JP2004129554A - 蛍光標識方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】蛍光性物質による核酸標識方法の効率を上げ、それにより遺伝子の高感度な解析方法の提供。
【解決手段】一般式(I)
Ln−S−N   (I)
(式中、Lnは4,4’−ビス(1”,1”,1”,2”,2”,3”,3”−ヘプタフルオロ−4”,6”−ヘキサンジオン−6”−イル)クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Sはスペーサー分子を、Nはヌクレオチドをそれぞれ示す)
で表される蛍光性物質をヌクレオチド鎖中に取り込ませることにより核酸を標識する方法において、反応液中に界面活性剤を共存させることを特徴とする蛍光標識方法。
【選択図】 なし

Description

【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光性物質による核酸の標識方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
生物学的高分子の非アイソトープ標識におけるランタノイド金属イオンキレートの使用は、基礎研究の分野および診断の分野において大きな関心を集めている。この技術は、目的のシグナルを圧倒する通常の蛍光バックグラウンドに比較して長く持続するランタノイド元素の蛍光の利益を受けることができる。特に、バックグラウンド蛍光の蛍光崩壊時間がナノ秒オーダーであるのに対して、三価ランタノイドイオンであるユウロピウム〔Eu(III)〕、テルビウム〔Tb(III)〕およびサマリウム〔Sm(III)〕は実にミリ秒オーダーの蛍光崩壊時間を有する。
【0003】
適切な波長およびエネルギーレベルにおいて、サンプルに照射することによりバックグラウンド蛍光は既に崩壊しているが、ランタノイドを利用した標本はなお発光しているというタイムラグを利用して当該蛍光を測定することができる。この技術は、時間分解分光法として知られている。この技術の原理については、特許文献1および2ならびに非特許文献1に詳述されている。
【0004】
本発明者らは、このランタノイドイオンの蛍光性を核酸プローブアッセイに利用すべく種々検討を行ってきた。ランタノイドイオンの蛍光性は、一般にそれらがキレート剤によって捕獲される時に増強される。これは、水溶液中イオンの水和が放出エネルギーを劇的に消失するからである。キレート化はまた、当該イオンを検出すべき標的の近傍へ運ぶためにも必要である。従って、ランタノイド金属イオンキレートを用いてDNA/RNAあるいは遺伝子プローブの直接標識を行うことができれば、核酸プローブアッセイの検出にランタノイドイオンの蛍光性を利用することができる。
【0005】
本発明者らは、先に特定のキレート構造を選択することにより、蛍光強度が強く安定性の高い遺伝子プローブを調製し得る蛍光性物質が得られることを見出し、その利用方法を確立した(特許文献3参照)。その蛍光性物質とは、一般式(I)
Ln−S−N   (I)
(式中、Lnは4,4’−ビス(1”,1”,1”,2”,2”,3”,3”−ヘプタフルオロ−4”,6”−ヘキサンジオン−6”−イル)クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Sはスペーサー分子を、Nはヌクレオチドをそれぞれ示す)で表されるものである。
【0006】
この蛍光性物質は従来の蛍光物質よりも蛍光強度が高く、なお且つ蛍光安定性に優れていることから、従来よりも蛍光強度が強く、安定性の高い遺伝子プローブの作製、高感度の核酸プローブアッセイが可能になった。
【0007】
しかしながら、核酸プローブアッセイ、中でもCGH(Comparative Genomic Hybridization)等の染色体診断用途においては、蛍光強度が強ければ強いほどより高感度な検出が可能となるため、更なる高感度化が望まれる。
【0008】
【特許文献1】
米国特許第4,150,295号公報
【特許文献2】
米国特許第4,058,732号公報
【特許文献3】
特開2001−247857号公報
【非特許文献1】
Immunofluorescense and Related Staining Techniques, Knapp et al. eds. (1978: Elsevier/North Holland Biomedical Press)
