CN114252613A

CN114252613A - 一种用于检测HBsAg抗原蛋白的组合物及其使用方法

Info

Publication number: CN114252613A
Application number: CN202111515668.6A
Authority: CN
Inventors: 刘玉菲; 袁梦迪; 胡永琴; 张国秀
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2021-12-13
Filing date: 2021-12-13
Publication date: 2022-03-29

Abstract

本发明公开了一种用于检测HBsAg抗原蛋白的组合物，包括钙钛矿荧光复合物与四氧化三铁磁性颗粒；所述钙钛矿荧光复合物用于与第一抗体结合，提供荧光型号；所述四氧化三铁磁性颗粒用于与第二抗体结合，用做捕获HBsAg抗原蛋白的载体；所述第一抗体与所述第二抗体均能与所述HBsAg抗原蛋白进行特异性结合，且所述第一抗体不同于所述第二抗体。本发明还公开了这种组合物的使用方法，即相应的检测方法。这种组合物成本低，检测效率高，对于HBsAg抗原蛋白检测具有高灵敏度、低检测限、宽检测范围的特点，该组合物及其使用方法具有良好的应用前景，为HBsAg抗原蛋白检测提供了新的思路。

Description

一种用于检测HBsAg抗原蛋白的组合物及其使用方法

技术领域

本申请涉及物质检测领域，尤其涉及检测HBsAg抗原蛋白的组合物及其使用方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒，它是引起全球性公共卫生问题的乙型肝炎的病原体，有着极强的传染性。HBV感染者以食欲衰减、恶心呕吐以及肝功能异常为主要临床表现，而重型HBV感染者表现为肝肾功能衰竭，并且有着出血倾向，甚至导致死亡。为了保护人类健康，对HBV 进行早期诊断与检测是迫在眉睫的事情。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是糖基化的病毒蛋白gp27，大量存在于感染者的血液中，HBsAg为HBV感染后首个出现的血清标志物，不仅效价最高，而且与HBV复制指标 HBV-DNA有着明显的正相关性，对乙型肝炎的早期诊断有着十分重要的意义。迄今为止，对HBsAg的检测方法主要包括：酶联免疫吸附测定、金纳米颗粒标记技术、电化学测试以及化学发光法等。但是以上方法通常不仅需要昂贵的设备与仪器，并且存在操作复杂、实验流程耗时等弊端，因此，研制出一种简单、高灵敏、耗时短的能够对HBsAg产生高亲和力，达到高特异性识别的新型低浓度检测传感器体系，是十分有必要的。

发明内容

基于以上问题，本发明提出了一种用于检测HBsAg抗原蛋白的组合物，包括钙钛矿荧光复合物与四氧化三铁磁性颗粒；

所述钙钛矿荧光复合物用于与第一抗体结合，提供荧光型号；

所述四氧化三铁磁性颗粒用于与第二抗体结合，用做捕获HBsAg抗原蛋白的载体；

所述第一抗体与所述第二抗体均能与所述HBsAg抗原蛋白进行特异性结合，且所述第一抗体不同于所述第二抗体。

在其中一个实施例中，所述四氧化三铁磁性颗粒的表面具有羧基官能团，所述四氧化三铁磁性颗粒的粒径为20nm-200nm。

在其中一个实施例中，所述钙钛矿荧光复合物包括钙钛矿荧光量子点和聚合物，所述钙钛矿荧光量子点分散于所述聚合物内部。

在其中一个实施例中，所述钙钛矿荧光复合物为微球状，所述四氧化三铁磁性颗粒的粒径为100nm-500nm，所述钙钛矿荧光量子点为铯铅溴钙钛矿量子点，所述聚合物为苯乙烯-丙烯酰胺共聚物。

