RU2378383C1 - Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя болезней овощных культур - грамотрицательной бактерии pseudomonas syringae pv lachrymans методом полимеразной цепной реакции - Google Patents
Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя болезней овощных культур - грамотрицательной бактерии pseudomonas syringae pv lachrymans методом полимеразной цепной реакции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2378383C1 RU2378383C1 RU2008126866/13A RU2008126866A RU2378383C1 RU 2378383 C1 RU2378383 C1 RU 2378383C1 RU 2008126866/13 A RU2008126866/13 A RU 2008126866/13A RU 2008126866 A RU2008126866 A RU 2008126866A RU 2378383 C1 RU2378383 C1 RU 2378383C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lachrymans
- gram
- polymerase chain
- chain reaction
- pseudomonas syringae
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Создают набор синтетических олигонуклеотидов, включающий праймеры 5'-САА GCG ТСА CCG ТАА CTG С-3' и 5'-CAG CGT AAT TGC TTG GTA САА-3' и зонд (BHQ1)-5'-GCC AGC CTG GAG C(FdT)C GAT АТС CCA CGT-3'Р. Постановка полимеразной цепной реакции с использованием упомянутого набора позволяет достоверно обнаружить в биологическом материале, в частности в защищенном грунте, семенах, растениях, плодах огурца и томата, ДНК возбудителя болезней овощных культур - грамотрицательной бактерии Pseudomonas syringae pv lachrymans.
Description
Изобретение относится к области молекулярно-генетической диагностики фитопатогенов.
В последние годы разрабатываются различные методы молекулярно-генетической диагностики фитопатогенов, которые позволяют выявлять последовательности ДНК, являющиеся характерными для определенного вида возбудителя инфекционного заболевания. Тем самым обнаруживается соответствующий возбудитель заболевания и делается вывод о его наличии в биологическом материале.
Наиболее перспективным является использование в этих целях метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) - высокоспецифичный и высокочувствительный метод выявления бактериальной ДНК. Принцип ПЦР заключается в многократном копировании (амплификации) определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя.
Известно изобретение по заявке №2003121605 (опубликована 27.01.2005), представляющее набор для идентификации энтерогеморрагических Escherihia coli. Это изобретение предполагает проведение ПЦР реакции с участием реагентов, входящих в этот набор. В частности, используются следующие праймеры, специфичные искомым бактериям, которые позволяют обнаружить ДНК этой бактерии при ПЦР:
Rfb for 5'-CAGGTGAAGGTGGAATGGTTG-3'
Rfb rev 5'-GAGTACATTGGCATGGTGTGG-3'
stx2 for 5'-ATCAGCAATGTGCTTCCGGAG-3'
stx2 rev 5'-CTGAGCACTTTGCAGTAACGG-3'.
В результате обнаруживаются энтерогеморрагические Escherihia coli.
Также известны аналогичные изобретения «Способ и набор для обнаружения ДНК бактерии заболевания лаймского боррелиоза - borrelia burgdorferi)) (заявка №2004105688, опубликована 10.08.2005) и «Набор реагентов для определения ДНК пародонтопатогенных микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции» (заявка №2005136997, опубликована 10.06.2007).
Работа над созданием праймеров, которые используются в подобных наборах, строится обычно следующим образом.
1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей геномов микроорганизмов либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности изучаемого микроорганизма выбирается участок генома, уникальный для данного вида микроорганизмов (или группы видов).
2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции (часто 2 праймера и проба).
На данном этапе работа заключается в создании выравнивания многих геномных последовательностей и выборе участка последовательности, где число мутаций соответствует требуемому расположению праймеров.
Выравнивание геномных последовательностей означает сравнение последовательностей многих организмов друг с другом, поиск уникальных для нужного микроорганизма участков, не имеющих аналогов у других микроорганизмов.
Поиск соответствия между числом мутаций и расположением праймеров означает, что мутации, возможные в данном микроорганизме (естесственно те, данные о которых уже есть в базах или уже самостоятельно получены), не должны затрагивать выбранный для праймеров участок генома, так как замены в геномной последовательности (мутации) могут негативно сказаться на работе праймеров.
3) Изготовление праймеров заказывается в особом сервисном центре.
4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей (например, для определения наличия/отсутствия данного микроорганизма в биоматериале).
