CN113699215A - 一种核酸适体筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸适体筛选方法，包括：将待检验的核酸样品分为两组，第一组核酸样品在不含靶物质的条件下进行扩增，或不进行扩增，第二组一组核酸样品在含有靶物质的条件下进行扩增；对扩增后的两组核酸样品分别进行测序；测序完成后，比较两组核酸样品中核酸序列的覆盖深度差异，找出第二组中覆盖深度明显下降的核酸序列，筛选出候选核酸适体。该筛选方法能够更加简便、快捷、大批量地进行核酸适体的筛选，适用于从较长序列的核酸、多物种的基因组中筛选候选核酸适体。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术，特别涉及一种核酸适体筛选方法。
背景技术
核酸适体一般是指分子大小介于25～60个核苷酸的单链寡核苷酸序列，它通过折叠成稳定的三维结构与靶标分子产生特异性分子间相互作用，能特异结合蛋白质或其他小分子物质。核酸适体具有与抗体相当或更优异的特异性和亲和力，且兼具靶标范围广、生产成本低、易规模化制备、可实现精准化学合成和修饰以及免疫原性低等优势。
目前使用较为广泛的核酸适体筛选方式是通过指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，SELEX)，从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体。SELEX技术的基本思想是在体外通过化学方法合成一个单链寡核苷酸库，用其与靶物质混合，靶物质将与对应的核酸适体结合形成复合物，洗去与靶物质不结合或与靶物质有高亲和力外的核酸分子，通过一轮又一轮重复的筛选与扩增，文库中核酸适体的纯度逐渐增大，从而能够分离纯化出与靶物质高度亲和的核酸适体。
根据发现，一些核酸适体会在靶物质的作用下会产生构象上的变化，例如形成四联体或茎环等二级结构。例如铅离子的某些核酸适体能够形成G四联体，这是一种富含鸟嘌呤的DNA或RNA链折叠形成的稳定的核酸二级结构。在铅离子的作用下，具有特定序列的核酸片段作为核酸适体与其结合，形成非常稳定的G四联体结构；此外还有其他某些特定序列的核酸片段能够与铅离子作用形成稳定的茎环结构。能够和核酸适体结合形成核酸二级结构的靶物质包括汞离子、铅离子等金属离子，一些无机离子，以及抗生素、黄酮类化合物、PDS、凝血酶等有机物。如果对产生二级结构的核酸片段进行扩增，该结构会阻止DNA聚合酶或逆转录酶前进，使扩增难度变大，得到的扩增片段减少。片段数量的减少会体现在下一步测序的结果中，从而筛选出对应靶物质的核酸适体。
SELEX筛选方式的库容量大，适应范围广，能够获得高亲和力的核酸配体，但是需要进行多轮重复的筛选与扩增，并且非特异性扩增是一个难以避免的重要问题。此外在分离与靶物质结合的寡核苷酸的环节中，由于DNA的疏水性质，会导致部分非结合游离核酸残留在滤膜上，产生背景吸附。如果背景吸附率过高，会导致筛选轮数增多，甚至是筛选失败。而基于测序技术通过比对覆盖深度的核酸适体筛选方式将扩增和筛选过程进行了简化，仅仅通过一次扩增和一轮测序就能够大批量得获得候选的核酸适体，使筛选过程更加简便高效。
现有技术中还未见基于测序的候选核酸适体筛选方法。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供一种高效、简便的核酸适体筛选方法。
技术方案：本发明提供一种核酸适体筛选方法，包括如下步骤：
(1)将待检验的核酸样品分为两组，第一组核酸样品在不含靶物质的条件下进行扩增，或不进行扩增，第二组核酸样品在含有靶物质的条件下进行扩增；
(2)对扩增后的两组核酸样品分别进行测序；
(3)测序完成后，比较两组核酸样品中核酸序列的覆盖深度差异，找出第二组中覆盖深度明显下降的核酸序列，筛选出候选核酸适体。