在其中一个实施例中，所述钙钛矿荧光量子点的粒径低于15nm。

这种组合物成本低，检测效率高，对于HBsAg抗原蛋白检测具有高灵敏度、低检测限、宽检测范围的特点，具有良好的应用前景，为HBsAg抗原蛋白检测提供了新的思路。

本发明的另一方面，提供了上述组合物的使用方法，包括以下步骤：

S1：提供第一抗体和四氧化三铁磁性颗粒，使四氧化三铁磁性颗粒与所述第一抗体结合，形成第一交联物；

S2：提供第二抗体和钙钛矿荧光复合物，使所述第二抗体与所述钙钛矿荧光复合物结合，形成第二交联物；

S3：将所述第一交联物、所述第二交联物与待测物混合于缓冲液中，孵育0.5-2h得到第一混合液；

S4：对第一混合液进行磁分离后，对得到的磁性固态物分散于缓冲液后结合荧光光谱仪进行检测。

在其中一个实施例中，所述钙钛矿荧光复合物包括钙钛矿荧光量子点和聚合物，所述钙钛矿荧光量子点分散于所述聚合物内部；所述钙钛矿荧光复合物为微球状，所述钙钛矿荧光复合物的粒径为100nm-500nm；钙钛矿荧光量子点为铯铅氯、铯铅溴或铯铅碘钙钛矿量子点中的至少一种，所述聚合物为苯乙烯-丙烯酰胺共聚物；所述钙钛矿荧光量子点的粒径低于15nm。

在其中一个实施例中，在所述步骤S1和所述步骤S2中分别加入封端剂，用于封闭所述第一交联物或所述第二交联物表面多余的表面基团，所述封端剂为牛血清白蛋白。

在其中一个实施例中，在所述步骤S1和/或所述步骤S2中，所述第一抗体或所述第二抗体均通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和 N-羟基琥珀酰亚胺的依次作用分别与所述四氧化三铁磁性物质或所述钙钛矿荧光复合物结合。

上述检测方法，操作方便，时效高，且检测灵敏度，检测限低，检测范围广，具有良好的应用前景，为HBsAg抗原蛋白的检测提供了新思路。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明：

图1示出了本发明实施例的组合物的使用方法的示意图；

图2示出了本发明中实施例中制备的四氧化三铁磁性颗粒的表征结果；

图3示出了本发明实施例中制备钙钛矿荧光复合物使用的钙钛矿荧光量子点和PSAA微球的TEM照片；

图4示出了本发明实施例中制备得到的钙钛矿荧光复合物的TEM照片；

图5示出了本发明实施例中制备得到的钙钛矿荧光复合物的TEM mapping结果；

图6示出了本发明实施例中制备得到的钙钛矿荧光复合物的光学性能及稳定性；

图7示出了本发明实施例中得到的偶联前后的Fe₃O₄-COOH和 CPB@PSAA的酶吸收数据；

图8示出了本发明实施例检测不同浓度HBsAg时的荧光数据；

图9示出了本发明实施例的特异性数据。

具体实施方式

为了更详细地阐明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明的技术方案做进一步阐述。

在本申请中，提出了一种用于检测HBsAg抗原蛋白的组合物以及其对应的使用方法，即对HBsAg的检测方法。本发明中提出的组合物包括钙钛矿荧光复合物与四氧化三铁磁性颗粒；所述钙钛矿荧光复合物用于与第一抗体结合，提供荧光型号；所述四氧化三铁磁性颗粒用于与第二抗体结合，用做捕获HBsAg抗原蛋白的载体；所述第一抗体与所述第二抗体均能与所述 HBsAg抗原蛋白进行特异性结合，且所述第一抗体不同于所述第二抗体。使用上述组合物对HBsAg进行检测时，通常包括以下步骤：S1，提供第一抗体和四氧化三铁磁性颗粒，使四氧化三铁磁性颗粒与所述第一抗体结合，形成第一交联物；S2，提供第二抗体和钙钛矿荧光复合物，使所述第二抗体与所述钙钛矿荧光复合物结合，形成第二交联物；S3，将所述第一交联物、所述第二交联物与待测物混合于缓冲液中，孵育0.5-2h得到第一混合液；S4，对第一混合液进行磁分离后，对得到的磁性固态物分散于缓冲液后结合荧光光谱仪进行检测。需要说明的是，检测过程中使用的第一抗体与第二抗体均能与HBsAg产生特异性结合，但彼此的种类并不相同。例如：第一抗体和第二抗体均可选自鼠抗HBsAg(Mab)、羊抗HBsAg(Gab)、兔抗HBsAg (Rab)中的一种，且彼此不同。

