ITTO20120302A1 - Dispositivo integrato e metodo per la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

del brevetto per Invenzione Industriale dal titolo:

"DISPOSITIVO INTEGRATO E METODO PER LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI QUANTITATIVA IN TEMPO REALE"

DESCRIZIONE

La presente invenzione à ̈ relativa ad un dispositivo integrato e ad un metodo per la PCR quantitativa in tempo reale (reazione a catena della polimerasi).

Le tipiche procedure per analizzare materiali biologici, quali acidi nucleici, richiedono una pluralità di operazioni a partire da materia grezzo. Queste operazioni possono includere vari gradi di purificazione, lisi, amplificazione o purificazione cellulare e l’analisi del prodotto purificato o amplificato risultante.

Per esempio, nei test ematici a base di DNA, i campioni vengono spesso purificati mediante filtrazione, centrifugazione o mediante elettroforesi in modo da eliminare tutte le cellule non nucleate. Quindi, i globuli bianchi restanti vengono lisati utilizzando mezzi chimici, termici o biochimici al fine di liberare il DNA da analizzare.

Successivamente, il DNA viene amplificato mediante una reazione di amplificazione. Prima, viene denaturato mediante procedimenti termici, biochimici o chimici. Le procedure sono simili se si deve analizzare l’RNA, ma si da più importanza alla purificazione o ad altri mezzi per proteggere la molecola di RNA labile. L’RNA viene solitamente copiato nel DNA (cDNA) e quindi l’analisi procede come descritto per il DNA.

La discussione qui viene semplificata focalizzandosi sul rilevamento di DNA mediante amplificazione PCR, come esempio di molecola biologica che può essere analizzata utilizzando il presente dispositivo. Tuttavia, il presente dispositivo e il presente metodo possono essere utilizzati per altri test chimici o biologici.

Come indicato, la PCR consente di moltiplicare una quantità iniziale di filamenti di DNA, aggiunti ad una miscela di reazione. Il procedimento di amplificazione include fondamentalmente tre fasi, includenti una fase di denaturazione, in cui i filamenti a doppia elica target di DNA vengono separati in filamenti a singola elica riscaldando la miscela ad una prima temperatura elevata, per esempio superiore a 90°C; una fase di annealing, in cui i primers vengono trattati termicamente sui filamenti a singola elica target ad una seconda temperatura inferiore, 50-65°C; ed una fase di estensione, in cui i nuovi filamenti di DNA, complementari ai filamenti target di DNA, vengono sintetizzati ad una temperatura intermedia, per esempio a 70-85°C, formando prodotti di amplificazione a doppia elica, chiamati anche “ampliconi†.

La PCR quantitativa in tempo reale à ̈ una tecnica ampiamente utilizzata basata sul monitoraggio in tempo reale della reazione PCR durante il suo progresso e può consentire la quantificazione delle molecole target iniziali in base a curve di amplificazione. Ciò può essere conseguito utilizzando sonde o coloranti fluorescenti, quali bromuro di etidio (EtBr), che si intercala in una doppia elica e quindi emette fluorescenza. Quindi, la fluorescenza aumenta quando le sonde o i coloranti fluorescenti si legano con i prodotti di amplificazione a doppia elica e questo aumento di fluorescenza può essere monitorato quando la reazione procede e il livello di prodotto di amplificazione aumenta in modo esponenziale. Le sonde marcate che ibridano su sequenze amplificate possono essere utilizzate nella stessa modalità. Maggiore à ̈ la quantità di molecola target all’inizio della reazione, maggiore à ̈ il segnale ottenuto in un momento t quando la reazione à ̈ ancora nella parte esponenziale della curva di amplificazione.

Sebbene siano ampiamente disponibili sul mercato strumenti consolidati, l’attuale tendenza à ̈ quella di sviluppare nuovi dispositivi mirati ad aumentare la resa e la portabilità. Tali dispositivi possono implicare matrici impaccate di pozzetti da nanolitri in grado di eseguire lo screening altamente parallelo di cartucce pre-caricate per applicazioni point-of-care (nel punto di interesse).

Tra i vari aspetti che caratterizzano gli strumenti per PCR quantitativa in tempo reale (RTQ-PCR) attuali, quali riproducibilità, parallelizzazione, etc., un aspetto importante à ̈ correlato alla velocità di esecuzione dei test. Infatti, per via dei metodi funzionali intrinseci alla PCR, sono necessari diversi cicli di amplificazione per rilevare il prodotto, ciascuno includendo la commutazione della temperatura tra due o tre differenti temperature, come discusso in precedenza. Ogni ciclo può impiegare diversi secondi e sono tipicamente necessari decine di cicli per eseguire un test. In particolare, quando sono disponibili poche copie di DNA iniziali, l’intero test può durare un’ora o più.

