JP6781883B2

JP6781883B2 - アプタマーの選抜方法

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Publication number: JP6781883B2
Application number: JP2016051099A
Authority: JP
Inventors: 齋藤　伸吾; 伸吾齋藤; 廣瀬　和生; 和生廣瀬; 真帆土田; 雅美渋川; 佐藤　誠; 佐藤　　誠
Original assignee: Shino Test Corp; Saitama University NUC
Current assignee: Shino Test Corp; Saitama University NUC
Priority date: 2015-03-16
Filing date: 2016-03-15
Publication date: 2020-11-11
Anticipated expiration: 2036-03-15
Also published as: JP2016171795A

Description

本発明は、アプタマーの選抜方法に関するものである。

アプタマーは、標的物質に対して特異的な結合能力をもつ生体高分子であり、タンパク質よりも取り扱いが容易な物質として注目されており、創薬分野で盛んに研究されているだけでなく、臨床診断試薬や生化学研究における分子ツールとしても用いられており、将来的に多様な応用法が期待されている。
このアプタマーは、標的物質に対して特異的な結合能力をもつ生体高分子という点で抗体と類似しているが、生物を用いずに化学的に試験管内での合成が可能であり、修飾・改変が容易にできること、安定性が高く、免疫原性が低いという、抗体にはない長所を有するものである。

このアプタマーの選抜方法としては、例えば、１０¹³〜１０²⁰にも及ぶ膨大な一本鎖核酸のプール（核酸ライブラリー）中の任意の配列パターンの中からアプタマーを選抜する方法である、試験管内進化法（ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；ＳＥＬＥＸ法）が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
このＳＥＬＥＸ法は、次の１〜３の工程（１．核酸ライブラリーと標的物質との複合体形成、２．標的物質に結合するアプタマーの回収、３．回収したアプタマーの増幅）を１ラウンドとして、このラウンドを繰り返し行うことにより、標的物質との結合能力の強いアプタマーだけを選抜するというものである。
しかしながら、このＳＥＬＥＸ法では、１回のラウンドで得られるアプタマーの標的物質との結合能力や特異性が十分でないため、ラウンドを数回から十数回程度繰り返す必要がある。このため、十分な結合能力と特異性を有するアプタマーを得るためには、多くの労力と時間を要するという問題があった。

このため、近年では、標的物質との結合能力の改良や、効率的にアプタマーを選抜するためにＳＥＬＥＸ法の改良が行われている。
例えば、標的物質と類似した構造を持つ物質を担体に固定化し、ＳＥＬＥＸ法と同様の工程を行うことで、類似した構造をもつ化合物に結合する交差反応性の高い核酸分子を除去することにより、標的物質に対するアプタマーの特異性を改善する、ＣＯＵＮＴＥＲＳＥＬＥＸ法や、アプタマーの分離工程において、標的物質と結合した核酸分子と結合していない核酸分子とをキャピラリー電気泳動法（ＣＥ）を用いて分離する、ＣＥ−ＳＥＬＥＸ法（例えば、特許文献１）が報告されている。
後者のＣＥ−ＳＥＬＥＸ法は、核酸アプタマーの分離能が高く、ラウンド数も４〜６回と少ないため、タンパク質に対するアプタマーを効率的に選抜可能な方法として知られている。

また、低分子やタンパク質だけでなく、細胞や組織の表面に存在する分子に結合するアプタマーを選抜する、Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法（例えば、非特許文献２）が報告されている。
しかしながら、このＣｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法は、シャーレ内で標的物質と核酸ライブラリーの混合及び分離を行うため、分離効率が著しく悪く、標的物質と核酸分子との複合体を完全に分離することは難しい。このため、全工程に一ヶ月近い時間がかかり、かつ結合力の弱いアプタマーも一緒に選抜してしまうという問題点があった。

前述したＣＥ−ＳＥＬＥＸ法に用いられるＣＥは、現存する中で最も分離能の高い分離分析手法であるが、このＣＥを用いたＣｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法はこれまで報告されていない。これは、浮遊細胞（微生物を含む）をＣＥに導入した場合、細胞の会合体の無数のピークが検出されてしまい、「細胞と一本鎖核酸の複合体」と核酸プールを分離することが不可能であったことに起因する。

国際公開第ＷＯ０３／１０２２１２号パンフレット

ＴｕｅｒｋＣ．ａｎｄＧｏｌｄＬ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９（４９６８）：５０５−５１０（１９９０）ＧｕｏＫ．−Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，９（４）：６６８−６７８（２００８）

従って、本発明の課題は、粒子や細胞等の表面に存在する標的物質に対して高い結合能を有するアプタマーを短時間にかつ高効率的に選抜する方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、高分子化合物の存在下でキャピラリー過渡的等速電気泳動を行うことにより、粒子や細胞等の表面に存在する標的物質に対して高い結合能力を有するアプタマーを短時間にかつ高効率的に選抜できることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）アプタマーの選抜方法であって、
（ａ）アプタマー候補からなるライブラリーと標的物質とを溶液中で混合して、アプタマーと標的物質とを結合させ、これらの複合体を形成させる工程、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、高分子化合物を含む泳動液の存在下、キャピラリー過渡的等速電気泳動法によって、前記複合体を含む溶液から前記複合体を濃縮し分離する工程、
（ｃ）前記工程（ｂ）により分離された前記複合体からアプタマーを回収し、前記アプタマーを増幅する工程、を含む前記選抜方法。
（２）前記標的物質が、粒子や細胞等の表面に存在するものである、前記（１）記載の選抜方法。
（３）前記高分子化合物が、ポリエチレンオキサイドである、前記（１）又は（２）記載の選抜方法。
（４）前記泳動液が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−グリシン緩衝液である、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の選抜方法。
（５）前記工程（ａ）〜（ｃ）を複数回繰り返す工程をさらに含む、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の選抜方法。

本発明によれば、高分子化合物の存在下でキャピラリー過渡的等速電気泳動を行うことにより、粒子や細胞等の表面に存在する標的物質に対して高い結合能力を有するアプタマーを短時間にかつ高効率的に選抜することができるものである。

本発明により大腸菌に対するアプタマーを選抜した際の電気泳動図である。本発明により枯草菌に対するアプタマーを選抜した際の電気泳動図である。本発明により酵母に対するアプタマーを選抜した際の電気泳動図である。本発明により選抜したアプタマーの大腸菌に対するアフィニティーを確認した結果を示した図である。本発明により選抜したアプタマーの酵母に対するアフィニティーを確認した結果を示した図である。配列番号４、配列番号５及びＤＮＡライブラリーの解離定数を測定した結果を示した図である。本発明により選抜した大腸菌に対するアプタマーの選択性を確認した結果を示した図である。本発明によりＰＣ−９細胞に対するアプタマーを選抜した際の電気泳動図である。本発明により選抜したＰＣ−９細胞に対するアプタマーのアフィニティーを確認した結果を示した図である。本発明による選抜前のＤＮＡライブラリーのＰＣ−９細胞に対するアフィニティーを確認した結果を示した図である。

以下、本発明を詳細に説明するが、以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明はこの実施の形態に限定されるものではない。また、本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施することができる。

