KR20150057262A - 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 압타머 및 그 제조방법이 개시된다. 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 특이적으로 결합하는 압타머의 제조방법은, 양 끝에 PCR용 프라이머 영역을 가지며 중앙에 무작위로 배열된 40~60개의 염기를 가지는 DNA들을 포함하는 DNA 라이브러리와 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 결합버퍼 용액에 혼합하여 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)-DNA 결합체를 유도하는 단계(S1); 상기 DNA 라이브러리와 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 혼합용액을 원심분리하여 상기 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)-DNA 결합체를 추출하는 단계(S2): FACS(fluorescense activated cell sorter)를 사용하여, 상기 살모넬라-DNA 결합체로부터 DNA를 분리하는 단계(S3); 상기 분리된 DNA를 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭시키는 단계(S4); 상기 증폭된 DNA와 비-표적 미생물을 결합 버퍼 용액에 혼합하여 비-표적 미생물-DNA 결합체를 유도하는 단계(S5); 및 상기 농축된 DNA와 비-표적 미생물의 혼합용액을 원심분리하여 상기 비-표적 미생물과 결합하지 않은 DNA를 추출하는 단계(S6)를 포함한다.
Description
본 발명은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 압타머(aptamer) 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
식중독균들은 부패한 채소, 농수산물, 각종 저장식품, 식품제조공정을 통하여 인체에 감염되면 식중독을 일으킬 수 있으므로, 식품의 안전성을 제고하고 보건위생환경을 개선하는 측면에서 이들 식중독균을 보다 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 기술을 개발하는 것에 관심이 높다. 그러나 지금까지 식중독균에 대한 효율적인 신속 검출법은 이상적인 리간드가 없어 어려움을 겪고 있다.
식중독균에 대한 신속 검출법으로 생물발광과 미생물대사결과의 반응산물을 이용하는 방법은 상대적으로 선택성이 결여되어 있으므로 단지 식중독균에 대한 일반적인 지표로만 활용될 수 있을 뿐이고, 부가적으로 선택성이 높은 면역학적 방법과 핵산중합을 사용하여 명확한 동정을 해야 하는 추가적인 단계가 필요하고 특별한 장비 및 실험시설이 있어야 하는 문제점이 있으며, 아울러 효소면역측정과 면역형광측정의 경우는 사용하는 항체의 불안전성으로 인해 물질의 보관 및 유통에 문제가 있으며 또한 항체는 식중독균의 세포벽에 의한 선택성 및 감도에 대한 단점이 있다.
한편, 압타머(Aptamer)는 저분자의 올리고 뉴클레오타이드로 표적분자에 특이적이고 선택적으로 결합한다. 널리 알려진 바와 같이 핵산은 뉴클레오티드가 공유결합으로 연결된 선형적인 다합체로서, 뉴클레오티드는 작은 유기화합물로서 인산, 당 및 퓨린(아데닌 혹은 구아닌) 혹은 피리미딘(사이토신, 티미딘, 우라실)으로 이루어져 있다.상호작용에 의해 결합하여 독특한 입체구조를 형성하는데, 이런 구조는 단일가닥의 염기서열에 의해 결정된다.
일반적으로 DNA와 RNA와 같은 핵산들은 세포구조 및 효소 등의 활성을 가진 단백질들을 발현하기 위한 정보의 저장체이나, 1982년에 RNA가 특정한 구조를 형성함으로써 효소로서의 활성도 갖고 있다는 보고가 나온 후로 핵산이 구조적인 특성과 그에 따른 특정 기능에 대한 많은 보고가 있다. 핵산은 4개의 염기의 반복으로 구성되어 높은 다양성을 유지하여 많은 입체구조를 형성하며 이런 입체구조는 특정물질과 상호작용을 하여 복합체를 형성하여 안정화된다.
이러한 특성으로 인해 핵산이 단백질을 포함하는 특정물질에 대하여 하나의 리간드(ligand)로서 작용할 수 있는 바, 다양한 염기순서로 배열된 단일가닥핵산이 조합된 라이브러리로부터 일정한 선별과정과 염기서열결정을 통하여 높은 결합력과 특이성으로 특정물질과 결합하는 압타머를 제작할 수 있다.
