CN102703601B - 多功能磁性荧光微球及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了多功能磁性荧光微球,包括磁性纳米材料、不同发射光谱特征的荧光材料、桥连DNA和标记有淬灭荧光基团的识别不同靶位点的生物探针,磁性纳米材料和荧光材料通过桥连DNA连接,桥连DNA含有限制性内切酶识别位点,生物探针偶联在所述荧光材料表面;还公开了多功能磁性荧光微球的制备方法,其制备方法简单,制得的多功能磁性荧光微球可以用于靶分子高分辨检测或靶细胞的富集,具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和细胞遗传学领域,特别涉及多功能磁性荧光微球及其制备方法和应用。
背景技术
磁性纳米材料具有超顺磁特点,使其取得了广泛的生物学应用,如可以用于核磁成像,生物靶分子的分离、富集,生物传感,靶向药物输送等各个领域。近年来,开始出现了将磁性纳米材料与荧光物质进行组装,从而形成具有磁性和荧光双功能的材料,利用磁性纳米材料超顺磁的特点和荧光物质在紫外激发下发射荧光的特点,从而能够高分辨的进行可视化药物靶向的输送和动态观测。
磁性纳米材料与荧光物质偶联的方法主要有:1)微球生长法:其是以Fe3O4 为核心,然后外面被覆一层荧光纳米材料,通过控制表面的被覆来进行双功能微球的组装。这种方法的缺点主要是由于Fe3O4核心的粒径太小,从而使得整个超顺磁的强度太低,用于生物分离效果太差,不适合进行可视化示踪。2)混合生长法:其是以SiO2为核心,表面被覆Fe3O4 和量子点的混合物,然后外表面再被覆一层聚合物,从而将磁性纳米材料和荧光物质聚合在一个有限的空间内形成一个双功能微球,该方法通过控制Fe3O4 和量子点的混合比例,可以制成不同磁性和不同荧光强度的微球;然而该方法的主要缺点是表面被覆的Fe3O4和量子点的比例难以精确控制,从而其发光强度和磁性强度不易准确定量。3)多孔组装法:该方法采用SiO2为核心,利用其多孔的结构,从而将Fe3O4 和量子点按一定比例进行装载,使其进入SiO2的多孔内形成双功能微球。该方法的最大缺陷是由于SiO2的孔径是有限的,这样就限制了Fe3O4和量子点的大小。上述方法构建的具有磁性和荧光双功能的复合物是利用共价键将磁性纳米材料和荧光物质共价偶联,故其结合力较强,因此在进行生物学样本分离富集后不能将磁性纳米材料和荧光物质分离。由于生物学样本的基质具有复杂性,磁性微球对血液中的各种白蛋白,IgG等具有非特异性吸附,而这些非特异性吸附的蛋白分子会对的荧光检测造成极大的影响,从而引起假阳性或者假阴性结果的产生。
为了提高检测灵敏度和特异性,急需一种将生物学样本分离富集后能够将磁性纳米材料与荧光物质分离的多功能磁性荧光微球。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供多功能磁性荧光微球,检测灵敏度高和特异性好,富集后可以用限制性内切酶,将磁性纳米材料与荧光物质之间的连接切断,用外加磁场分离去除磁性纳米材料,能够避免因磁性纳米材料对检测样本中蛋白质和核酸分子的非特异吸附而影响检测结果。
为实现上述目的,技术方案为:
多功能磁性荧光微球,所述多功能磁性荧光微球包括磁性纳米材料、不同发射光谱特征的荧光材料、桥连DNA和标记有淬灭荧光基团的识别不同靶位点的生物探针,所述磁性纳米材料和荧光材料通过桥连DNA连接,所述桥连DNA含有限制性内切酶识别位点,所述生物探针偶联在所述荧光材料表面。
进一步,所述多功能磁性荧光微球是由桥连DNA一端标记的生物素与磁性纳米材料表面标记的链霉亲和素偶联,所述桥连DNA另一端通过末端标记的氨基与表面修饰有羧基的荧光材料偶联,所述荧光材料表面修饰的羧基偶联有至少一种生物探针。
本发明中可以在荧光材料表面同时偶联多种生物探针,可以在同一检测体系中同时实现多个靶位点的检测,加快了检测速度,同时能够降低检测成本。其中荧光材料优选为量子点,最优为CdTe量子点。
本发明中,磁性纳米材料优选铁系氧化物,更优选为四氧化三铁。
进一步,所述生物探针为分子信标或/和叶酸。
进一步,所述分子信标为识别至少一个靶位点的不同序列的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针一端分别标记有最大发射波长间隔大于30nm的荧光材料,另一端标记淬灭荧光基团。
本发明中可以同时用不同发射光谱特征的荧光材料分别标记生物探针,根据检测颜色用于判断检测结果,为了防止荧光材料之间的相互干扰,选择最大发射波长间隔大于30nm的荧光材料进行标记,更优选为最大发射波长间隔40nm。
进一步,所述寡核苷酸探针为识别HBV基因型B、HBV基因型C和HBV基因型D的探针;所述识别HBV基因型B的探针如5'-NH2-cgtccgtcgcagtcccaaatctccacggacg-BHQ2-3'所示,所述识别HBV基因型C的探针如5'-NH2-cgtccgcctctacttccaggaacatcaaccggacg-BHQ2-3'所示;所述识别HBV基因型D的核苷酸序列如5'-NH2- cgtccgcatcatccatataactgaaagccaaacagtgcggacg-BHQ2-3'所示。