进一步地，所述步骤(1)中待检验的核酸样品为真核生物、原核生物或病毒的天然DNA或RNA或来自于人工合成的核酸序列。
进一步地，所述人工合成的核酸序列是一组固定序列的核酸序列的组合或一组由简并碱基构成的核酸序列或两者的结合。
进一步地，所述步骤(1)中的靶物质为金属离子、其他无机离子、有机小分子或有机大分子。
进一步地，所述步骤(1)中的靶物质浓度范围为0.1pM-2mM。
进一步地，所述步骤(1)中核酸扩增包括基于PCR的扩增反应或等温扩增反应或PCR和等温相结合的扩增反应。
进一步地，所述步骤(2)中测序是指第一代测序技术、高通量测序技术或单分子测序技术。
进一步地，所述步骤(3)中核酸序列的覆盖深度，是测序结果中比对到目标序列的碱基总数与目标序列区域大小的比值。
进一步地，所述步骤(3)中比较两组核酸样品中核酸序列的覆盖深度差异，是指对所述两组核酸样品各个核酸序列和碱基位置的覆盖深度分别进行统计，比较两组核酸样品中核酸序列的覆盖深度差异。
进一步地，所述步骤(3)中所述覆盖深度明显下降，是指在第二组中覆盖深度相较于第一组下降50％及以上，且这种下降持续超过10个碱基。
将待检验的核酸样品分为两组，向其中一组核酸样品中加入靶物质，其浓度范围为0.1pM-2mM，使样品与靶物质进行充分反应。在靶物质的作用下，具有特定序列的核酸片段能够作为核酸适体与其结合，从而形成非常稳定的二级结构，它会阻止DNA聚合酶或逆转录酶前进，导致该片段的扩增难度变大，因此得到的扩增片段减少，片段数量的减少会体现在下一步测序的结果中.核酸扩增环节使用的技术包括基于PCR的扩增反应、等温扩增反应，或PCR和等温相结合的扩增反应。
第一代测序技术一般是指链终止法，化学降解法，以及在它们的基础上发展的各种DNA测序技术。高通量测序是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术，该技术引入了可逆终止末端，从而实现边合成边测序，在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记来确定DNA序列。单分子测序技术是利用DNA聚合酶合成与模板互补的DNA链，用4色荧光标记4种dNTP，在碱基配对时，不同碱基的加入会发出不同光，根据光的波长与峰值即可判断进入的碱基类型，在三维空间中记录模板位置和核苷酸序列信息，再反向构建DNA模板的序列。
测序完成后得到的数据进行质控筛选，对照已知的参考基因组信息，将reads进行比对和拼接，统计得到待测样品每个位点的覆盖深度。核酸序列的覆盖深度，是测序结果中比对到目标序列的碱基总数与目标序列区域大小的比值，即Depth＝(L×N)/G，其中L表示比对上该位点的reads长度，N表示比对上该位点的reads数目，G表示测序目标区域的总碱基长度。在靶物质的作用下，某些核酸序列能够作为核酸适体与靶物质结合，产生构象上的变化，例如形成四联体或茎环等非常稳定的核酸二级结构，从而阻止DNA聚合酶或逆转录酶前进，导致该片段的扩增难度变大，得到的扩增片段减少，故该片段的覆盖深度降低。
对含靶物质的核酸样品组和不含靶物质的对照组分别绘制覆盖深度变化曲线，分析对比两组核酸样品中核酸序列的覆盖深度差异，找出找出含靶物质的核酸样品组中覆盖深度明显下降的核酸片段，筛选出含靶物质的核酸样品组中覆盖深度低于不含靶物质组50％且深度＞1的区域，若其序列长度在10bp及以上，则推断此段核酸序列具有潜在二级结构，从而筛选出核酸适体。将多个平行实验组的实验结果结合分析，对候选核酸适体进行进一步筛选，以减少实验中产生的误差。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：