특정물질과 결합하는 핵산을 선별하는 방법을 셀렉스(SELEX, Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment)라 하고, 이런 SELEX를 통하여 자연 상태에서 핵산과 결합할 수 있는 단백질뿐만 아니라 핵산과 결합하고 있지 않은 단백질을 비롯한 여러 생체분자와도 매우 높은 친화력으로 결합할 수 있는 분자들이 선별되고 있다.
최근 이러한 압타머를 이용하여 질병을 진단하고 치료하는 다양한 시도가 이루어지고 있다. 특히, 질병의 원인이 되는 각종 병원체들의 존재를 검출하는데 압타머를 이용함으로써 질병을 미연에 방지할 수 있다.
그러나 일반적으로 압타머는 하나의 표적 물질에만 결합하는 것이 아니라 유사한 구조를 가지는 다른 물질에도 결합할 수 있어 질병의 진단이나 병원체의 검출 정확도가 떨어지는 문제가 있다.
본 발명은 식중독을 일으키는 병원균, 특히 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 압타머를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 압타머의 제작방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 60에 기재된 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가지는 단일가닥 DNA 압타머가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 특이적으로 결합하는 압타머의 제조방법은, 양 끝에 PCR용 프라이머 영역을 가지며 중앙에 무작위로 배열된 40~60개의 염기를 가지는 DNA들을 포함하는 DNA 라이브러리와 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 결합버퍼 용액에 혼합하여 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)-DNA 결합체를 유도하는 단계(S1); 상기 DNA 라이브러리와 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 혼합용액을 원심분리하여 상기 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)-DNA 결합체를 추출하는 단계(S2): FACS(fluorescense activated cell sorter)를 사용하여, 상기 살모넬라-DNA 결합체로부터 DNA를 분리하는 단계(S3); 상기 분리된 DNA를 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭시키는 단계(S4); 상기 증폭된 DNA와 비-표적 미생물을 결합 버퍼 용액에 혼합하여 비-표적 미생물-DNA 결합체를 유도하는 단계(S5); 및 상기 농축된 DNA와 비-표적 미생물의 혼합용액을 원심분리하여 상기 비-표적 미생물과 결합하지 않은 DNA를 추출하는 단계(S6)를 포함한다.
상기 결합버퍼 용액은 인산버퍼 용액일 수 있다.
또한, 상기 비-표적 미생물은 대장균 및 살모넬라 엔테리타이디스 중 적어도 하나일 수 있다.
본 발명의 상기 실시예에 따른 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 특이적으로 결합하는 압타머의 제조방법은, 상기 증폭된 DNA를 원심분리 필터를 사용하여 농축하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭되는 주형의 농도는 0.1%~30%의 범위를 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 특이적으로 결합하는 압타머의 제조방법은, 상기 S1 및 S2 단계를 2회 이상 반복한 이후 상기 S3 단계를 수행하도록 변형될 수 있다.
이 경우, 상기 S3 단계를 수행한 이후, 상기 S6 단계를 2회 이상 반복 수행하도록 구성될 수 있다.
또한, 상기 S6 단계를 2회 이상 반복한 이후, 상기 S1 및 S2 단계를 2회 이상 반복하고 상기 단계 S3를 수행하도록 변형될 수 있다.
이하, 첨부도면과 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이하의 구체적 실시예는 본 발명의 설명을 위한 예시적 목적으로 기술되었으며, 본 발명의 범위는 이하의 실시예에 의해 제한되지 않는다.
본 발명에 따르면, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 유사한 식중독균인 대장균, 황색포도상구균 등과는 결합하지 않으면서 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과는 특이적으로 결합하는 서열목록 1 내지 60의 단일가닥 DNA 압타머단일가닥 DNA 압타머 및 그 제조방법을 제공함으로써, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 신속하고 정확한 검출이 가능해지게 된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일가닥 DNA 압타머의 제조방법에 사용되는 SELEX 및 counter SELEX의 개념을 도시한 다이어그램이다.
도 2는 PCR 과정을 거친 단일가닥 DNA의 전기영동 결과를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 압타머의 제조과정을 도시한 순서도이다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일가닥 DNA 압타머의 유세포 분석 결과를 도시한 도면이다.
도 2는 PCR 과정을 거친 단일가닥 DNA의 전기영동 결과를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 압타머의 제조과정을 도시한 순서도이다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일가닥 DNA 압타머의 유세포 분석 결과를 도시한 도면이다.
도 1을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 단일가닥 DNA 압타머의 제조방법을 보다 상세히 설명한다.