进一步,所述桥连DNA长度为10-40bps。
进一步,所述桥连DNA长度为20bps。
本发明使用的生物探针包括适配子、分子信标、单链结合蛋白、肽核酸(PNA),DNA探针、单克隆抗体和叶酸。
本发明目的之二在于提供多功能磁性荧光微球的制备方法,该制备方法简单,能够使生物探针均匀分布在磁性微球表面,技术方案为:
所述的多功能磁性荧光微球的制备方法,具体步骤如下:
a、制备磁性纳米材料,然后与桥连ssDNA偶联,制得桥连ssDNA标记的磁性纳米材料,所述桥连ssDNA含有限制性内切酶识别位点;
b、取不同发射光谱特征的荧光材料,然后分别与桥连ssDNA的互补序列ssDNA’和标记有淬灭荧光基团的识别不同靶位点的生物探针偶联,得ssDNA'和生物探针同步标记的荧光材料;
c、将步骤a所得桥连ssDNA标记的磁性纳米材料和步骤b所得ssDNA'和生物探针同步标记的荧光材料混合进行杂交,经磁性富集,得多功能荧光微性微球。
进一步,所述步骤a是将磁性纳米材料表面偶联链霉亲和素,然后与5’端标记生物素的桥连ssDNA偶联;
所述步骤b是将荧光材料的表面进行羧基修饰,然后与氨基标记的与所述桥连ssDNA互补的序列ssDNA'和氨基标记的生物探针偶联。
本发明目的之三在于提供磁性荧光多功能微球复合体的应用,技术方案为:
所述多功能磁性荧光微球在靶分子检测或靶细胞富集中的应用。
本发明有益效果在于:本发明公开的多功能磁性荧光微球,在磁性纳米材料与荧光材料之间通过一段含有限制性内切酶识别位点的双链DNA偶联,因此可以用限制性内切酶分离磁性纳米材料,然后进行检测,能够消除因磁性纳米材料对样本中的生物分子非特异吸附造成的假阳性或者磁性纳米材料对荧光材料的荧光淬灭造成的假阴性结果;并且可以通过在荧光材料表面标记识别不同靶序列的生物探针,因此可以同时检测多个指标,节约了检测成本,同时检测范围广;还公开了多功能磁性荧光微球的制备方法,该制备方法简单,制得的多功能磁性荧光微球含有多种生物探针,能够特异受体结合,例如,可以同时HBV基因型B、C和D的DNA;或用于肿瘤细胞的靶向富集,并且在富集后对肿瘤细胞具有杀伤力,具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明多功能磁性荧光微球检测原理示意图。
图2为本发明多功能磁性荧光微球酶切前后荧光强度结果图。
图3为本发明不匹配的DNA分子导致的荧光增强效应结果图(从左至右分别为完全匹配,单碱基不匹配,双碱基不匹配,3碱基不匹配、5碱基不匹配和10碱基不匹配)。
图4为本发明多功能磁性荧光微球在浓度分别为10-1nM,101nM,102nM,1031nM,1041nM,1051nM和106nM条件下检测荧光强度绘制的标准曲线。
图5为本发明多功能磁性荧光微球同步检测乙型肝炎B、C和D基因型结果图。
图6为本发明多功能磁性荧光微球富集肿瘤细胞后分别在培养0分钟、50分钟、100分钟、150分钟、200分钟和250分钟后的存活率。
图7为本发明不同浓度的多功能磁性荧光微球对细胞浓度为107个/mL的细胞悬液富集后的存活率(浓度分别为1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL和1000μg/mL)。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件。
本发明使用的量子点主要包括单核量子点(如CdS、CdSe、CdTe等)和核壳结构的量子点(如CdS/ZnO、CdSe/ZnS、CdTe/CdS等)。核壳结构的量子点是在一种材料如CdSe的外部包覆另一种具有较大能带隙的材料(如CdS、ZnS等)所构成的量子点,其光学特性由内核决定,外壳具有明显的提高量子产率和增强光化学稳定性的作用。此外,还通过量子点的大小来获得具有不同发射光谱特征的荧光材料。
实施例1、单色荧光探针的标记
一、超顺磁微球的功能化
磁性纳米材料的制备:准确称取3.18g的 FeCl3(摩尔质量为0.0196mol)和2.72g的FeSO4(摩尔质量为0.0098 mol )的置于500mL三颈烧瓶中,加入200mL 去离子水,充分溶解,通入高纯氩气并搅拌,将氩气气氛升温至80℃,以去除水中的氧气;然后加入4mL质量分数为25%的氨水,再逐滴加入2mL的油酸,温度升至96℃反应0.5小时,然后再转速为1000转/分钟条件下,乳化20分钟形成乳液,缓慢加入NaOH溶液,并搅拌1小时,再滴加10mL无水乙醇,然后搅拌5分钟,冷却到25℃时停止通氩气,依次用双蒸水、无水乙醇洗涤至中性,然后于温度为80℃条件下真空干燥6小时,得到粒径约为8nm黑色粉末状物质,即油酸包覆的脂溶性磁性纳米材料(MP)。
聚苯乙烯磁性纳米材料的制备:(1)取0.8g制得的油酸包覆的脂溶性磁性纳米材料(MP),然后加入苯乙烯20mL、丙烯酸0.4 mL和对二乙烯基苯1 mL,超声处理10分钟,充分混匀后加入0.1g偶氮二异丁腈,搅拌使其充分溶解,得棕黑色混合液,即聚苯乙烯磁性纳米材料,备用;(2)取0.8g聚乙烯吡咯烷酮和200 mL无水乙醇加入三颈烧瓶中,充分搅拌使其溶解后,然后通入高纯氩气,将氩气气氛升温至70℃,加入制得的聚苯乙烯磁性纳米材料,在温度为70℃条件下反应24小时,在转速为1500转/分钟条件下离心10分钟,收集沉淀,然后用1mol/L的盐酸侵泡24小时,洗涤至中性;洗涤后在温度为25℃条件真空干燥;最后用磁力架分离,得分离的聚苯乙烯磁性纳米材料(MM)。