Questo può essere un aspetto limitante, in particolare per applicazioni di point-of-care, in cui la velocità à ̈ una considerazione molto importante.

Questa limitazione può essere chiaramente apprezzata dai diagrammi delle figure 1 e 2. La figura 1 schematizza una curva RTQ-PCR che mostra la fluorescenza in aumento durante l’esecuzione dei cicli. Come si può vedere, la curva ha tre porzioni differenti: una iniziale, porzione A, in cui la fluorescenza rimane bassa (livello di fondo); una seconda porzione, porzione B, dopo un punto chiamato ciclo di soglia “CT†, in cui la curva cresce in modo esponenziale per alcuni cicli; ed una porzione finale, porzione C, in cui la curva satura e non à ̈ visibile alcuna ulteriore amplificazione.

Nella porzione A, la fluorescenza di fondo à ̈ dominante. La fluorescenza di fondo à ̈ intrinseca nei metodi RTQ-PCR e non può essere evitata, neppure ridotta fortemente solo ottimizzando i metodi di rilevamento. Infatti la fluorescenza di fondo à ̈ dovuta alla presenza di sonde fluorescenti libere o fluorofori nel contenitore di reazione o nel pozzetto. Data l’elevata concentrazione iniziale delle sonde fluorescenti libere, in questa porzione iniziale la fluorescenza dovuta all’amplificazione à ̈ irrilevante oppure non distinguibile dalla fluorescenza intrinseca. Dopo il ciclo di soglia CT, tuttavia, la curva di fluorescenza aumenta fortemente grazie alla crescita esponenziale dei prodotti di amplificazione.

Come illustrato in figura 2 (si veda http://www.sabiosciences.com/pathway7.php), il ciclo di soglia CT dipende, per esempio, dalla concentrazione dei filamenti target iniziali nel contenitore di reazione (indicato lateralmente su ciascuna curva). Come visibile, nel caso di concentrazioni molto basse (1-10<4>), il ciclo di soglia CT può richiedere diversi cicli di amplificazione; quindi l’intera procedura richiede molto tempo.

Pertanto, esiste l’esigenza di fornire un dispositivo ed un metodo per ridurre il tempo necessario per eseguire la RTQ-PCR.

Sono state proposte numerose tecniche e metodi per migliorare l’efficienza della RTQ-PCR.

Il documento EP 2077336 descrive, per esempio, un metodo per l’analisi quantitativa contemporanea di sequenze multiple di acido nucleico in un singolo compartimento, avente l’intento di aumentare il numero di differenti sequenze che possono essere rilevate contemporaneamente. A tal fine, numerose sonde oligonucleotidiche immobilizzate sulla superficie, complementari alle sequenze multiple da analizzare, fungono da sonde di cattura e vengono rilevate utilizzando un dispositivo di lettura altamente specifico sulla superficie. Le sonde di cattura possono essere immobilizzate su gocce paramagnetiche attratte verso una superficie attraverso un campo magnetico.

Il documento US2008305481 descrive metodi e sistemi che utilizzano microsfere superparamagnetiche codificate a fluorescenza per l’immobilizzazione di prodotti di amplificazione durante il procedimento PCR. Inoltre questo documento à ̈ diretto a consentire l’analisi multipla di RTQ-PCR.

Entrambe le soluzioni note sono dirette ad aumentare la capacità di multiplazione, e seguendo un rilevamento a singola goccia o "bead" (oppure goccia per goccia). Tra le varie tecniche di rilevamento, si considera il fotorilevamento utilizzando un variatore di lente lineare (LLC) o rilevatori confocali. Per distinguere dalla fluorescenza di fondo, il piano ottico del rilevatore à ̈ impostato sulla superficie in cui si concentrano le gocce, migliorando in tal modo il rapporto segnale-rumore.

Per consentire il rilevamento di gocce immobilizzate sulla superficie di fondo del contenitore, à ̈ necessario l’utilizzo di tecniche di rilevamento molto complesse o di gocce relativamente grandi. Infatti, i rilevatori confocali non sono adatti a distinguere la fluorescenza in volumi inferiori alla loro risoluzione ed hanno una risoluzione minima di circa 1 µm. In altri termini, essi raccolgono tutta la fluorescenza emessa in un volume che può essere approssimato con un cilindro avente diametro di base e altezza di 1 µm.