DNA 풀의 형성
황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산의 선별을 위해, 아래와 같이 양끝에 프라이머 결합용 고정서열을 가지며 중앙에 60개의 염기가 무작위로 배열된 염기서열을 가지는 DNA들로 구성된 DNA 라이브러리(100)를 준비하였다.
5'-[고정서열1]-N60-[고정서열2]-3'
여기서 고정서열1 및 고정서열2는 DNA 라이브러리(100)에 포함된 DNA들의 고정된 부위이며 N60은 60개의 A, G, T, C등의 염기들이 무작위로 배열된 염기서열이다.
PCR시에 이용되는 FW 프라이머는 위의 염기배열의 밑줄 친 염기들의 5' 말단의 고정서열1과 염기결합을 할 수 있고 PCR의 RE 프라이머는 위의 염기배열의 밑줄 친 염기들의 3' 말단의 고정서열2와 염기결합을 할 수 있다. 또한, 5' 말단 및 3' 말단의 고정서열에는 각각 제한효소가 인식하는 특정 염기서열을 포함한다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 5' 말단의 고정서열에는 제한효소 EcoRI의 인식서열인 GAATCC가 포함되어 있으며, 3' 말단의 고정서열에는 제한효소 BamHI의 제한효소의 인식서열인 GGATCC가 포함되어 있다.
DNA 라이브러리(100) 내의 단일가닥 DNA를 표적 미생물(300)인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 결합시키기 전에, 95℃에서 10분, -20℃에서 10분간 열처리하여 변성시켰다. 이러한 열변성을 통해 유도된 3차원 구조를 가지는 단일가닥 DNA들(200)이 단일가닥 DNA 풀을 구성한다.
1. 결합 특이성을 가지는 단일가닥 DNA의 선별(SELEX)
무작위 서열을 포함하는 단일가닥 DNA들(200)을 표적 미생물(300)인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 함께 121℃에서 15분간 고압멸균된 결합버퍼용액(인산 버퍼용액, Phosphate buffered saline, pH 7.2)에 넣고 혼합하여 상온에서 반응시켜 결합을 유도한다. 이러한 결합버퍼용액은 표적 미생물인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 활동에 영향을 미치지 않으므로 표적 미생물(300)인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)이 최적의 상태에서 단일가닥 DNA들(200)과 결합할 수 있도록 한다.
혼합액 중의 표적 미생물-단일가닥 DNA 결합체(310)와 미결합 단일가닥 DNA(210)를 분리하기 위해 10,000g에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리는 살아 있는 표적 미생물에 최대한 영향을 주지 않은 상태로 표적 미생물-단일가닥 DNA 결합체(310)를 분리하는 바람직한 방법이다.
원심분리 직후, 표적 미생물과 결합하지 않은 미결합 단일가닥 DNA(210)를 제거하기 위해 상층액을 분리한다. 표적 미생물-단일가닥 DNA 결합체(310)는 남은 혼합 용액에 존재한다. 표적 미생물-단일가닥 DNA 결합체(310)의 단일가닥 DNA는 본 발명에 따른 압타머 후보 DNA가 된다.
미생물-단일가닥 DNA 결합체(310)만 남은 혼합 용액에 동일한 부피의 멸균 증류수를 첨가하여 95℃에서 10분간 가열하여 열처리함으로써 단일가닥 DNA를 표적 미생물로부터 용리하고, 이 용액을 10,000g에서 10분간 원심분리한다. 용리된 압타머 후보 단일가닥 DNA(220)는 원심분리 후 용액의 상층에 부유하므로, 상층액만을 적출하여 PCR 증폭을 수행한다.
이때, 식중독균과 결합된 단일가닥 DNA의 양이 매우 적기 때문에 PCR 증폭시 주형 농도를 0.1%부터 30%까지의 범위에서 다양하게 조절하여 시행하였다.
이때, 표적 미생물과 결합된 단일가닥 DNA가 미량이므로 PCR 증폭 후에도 DNA 밴드 확인이 어려운 문제가 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, PCR 증폭 후, 원심분리 필터를 사용하여 농축과정을 거칠 수 있다.
도 2는 원심분리 전후의 DNA 전기영동 분석 결과를 도시한 도면이다.