〔１〕発明の基本要件
本発明のアプタマーの選抜方法では、高分子化合物の存在下でキャピラリー過渡的等速電気泳動を行うことにより、粒子や細胞等の表面に存在する標的物質に対して高い結合能力を有するアプタマーを短時間にかつ高効率的に選抜することができる。

〔２〕アプタマー
本発明において、アプタマーとは、標的物質に対して特異的な結合能力をもつ核酸分子やペプチドをいい、配列、分子の大きさ、分子の立体構造等によって限定されるものではない。
本発明におけるアプタマーが核酸アプタマーの場合、核酸分子はＲＮＡでもＤＮＡでもよく、ＰＮＡ等のペプチド核酸でもよい。また、一本鎖ＲＮＡや一本鎖ＤＮＡ等の一本鎖核酸や、二本鎖ＲＮＡや二本鎖ＤＮＡ等の二本鎖核酸でもよい。なお、核酸アプタマーが二本鎖核酸の場合は、例えば、使用する前に、変性等によって一本鎖にすることが好ましい。
また、本発明においては、アプタマーが、核酸アプタマーであることが好ましい。

〔３〕アプタマー候補からなるライブラリー
本発明のアプタマー候補からなるライブラリーは、アプタマーの候補となる核酸分子又はペプチドを複数含む混合物のことをいう。アプタマー候補が核酸分子である場合、アデニン、グアニン、シトシン、チミンから任意に選択された塩基を２０〜１２０個程度連結した領域（ランダム領域）を有していれば、その他の構造に制限はないが、ポリメラーゼ連鎖反応等での増幅を可能にするため、その両端にプライマーとなるべき塩基配列を有するものを使用することが好ましい。この場合、使用するプライマー配列部分の塩基配列数は特に限定されるものではないが、２０〜５０塩基が好ましい。
また、アプタマー候補からなるライブラリーは、高次構造を形成させるため、溶液中で一度９０℃以上に昇温することが好ましい。室温に戻す時間は特に限定されないが、１℃／１分程度が好ましい。

〔４〕標的物質
本発明において、標的物質としては、特に制限されないが、本発明のアプタマー選抜方法によって得られたアプタマーが認識できるものであればよい。例えば、粒子や細胞等の表面に結合又は表現された物質を挙げることができる。この粒子や細胞の大きさは、例えば、数ｎｍ〜１００μｍで、形状は特に制限されないが、球状か棒状が好ましい。
また、本発明において、前記の粒子や細胞等の表面に結合又は表現された物質としては、例えば、無機物、金属イオン、金属錯体、有機物質、生体分子、細胞、微生物、ウイルス、リケッチア、マイコプラズマ、クラミジア、プリオン等の各種粒子等を挙げることができる。
なお、本発明においては、標的物質が、微生物、ウイルス又は細胞であることが好ましい。

（１）標的物質の培養方法
本発明において標的物質が微生物、ウイルス又は細胞である場合、液体培地で培養することが好ましい。この場合、液体培地の種類に特に制限はなく、それぞれの微生物、ウイルス又は細胞の培養に適したものを用いればよい。また、微生物、ウイルス又は細胞は培養直後のものを使用するのが好ましい。

（２）標的物質の精製方法
本発明において、標的物質が微生物、ウイルス又は細胞である場合、その精製には、遠心分離を使用するのが好ましい。例えば、微生物として大腸菌を精製する場合、３０００〜１３０００ｒｐｍで１〜１０分間遠心分離に供し、上澄み液を除去、純水で洗浄する操作を４回程度繰り返せば良い。

〔５〕キャピラリー過渡的等速電気泳動法
本発明において、アプタマーの選抜には、キャピラリー過渡的等速電気泳動法を用いる。キャピラリー過渡的等速電気泳動法とは、電気泳動度の極めて小さい物質と大きい物質（電解液）とを共存させ、使用することで、キャピラリー内で核酸分子と標的物質との複合体と遊離の核酸ライブラリーの濃縮及び分離を一段階で行うことができる方法である。
キャピラリー過渡的等速電気泳動で使用する電解液の条件等は特に制限されず、当該技術分野において周知の方法を用いればよい。

〔６〕アプタマーの選抜方法
（１）アプタマーの選抜方法
本発明において、アプタマーを選抜する方法は、下記の（ａ）〜（ｃ）の工程によりなるものである。
（ａ）アプタマー候補からなるライブラリーと標的物質とを溶液中で混合して、アプタマーと標的物質とを結合させ、これらの複合体を形成させる工程。
（ｂ）前記工程（ａ）の後、高分子化合物を含む泳動液の存在下、キャピラリー過渡的等速電気泳動法によって、前記複合体を含む溶液から前記複合体を濃縮し分離する工程。
（ｃ）前記工程（ｂ）により分離された前記複合体からアプタマーを回収し、前記アプタマーを増幅する工程。

以下、本発明のアプタマーの選抜方法の各工程を、アプタマーが核酸アプタマーである場合を例にとって詳細に説明する。

（２）工程（ａ）
本発明のアプタマー選抜方法の工程（ａ）では、前記したアプタマー候補からなるライブラリーと標的物質とを溶液中で混合することにより、この混合溶液中においてアプタマーと標的物質とを接触、結合させ、「アプタマーと標的物質との複合体」を形成させる。

この混合溶液中において「アプタマーと標的物質との複合体」を形成させる際の時間は、１分〜１時間程度が好ましい。

そして、この混合溶液中において「アプタマーと標的物質との複合体」を形成させる際の温度は、特に制限はなく、室温でもよく、冷温下でもよく、又は加温下でもよい。

また、この混合溶液中において「アプタマーと標的物質との複合体」を形成させる際に使用する緩衝液としては、そのｐＨが、ｐＨ７〜１１の範囲のものが好ましく、ｐＨ７〜９の範囲のものがより好ましい。
この緩衝液としては、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液等を挙げることができる。

更に、この混合溶液中には、キャピラリー過渡的等速電気泳動法における標的物質のピーク収束効果を高めるため、高分子化合物を含有させることができる。
この高分子化合物としては、ポリエチレンオキサイドであることが好ましい。このポリエチレンオキサイドの分子量に特に制限はないが、分子量が１０００〜１０，０００，０００の範囲内にあるものを使用することができ、分子量１０，０００〜８，０００，０００のものを使用することが好ましく、分子量１００，０００〜１，０００，０００ものを使用することが特に好ましい。
また、この混合溶液中にポリエチレンオキサイドを含有させる濃度は、０．００６〜０．５％（ｇ／ｖ）とするのが好ましい。

（３）工程（ｂ）
本発明のアプタマー選抜方法の工程（ｂ）においては、前記の工程（ａ）におけるアプタマー候補からなるライブラリーと標的物質との混合溶液を、キャピラリー過渡的等速電気泳動法に適用する。
これは、このアプタマー候補からなるライブラリーと標的物質との混合溶液を、キャピラリー電気泳動装置に設置されたキャピラリーに、圧力又は電圧を印加することにより注入し、次に通電して、前記の「アプタマーと標的物質との複合体」を泳動させることにより行う。
このアプタマー候補からなるライブラリーと標的物質との混合溶液をキャピラリー過渡的等速電気泳動法に適用することにより、「アプタマーと標的物質との複合体」と遊離のアプタマー候補からなるライブラリーとの分離を行う。

