JP2024520927A - オリゴヌクレオチドプールからの遺伝子アセンブリー - Google Patents

Abstract

ｇＳｙｎｔｈおよびアダマーベースのＤＮＡ合成方法に必要な物質を生成するための、アレイベースのオリゴヌクレオチド合成を含む、ハイスループットオリゴヌクレオチド合成方法を利用する組成物および方法が、本明細書に開示される。したがって、ｇＳｙｎｔｈおよびアダマー技術をハイスループットオリゴヌクレオチド合成と組み合わせて、慣習的な高忠実度の遺伝子（標的核酸）合成を生成する組成物および方法が、本明細書に開示される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、内容が全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／１８６，８７１号に対する優先権及びその利益を主張する。

配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出されており、かつ参照により全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年５月１１日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、「ＤＮＷＲ－０１０＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名前であり、約２３，４６２バイトのサイズである。

当該技術分野において、高忠実度およびハイスループットで任意の二本鎖ＤＮＡ配列を効率的に産生する遺伝子アセンブリーの必要がある。遺伝子アセンブリーの最近の進歩には、ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０５１８３８号に詳細に記載されており、国際公開第２０２１０５５９６２Ａ１号として公開される、ｇＳｙｎｔｈ法と呼ばれる二本鎖ＤＮＡアセンブリー法が含まれる。ｇＳｙｎｔｈ法は、高忠実度のＤＮＡ配列アセンブリーを生じるが、ｇＳｙｎｔｈ法に必要な物質および二本鎖エレメントを産生するためのアレイベースのオリゴヌクレオチド合成（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｖｏｌｕｍｅ ２１，ｐａｇｅｓ２０－２４，１９９９を参照）などのハイスループットＤＮＡ合成技術の使用は、中間の増幅（Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ－ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ａｎｅｍｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０ Ｄｅｃ １９８５：Ｖｏｌ．２３０，Ｉｓｓｕｅ ４７３２，ｐｐ．１３５０－１３５４）を必要とするため、ｇＳｙｎｔｈ法のスループットを増加させる必要がある。

ｇＳｙｎｔｈ法に加えて、「アダマー」と呼ばれる基本的な構築二本鎖ＤＮＡ構築物として使用される、環境によい（例えば、「グリーン」）二本鎖ＤＮＡアセンブリー／合成方法が最近開発されている。アダマーは、ＤＮＡペイロードならびに配列の操作を可能にする様々な調節エレメントを担持する二本鎖二重ヘアピン構造である。アダマーエレメントは、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）の結合部位、ＩＩ型Ｓ制限エンドヌクレアーゼ（ＩＩＳＲＥ）の結合部位、ペイロードＤＮＡ配列、および単純なＧＮＡモチーフ（Ｙｏｓｈｉｚａｗａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，ＧＮＡ Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｏｏｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｘｔｒａｏｒｄｉｎａｒｉｌｙ Ｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｈａｉｒｐｉｎｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７，３６，１６，４７６１－４７６７）から高親和性リガンド結合を有する複雑な三次元アプタマー（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ．Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｇａｎｄｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌｕｍｅ ３４６，ｐａｇｅｓ８１８－８２２．１９９０； Ｔｕｅｒｋ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＲＮＡ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ０３ Ａｕｇ １９９０：Ｖｏｌ．２４９，Ｉｓｓｕｅ ４９６８，ｐｐ．５０５－５１０）の範囲にあるヘアピン構造を含み得るが、これらに限定されない。

アレイベースのオリゴヌクレオチド合成を含むハイスループットオリゴヌクレオチド合成方法を利用して、上および本明細書に記載されるｇＳｙｎｔｈおよびアダマーベースのＤＮＡ合成方法に必要な物質を生成する組成物および方法が本明細書に開示される。したがって、ｇＳｙｎｔｈおよびアダマー技術をハイスループットオリゴヌクレオチド合成と組み合わせて、慣習的な高忠実度の遺伝子（標的核酸）合成を生成する組成物および方法が、本明細書に開示される。

概要
本開示は、核酸分子の二種以上の複数を含む組成物を提供し、核酸分子の複数のそれぞれは、二種以上の種の核酸分子を含み、異なる種の核酸分子は、異なる核酸配列を含み、対応する複数の少なくとも一つのセットが、単一の反応体積で合わされるとき、セット内の異なる複数からの核酸分子が一緒にハイブリダイズして、少なくとも一種のハイブリダイズされた複合体を形成するように、核酸分子の二種以上の複数内には、対応する複数の少なくとも一つのセットが存在する。

いくつかの態様では、本開示の組成物は、核酸分子の約ａ）六種、ｂ）１０種、ｃ）１５種、ｄ）２０種またはｅ）５０種の複数を含む。

本開示の組成物のいくつかの態様では、核酸分子のそれぞれの複数は、少なくとも約２５種の異なる種の核酸分子を含む。

本開示の組成物のいくつかの態様では、対応する複数のそれぞれのセットは、同じ数の複数を含む。

本開示の組成物のいくつかの態様では、少なくとも一つの種のハイブリダイズされた複合体は、対応する複数のセット内の複数のそれぞれからの一種の核酸種を含む。

本開示の組成物のいくつかの態様では、核酸分子の二種以上の複数は、別個の体積で存在する。

本開示の組成物のいくつかの態様では、対応する複数の少なくとも一つのセットは、核酸分子の少なくとも約ａ）二種、ｂ）三種、ｃ）四種またはｄ）五種の複数を含む。

本開示の組成物のいくつかの態様では、対応する複数のセットの数は、
（式中、Ｘは、複数の核酸分子の総数と等しく、Ｙは、一緒にハイブリダイズして、単一のハイブリダイズされた複合体を形成する核酸の複数の数と等しい）と等しい。

本開示の組成物のいくつかの態様では、ａ）対応する複数の少なくとも一つのセットは、二種の複数を含み、少なくとも一つのハイブリダイズされた複合体は、二種の核酸分子を含み、ｂ）対応する複数の少なくとも一つのセットは、三種の複数を含み、少なくとも一つのハイブリダイズされた複合体は、三種の核酸分子を含むか、またはｃ）対応する複数の少なくとも一つのセットは、四種の複数を含み、少なくとも一つのハイブリダイズされた複合体は、四種の核酸分子を含む。