C1, C2는 SELEX 시작 전의 DNA 라이브러리 내의 DNA 분석 결과이며, S1-1은 1차 SELEX에서 추출된 단일가닥 DNA, S1-2는 S1-1의 단일가닥 DNA를 원심분리 필터를 사용하여 20배로 농축한 때의 분석결과이다. S5-1과 S5-2는 각각 5차 SELEX에서 추출된 단일가닥 DNA, S5-1의 단일가닥 DNA를 원심분리 필터를 사용하여 20배로 농축한 때의 분석결과이다.
도 2에 잘 나타나 있듯이, DNA 밴드는 SELEX 횟수가 증가할수록 확인이 쉬워지지만, 원심분리 필터에 의해 농축과정을 거치면 현저하게 분명해진다. 1차 SELEX에서 농축된 DNA(S1-2)는 5차 SELEX에서 농축되지 않은 DNA(S5-1)에 비해서도 DNA 밴드가 더 분명하게 확인되며, 5차 SELEX에서 농축된 DNA(S5-2)는 밴드가 확실하게 관찰된다.
이와 같이, SELEX에서 원심분리 필터를 사용하여 DNA를 농축함으로써, SELEX 성공률이 현저하게 증가될 수 있다.
1차 SELEX에서 결합된 단일가닥 DNA만을 선택적으로 증폭한 후, 동일한 과정으로 10회에 걸쳐 표적 미생물과 선택적으로 결합하는 단일가닥 DNA를 획득하였다.
2. 비-표적(non-target) 미생물과 결합하는 압타머 후보 단일가닥 DNA의 제외(counter-SELEX)
10차 SELEX 종료 후, 비-표적 미생물과 결합하는 단일가닥 DNA를 제외하기 위해 카운터-SELEX(counter-SELEX)를 실시하였다.
본 발명의 일실시예에서는 대장균 및 살모넬라 엔테리타이디스(Salmonella enteritidis)에 대해 각각 6회에 걸쳐 상기 SELEX와 동일한 조건으로 카운터-SELEX를 실시하였다.
즉, 압타머 후보 단일가닥 DNA들(220)을 비-표적 미생물(400)과 결합 버퍼용액에 혼합하여 결합을 유도하고 원심분리에 의해 비-표적 미생물-단일가닥 DNA 결합체(410)와 미결합 단일가닥 DNA(230)를 분리한 후, 미결합 단일가닥 DNA(230)만PCR 증폭하면, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 특이적으로 결합하면서 비-표적 미생물, 예컨대 대장균 및 살모넬라 엔테리타이디스(Salmonella enteritidis)과는 결합하지 않는 단일가닥 DNA를 얻을 수 있다.
3. FACS를 이용한 유세포 분석 및 표적세포 분리
본 발명에 따른 압타머 제작 방법은 개선된 선택성을 가지는 압타머의 제작을 위해, FACS(fluorescense activated cell sorter)를 이용한 유세포 분석 및 표적세포 분리를 수행하도록 구성될 수 있다.
FACS의 작동원리는, 우선 형광표지한 세포의 부유액을 압축공기로 밀어내어, 노즐의 중심부에서 유출시킨다. 이 노즐은 특수한 구조를 하고 있어서, 시드액(seed liquid)이 항상 세포 부유액의 흐름을 감싸듯이 해서 유출하며, 세포는 이 시드액에 보호되어서 유출된다. 초음파 노즐바이브레이터가 매초 약 40, 000회 이상의 진동을 노즐에 가하면, 진동에 의해 노즐에서 유출한 세포를 포함하는 수류가 매초 약 40,000개의 물방울로 바뀌어진다. 한편, 집광 렌즈로 가늘게 죄어진 레이저 빔이 물방울이 되기 직전의 수류에 조사되어 통과하는 세포에 비춰진다. 레이저 빔이 산란하며 발생한 산란광과 형광은 수광관에서 전기신호로 바뀌어져 컴퓨터로 보내진다. 거기서 각기 목적에 따라 여러가지 해석이 실시된다. 만일 이때에 설정된 조건에 맞는 세포가 있으면, 그 세포를 포함하는 물방울은 충전되고, 그 뒤 편광판의 전기장을 통과할 때에 그 충전에 의해 오른쪽 또는 왼쪽으로 분리되기에 이른다. 그리고 충전되지 않은 물방울은 바로 밑으로 낙하한다. 충전은 ＋, －의 양쪽으로 이뤄지므로 동시에 2종류의 세포군의 선별이 가능하다. 또 이들 일련의 분리과정을 모두 무균적으로, 또한 저온에서 조작하는 일도 가능하다.