聚苯乙烯磁性纳米材料表面偶联链霉亲和素:在浓度为10mmol/L、pH 6.0的NaH2PO4缓冲液中,加入0.6mg聚苯乙烯磁性微球在磁场作用下洗涤,然后将洗涤后的聚苯乙烯磁性纳米材料溶于3mL浓度为10mmol/L、pH 6.0的NaH2PO4缓冲液中,然后加入30mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和18mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),并调节pH至7.1,混匀后在温度为25℃条件下振荡15分钟,充分混匀并避免聚苯乙烯磁性纳米材料沉淀;然后在磁场下先用浓度为2mmol/L的盐酸(HCl)溶液洗涤,再用浓度为20mmol/L、pH7.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液重悬,向重悬液中加入0.12mg的链霉亲和素,混匀,在25℃条件下振荡2小时,然后在磁场下用浓度为20mmol/L、pH7.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液洗涤聚苯乙烯磁性纳米材料,最后重悬在4 mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,得链霉亲和素标记的磁性纳米材料(SA-MM)。
桥连ssDNA标记的磁性纳米材料(ssDNA-MM)的制备:取1 mL链霉亲和素标记的磁性纳米材料(SA-MM) 分别加入4个含5 mL PBS 缓冲液的试管中,然后分别加入5’端用生物素标记的桥连ssDNA,桥连ssDNA长度分别为10 bp、20 bp、30 bp和40 bp,桥连ssDNA序列如表1所示。然后在搅拌条件下反应2小时,使ssDNA 5’端的生物素与磁性微球表面偶联的链霉亲和素连接,用磁性富集法富集、分离磁性纳米材料,并用PBS缓冲液清洗3次以去除磁性纳米材料表面过量的非特异性结合的桥连ssDNA,将清洗的磁性纳米材料加入到2mL PBS缓冲液中,再加入200μL体积分数为0.05%的BSA溶液,封闭磁性纳米材料表面未完全偶联的剩余的活化位点。封闭后,用磁性富集法收集磁性纳米材料,再用PBS缓冲液清洗3次,得桥连ssDNA标记的磁性纳米材料(ssDNA-MM),保存于4℃条件下,备用。
表1. 桥连ssDNA核苷酸序列
名称 | 序列 | Tm | 长度 |
ssDNA 1 | 5’-Biotin-cccagctgccc-3’( PvuII识别序列cagctg) | 46.0 | 10bp |
ssDNA 2 | 5’-Biotin-gggcagctggggcgggcggg-3’ | 75.1 | 20bp |
ssDNA 3 | 5’-Biotin-tgacgggcggggtgtacaacagctgagtat-3’ | 70.8 | 30bp |
ssDNA 4 | 5’-Biotin-tgacgggcggggtgtacaacagctgtgcctggaatcacccg-3’ | 79.8 | 40bp |
ssDNA 1' | 5’- NH2-gggcagctggg -3’ | 46.0 | 10bp |
ssDNA 2' | 5’- NH2-cccgcccgccccagctgccc -3’ | 75.1 | 20bp |
ssDNA 3' | 5’- NH2-atactcagctgttgtacaccccgcccgtca -3’ | 70.8 | 30bp |
ssDNA 4' | 5’- NH2-cgggtgattccaggcacagctgttgtacaccccgcccgtca -3’ | 79.8 | 40bp |
二、荧光材料
准确取10 mL 油溶性CdTe量子点,加入20 mL巯基乙酸(MAA),在反应皿中搅拌反应6小时,然后在转速为20000rpm、离心20分钟,弃去上清液,将沉淀溶于5mL 氯仿中,并在20000rpm、离心20分钟,重复此过程3遍以去除多余未反应的巯基乙酸(MAA)。将沉淀烘至微干,然后加入PBS缓冲液(pH8.0),充分混匀后得巯基乙酸标记的量子点溶液,即羧基标记的水溶性量子点溶液。
分别配制浓度为50nM的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和50nM 的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液,然后将巯基乙酸标记的量子点溶液加入到浓度为2mM EDC和5mM NHS混合溶液中,在搅拌情况下反应5小时,待其反应完全后通过超滤去除未偶联的剩余EDC和NHS。将超滤产物用PBS缓冲液清洗3遍得到EDC活化的量子点,即在量子点表面标记有羧基(-COOH),保存于4℃条件下备用。