なお、このキャピラリー過渡的等速電気泳動法に使用するキャピラリーは、特に制限されないが、例えば、フューズドシリカキャピラリーが好ましい。また、キャピラリー過渡的等速電気泳動法に使用するキャピラリーの長さは、３０〜１００ｃｍ程度が好ましい。

更に、このキャピラリー過渡的等速電気泳動法に使用するキャピラリーの内径は、２５〜２００μｍが好ましく、７５〜１００μｍがより好ましい。

また、このキャピラリー過渡的等速電気泳動法に使用する泳動液としては、そのｐＨが、ｐＨ７〜１１の範囲のものが好ましく、ｐＨ７〜９の範囲のものがより好ましい。この泳動液の緩衝液としては、前記のｐＨ範囲において緩衝能を有する緩衝剤よりなるものであればよい。
この緩衝液としては、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−グリシン緩衝液等を挙げることができる。

更に、この泳動液には、キャピラリー過渡的等速電気泳動法における標的物質のピーク収束効果を高めるため、高分子化合物を含有させる。
この高分子化合物としては、ポリエチレンオキサイドであることが好ましい。このポリエチレンオキサイドの分子量に特に制限はないが、分子量が１０００〜１０，０００，０００の範囲内にあるものを使用することができ、分子量１０，０００〜８，０００，０００のものを使用することが好ましく、分子量１００，０００〜１，０００，０００ものを使用することが特に好ましい。
また、この泳動液中にポリエチレンオキサイドを含有させる濃度は、０．００６〜０．５％（ｇ／ｖ）とするのが好ましい。

更に、この泳動液及び標的物質とアプタマー候補からなるライブラリーとの混合溶液の緩衝液は、それぞれ電気泳動度の極めて小さい物質と大きい物質とを共存させ、使用することで、「アプタマーと標的物質との複合体」及び「アプタマー候補からなるライブラリー」のゾーンを濃縮し、ゾーン幅を短くさせることができる。
この電気泳動度の極めて小さい物質としては、グリシン等が好ましく、電気泳動度の大きい物質としては塩化物イオン等が好ましい。
これらの電気泳動度の極めて小さい物質、電気泳動度の大きい物質を共存させる濃度であるが、１μＭ〜１０００ｍＭが好ましく、１００μＭ〜５００ｍＭがより好ましく、１ｍＭ〜２００ｍＭが特に好ましい。

このキャピラリー過渡的等速電気泳動法に使用するキャピラリーに、前記工程（ａ）で調製した核酸ライブラリーと標的物質との混合溶液を注入する量は、５〜１０００ｎＬの範囲が好ましく、２５０〜１０００ｎＬがより好ましい。
また、アプタマー候補からなるライブラリーと標的物質との混合溶液を注入する方法は、特に制限されないが、例えば、圧力による注入が好ましい。

このキャピラリー過渡的等速電気泳動法の際の通電条件は、使用する泳動液等の条件に応じたものとすれば良いが、一般的には、５ｋＶ〜３０ｋＶの電圧において行えばよい。

「アプタマーと標的物質との複合体」を回収する際には、電圧の印加を止め、「アプタマーと標的物質との複合体」を回収するための溶液をキャピラリー出口側に設置し、再度電圧を一定時間印加することで、目的の分画を回収する。

「アプタマーと標的物質との複合体」を回収する分画は、電気浸透流からＤＮＡピークまでの立ち上がりまでで良いが、標的物質及び「アプタマーと標的物質との複合体」が単一のピークとして泳動分離されるため、当該分画だけを回収するのが、効率的にアプタマーを選抜できるのでより好ましい。

「アプタマーと標的物質との複合体」を回収する際に、キャピラリー出口側に設置する「アプタマーと標的物質との複合体」を回収するための溶液は、特に制限されず、例えば、泳動液と同じ緩衝液でよく、純水でもよい。

（４）工程（ｃ）
本発明のアプタマー選抜方法の工程（ｃ）においては、前記工程（ｂ）により遊離のアプタマー候補からなるライブラリーから分離された「アプタマーと標的物質との複合体」からアプタマーを回収し、前記アプタマーを増幅する。
また、アプタマーの増幅方法は、特に制限されないが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法や、各種等温増幅法等を使用することができる。
なお、アプタマーがＲＮＡの場合には、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した後に増幅を行えばよい。

例えば、増幅方法としてＰＣＲを使用する場合、特に制限されず、当該技術分野において周知の方法を用いればよく、市販のＰＣＲキットを用いてもよい。
また、前記工程（ｂ）で回収されたアプタマーをＰＣＲで増幅する際に使用する、ＤＮＡポリメラーゼは特に制限されない。また、回収されたアプタマーをＰＣＲで増幅する際に使用する、プライマーとなるＤＮＡの濃度は、１００〜１０００ｎＭ程度が好ましい。

更に、ＰＣＲ増幅後、標的物質と結合する核酸分子（アプタマー）の検出を容易にするため、５´末端に放射標識又は蛍光標識等による標識を行ってもよい。また、ＰＣＲ増幅後の二本鎖の核酸分子を一本鎖化するために、標的物質と結合する核酸分子（アプタマー）の相補鎖の５´末端をビオチン化等の修飾を行ってもよい。

（５）工程（ａ’）
前記の工程（ａ）〜（ｃ）で標的物質に結合するアプタマーが選抜されない場合には、前記工程（ａ）を行う前に、以下の工程（ａ’）を行うことが好ましい。
（ａ’）アプタマー選抜の際に、偶発的に結合又は混入する非特異的結合性一本鎖核酸を除去する工程。

本発明のアプタマー選抜方法の工程（ａ’）においては、標的物質とは異なる種類の粒子や細胞等の物質と、上記で調製したアプタマー候補からなるライブラリー溶液とを混合し、接触させ、遠心分離に供することにより、標的物質とは異なる種類の粒子や細胞等の物質に結合する核酸分子と、遊離の核酸分子とに分離する。この際の上澄み溶液を回収することで、アプタマー選抜の際に、標的物質と偶発的に結合する核酸分子、又は非特異的に結合する核酸分子の存在割合を減少させたアプタマー候補からなるライブリーを調製する。

アプタマー選抜方法の工程（ａ’）において、上記で得られたアプタマー候補からなるライブラリーと、標的物質とは異なる種類の粒子や細胞等の物質とを適当な濃度比で混合し、接触させる。このとき使用する標的物質とは異なる種類の粒子や細胞等の物質は、細胞、微生物又はウイルス等であれば、特に制限されない。

そして、上記で得られたアプタマー候補からなるライブラリーと、標的物質とは異なる種類の粒子や細胞等の物質を混合し、接触させる温度は、特に制限はなく、室温でよく、冷温下でもよく、又は加温下でもよい。