측정파라미터로서 산란광과 형광강도 이외에 형광의 색조나 형광편광까지 선택할 수 있고, 또 조합시키는 일도 가능하다. 컴퓨터로 해석된 이들 정보를 브라운관상에서 표시할 수가 있고, 이들 표시에서 선별영역을 결정할 수가 있다.
FACS에 의한 해석의 대상은 DNA나 RNA, 림프구, 백혈구, 항원, 면역글로불린, 효소, 바이러스, 화학물질, 염색체 등 응용범위가 다양하고, 면역학, 종양학 등의 생명과학분야를 포괄하고 있다.
이와 같은 FACS를 이용하여 유세포 분석과 표적세포 분리를 동시에 수행함으로써 선택성이 개선된 압타머를 제작할 수 있다.
4. SELEX, counter-SELEX 및 FACS 분리의 반복에 의한 단일가닥 DNA 압타머의 제작방법
표적 미생물, 즉 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 압타머의 선택성을 향상시키고 압타머 제조의 효율성을 개선시키기 위한 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, SELEX, counter-SELEX 및 FACS를 이용한 세포 분리 과정을 반복하여 실시되는 단일가닥 DNA 압타머 제작 방법이 제공될 수 있다.
도 3을 참조하여 본 발명의 이와 같은 실시예를 설명하면 다음과 같다.
먼저 SELEX를 3회 반복하여 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 후보군을 추출한다(S1).
1차로 추출된 단일가닥 DNA 후보군에 대해 FACS를 이용하여 유세포 분석 및 표적세포 분리를 수행한다(S2).
분리된 단일가닥 DNA 후보군에 대해 counter SELEX를 3회에 걸쳐 실시하고, 비표적 미생물과 결합하지 않은 단일가닥 DNA를 추출한다(S3).
S3에서 추출된 단일가닥 DNA를 대상으로 S1~S3의 과정, 즉 SELEX, FACS를 이용한 세포분리, 및 counter-SELEX를 반복한다(S4, S5, S6).
S6의 2차 counter-SELEX에서 추출된 단일가닥 DNA를 대상으로 SELEX를 4회 실시하고 표적 미생물, 즉 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 결합한 단일가닥 DNA를 추출한다(S7).
S7에서 추출된 단일가닥 DNA-황색포도상구균 결합체를 FACS를 이용하여 세포 분리한다(S8).
상기와 같이, 3회의 SELEX - 1회의 FACS 세포분리 - 3회의 counter SELEX로 구성된 과정을 반복하고 마지막 counter SELEX에서 얻어진 단일가닥 DNA에 대해 4회의 SELEX-FAC 유세포 분석를 수행함으로써 선택성이 향상된 압타머를 보다 효율적으로 얻을 수 있게 된다.
이상에서는 3회의 SELEX - 1회의 FACS 유세포 분석 및 세포분리 - 3회의 counter SELEX로 구성된 과정을 2회에 걸쳐 반복하는 것으로 설명하였으나, 각각의 SELEX 및 counter SELEX의 실시회수는 다를 수 있으며(예컨대, 4회의 SELEX- - 1회의 FACS 유세포 분석 및 세포분리 - 2회의 counter SELEX, 또는 4회의 SELEX - 1회의 FACS 유세포 분석 및 세포분리 - 4회의 counter SELEX), 과정의 반복 횟수도 3회 이상이 될 수 있다.
5. 획득된 압타머의 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 결합 특이성 검증
최종적으로 얻어진 단일가닥 DNA 압타머와 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 결합 특이성을 확인하기 위해 FACS를 이용하여 유세포 분석하였다. 유세포 분석시, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 압타머와의 결합력을 확인하기 위해 형광표지된 압타머를 사용하였다.