这种组合物及其使用方法具有成本低，检测效率高的优点，对于HBsAg 抗原蛋白检测具有高灵敏度、低检测限、宽检测范围的特点，具有良好的应用前景，为HBsAg抗原蛋白检测提供了新的思路。

需要说明的是，上述使用方法的步骤S1和步骤S2的顺序不作限定，步骤S3和步骤S4在步骤S1和步骤S2完成后依次执行。

优选地，上述组合物中的四氧化三铁颗粒通过以下步骤制备得到：

S101：将六水合氯化铁、二水合柠檬酸三钠添加至乙二醇溶液中，充分溶解；

S102：向S101得到的溶液中加入三水合乙酸钠，充分搅拌反应得到黑色溶液；

S103：将所述黑色溶液至于密封溶液内，在180℃-250℃下反应10h-15h 后洗涤分离。

通过上述步骤即可得到制备得到性能合适的磁性四氧化三铁颗粒。

进一步优选地，步骤S101中的六水合氯化铁、二水合柠檬酸三钠在乙二醇中的溶解通过超声和机械搅拌的方式完成；所述六水合氯化铁与所述二水合柠檬酸三钠的摩尔比为2:1-3:1。步骤S102中，加入的三水合乙酸钠与六水合氯化铁的摩尔比为5:1-6:1。

在上述反应中，乙二醇的用量不作限定，能充分溶解反应物即可。

优选地，上述四氧化三铁磁性颗粒的制备方法还包括步骤S104：使用至少两种不同溶剂对产物进行交替洗涤。进一步优选地，洗涤溶剂为无水乙醇、丙酮、去离子水中的至少两种。更优选地，洗涤后的产物通过冷冻干燥的形式进行干燥后在低于10℃的温度下进行保存。

通过上述方法制备出的四氧化三铁磁性颗粒表面具备充分的羧基功能团，为后续对HBsAg的捕获和负载提供了基础。通过以上步骤得到的四氧化三铁磁性颗粒还具有明细的磁性，且粒径均一，粒径范围在20nm-200nm 之间，比表面积大，且在水性溶液中具备良好的分散性，能对水性溶液体系中的HBsAg进行充分的捕获。

具体地，本申请中后续实施例中使用的四氧化三铁磁性颗粒的制备过程如下：

称取0.675g六水合氯化铁与0.2791g二水合柠檬酸三钠置于50 mL烧杯中，再加入20mL乙二醇，超声10min后，室温下搅拌1h，随后迅速加入1.9907g三水合乙酸钠，继续搅拌30min，然后将得到的棕黑色混合溶液转移至带有四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，在200℃下反应 12.5h后取出，自然冷却至室温后，产物用无水乙醇与去离子水通过磁分离方式交替洗涤三次，然后置入真空冷冻干燥机中干燥2天，将得到的棕黑色四氧化三铁磁性颗粒粉末保存于4℃冰箱中以供后续使用。对得到的样品进行SEM、TEM、XPS、XRD、FTIR等表征其微观形貌及结构，并测试其磁性。

