをエタノール沈澱により回収後、アガロースゲル電気泳動で調べた。組織Ａからの鋳型として利用されたｃＤＮＡについては、その量が１（希釈せず）、１／２〜１／１０００希釈までは３１７ｂｐ部分にバンドが認められたが、１／１００００希釈、ｃＤＮＡを加えずにプライマーのみで反応させた場合、及び組織Ｂからのものではバンドが見られなかった。
【０１７６】
比較例５
実施例４で採取した組織Ａ、Ｂについて従来法である培養法により評価した。組織Ａでは増殖が認められ、悪性癌と判断された。組織Ｂでは増殖は認められず、良性のポリープと判断された。
【０１７７】
【発明の効果】
本発明によれば、２本鎖核酸と特異的に反応する色素化合物をＰＣＲ増幅産物の検出に用いるので、ＰＣＲを利用する各種の検出、定量あるいは菌数の計測における操作の大幅な簡便化が計れ、しかも正確な測定や定量が行える。
【０１７８】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：ＰＣＲ用プライマー
配列
AGAGTTTGAT CATGGCTCAG 20
【０１７９】
配列番号：２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：ＰＣＲ用プライマー
配列
AACCCAACAT CTCACGACAC 20
【０１８０】
配列番号：３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：ＰＣＲ用プライマー
配列
AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG 20
【０１８１】
配列番号：４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：ＰＣＲ用プライマー
配列
AACCCAACAT CTCACGACAC 20
【０１８２】
配列番号：５
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：ＰＣＲ用プライマー
配列
GACTCTGGAG TGAGAATCAT A 21
【０１８３】
配列番号：６
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴：ＰＣＲ用プライマー
配列
ATCCAATCAC CCACATGCAT T 21
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において調製した各サンプルのマイクロプレート上での配置を示す図である。
【図２】実施例１で得られた蛍光強度と鋳型ＤＮＡ（テンプレート）量との関係を示す図である。
【図３】比較例２で得られた蛍光強度と鋳型ＤＮＡ（テンプレート）量との関係を示す図である。
【図４】実施例２において調製した各サンプルのマイクロプレート上での配置を示す図である。
【図５】実施例２においてマイクロプレートで調製した各サンプルでのＰＣＲ増幅産物の形成状態を示す図であり、斜線部は蛍光強度がブランクの２倍以上のウエルを示す。
【図６】実施例２と比較例３で得られた菌数の相関関係を示す図である。
【図７】実施例３においてブランクの２倍以上の蛍光強度を示すウエルの位置を示す図である。
【図８】実施例４における組織Ａからのサンプルでの結果を示す図である。
【図９】本発明の核酸検出用のキットの一例の構成及び使用方法を示す図である。
【符号の説明】
１ 容器
２ 試薬領域を構成する容器
３ プライマー
４ ピペット先端部
５ 反応領域
Claims (16)
- 標的核酸の特定配列領域の増幅に必要なプライマーの存在下で核酸試料に対してＰＣＲを行う過程と、該試料中に標的核酸が存在する場合に増幅される２本鎖核酸からなる増幅産物に、遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物を反応させた際に得られる蛍光の強度を測定する過程と、を有し、測定された蛍光強度から前記核酸試料中の標的核酸の量を求める核酸の定量方法であって、
前記色素化合物が、下記化合物番号１〜４、６、９、１１及び１５〜１６の化合物のいずれかであることを特徴とする核酸の定量方法。
- 前記色素化合物が水不溶性であり、該色素化合物と水性媒体とを含む反応系でＰＣＲを行った後、該反応系に溶剤を添加して該色素化合物を溶解させることで増幅産物と反応させる請求項１に記載の核酸の定量方法。
