CN113634226A - Fe3O4/GO复合纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Fe3O4/GO复合纳米材料及其制备方法和应用,所述方法先通过溶剂热反应制备四氧化三铁纳米微球,然后采用二氧化硅和聚醚酰亚胺对四氧化三铁纳米微球进行表面修饰,同时采用聚丙烯酸对氧化石墨烯进行表面修饰,最后将修饰后的四氧化三铁纳米微球和氧化石墨烯复合制备获得Fe3O4/GO复合纳米材料。与现有技术相比,本发明具有以下优点:(1)所述方法首次将水溶性好、比表面积大的氧化石墨烯进行聚丙烯酸修饰,并进一步与四氧化三铁复合,从而制备针对循环肿瘤细胞的高捕获效率复合纳米材料;(2)所述材料广谱性地捕获表面带负电荷的癌细胞;(3)所述材料采用磁分离方法,具有操作简便、耗时短、灵敏度高、广谱性强、材料成本低的优势。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域,涉及一种功能型纳米材料,具体为Fe3O4/GO复合纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
癌症患者的死亡率与癌症诊断时间相关,90%以上癌症患者的死亡起因于发生了转移。循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)在癌症转移过程中发挥重要作用,是反映癌症病情发展的风向标。对其进行捕获富集,可实现对癌症的早期诊断、预后评估、化疗药物的药效评价及个体化治疗。
目前,CTCs常用的富集方法有免疫磁珠分选、微流控芯片技术、膜滤过法和密度梯度离心法等,这些捕获方法各具优势,但同时也存在捕获效率低、灵敏度低、广谱性不够等问题。
“瓦伯格效应”导致癌细胞表面带负电荷,有望成为解决CTCs捕获广谱性问题的突破口。
四氧化三铁纳米粒子因具有独特的物理化学性能因而在催化、磁成像等领域具有重要研究价值。四氧化三铁纳米颗粒因其制备方法简单、磁性能突出而倍受关注,但其粒径必须较小且在一定尺寸内才能具备超顺磁性。然而其粒径越小,比表面积就越大,表面能也越高,也就越不稳定。因此,通常需要采用一定的方法如表面修饰或者包覆处理以稳定和保护四氧化三铁纳米颗粒,使其达到化学稳定、高分散性等特点。现有技术中一般采用在四氧化三铁纳米颗粒表面包覆二氧化硅的方式达到以上要求。二氧化硅的修饰不仅可以保护四氧化三铁纳米颗粒的磁性内核免于氧化,而且能够提供活性位点进行聚合物功能化,得到具有良好化学惰性和生物相容性的磁性纳米颗粒。但是以上磁性纳米颗粒在用于检测过程中存在效率和灵敏度不够高等缺陷,因此有必要开发一种更为稳定,且高效、灵敏、广谱的捕获不同种类癌细胞的新型功能化复合纳米材料。
发明内容
解决的技术问题:为了克服现有技术的不足,获得一种稳定性好、高分散性,且用于CTCs的高效、灵敏和广谱检测的新型功能化磁性纳米材料,鉴于此,本发明提供了Fe3O4/GO复合纳米材料及其制备方法和应用。
技术方案:Fe3O4/GO复合纳米材料的制备方法,所述方法先通过溶剂热反应制备四氧化三铁纳米微球,然后采用二氧化硅和聚醚酰亚胺对四氧化三铁纳米微球进行表面修饰,同时采用聚丙烯酸对氧化石墨烯进行表面修饰,最后将修饰后的四氧化三铁纳米微球和氧化石墨烯复合制备获得Fe3O4/GO复合纳米材料。
优选的,四氧化三铁纳米微球的制备方法包括以下步骤:
(1)在磁力搅拌下将乙酸钠和六水合三氯化铁溶于乙二醇中,然后转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,100-500℃加热1-20h;