设计分子信标(MB),并在5’端氨基(-NH2)标记,3’端用BHQ-2标记,具体为5'-NH2-cgtccgctttagggcatggacattgacggacg-BHQ2-3',其中划线部分为茎环结构,由于BHQ-2在550nm-650nm范围内具有极强的荧光淬灭效果,因此用BHQ-2染料标记可以同时淬灭多种荧光染料的荧光。从而精简了实验试剂,减少了不同发射光谱特征淬灭基团造成的荧光干扰。同时将表1所示的5’端用-NH2标记的桥连ssDNA1互补序列(ssDNA1’)、桥连ssDNA2互补序列(ssDNA2’)、桥连ssDNA3互补序列(ssDNA3’)和桥连ssDNA4互补序列(ssDNA4’)分别与分子信标按1:10的摩尔比混合,混合后使桥连ssDNA互补序列(ssDNA’)终浓度为100μM,分子信标终浓度为1mM,然后取上述混合液1mL加入到经过EDC活化的量子点中,在搅拌情况下反应12小时,具体反应为通过分子信标5’端-NH2与量子点表面的-COOH缩合反应,形成酰胺键,从而形成量子点、分子信标和ssDNA’偶联成复合物。待其反应完全后通过超滤去除未偶联的剩余分子信标分子,然后加入体积分数为0.05% 的BSA,从而封闭未完全偶联的剩余的活化位点。将超滤产物用PBS清洗3遍得到纯化的偶联有分子信标和ssDNA’的量子点,简称为ssDNA'-QD-MB复合物,保存于4℃条件下备用。
此步骤也可以用如下步骤代替:首先用无菌双蒸水配制1mM的分子信标溶液,然后取100μL 1mM的分子信标溶液,加入表面标记有-COOH的量子点,在搅拌情况下反应12小时,反应后通过超滤去除未偶联的分子信标。然后将超滤产物加入200μL 1mM 5’端-NH2标记的桥连ssDNA互补序列(ssDNA'),从而使量子点表面的-COOH与ssDNA' 5’端的-NH2基缩合反应,得ssDNA'-QD-MB复合物。
三、多功能磁性微球的自组装
取上述桥连ssDNA标记的磁性纳米材料(ssDNA-MM)溶于1 mL PBS缓冲液中至终浓度为1M,然后加入浓度为30M的ssDNA'-QD-MB复合物1mL,在温度为25℃条件下搅拌反应2小时,使磁性纳米材料偶联的桥连ssDNA与ssDNA'-QD-MB复合物的ssDNA'杂交,得到桥连DNA(即双链DNA)偶联的多功能磁性荧光微球 (MM-DNA-QD-MB),通过磁性富集的方法富集、分离磁性纳米材料,富集后采用PBS清洗3次以去除磁性纳米材料表面过量的未偶联的ssDNA'-QD-MB复合物,保存于4℃条件下,备用。
四、检测多功能磁性微球及其条件优化
为了验证桥连DNA成功偶联,利用桥连ssDNA序列的两个功能,其一内部含有限制性内切酶识别位点,本实施例以PvuII识别位点为例,也可以为其他酶切位点;其二酶切后与量子点连接一端可以作为PCR扩增的上游引物。取上述ssDNA2为桥连ssDNA,ssDNA2’为桥连ssDNA互补序列制备的多功能磁性荧光微球(MM-DNA-QD-MB)2mL,然后用含浓度为0.1M Tris-HCl和质量分数为0.05% Tween-20的清洗液清洗3次,然后加入0.5μL 的50000 unit/mL的限制性内切酶PvuII溶液,酶切20分钟。再用磁铁将磁富集后,在温度为95℃加热5分钟将双链解开,再次去除磁性纳米材料,以桥连ssDNA中的序列5’-ttgtacaccccgcccg-3’ (SEQ ID NO.1)为上游引物,并设计下游引物,序列为5’-tcaccccaatcatttgtccc-3’ (SEQ ID NO.2),进行PCR扩增,用于扩增金黄色葡萄球菌16s rRNA,PCR条件为95.0℃预变性5分钟;95.0℃变性30秒,55.0℃退火30秒,72℃延伸1分钟,36个循环;然后72℃后延伸4分钟后于4.0℃保存,经琼脂糖凝胶电泳,其扩增产物为103bp,经测序表明,PCR扩增产物的序列为:5’-tgtacaccccgcccgtcaccccccgagagtttgtaacccccgaagccggtggagtaaccttttaggaaccagccgtctaaggtgggacaaatgattggggtga-3’ (SEQ ID NO.3)。扩增产物的出现证明了磁性纳米材料上面成功偶联了ssDNA,并且有效进行了酶切。
PBS缓冲液pH的优化:量子点的荧光强度是呈pH依赖性的,在酸性条件下,荧光强度要远低于碱性条件。按照上述方法,研究Tris-HCl 缓冲液的pH值对完全匹配DNA杂交效率的影响。具体方法同上,不同之处在于,杂交时Tris-HCl 缓冲液的pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的杂交液进行杂交实验,结果显示发现当pH为8和9时,其杂交产物的荧光强度最强,其杂交效率最高。同时研究Tris-Hcl缓冲液pH对量子点荧光淬灭的影响,分别研究了pH分别为6、7、8、9、10和11条件下的荧光强度,结果表明在pH为11时,其荧光强度最强,随着pH的降低依次减弱,本发明选择pH为9的条件下进行杂交和检测荧光强度。