また、上記で得られたアプタマー候補からなるライブラリーと、標的物質とは異なる種類の粒子や細胞等の物質を混合し、接触させる際の緩衝液としては、特に制限はないが、前記工程（ａ）で使用する緩衝液を使用することが好ましい。

更に、上記で得られたアプタマー候補からなるライブラリーと、標的物質と異なる種類の粒子や細胞等の物質を混合し、接触させた後、標的物質と異なる種類の粒子や細胞等の物質に結合する一本鎖核酸分子と遊離の一本鎖核酸分子とを分離する方法には、特に制限はないが、遠心分離を行うことが好ましい。
この場合、標的物質と異なる種類の粒子や細胞等の物質に結合する一本鎖核酸分子と遊離の一本鎖核酸分子とを分離する際の、遠心分離の回転数は、特に制約はなく、１０００〜１５０００ｒｐｍ程度でよく、１０００〜５０００ｒｐｍ程度が好ましい。

（５）工程（ｄ）
本発明のアプタマー選抜方法においては、前記工程（ｃ）で増幅されたアプタマーを一本鎖の核酸分子に変換する工程（ｄ）を行う。
前記工程（ｃ）で増幅されたアプタマーを一本鎖の核酸分子に変換する方法は、特に制限されず、当該技術分野において周知の方法を用いればよい。
そのような方法としては、例えば、ストレプトアビジン固定化磁性粒子とビオチンとの結合を利用する分離が挙げられる。これにより、増幅した二本鎖の核酸分子のうち標的物質に結合活性を有する一本鎖の核酸分子を分離することができ、さらにＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ反応溶液中に含まれる不要な共存物質を除去することができる。

ここで、工程（ａ）から工程（ｄ）までを便宜上ラウンドと呼ぶ。工程（ｄ）まで行ったのち、回収され、一本鎖化された一本鎖の核酸分子を次のラウンドの核酸ライブラリーとして使用することもできる。このラウンド後に回収した核酸ライブラリー溶液に標的物質を加え、ラウンドを繰り返し行ってもよい。ラウンドは、２〜２０回繰り返すことが好ましいが、１回でアプタマーが選抜できる場合は１回でもよい。

更に、前記工程（ｃ）で増幅されたアプタマーの塩基配列の決定を行う。
前記工程（ｃ）で増幅されたアプタマーの配列の決定を行う方法は特に制限されず、当該技術分野において周知の方法を用いればよい。そのような方法としては、例えば、大腸菌への形質転換により、プラスミドを調製後、クローン化したＤＮＡをキャピラリー電気泳動により塩基配列を同定する方法や、次世代シーケンサーを使用する方法等を挙げることができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

〔実施例１〕
［グラム陰性細菌（大腸菌）、グラム陽性細菌（枯草菌）及び真菌（酵母）に対するＤＮＡアプタマーの選抜］
本発明のアプタマー選抜方法を用いて標的物質である微生物（グラム陰性細菌である大腸菌、グラム陽性細菌である枯草菌、及び真菌である酵母）に対して特異的に結合するＤＮＡアプタマーの選抜を行った。

１．微生物の培養と精製
細菌（大腸菌及び枯草菌）は試験管中で培養した。このとき用いた培地はトリプトン：１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス：０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム：１％（ｗ／ｖ）を含むＬＢ培地を用い、３７度、毎分１２０回転で一晩撹拌し、細菌数が１０^８〜１０^９ｃｆｕ／ｍＬとなるように培養した。
その後、培養した細菌溶液１ｍＬをとり、毎分３６００回転で３分間遠心処理を行い、上澄み液を除去後、純水１ｍＬを添加した。この操作を３回繰り返すことにより細菌を洗浄した。

真菌である酵母は、市販のイースト菌１ｍｇを遠心用バイアルにとり、純水１ｍＬを添加後、撹拌し、溶解した。
その後、酵母を溶解した試料を、毎分３６００回転で３分間遠心処理を行い、上澄み液を除去後、純水１ｍＬを添加した。この操作を３回繰り返すことにより細菌を洗浄した。

２．ＤＮＡライブラリーの調製
ＤＮＡライブラリーは以下の配列を有し、５´末端がフルオレセインで蛍光修飾され、全長が８８塩基で、ランダム配列部分（Ｎ）が４５塩基のオリゴＤＮＡを用いた。
〔配列番号１〕：５´−６ＦＡＭ−ＧＣＡＡＴＧＧＴＡＣＧＧＴＡＣＴＴＣＣ−Ｎ４５−ＣＡＡＡＡＧＴＧＣＡＣＧＣＴＡＣＴＴＴＧＣＴＡＡ−３´〔医学生物学研究所社製〕

１０ｍＭ水酸化ナトリウムを含む、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．５）を調製し、この緩衝溶液を溶媒として１０μＭのＤＮＡライブラリー溶液を調製した。この試料をサーマルサイクラーに設置し、９５度まで温度を上昇させ、５分間熱変性させた後、６０分間で２０度まで冷却して用いた。

３．標的物質とＤＮＡライブラリーの混合
大腸菌、枯草菌、又は酵母に対して特異的に結合するＤＮＡアプタマーの選抜のため、以下の試料１、試料２及び試料３を調製した。
〔試料１〕前記１の大腸菌溶液と、前記２のＤＮＡライブラリー溶液と、５００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．５）と、０．１２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンオキサイド６００，０００と、純水とを、それぞれ２：１：１：１：５で混合し、これにより大腸菌とＤＮＡライブラリーとを接触させ、室温にて３０分放置し、この混合溶液中において大腸菌とＤＮＡアプタマーとの複合体を形成させた。

〔試料２〕前記１の枯草菌溶液と、前記２のＤＮＡライブラリー溶液と、５００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．５）と、０．１２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンオキサイド６００，０００と、純水とを、それぞれ２：１：１：１：５で混合し、これにより枯草菌とＤＮＡライブラリーとを接触させ、室温にて３０分放置し、この混合溶液中において枯草菌とＤＮＡアプタマーとの複合体を形成させた。

〔試料３〕前記１の酵母溶液と、前記２のＤＮＡライブラリー溶液と、５００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．５）と、０．１２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンオキサイド６００，０００と、純水とを、それぞれ２：１：１：１：５で混合し、これにより酵母とＤＮＡライブラリーとを接触させ、室温にて３０分放置し、この混合溶液中において酵母とＤＮＡアプタマーとの複合体を形成させた。

４．キャピラリー過渡的等速電気泳動法による細菌−ＤＮＡアプタマー複合体と遊離のＤＮＡライブラリーの分離と細菌−ＤＮＡアプタマー複合体の回収
０．０１２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンオキサイド６００，０００を含む、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−３００ｍＭグリシン緩衝溶液（ｐＨ８．５）を調製し、この緩衝溶液をキャピラリー電気泳動の泳動液とした。

キャピラリー電気泳動装置は、ＡｇｉｌｅｎｔＧ７１００キャピラリー電気泳動システム〔アジレント・テクノロジー社製〕を使用し、検出波長は２７０ｎｍとした。

キャピラリー電気泳動装置は、内径１００μｍ、全長５０ｃｍ、有効長４１．５ｃｍのフューズドシリカキャピラリー〔ＧＬサイエンス社製〕を設置して用いた。

前記の泳動液を、前記のフューズドシリカキャピラリーに満たした後、前記３の試料１、試料２、又は試料３を５０ｍｂａｒで１８秒間、圧力を印加することで、５００ｎＬ注入した。

