CN108636305B - 一种用于蛋白质分离的聚合物磁珠制备方法 - Google Patents

一种用于蛋白质分离的聚合物磁珠制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开的是一种可用于蛋白质分离的聚合物磁珠制备方法，属于生物医用高分子纳米复合材料技术领域。采用侧链含羧基刚性两亲嵌段共聚物为高分子载体，油溶性超顺磁Fe3O4纳米粒子为内核制备磁性复合微珠，采用微乳液自组装的方法将油溶性超顺磁性纳米粒子包埋在聚合物微球内部，经过溶剂干燥、洗涤、离心分离后得到表面含羧基的聚合物磁珠，再对所得磁性复合微珠的形貌及磁性进行表征，利用磁珠表面羧基偶联抗体，有望实现此类复合微球在细胞及蛋白分离等生物医学领域的应用。本发明合成方法简单，易于操作，且制备得到聚合物微球表面富含羧基，可方便进行后续生物功能化。

Description

一种用于蛋白质分离的聚合物磁珠制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用高分子复合材料技术领域，具体是涉及一种用于蛋白质分离的聚合物磁珠制备方法。
背景技术
小尺寸Fe3O4磁性纳米粒子(<30nm)因具有独特的顺磁性及良好的生物相容性，已成为磁热治疗、细胞磁标记及磁分离、药物控释以及磁共振成像领域的研究热点，也是迄今为止成功通过FDA认证的可用于生物医学领域的少数无机纳米材料之一。但是，传统的超顺磁Fe3O4纳米粒子在水相环境中极易团聚，且需要对其表面配体进行设计以增强其生物功能化能力。因此，把功能高分子与超顺磁性纳米粒子相结合得到一种磁性微珠，在保持复合材料的良好磁性及生物相容性的同时，可借助功能高分子灵活的分子设计策略提升复合微珠的生物功能化途径，为开发可用于细胞分离、免疫检测及生物成像等生物医学方面领域的磁珠材料奠定基础。
目前，磁性复合微珠的主要制备方法是将无机磁性纳米材料与有机功能高分子材料等进行复合。但是，由于高质量的超顺磁纳米粒子大多为油溶性，在水相环境中极易团聚沉淀，而通过两亲性高分子的微乳液自组装，可方便实现油溶性无机磁性纳米粒子的水相转移。具体而言，可通过多种方法将油溶性无机磁性纳米粒子包埋在聚合物微珠内部，例如聚合法、微乳液自组装、微流控法和多孔微球负载法等。其中，聚合法得到的微球单分散性较差易聚集，微流控法得到的微球粒径较大，多孔微球负载法通过溶胀作用实现包覆，但存在纳米粒子外泄性能降低等问题。此外，目前用于包覆纳米粒子的聚合物载体通常为不含芳香环的柔性碳链高分子，因其疏水作用较小，对纳米粒子的包埋容量及包埋稳定性有限；同时若进行生物医学方面的应用，需进一步修饰其他功能性基团。因此若采用具有强疏水作用的两性高分子为载体，在通过微乳液法包埋磁性纳米粒子获得磁性微珠的同时，使其表面富含羧基以利于后生物功能化，在偶联抗体后，有望获得可用于蛋白及细胞分离的功能微珠。
发明内容
本发明解决的技术问题是：针对现有技术的不足，首先采用一种含羧基刚性两亲嵌段共聚物为载体，随后通过微乳液自组装的方法，利用高分子链亲疏水相互作用包埋油溶性超顺磁Fe3O4纳米粒子得到单分散性的磁性复合微珠，其表面羧基可用于偶联抗体，以实现蛋白质的特异性分离。
本发明的技术方案是：
一种用于蛋白质分离的聚合物磁珠制备方法，是通过微乳液自组装的方法制备得到，具体包括以下步骤：
(1)称取5～20mg含羧基的刚性两亲嵌段共聚物溶于0～2mL四氢呋喃中，随后加入1.5～10mL二氯甲烷，配成均相溶液；
(2)称取2～20mg超顺磁性Fe3O4纳米粒子，加入步骤(1)中得到的均相溶液中并超声分散，得到混合液；
(3)将步骤(2)得到的混合液加入至10～50mL含1～10mg/mL的十二烷基磺酸钠(SDS)/水溶液中，20～30℃下连续搅拌12～24h至溶剂挥发完全，多次离心及纯水洗涤，最后分散在水中，得到磁性复合微珠；
(4)将步骤(3)中制备得到的磁性复合微珠转移至pH为7.4的PBS缓冲液中，向其中加入50～100mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与150～250mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温静置15-30min后，采用磁性分离收集活化磁珠；
(5)将上述活化磁珠重新分散PBS缓冲液中，向其中加入0.02-0.1mg/mL的兔抗鼠IgG抗体溶液，在室温静置15-30min后，磁分离洗涤后获得表面偶联抗体的用于蛋白质分离的聚合物磁珠。
本方法得到的磁性复合微珠具有稳定性强、分散性好、磁性能稳定且易于生物功能化的特点，可应用于细胞及蛋白分离等生物医学领域。
进一步地，在上述方案中，步骤(1)中所述溶剂四氢呋喃也可用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或者二甲基亚砜(DMSO)替换。
在上述方案中优选地，步骤(1)中所述含羧基的刚性两亲嵌段共聚物可以是共聚聚芳醚。
进一步地，在上述方案中，可通过改变超顺磁性Fe3O4纳米粒子的包埋量来调整磁性共聚聚芳醚微球的磁性能。
更进一步地，步骤(2)中所述超声分散的参数为：室温超声分散10分钟。
更进一步地，步骤(3)中所述多次离心及纯水洗涤具体操作为：室温离心3min，离心速度10000rpm，去掉上清液，加入25mL水后分散均匀后，重复上述步骤。