Questo non à ̈ un problema quando viene eseguita una scansione goccia a goccia, come suggerito nel rilevamento multiplo, discusso nei documenti di cui sopra, poiché si possono utilizzare grandi gocce.

Tuttavia, questa soluzione non risolve il problema di ridurre sostanzialmente il ciclo di soglia CT nel rilevamento di un singolo tipo di prodotto di amplificazione, in cui la distinzione tra differenti prodotti di target viene eseguita utilizzando diversi contenitori disposti in grandi matrici, se così si desidera.

In questo caso, infatti, il rilevamento di una piccola quantità di ampliconi alla volta non consente una riduzione del tempo di processo.

D’altra parte, se si utilizzano gocce con dimensioni minori, anche un volume del liquido sovrastante lo strato degli ampliconi immobilizzati potrebbe essere rilevato dal lettore confocale, poiché quest’ultimo non à ̈ in grado di rilevare volumi inferiori alla propria risoluzione. Ne consegue che possono essere rilevati anche fluorofori non attivati flottanti liberi. In tal caso, la lettura potrebbe essere nuovamente influenzata dalla fluorescenza di fondo.

La dipendenza dello spessore dello strato immobilizzato su una superficie del contenitore rispetto alle dimensioni delle gocce e al guadagno ottenibile sono illustrate nelle figure 3a, 3b, in cui la figura 3b mostra la porzione sul lato destro della curva della figura 3a, in scala ingrandita. La linea D (i cui valori sono illustrati sulla sinistra), schematizza lo spessore dello strato in funzione del diametro delle gocce, mentre la linea E schematizza il guadagno di ciclo (ovvero la riduzione del numero di cicli necessari per raggiungere il ciclo di soglia Ct dovuto alla riduzione delle dimensioni delle gocce). Come visibile, il guadagno di ciclo aumenta considerevolmente in caso di gocce più piccole, ma la contemporanea riduzione dello spessore ben al di sotto della risoluzione a microscopio confocale impedisce il rilevamento attraverso un rilevatore confocale. In altri termini, quando si utilizza un rilevatore confocale, devono essere utilizzate gocce relativamente grandi, in cui il guadagno à ̈ basso.

Pertanto, il compito dell’invenzione consiste nel concepire un metodo e un dispositivo che superino la limitazione delle soluzioni note e consentano una RTQ-PCR rapida in una matrice di contenitori.

Secondo la presente invenzione, sono previsti un metodo e un dispositivo per il rilevamento quantitativo in tempo reale di singole sequenze di acido nucleico target, come riportato nelle rivendicazioni 1 e 9, rispettivamente.

Per la comprensione della presente invenzione, vengono ora descritte le forme di realizzazione preferite, solamente come esempio non limitativo, facendo riferimento ai disegni allegati, in cui:

la figura 1 mostra il diagramma della fluorescenza rispetto al numero di cicli di amplificazione durante una RTQ-PCR;

la figura 2 mostra i diagrammi dei cicli di soglia rispetto al numero di cicli eseguiti in funzione del numero di sequenze target iniziali presenti nel campione;

la figura 3a mostra il diagramma dello spessore di strato e del guadagno ottenuto rispetto al diametro delle gocce;

la figura 3b mostra una porzione del diagramma della figura 3a, in scala ingrandita;

la figura 4 Ã ̈ una vista laterale di una microcella di reazione in una prima fase della reazione;

la figura 5 Ã ̈ una vista laterale della microcella di reazione della figura 4 in una fase successiva della reazione;

la figura 6 Ã ̈ una vista laterale di una microcella di reazione differente nella medesima fase della figura 5;

la figura 7 mostra un’altra forma di realizzazione della microcella di reazione;

la figura 8 Ã ̈ una vista in prospettiva di una microcella;

la figura 9 mostra una sezione trasversale di una porzione della microcella della figura 8;

la figura 10 Ã ̈ una vista in prospettiva di una matrice di microcelle;

la figura 11 mostra un’implementazione di un elemento a rilevatore confocale integrato; e

la figura 12 mostra un dispositivo per il rilevamento della RTQ-PCR comprendente le microcelle della figura 8 e gli elementi a rilevatore confocale della figura 11.

Secondo un aspetto, vengono utilizzati primer derivati da nanogocce paramagnetiche o super paramagnetiche; dopo ciascun ciclo di amplificazione o dopo un dato numero di cicli di amplificazione, un campo magnetico viene applicato ad un pozzetto contenente il liquido di reazione per confinare e concentrare le nanogocce in un multistrato, formato sovrapponendo le nano gocce, e la fluorescenza viene letta nello strato di concentrazione utilizzando una tecnica di rilevamento a discriminazione spaziale specifica per la superficie, per esempio utilizzando un microscopio confocale.

