CN111500572B - 一种基于毛细管电泳筛选非天然核酸适体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于毛细管电泳筛选非天然核酸适体的方法，包括以下步骤：首先合成初始DNA分子随机文库和引物，然后进行循环筛选。在每一轮筛选里，采用引物延伸的方法获得非天然核酸文库，以CTLA‑4为靶蛋白，将非天然核酸文库与靶蛋白共孵育，利用CE‑LIF方法分离结合靶蛋白的非天然核酸分子，然后进行逆转录和PCR扩增，获得富集DNA分子文库，并应用于下一轮筛选。如此重复筛选若干轮，对富集DNA分子进行测序，可推断得到非天然核酸分子的序列信息。最后制备单链非天然核酸分子，测试其与靶蛋白结合的亲和力，获得有特异性的非天然核酸适体。本发明方法能够高效筛选出高亲和力和稳定性的非天然核酸适体，有利于提高功能性核酸在生物环境下的作用效果。

Description

一种基于毛细管电泳筛选非天然核酸适体的方法

技术领域

本发明涉及一种基于毛细管电泳筛选非天然核酸适体的方法，属于非天然核酸适体筛选技术领域。

背景技术

核酸适体(Aptamer)也被称作适配体、适体、适配子等，是一类单链RNA分子或单链DNA分子，通常由几十到一百多个碱基组成，是从人工合成的RNA或DNA分子随机文库中筛选分离出能与目标物质进行高特异性、高灵敏度结合的单链寡核苷酸。虽然适体的结合方式与抗体较为相似，但核酸适体特有的性质在很多方面都优于抗体。与抗体相比，核酸适体可以通过体外筛选获得，在生产成本、稳定性、修饰难易程度和组织穿透力等方面具有明显优势。在某些应用领域和场景里，核酸适体有望替代抗体，在分子生物学、分析化学以及临床医学等各个领域具有广泛的应用前景。通常，核酸适体是通过指数级富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)筛选得到的。以DNA适体为例，SELEX的基本步骤是将包含大容量的随机寡核苷酸序列的DNA分子随机文库溶液与靶分子共同孵育，并通过各种分离手段将结合靶分子的DNA分子与未结合的DNA分子分离，并对这些能够结合的DNA分子通过聚合酶链式反应进行扩增，经分离为单链后，生成次级文库，再用于下轮筛选，如此重复数轮后，挑选出富集的DNA分子，并进行测序即获得特异性识别靶分子的寡核苷酸分子，即核酸适体。大容量的分子文库能够涵盖丰富多样的立体构象，理论上可以针对任何靶分子进行筛选，得到其特异性识别的核酸适体。

以往筛选出的适体为天然DNA和RNA，在实际应用过程中存在作用时间短、作用效果不理想的情况。而与天然核酸相比，非天然核酸则不仅具有类似的碱基互补配对能力，还具有更好的抗酶切、耐酸、耐热等特性，因而在实际运用场景中具有更高的稳定性和更广泛的应用性。

细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)是一种T淋巴细胞跨膜蛋白，它最早在筛选小鼠杀伤性T细胞的cDNA文库时被发现。CTLA-4具有高度的内吞性，通常存在于胞内小体中，以二聚体的形式存在。CTLA-4能够与抗原呈递细胞或者活化的T细胞表面B7受体结合，传导抑制性信号到T细胞，起到抑制T细胞激活的作用，是癌细胞免疫逃逸的一种途径。而相对传统化疗或靶向治疗，生物免疫治疗针对的是免疫细胞或者免疫系统，而不是癌细胞。在癌症免疫治疗中，抑制免疫检查点通路被认为是最有前景的治疗方式之一，其机制是通过抑制通路中相关靶点从而解除T细胞活性受抑的状态，活化后的T细胞能够恢复对肿瘤细胞的攻击。靶向免疫检查点蛋白的抑制剂并不直接作用于肿瘤细胞，而是通过作用于T细胞来间接杀伤肿瘤细胞；另外，它们并不是针对肿瘤表面的某种特定物质，而是系统性地增强了全身的抗肿瘤免疫反应。目前已经获得的CTLA-4抑制剂中，存在易降解，成本高或结合效果不够好的情况。

发明内容

发明目的：为解决上述现有技术中获得的适体存在不稳定，成本高，亲和力不够高的问题，本发明提供了一种基于毛细管电泳筛选非天然核酸适体的方法。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于毛细管电泳筛选非天然核酸适体的方法，包括以下步骤：首先合成初始DNA分子随机文库和引物，然后进行筛选；在每一轮筛选中，采用引物延伸的方法获得非天然核酸文库，以CTLA-4为靶蛋白，将非天然核酸文库与靶蛋白共孵育，利用毛细管电泳-激光诱导荧光(Capillary electrophoresis-laser induced fluorescence，CE-LIF)的方法分离结合靶蛋白的非天然核酸分子，然后进行逆转录和PCR扩增，获得富集DNA分子文库，应用于下一轮筛选；如此重复筛选若干轮，对富集DNA分子进行测序，根据测序结果推断得到非天然核酸分子的序列信息，然后制备单链非天然核酸分子，测试其与靶蛋白结合的亲和力，具有亲和力的非天然核酸分子即为非天然核酸适体。