(2)将步骤(1)所得产物磁分离,吸弃上清,无水乙醇洗涤;
(3)将步骤(2)所得产物磁分离,吸弃上清,去离子水洗涤,所得产物即为四氧化三铁纳米微球。
优选的,四氧化三铁纳米微球表面修饰的方法包括以下步骤:
(1)将四氧化三铁纳米微球分散在乙醇溶液中,用氨水调节pH值为8-10;
(2)在机械搅拌条件下,将无水乙醇稀释后的正硅酸乙酯加至步骤(1)所得的溶液中,搅拌过夜;
(3)将步骤(2)产物磁分离,吸弃上清,无水乙醇洗涤;
(4)将步骤(3)产物磁分离,吸弃上清,去离子水洗涤,所得产物即为四氧化三铁-二氧化硅纳米微球;
(5)制备聚醚酰亚胺溶液,加入步骤(4)的四氧化三铁-二氧化硅纳米微球溶液中,超声搅拌1-5h;
(6)将步骤(5)的产物磁分离,吸弃上清,去离子水洗涤,产物即为四氧化三铁-二氧化硅-聚醚酰亚胺纳米微球。
优选的,氧化石墨烯表面修饰的方法包括以下步骤:
(1)分别制备氧化石墨烯水分散液和聚丙烯酸水溶液,将聚丙烯酸水溶液等体积滴加至氧化石墨烯水分散液中,超声分散10-60min;
(2)将步骤(1)的产物离心弃上清,去离子水洗涤,所得产物即为氧化石墨烯-聚丙烯酸纳米材料。
优选的,修饰后的四氧化三铁纳米微球和氧化石墨烯复合的方法包括以下步骤:
(1)将氧化石墨烯-聚丙烯酸纳米材料加入2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中,超声10-40min;
(2)将碳化二亚胺水溶液加入到步骤(1)所得到的溶液中,搅拌均匀;再加入N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐水溶液,室温搅拌均匀;然后离心弃上清;
(3)向步骤(2)的产物中加入四氧化三铁-二氧化硅-聚醚酰亚胺纳米微球水溶液,室温摇床反应6-24h,所得产物磁分离,吸弃上清,去离子水洗涤;
(4)制备聚醚酰亚胺水溶液,并将步骤(3)的产物滴加至聚醚酰亚胺水溶液中,超声10-60min,室温摇床避光反应6-24h;
(5)步骤(4)产物磁分离,吸弃上清,去离子水洗涤,所得产物即为Fe3O4/GO复合纳米材料。
由以上1-5任一所述方法制备获得的Fe3O4/GO复合纳米材料。
以上所述的Fe3O4/GO复合纳米材料在制备癌细胞捕获试剂盒中的应用。
以上所述的Fe3O4/GO复合纳米材料在制备临床癌症的早期筛查和预后评估试剂盒中的应用。
本发明所述Fe3O4/GO复合纳米材料的制备/设计原理在于:氧化石墨烯含有丰富的含氧官能团,如羟基(-OH)、羧基(-COOH)、环氧基(C-O-C)和氢键,因此可以通过π-π相互作用保证其结构的稳定性及在二维平面上具有强吸附性能。本发明利用氧化石墨烯独特的纳米结构、表面积大、以及在水溶液中的溶解性、含氧官能团易修饰的特点来设计用作捕获CTCs的复合纳米材料。聚丙烯酸(PAA)具有无毒、涂膜性能优异等优点,在分子设计上,含有大量的羧基,有利于与氧化石墨烯之间形成氢键。基于此,本发明采用聚丙烯酸对氧化石墨烯进行表面修饰,以使得氧化石墨烯获得更多的羧基,便于后续与四氧化三铁纳米粒子进行连接。
本发明采用二氧化硅和聚醚酰亚胺对四氧化三铁表面进行修饰,以保护四氧化三铁纳米颗粒的磁性内核免于氧化,同时修饰聚醚酰亚胺,四氧化三铁纳米颗粒表面修饰聚醚酰亚胺后能使其表面携带氨基基团。
修饰后的氧化石墨烯表面的羧基与修饰后的四氧化三铁纳米颗粒表面,本发明利用碳化二亚胺水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐水溶液使得四氧化三铁-二氧化硅-聚醚酰亚胺表面的氨基和氧化石墨烯-聚丙烯酸表面的羧基发生脱水缩合反应,形成酰胺键,从而使得四氧化三铁和氧化石墨烯发生结合。结合后的四氧化三铁-氧化石墨烯复合纳米材料表面带负电荷,将其放在聚醚酰亚胺溶液中超声后使其带正电。而“瓦伯格效应”导致癌细胞表面带负电荷,合成的四氧化三铁-氧化石墨烯复合纳米材料则能通过正负电荷相互吸引的原理捕获癌细胞。