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、蛍光性物質による核酸標識方法の効率を上げ、それにより遺伝子の高感度な解析方法を提供することにある。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討した結果、特定の反応条件を選択することにより、標識効率がより高い蛍光性物質の標識方法を見出し、これにより高感度な遺伝子プローブの検出方法を確立して本発明を完成するに至った。
【0010】
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)一般式(I)
Ln−S−N   (I)
(式中、Lnは4,4’−ビス(1”,1”,1”,2”,2”,3”,3”−ヘプタフルオロ−4”,6”−ヘキサンジオン−6”−イル)クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Sはスペーサー分子を、Nはヌクレオチドをそれぞれ示す)
で表される蛍光性物質をヌクレオチド鎖中に取り込ませることにより核酸を標識する方法において、反応液中に界面活性剤を共存させることを特徴とする蛍光標識方法。
(2)界面活性剤が非イオン性界面活性剤である上記(1)記載の蛍光標識方法。
(3)非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルまたはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである上記(2)記載の蛍光標識方法。
(4)界面活性剤の濃度が0.1mg/ml以上である上記(1)〜(3)のいずれかに記載の蛍光標識方法。
【0011】
本発明において「蛍光性物質」とは、ランタノイド金属イオンに配位して錯体となったときに錯体由来の蛍光を発することのできる化合物をいう。ここで使用可能なランタノイド金属イオンとしては、ユウロピウム、サマリウム、テルビウム、ジスプロシウム等が挙げられる。標識体の蛍光検出にはこれらのランタノイド金属イオンを単独で、もしくは複数種混合して使用することができる。
【0012】
本発明において「誘導体」とは、基本構造に官能基等の化合物を置換もしくは付加せしめるよう合成されたものを意味する。より具体的には4,4’−ビス(1”,1”,1”,2”,2”,3”,3”−ヘプタフルオロ−4”,6”−ヘキサンジオン−6”−イル)クロロスルホ−ο−テルフェニル〔4,4’−bis(1”, 1”, 1”, 2”, 2”, 3”, 3”−heptafluoro−4”, 6”−hexanedion−6”−yl)−chlorosulfo−ο−terphenyl;以下BHHCTとも略す〕の誘導体としては、4,4’−ビス(1”,1”,1”,2”,2”,3”,3”−ヘプタフルオロ−4”,6”−ヘキサンジオン−6”−イル)テルフェニルや4,4’−ビス(1”,1”,1”,2”,2”,3”,3”−ヘプタフルオロ−4”,6”−ヘキサンジオン−6”−イル)クロロスルホ−p−テルフェニル等が挙げられる。
【0013】
本発明において「スペーサー分子」とは、一般式(I)で表される蛍光性物質においてLn、すなわち、4,4’−ビス(1”,1”,1”,2”, 2”,3”,3”−ヘプタフルオロ−4”,6”−ヘキサンジオン−6”−イル)クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体、およびN、すなわちヌクレオチドの両者に結合可能であり、当該結合によりそれらをつなぐことができる二価の基であれば特に限定されない。好適なスペーサー分子として、炭素と炭素の間に7以下のアミド結合を有していてもよい炭素数5以上25以下の二価の脂肪族炭化水素基が挙げられる。さらに具体的には、−CH=CH−CO−NH−CH−CH−NH−(CO−CH−CH−CH−CH−CH−NH)−、−CH=CH−CH−NH−CO−(CH−NH−等が挙げられる。
【0014】
本発明に利用される蛍光性物質に含められるヌクレオチドとしては、種々のデオキシリボヌクレオチド(dATP、dGTP、dTTP、dCTP、dUTP)、種々のリボヌクレオチド(rATP、rGTP、rTTP、rCTP、rUTP)およびそれらの誘導体が挙げられる。ここで、誘導体とは、基本構造に官能基等の化合物を置換もしくは付加せしめるよう合成されたものを意味し、具体的にはdITP、ITP、7−deaza−dGTP等が挙げられる。
【0015】