优选，所述非天然核酸适体中，单体G和A为2’修饰甲氧基的脱氧核糖核苷酸单体，单体C和T为未修饰的脱氧核糖核苷酸单体。

作为本发明一种实施方案，所述非天然核酸适体的序列如SEQ ID NO：1所示：

5’-ACCACGGACAGGTTACCCGGATTCAGACTCTGGGATCTCAATGCACTGACGAT-3’(SEQ IDNO：1)

其中，单体G和单体A为2’修饰甲氧基的脱氧核糖核苷酸单体，单体C和单体T为未修饰的脱氧核糖核苷酸单体。

优选，在引物延伸过程中，脱氧核糖核苷酸单体G和单体A替换为单体2’-OMe-G和单体2’-OMe-A。

优选，所述重复筛选若干轮为重复筛选三轮。

所述的基于毛细管电泳筛选非天然核酸适体的方法，具体包括以下步骤：

(1)合成初始DNA分子随机文库和上下游引物；

(2)取DNA分子随机文库利用聚合酶以dC、dT、2’-OMe-G和2’-OMe-A核苷三磷酸为底物进行引物延伸后链分离，获得非天然核酸文库；

(3)将非天然核酸文库溶液退火处理后与CTLA-4蛋白置于室温孵育，获得蛋白核酸混合物；

(4)将蛋白核酸混合物用CE-LIF方法进行分离，收集蛋白核酸复合物溶液；

(5)将蛋白核酸复合物溶液用聚合酶进行逆转录；

(6)以逆转录产物为模板，PCR扩增19～25个循环后，分离单链，得到本轮筛选获得的富集文库，可用于下一轮筛选；

(7)重复(2)-(6)步骤；

(8)筛选三轮后，将最后一轮筛选获得的PCR扩增产物连接载体中，并对含成功连接载体的菌落进行测序；

(9)根据测序结果推断得到非天然核酸分子的序列信息，制备单链非天然核酸分子；

(10)测试非天然核酸分子与CTLA-4的亲和力，具有亲和力的非天然核酸分子即为所述非天然核酸适体；

进一步的，可以对其中亲和力较高的非天然核酸适体进行二级结构预测和截短优化，得到亲和力更佳的非天然核酸适体。

进一步优选，步骤(2)中的聚合酶选自SFM4-6聚合酶。

进一步优选，步骤(5)中的聚合酶选自SFM4-9聚合酶。

进一步优选，步骤(8)中的载体选自pEASY-T1。

技术效果：本发明通过毛细管电泳筛选技术筛选得到的非天然核酸适体，与以往获取对靶标具有亲和性的抗体相比，具有可人工合成、结构简单、亲和力高、筛选效率高的优势；与以往DNA或RNA适体筛选方法相比，此本发明在筛选过程中，核酸链含两种非天然脱氧核糖核苷酸，显著提高适体抗核酸酶降解的效果，同时还能提高引物延伸过程中的反应效率，以减少因延伸反应导致的序列删除的影响；与以往通过筛选获得的非天然核酸适体相比，此本发明在筛选过程中，该核酸链仅使用两种非天然脱氧核糖核苷酸，能够在保证适体的稳定性基础上，还能进一步降低成本。

附图说明

图1为本发明方法的流程图；

图2为本发明延伸反应中所用非天然核糖核苷酸单体化学式；

图3为本发明延伸反应及逆转录反应的结果图；

图4为本发明毛细管电泳的操作程序；

图5为本发明的核酸适体的结合能力检测结；

图6为本发明的非天然核酸适体预测二级结构示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例本发明非天然核酸的筛选流程

1、合成初始DNA分子随机文库和引物

DNA分子随机文库核酸序列，如下所示：

5’-biotin-ATCGTCAGTGCATTGAGA-N40-GGTGGTATCCCCAAGGGGA-3’；(SEQ ID NO：2)

N40代表随机核酸序列，四种脱氧核糖核苷酸单体比例如下所示：

A:T:G:C＝1:1:1:1；

上游引物核酸序列，如下所示：

5’-biotin-ATCGTCAGTGCATTGAGA-3’；(SEQ ID NO：3)

下游引物核酸序列，如下所示：

5’-FAM-TCCCCTTGGGGATACCACC-3’。(SEQ ID NO：4)

2、毛细管电泳筛选非天然核酸适体过程：

2.1取初始DNA分子随机文库进行引物延伸，获得非天然核酸文库。如图3左图所示，具体步骤为：

取2nmol DNA分子随机文库加入到1×标准Taq酶反应缓冲液中，再依次加入1.5μM下游引物，0.15mM NTPs(2’-OMe-GTP/2’-OMe-ATP/dTTP/dCTP)，1mM MnCl₂，3mM SFM4-6聚合酶进行反应，反应条件为50℃，8h；70℃，2h；