In particolare, i parametri del metodo possono essere selezionati in modo tale che il multistrato abbia uno spessore corrispondente alla risoluzione verticale del dispositivo di lettura specifico per superficie. Qui, il termine “corrispondente†, indica il valore di risoluzione verticale ±10%.

In aggiunta, i parametri del sistema possono essere selezionati in modo da impostarne il piano focale in una regione centrale del multistrato. Idealmente, il piano focale à ̈ impostato nel piano mediano, ovvero ad un’altezza di h/2 rispetto alla parete di fondo, in cui h indica lo spessore del multistrato, ma à ̈ anche accettabile una distanza nell’intervallo h/2 ±30%.

Poiché la fluorescenza viene misurata nella regione di confinamento di nanogocce formata da un multistrato avente uno spessore comparabile con risoluzione verticale di lettura, in cui le sonde legate sono molto più concentrate rispetto alle sonde non legate, la fluorescenza di fondo à ̈ notevolmente ridotta, il che consente di raggiungere il ciclo di soglia CT con meno cicli termici. Quindi, le misurazioni RTQ-PCR possono essere notevolmente velocizzate.

L’utilizzo di primer per PCR legati a nanogocce magnetiche à ̈ stato già dimostrato nella letteratura con l’intento di sviluppare una nuova metodologia di saggio (si veda, per esempio, Lermoa et al., “In situ DNA amplification with magnetic primers for the electrochemical detection of food pathogens†, Biosensors and Bioelectronics 22 (9-10); 2010-2017 (2007); si veda anche C.S. Jacobsen, “Microscale detection of specific bacterial DNA in soil with a magnetic capture-hybridization and PCR amplification assay†, Appl. Environ. Microbiol. 61 (9); 3347-3352 (1995).

Inoltre, sebbene il sistema sia stato esemplificato utilizzando i primer legati alle gocce magnetiche, sono possibili altri formati di saggio. Per esempio, nanoparticelle magnetiche o altri marcatori magnetici, quali marcatori a base di ferrocene, magneti a singola molecola e simili possono essere sviluppati e utilizzati per magnetizzare i prodotti della PCR in altri modi.

Poiché le nanogocce sono magneticamente confinate in un multistrato avente uno spessore preselezionabile, si possono utilizzare gocce aventi un diametro di pochi nm. Per esempio, le nanogocce possono avere un diametro inferiore a 50 nm, preferibilmente al massimo di circa 16 nm (per esempio meno di 17 nm); più preferibilmente tra 5 e 10 nm, per esempio di circa 5-6 nm o anche minori (per esempio fino a 1-2 nm). Pertanto, si ottiene una concentrazione molto elevata delle nanogocce nel multistrato, insieme ad una compattazione molto elevata delle sonde fluorescenti attivate e la riduzione dello spazio libero tra le nanogocce. Di conseguenza, viene anche ridotto il numero dei fluorofori non attivati nella regione monitorata fino ad un valore trascurabile. Poiché tutti i fluorofori attivati sono contenuti nella regione di rilevamento, la loro concentrazione aumenta, riducendo pertanto il numero di cicli di amplificazione prima del ciclo di soglia CT. Quando si utilizzano nanogocce inferiori a 17 nm, à ̈ stato dimostrato che possono essere ottenute come singoli cristalli con caratteristiche superparamagnetiche (si veda, per esempio, Cafer T. Yavuz et al. “Low-Field Magnetic Separation of monodisperse nanocrystals, Science 314 (5801): 964-967 (2006), a pagina 966, colonna di sinistra, che indica un valore di circa 16 nm per particelle di ossido di ferro); per ottenere nanoparticelle nell’intervallo di 17-50 nm, à ̈ necessario includere i singoli cristalli in una matrice (per esempio polimerica), in modo più complesso e costoso.

Per aumentare ulteriormente l’effetto di compattazione e ridurre l’effetto dei fluorofori non attivati, secondo un ulteriore aspetto, à ̈ stato anche proposto il confinamento laterale delle nanogocce. A tal fine, ciascuna cella ha il proprio magnete disposto al di sotto della superficie di fondo di un rispettivo contenitore e ha un diametro inferiore rispetto alla superficie di fondo. La possibilità di ottenere il contenimento di materiale superparamagnetico in un campo magnetico basso à ̈ stata dimostrata, per esempio in Cafer T. Yavuz et al. “Low-Field Magnetic Separation of monodisperse nanocrystals, Science 314 (5801): 964-967 (2006).