该方法检测出不同核酸片段的测序深度不同，从而确定形成二级结构的位置，得到靶物质的候选核酸适体。通过测序后比对覆盖深度的方式，将扩增和筛选过程进行了简化，仅仅通过一轮测序就能够大批量得获得候选的核酸适体。相比于使用传统的SELEX方式进行适体筛选需要进行多轮循环、有非特异性扩增、背景吸附率高等问题，这种基于测序的方式更加简便高效，能够筛选出覆盖深度低的核酸片段，得到高亲和力的核酸配体，并且可以用于来自不同物种基因组的核酸或者来自于人工合成的核酸序列，表现出了其广适性。该筛选方法能够更加简便、快捷、大批量地进行核酸适体的筛选，适用于从较长序列的核酸、多物种的基因组中筛选候选核酸适体。
附图说明
图1为核酸链形成二级结构对测序覆盖深度影响的示意图；
图2为核酸适体与靶物质结合形成核酸二级结构的示意图；
图3为加入铅离子的核酸样品与不含铅离子的核酸样品进行测序后绘制的测序覆盖深度曲线，其中，a图为不含铅离子的核酸样品的测序覆盖深度曲线，b图为含铅离子的核酸样品的测序覆盖深度曲线；
图4为基因组测序的覆盖深度结果示意图。
具体实施方式
实施例1
向核酸样品中加入靶物质促进核酸样品形成二级结构，并对核酸样品进行扩增和测序，包括以下步骤：
(1)从培养的人K562细胞系中以酚-氯仿法提取基因组DNA并溶于TE缓冲液。将待检验的核酸样品分为两组，每组包含10μL共100ng基因组核酸。
(2)向上述一组核酸样品中加入终浓度为1μM MnCl2溶液，使两者进行充分混合；另一组中加入等量的水。
(3)对含靶物质和不含靶物质的核酸样品组分别加入50μM随机引物、4mMdNTP、1U/μLphi29聚合酶及对应缓冲液进行MDA全基因组扩增，反应条件为30℃8h。
(4)在扩增后对两组样品分别进行超声打断和连接酶连接测序接头步骤，经过磁珠纯化后获得长度分布在200-1200bp的待测序样品溶液。
(5)测序完成后得到的数据进行质控筛选，并对照已知的参考基因组信息，将reads进行比对和拼接，统计得到两组样品在全基因组范围的的测序覆盖深度分布并绘制图像曲线。
(6)分析对比两组核酸样品中核酸序列的覆盖深度差异，将二者相除，找出含靶物质的核酸样品组中覆盖深度低于不含靶物质组50％且深度＞1的区域，若其序列长度在10bp及以上，则推断此段核酸序列具有潜在二级结构，从而筛选出核酸适体。
实施例2
按照实施例1的方法，对一段人工合成的核酸进行铅离子核酸适体的筛选，样品序列为：
向198μL浓度为20μM的核酸样品中加入2μL浓度为100μM Pb(NO3)2溶液，使其进行充分反应。另一组样品核酸浓度保持一致，但加入相同摩尔量的NaNO3溶液。
对含铅离子的核酸样品组和不含铅离子的核酸样品组分别进行扩增，采用PCR(聚合酶链式反应)进行扩增。PCR反应体系包含400μM dNTPs、2μM引物、0.025unit/μL rTaq酶和1μL模板于50μL 1×PCR缓冲液中。PCR的流程为变性(92℃，15s)、退火(58℃，30s)、延伸(72℃，20s)，共进行14个循环，最后于72℃延伸5min。
在扩增后对两组样品分别进行超声打断和连接酶连接测序接头步骤，经过磁珠纯化后获得长度分布在200-1200bp的待测序样品溶液。对样品进行测序，采用的高通量测序引入可逆终止末端，能够实现边合成边测序。对得到的核酸样品的测序数据进行进行质控筛选，并对照已知的参考基因组信息，将reads进行比对和拼接，统计得到两组样品在全基因组范围的的测序覆盖深度分布并绘制图像曲线。
分析对比两组核酸样品中核酸序列的覆盖深度差异，找出含铅离子的核酸样品组中覆盖深度明显下降的核酸片段，若其覆盖深度相较于不含铅离子的核酸样品组对应的位置下降50％及以上且最低深度＞1，同时该序列长度在10bp及以上，则能够推断此段核酸序列产生了二级结构，从而筛选出核酸适体。在测序深度结果中，发现添加Pb(NO3)2组中ctcagtcgacgacggccagtagctgacatcagtgtacgatctagtcgtcga序列在测序结果中出现连续低于对照组60％的覆盖深度。由此得出这部分序列能够与铅离子作用形成茎环结构阻碍扩增，可以作为铅离子的核酸适体。
实施例3