将上述获得的引物延伸反应产物溶液进行链分离并脱盐，获得单链非天然核酸文库。具体步骤为：

将载有链霉亲和素的树脂用PBS进行冲洗两次，加入延伸反应产物溶液孵育30min，用PBS冲洗一次，再用200mM NaOH洗脱3次，收集3次洗脱液，加入醋酸钠溶液调pH至中性，再用脱盐柱进行脱盐；

2.2单链非天然核酸文库溶液经95℃加热并缓慢降温至室温，加入不同比例的CTLA-4蛋白，置于室温孵育1h，获得蛋白核酸混合物；

2.3将蛋白核酸混合物用CE-LIF方法进行分离并收集蛋白-核酸复合物，操作程序如图4所示，具体参数为：

毛细管电泳使用的毛细管为熔融石英毛细管，总长度为70cm，进样口至观测窗口有效长度为50cm，内径为75μm；采用Beckman P/ACE MDQ plus毛细管电泳仪进行电泳；涂层为1％PVP；电泳缓冲液为40mM Tris-HCl，80mM NaCl，0.8mM MgCl₂，pH值为7.4；进样条件为：0.5psi，5s；分析条件为：分析温度为25℃，分析电压为10kV；毛细管电泳时采用激光诱导荧光检测，检测条件为：激发波长488nm，发射波长520nm。收集电泳28min之后的样品进行下一步；

2.4将蛋白-核酸复合物溶液用SFM4-9聚合酶进行逆转录，如图3右图所示，具体步骤为：

取逆转录总反应体积的2/5体积的蛋白-核酸复合物溶液加入到1×SFM4-9反应缓冲液中(1×标准Taq酶反应缓冲液+0.1％BSA)，加入50nM上游引物，0.75mM dNTPs，1mMMnCl₂，2.5mM SFM4-9聚合酶进行反应，反应条件为：50℃，12h；72℃，2h；

2.5PCR扩增步骤：取PCR反应体积的3/10体积的逆转录产物作为模板加入到1×Taq聚合酶混合物中，再加入0.5mM上下游引物，扩增19～25个循环后，分离单链，得到本轮筛选的富集文库，并可用于下一轮筛选，PCR扩增条件为：95℃，5min；(95℃，30s；50℃，30s；72℃，20s)×19～25轮；72℃，5min；

2.6重复2.1-2.5步骤；

2.7筛选三轮后，将最后一轮筛选结束获得的PCR扩增产物连接于pEASY-T1载体中，并对含成功连接载体的菌落进行测序。

2.8根据测序结果推断得到非天然核酸分子序列信息，合成引物延伸的模板，进行引物延伸反应，并分离单链，获得非天然核酸分子。

2.8通过点斑迹法测试非天然核酸分子结合靶蛋白的亲和力，得到能与CTLA-4结合的非天然核酸适体。

2.9对其中亲和力较高的非天然核酸适体进行二级结构预测和截短优化，得到亲和力高、特异性强的非天然核酸适体，其亲和力测试结果如图5。非天然核酸适体二级结构预测结果如图6所示。

所述非天然核酸适体序列如SEQ ID NO：1所示：

5’-ACCACGGACAGGTTACCCGGATTCAGACTCTGGGATCTCAATGCACTGACG AT-3’(SEQ IDNO：1)

其中，单体G和单体A为2’修饰甲氧基的脱氧核糖核苷酸单体，单体C和单体T为未修饰的脱氧核糖核苷酸单体。

所述步骤2.1中引物延伸所用的聚合酶为文献已有报道的SFM4-6。

所述步骤2.2中添加CTLA-4蛋白与非天然核酸文库的摩尔比分别为：第一轮2:3；第二轮1:10；第三轮1:100。

所述步骤2.3中毛细管电泳所使用的毛细管为熔融石英毛细管，总长度为70cm，进样口至观测窗口有效长度为50cm，内径为75μm；采用Beckman P/ACE MDQ plus毛细管电泳仪进行电泳；涂层为1％PVP；电泳缓冲液为40mM Tris-HCl，80mM NaCl，0.8mM MgCl₂，pH值为7.4；进样条件为：0.5psi，5s；分析条件为：分析温度为25℃，分析电压为10kV；毛细管电泳时采用激光诱导荧光检测，检测条件为：激发波长488nm，发射波长520nm。

非天然核酸文库5’端修饰的荧光标记物为FAM。

所述步骤2.4中引物延伸所用的聚合酶为文献已有报道的SFM4-9。

序列表

<110> 南京大学

<120> 一种基于毛细管电泳筛选非天然核酸适体的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accacggaca ggttacccgg attcagactc tgggatctca atgcactgac gat 53

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcgtcagtg cattgagang gtggtatccc caagggga 38

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcgtcagtg cattgaga 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccccttggg gataccacc 19

Claims (1)

1.一种非天然核酸适体，所述非天然核酸适体的序列为：

5’-ACCACGGACAGGTTACCCGGATTCAGACTCTGGGATCTCAATGCACTGACGAT-3’（SEQ ID NO：1）

其中，单体G和单体A为2’修饰甲氧基的脱氧核糖核苷酸单体，单体C和单体T为未修饰的脱氧核糖核苷酸单体。

Images