Questi e altri aspetti del presente sistema e del presente metodo verranno descritti in dettaglio qui di seguito.

La figura 4 mostra una microcella di reazione 1 per eseguire la RTQ-PCR. Qui la microcella 1 ha un micropozzetto 2 comprendente una parete laterale 3 e una parete di fondo 4. Un magnete 5 si estende in prossimità della parete di fondo 4, qui sotto la parte di fondo 4, sebbene il magnete possa anche essere posizionato nella o sulla parete di fondo; in questo ultimo caso, una pellicola protettiva (non illustrata) può rivestire il magnete 5.

Un obbiettivo 6, in particolare un obbiettivo confocale, à ̈ disposto sul micropozzetto 2 ed à ̈ collegato ad un’unità di elaborazione 8.

Un’alimentazione di potenza 7 à ̈ collegata al magnete 5 per la sua attivazione e per generare un campo magnetico in una fase di rilevamento.

La microcella 1 Ã ̈ configurata in modo da eseguire la RTQ-PCR e il rilevamento di fluorescenza multistrato, come descritto qui di seguito.

In dettaglio, inizialmente una soluzione 10 viene introdotta nel micropozzetto 2, per esempio mediante iniezione. La soluzione 10 comprende sequenze a doppia elica target (indicate con 11); primer magnetici 12 (ovvero, come illustrato nel dettaglio ingrandito, primer 13 immobilizzati su nanogocce magnetiche 14); DNA polimerasi (non illustrata), sonde fluorescenti libere 15 e dNTP liberi 16, in modo di per sé noto.

Per esempio, le sonde fluorescenti 15 possono essere Sybr Green o altre sonde marcate a fluorescenza disponibili in commercio (per esempio beacon molecolari, scorpioni, sonde di illuminazione, etc.). Le nanogocce 14 sono di materiale paramagnetico o superparamagnetico quali nanocristalli di ferro, magnetite (Fe3O4), maghemite (yFe2O3), in modo da essere facilmente magnetizzate in presenza di un campo magnetico ed attratte dal magnete 5 verso la parete di fondo 4, ma ritornano allo stato non magnetizzato quando sono libere di muoversi nella soluzione 10, non appena il campo magnetico viene rimosso. Come indicato, le nanogocce hanno un diametro inferiore a 50 nm, preferibilmente di 5-10 nm, per esempio 5-6 nm.

Quindi viene eseguito un ciclo di amplificazione, in una modalità di per sé nota, comprendente una fase di denaturazione ad una prima temperatura più elevata, per ottenere singoli filamenti dalle sequenze a doppia elica target; una fase di annealing, ad una temperatura inferiore, per consentire il trattamento termico dei primer magnetici 12 in singoli filamenti; ed una fase di estensione, ad una temperatura intermedia, in cui la DNA polimerasi sintetizza nuovi filamenti dai dNTP 16, per ottenere prodotti di amplificazione, illustrati schematicamente nel punto 20 e che incorporano sonde fluorescenti 15, come visibili nel dettaglio ingrandito.

Quindi il magnete 5 viene eccitato in modo da generare un campo magnetico, come illustrato schematicamente in fig.

5. Come indicato, i parametri del campo magnetico sono selezionati in modo tale che il multistrato 22 abbia uno spessore corrispondente alla risoluzione verticale (definita anche “risoluzione assiale†o “spessore di fetta ottico†) dell’obbiettivo 6. Per esempio, viene generato un campo magnetico di circa 1 T. In aggiunta, come discusso in precedenza, il sistema à ̈ progettato in modo tale che il piano focale dell’obbiettivo 6 sia impostato in una regione centrale del multistrato 22. Di conseguenza, tutti i primer magnetici 12 vengono attratti verso la parete di fondo 4 del micropozzetto 2. Come spiegato in precedenza, grazie alle dimensioni delle nanogocce 14, e della loro concentrazione nella soluzione, tutte le nanogocce 12, legate a rispettivi ampliconi o non ancora legate, vengono attratte e formano un multistrato 22 di gocce. Durante questa fase, l’obbiettivo 6 legge la fluorescenza nel multistrato 22 e genera un segnale elettrico corrispondente S.

Il segnale elettrico S generato dall’obbiettivo 6 viene inviato all’unità di elaborazione 8, per l’elaborazione standard.