本発明に利用される蛍光性物質を取り込ませるヌクレオチド鎖としては、上記種々のヌクレオチドが連続したヌクレオチド鎖(DNAやRNA)を使用することができる。具体的には、当該ヌクレオチド鎖としては、細胞内に発現するmRNAと特異的にハイブリッドを形成し得るcDNAあるいはアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。また、細胞内の核酸あるいは染色体の一部の特異的配列と相補的なヌクレオチド鎖を使用することができる。
【0016】
本発明に利用される蛍光性物質をヌクレオチド鎖中に取り込ませる工程は、試験管内酵素触媒ポリメリゼーションを利用することにより為される。具体的には、鋳型となる遺伝子DNAを基に、市販の耐熱性ポリメラーゼを用いたポリメラーゼ・チェーン・リアクション(以下、PCRと略す場合もある)またはポリメラーゼ・チェーン・リアクション・キットを用いて取り込ませる方法、市販のDNAポリメラーゼを用いたランダムプライマー法を用いて取り込ませる方法、市販のDNAポリメラーゼを用いたニックトランスレーションまたは市販のニックトランスレーションキットを用いて取り込ませる方法等がある。
【0017】
本発明の標識方法においては、蛍光性物質の標識用酵素への親和性が上がる等の推定される原因により、標識効率が上がることから界面活性剤を共存させる。本発明に用いられる界面活性剤としては、非イオン性またはイオン性のいずれでもよいが、標識に用いる酵素に対する作用が温和であることから非イオン性界面活性剤の方がより好ましい。非イオン性界面活性剤の中でも、親水疎水比(HLB)価が高いことから、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルまたはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが特に好ましい。具体例としてはTriton X−100、Tween 20、Nonidet P−40等が挙げられる。これらの界面活性剤を単独で、もしくは複数種混合して使用することができる。用いられる界面活性剤の反応液中の濃度は0.1〜50mg/mlであり、好ましくは1〜10mg/mlである。
【0018】
【実施例】
以下、本発明を実施例にて具体的且つ詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
以下の実施例において、BHHCT−11−dUTPとはBHHCTが、炭素と窒素の合計の原子数が11のスペーサー分子を介してdUTPと結合している蛍光性物質を意味し、特開2001−247857号公報に従って合成した。
また、BHHCT−4−dUTPとはBHHCTが、炭素と窒素の合計の原子数が4のスペーサー分子を介してdUTPと結合している蛍光性物質を意味し、以下に示す方法により合成した。
【0019】
(1)BHHCTの合成
特開平9−241233号公報に従いBHHCTを合成した。o−テルフェニル2.63gからBHHCT6.5gを得た。
【0020】
(2)Hg−dUTPの合成
dUTP−ナトリウム塩300mgを0.1M酢酸ナトリウム水溶液(pH6.0)60mlに溶解した。酢酸水銀851.9mgを加え、50〜55℃で4時間攪拌した。反応液を冷却した後、塩化リチウム203.98mgを加え、生成した塩化水銀を除くために反応液を酢酸エチルで洗浄し、5倍量のエタノールを加え−20℃で結晶を析出させた。この結晶を減圧濾過し、室温で減圧乾燥してHg−dUTPの白色結晶402.9mgを得た。
【0021】
(3)アリルアミン−dUTPの合成
0.1M酢酸ナトリウム水溶液(pH=5.0)で20mMに調製したHg−dUTP18.5mlに水2.7ml中のテトラクロロパラジウム(II)酸カリウム121.17mgを加え、次いで2Mアリルアミン水溶液(pH=7.0)2.22mlを加え室温で24時間攪拌した。この反応液を濾過して黒色固形のパラジウムを除去し、濾液をそのままカラムクロマト(DEAE Sephadex A−25;酢酸ナトリウム水溶液(pH=8.5)の0.1−0.6Mグラジエント)にかけ、精製した。精製されている画分を合わせて5倍量のエタノールを加え、−20℃で結晶を析出させた。この結晶を減圧濾過し、室温で減圧乾燥してアリルアミン−dUTPの白色結晶59.9mgを得た。
【0022】
(4)NHS−BHHCTの合成
THF50ml中にBHHCT1.7gおよびN−ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)0.21gを溶解した。この溶液にDCC(ジシクロヘキシルカルボジイミド)0.38gを添加し、次いでトリエチルアミン0.2gを滴下し、室温で1時間攪拌した。この反応液を処理し、シリカゲルカラムにかけ精製し、NHS−BHHCTの黄色粘性液体0.5gを得た。