用上述由表1中制备的桥连DNA长度分别为10bp,20bp,30bp,40bp的多功能磁性荧光微球,分别测试不同长度的桥连DNA对多功能磁性荧光微球杂交性能的影响。以与分子信标茎环结构的互补序列(5’-tcaatgtccatgccctaaag-3’ SEQ ID NO.4)进行杂交反应。结果表明,桥连DNA长度为10bp时,其杂交效率极为低下,其原因可能是由于磁性纳米材料和荧光材料之间的空间位阻较大,阻碍了其杂交;也可能是磁性纳米材料与量子点间位置较近,而产生了较为明显的荧光吸收。桥连DNA长度为20bp时,杂交效率最高,故本发明优选表1中ssDNA2和ssDNA2’为桥连DNA。
五、多功能磁性荧光微球用于核酸检测
取1 mL 1M的多功能磁性荧光微球 (MM-DNA-QD-MB),加入5 mL pH为9的PBS缓冲液中,然后分别加入1mL 1M的SEQ ID NO.4所示序列(与分子信标茎环结构的序列完全互补),杂交1小时,通过磁性富集的方法富集、分离杂交复合体。将复合体用PBS缓冲液清洗3次以去除磁性纳米材料表面非特异结合的靶分子DNA。由于完全互补的靶分子能够与分子信标中的茎环部分互补结合,从而打开发夹结构,使供体基团和受体基团分开,其距离超过有效荧光共振能量转移(FRET)距离,从而使受体基团无法淬灭供体荧光,使荧光呈现,其原理如图1所示。又由于磁性纳米材料具有较强的荧光吸收作用,故将分离的杂交复合体溶于100μL 酶切缓冲液(含50 mM醋酸钾,20 mM Tris-醋酸,10 mM醋酸镁,1 mM 二硫苏糖醇,pH 7.9 )中,并用荧光光谱检测(970crt型荧光分光光度计)荧光强度;再加入0.5μL 浓度为50000 unit/mL的PvuII限制性内切酶,酶切20分钟之后,利用外加磁场去除体系中的磁性纳米材料,再检测荧光强度,结果如图2所示。结果显示酶切后,在最大吸收波长处荧光强度更强,能提高检测的精度。
六、碱基识别能力检测
以5'-NH2-cgtccgtcgcagtcccaaatctccacggacg-BHQ2-3'序列为分子信标,同时设计与该分子信标的环序列完全互补、单碱基不匹配、双碱基不匹配、3碱基不匹配、5碱基不匹配和10碱基不匹配的序列,具体序列如表2所示,划线序列为不匹配序列,按照上述方法制备含SEQ ID NO.13所示分子信标的多功能磁性荧光微球,然后分别与完全互补、单碱基不匹配、双碱基不匹配、三碱基不匹配、5碱基不匹配的序列进行杂交反应,反应完成后酶切、富集去除磁性纳米材料后进行荧光检测,记录由不匹配碱基的DNA分子导致的荧光增强效应,结果如图3所示。结果显示观察到完全匹配的荧光强度为5.5×105a.u.,而单碱基不匹配的荧光强度为2×105a.u.,双碱基不匹配、3碱基不匹配、3碱基不匹配和10碱基不匹配的荧光强度较低。因此,运用此方法根据荧光强度,可以检测出单碱基不匹配。
表2、多色分子信标探针
名称 | 序列 |
分子信标 | 5'-NH2-cgtccgtcgcagtcccaaatctccacggacg-BHQ2-3' |
完全匹配序列 | 5'-tggagatttgggactgcga-3' (SEQ ID NO.5) |
单碱基不匹配 | 5'-tggagattt a ggactgcga-3' (SEQ ID NO.6) |
双个碱基不匹配 | 5'-tggagattt aa gactgcga-3' (SEQ ID NO.7) |
3个碱基不匹配 | 5'-tggagattt aat actgcga-3' (SEQ ID NO.8) |
5个碱基不匹配 | 5'-tggagatt gaaat ctgcga-3' (SEQ ID NO.9) |
10个碱基不匹配 | 5'-tgga ggcggaaatt tgcga-3' (SEQ ID NO.10) |
七、检测线性和灵敏度
依次将与分子信标茎环结构完全互补的序列依次稀释到10-1nM,101nM,102nM,1031nM,1041nM,1051nM和106nM 的浓度,分别取200μL加入到1mL杂交液中,反应2小时,然后采用上述检测方法富集杂交复合体,经过3次清洗后加入2μL限制性酶PvuII,酶切20分钟并去除磁性纳米材料,最后将上清液溶于300μL Tris-HCl缓冲液中进行荧光强度测量。根据测量结果绘制标准曲线,如图4所示,再根据最低稀释倍数重复3次检测CV<5%为最低线性区间。用PBS缓冲液替换分子信标茎环结构完全互补加入反应体系中,进行荧光强度检测,得到空白对照荧光强度。连续测试20个空白对照荧光强度,以其均值加上3倍标准差作为该方法的最低检出限。根据计算,其最低检出限为0.02nM。其有效工作区间为0.1nM-1mM。此工作区间达到107。
实施例2、
一、三色荧光探针的标记