유세포 분석을 통해 특이적 결합이 확인된 단일가닥 DNA의 염기서열은 아래의 표 1과 같다.
| 서열번호 | 염기서열 |
| 1 | GCGTGCAGCGGGGGCTGCGCGGTGGAGTGCTGTGGGCG |
| 2 | ACGGGCGTGGGAGGCAATGCCTTGCTTGTAGGCTTCCCCTGTGCGCG |
| 3 | CACGCGCAAACAGATTAACACTCCGCCTAAGTCTGCCGCACGC |
| 4 | CACGCGCAAACAGATTAACACTCCGCCTAAGTCTGCCGCCCGT |
| 5 | GCGTGCAGCAGGGGCTGTGTCGCGGTCGGTAGTGCTGTGGTGCG |
| 6 | GCGTGGCGGTCGGTTGCGGCGGCTCAGGGGAGGTGTGCGGCGCG |
| 7 | ACGTGCAGCGGGCTGGTATGTGACATCGATGCTGCTGCGGGGCG |
| 8 | GCGTGCAGAGGCGTACCACGAGGGTCGTGCAGTCCCTCTGCGCG |
| 9 | GCGTGTCGGTGTCGTCCGGTGGCTGTGGGGCTGGGTGTTGCGCG |
| 10 | GCGTGCGGAGCCAGGATGGGAGGTCTGTAGGTCTGCGGGGCGTG |
| 11 | GCGTGCAGCGGGCTGGTATGTGACATCGATGCTGCTGCGGGGCG |
| 12 | GCGTGCAGAGGCGTACCACGAGGGTAGTGCAGTCCCTCTGCGCG |
| 13 | ACGTGCAGCGGGCTGGTATGTGACATCGATGATGCTGCGGGGCG |
| 14 | GCGTGTCGGTGTCTGCCGGGGGATGTGGAGGCTGGGTGTTGCGCG |
| 15 | GCGTGGGCGGGCTACCTGGCTAGTACGCCATGATGCCTGCACGCG |
| 16 | GCGTGGGGCGACAGGGTGCGTCGTCCGCAATCTGCTCTGCGCCG |
| 17 | GCGTGCAGCAGGTGCTGTGTCGCGGTCGGTAGTGCTGTGGTGCG |
| 18 | GCGTGCAGCAGGGGCTGTGTCGCGGTCGGTAGTGATGTGGTGCG |
| 19 | GCGTGCGGAGCCAGGATGGGAGGTCTGTATGTCTGCGGGGCGTG |
| 20 | GCGTGCGGAGCCAGGATGGGAGGTCTGTAAGTCTGCGGGGCGTG |
| 21 | GCGTGCAGCAGGGGCTGTGTCGAGGTCGGTAGTGCTGTGGTGCG |
| 22 | GCGTGACGTCAGAGCGGGTAGCTCGTCGGGTATAGGTGCGCGCG |
| 23 | GCGGGCGTGGGAGGCAATGCCTTGATTGTAGGCTTCCCCTGTGCGCG |
| 24 | GCGTGCAGCAGGGGCTGTGTCGCTGTCGGTAGTGCTGTGGTGCG |
| 25 | GCGTGCAGAGGCGTACCACGAGGGTCGTACAGTCCCTCTGCGCG |
| 26 | GCGTGCAGCAGGGTCTGTGTCGAGGTCGGTAGTGCTGTGGTGCG |
| 27 | GCGTGCAGCAGGGGCTGTGTCGCGGTCGGTAGTGCTGTGGGGCG |
| 28 | GCGTGTAGGTGTCGTCCGGTGGCTGTGGGGCTGGGTGTTGCGCG |
| 29 | ACGGGCGTGGGAGGCAATGCCTTGCTTGTAGGCTTCCCCTGTGCGCG |
| 30 | ACGTGCAGAGGCGTACCACGAGGGTCGTGCAGTCCCTCTGCGCG |
| 31 | ACGTGCAGCCGGAAGACATCGGCCGGTCATTCTGACTTGGCGCGGGTGGATCCACCAGCCACCAGACCGAACACGCGACGGTGAGACAGTGACGCTACGCC |
| 32 | GCGTGCAGAAGGGGCTGTGTCGCGGCCGGCAGTGCCTGCGGTGCG |
| 33 | TGGTGCAGCGGGCTGGTATGTGACATCGATGCTGCTGCGGGGCG |