次に、２０ｋＶの電圧を印加することにより、ＤＮＡアプタマーと微生物（大腸菌、枯草菌、又は酵母）との複合体と遊離のＤＮＡライブラリーの分離を行った。

分離されたＤＮＡアプタマーと微生物（大腸菌、枯草菌、又は酵母）との複合体がキャピラリー出口に到達する１２秒前から３０秒間の分画を３０μＬの純水に回収した。

５．大腸菌結合性ＤＮＡアプタマーのポリメラーゼ連鎖反応による増幅
ＰＣＲの反応溶液の調製は、ＰＣＲ酵素キットであるＴａＫａＲａＥｘＴａｑ〔タカラバイオ社製〕のプロトコールに準拠して調製した。

ここで用いたプライマー配列を以下に示した。
〔配列番号２〕５´−ＦＡＭ−ＧＣＡＡＴＧＧＴＡＣＧＧＴＡＣＴＴＣＣ−３´〔医学生物学研究所社製〕
〔配列番号３〕５´−Ｂｉｏ−ＴＴＡＧＣＡＡＡＧＴＡＧＣＧＴＧＣＡＣＴＴＴＴＧ−３´〔医学生物学研究所社製〕
配列番号２のＤＮＡには、ＰＣＲ増幅後のＤＮＡの検出を容易にするため、５´末端にフルオレセインを修飾したものを用いた。また、配列番号３のＤＮＡには、ＰＣＲ増幅後のＤＮＡを一本鎖化するために、５´末端にビオチンを修飾したものを用いた。

前記の配列番号２及び配列番号３のＤＮＡ（プライマー）と前記のＰＣＲ酵素キットを用いて以下のようにＰＣＲ反応溶液を調製した。
２．５ｍＭデオキシヌクレオシド三リン酸溶液４μＬ、５μＭの配列番号２のＤＮＡを３μＬ、５μＭの配列番号３のＤＮＡを３μＬ，５ｕｎｉｔ/μＬのＴａｑポリメラーゼを０．２５μＬ、１０×ＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒを５μＬ、前記４のＤＮＡアプタマーと大腸菌との複合体を含む溶液を２μＬ加え，超純水で全量を５０μＬとした．

前記で調製したＰＣＲ反応溶液をサーマルサイクラーに設置し、次の温度条件で増幅を行った。はじめは９５度５分間加熱し、熱変性（９５度で３０秒間）、アニーリング（５６．３度で３０秒間）、伸長反応（７２度で１０秒間）のサイクルを１５回繰り返し行った。

６．ＰＣＲ増幅試料の一本鎖化
前記５でＰＣＲにより増幅したＤＮＡを一本鎖化するために、核酸精製用ストレプトアビジン結合磁気ビーズ〔ＶＥＲＩＴＡＳ社製〕を用いた。前記５で得られたＤＮＡ溶液と、核酸精製用ストレプトアビジン結合磁気ビーズを混合し、接触させ、ストレプトアビジン−ビオチン結合によってＰＣＲ産物のＤＮＡを磁気ビーズ上に固定化した。次に磁石により磁気ビーズを回収し、上澄み液を除去後、０．１Ｍ水酸化ナトリウムを添加した。このときの上澄み液を回収することで、選抜後のＤＮＡプールを得た。

７．結果
前記試料１〜試料３をキャピラリー過渡的等速電気泳動で細菌とＤＮＡライブラリーを分離検出した際の電気泳動図をそれぞれ図１〜図３に示した。
これらの図１〜図３から、様々な種類の微生物（グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、及び真菌）とＤＮＡライブラリーとの完全分離が可能であることが分かる。

すなわち、通常は、多くの細菌のピークが出現するが、本発明の工程（ｂ）では粒子である細菌と分子であるＤＮＡライブラリーの両方が、キャピラリー内で濃縮され、そして分離されていることが分かる。また、微生物及び微生物とＤＮＡアプタマーとの複合体の混合物と、ＤＮＡライブラリーの両方がそれぞれ一本ずつの先鋭なピークを示していることが分かる。

さらにＤＮＡピークを正規分布と仮定し、微生物とＤＮＡアプタマーとの複合体を分取した分画中に含まれるＤＮＡライブラリー量を計算したところ、理論上１分子も存在しないことが分かった。
これはすなわち本発明のキャピラリー過渡的等速電気泳動法を用いた細菌及び細胞に対するＤＮＡアプタマーの選抜方法を用いれば、結合しないＤＮＡを含まない分画を効率的に分離、回収できることを示している。

〔実施例２〕
［グラム陰性細菌（大腸菌）及び真菌（酵母）に対するＤＮＡアプタマーの選抜後のＤＮＡプールの結合特性の評価］
１．試料調製
実施例１で得られた１ラウンドの選抜（工程（ａ）〜（ｅ）をそれぞれ一度だけ行う）をした後のＤＮＡプールの目的の微生物に対するアフィニティーの有無を確認するため、以下の試料４を調製した。
〔試料４〕実施例１の６で得られた各微生物に対する１ラウンドのＤＮＡアプタマー選抜（本発明の工程（ａ）〜（ｅ）をそれぞれ一度だけ行う）をした後のＤＮＡプールの所定量と、実施例１の１で得たＤＮＡアプタマー選抜の標的物質である微生物の所定量とを、０．０１２５％ポリエチレンオキサイド６００，０００を含む、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．５）に溶解し、調製した。

ＤＮＡを添加しない場合の微生物のピークを測定するため、以下の試料５を調製した。
〔試料５〕実施例１の１の微生物（大腸菌又は酵母）を所定量、０．０１２５％ポリエチレンオキサイド６００，０００を含む、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．５）に溶解し、調製した。

２．キャピラリー過渡的等速電気泳動
０．０１２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンオキサイド６００，０００を含む、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−３００ｍＭグリシン緩衝溶液（ｐＨ８．５）を調製し、この緩衝溶液をキャピラリー電気泳動の泳動液とした。

キャピラリー電気泳動装置は、Ｐ／ＡＣＥＭＤＱ〔ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製〕を使用し、ＭＤＱレーザー誘導蛍光ディテクタを設置して用いた。レーザーモジュールは、アルゴンイオンを使用し、励起波長は４８８ｎｍとした。

また、キャピラリー電気泳動装置は、内径１００μｍ、全長５０．２ｃｍ、有効長４０．０ｃｍのフューズドシリカキャピラリーを設置して用いた。

前記の泳動液を、前記のフューズドシリカキャピラリーに満たした後、前記試料３を１ｐｓｉで１３秒間、圧力を印加することで、５００ｎＬ注入した。

次に、２０ｋＶの電圧を印加することにより、ＤＮＡアプタマーと微生物との複合体を蛍光検出し、ＤＮＡアプタマーと微生物との結合の有無を調査した。すなわち、ＤＮＡアプタマーが細菌と結合すれば、高い強度の信号として蛍光検出される。