本開示の組成物のいくつかの態様では、対応する複数のセットが、単一の反応で合わせられるとき、少なくとも約五種の異なるハイブリダイズされた複合体種が形成される。

本開示の組成物のいくつかの態様では、核酸分子の単一の複数内の異なる種の核酸分子は、互いに相補的ではない。

本開示は、少なくとも一つのアダマーを生成する方法を提供し、方法は、ａ）本開示の組成物を用意すること、ｂ）少なくとも一種のハイブリダイズされた複合体が形成されるように、核酸分子の対応する複数の少なくとも一つのセットを単一の反応体積で合わせること、ｃ）ハイブリダイズされた複合体の少なくとも一種を少なくとも一種のリガーゼ酵素と接触させて、ヘアピンによって両末端でキャップされたその少なくとも一つのアダマーを形成することを含む。

いくつかの態様では、本開示の方法は、工程（ｃ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、これにより、適切にライゲートされたアダマーを精製することをさらに含む。

いくつかの態様では、本開示の方法は、少なくとも一種のハイブリダイズされた複合体をＭｕｔＳ酵素と接触させることをさらに含む。

いくつかの態様では、アダマーは、ａ）第一のＩＩ型Ｓ制限エンドヌクレアーゼ（ＩＩＳＲＥ）配列、ｂ）ペイロード配列、ｃ）少なくとも第二のＩＩＳＲＥ配列を含み、アダマーの少なくとも一つの末端は、ヘアピン構造を含む。

いくつかの態様では、アダマーは、アダマーの両末端にヘアピン構造を含む。

いくつかの態様では、アダマーは、ａ）第一のＩＩＳＲＥ配列、ｂ）第二のＩＩＳＲＥ配列、ｃ）ペイロード配列、及びｄ）少なくとも第三のＩＩＳＲＥ配列を含む。

いくつかの態様では、アダマーは、ａ）第一のＩＩＳＲＥ配列、ｂ）第二のＩＩＳＲＥ配列、ｃ）ペイロード配列、ｄ）第三のＩＩＳＲＥ配列、及びｅ）少なくとも第四のＩＩＳＲＥ配列を含む。

いくつかの態様では、アダマーは、多重クローニング部位（ＭＣＳ）配列をさらに含み、ＭＣＳ配列は、一つ以上の制限エンドヌクレアーゼ配列を含む。

いくつかの態様では、ＩＩＳＲＥ配列の少なくとも一つは、ＭｌｙＩ配列、ＮｇｏＡＶＩＩ配列、ＳｓｐＤ５Ｉ配列、ＡｌｗＩ配列、ＢｃｃＩ配列、ＢｃｅｆＩ配列、ＰｌｅＩ配列、ＢｃｅＡＩ配列、ＢｃｅＳＩＶ配列、ＢｓｃＡＩ配列、ＢｓｐＤ６Ｉ配列、ＦａｕＩ配列、ＥａｒＩ配列、ＢｓｐＱＩ配列、ＢｆｕＡＩ配列、ＰａｑＣＩ配列、Ｅｓｐ３Ｉ配列、ＢｂｓＩ配列、ＢｂｖＩ配列、ＢｔｇＺＩ配列、ＦｏｋＩ配列、ＢｓｍＦＩ配列、ＢｓａＩ配列、ＢｃｏＤＩ配列およびＨｇａＩ配列から選択される。

いくつかの態様では、少なくとも一つのヘアピン構造は、アプタマー配列を含む。いくつかの態様では、アプタマー配列は、ｐＬ１アプタマー配列、トロンビン２９－ｍｅｒアパタマー配列、Ｓ２．２アプタマー配列、ＡＲＴ１１７２アプタマー配列、Ｒ１２．４５アプタマー配列、Ｒｂ００８アプタマー配列及び３８ＮＴ ＳＥＬＥＸアパタマー配列から選択される。

本開示は、標的核酸配列を含む核酸分子を合成する方法を提供し、方法は、ａ）前述の請求項のいずれか一項の組成物を用意すること、組成物は、対応する複数のセットが、単一の反応体積で合わされるとき、セット内の異なる複数からの核酸分子が、一緒にハイブリダイズして、二種以上のハイブリダイズされた複合体を形成するように、核酸分子の対応する複数のセットを含み、二種以上の種のハイブリダイズされた複合体は、標的核酸配列の断片を含む、ｂ）二種以上のハイブリダイズされた複合体が形成されるように、核酸分子の対応する複数のセットを単一の反応体積で合わせること、ｃ）二種以上のハイブリダイズされた複合体を少なくとも一つのリガーゼ酵素と接触させて、ヘアピンによって両末端でキャップされた二種以上のアダマーを形成すること、ｄ）二種以上のアダマーをアセンブリーして、標的核酸配列を含む核酸分子を合成することを含む。

本開示の方法のいくつかの態様では、二種以上のアダマーをアセンブリーすることは、アダマーをａ）一つ以上の制限酵素およびｂ）一つ以上のリガーゼで、同時または連続のいずれかで処理し、これにより、標的核酸配列を含む核酸分子をアセンブリーすることを含む。

本開示の方法のいくつかの態様では、二種以上のアダマーをアセンブリーすることは、アダマーをａ）少なくとも一つのガイドＲＮＡと組み合わせたニッカーゼ活性を示す改変されたＣａｓ９およびｂ）一つ以上のリガーゼで、同時または連続のいずれかで処理し、これにより、標的核酸配列を含む核酸分子をアセンブリーすることを含む。

上記および本明細書に記載される態様および／または実施形態のいずれかは、上記および本明細書に記載される任意の他の態様および／または実施形態と組み合わせることができる。

別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において、単数形はまた、文脈が別途明確に示さない限り、複数形を含み、例として、用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、単数形または複数形であると理解され、用語「または」は、包括的であると理解される。一例として、「エレメント」は、一つ以上のエレメントを意味する。本明細書全体を通して、「含むこと」という用語または「含む」もしくは「含むこと」などの変形は、記載されたエレメント、整数もしくはステップ、またはエレメント、整数もしくはステップの群を含むが、任意の他のエレメント、整数もしくはステップ、またはエレメント、整数もしくはステップの群を除外するものではないことを意味すると理解されるであろう。約は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内であると理解することができる。本明細書全体を通して、「ｘ～ｙ」または「ｘ～ｙ」（式中、ｘおよびｙは、二つの値である）と記載される値の範囲の列挙は、ｘおよびｙを含むと理解される。文脈から別段明確でない限り、本明細書に提供されるすべての数値は、「約」という用語によって修飾される。