按照实施例1的方法，对取一段来自于人体淋巴细胞的天然核酸序列进行PDS核酸适体的筛选。向浓度为20μM的核酸样品中加入终浓度为1μM PDS，使其进行充分反应。另一组样品核酸浓度保持一致，但加入等量的水。
对含PDS的核酸样品组和不含PDS的核酸样品组分别进行扩增，采用PCR(聚合酶链式反应)进行扩增。PCR反应体系包含400μM dNTPs、2μM引物、0.025unit/μL rTaq酶和1μL模板于50μL 1×PCR缓冲液中。PCR的流程为变性(98℃，15s)、退火(58℃，30s)、延伸(72℃，90s)，共进行14个循环，最后于72℃延伸5min。
在扩增后对两组样品分别进行超声打断和连接酶连接测序接头步骤，经过磁珠纯化后获得长度分布在200-1200bp的待测序样品溶液。对样品进行测序，采用的高通量测序引入可逆终止末端，能够实现边合成边测序。对得到的核酸样品的测序数据进行进行质控筛选，并对照已知的参考基因组信息，将reads进行比对和拼接，统计得到两组样品在全基因组范围的的测序覆盖深度分布并绘制图像曲线。
分析对比两组核酸样品中核酸序列的覆盖深度差异，找出含PDS的核酸样品组中覆盖深度明显下降的核酸片段，若其覆盖深度相较于不含PDS的核酸样品组对应的位置下降50％及以上且最低深度＞1，同时该序列长度在10bp及以上，则能够推断此段核酸序列产生了二级结构，从而筛选出核酸适体。在测序深度结果中，发现添加PDS的核酸样品组中一种富含鸟嘌呤DNA序列在测序结果中出现连续低于对照组60％的覆盖深度。由此得出这部分序列能够与PDS作用形成G四联体阻碍扩增，可以作为PDS的核酸适体。
Claims (10)
1.一种核酸适体筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将待检验的核酸样品分为两组，第一组核酸样品在不含靶物质的条件下进行扩增，或不进行扩增，第二组核酸样品在含有靶物质的条件下进行扩增；
(2)对扩增后的两组核酸样品分别进行测序；
(3)测序完成后，比较两组核酸样品中核酸序列的覆盖深度差异，找出第二组中覆盖深度明显下降的核酸序列，筛选出候选核酸适体。
2.根据权利要求1所述的核酸适体筛选方法，其特征在于：所述步骤(1)中待检验的核酸样品为真核生物、原核生物或病毒的天然DNA或RNA或来自于人工合成的核酸序列。
3.根据权利要求2所述的核酸适体筛选方法，其特征在于：所述人工合成的核酸序列是一组固定序列的核酸序列的组合或一组由简并碱基构成的核酸序列或两者的结合。
4.根据权利要求1所述的核酸适体筛选方法，其特征在于：所述步骤(1)中的靶物质为金属离子、其他无机离子、有机小分子或有机大分子。
5.根据权利要求1所述的核酸适体筛选方法，其特征在于：所述步骤(1)中的靶物质浓度范围为0.1pM-2mM。
6.根据权利要求1所述的核酸适体筛选方法，其特征在于：所述步骤(1)中核酸扩增包括基于PCR的扩增反应或等温扩增反应或PCR和等温相结合的扩增反应。
7.根据权利要求1所述的核酸适体筛选方法，其特征在于：所述步骤(2)中测序是指第一代测序技术、高通量测序技术或单分子测序技术。
8.根据权利要求1所述的核酸适体筛选方法，其特征在于：所述步骤(3)中核酸序列的覆盖深度，是测序结果中比对到目标序列的碱基总数与目标序列区域大小的比值。
9.根据权利要求1所述的核酸适体筛选方法，其特征在于：所述步骤(3)中比较两组核酸样品中核酸序列的覆盖深度差异，是指对所述两组核酸样品各个核酸序列和碱基位置的覆盖深度分别进行统计，比较两组核酸样品中核酸序列的覆盖深度差异。
10.根据权利要求1所述的核酸适体筛选方法，其特征在于：所述步骤(3)中所述覆盖深度明显下降，是指在第二组中覆盖深度相较于第一组下降50％及以上，且这种下降持续超过10个碱基。
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