Non appena il magnete 5 viene diseccitato, le nanogocce 14 sono libere di allontanarsi dalla parte di fondo 4 e, a causa del moto browniano, sono libere di allontanarsi in modo flottante e di distribuirsi nel liquido 10 nel micropozzetto 2.

Il ciclo di cui sopra viene ripetuto più volte, fino a quando la fluorescenza non supera la soglia CT e l’unità di elaborazione può generare i risultati delle analisi, fornendo solitamente la concentrazione delle molecole target nel campione.

Nelle forme di realizzazione delle figure 6 e 7 viene anche eseguito un confinamento laterale. In dettaglio, in entrambe le forme di realizzazione, il magnete 5 ha un diametro inferiore rispetto alla parete di fondo 4, per esempio 1/5 – 1/10. Applicando un campo magnetico sufficientemente forte, per esempio, di circa 1T, le nanogocce 14 percepiscono una elevata forza di richiamo che le fa impilare in modo da formare un multistrato avente una larghezza all’incirca uguale alla dimensione dei magneti. Questo effetto può essere aumentato prevedendo un incavo nella parete di fondo 4, si veda per esempio la figura 6 nel punto 25, sebbene ciò non sia necessario (come illustrato nella figura 7).

Le figure 8 e 9 mostrano un’implementazione del micropozzetto 2. Qui le pareti laterali 3 sono definite da un corpo pozzetto 29, di plastica, per esempio di policarbonato, e sono cilindriche. La parete di fondo 4 à ̈ formata in un corpo di base 30 differente dal corpo pozzetto 29 e chiude il micropozzetto 2 in corrispondenza del fondo. Il corpo di base 30 comprende un substrato 31 di materiale semiconduttore, per esempio silicio, rivestito da uno strato dielettrico 32, per esempio di diossido di silicio.

Una regione di nucleo 33, di materiale ferromagnetico quale ferro, nichel, cobalto e loro leghe, viene annegata nello strato dielettrico 32, in una posizione centrale della base del micropozzetto 2. Una bobina 34 di materiale conduttivo, per esempio un metallo quale alluminio, si avvolge attorno alla regione ferromagnetica 33, ad una data distanza dalla stessa, all’interno dello stesso strato dielettrico 32. La bobina 34 e la regione di nucleo 33 formano il magnete 5. Qui, à ̈ la larghezza della regione di nucleo 33 che determina il confinamento laterale del multistrato 22. In questo modo, può essere realizzata una piastra di microtitolazione avente una base magnetica per ciascun pozzetto, utilizzando tecniche di realizzazione di semiconduttori standard ed economiche.

Per esempio, la microcella 1 può avere le seguenti dimensioni: diametro e altezza del micropozzetto 2: 300 µm; spessore della regione di nucleo 33: 1-2 µm; spessore della bobina 34: 1-2 µm; spessore dello strato dielettrico 32: lievemente superiore rispetto alla regione di nucleo e alla bobina, giusto per coprirle, per esempio, 2-2,5 µm; raggio interno della bobina 34: 250 µm; raggio esterno della bobina 34: 400 µm; larghezza W della striscia di alluminio che forma la bobina 34: 1,5 µm; distanza L tra le spire della bobina 34; numero N di spire della bobina 34: 50; permeabilità Km della regione di nucleo 33: 103. Con tale micropozzetto 2, alimentando la bobina 34 con una corrente i di 10 mA, à ̈ possibile generare un campo magnetico BN di:

in cui µoà ̈ la permeabilità nel vuoto e Rn à ̈ il raggio di ciascuna spira della bobina 34, il cui valore massimo, eventualmente, à ̈ limitato dalla saturazione magnetica del materiale della regione di nucleo 33 (ferro, nichel, cobalto e leghe).

Il micropozzetto 2 può far parte di una matrice 40 di pozzetti avente un corpo di base comune 45 (di materiale semiconduttore, analogo al corpo 30 della figura 9) ed un corpo di parete comune 46 (analogo al pozzetto 29 della figura 9), come illustrato nella figura 10, in cui i micropozzetti 2 possono essere configurati in modo da rilevare un medesimo prodotto target o micropozzetti differenti 2 possono rilevare differenti target.

La matrice 40 di pozzetti può far parte di un dispositivo integrato per eseguire la RTQ-PCR, come illustrato nella figura 11. Qui, il dispositivo 50 comprende la matrice 40 di pozzetti, un generatore di potenza 41, comune per tutte le microcelle 2 e collegato alla matrice 40 di pozzetti; una matrice rilevatori 42, formata da una pluralità di rilevatori ottici confocali 43, disposti al di sopra della matrice 40 di pozzetti; ed un’unità di elaborazione 44, per controllare le varie fasi della RTQ-PCR e l’eccitazione dei magneti 5. Se necessario, il generatore di potenza 41 e l’unità di elaborazione 44 possono essere integrati nel substrato 31 del corpo di base comune 45 di materiale semiconduttore.