通过上述实验制备得到的是羧基化的磁性四氧化三铁磁性颗粒 (Fe₃O₄-COOH)，结合图2a和图2b可以看到，制备出的四氧化三铁磁性颗粒具有良好的单分散性，且粒径均一，平均粒径约为138.26nm。需要说明的是，本领域技术人员可以调整上述实验中各物质的用量得到平均粒径在 20nm-200nm不等的四氧化三铁颗粒。图2c示出了样品的XPS谱图，证明了Fe、O、C三种元素的存在。图2d为Fe₃O₄-COOH的XRD图谱，从图中可以看到出现了明显的衍射峰，其衍射角2θ＝30.16°，35.50°，43.07°， 53.58°，57.13°，62.65°，分别对应Fe₃O₄-COOH的(220)，(311)，(400)，(422)， (511)与(440)晶面，与JCPDS No.19-0629卡片匹配度良好，为反尖晶石结构，并且物相单一，没有多余的杂峰相。如图2e所示，为了进一步证明磁纳米粒子上羧基的存在，测试了Fe₃O₄-COOH的红外光谱，592cm^-1处的吸收峰属于Fe-O的特征峰，1402cm^-1与1641cm^-1分别为OH弯曲振动与C＝O伸缩振动，两者均属于羧基的特征峰，2974cm^-1与3435cm^-1处的宽峰属于游离的O-H伸缩振动，可能来自于未干燥的水分子。图2f为Fe₃O₄-COOH的磁滞回归曲线，可以从图中看到饱和磁化强度值为56.89 emu/g，在室温下矫顽力几乎为零，使用商业磁性支架可以在20s内实现快速聚集。发明人将制备的Fe₃O₄-COOH分别分散水溶液与0.01M 1×PBS 缓冲溶液中，呈现出了良好的分散性，并且在外部施加磁铁的情况下，两者都能在20s内变得澄清透明，证实了制备的Fe₃O₄-COOH具有优异的磁响应性能。

在一些优选的实施方案中，上述钙钛矿荧光复合物的制备过程包括以下步骤：

S201：提供改性的钙钛矿量子点溶液，以及苯乙烯-丙烯酰胺共聚物微球；

S202：将所述苯乙烯-丙烯酰胺共聚物微球分别置于无水乙醇和异丙醇溶液中离心洗涤，并分散于异丙醇溶液中；S203：将所述改性的钙钛矿量子点溶液至于溶胀剂中，并加入步骤S202中得到的苯乙烯-丙烯酰胺共聚物微球的异丙醇分散液中，超声10min-60min，使所述改性的钙钛矿量子点溶胀于所述苯乙烯-丙烯酰胺共聚物微球中。

需要说明的是，为了保证钙钛矿量子点晶体能均匀地溶胀于苯乙烯-丙烯酰胺共聚物微球中，优选地，在步骤S203中的超声过程进行的同时对反应容器进行均匀地转动。

通过上述方法制备得到的钙钛矿荧光复合物，其中的钙钛矿荧光量子点能稳定且均匀地在苯乙烯-丙烯酰胺共聚物微球中形成良好的分散，使得钙钛矿荧光量子点的具备良好的稳定性。

优选地，所述溶胀剂为甲苯。

优选地，上述制备过程还包括步骤S204：将步骤S203得到的产物至于过量正己烷中离心沉淀，并使用乙醇清洗沉淀物。该步骤可以去除反应体系中的溶胀剂，同时使得钙钛矿荧光复合物的微球尺寸进行收缩。

优选地，步骤S201中的改性的钙钛矿量子点溶液可以是氨基化的钙钛矿量子点溶液或者是羧基化的钙钛矿量子点溶液，具体地，可以是经过双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)、四丁基溴化铵(TOAB)等物质中的一种或多种改性过的钙钛矿量子点溶液。这些物质可以是本领域的已知物质，也可以是通过已知方法制备得到的物质，可以根据本领域技术人员的需求自行调整。

通过上述方法制备的钙钛矿荧光复合物为微球状，其表面具有氨基或羧基官能团，粒径为100nm-500nm。在一些优选的实施例中，钙钛矿荧光量子点为铯铅氯、铯铅溴或铯铅碘钙钛矿量子点中的至少一种。