本明細書に記載されるものと類似または均等な方法および材料は、本開示の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および物質が、以下に記載される。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、すべての目的のためその全体が参照により組み込まれる。本明細書に引用される参考文献は、特許請求される発明の先行技術であるとは認められない。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が、優先する。加えて、物質、方法、および例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。本開示の他の特性および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。

上記の特徴及び更なる特徴は、添付の図面と併せて以下の発明を実施するための形態からより明確に理解されるであろう。

図１は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド対からのアダマーの生成を示す概略図を示す。図１は、二つの一本鎖ＤＮＡ分子からＤＮＡアダマーを構築することを示す。上の鎖および下の鎖、ＤＵＰＬＥＸ ＩＮＳＥＲＴおよび二つのニック部位は、示される通りである。図１に提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号１～７に記載される。 図２は、遺伝子アセンブリーのためのアダマーセットを生成するための対での組み合わせのプールを有する二本鎖システムを示す。左側のパネルは、アダマー生成のための上および下の鎖のプール位置を示す。６つのプールのそれぞれの組み合わせは、相補的な上の鎖および下の鎖の固有の組み合わせを提供する。６つのプールから１５個の可能な対での組み合わせがあり、これは、遺伝子Ａ～Ｏに対応する。右側のパネルは、プールの数と可能な遺伝子アセンブリーの数、一つのプール当たりのアダマー遺伝子セットの数、および一つのプール当たりの異なるオリゴヌクレオチドの総数との間の関連を示す。 図３は、複数のオリゴヌクレオチドアレイプール、アダマー生成のための二つの鎖および三つの鎖の設計からのアダマー生成を示す。３００塩基鎖について、重複する相補領域は長く、二本鎖システムについては２００塩基対並びに三本鎖システムについては、左の鎖と真ん中の鎖の間に２００塩基対および真ん中の鎖と右の鎖については１００塩基対である。二本鎖システムについては、成功したハイブリダイゼーションから生じる二つのニックおよび三本鎖システムのための三つのニックが存在する。これらのニックは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって迅速かつ効率的に分解される。 図４は、遺伝子アセンブリーのためのアダマーセットを生成するための三元の組み合わせを有する三つの標準的なシステムを示す。左側のパネルは、アダマー生成のための真ん中および右の鎖のプール位置を示す。６つのプールのそれぞれの組み合わせは、相補的な左、真ん中および右の鎖の固有の組み合わせを提供する。６つのプールから２０個の可能な対での組み合わせがあり、これは、遺伝子Ａ～Ｔに対応する。右側のパネルは、プールの数と可能な遺伝子アセンブリーの数、一つのプール当たりのアダマー遺伝子セットの数、および一つのプール当たりの異なるオリゴヌクレオチドの総数との間の関連を示す。 図５は、六つのプールアレイレイアウトによる三つの鎖システムを示す。図５は、左に、六つのオリゴヌクレオチドアレイプールにわたる三本鎖システムの組み合わせマップを示し、右に、例示的なアレイレイアウトを示す。三つのプールのそれぞれの組み合わせは、アダマーの単一の遺伝子セットを生じる。ここで、遺伝子Ｓ（薄紫色）は、それぞれのプール１、プール４およびプール６上の五つの別個のオリゴヌクレオチド（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）によってコードされる五つのアダマーから構築される。 図６は、高忠実度の遺伝子配列を生成するためのアダマーを組み合わせるためのプールされたアプローチの使用を示す概略図を示す。内部ＩＩＳＲＥ部位は、黒色のスペックルによって示される。ｇＳｙｎｔｈ部位は、番号を付けられた四角によって示される。 図７は、両末端にヘアピンを含む二本鎖核酸分子である、アダマーの例示的な概略図である。 図８は、本開示の様々なアダマー設計の例示的な概略図を示す。エクソヌクレアーゼ耐性を促進するための固体支持体及び二重ヘアピンへの結合手段である、アダマー設計のいくつかの例が示されており、各々のアダマータイプが隣接するＩＩＳＲＥ部位を有するペイロードを有する。凡例には、いくつかの可能なＩＩＳＲＥ部位及びＲＥ部位、並びにトロンビンアプタマーヘアピンが示されている。 図９は、本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。最初に第１のアダマー及び第２のアダマーを、ＤＮＡライゲーションを使用して、既に固体支持体にロードしたＭＣＳを有する結合スタッドに結合させる。ドナー構築物及びアクセプター構築物が別個の体積で生成される。ドナー構築物及びアクセプター構築物を別個のＩＩＳＲＥで処理して、ライゲート可能な末端が生成される。この図では、アクセプターがＲ１ ＩＩＳＲＥでの消化によって生成され、放出された末端及び酵素がすすぎによって廃棄される。ドナー構築物が紫色のＬ２酵素での消化によって生成される。ドナー構築物溶液（Ｌ２酵素を有する）をアクセプターウェルに移し、２、３、又は４塩基粘着末端ライゲーションに対して８０％超の高い効率を有するＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用してライゲートする。ウェルをエクソヌクレアーゼで処理し、すすぐ。その後、結果として得られたアダマー構築物は、その後の伸長サイクルの準備が整った状態である。 図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、図１０Ｇおよび図１０Ｈは、２７ヌクレオチド長の標的核酸分子を合成するために本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。図１０Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８に記載のものに対応する。図１０Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号９～１０に記載のものに対応する。図１０Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号１１～２２に記載のものに対応する。図１０Ｈに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号２３～３３に記載のものに対応する。 図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、図１０Ｇおよび図１０Ｈは、２７ヌクレオチド長の標的核酸分子を合成するために本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。図１０Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８に記載のものに対応する。図１０Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号９～１０に記載のものに対応する。図１０Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号１１～２２に記載のものに対応する。図１０Ｈに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号２３～３３に記載のものに対応する。 図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、図１０Ｇおよび図１０Ｈは、２７ヌクレオチド長の標的核酸分子を合成するために本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。図１０Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８に記載のものに対応する。図１０Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号９～１０に記載のものに対応する。図１０Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号１１～２２に記載のものに対応する。図１０Ｈに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号２３～３３に記載のものに対応する。 図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、図１０Ｇおよび図１０Ｈは、２７ヌクレオチド長の標的核酸分子を合成するために本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。図１０Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８に記載のものに対応する。図１０Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号９～１０に記載のものに対応する。図１０Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号１１～２２に記載のものに対応する。図１０Ｈに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号２３～３３に記載のものに対応する。 