设计HBV(乙肝病毒)基因型B、HBV基因型C和HBV基因型D的特异识别序列,分别为识别HBV基因型B的核苷酸序列为5'-cgtccgtcgcagtcccaaatctccacggacg-3'(SEQ ID NO.11),识别HBV基因型C的核苷酸序列为5'-cgtccgcctctacttccaggaacatcaaccggacg-3'(SEQ ID NO.12),识别HBV基因型D的核苷酸序列为5'- cgtccgcatcatccatataactgaaagccaaacagtgcggacg-3'(SEQ ID NO.13),并分别在识别序列的5’端用三种核心直径不同的CdSe/ZnS量子点,其最大发射波长分别为540nm,580nm和630nm的CdSe/ZnS量子点标记识,识别序列的3’端标记淬灭荧光基团,分别命名为HBV-B、HBV-C和HBV-D,具体如表3所示。按照实施例1的制备方法制备多功能磁性荧光微球,并在制备过程中将标记了三种发射波长的分子信标采用等摩尔浓度混合,混合后使每种分子信标终浓度为100mM,然后与浓度为1mM的 5’端标记-NH2的ssDNA’偶联,并选择能够同时淬灭三种量子点的荧光淬灭基团BHQ-2。由于在制备过程中采用等摩尔浓度偶联,并且其偶联效率相同,使三种不同探针能够均匀分布。制备完成后,采用上面的方法进行洗涤并最后保存于4℃的PBS缓冲液中备用。
表3、多色分子信标探针
名称 | 序列 | 最大发射波长 |
HBV-B | 5'-NH2-cgtccgtcgcagtcccaaatctccacggacg-BHQ2-3' | 540nm |
HBV-C | 5'-NH2-cgtccgcctctacttccaggaacatcaaccggacg-BHQ2-3' | 580nm |
HBV-D | 5'-NH2- cgtccgcatcatccatataactgaaagccaaacagtgcggacg –BHQ2-3' | 630nm |
HBV-B’ | 5'-tggagatttgggactgcga-3'(SEQ ID NO.14) | |
HBV-C’ | 5'-gttgatgttcctggaagtagagg-3'(SEQ ID NO.15) | |
HBV-D’ | 5'-cactgtttggctttcagttatatggatgatg-3'(SEQ ID NO.16) |
二、混合靶分子的检测
将浓度为1mmol/L的HBV-B、HBV-C 和HBV-D 的茎环结构的互补链HBV-B’、HBV-C’ 和HBV-D’等体积混合,具体序列如表3所示,得到HBV三种基因型的混合DNA片段,以此构建肝炎病毒混合感染的模型。按照实施例1的方法,取1mL 1M的三种颜色的多功能磁性荧光微球,加入5mL pH为9的PBS缓冲液,然后加入1mL上述HBV三种基因型的混合DNA片段,杂交1小时,通过磁性富集方法富集、分离杂交复合体。将杂交复合体经过PvuII酶切消化后,在480nm的激发光下进行荧光强度测量,结果如图5所示。由图5可知,在最大发射波长为540nm,580nm和630nm处能够检测到荧光,表明三色量子点标记的多功能磁性荧光微球可以时检测乙型肝炎不同基因型。
实施例3、磁性荧光多功能微球复合体用于肿瘤细胞的靶向富集
由于肿瘤细胞表面常会表达过量的叶酸受体,因此可以利用叶酸来区分肿瘤细胞和普通正常细胞,并利用磁性纳米材料进行特异性肿瘤细胞的分离和富集。
制备叶酸标记的多功能磁性纳米材料:制备方法同实施例1,不同之处在于将分子信标改为叶酸。由于叶酸表面同时具有羧基和氨基,因此将叶酸与量子点偶联可以采用缩合反应进行。首先采用巯基乙酸取代油性量子点表面的TOPO位点,从而形成具有水溶性的量子点,此过程同实施例1中的量子点表面修饰。然后采用EDC 和NHS对量子点表面功能化,加入叶酸后通过叶酸表面的-NH2与表面标记有-COOH的量子点缩合反应,反应2小时,实现叶酸与量子点的偶联。然后加入10mL 1mM的桥连ssDNA,再继续反应2小时,从而实现桥连ssDNA互补序列和叶酸在量子点表面同步偶联。偶联完成后,采用超滤去除未反应的过量桥连ssDNA和叶酸。经过三次PBS缓冲液洗涤后,得到的叶酸标记的量子点并保存于4℃,备用。叶酸标记的量子点与桥连ssDNA标记的磁性微球在37℃的杂交缓冲液,杂交2小时,得多功能磁性荧光微球,然后经过磁性富集、分离得到高纯度的多功能磁性荧光微球,将该多功能磁性荧光微球溶于1mL PBS缓冲液中保存于4℃,备用。
肿瘤细胞的靶向富集:运用常规的体外培养方法进行HeLa细胞和正常上皮细胞的培养,具体方法如下:取对数生长期的HeLa细胞和正常上皮细胞。每个35mm培养皿中加入2mL胰蛋白酶,放置于37℃细胞培养箱中消化5分钟,然后加入RP1640培养液5mL后用枪头进行吹打,然后将细胞悬液转移至离心管中,在1000rpm条件下离心5分钟,去除上清液后得到聚集的细胞,将收集的细胞中再次加入5mL培养液,并用1mL枪头进行吹打,从而使聚集的细胞均匀分散于整个悬液中。利用白细胞计数器进行HeLa细胞和上皮细胞的计数。最后将细胞均稀释至107个/mL。取上述浓度的细胞悬液各1mL,加入前面准备好的1mL 1mM的磁性荧光多功能微球复合体。在37℃条件下反应1小时,待叶酸与细胞表面的叶酸受体紧密结合后,用外加磁场对磁性纳米材料进行分离和富集。由于HeLa细胞表面富含大量的叶酸受体,因此能够被磁性纳米材料富集,从而聚集在磁性纳米材料的周围。而上皮细胞表面没有叶酸受体,故无法与磁性纳米材料富集,通过此方法可以对肿瘤细胞进行选择性富集。