| 34 | GCGTGCAGCAGGGGCTGTGTCGCGGTCGGTATTGCTGTGGTGCG |
| 35 | ACGTGGGGCGACAGGGTGCGTCGTCCGCAATCTGCTCTGCGCCG |
| 36 | GCGTGCAGCAGGGGCTGTGTCGCGGTCTGTAGTGCTGTGGTGCG |
| 37 | GCGTGCAGCAGGGTCTGTGTCGCGGTCGGTAGTGCTGTGGTGCG |
| 38 | ACGTGAAGCCAGCCAGGGTTGCTTCCCGGTCCACTTCTTGCCGG |
| 39 | GCGTGCAGCAGGGGCTGTGTCACGGTCGGTAGTGCTGTGGTGCG |
| 40 | ACGTGAAGCCAGCCAGGGTTGCTTCCCGTTCCACTTCTTGCCGGGGTGGATCCCGGGAGATCAGCTTGCTCGTGGGTAGCGCCGGCCTGCACCA |
| 41 | GGCGTAGCGTCACTGTCTCACCGTCGCGTGTTCGGTCTGGTGGCGAGTGGATCCACCCGCACTGCAGACGTACCTGCTATTCGGGGAAATGTTCTGCACCGT |
| 42 | GCGTGCAGCAGGGGCTGTGTCGCTGTCGGTAGTGCTGTGGTGCG |
| 43 | GCGTGCAGAGGCGTACCACGATGGTCGTGCAGTCCCTCTGCGCG |
| 44 | CACGCGCAAACAGATTAACACTCCGCCTAAGTCTGCCGCACGC |
| 45 | GCGTGCAGCAGGGCTGTGTCGCGGTCGGTAGTGCTGGGTGCG |
| 46 | GCGTGCAGCGGGGTCCCGGGCGTGGTAGTGCTGTGGGCG |
| 47 | GCGTGCAGCGGGTACCACGAGGGTGGTAGTGCTGCGGCGCG |
| 48 | GCGTGCAGCAGGGGCTGTGTCGCGGTCGGTAGTTGTGGTGCG |
| 49 | GCGTGCAGCGGGGGCTGTGGCGCGGTGGTAGTGCTGTGGGCG |
| 50 | GCGTGCAGCAGGGCTGTGTCGGGTCGGTACGGCTGTGGGCG |
| 51 | GCGTGCAGCGGGTGCAGGGCTGGTAGTGCTGCGGCGCG |
| 52 | GCGTGCAGAGGTACCTCGGCCTGAGTCCGCGCG |
| 53 | GCGTGCAGCGGGGGCTGTGCGCGGTCGGTAGTGCCGGGCGCG |
| 54 | GCGTGCAGAAGGTACCTCGGCCTGAGTCCGCGCG |
| 55 | GCGTGCAGCGGGCGTTTGGCGTCGATGTGCTGTGGTGCG |
| 56 | GCGTGCAGCAGGGGCTGTGTCGCGGTAGGTAGTGCTGTGGTGCG |
| 57 | GCGTGCAGAGGCGTACCACGAGGGTCGTGCAGTCCCTCTGTGCG |
| 58 | GCGTGCAGCAGGGGCTGTGTAGCGGTCGGTAGTGCTGTGGTGC |
| 59 | GCGTGCAGCGGGCTGGTATGTGAAATCGATGCTGCTGCGGGGCG |
| 60 | GCGTGCAGCAGTGGCTGTGTCGCGGTCGGTAGTGCTGTGGTGCG |
도 4에 도시된 바와 같이, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)만 분석한 결과(a)와 형광표지된 서열번호 1 내지 60의 단일가닥 DNA 압타머와 결합한 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 분석한 결과(b)를 비교하면 압타머 결합 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에서 주기적 형광신호가 검출되어 압타머-황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 특이적 결합이 확인되었다.