３．カウンターセレクション
実施例１の７の微生物結合性ＤＮＡプールの結合特性の評価において実施例１の１〜６で選抜したＤＮＡが目的の微生物に対してアフィニティーを持たない場合、ＤＮＡライブラリーに含まれる微生物表面に非特異的に結合するＤＮＡを取り除く操作（カウンターセレクション，本発明の工程（ａ’））が必要となる。

ここでは酵母のＤＮＡアプタマーの選抜の際に、カウンターセレクション（本発明の工程（ａ’））の操作を行った。具体的な操作を以下に示した。
実施例１の２で調製したＤＮＡライブラリーを最終濃度が１００ｎＭとなるように所定量と、実施例１の３の大腸菌の最終濃度が８×１０^９ｃｆｕ／ｍＬとなるように所定量とを取り、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．５）中で混合し、１時間室温で放置し、接触させた。

次にＤＮＡライブラリーと大腸菌の混合試料を、毎分６１５０回転で５分間遠心分離し、上澄み溶液を回収し、大腸菌に対して結合しないＤＮＡを回収した。

ここで回収したＤＮＡを前記３のＤＮＡライブラリーとして使用し、実施例１の４〜６と同様の操作を行い、酵母結合性ＤＮＡアプタマーを選抜した。

４．結果
図４は、大腸菌に対するＤＮＡアプタマー選抜後のＤＮＡプールの大腸菌に対するアフィニティーの有無を確認した結果である。大腸菌に、大腸菌に対するＤＮＡアプタマー選抜後のＤＮＡプールを添加したところ、大腸菌ピークの蛍光が増感することが分かった。
すなわち、これは選抜されたＤＮＡが大腸菌に対してアフィニティーを持つことを示している。

図５は、カウンターセレクションを適用後、酵母に対するＤＮＡアプタマー選抜後のＤＮＡプールの酵母に対するアフィニティーの有無を調査した結果である。酵母にカウンターセレクションを適用後、酵母に対するＤＮＡアプタマー選抜後のＤＮＡを添加したところ、酵母ピークの蛍光信号が増感することが分かった。
すなわち、これは選抜されたＤＮＡが酵母に対してアフィニティーを持つことを示している。

〔実施例３〕
［グラム陰性細菌（大腸菌）に対するＤＮＡアプタマーの配列の決定とその結合特性の評価］
１．塩基配列の調査
増幅したＤＮＡは次世代シーケンサーによって塩基配列の決定をした。

２．実施例１で選抜された大腸菌結合性ＤＮＡアプタマーの結合特性の評価
（ａ）塩基配列
配列決定後、結合特性を調査した塩基配列は以下のとおりである。
〔配列番号４〕５´−ＦＡＭ−ＧＣＡＡＴＧＧＴＡＣＧＧＴＡＣＴＴＣＣＡＣＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＴＡＧＴＧＡＴＡＧＴＡＴＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＴＣＴＣＴＧＣＡＣＴＡＣＡＡＡＡＧＴＧＣＡＣＧＣＴＡＣＴＴＴＧＣＴＡＡ−３´
〔配列番号５〕５´−ＦＡＭ−ＧＣＡＡＴＧＧＴＡＣＧＧＴＡＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＴＧＣＡＣＧＴＣＴＴＣＡＡＧＧＴＴＣＴＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＴＡＴＡＣＡＴＴＧＧＣＡＡＡＡＧＴＧＣＡＣＧＣＴＡＣＴＴＴＧＣＴＡＡ−３´

（ｂ）一本鎖ＤＮＡ溶液の調製
１０ｍＭ水酸化ナトリウムを含む、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．５）を調製し、この緩衝溶液を溶媒として１０μＭの配列番号２の一本鎖ＤＮＡ溶液及び配列番号３の一本鎖ＤＮＡ溶液を調製した。この試料をサーマルサイクラーに設置し、９５度まで温度を上昇させ、５分間熱変性させた後、６０分間で２０度まで冷却して用いた。

（ｃ）測定試料の調製
前記の配列番号４及び配列番号５の大腸菌に対する解離定数の測定のため、以下の試料６及び試料７を調製した。
〔試料６〕配列番号４の最終濃度が０、１０、２０、５０、１００、３００ｎＭとなるように、前記で調製した１０μＭの配列番号４のＤＮＡ溶液を所定量と、最終濃度が１０^８ｃｆｕ／ｍＬとなるように、実施例１の１で調製した大腸菌溶液を所定量とをとり、０．０１２５％ポリエチレンオキサイド６００，０００を含む、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．５）に溶解した。

〔試料７〕配列番号５の最終濃度が０、１０、２０、５０、１００、３００ｎＭとなるように、前記で調製した１０μＭの配列番号５のＤＮＡ溶液を所定量と、最終濃度が１０^８ｃｆｕ／ｍＬとなるように、実施例１の１で調製した大腸菌溶液を所定量とをとり、０．０１２５％ポリエチレンオキサイド６００，０００を含む、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．５）に溶解した。

選抜前後でのＤＮＡのアフィニティーの比較を行うため、以下の試料８を調製した。
〔試料８〕ＤＮＡライブラリーの最終濃度が０、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００、２０００、４０００ｎＭとなるように、実施例１の２で調製した１０μＭのＤＮＡライブラリーを所定量と、実施例１の１で調製した大腸菌溶液を所定量とをとり、０．０１２５％ポリエチレンオキサイド６００，０００を含む、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．５）に溶解した。

更に、配列番号５の大腸菌に対する結合の選択性を調査するため、以下の試料９を調製した。
〔試料９〕配列番号５の最終濃度が１０ｎＭとなるように前記で調製した１０μＭの配列番号５のＤＮＡ溶液を所定量と、最終濃度が１０^８ｃｆｕ／ｍＬとなるように実施例１の１で調製した大腸菌溶液を所定量、又は最終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるように実施例１の１で調製した酵母溶液を所定量とを取り、０．０１２５％ポリエチレンオキサイド６００，０００を含む、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．５）に溶解した。

（ｄ）キャピラリー過渡的等速電気泳動
０．０１２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンオキサイド６００，０００を含む、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−３００ｍＭグリシン緩衝溶液（ｐＨ８．５）を調製し、この緩衝溶液をキャピラリー電気泳動の泳動液とした。

キャピラリー電気泳動装置は、内径１００μｍ、全長５０．２ｃｍ、有効長４０．０ｃｍのフューズドシリカキャピラリーを設置して用いた。

前記の泳動液を、前記のフューズドシリカキャピラリーに満たした後、前記試料６、前記試料７、前記試料８、又は前記試料９を１ｐｓｉで１３秒間、圧力を印加することで、５００ｎＬ注入した。

次に、２０ｋＶの電圧を印加することにより、ＤＮＡアプタマーと細菌との複合体を検出した。

さらに、前記試料６、前記試料７、及び前記試料８におけるＤＮＡアプタマーと大腸菌との複合体の補正ピーク面積を、添加したＤＮＡアプタマー濃度に対してプロットし、本発明のＤＮＡアプタマー選抜方法によって選抜された大腸菌結合性ＤＮＡアプタマーの大腸菌に対する解離定数を算出した。