La matrice rilevatori 42 può essere implementata dal rilevatore ottico confocale descritto nella domanda di brevetto italiano T02011A000298, depositata il 1 Aprile 2011 a nome della medesima richiedente, che à ̈ caratterizzato dalle sue dimensioni complessive ridotte e quindi può essere utilizzato nel sistema 50.

Come illustrato in fig. 12, ciascun rilevatore 43 comprende una sorgente di luce 51, una prima lente 52, un sensore optoelettronico 53, un foro stenopeico 54 ed una seconda lente 55, disposti in successione e allineati verticalmente.

Dal punto di vista funzionale, quando le sonde fluorescenti 15 (figura 3) vengono illuminate da un primo fascio ottico B1generato dalla sorgente di luce 51, esse generano un secondo fascio ottico B2ad una lunghezza d’onda generalmente differente.

Quindi, i fasci ottici B1e B2si propagano lungo gli assi H dei rilevatori.

Il sensore optoelettronico 53, il foro stenopeico 54, e la seconda lente 55 possono essere formati all’interno di una medesima regione dielettrica 66 trasparente alle lunghezze d’onda utilizzate, per esempio ossido di silicio SiO2, in modo da definire un corpo monolitico. La seconda lente 55 può essere costituita da triossido di antimonio Sb2O3o da TiO2.

Una simulazione eseguita dalla richiedente mostra il guadagno ottenibile con l’utilizzo di nanogocce disposte in un multistrato. Nella simulazione, à ̈ stato utilizzato un micropozzetto 2 avente un raggio ed un’altezza di 0,5 mm, quindi un volume della camera di 393 nL, una bobina 34 con un diametro esterno di 0,5 mm, una regione ferromagnetica 33 con raggio di 0,087 mm. La simulazione à ̈ stata eseguita per gocce di 10 nm impostando una concentrazione di primer di 100 nM e ipotizzando un singolo primer per ciascuna nanogoccia 14; ciò determina una capacità di legame di 3000 primer/µm<2>di superficie di gocce. In caso di confinamento 2D, quindi in modo da avere un multistrato 22 di 1 µm di spessore ma nessun confinamento laterale, con gli stessi valori, vengono utilizzate gocce di 333 nm.

La simulazione ha fornito i risultati illustrati nella tabella I, in cui il guadagno di concentrazione Gcrappresenta il guadagno del rapporto sonde attivate/sonde non attivate nello strato di confinamento rispetto alle gocce disperse nella soluzione (nessun confinamento). L’elevato valore del guadagno di concentrazione Gcper il confinamento 3D dimostra che soltanto una frazione molto piccola di sonde libere à ̈ contenuta nello strato di confinamento 22. La tabella mostra anche il guadagno di ciclo Gcy(che indica la riduzione dei cicli per raggiungere i cicli di soglia) ottenibile con il confinamento 3D e 2D.

Tabella 1

Confinamento 3D Confinamento 2D Diametro gocce 10 nm 330 nm

Spessore strato 1 µm 1 µm

Guadagno Gc34868 986

Guadagno Gcy15,1 10,0

I vantaggi del presente metodo e del presente dispositivo risultano chiari da quanto precede. In particolare, si enfatizza il fatto che le forme di realizzazione descritte conseguono una RTQ-PCR molto rapida e sensibile, ben riproducibile e compatibile con una resa elevata. Il dispositivo può essere realizzato di dimensioni molto ridotte, dato che dipende principalmente dal numero di celle (contenitori) nella matrice, ciascun micropozzetto 2 essendo in grado di eseguire un’analisi rapida ed affidabile con volumi molto ridotti di soluzione, di pochi nanolitri. Grazie alle dimensioni ridotte, à ̈ anche possibile ottenere rampe termiche rapide, riducendo quindi ulteriormente il tempo per l’analisi; e il sistema può essere realizzato utilizzando la tecnologia di fabbricazione planare dei circuiti integrati e quindi condivide i suoi vantaggi di basso costo, elevata riproducibilità, elevata affidabilità e ridotte dimensioni.

Infine, risulta evidente che numerose variazioni e modifiche possono essere apportate a quanto descritto ed illustrato, il tutto rientrando nell’ambito di protezione dell’invenzione come definito dalle rivendicazioni allegate.