具体地，本申请中后续实施例中使用的钙钛矿荧光复合物的制备过程如下：

首先提前制备好DDAB改性的铯铅溴钙钛矿量子点溶液与苯乙烯-丙烯酰胺共聚物(PSAA)微球水溶液，将定量完成的PSAA微球水溶液于 14000rpm下离心20min去上清液后分散于无水乙醇中，再同样于14000 rpm下离心5min去上清液后分散于体积不少于900μL的异丙醇中。下一步取DDAB改性的铯铅溴钙钛矿量子点溶液于离心管中，加入甲苯定容至100μL后，加入上一步加工后的PSAA异丙醇溶液，立即超声30分钟。在超声过程中，匀速转动离心管以使钙钛矿纳米晶均匀进入PSAA球中。超声结束后，加入过量正己烷离心1min，最后将得到的沉淀在4℃ 冰箱下保存以供后续使用。通过TEM对制得样品的微观形貌、结构及元素构成进行分析。图3a为制备过程中使用的DDAB改性的铯铅溴钙钛矿量子点的TEM照片，可以看出使用的钙钛矿量子点为典型的密堆层立方结构，图3b为使用的PSAA微球的TEM照片，可以看出PSAA微球的粒径均匀且分散性良好，经过粒径统计分析得到其平均粒径为317.00nm。其内部为疏水的聚苯乙烯，外部有着大量亲水的酰胺基团，极利于官能团改性，因此能够为钙钛矿纳米晶体的包覆提供理想条件。

反应后得到的钙钛矿荧光复合物的TEM照片如图4a所示，可以看到粒径均一的PSAA微球包覆着钙钛矿纳米晶，对其中的钙钛矿纳米晶做 HRTEM(图4b)，其晶格仍为0.41nm，可见钙钛矿量子点仍保留了其原有晶型特征。为了进一步证明钙钛矿的成功嵌入，发明人对钙钛矿荧光复合物进行了TEM mapping分析(图5)，可以看到其组成元素为：C、N、O、 Cs、Pb、Br，与PSAA微球及铯铅溴钙钛矿量子点的元素组成一致，说明了CPB@PSAA的成功制备。

为了明确上述CPB@PSAA的光学特性，发明人测定了CPB@PSAA 的荧光最佳激发发射光谱，如图6a所示，图中两条曲线从左至右分别是 CPB@PSAA的最佳激发激发光谱与发射光谱，其最佳激发波长为295nm，发射波长为517nm，图6a上方插图为CPB@PSAA水溶液在日光灯下与紫外灯下的照片，可以看到在365nm紫外灯下，CPB@PSAA水溶液发出明亮的绿色荧光。

接下来对CPB@PSAA的环境与存储稳定性进行研究，将一定量 CPB@PSAA混入不同浓度的NaCl溶液(0,0.5,1,1.5,2,3M)中，25℃ 下震荡2h，最后取同体积的CPB@PSAA盐溶液放入荧光光谱仪进行检测，重复3次试验，得到的结果如图6b所示，可以看到在不同浓度盐溶液下， CPB@PSAA的荧光强度几乎没有变化，说明CPB@PSAA在高离子浓度环境下，也能保持良好的光学性质。进一步地，图6c是对CPB@PSAA的存储稳定性的研究，将CPB@PSAA水溶液放置0,5,10,15,25,40,50天，分别测出其荧光强度值，进行归一化处理，可以看到就算放置50天，其相对荧光强度下降不到1.5％。综上，说明本申请中制备的CPB@PSAA具有极佳的稳定性，是作为免疫检测荧光信号源的理想复合材料。

接下来，通过制备得到的四氧化三铁磁性颗粒以及钙钛矿荧光复合物对 HBsAg进行检测。

在一个优选的实施例中，步骤S1和步骤S2中的第一抗体或所述第二抗体均通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的依次作用分别与所述四氧化三铁磁性物质或所述钙钛矿荧光复合物结合。