Предлагаемое изобретение позволяет обнаруживать ДНК фитопатогенной бактерии Pseudomonas syringae pv lachrymans, которая вызывает угловатую пятнистость листьев огурцов, вызывая гибель пораженных всходов и значительные потери урожая.
Однако аналогичные наборы, а также реакционные смеси, праймеры и способы обнаружения ДНК этой бактерии неизвестны.
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанной бактерии в биологическом материале (защищенный грунт, семена, растения, плоды огурца и томата).
Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя болезней овощных культур - грамотрицательной бактерии Pseudomonas syringae pv lachrymans, включающего в себя праймеры:
5'-CAA GCG ТСА CCG ТАA CTG С-3'
5'-CAG CGT AAT TGC TTG GTA CAA-3'
и пробу: (BHQl)-5'-GCC AGC CTG GAG C(FdT)C GAT АТС CCA CGT-3'Р, где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т.
Указанный набор синтетических олигонуклеотидов является составной частью набора следующих веществ.
1) Пробирка с реакционной смесью, запаянная парафином. В данную смесь входят указанные праймеры и проба, специфичные к участку ДНК Pseudomonas syringae pv lachrymans - гену HrpS, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов, реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (рН 8.8 при 25°С), 500 мМ КСl, 0.8% Р40, 20 мМ MGCl2), внутренний контрольный образец (ВК).
И праймеры, и проба представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Праймеры, специфичные к маркерному участку генома возбудителя, вводятся в реакцию непосредственно для амплификации (наработки) продукта. Проба (тоже специфичная к данному участку ДНК) имеет в своем составе флуоресцентную метку, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, что в свою очередь зависит от эффективности работы праймеров, количества стартового материала и других параметров реакции. Иными словами праймеры обеспечивают течение реакции, проба - проявку ее результатов.
Внутренний контрольный образец (ВК) представляет собой ДНК-последовательность, вносимую в реакцию для оценки эффективности ее протекания. Наработка ВК идет независимо от наработки специфического продукта с помощью отдельных праймеров и проб.
2) Раствор фермента Taq-полимеразы.
3) Положительный контрольный образец - ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 240 п.н. генома Pseudomonas syringae pv lachrymans. Он вносится в пробирку (по аналогии с исследуемыми образцами) для того, чтобы иметь возможность сравнивать результаты, полученные в опытных пробирках, с тем, как должно получаться при "положительной реакции". Соответственно добавляемые в остальные пробирки образцы ДНК являются опытными.
4) Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.
Данный набор применяется следующим образом.
1) Биологический материал (защищенный грунт, семена, растения, плоды огурца и томата) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора реагентов проводится через процедуру пробоподготовки с использованием другого набора (набор реагентов для пробоподготовки, не является предметом данного патента); в ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую в свою очередь используют для ПЦР.
2) Необходимое количество пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и пробу, маркируется согласно количеству анализируемых образцов.
3) Во все промаркированные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы.
4) Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок К-(отрицательный контрольный образец), К+ (положительный контрольный образец)) вносится выделенная согласно п.1) ДНК.
5) В пробирку, маркированную К-, вносится отрицательный контрольный образец.
6) В пробирку, маркированную К+, вносится положительный контрольный образец.
7) Все пробирки устанавливаются в блок амплификатора, амплификация проводится согласно режимам, прописанным в инструкции к набору. Детекция результатов осуществляется детектирующим амплификатором автоматически во время амплификации (устройства: амплификаторы детектирующие ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО "НПФ ДНК-Технология")).
Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору.
В случае образования специфического продукта ДНК проба разрушается, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции, который фиксируется специальными приборами - детектирующими амплификаторами.