【0023】
(5)BHHCT−4−dUTPの合成
0.1M炭酸水素ナトリウム(pH=8.5)20ml中にアリルアミン−dUTP60mgを溶解した。この溶液にDMF2mlに溶解したNHS−BHHCT101mgを滴下し、室温で4時間攪拌した。この反応液に5倍量のエタノールを加え、−20℃で24時間放置し結晶を析出させた。この結晶を減圧濾過し、室温で減圧乾燥してBHHCT−4−dUTPの薄黄色結晶46mgを得た。また、減圧濾過後の濾液を濃縮し、エタノールを加え、2次晶179.3mgを得た。
【0024】
実施例1
(1)PCR法によるBHHCT−11−dUTP標識反応
PCR反応を用いDNAをBHHCT−11−dUTPにより標識した。鋳型DNAとしてpUC19(東洋紡)、プライマーとしてM13 Primer P7(東洋紡)、M13 Primer P8(東洋紡)を用い、Triton X−100の濃度を0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、1mg/mlと変えて以下の組成の試薬(50μl)を調製した。PCR用酵素としては、rTaq DNA Polymerase(東洋紡)を用いた。
10ng pUC19
0.3μM 各Primer
5μl 10× PCR Buffer
4.5mM MgCl
0.04mM BHHCT−11−dUTP
0.2mM dGTP
0.2mM dATP
0.2mM dTTP
0.2mM dCTP
5U rTaq DNA Polymerase
すべての試薬を以下の条件で反応させた。
94℃,2分間の後、以下の3ステップを30サイクル繰り返した。
94℃,15秒間、55℃,30秒間、68℃,2分30秒間。
【0025】
(2)電気泳動による増幅確認
20g/lアガロース・ゲル(TAE buffer)を用い、(1)の反応後の溶液を電気泳動した(図1)。すべての試薬で、149bpのDNA断片の増幅が認められた。
【0026】
(3)標識の確認
標識反応後の溶液30μlに蒸留水3μlを添加した後、エタノール沈澱により未反応のBHHCT−11−dUTPを除去した。エタノール沈澱による沈澱を乾燥した後、110μlのユウロピウム水溶液(50mM Tris−HCl,pH=7.4、0.1mM EuCl、0.01mM TOPO(トリ−n−オクチルホスフィンオキシド)、0.1mg/ml Triton X−100)で溶解した。溶解液100μlの蛍光強度を遮光保存30分間経過後に、蛍光光度計(大日本製薬 フルオロスキャンII)で、励起波長315nm、蛍光波長612nmの条件にて測定した(表1)。PCR反応液中にTriton X−100を含んでいない試薬よりもTriton X−100を含んでいる試薬の方が蛍光強度が高くなり、より高頻度にBHHCT−11−dUTPで標識されていることが確認できた。
【0027】
【表1】
Figure 2004129554
【0028】
実施例2
(1)PCR法によるBHHCT−4−dUTP標識反応
PCR反応を用いDNAをBHHCT−4−dUTPにより標識した。鋳型DNAとしてpUC19(東洋紡)、プライマーとしてM13 Primer P7(東洋紡)、M13 Primer P8(東洋紡)を用いた。以下の組成を基本とし、界面活性剤の異なる(1mg/ml Triton X−100、1mg/mlTween 20、1mg/ml Nonidet P−40、界面活性剤なし)4種類の試薬(50μl)を調製した。PCR用酵素としては、KOD −Plus−(東洋紡)を用いた。
10ng pUC19
0.3μM 各Primer
5μl 10× PCR Buffer
3mM MgSO
0.2mM BHHCT−4−dUTP
0.2mM dGTP
0.2mM dATP
0.2mM dTTP
0.2mM dCTP
1U KOD −Plus−
すべての試薬を以下の条件で反応させた。
94℃,2分間の後、以下の3ステップを30サイクル繰り返した。
94℃,15秒間、55℃,30秒間、72℃,7分間。
【0029】
(2)電気泳動による増幅確認
20g/lアガロース・ゲル(TAE buffer)を用い、(1)の反応後の溶液を電気泳動した(図2)。すべての試薬で、149bpのDNA断片の増幅が認められた。
【0030】
(3)標識の確認