本发明的有益效果是：本发明采用含羧基刚性两亲嵌段共聚物为载体包埋磁性纳米粒子，聚合物分子链间的π-π相互作用显著增强了复合磁珠内部Fe3O4纳米粒子的稳定性，对提升油溶性纳米粒子的包埋容量及包埋稳定性有较大意义。此外，其合成方法简单，易于操作，且制备得到聚合物微球表面富含羧基，可方便进行后续生物功能化。
附图说明
图1是本发明所述的含羧基刚性两亲嵌段共聚物的结构示意图。
图2是本发明用于蛋白质分离的磁性聚合物微珠制备示意图。
图3是本发明实施例1制备的聚合物载体微珠的扫描电镜(SEM)照片。
图4是本发明实施例2制备的磁性复合微珠晶体结构的X射线衍射(XRD)测试数据。
图5是本发明实施例2制备的磁性复合微珠磁性能的振动样品磁强计(VSM)测试数据。
图6是本发明实施例5制备的聚合物磁珠蛋白分离数据图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的技术方案和保护范围不限于下述具体实施例。
实施例1
(1)称取10mg含羧基刚性两亲嵌段共聚物溶于0.2mL四氢呋喃中，随后加入1.8mL二氯甲烷。
(2)称取40mg SDS溶于20mL去离子水中。
(3)搅拌条件下，将步骤(1)得到的混合液缓慢加入至步骤(2)的溶液中，在25℃条件下连续搅拌12h至溶剂挥发完全。
(4)将步骤(3)得到的乳液采用多次离心取沉淀并用纯水洗涤纯化，然后分散在纯水中得到聚合物载体微珠(Polymer Beads,PB)。
实施实例1所述的刚性两亲嵌段共聚物结构如图1所示，其分子主链含有大量苯环，侧链含有羧基。对实施例所得聚合物微珠进行形貌表征及XRD测试，得到图3A所示SEM图片及图4所示XRD曲线结果。由SEM图可看出所制得的聚合物微珠粒径较为均匀且分散性较好，由图4结果可知，PB为无定型高分子微球。
实施例2
磁性复合微珠(MB)由微乳液自组装的方法制备得到，具体而言是通过选择性溶剂乳液体系中刚性两亲嵌段共聚物与超顺磁性Fe3O4纳米粒子的共组装得到，具体步骤为：
(1)称取10mg含羧基刚性两亲嵌段共聚物溶于0.2mL四氢呋喃中，随后加入1.8mL二氯甲烷，称取5mg超顺磁性四氧化三铁纳米粒子至混合溶液中并超声分散。
(2)称取40mgSDS溶于20mL去离子水中。
(3)搅拌条件下，将步骤(1)中得到的混合液缓慢加入至步骤(2)的溶液中，在25℃条件下连续搅拌12h至溶剂挥发完全。
(4)将步骤(3)得到的乳液采用多次离心取沉淀并用纯水洗涤纯化，然后分散在纯水中得到磁性复合微珠(Magnetic Beads,MB)。
实施实例2中磁性复合微珠MB的制备是通过微乳液共组装实现，其制备过程如图2所示。
对实施例2所得磁性复合微珠的微观形貌进行扫描电子显微镜(SEM)表征，其结果如图3B所示。
对实施例2所用超顺磁性Fe3O4纳米粒子及所得磁性复合微珠MB的晶体结构进行X射线衍射表征，其结果如图4所示。
对实施例2所用超顺磁性Fe3O4纳米粒子及所得磁性复合微珠MB的磁性能采用振动样品磁强计(VSM)进行测试，其结果如图5所示。
实施例3
本实施例与实施例2相比，区别在于：步骤(1)中所用含羧基的刚性两亲嵌段共聚物质量为5mg，且所用四氢呋喃替换为DMF，其余步骤与实施例2相同。目的在于可根据实际需要改变条件调整磁复合微珠的形貌尺寸。
实施例4
本实施例与实施例2相比，区别在于：步骤(1)中所用超顺磁性四氧化三铁纳米粒子为10mg，其余步骤与实施例2相同。目的在于可根据实际需要调整磁性复合微珠的饱和磁化强度。
实施例5
用于蛋白质分离的聚合物磁珠(Polymer Magnetic Beads,PMB)由上述制备得到的复合磁珠MB表面偶联抗体得到，具体步骤为：
(1)称取10mg含羧基刚性两亲嵌段共聚物溶于0.2mL四氢呋喃中，随后加入1.8mL二氯甲烷，称取5mg超顺磁性四氧化三铁纳米粒子至混合溶液中并超声分散。
(2)称取40mgSDS溶于20mL去离子水中。
(3)搅拌条件下，将步骤(1)中得到的混合液缓慢加入至步骤(2)的溶液中，在25℃条件下连续搅拌12h至溶剂挥发完全。
(4)将步骤(3)中制备得到的磁性微珠MB转移至pH为7.4的PBS缓冲液中，向其中加入50mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与150mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温静置30min后，采用磁性分离收集活化磁珠。
(5)将步骤(4)中的活化磁珠重新分散PBS缓冲液中，向其中加入0.1mg/mL的兔抗鼠IgG抗体溶液，在室温静置30min后，磁分离洗涤后获得表面偶联抗体、可用于分离IgG蛋白的聚合物磁珠PMB，其蛋白分离效果如图6所示。由图6可知，三种不同磁性聚合物磁珠PMB均可实现蛋白质的有效分离。
对上述实施实例所得聚合物微珠PB及磁性复合微珠MB进行SEM表征、XRD以及磁性(VSM)测试，得到图3至图5的实验结果。由图3的SEM照片可看出所制得的PB及MB粒径都较为均匀且分散性较好；由图4的XRD测试结果可知，超顺磁性Fe3O4纳米粒子已成功包埋在含羧基的PB之中；同时对比分析图5中超顺磁性Fe3O4纳米粒子与本发明所得磁珠MB的磁滞回线，得出聚合物包埋超顺磁性纳米粒子后仍然具有一定的饱和磁强度且保持超顺磁性，同时可通过改变超顺磁性纳米粒子的包埋量来调整磁性共聚聚芳醚微球的磁性能。