有益效果:(1)本发明所述方法首次将水溶性好、比表面积大的氧化石墨烯进行聚丙烯酸修饰,并进一步与四氧化三铁复合,从而制备针对循环肿瘤细胞的高捕获效率复合纳米材料;(2)本发明所述Fe3O4/GO复合纳米材料广谱性地捕获表面带负电荷的癌细胞;(3)本发明所述复合纳米材料采用磁分离方法,具有操作简便、耗时短、灵敏度高、广谱性强、材料成本低的优势。
附图说明
图1是四氧化三铁-二氧化硅-聚醚酰亚胺纳米微球的透射电子显微镜图片,其中Ⅰ为比例尺2μm,Ⅱ为比例尺0.5μm;
图2是氧化石墨烯-聚丙烯酸纳米材料的透射电子显微镜图片,其中Ⅰ为比例尺1μm,Ⅱ为比例尺0.2μm;
图3是Fe3O4/GO复合纳米材料的透射电子显微镜图片,其中Ⅰ为比例尺1μm,Ⅱ为比例尺0.5μm;
图4是采用Fe3O4/GO复合纳米材料从模拟血样中捕获分离的A549细胞diff-quik染色图片及其局部放大图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换,均属于本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
Fe3O4/GO复合纳米材料采用以下方法制得:
(1)制备四氧化三铁纳米微球,具体步骤如下:
①在磁力搅拌下将1-5g乙酸钠和0.1-2g六水合三氯化铁溶于10-50mL乙二醇中,得到均匀黄色溶液;
②将步骤①中所得溶液转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中在100-500℃条件下加热1-20h;
③将步骤②中所得产物磁分离,吸弃上清,无水乙醇洗涤3次;
④将步骤③中所得产物磁分离,吸弃上清,去离子水洗涤3次,所得产物即为四氧化三铁纳米微球。
(2)四氧化三铁纳米微球的表面修饰,具体步骤如下:
①将50-500mg四氧化三铁纳米微球分散在10-500mL无水乙醇与水的混合物(V无水乙醇/V水=1/1~10/1)中,用氨水调节pH值为8-10;
②在机械搅拌条件下,将10-500μl正硅酸乙酯用1-20mL无水乙醇稀释后缓慢加入到步骤①所得溶液中,搅拌过夜;
③将步骤②中所得产物磁分离,吸弃上清,无水乙醇洗涤3次;
④将步骤③中所得产物磁分离,吸弃上清,去离子水洗涤3次,所得产物即为四氧化三铁-二氧化硅纳米微球;
⑤称取100-500mg聚醚酰亚胺,溶解于10-100ml去离子水中,制备聚醚酰亚胺溶液;
⑥将10-100mL的聚醚酰亚胺溶液(1-100mg/mL)加入至10-50mL的四氧化三铁-二氧化硅纳米微球溶液(0.1-10mg/mL)中,超声搅拌1-5h;
⑦将步骤⑥中所得产物磁分离,吸弃上清,去离子水洗涤3次,产物即为四氧化三铁-二氧化硅-聚醚酰亚胺纳米微球(如图1所示)。
(3)氧化石墨烯的表面修饰,具体步骤如下:
①称量10-50mg氧化石墨烯于研钵中,研磨至粉末状,加入10-50mL去离子水,超声分散10-60min,得到氧化石墨烯水分散液;
②称量10-500mg聚丙烯酸,加入10-50mL去离子水并超声10-60min至完全溶解,得到聚丙烯酸溶液;
③将步骤②中得到的聚丙烯酸溶液等体积滴加到步骤①中得到的氧化石墨烯水分散液中,超声分散10-60min;
④将步骤③中所得的产物以17000×g,离心20min,弃上清;