図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、図１０Ｇおよび図１０Ｈは、２７ヌクレオチド長の標的核酸分子を合成するために本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。図１０Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８に記載のものに対応する。図１０Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号９～１０に記載のものに対応する。図１０Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号１１～２２に記載のものに対応する。図１０Ｈに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号２３～３３に記載のものに対応する。 図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、図１０Ｇおよび図１０Ｈは、２７ヌクレオチド長の標的核酸分子を合成するために本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。図１０Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８に記載のものに対応する。図１０Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号９～１０に記載のものに対応する。図１０Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号１１～２２に記載のものに対応する。図１０Ｈに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号２３～３３に記載のものに対応する。 図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、図１０Ｇおよび図１０Ｈは、２７ヌクレオチド長の標的核酸分子を合成するために本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。図１０Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８に記載のものに対応する。図１０Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号９～１０に記載のものに対応する。図１０Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号１１～２２に記載のものに対応する。図１０Ｈに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号２３～３３に記載のものに対応する。 図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、図１０Ｇおよび図１０Ｈは、２７ヌクレオチド長の標的核酸分子を合成するために本開示のアダマーの使用を含む、本開示の核酸を合成する方法の例示的な概略図である。図１０Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８に記載のものに対応する。図１０Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号９～１０に記載のものに対応する。図１０Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号１１～２２に記載のものに対応する。図１０Ｈに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号２３～３３に記載のものに対応する。 図１１Ａ～１１Ｆは、本開示の二本鎖幾何学的合成（ｇＳｙｎｔｈ）の概略図である。図１１Ａは、本開示の二本鎖ｇＳｙｎｔｈ法を使用して合成されるべき配列である。太字および下線の配列の部分は、選択された４ｍｅｒのオーバーハングに対応し、したがって、配列全体を合成するために使用される断片を定義する。図１１Ａに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３４に記載のものに対応する。 図１１Ｂは、図１１Ａに示される配列を構築するために本開示の二本鎖ｇＳｙｎｔｈ法において使用される、図１１Ａに示される配列の個々の二本鎖核酸断片を示す。これらの断片は、図１１Ａにおいて選択される部位に基づき選ばれる。図１１Ｂに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３５～６２に記載のものに対応する。 図１１Ｃは、図１１Ｂ中の断片が、図１１Ａに示される配列を精製するためにアセンブリーされるべき順序を示す、バイナリツリーの概略図である。 図１１Ｄは、図１１Ａに示される配列を合成するための二本鎖ｇＳｙｎｔｈ法における第一ラウンドのライゲーションの概略図である。第一のライゲーションラウンドにおいて、断片１および２、断片３および４、断片５および６、断片７および８、断片９および１０、断片１１および１２、ならびに断片１３および１４は、それらの相補的な５’オーバーハングを介してハイブリダイズされ、次いで、一緒にライゲートされて、断片１＋２、断片３＋４、断片５＋６、断片７＋８、断片９＋１０、断片１１＋１２、および断片１３＋１４が生成される。図１１Ｄに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号３５～６２に記載のものに対応する。 図１１Ｅは、図１１Ａに示される配列を合成するための二本鎖ｇＳｙｎｔｈ法における第二ラウンドのライゲーションの概略図である。第二のライゲーションラウンドにおいて、断片１＋２および３＋４、断片５＋６および７＋８、ならびに断片１１＋１２および１３＋１４は、それらの相補的な５’オーバーハングを介してハイブリダイズされ、次いで、一緒にライゲートされて、断片１＋２＋３＋４、断片５＋６＋７＋８、および断片１１＋１２＋１３＋１４が生成される。図１１Ｅに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号６３～７６に記載のものに対応する。 図１１Ｆは、図１１Ａに示される配列を合成するための二本鎖ｇＳｙｎｔｈ法における第三ラウンドのライゲーションの概略図である。第三のライゲーションラウンドにおいて、断片１＋２＋３＋４および５＋６＋７＋８、ならびに断片９＋１０および１１＋１２＋１３＋１４は、それらの相補的な５’オーバーハングを介してハイブリダイズされ、次いで、一緒にライゲートされて、断片１＋２＋３＋４＋５＋６＋７＋８および断片９＋１０＋１１＋１２＋１３＋１４が生成される。図１１Ｆに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号７７～８４に記載のものに対応する。 図１１Ｇは、図１１Ａに示される配列を合成するための二本鎖ｇＳｙｎｔｈ法における第四および最終ラウンドのライゲーションの概略図である。第四のライゲーションラウンドにおいて、断片１＋２＋３＋４＋５＋６＋７＋８および９＋１０＋１１＋１２＋１３＋１４は、それらの相補的な５’オーバーハングを介してハイブリダイズされ、一緒にライゲートされ、これにより、図１Ａに示される配列が生成される。図１１Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８５～８８に記載のものに対応する。 図１２は、本開示の方法を使用して合成されるべき標的核酸配列の例示的なプロセシングおよび分析を示す。４３１ｂｐの完全長配列は、五つの可変サイズの断片（Ｆ１～Ｆ５）に分割された。これらの断片は、最終配列を生成するために使用されるアダマーのペイロードである。コンピュータプログラムを使用して、ライゲーション反応に適合する十分に間隔を置いた４塩基オーバーハング部位、ならびに最適なＧＣ含量などの他の特徴を確実に予測した。配列全体を、ＩＩＳＲＥ部位（ＢｓｍＦＩ、ＦｏｋＩ、ＢｔｇＺＩ、ＳｆａＮＩ）の存在について分析した。標的配列に存在する部位は、アセンブリーの目的のため特定のＩＩＳＲＥを除外する。 図１３は、図１２で同定された断片に対応するアダマーを示す。予測される断片（青色の矢印は、５’－＞３’の向きを示す）であるアダマーのペイロードは、ＩＩＳＲＥ部位（例えば、内部断片についてはＢｓａＩ）に隣接する。４塩基オーバーハングは、薄オレンジ色のボックス（上の鎖）および薄緑色のボックス（下の鎖）で示される。末端断片Ｆ１およびＦ５については、外部ＩＩＳＲＥ部位は、配列のクローニング後の続くアセンブリーを可能にするよう異なる（ＢｂｓＩ）。断片Ｆ１およびＦ５はまた、増幅のためのフォワードプライマー部位ならびにリバースプライマー部位（拡張されたＴ７および拡張されたＴ３）ならびにクローニングのためのＲＥ部位（ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ）を有する。図１１Ｇに提示される１０個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号８９～１０８に記載のものに対応する。 図１４は、配列決定による、図１３に提示されるアダマーを使用してアセンブリーされた標的核酸配列の検証を示す。クローンは、ピックアップされ、キャピラリーシーケンシングを使用してプラスミドを配列決定された。リバース配列およびフォワード配列は完全に整列され、これにより、オリゴヌクレオチドのプールからのアダマーベースのアセンブリーの精度が検証される。 図１５は、本開示の方法を使用してアセンブリーされた追加の標的核酸配列のアセンブリー手法の設計を示す。 図１５は、本開示の方法を使用してアセンブリーされた追加の標的核酸配列のアセンブリー手法の設計を示す。