Claims (6)

1.一种用于蛋白质分离的聚合物磁珠制备方法，其特征在于，是通过微乳液自组装的方法制备得到，具体包括以下步骤：
(1)称取5～20mg含羧基的刚性两亲嵌段共聚物溶于0～2mL四氢呋喃中，随后加入1.5～10mL二氯甲烷，配成均相溶液；
(2)称取2～20mg超顺磁性Fe3O4纳米粒子，加入步骤(1)中得到的均相溶液中并超声分散，得到混合液；
(3)将步骤(2)得到的混合液加入至10～50mL含1～10mg/mL的十二烷基磺酸钠(SDS)/水溶液中，20～30℃下连续搅拌12～24h至溶剂挥发完全，多次离心及纯水洗涤，最后分散在水中，得到磁性复合微珠；
(4)将步骤(3)中制备得到的磁性复合微珠转移至pH为7.4的PBS缓冲液中，向其中加入50～100mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与150～250mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温静置15-30min后，采用磁性分离收集活化磁珠；
(5)将上述活化磁珠重新分散PBS缓冲液中，向其中加入0.02-0.1mg/mL的兔抗鼠IgG抗体溶液，在室温静置15-30min后，磁分离洗涤后获得表面偶联抗体的用于蛋白质分离的聚合物磁珠。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述溶剂四氢呋喃也可用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或者二甲基亚砜(DMSO)替换。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述含羧基的刚性两亲嵌段共聚物可以是共聚聚芳醚。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，可通过改变超顺磁性Fe3O4纳米粒子的包埋量来调整磁性共聚聚芳醚微球的磁性能。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述超声分散的参数为：室温超声分散10分钟。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述多次离心及纯水洗涤具体操作为：
室温离心3min，离心速度10000rpm，去掉上清液，加入25mL水后分散均匀后，重复上述步骤。
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