Per esempio, il micropozzetto 2 può presentare la propria parete di fondo e il magnete può essere formato in un corpo separato, comprendente il substrato 31 e lo strato dielettrico 32. Il corpo separato o la base può inserirsi sotto i pozzetti, portando quindi le bobine magnetiche nella posizione desiderata, al di sotto di ciascun pozzetto.

In aggiunta, se il ciclo di soglia CT à ̈ noto, il metodo può comprendere l’esecuzione di numerosi cicli di amplificazione senza lettura di fluorescenza e l’esecuzione della lettura soltanto quando ci si avvicina al ciclo di soglia CT.

Claims (15)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per il rilevamento quantitativo in tempo reale di sequenze di acido nucleico target di tipo singolo amplificate utilizzando una PCR in un micropozzetto (2), comprendente le fasi di: - introdurre nel micropozzetto un campione comprendente le sequenze di acido nucleico target, i primer magnetici e le sonde di marcatura; - eseguire uno o più cicli di amplificazione per formare ampliconi marcati; - attrarre i primer magnetici verso una superficie (4) attraverso un campo magnetico per formare un multistrato comprendente i prodotti di amplificazione marcati e primer magnetici liberi; e - rilevare i prodotti di amplificazione marcati nel multistrato con un metodo di lettura specifico per la superficie durante uno o più di detti cicli di amplificazione.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la fase di rilevare i prodotti di amplificazione marcati comprende utilizzare un dispositivo di lettura specifico per la superficie avente una risoluzione verticale e il multistrato ha uno spessore corrispondente alla risoluzione verticale del dispositivo di lettura specifico per la superficie.
3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la fase di rilevare i prodotti di amplificazione marcati comprende utilizzare un dispositivo di lettura specifico per la superficie avente un piano focale e la fase di rilevare i prodotti di amplificazione marcati comprende impostare il piano focale in una regione centrale del multistrato.
4. 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui la fase di introdurre primer magnetici comprende utilizzare primer fissati su gocce paramagnetiche aventi diametro inferiore a 50 nm.
5. 5. Metodo secondo la rivendicazione 4, in cui le gocce paramagnetiche sono singoli cristalli.
6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui le gocce paramagnetiche hanno diametro di al massimo 17 nm, preferibilmente nell'intervallo 5-10 nm.
7. 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui attrarre primer magnetici comprende confinare lateralmente i primer magnetici per ottenere un multistrato di prodotti di amplificazione marcati e primer magnetici liberi avente larghezza inferiore a quella della superficie.
8. 8. Metodo secondo la rivendicazione 7, in cui attrarre primer magnetici comprende eccitare un magnete che si estende lateralmente alla superficie ed avente larghezza inferiore alla superficie.
9. 9. Cella per eseguire il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, comprendente: - un micropozzetto (1) avente una superficie (4); - un dispositivo di lettura specifico per la superficie (42) avente un piano focale sulla superficie; - un generatore di campo magnetico (5) estendentesi adiacente alla superficie e configurato in modo da attrarre primer magnetici verso la superficie e generare un multistrato di primer magnetici.
10. 10. Cella secondo la rivendicazione 9, in cui il generatore di campo magnetico (5) ha larghezza inferiore rispetto alla superficie (4).
11. 11. Cella secondo la rivendicazione 9 o 10, in cui il dispositivo di lettura specifico per la superficie (42) Ã ̈ un obbiettivo confocale.
12. 12. Cella secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 11, in cui il micropozzetto (1) ha una parete di fondo (4) formante la superficie e alloggiante il generatore di campo magnetico (5).
13. 13. Cella secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 12, comprendente inoltre un substrato (31) di materiale semiconduttore ed uno strato dielettrico (32), lo strato elettromagnetico alloggiando una bobina (34) ed una regione ferromagnetica (33) circondata dalla bobina.
14. 14. Piastra multisaggio, comprendente un corpo formante una pluralità di pozzetti (2), ciascun pozzetto avendo pareti (3) ed una base (4) di larghezza W, ciascuna base (4) comprendendo una regione di nucleo (33) di materiale ferromagnetico ed avendo una bobina (34) di materiale conduttivo circondante la regione di nucleo e collegabile elettricamente ad un generatore di potenza (41), in cui la regione di nucleo ha una larghezza inferiore a W.
15. 15. Piastra multisaggio secondo la rivendicazione 14, in cui la base (4) comprende un substrato semiconduttore (31) ed uno strato dielettrico (32), lo strato dielettrico alloggiando la regione di nucleo (33) e la bobina (34).