本開示は、ｇＳｙｎｔｈベースの方法およびアダマーベースの方法を含むが、これらに限定されない、二本鎖ＤＮＡアセンブリー／合成方法において使用するための、アダマーを含むが、これに限定されない、二本鎖または部分的二本鎖核酸分子を生成するためにプールされた核酸分子を利用する組成物および方法に関する。すなわち、本明細書に記載される組成物および方法は、大量の精製されたヌクレオチドおよびエラープローンＤＮＡポリメラーゼを必要とする二本鎖の介在する増幅を必要とすることなく、プールされた核酸分子の非常に高いオリゴヌクレオチド産生の可能性を利用することによって、既存のｇＳｙｎｔｈベースのＤＮＡアセンブリー／合成方法およびアダマーベースのＤＮＡアセンブリー／合成方法を改善する。一部の態様では、これらのプールされた核酸分子は、アレイベースのオリゴヌクレオチド合成方法を使用して生成することができる。

一態様では、多数のオリゴヌクレオチドプールを生成し、次いで組み合わせて、個々の遺伝子をそれらの組み合わせたプールで生成したアダマーから独自に構築することができる。例えば、ｇＳｙｎｔｈアルゴリズムを使用して、任意の遺伝子を、それぞれの接合部に固有の高忠実度オーバーハング配列を有する比較的少数の断片に分解することができ、これにより、真っ直ぐなフォワード粘着末端ライゲーションを可能にして、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリアプローチ（Ｐｒｙｏｒ Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎａｂｌｉｎｇ ｏｎｅ－ｐｏｔ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｏｆ ｕｎｐｒｅｃｅｄｅｎｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｄａｔａ－ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｄｅｓｉｇｎ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １５（９）：ｅ０２３８５９２．２０２０）と類似の最終産物を生成する。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーが、クローン化された配列と最適に機能し、均一に消化され、選択された高忠実度が重複することに留意することが重要である。二本鎖配列が、５００塩基対である場合（二つの３００塩基オリゴを組み合わせて、調節エレメントのための１００塩基を有するアダマーを生成すると仮定すると、５００塩基または２５０塩基対の二重鎖が残る）、次いで五つの連続配列のライゲーションにより、２．５ｋｂの遺伝子が生成される。いくつかの態様では、本開示の方法の使用者は、任意の個々の遺伝子断片の長さを大きく変動させて、アセンブリー、ＩＩＳＲＥ部位の可能性および二次構造パラメーターを最適に適合させることができる。

いくつかの態様では、アダマー（その構造は、本明細書でさらに詳細に記載される）は、互いにハイブリダイズして、一対の未分解ニッチを有する二本鎖二重ヘアピン構造を形成する、一対の相補的ＤＮＡ鎖の固有の組み合わせによって生成することができる。これらのニックは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼの適用によって修復することができる。ニックが分解されると、アフィニティー試薬と組み合わせたＨｉｓタグ付きＭｕｔＳタンパク質によって、可能性のあるミスマッチを除去することができる（Ｗａｎｇ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｆｉｓｈｉｎｇ ｏｕｔ ｓｕｂｔｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｔａｇｇｅｄ Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＭｕｔＳ．Ｖｏｌｕｍｅ ５４７，Ｉｓｓｕｅｓ １－２，２２ Ｍａｒｃｈ ２００４，Ｐａｇｅｓ ４１－４７）。いくつかの態様では、全ての非アダマーＤＮＡは、Ｔ７エクソヌクレアーゼの適用によって除去される。

ＤＮＡアダマーは、二つの一本鎖ＤＮＡ分子から構築することができる。ＤＵＰＬＥＸ ＩＮＳＥＲＴは、２５０塩基対（これは、３００塩基の推定一本鎖オリゴヌクレオチドサイズから１００塩基の調節配列を可能にする）のオーダーで、大きくすることができる。総配列量が高い可能性があるため、選択性と二本鎖回復の両方の観点からハイブリダイゼーションの忠実度も高い。アニーリングは、安定なヘアピンを有するほぼ完全に二本鎖の配列を生成することができる。二つの「ニック」は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでの簡単な処理によって効率的かつ迅速に修復することができる。限定のライゲーションを高忠実度のハイブリダイゼーションと組み合わせることで、Ｔ７エクソヌクレアーゼ耐性物質のみが、所望のアダマー産物であり得る。加えて、処理を、Ｈｉｓタグ付きＴａｑ ＭｕｔＳタンパク質を用いて行い、可能性のあるミスマッチ塩基対に結合し、続いてＮｉ－ＮＴＡ（ニッケルニトリロ酢酸）アガロースアフィニティ樹脂と接触させて、ＤＮＡを含有するＭｕｔＳ結合ミスマッチを除去し、これにより、実質的に濃縮された純粋な所望の生成物を得ることができる（図１を参照）。