优选地，在步骤S1和步骤S2中均分别加入封端剂，用于封闭所述第一交联物或所述第二交联物表面多余的表面基团，进一步优选地，所述封端剂为牛血清白蛋白(BSA)。

具体地，本申请中通过以下过程使磁性四氧化三铁颗粒和CPB@PSAA 分别与第一抗体和第二抗体进行交联。

将Mab固定于Fe₃O₄-COOH纳米粒子表面：取一定量的Fe₃O₄-COOH 粉末于离心管中，加入500μL浓度为0.01M PB溶液(pH＝5.0)超声1min 进行充分溶解后，加入100μL浓度为5mg/mL的EDC溶液，在25℃下摇床震荡孵育15分钟，再迅速向溶液中加入100μL浓度为2.5mg/mL的 NHS溶液继续摇床孵育15分钟。反应完成后，通过磁分离弃去上清，将沉淀溶于装有3mL的磷酸缓冲盐溶液(1×PBS)的烧瓶中，再加入1mL 一定浓度的Mab，于37℃下气浴震荡孵育1.5h。反应完成后，将溶液取出并移入离心管中进行磁分离洗涤，用1×PBS洗涤3次后，将沉淀分散于 10mg/mL BSA盐溶液中，得到MAb@Fe₃O₄-COOH分散液，于4℃冰箱中放置保存备用。其中，Fe₃O₄-COOH与Mab的质量之比为5:1-20:1。

将Gab固定于CPB@PSAA荧光微球表面：取一定量的CPB@PSAA 粉末于离心管中，加入500μL浓度为0.01M PB溶液(pH＝5.0)超声1min进行充分溶解后，加入100μL浓度为5mg/mL的EDC溶液，在25℃下摇床震荡孵育15分钟，再迅速向溶液中加入100μL浓度为2.5mg/mL的NHS溶液继续摇床孵育15分钟。反应完成后，离心10分钟弃去上清，将沉淀溶于装有3mL1×PBS的烧瓶中，再加入1mL一定浓度的Gab，于37℃下水浴搅1.5h。反应完成后，将溶液取出并移入离心管中在4℃下进行离心洗涤，用浓度为0.01M的1×PBS溶液洗涤3次后，将沉淀分散于10mg/mL BSA盐溶液中，得到GAb@CPB@PSAA，溶液于4℃冰箱中放置保存。其中，CPB@PSAA与Gab的质量之比为10:1-50:1。

为了验证Mab与Gab分别是否分别与Fe₃O₄-COOH和CPB@PSAA偶联上，选择ELISA进行验证实验：

使用浓度为2％的BSA在37℃下分别对Fe₃O₄-COOH、CPB@PSAA、 MAb@Fe₃O₄-COOH及GAb@CPB@PSAA进行封闭处理1h，以避免酶标抗体粘连在纳米粒子上而造成的误差，完成后用1×PBS分别洗涤3次，随后将HRP-兔抗鼠IgG与HRP-兔抗羊IgG以1:8000的比例进行稀释后，分别加入到Fe₃O₄-COOH、MAb@Fe₃O₄-COOH与CPB@PSAA、 GAb@CPB@PSAA中，37℃下孵育30min后，分别用1×PBS洗涤3次，完成后分别加入TMB显色液，静置15min后，加入1M HCl终止反应，重复3次试验并于酶标仪上进行检测。如图4a与4b所示，可以明显地看到， Fe₃O₄-COOH与CPB@PSAA分别作为MAb@Fe₃O₄-COOH与 GAb@CPB@PSAA的对照组，它们的吸收值是特别低的，相对来说， MAb@Fe₃O₄-COOH与GAb@CPB@PSAA由于抗体的成功修饰，使得表面具有大量结合的酶标抗体，从而吸收值也得到突变。因此，使用ELISA高效地证明了MAb@Fe₃O₄-COOH与GAb@CPB@PSAA的成功制备。