100 : DNA 라이브러리
200 : 변형된 단일가닥 DNA
300 : 표적 미생물 400 : 비-표적 미생물
300 : 표적 미생물 400 : 비-표적 미생물
<110> Republic of Korea(Management : Rural Development Administraion)
<120> SINGLE STRANDED DNA APTAMERS SPECIFICALLY BINDING TO
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
<130> 13P-018
<160> 60
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 38
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<213> Artificial Sequence
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<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
<400> 1
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<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
<400> 20
gcgtgcggag ccaggatggg aggtctgtaa gtctgcgggg cgtg 44
<210> 21
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<213> Artificial Sequence
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<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
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<213> Artificial Sequence
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<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
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<210> 24
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<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
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<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
<400> 25
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<213> Artificial Sequence
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<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
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<212> DNA
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<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
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acgtgcagag gcgtaccacg agggtcgtgc agtccctctg cgcg 44
<210> 31
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<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
<400> 31
acgtgcagcc ggaagacatc ggccggtcat tctgacttgg cgcgggtgga tccaccagcc 60
accagaccga acacgcgacg gtgagacagt gacgctacgc c 101
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<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
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<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
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<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
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acgtgaagcc agccagggtt gcttcccggt ccacttcttg ccgg 44
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<211> 94
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<213> Artificial Sequence
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<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
<400> 40
acgtgaagcc agccagggtt gcttcccgtt ccacttcttg ccggggtgga tcccgggaga 60
tcagcttgct cgtgggtagc gccggcctgc acca 94
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<211> 102
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
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ggcgtagcgt cactgtctca ccgtcgcgtg ttcggtctgg tggcgagtgg atccacccgc 60
actgcagacg tacctgctat tcggggaaat gttctgcacc gt 102
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<213> Artificial Sequence
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<400> 44
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<212> DNA
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<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
<400> 45
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<400> 46
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
<400> 47
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<400> 48
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<211> 38
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gcgtgcagca ggggctgtgt agcggtcggt agtgctgtgg tgc 43
<210> 59
<211> 44
<212> DNA
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<220>
<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
<400> 59
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<210> 60
<211> 44
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<223> aptamer specifically binding to taphylococcus aureus
<400> 60
gcgtgcagca gtggctgtgt cgcggtcggt agtgctgtgg tgcg 44
Claims (9)
- 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 60에 기재된 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가지는 단일가닥 DNA 압타머.
- 양 끝에 PCR용 프라이머 영역을 가지며 중앙에 무작위로 배열된 40~60개의 염기를 가지는 DNA들을 포함하는 DNA 라이브러리와 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 결합버퍼 용액에 혼합하여 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)-DNA 결합체를 유도하는 단계(S1);
상기 DNA 라이브러리와 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 혼합용액을 원심분리하여 상기 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)-DNA 결합체를 추출하는 단계(S2):
FACS(fluorescense activated cell sorter)를 사용하여, 상기 살모넬라-DNA 결합체로부터 DNA를 분리하는 단계(S3);
상기 분리된 DNA를 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭시키는 단계(S4);
상기 증폭된 DNA와 비-표적 미생물을 결합 버퍼 용액에 혼합하여 비-표적 미생물-DNA 결합체를 유도하는 단계(S5); 및
상기 농축된 DNA와 비-표적 미생물의 혼합용액을 원심분리하여 상기 비-표적 미생물과 결합하지 않은 DNA를 추출하는 단계(S6)
를 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 특이적으로 결합하는 압타머의 제조방법. - 제2항에 있어서,
상기 결합버퍼 용액은 인산버퍼 용액인 압타머의 제조방법. - 제2항에 있어서,
상기 비-표적 미생물은 대장균 및 살모넬라 엔테리타이디스 중 적어도 하나인 압타머의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 증폭된 DNA를 원심분리 필터를 사용하여 농축하는 단계를 더 포함하는 압타머의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭되는 주형의 농도는 0.1%~30%의 범위를 가지는 것을 특징으로 하는 압타머의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 S1 및 S2 단계를 2회 이상 반복한 이후 상기 S3 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 압타머의 제조방법. - 제7항에 있어서,
상기 S3 단계를 수행한 이후, 상기 S6 단계를 2회 이상 반복하는 것을 특징으로 하는 압타머의 제조방법. - 제8항에 있어서,
상기 S6 단계를 2회 이상 반복한 이후,
상기 S1 및 S2 단계를 2회 이상 반복하고 상기 단계 S3를 수행하는 것을 특징으로 하는 압타머의 제조방법.
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| KR1020130140373A KR101566476B1 (ko) | 2013-11-19 | 2013-11-19 | 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 |
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| KR1020130140373A KR101566476B1 (ko) | 2013-11-19 | 2013-11-19 | 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230068834A (ko) | 2021-11-11 | 2023-05-18 | 고려대학교 산학협력단 | 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 앱타머 |
| KR20230087892A (ko) | 2021-12-10 | 2023-06-19 | 고려대학교 산학협력단 | 압타머 쌍을 이용한 샌드위치 방식의 황색포도상구균 검출용 조성물, 바이오센서 및 검출 방법 |
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2013
- 2013-11-19 KR KR1020130140373A patent/KR101566476B1/ko active IP Right Grant
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| KR101566476B1 (ko) | 2015-11-05 |
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