すなわち、いくつかの態様では、本開示のアダマーは、図３の上部のパネルに示される通り、第一の一本鎖核酸分子および第二の一本鎖核酸分子をハイブリダイズすることによって生成することができ、第一の一本鎖核酸分子は、第二の一本鎖核酸分子上の第二の領域に相補的である第一の領域および自己相補的である第二の領域を含み、第二の一本鎖核酸分子は、自己相補的である第一の領域および第一の一本鎖核酸分子上の第一の領域に相補的である第二の領域を含む。第一の一本鎖核酸分子および第二の一本鎖核酸分子を一緒にハイブリダイズして、ハイブリダイズした複合体を生成する。次いで、ハイブリダイズされた複合体は、ミスマッチ塩基に結合し、ＤＮＡをエクソヌクレアーゼ消化に曝露させる、酵素ＭｕｔＳと任意選択的に接触させることができる。次いで、ハイブリダイズされた複合体をリガーゼ酵素と接触させて、ヘアピンによって両末端でキャップされた二本鎖アダマー構造を形成することができる。リガーゼ酵素との接触後、生成物をＴ７エクソヌクレアーゼと接触させて、適切に形成されたアダマーを精製および濃縮することができる。この方法は、本明細書において「二本鎖アダマーアセンブリー方法」と呼ばれる。

したがって、本開示は、本明細書に記載されるアダマーを生成する方法を提供し、方法は、ａ）第一の一本鎖核酸分子および第二の一本鎖核酸分子を用意すること、第一の一本鎖核酸分子および第二の一本鎖核酸分子の配列は、生成されるべきであるアダマーの一部を含み、第一の一本鎖核酸分子は、第二の一本鎖核酸分子上の第二の領域に相補的である第一の領域および自己相補的である第二の領域を含み、第二の一本鎖核酸分子は、自己相補的である第一の領域および第一の一本鎖核酸分子上の第一の領域に相補的である第二の領域を含む、ｂ）第一の一本鎖核酸分子および第二の一本鎖核酸分子をハイブリダイズすること、ならびにｃ）部分的な二本鎖核酸分子をリガーゼ酵素と接触させて、ヘアピンによって両末端でキャップされた二本鎖アダマー構造を形成することを含む。

いくつかの態様では、前述の方法は、工程（ｃ）の生成物をエクソヌクレアーゼで処理し、これにより、適切にライゲートされたアダマーを精製することをさらに含むことができる。

いくつかの態様では、前述の方法は、工程（ｂ）の後および工程（ｃ）の前に、部分的な二本鎖核酸分子をＭｕｔＳ酵素と接触させることをさらに含むことができる。

いくつかの態様では、図３の真ん中のパネルに示される通り、アダマーは、第一の一本鎖核酸分子、第二の一本鎖核酸分子および第三の一本鎖核酸分子をハイブリダイズすることによって生成することができ、第一の一本鎖核酸分子は、第二の一本鎖核酸分子上の第一の領域に相補的である第一の領域および自己相補的である第二の領域を含み、第二の一本鎖核酸分子は、第一の一本鎖核酸分子の第一の領域に相補的である第一の領域および第三の一本鎖核酸分子の第一の領域に相補的である第二の領域を含み、第三の一本鎖核酸分子は、第二の一本鎖核酸分子の第二の領域に相補的である第一の領域および自己相補的である第二の領域を含む。図３において、第一の一本鎖核酸分子は、左の鎖と呼ばれ、第二の一本鎖核酸分子は、真ん中の鎖と呼ばれ、第三の一本鎖核酸分子は、右の鎖と呼ばれる。第一の一本鎖核酸分子、第二の一本鎖核酸分子、および第三の一本鎖核酸分子を一緒にハイブリダイズして、ハイブリダイズした複合体を生成する。次いで、ハイブリダイズされた複合体は、ミスマッチ塩基に結合し、ＤＮＡをエクソヌクレアーゼ消化に曝露させる、酵素ＭｕｔＳと任意選択的に接触させることができる。次いで、ハイブリダイズされた複合体をリガーゼ酵素と接触させて、ヘアピンによって両末端でキャップされた二本鎖アダマー構造を形成することができる。リガーゼ酵素との接触後、生成物をＴ７エクソヌクレアーゼと接触させて、適切に形成されたアダマーを精製および濃縮することができる。三本鎖システムでは、左の鎖および右の鎖に対して真ん中の鎖の位置は、鎖の間のハイブリダイゼーションの程度のバランスを取るように調整することができる。しかしながら、ヘアピンを形成するための自己ハイブリダイゼーションの量と完全なアダマー構造を形成するための交差ハイブリダイゼーションの量との間にはトレードオフがある。この方法は、本明細書において「三本鎖アダマーアセンブリー方法」と呼ばれる。

したがって、本開示は、本明細書に記載されるアダマーを生成する方法を提供し、方法は、ａ）第一の一本鎖核酸分子、第二の一本鎖核酸分子および第三の一本鎖核酸分子を用意すること、第一の一本鎖核酸分子、第二の一本鎖核酸分子、および第三の一本鎖核酸分子の配列は、生成されるべきであるアダマーの一部を含み、第一の一本鎖核酸分子は、第二の一本鎖核酸分子上の第一の領域と相補的である第一の領域および自己相補的である第二の領域を含み、第二の一本鎖核酸分子は、第一の一本鎖核酸分子の第一の領域に相補的である第一の領域および第三の一本鎖核酸分子の第一の領域に相補的である第二の領域を含み、第三の一本鎖核酸分子は、第二の一本鎖核酸分子の第二の領域に相補的である第一の領域および自己相補的である第二の領域を含む、ｂ）第一の一本鎖核酸分子、第二の一本鎖核酸分子、および第三の一本鎖核酸分子をハイブリダイズすること、ならびにｃ）部分的な二本鎖核酸分子をリガーゼ酵素と接触させて、ヘアピンによって両末端でキャップされた二本鎖アダマー構造を形成することを含む。

いくつかの態様では、前述の方法は、工程（ｃ）の生成物をエクソヌクレアーゼで処理し、これにより、適切にライゲートされたアダマーを精製することをさらに含むことができる。