接着，确定上述组合物对HBsAg的检测浓度范围：

用1×PBS缓冲液配置100μL浓度分别为0、0.2、0.5、1、2、5、10、 15、20、25、30、40、50ng/mL的HBsAg溶液。取10μL MAb@Fe₃O₄-COOH 溶液于离心管中，向其中加入100μL上述其一浓度的HBsAg溶液后，再加入10μL GAb@CPB@PSAA溶液，轻微涡旋操作后，放入37℃的气浴震荡仪中孵育1h。反应完成后，用1×PBS通过磁分离洗涤1次，分散于 100μL 1×PBS中，再将溶液移入比色皿中，放入荧光光谱仪，进行检测；使用不同浓度的HBsAg溶液进行检测，结合荧光强度计算检测限和检测范围。

如图8a和图8b所示，随着HBsAg浓度的逐渐增加，整个荧光免疫传感系统的荧光信号也在逐渐增强。如图8b所示，HBsAg浓度为0.2-15ng/mL 的相应荧光信号响应显示出良好的线性关系，其中线性回归方程为I-I₀＝19.99955C+0.00514，相关系数为R²＝0.996。其中，I₀与I分别代表在添加 HBsAg之前和之后在517nm处的荧光强度值，C代表的是溶液中HBsAg 的浓度(ng/mL)。基于3δ/k(其中δ表示空白样品的标准偏差，k表示校准曲线的斜率)，可知，该检测方法的检出限(LOD)低至0.03ng/mL。

实施例1：

对血清中的HBsAg进行检测：

用1×PBS缓冲液配置100μL HBsAg浓度分别为1ng/mL、5ng/mL、 10ng/mL的血清溶液。取10μL MAb@Fe₃O₄-COOH溶液于离心管中，向其中加入100μL某特定浓度HBsAg溶液后，再加入10μL GAb@CPB@PSAA 溶液，轻微涡旋操作后，放入37℃的气浴震荡仪中孵育1h。反应完成后，用1×PBS通过磁分离洗涤1次，分散于100μL 1×PBS中，再将溶液移入比色皿中，放入荧光光谱仪，进行检测，检测结果如下表所示。

结果表明，该方法得到的实际样品分析结果与已知的添加的HBsAg浓度高度一致，其平均回收率为91.00％-107.80％。此外，它们的相对标准偏差都不超过4.40％。因此，本申请所提出的对HBsAg测定方法是可靠的，能够用于实际样品测定。

此外，为了评估该传感系统对HBsAg的特异性检测，将浓度为100ng/mL 的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、甲胎蛋白(AFP) 与癌胚抗原(CEA)分别作为阴性对照组，将浓度为5ng/mL的HBsAg作为实验组，观察荧光信号结果。如图9所示，可以看到，就算在HBcAg， HBeAg，AFP与CEA的浓度分别为HBsAg的二十倍的情况下，该传感系统对HBcAg，HBeAg，AFP与CEA的荧光信号反馈仍然十分微弱，而微量的HBsAg便可以产生强烈的荧光信号。这是由于在阴性样品的实验中，由于阴性对照蛋白不能与免疫复合物相结合，在洗涤时很轻易地就被洗掉了，因此GAb@CPB@PSAA是不会标记上阴性对照蛋白的，最终观察到的荧光信号就十分微弱。由此可知，该传感系统的荧光信号强度是HBsAg 与相应的特异性抗体之间生物特异性相互作用的结果。综上，说明我们制备的荧光免疫传感系统对HBsAg的检测具有超高特异性。