分离出来的HeLa细胞至于强磁场中静置1小时,然后加入2mL的酶切缓冲液和1μL的PvuII高保真限制性外切酶。反应20分钟后通过磁铁去除磁性纳米材料,体系中剩下高浓度的量子点和HeLa细胞。在37℃条件下培养5小时,分别在培养0分钟、50分钟、100分钟、150分钟、200分钟和250分钟样品取样品,然后运用CAM/EthD-1死活分析双染试剂盒观察HeLa细胞的存活率。结果如图6所示,结果表明随着孵育时间的延长,细胞的存活率呈现出指数级的下降趋势,在3小时内杀伤106个HeLa细胞,其原因可能与由叶酸-叶酸受体介导的HeLa细胞的胞吞作用有关。采用与上述相同的方法富集HeLa细胞,不同之处在于分别用1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL和1000μg/mL的磁性荧光多功能微球复合体对细胞浓度为107个/mL的细胞悬液进行富集,分离出来的HeLa细胞至于强磁场中静置1小时,然后加入1μL的PvuII高保真限制性外切酶。反应20分钟后通过磁铁去除磁性纳米材料,体系中剩下高浓度的量子点和HeLa细胞。在37℃条件下培养5小时,然后运用CAM/EthD-1死活分析双染试剂盒观察HeLa细胞的存活率,结果如图7所示。结果显示,不同磁性荧光多功能微球复合体的浓度对HeLa细胞的杀伤强度不同,其杀伤趋势呈浓度依赖性,更高的量子点浓度具有更强的细胞毒性,而经过表面功能化的量子点对于正常细胞的毒性极其微小。
本发明中桥连DNA中的限制性酶切位点为PvuII,还可以根据设计的靶序列选择为其他任意酶切位点均可以实施,例如:限制性核酸内切酶 BstEⅡ、限制性核酸内切酶 Nar I、限制性核酸内切酶 Not I、限制性核酸内切酶 Nco I、限制性核酸内切酶 BglⅠ、限制性核酸内切酶 RsaⅠ、限制性核酸内切酶 Nci I、限制性核酸内切酶 Sca I、限制性核酸内切酶 Sty I、限制性核酸内切酶 EcoRⅠ、限制性核酸内切酶Spe I 、限制性核酸内切酶 Alu Ⅰ、限制性核酸内切酶 AvaⅡ、限制性核酸内切酶 BalⅠ、限制性核酸内切酶 Bam HⅠ、限制性核酸内切酶 BclⅠ、限制性核酸内切酶 BglⅡ、限制性核酸内切酶 EcoRⅡ、限制性核酸内切酶 HaeⅡ、限制性核酸内切酶 HaeⅢ、限制性核酸内切酶 HhaⅠ、限制性核酸内切酶 HindⅢ、限制性核酸内切酶 HinfⅠ、限制性核酸内切酶 HpaⅠ、限制性核酸内切酶 KpnⅠ、限制性核酸内切酶 MboⅡ、限制性核酸内切酶 PstⅠ、限制性核酸内切酶 SacⅠ、限制性核酸内切酶 SacⅡ等的酶切位点。
本发明中生物探针除了可以为实施例中的分子信标和叶酸外还可以为其他生物探针,根据检测物的特点可以选择适配子、适配子信标、单链结合蛋白、肽核酸、DNA探针和单克隆抗体等。
本发明中荧光基团以量子点为例,也可以为其他荧光基团,例如:FITC、罗丹明6G、FAM等荧光基团中的一种或多种同时使用。
本发明中淬灭荧光基团以BHQ-2为例、还可以为其他淬灭荧光基团,例如BHQ-1、BHQ-3、苯甲酸(DABCYL)、6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)中的一种或多种组合。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
<110> 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
<120> 多功能磁性荧光微球及其制备方法和应用
<160> 16
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物
<400> 1
ttgtacaccc cgcccg 16
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物
<400> 2
tcaccccaat catttgtccc 20
<210> 3
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增产物
<400> 3
tgtacacccc gcccgtcacc ccccgagagt ttgtaacccc cgaagccggt ggagtaacct 60
tttaggaacc agccgtctaa ggtgggacaa atgattgggg tga 103
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 分子信标茎环结构的互补序列
<400> 4
tcaatgtcca tgccctaaag 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 完全匹配序列
<400> 5
tggagatttg ggactgcga 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单碱基不匹配
<400> 6
tggagattt aggactgcga 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 双碱基不匹配
<400> 7
tggagattta agactgcga 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3碱基不匹配