いくつかの態様では、前述の方法は、工程（ｂ）の後および工程（ｃ）の前に、部分的な二本鎖核酸分子をＭｕｔＳ酵素と接触させることをさらに含むことができる。

いくつかの態様では、図３の下部のパネルに示される通り、アダマーは、第一の一本鎖核酸分子、第二の一本鎖核酸分子、第三の一本鎖核酸分子、および第四の一本鎖核酸分子をハイブリダイズすることによって生成することができ、第一の一本鎖核酸分子は、第二の一本鎖核酸分子上の第一の領域に相補的である第一の領域および自己相補的である第二の領域を含み、第二の一本鎖核酸分子は、第一の一本鎖核酸分子の第一の領域に相補的である第一の領域および第三の一本鎖核酸分子の第一の領域に相補的である第二の領域を含み、第三の一本鎖核酸分子は、第二の一本鎖核酸分子の第二の領域に相補的である第一の領域および第四の一本鎖核酸分子上の第一の領域に相補的である第二の領域を含み、第四の一本鎖核酸分子は、第三の一本鎖核酸分子の第二の領域に相補的である第一の領域および自己相補的である第二の領域を含む。第一の一本鎖核酸分子、第二の一本鎖核酸分子、第三の一本鎖核酸分子、および第四の一本鎖核酸分子を一緒にハイブリダイズして、ハイブリダイズした複合体を生成する。次いで、ハイブリダイズされた複合体は、ミスマッチ塩基に結合し、ＤＮＡをエクソヌクレアーゼ消化に曝露させる、酵素ＭｕｔＳと任意選択的に接触させることができる。次いで、ハイブリダイズされた複合体をリガーゼ酵素と接触させて、ヘアピンによって両末端でキャップされた二本鎖アダマー構造を形成することができる。リガーゼ酵素との接触後、生成物をＴ７エクソヌクレアーゼと接触させて、適切に形成されたアダマーを精製および濃縮することができる。三本鎖システムでは、左の鎖および右の鎖に対して真ん中の鎖の位置は、鎖の間のハイブリダイゼーションの程度のバランスを取るように調整することができる。しかしながら、ヘアピンを形成するための自己ハイブリダイゼーションの量と完全なアダマー構造を形成するための交差ハイブリダイゼーションの量との間にはトレードオフがある。この方法は、本明細書において「四本鎖アダマーアセンブリー方法」と呼ばれる。

したがって、本開示は、本明細書に記載されるアダマーを生成する方法を提供し、方法は、ａ）第一の一本鎖核酸分子、第二の一本鎖核酸分子、第三の一本鎖核酸分子、および第四の一本鎖核酸分子を用意すること、第一の一本鎖核酸分子、第二の一本鎖核酸分子、第三の一本鎖核酸分子、および第四の一本鎖核酸分子の配列は、生成されるべきであるアダマーの一部を含み、第一の一本鎖核酸分子は、第二の一本鎖核酸分子上の第一の領域に相補的である第一の領域および自己相補的である第二の領域を含み、第二の一本鎖核酸分子は、第一の一本鎖核酸分子の第一の領域に相補的である第一の領域および第三の一本鎖核酸分子の第一の領域に相補的である第二の領域を含み、第三の一本鎖核酸分子は、第二の一本鎖核酸分子の第二の領域に相補的である第一の領域および第四の一本鎖核酸分子上の第一の領域に相補的である第二の領域を含み、第四の一本鎖核酸分子は、第三の一本鎖核酸分子の第二の領域に相補的である第一の領域および自己相補的である第二の領域を含む、ｂ）第一の一本鎖核酸分子、第二の一本鎖核酸分子、第三の一本鎖核酸分子をハイブリダイズすること、ならびにｃ）部分的な二本鎖核酸分子をリガーゼ酵素と接触させて、ヘアピンによって両末端でキャップされた二本鎖アダマー構造を形成することを含む。

いくつかの態様では、前述の方法は、工程（ｃ）の生成物をエクソヌクレアーゼで処理し、これにより、適切にライゲートされたアダマーを精製することをさらに含むことができる。

いくつかの態様では、前述の方法は、工程（ｂ）の後および工程（ｃ）の前に、部分的な二本鎖核酸分子をＭｕｔＳ酵素と接触させることをさらに含むことができる。

二本鎖アダマーアセンブリー方法、三本鎖アダマーアセンブリー方法および／または四本鎖アダマーアセンブリー方法の文脈において、それぞれの方法に使用される個々の一本鎖核酸分子は、核酸分子の別個の複数（本明細書において「プール」とも呼ばれる）において個々に提供することができ、核酸分子の別個の複数は、アレイベースのオリゴヌクレオチド合成などの方法を使用して生成される。当業者によって理解されるように、アレイベースのオリゴヌクレオチド合成方法は、電気化学的方法、光ベースの化学方法、インクジェット印刷方法または任意のその組み合わせを含むが、これらに限定されない。

すなわち、遺伝子断片セットは、固有の対のプールが、合成されるべき最終遺伝子（標的核酸）構築物の断片のそれぞれを表すアダマーを生成するように組み合わされるように、いくつかのオリゴヌクレオチドプールにわたって分配することができる。例として、それぞれの遺伝子が、五つの断片から構築される六つのオリゴヌクレオチドアレイプールについては、合計１５の遺伝子構築が可能となり、それぞれのプールは、五つの異なる遺伝子の上位または下位の五つの断片を含有する。したがって、オリゴヌクレオチドが、約３００塩基長である、それぞれ２５個のオリゴヌクレオチドの６つのプールは、２．５ｋｂの長さの１５個の遺伝子を構築するのに十分であろう。

対での組み合わせでは、現在のアレイプールの容量が、十分に利用されていないことが明らかである。１２２５個の遺伝子がアセンブリーされ得る５０個のプールがあっても、一つのプール当たりの別個のオリゴヌクレオチドの総数は、わずか２４５である（図２を参照）。一つのプール当たりの別個のオリゴヌクレオチドの数が少ないと、それぞれの特定のオリゴヌクレオチドの量は増加するが、所定の遺伝子を有効にアセンブリーするために必要なそれぞれのオリゴヌクレオチドの総量には限界がある。アダマーを生成するために使用される鎖の数を増加させることによって、一つプール当たりの遺伝子の総数および別個のオリゴヌクレオチドは、特に、多数のプールで劇的に増加する。