Claims (1)
- Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя болезней овощных культур - грамотрицательной бактерии Pseudomonas syringae pv lachrymans методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что включает в себя праймеры
5'-САА GCG ТСА CCG ТАА СТG С-3';
5'-CAG CGT ААТ TGC TTG GTA САА-3',
и пробу (BHQ1)-5'-GCC AGC CTG GAG C(FdT)C GAT АТС ССА CGT-3'P, где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008126866/13A RU2378383C1 (ru) | 2008-07-03 | 2008-07-03 | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя болезней овощных культур - грамотрицательной бактерии pseudomonas syringae pv lachrymans методом полимеразной цепной реакции |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008126866/13A RU2378383C1 (ru) | 2008-07-03 | 2008-07-03 | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя болезней овощных культур - грамотрицательной бактерии pseudomonas syringae pv lachrymans методом полимеразной цепной реакции |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2378383C1 true RU2378383C1 (ru) | 2010-01-10 |
Family
ID=41644201
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008126866/13A RU2378383C1 (ru) | 2008-07-03 | 2008-07-03 | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя болезней овощных культур - грамотрицательной бактерии pseudomonas syringae pv lachrymans методом полимеразной цепной реакции |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2378383C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2458142C1 (ru) * | 2011-05-31 | 2012-08-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет | Способ диагностики биоматериалов на наличие в них агробактерий |
-
2008
- 2008-07-03 RU RU2008126866/13A patent/RU2378383C1/ru active
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2458142C1 (ru) * | 2011-05-31 | 2012-08-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет | Способ диагностики биоматериалов на наличие в них агробактерий |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5846729A (en) | Assaying nucleotides in solution using a fluorescent intensity quenching effect | |
US6046004A (en) | Solution hybridization of nucleic acids with antisense probes having modified backbones | |
JP5099920B2 (ja) | 核酸試験用対照 | |
CN114045356B (zh) | 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测柑橘黄龙病的试剂盒及方法 | |
KR20070011354A (ko) | 취약 x염색체 증후군과 같은 strp의 검출 방법 | |
US9845495B2 (en) | Method and kit for detecting target nucleic acid | |
JP4972104B2 (ja) | 病原体の同定のためのオリゴヌクレオチドマイクロアレイ | |
KR101225522B1 (ko) | 성적인 접촉에 의해 감염되는 질병을 일으키는 병원성 미생물 검사용 프로브, 그리고 이를 이용한 병원성 미생물 검사 칩, 검사키트 및 검사방법 | |
RU2378383C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя болезней овощных культур - грамотрицательной бактерии pseudomonas syringae pv lachrymans методом полимеразной цепной реакции | |
RU2378382C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя болезней овощных культур - грамотрицательной бактерии xanthomonas campestris pv vesicaroria методом полимеразной цепной реакции | |
RU2420589C1 (ru) | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Prevotella intermedia МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ | |
RU2376388C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя болезней овощных культур - грамотрицательной бактерии pseudomonas corrugata методом полимеразной цепной реакции | |
RU2420591C1 (ru) | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Porphyromonas gingivalis МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ | |
RU2510856C2 (ru) | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Candida albicans МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ | |
JP7176682B2 (ja) | 白癬菌の遺伝子をlamp法により検出するためのプライマーセット及びそれを含むキット並びにそれらを用いて白癬菌を検出する方法 | |
RU2415947C1 (ru) | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО МОНОЦИТАРНОГО ЭРЛИХИОЗА Ehrlichia spp. МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ "В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ" | |
RU2510857C2 (ru) | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Treponema denticola МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ | |
US8911939B2 (en) | Detection of Johnsongrass and its hybrid seed | |
KR20130039518A (ko) | 특정 프라이머 세트를 포함하는 배추무름병균을 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 배추무름병균을 검출하는 방법 | |
KR102110908B1 (ko) | 배추과 작물의 검은썩음병균 race 6을 판별할 수 있는 특이적 분자마커 및 이를 이용한 검은썩음병균 race 6 판별방법 | |
KR102110907B1 (ko) | 배추과 작물의 검은썩음병균 race 4를 판별할 수 있는 특이적 분자마커 및 이를 이용한 검은썩음병균 race 4 판별방법 | |
KR102110905B1 (ko) | 배추과 작물의 검은썩음병균 race 3을 판별할 수 있는 특이적 분자마커 및 이를 이용한 검은썩음병균 race 3 판별방법 | |
KR102110906B1 (ko) | 배추과 작물의 검은썩음병균 race 1을 판별할 수 있는 특이적 분자마커 및 이를 이용한 검은썩음병균 race 1 판별방법 | |
RU2535988C2 (ru) | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Tannerella forsythensis МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ | |
RU2420592C1 (ru) | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПАРОДОНТОПАТОГЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА Actinobacillus actinomycetemcomitans МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20170830 |