<400> 8
tggagattta atactgcga 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5碱基不匹配
<400> 9
tggagattga aatctgcga 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 10碱基不匹配
<400> 10
tggaggcgga aattagcga 19
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 识别HBV基因型B的核苷酸序列
<400> 11
cgtccgtcgc agtcccaaat ctccacggac g 31
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 识别HBV基因型C的核苷酸序列
<400> 12
cgtccgcctc tacttccagg aacatcaacc ggacg 35
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 识别HBV基因型D的核苷酸序列
<400> 13
cgtccgcatc atccatataa ctgaaagcca aacagtgcgg acg 43
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV-B互补链
<400> 14
Tggagatttg ggactgcga 19
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV-C互补链
<400> 15
gttgatgttc ctggaagtag agg 23
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBV-D互补链
<400> 16
cactgtttgg ctttcagtta tatggatgat g 31
Claims (9)
1.多功能磁性荧光微球,其特征在于:所述多功能磁性荧光微球包括磁性纳米材料、不同发射光谱特征的荧光材料、桥连DNA和标记有淬灭荧光基团的识别不同靶位点的生物探针,所述磁性纳米材料和荧光材料通过桥连DNA连接,所述桥连DNA含有限制性内切酶识别位点,所述生物探针偶联在所述荧光材料表面。
2.根据权利要求1所述的多功能磁性荧光微球,其特征在于:所述多功能磁性荧光微球是由桥连DNA一端标记的生物素与磁性纳米材料表面标记的链霉亲和素偶联,所述桥连DNA另一端通过末端标记的氨基与表面修饰有羧基的荧光材料偶联,所述荧光材料表面修饰的羧基偶联有至少一种生物探针。
3.根据权利要求1或2所述的多功能磁性荧光微球,其特征在于:所述生物探针为分子信标或/和叶酸。
4.根据权利要求1所述的多功能磁性荧光微球,其特征在于:所述分子信标为识别至少一个靶位点的不同序列的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针一端分别标记有最大发射波长间隔大于30nm的荧光材料,另一端标记淬灭荧光基团。
5.根据权利要求4所述的多功能磁性荧光微球,其特征在于:所述寡核苷酸探针为识别HBV基因型B、HBV基因型C和HBV基因型D的探针;所述识别HBV基因型B的探针如5'-NH2-cgtccgtcgcagtcccaaatctccacggacg-BHQ2-3'所示,所述识别HBV基因型C的探针如5'-NH2-cgtccgcctctacttccaggaacatcaaccggacg-BHQ2-3'所示;所述识别HBV基因型D的核苷酸序列如5'-NH2- cgtccgcatcatccatataactgaaagccaaacagtgcggacg-BHQ2-3'所示。
6.根据权利要求1或2所述的多功能磁性荧光微球,其特征在于:所述桥连DNA长度为10-40bps。
7.根据权利要求6所述的多功能磁性荧光微球,其特征在于:所述桥连DNA长度为20bps。
8.权利要求1-7任一项所述的多功能磁性荧光微球的制备方法,其特征在于:具体步骤如下:
a、制备磁性纳米材料,然后与桥连ssDNA偶联,制得桥连ssDNA标记的磁性纳米材料,所述桥连ssDNA含有限制性内切酶识别位点;
b、取不同发射光谱特征的荧光材料,然后分别与桥连ssDNA的互补序列ssDNA’和标记有淬灭荧光基团的识别不同靶位点的生物探针偶联,得ssDNA'和生物探针同步标记的荧光材料;
c、将步骤a所得桥连ssDNA标记的磁性纳米材料和步骤b所得ssDNA'和生物探针同步标记的荧光材料混合进行杂交,经磁性富集,得多功能荧光微性微球。
9.根据权利要求8所述的多功能磁性荧光微球的制备方法,其特征在于:
所述步骤a是将磁性纳米材料表面偶联链霉亲和素,然后与5’端标记生物素的桥连ssDNA偶联;
所述步骤b是将荧光材料的表面进行羧基修饰,然后与氨基标记的与所述桥连ssDNA互补的序列ssDNA'和氨基标记的生物探针偶联。
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