反応後の溶液30μlに蒸留水3μlを添加した後、エタノール沈澱により未反応のBHHCT−4−dUTPを除去した。エタノール沈澱による沈澱を乾燥した後、110μlのユウロピウム水溶液(50mM Tris−HCl,pH=7.4、0.1mM EuCl、0.01mM TOPO、0.1mg/ml Triton X−100)で溶解した。溶解液100μlの蛍光強度を遮光保存30分間経過後に、蛍光光度計(大日本製薬 フルオロスキャンII)で、励起波長315nm、蛍光波長612nmの条件にて測定した(表2)。PCR反応液中に界面活性剤を含んでいない試薬よりも界面活性剤を含んでいる試薬の方が蛍光強度が高くなり、より高頻度にBHHCT−4−dUTPで標識されていることが確認できた。
【0031】
【表2】
Figure 2004129554
【0032】
実施例3
(1)ランダムプライマー法によるBHHCT−11−dUTP標識反応
ランダムプライマー法を用いDNAをBHHCT−11−dUTPにより標識した。鋳型DNAとしてλ/HindIII digest(東洋紡)、プライマーとして5’末端をビオチン化した6merのランダムプライマーを用い、以下の組成で試薬(125μl)を2本調製した。
11mg λ/HindIII digest
0.2mM 5’ビオチン化ランダムプライマー
120mM Tris−HCl (pH7.4)
24mM MgCl
0.24mM DTT
2本の調製液を94℃で5分間熱処理を行い、処理後ただちに氷上で冷却した。氷冷後の溶液に、以下の組成を基本として、それぞれTriton X−100の濃度が0mg/ml、1mg/mlとなるように試薬を添加混合し、反応液(300μl)を調製した。反応酵素としてKlenow Fragment(東洋紡)を用いた。
0.035mM BHHCT−11−dUTP
0.1mM dGTP
0.1mM dATP
0.065mM dTTP
0.1mM dCTP
45U Klenow Fragment
調製した試薬を16℃で3時間反応させ、70℃、10分間の熱処理を行い、反応を停止させた。
【0033】
(2)標識の確認
反応終了後の標識反応液をストレプトアビジンコート・マイクロタイタープレート(ロッシュ製)に100μl/ウェルで分注した。37℃で1時間インキュベーションした後、マイクロタイタープレートから標識反応液を除き、350μl/ウェルのトリス緩衝生理食塩水で3回洗浄を行った。100μl/ウェルでユウロピウム水溶液(50mM Tris−HCl,pH=7.4、0.1mM EuCl、0.01mM TOPO、0.1mg/ml Triton X−100)を分注し、遮光保存30分間経過後に、蛍光光度計(大日本製薬 フルオロスキャンII)で、励起波長315nm、蛍光波長612nmの条件にて蛍光強度を測定した(表3)。標識反応時のTriton X−100濃度が0mg/mlの場合よりも、1mg/mlの方が高い蛍光強度となった。
【0034】
【表3】
Figure 2004129554
【0035】
【発明の効果】
本発明の方法を利用することにより、蛍光強度が強い遺伝子プローブの作製、高感度な核酸プローブアッセイが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、rTaq DNA Polymeraseを用いたPCR法によるBHHCT−11−dUTP標識反応で、アガロース・ゲル電気泳動によりPCR産物の増幅を確認したものである。
【図2】図2は、KOD −Plus−を用いたPCR法によるBHHCT−4−dUTP標識反応で、アガロース・ゲル電気泳動によりPCR産物の増幅を確認したものである。

Claims (4)

  1. 一般式(I)
    Ln−S−N   (I)
    (式中、Lnは4,4’−ビス(1”,1”,1”,2”,2”,3”,3”−ヘプタフルオロ−4”,6”−ヘキサンジオン−6”−イル)クロロスルホ−ο−テルフェニルまたはその誘導体を、Sはスペーサー分子を、Nはヌクレオチドをそれぞれ示す)
    で表される蛍光性物質をヌクレオチド鎖中に取り込ませることにより核酸を標識する方法において、反応液中に界面活性剤を共存させることを特徴とする蛍光標識方法。
  2. 界面活性剤が非イオン性界面活性剤である請求項1記載の蛍光標識方法。
  3. 非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルまたはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである請求項2記載の蛍光標識方法。
  4. 界面活性剤の濃度が0.1mg/ml以上である請求項1〜3のいずれかに記載の蛍光標識方法。
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