３．結果
図６は、配列番号４及び配列番号５及びＤＮＡライブラリーの解離定数を測定した際に使用した、縦軸に結合割合、横軸に添加したＤＮＡ濃度をプロットした図である。
配列番号４及び配列番号５の大腸菌に対する解離定数はそれぞれ１６±５ｎＭ、２３±１０ｎＭであり、細菌のＤＮＡアプタマーとしては十分なアフィニティーを持つことが分かった。一方でＤＮＡライブラリーの解離定数は、３．５±１．６μＭであり、配列番号４及び配列番号５よりも約２桁高い値になった。

なお、既報（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｓ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４３６（１）：２２−２８（２０１３））では、大腸菌に対する高いアフィニティーを示すアプタマーを１０ラウンドのＣｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法で選抜したことが報告されている。この既報で選抜されたアプタマーの解離定数は１２．４〜２５．２ｎＭであり、本発明で選抜された大腸菌に対するアプタマーの解離定数は１６±５ｎＭ及び２３±１０ｎＭであり、配列番号４及び配列番号５のＤＮＡが大腸菌に対するアプタマーとして高いアフィニティーを有することが明らかになった。
すなわち、本発明のアプタマー選抜法を使用すれば、一般的なＣｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法で選抜されるアプタマーと同等のアフィニティーを有するアプタマーを一度の分離・分取で高速に選抜できることが明らかになった。

また、図７は、大腸菌に対するＤＮＡアプタマーである配列番号５の選択性を調査した結果である。
１０ｎＭの配列番号５のＤＮＡを酵母に添加したところ、酵母の蛍光増感は観測されなかった。このことは配列番号５のＤＮＡが大腸菌に対して選択的な結合をすることを示している。

以上のことから、本発明であるキャピラリー過渡的等速電気泳動法を用いたＤＮＡアプタマー選抜法により、効率的にＤＮＡアプタマーを選抜できることが示された。

なお、一般的なＳＥＬＥＸ法により選抜されるタンパク質に対するＤＮＡアプタマーの解離定数は、数百〜サブｎＭ程度であり（Ｐｉｃｈｏｎ，Ｖ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ，４０７：６８１−６９８（２０１５））、一般的なＣｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法により選抜される細菌（ウィルス・細胞）に対するＤＮＡアプタマーの解離定数は、数百〜サブｎＭ程度（Ｔａｎ，Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ，１１３：２８４２−２８６２（２０１３））であると報告されている。一方で本発明のアプタマー選抜法を用いて、一度の分離・分取で高速に選抜されたＤＮＡアプタマーの解離定数は、数十〜数ｎＭであり、一般的なＣｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法で選抜されるＤＮＡアプタマーと同等のアフィニティを有することが示された。

すなわち、本発明のアプタマーの選抜方法では、高分子化合物の存在下でキャピラリー過渡的等速電気泳動を行うことにより、標的物質に対して高い結合能力を有するアプタマーを短時間（半日程度）にかつ高効率的に選抜することができることが確かめられた。

〔実施例４〕
［動物細胞（ヒト非小細胞肺癌株ＰＣ−９）に対するＤＮＡアプタマーの選抜］
本発明のアプタマー選抜方法を用いて、標的物質である動物細胞（ヒト非小細胞肺癌株ＰＣ−９）に対して特異的に結合するＤＮＡアプタマーの選抜を行った。

１．緩衝溶液の調製
５ｍＭの塩化ナトリウムと、２．５ｍＭの塩化マグネシウムと、２９０ｍＭのグルコース、０．０１２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンオキサイド６００，０００を含む２０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．５）を調製し、試料用の緩衝溶液として用いた。

２．細胞の培養と精製
ＰＣ−９の培養に用いた培地は、５００ｍＬのＲＰＭＩメディウム〔ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製〕に、５．７ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン液（５０００μｇ／ｍＬペニシリン、５００μｇ／ｍＬストレプトマイシン〔ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製〕）および、５５ｍＬの非働化処理したウシ胎児血清〔シグマ・アルドリッチ社製〕を添加して調製した。

ＰＣ−９の培養には、ＣＯ_２インキュベーターを使用し、３７℃、５％ＣＯ_２に設定し、１×１０^５〜２×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬとなるまで培養した。

ＰＣ−９の精製には、遠心分離機を使用し、２００ｇ、５分で細胞を沈降させ、上澄み液を除去後、前記１の試料用の緩衝溶液を添加した。この操作を２回繰り返すことにより細胞の精製を行い、２×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬのＰＣ−９溶液を調製した。

３．ＤＮＡライブラリーの調製
ＤＮＡライブラリーは以下の配列を有し、５´末端がフルオレセインで蛍光修飾され、全長が８８塩基で、ランダム配列部分（Ｎ）が４５塩基のオリゴＤＮＡを用いた。
〔配列番号１〕：５´−６ＦＡＭ−ＧＣＡＡＴＧＧＴＡＣＧＧＴＡＣＴＴＣＣ−Ｎ４５−ＣＡＡＡＡＧＴＧＣＡＣＧＣＴＡＣＴＴＴＧＣＴＡＡ−３´〔医学生物学研究所社製〕

前記１の試料用の緩衝溶液を溶媒として１０μＭのＤＮＡライブラリー溶液を調製した。この試料をサーマルサイクラーに設置し、９５度まで温度を上昇させ、５分間熱変性させた後、４℃に急冷したものを使用した。

４．標的物質とＤＮＡライブラリーの混合
ヒト非小細胞肺癌株ＰＣ−９に対して特異的に結合するＤＮＡアプタマーの選抜のため、以下の試料１０を調製した。
〔試料１０〕前記２の精製したＰＣ−９溶液と、前記３のＤＮＡライブラリー溶液と、前記１の試料用の緩衝溶液とを１：１：８で混合し、これによりＰＣ−９とＤＮＡライブラリーとを接触させ、氷上で６０分間放置し、この混合溶液中においてＰＣ−９とＤＮＡアプタマーとの複合体を形成させた。

５．キャピラリー過渡的等速電気泳動法による細胞−ＤＮＡアプタマー複合体と遊離のＤＮＡライブラリーの分離と細胞−ＤＮＡアプタマー複合体の回収
５ｍＭの塩化ナトリウムと、２．５ｍＭの塩化マグネシウムと、０．０１２５％ポリエチレンオキサイド６００，０００を含む４０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−２９０ｍＭグリシン緩衝溶液（ｐＨ８．５）を調製し、この緩衝溶液をキャピラリー電気泳動の泳動液とした。

キャピラリー電気泳動装置は、Ｐ／ＡＣＥＭＤＱ〔ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製〕を使用し、検出波長は２７０ｎｍとした。

キャピラリー電気泳動装置は、内径１００μｍ、全長６２．５ｃｍ、有効長５２．３ｃｍ、４０．６ｃｍのフューズドシリカキャピラリー〔ＧＬサイエンス社製〕を設置して用いた。