⑤去离子水洗3次,所得产物即为氧化石墨烯-聚丙烯酸纳米材料(如图2所示)。
(4)制备合成四氧化三铁/氧化石墨烯复合纳米材料,具体步骤如下:
①将1-50mg步骤(3)中所得到的氧化石墨烯-聚丙烯酸纳米材料加入到1-50mL 2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中(PH 5.5~6.0),超声10-40min;
②将0.1-5mL碳化二亚胺水溶液(1-20mg/mL)加入到步骤①中所得到的溶液中,搅拌均匀;
③将1-5mL N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐水溶液(1-50mg/mL)加入到步骤②中所得到的溶液中,于室温搅拌15min;
④将步骤③所得溶液以17000×g离心20min,吸弃上清;
⑤将1-5mL步骤(2)中所得到的四氧化三铁-二氧化硅-聚醚酰亚胺纳米微球水溶液(0.1-10mg/mL)加入步骤④中所得产物中,室温摇床反应6-24h;
⑥将步骤⑤所得产物磁分离,吸弃上清,去离子水洗3次;
⑦称量100-500mg聚醚酰亚胺分散于10-50mL去离子水中,超声分散10-60min,制备聚醚酰亚胺水溶液;
⑧将10-50mL步骤⑥中所得产物(0.1-10mg/mL)滴加到1-50mL步骤⑦所得聚醚酰亚胺水溶液(1-50mg/mL)中,并继续超声10-60min;
⑨将步骤⑧所得溶液置于室温摇床避光反应6-24h;
⑩将步骤⑨所得产物磁分离,吸弃上清,用去离子水洗涤3次,所得产物即为四氧化三铁/氧化石墨烯复合纳米材料(如图3所示)。
实施例2
采用实施例1所述Fe3O4/GO复合纳米材料进行癌细胞捕获,具体步骤如下:
(1)制备癌细胞悬液:
将1×105~1×106个A549细胞加入PBS缓冲溶液中,制备癌细胞悬液。将1×105~1×106个A549细胞分散于1-4mL PBS缓冲液中,制备同等体积、同等癌细胞密度的PBS悬液,作为对照组癌细胞。
(2)四氧化三铁/氧化石墨烯复合纳米材料与癌细胞悬液共孵育:
①称取适量四氧化三铁/氧化石墨烯复合纳米材料,使其分散于磷酸盐缓冲溶液(pH=7.2)中;
②吸取适量纳米材料溶液,加入1mL实施例5所得癌细胞悬液中,使其浓度为1-100μg/mL,颠倒混匀后,置于1-10℃孵育5-10分钟。
(3)癌细胞的捕获分离:
①步骤(2)所得的四氧化三铁/氧化石墨烯复合纳米材料与癌细胞的混合悬液,置于磁力架上,置于1-10℃静置5-10分钟;
②吸弃上清;
③将沉淀细胞以1mL PBS重悬,即为捕获癌细胞悬液。
(4)捕获癌细胞的鉴定及计数:
①从步骤(3)中所得捕获癌细胞悬液中吸取200μL细胞悬液,置于甩片机中以800-1000rpm离心3-5min甩片;
②将以上细胞甩片样品以diff-quik染色液染色,显微镜拍照,进行捕获细胞种类鉴定(图4);
③分别从步骤(1)所得对照组癌细胞悬液及步骤(3)中所得捕获癌细胞悬液中吸取20μL细胞悬液,置于countstar中拍照计数;
④癌细胞捕获效率=捕获癌细胞总数/对照组癌细胞总数×100%
运用上述方法,我们将癌细胞从癌细胞悬液中成功捕获分离,结果如图4所示。Diff-quik图片结果显示,利用本实施例方法,可有效将癌细胞从癌细胞悬液中捕获分离。本发明方法对A549细胞的捕获效率为90.6%。
综上所述,本发明创新性的设计、合成四氧化三铁/氧化石墨烯复合纳米材料,用于CTC的高效、灵敏、广谱检测。相较于抗原抗体、微流控等其他方法捕获CTCs,本发明方法灵敏度高、材料造价低廉,捕获CTCs所用磁分离操作流程简便,可对不同种类的癌细胞实现广谱性捕获。本发明方法有助于于临床癌症的早期筛查及癌症患者的预后评估。