综上所述，在本申请中，发明人通过一步水热法制备了富含羧基官能团的四氧化三铁颗粒Fe₃O₄-COOH，该四氧化三铁颗粒不仅能够在20s内快速完成磁分离，大幅度提升洗涤过程的效率，表面富含的羧基官能团也使其成为制备免疫磁珠的理想材料。通过溶胀-收缩策略制备的CPB@PSAA，有着明亮的绿色荧光，并且具有极强的亲水性与稳定性，同时其中富含的官能团也使其能够高效抓捕抗体，是作为荧光免疫信号的最佳选择。最后，通过该荧光免疫夹心传感系统可以完美实现HBsAg的快速、高效且灵敏地测定，观察到了令人满意的线性关系。此外，该荧光免疫夹心传感系统同样适用于血清样品中HBsAg的检测。该工作为病毒检测与荧光免疫传感系统的研究提供了新思路，在生物医学检测和化学传感领域具有广泛的应用潜力。

最后，应当予以说明的是：以上所述实施例仅仅是本发明为清楚地说明本发明所作的较佳举例，但这并不是对本发明的实施方案的限制，所属领域的普通技术人员应当理解，以上方案中技术特征可以任意组合，在上述具体实施方式的基础上还可以做出其它不同形式的修改或对部分技术特征进行同等替换，这里无法对所有的实施方式予以穷举，因而，凡在本发明的精神和原则之内，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的所有的任何修改、改进、等同替换等等，都应处于本发明请求保护的技术范围之内。

Claims

1.一种用于检测HBsAg抗原蛋白的组合物，其特征在于，包括钙钛矿荧光复合物与四氧化三铁磁性颗粒；

2.根据权利要求1所述的用于检测HBsAg抗原蛋白的组合物，其特征在于，所述四氧化三铁磁性颗粒的表面具有羧基官能团，所述四氧化三铁磁性颗粒的粒径为20nm-200nm。

3.根据权利要求1所述的用于检测HBsAg抗原蛋白的组合物，其特征在于，所述钙钛矿荧光复合物包括钙钛矿荧光量子点和聚合物，所述钙钛矿荧光量子点分散于所述聚合物内部。

4.根据权利要求3所述的用于检测HBsAg抗原蛋白的组合物，其特征在于，所述钙钛矿荧光复合物为微球状，所述钙钛矿荧光复合物的粒径为100nm-500nm，所述钙钛矿荧光量子点为铯铅溴钙钛矿量子点，所述聚合物为苯乙烯-丙烯酰胺共聚物。

5.根据权利要求3或4所述的用于检测HBsAg抗原蛋白的组合物，其特征在于，所述钙钛矿荧光量子点的粒径低于15nm。

6.根据权利要求1-5所述的用于检测HBsAg抗原蛋白的组合物的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的用于检测HBsAg抗原蛋白的组合物的使用方法，其特征在于，所述四氧化三铁磁性颗粒的表面具有羧基官能团，所述四氧化三铁磁性颗粒的粒径为20nm-200nm。

8.根据权利要求6所述的用于检测HBsAg抗原蛋白的组合物的使用方法，其特征在于，所述钙钛矿荧光复合物包括钙钛矿荧光量子点和聚合物，所述钙钛矿荧光量子点分散于所述聚合物内部；所述钙钛矿荧光复合物为微球状，所述钙钛矿荧光复合物的粒径为100nm-500nm；所述钙钛矿荧光量子点为铯铅氯、铯铅溴或铯铅碘钙钛矿量子点中的至少一种，所述聚合物为苯乙烯-丙烯酰胺共聚物；所述钙钛矿荧光量子点的粒径低于15nm。

9.根据权利要求6所述的用于检测HBsAg抗原蛋白的组合物的使用方法，其特征在于，在所述步骤S1和所述步骤S2中均分别加入封端剂，用于封闭所述第一交联物或所述第二交联物表面多余的表面基团，所述封端剂为牛血清白蛋白。

10.根据权利要求6所述的用于检测HBsAg抗原蛋白的组合物的使用方法，其特征在于，在所述步骤S1和所述步骤S2中，所述第一抗体或所述第二抗体均通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的依次作用分别与所述四氧化三铁磁性物质或所述钙钛矿荧光复合物结合。