- ＰＣＲ用の反応領域内に、遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物の必要量を配置した反応器を有する核酸定量用のキットであって、
前記色素化合物が、下記化合物番号１〜４、６、９、１１及び１５〜１６の化合物のいずれかであることを特徴とする核酸定量用のキット。
- 前記反応領域内に標的核酸の特定配列領域のＰＣＲの増幅に必要なプライマーの必要量を更に配置した請求項３に記載の核酸定量用キット。
- 前記色素化合物が水不溶性であり、反応領域内でのＰＣＲ後の反応液に該色素化合物を溶解させて増幅産物と反応させるための溶剤を更に有する請求項３または４に記載の核酸定量用キット。
- ＰＣＲ用の反応領域と、該反応領域と隔離された試薬領域とを有し、該試薬領域に遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物の必要量が配置され、該試薬領域内の色素化合物が前記反応領域内に添加可能に設けられている核酸定量用キットであって、
前記色素化合物が、下記化合物番号１〜４、６、９、１１及び１５〜１６の化合物のいずれかであることを特徴とする核酸定量用キット。
- 試薬領域がＰＣＲ用の試薬も含む請求項６に記載の核酸定量用キット。
- 試薬領域を複数に分割し、前記色素化合物を含む試薬領域と、ＰＣＲ用の試薬を含む試薬領域を設けた請求項７に記載の核酸定量用キット。
- 反応領域内に標的核酸の特定配列領域のＰＣＲの増幅に必要なプライマーの必要量を更に配置した請求項６〜８のいずれかに記載の核酸定量用キット。
- 前記色素化合物が水不溶性であり、反応領域内でのＰＣＲ後の反応液に該色素化合物を溶解させて増幅産物と反応させるための溶剤を更に有する請求項６〜９のいずれかに記載の核酸定量用キット。
- 試薬領域内に前記色素化合物の溶液が配置されている請求項６〜１０のいずれかに記載のＰＣＲ増幅産物の定量用キット。
- 被検出微生物または細胞を含む試料から核酸を抽出する過程と、得られた核酸抽出物の段階的希釈サンプルを調製する過程と、各希釈サンプルについて被検出微生物または細胞に特有の配列を増幅するためのＰＣＲを行う過程と、を有し、該ＰＣＲにより得られた２本鎖核酸からなる増幅産物に、遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物を反応させて得られる蛍光を測定し、蛍光が得られた希釈サンプルの希釈率から被検出微生物または細胞の数、特定遺伝子数、または特定遺伝子のコピー数を求める、被検出微生物または細胞の数、特定遺伝子数、または特定遺伝子のコピー数の計測方法であって、
前記色素化合物が、下記化合物番号１〜４、６、９、１１及び１５〜１６の化合物のいずれかであることを特徴とする被検出微生物または細胞の数、特定遺伝子数、または特定遺伝子のコピー数の計測方法。
- 前記色素化合物が水不溶性であり、該色素化合物と水性媒体とを含む反応系でＰＣＲを行った後、該反応系に溶剤を添加して該色素化合物を溶解させることで増幅産物と反応させる請求項１２に記載の計測方法。
- 多数のＰＣＲ用反応領域の各反応領域内に遊離時には蛍光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する色素化合物の必要量を配置した反応器を有し、これらの反応領域を利用して被検出微生物または細胞を含む試料から抽出した核酸抽出物の段階希釈が形成可能であり、かつ各希釈において前記被検出微生物または細胞に特有の配列を増幅するためのＰＣＲを行えるようにした、被検出微生物または細胞の数、特定遺伝子の数または特定遺伝子のコピー数を計測するためのキットであって、
前記色素化合物が、下記化合物番号１〜４、６、９、１１及び１５〜１６の化合物のいずれかであることを特徴とする被検出微生物または細胞の数、特定遺伝子の数または特定遺伝子のコピー数を計測するためのキット。
- 前記色素化合物が水不溶性であり、反応領域内でのＰＣＲ後の反応液に該色素化合物を溶解させて増幅産物と反応させるための溶剤を更に有する請求項１４に記載のキット。
- 反応領域内に被検出微生物または細胞に特有な配列のＰＣＲ増幅用のプライマーを更に有する請求項１４または１５に記載のキット。
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