Claims (8)
1.Fe3O4/GO复合纳米材料的制备方法,其特征在于,所述方法先通过溶剂热反应制备四氧化三铁纳米微球,然后采用二氧化硅和聚醚酰亚胺对四氧化三铁纳米微球进行表面修饰,同时采用聚丙烯酸对氧化石墨烯进行表面修饰,最后将修饰后的四氧化三铁纳米微球和氧化石墨烯复合制备获得Fe3O4/GO复合纳米材料。
2.根据权利要求1所述的Fe3O4/GO复合纳米材料的制备方法,其特征在于,四氧化三铁纳米微球的制备方法包括以下步骤:
(1)在磁力搅拌下将乙酸钠和六水合三氯化铁溶于乙二醇中,然后转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,100-500℃加热1-20h;
(2)将步骤(1)所得产物磁分离,吸弃上清,无水乙醇洗涤;
(3)将步骤(2)所得产物磁分离,吸弃上清,去离子水洗涤,所得产物即为四氧化三铁纳米微球。
3.根据权利要求1所述的Fe3O4/GO复合纳米材料的制备方法,其特征在于,四氧化三铁纳米微球表面修饰的方法包括以下步骤:
(1)将四氧化三铁纳米微球分散在乙醇溶液中,用氨水调节pH值为8-10;
(2)在机械搅拌条件下,将无水乙醇稀释后的正硅酸乙酯加至步骤(1)所得的溶液中,搅拌过夜;
(3)将步骤(2)产物磁分离,吸弃上清,无水乙醇洗涤;
(4)将步骤(3)产物磁分离,吸弃上清,去离子水洗涤,所得产物即为四氧化三铁-二氧化硅纳米微球;
(5)制备聚醚酰亚胺溶液,加入步骤(4)的四氧化三铁-二氧化硅纳米微球溶液中,超声搅拌1-5h;
(6)将步骤(5)的产物磁分离,吸弃上清,去离子水洗涤,产物即为四氧化三铁-二氧化硅-聚醚酰亚胺纳米微球。
4.根据权利要求1所述的Fe3O4/GO复合纳米材料的制备方法,其特征在于,氧化石墨烯表面修饰的方法包括以下步骤:
(1)分别制备氧化石墨烯水分散液和聚丙烯酸水溶液,将聚丙烯酸水溶液等体积滴加至氧化石墨烯水分散液中,超声分散10-60min;
(2)将步骤(1)的产物离心弃上清,去离子水洗涤,所得产物即为氧化石墨烯-聚丙烯酸纳米材料。
5.根据权利要求1所述的Fe3O4/GO复合纳米材料的制备方法,其特征在于,修饰后的四氧化三铁纳米微球和氧化石墨烯复合的方法包括以下步骤:
(1)将氧化石墨烯-聚丙烯酸纳米材料加入2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中,超声10-40min;
(2)将碳化二亚胺水溶液加入到步骤(1)所得到的溶液中,搅拌均匀;再加入N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐水溶液,室温搅拌均匀;然后离心弃上清;
(3)向步骤(2)的产物中加入四氧化三铁-二氧化硅-聚醚酰亚胺纳米微球水溶液,室温摇床反应6-24h,所得产物磁分离,吸弃上清,去离子水洗涤;
(4)制备聚醚酰亚胺水溶液,并将步骤(3)的产物滴加至聚醚酰亚胺水溶液中,超声10-60min,室温摇床避光反应6-24h;
(5)步骤(4)产物磁分离,吸弃上清,去离子水洗涤,所得产物即为Fe3O4/GO复合纳米材料。
6.由权利要求1-5任一所述方法制备获得的Fe3O4/GO复合纳米材料。
7.权利要求6所述的Fe3O4/GO复合纳米材料在制备癌细胞捕获试剂盒中的应用。
8.权利要求6所述的Fe3O4/GO复合纳米材料在制备临床癌症的早期筛查和预后评估试剂盒中的应用。
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