前記の泳動液を、前記のフューズドシリカキャピラリー内に満たした後、前記４の試料１０を０．５ｐｓｉで７秒間、圧力を印加することで、１００ｎＬ注入した。

次に、２５ｋＶの電圧を印加することにより、細胞（ＰＣ−９）とＤＮＡアプタマーとの複合体と遊離のＤＮＡライブラリーの分離を行った。

分離された細胞（ＰＣ−９）とＤＮＡアプタマーとの複合体がキャピラリー出口に到達する３０秒前から１分間の分画を５０μＬの純水に回収した。

６．細胞結合性ＤＮＡアプタマーのポリメラーゼ連鎖反応による増幅
ＰＣＲの反応溶液の調製は、ＰＣＲ酵素キットであるＴａＫａＲａＥｘＴａｑ〔タカラバイオ社製〕のプロトコールに準拠して調製した。

前記の配列番号２及び配列番号３のＤＮＡ（プライマー）と前記のＰＣＲ酵素キットを用いて以下のようにＰＣＲ反応溶液を調製した。
２．５ｍＭデオキシヌクレオシド三リン酸溶液４μＬ、５μＭの配列番号２のＤＮＡを３μＬ、５μＭの配列番号３のＤＮＡを３μＬ、５ｕｎｉｔ/μＬのＴａｑポリメラーゼを０．２５μＬ、１０×ＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒを５μＬ、前記４のＤＮＡアプタマーと細胞（ＰＣ−９）との複合体を含む溶液を２μＬ加え、超純水で全量を５０μＬとした。

前記で調製したＰＣＲ反応溶液をサーマルサイクラーに設置し、次の温度条件で増幅を行った。はじめは９５度５分間加熱し、熱変性（９５度で３０秒間）、アニーリング（５６．３度で３０秒間）、伸長反応（７２度で１０秒間）のサイクルを２５回繰り返し行った。

７．ＰＣＲ増幅試料の一本鎖化
前記６でＰＣＲにより増幅したＤＮＡを一本鎖化するために、核酸精製用ストレプトアビジン結合磁気ビーズ〔ＶＥＲＩＴＡＳ社製〕を用いた。前記６で得られたＤＮＡ溶液と、核酸精製用ストレプトアビジン結合磁気ビーズを混合し、接触させ、ストレプトアビジン−ビオチン結合によってＰＣＲ産物のＤＮＡを磁気ビーズ上に固定化した。次に磁石により磁気ビーズを回収し、上澄み液を除去後、２５ｍＭ水酸化ナトリウムを添加した。このときの上澄み液を回収することで、選抜後のＤＮＡプールを得た。

８．結果
図８は、キャピラリー過渡的等速電気泳動法で動物細胞であるＰＣ−９とＤＮＡライブラリーを分離検出した際の電気泳動図である。この図８からＰＣ−９とＤＮＡライブラリーの分離度は１３．６であり、細胞とＤＮＡライブラリーとの完全分離が可能であることが分かる。

〔実施例５〕
［動物細胞（ヒト非小細胞肺癌株ＰＣ−９）に対するＤＮＡアプタマーの選抜後のＤＮＡプールの結合特性の評価］
１．試料調製
実施例４で得られたヒト非小細胞肺癌株ＰＣ−９に対するＤＮＡアプタマーの選抜後のＤＮＡプールのヒト非小細胞肺癌株ＰＣ−９に対するアフィニティーの有無を確認するため、以下の試料１１を調製した。
〔試料１１〕実施例４の７で得られたＰＣ−９に対するＤＮＡアプタマーの選抜をした後のＤＮＡプールを所定量と、実施例４の２の精製したＰＣ−９の所定量とを、実施例４の１で得られた試料用の緩衝溶液に溶解し、１００ｎＭのＰＣ−９に対して選抜したＤＮＡプールと２×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬのＰＣ−９との混合試料を調製した。この試料を氷上で１時間放置し、この混合溶液中においてＰＣ−９とＤＮＡアプタマーとの複合体を形成させた。この試料を遠心分離機に供し、２００ｇ、５分で細胞を沈降させ、上澄み液を除去後、実施例４の１の試料用の緩衝溶液を添加した。この操作を２回繰り返すことにより複合体の洗浄を行った。

選抜前のＤＮＡライブラリーとＰＣ−９に対するアフィニティーの有無を確認するため、以下の試料１２を調製した。
〔試料１２〕実施例４の３のアニーリングしたＤＮＡライブラリーを所定量と、実施例４の２で得られた精製したＰＣ−９の所定量とを、実施例４の１で得られた試料用の緩衝溶液に溶解し、１００ｎＭのＤＮＡライブラリーと２×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬのＰＣ−９との混合試料を調製した。この試料を遠心分離機に供し、２００ｇ、５分で細胞を沈降させ、上澄み液を除去後、実施例４の１の試料用の緩衝溶液を添加した。この操作を２回繰り返すことにより複合体の洗浄を行った。

２．蛍光顕微鏡画像の取得
走査型蛍光顕微鏡はＦＶ−１０００Ｄ〔オリンパス社製〕を使用し、半導体レーザー（λｅｍ＝４７３ｎｍ、出力：１５ｍＶ）を設置して用いた。

前記１で調製した、試料１１および試料１２をスライドガラスに１０μＬ滴下し、カバーガラスをかぶせて、観察した。

３．結果
図９は、ＰＣ−９に対するＤＮＡアプタマー選抜後のＤＮＡプールのＰＣ−９に対するアフィニティーの有無を確認した結果である。ＰＣ−９と選抜後のＤＮＡプールの混合試料では、細胞表面に蛍光修飾化したＤＮＡ由来の蛍光を確認できた。これはすなわち、選抜されたＤＮＡがＰＣ−９に対してアフィニティーを持つことを示している。

図１０は、選抜前のＤＮＡライブラリーのＰＣ−９に対するアフィニティーの有無を確認した結果である。ＰＣ−９と選抜前のＤＮＡライブラリーの混合試料では、細胞表面に蛍光修飾化したＤＮＡ由来の蛍光は確認されなかった。図９の結果を考慮すると、ＤＮＡランダムライブラリーからＰＣ−９に対してアフィニティーを持つＤＮＡの集合体の選抜が行えたことを示している。

Claims

アプタマーの選抜方法であって、
（ａ）アプタマー候補からなるライブラリーと標的物質とを溶液中で混合して、アプタマーと標的物質とを結合させ、これらの複合体を形成させる工程、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、ポリエチレンオキサイドを含むｐＨ７〜９の泳動液の存在下、キャピラリー過渡的等速電気泳動法によって、前記複合体を含む溶液から前記複合体を濃縮し分離する工程、
（ｃ）前記工程（ｂ）により分離された前記複合体からアプタマーを回収し、前記アプタマーを増幅する工程、を含む前記選抜方法。
前記標的物質が、粒子や細胞等の表面に存在するものである、請求項１記載の選抜方法。
前記泳動液が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−グリシン緩衝液である、請求項１又は２に記載の選抜方法。
前記工程（ａ）〜（ｃ）を複数回繰り返す工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の選抜方法。