別の態様では、二本鎖よりむしろ、三本鎖アダマーアセンブリー方法を利用することができる（図３を参照）。三本鎖システムでは、プールの可能な組み合わせの数は劇的に増加する。二本鎖設計と三本鎖設計の両方について、ランダムな組み合わせよりむしろ特定のアダマーの形成のための強力な選択的利点がある。第一に、アレイプールからの長いオリゴ、例えば、一つの鎖当たり３００塩基を使用することにより、重複する相補的領域は、非常に長く、これは、通常の条件下での堅牢なハイブリダイゼーションを確実にする。第二に、プロセスは、非アダマーＤＮＡを除去するためのＴ７エクソヌクレアーゼ処理を含むため、ニックのライゲーションは、選択的な事象となる。したがって、ハイブリダイゼーションが正しくない場合、アダマーは、一緒にライゲーションして、二重ヘアピン構造を形成せず、Ｔ７エクソヌクレアーゼによって分解される。

別の好ましい実施形態では、四本鎖システムを利用することができる。一つの遺伝子当たり四つの鎖および四つのプールでは、プール数が１０以上になると、遺伝子の数は増える。例えば、１５個のプールで、合計１３６５個の遺伝子を生成することができる（表１を参照）。プールの複雑さが増すと、オリゴヌクレオチドアレイのより効率的な利用がもたらされる。

一部の市販のオリゴヌクレオチドアレイプールは、任意の数の別個のオリゴヌクレオチドで生成されてもよい。この場合、固定されたアレイ表面については、より少ない数の別個のオリゴヌクレオチドが、それぞれのオリゴヌクレオチド配列についてより大きな総質量をもたらす。六つのプールを有する三本鎖システムを考慮すると、それぞれのプールは、５０種の異なるオリゴヌクレオチド種を有し、したがって、組み合わされた三つのプールは、１５０種の別個のオリゴヌクレオチドが識別される（図５を参照）。組み合わせられたプールを使用して、任意の数のアダマーを生成することができるが、オーバーハングの不適切なライゲーションを避けるために、アセンブリー内のアダマーの数を最小に維持することが最良である。

したがって、本開示は、核酸分子の二種以上の複数を含む組成物を提供し、核酸分子の複数のそれぞれは、二種以上の核酸分子を含み、異なる種の核酸分子は、異なる核酸配列を含み、核酸分子の二種以上の複数内で、対応する複数のセットが、単一の反応体積で組み合わされるとき、セット内の複数の少なくとも一種からの少なくとも一種の核酸は、セット内の他の複数の少なくとも一種からの少なくとも一種の核酸分子とハイブリダイズして、少なくとも一種のハイブリダイズした複合体を形成するように、対応する複数の少なくとも一つのセットがある。

したがって、本開示は、核酸分子の二種以上の複数を含む組成物を提供し、核酸分子の複数のそれぞれは、二種以上の核酸分子を含み、異なる種の核酸分子は、異なる核酸配列を含み、核酸分子の二種以上の複数内で、対応する複数のセットが、単一の反応体積で組み合わせられるとき、セット内の異なる複数からの核酸分子が一緒にハイブリダイズして、少なくとも一種のハイブリダイズした複合体を形成するように、対応する複数の少なくとも一つのセットがある。

したがって、本開示は、核酸分子の二種以上の複数を含む組成物を提供し、核酸分子の複数のそれぞれは、二種以上の核酸分子を含み、異なる種の核酸分子は、異なる核酸配列を含み、核酸分子の二種以上の複数内に、対応する複数のセットが、単一の反応体積で組み合わされるとき、セット内のそれぞれの異なる複数からの核酸分子が一緒にハイブリダイズして、少なくとも一種のハイブリダイズした複合体を形成するように、対応する複数の少なくとも一つのセットがある。

前述の組成物のいくつかの態様では、ハイブリダイズされた複合体は、図３に示されるハイブリダイズされた複合体のいずれかであり得る。

前述の組成物のいくつかの態様では、核酸分子のそれぞれの複数内で、単一種の核酸分子は、複数で存在する（すなわち、複数内に存在する核酸分子のその種の一つより多くのコピーがある）。

いくつかの態様では、前述の組成物は、核酸分子の少なくとも約一種、または少なくとも約二種、または少なくとも三種、または少なくとも約四種、または少なくとも約五種、または少なくとも約六種、または少なくとも約七種、または少なくとも約八種、または少なくとも約九種、または少なくとも約１０、または少なくとも約１１、または少なくとも約１２、または少なくとも約１３、または少なくとも約１４、または少なくとも約１５、または少なくとも約１６、または少なくとも約１７、または少なくとも約１８、または少なくとも約１９、または少なくとも約２０、または少なくとも約２５、または少なくとも約３０、または少なくとも約３５、または少なくとも約４０、または少なくとも約４５、または少なくとも約５０、または少なくとも約５５、または少なくとも約６０、または少なくとも約６５、または少なくとも約７０、または少なくとも約７５、または少なくとも約８０、または少なくとも約８５、または少なくとも約９０、または少なくとも約９５、または少なくとも約１００、または少なくとも約１５０、または少なくとも約２００、または少なくとも約２５０、または少なくとも約３００、または少なくとも約３５０、または少なくとも約４００、または少なくとも約４５０、または少なくとも約５００、または少なくとも約５５０、または少なくとも約６００、または少なくとも約６５０、または少なくとも約７００、または少なくとも約７５０、または少なくとも約８００、または少なくとも約８５０、または少なくとも約９００、または少なくとも約９５０、または少なくとも約１０００、または少なくとも約１５００、または少なくとも約２０００、または少なくとも約２５００、または少なくとも約３０００、または少なくとも約３５００、または少なくとも約４０００、または少なくとも約４５００、または少なくとも約５０００、または少なくとも約５５００、または少なくとも約６０００、または少なくとも約６５００、または少なくとも約７０００、または少なくとも約７５００、または少なくとも８０００、または少なくとも約８５００、または少なくとも約９０００、または少なくとも約９５００、または少なくとも約１００００種の複数を含むことができる。

いくつかの態様では、前述の組成物は、核酸分子の約一種、または約二種、または約三種、または約四種、または約五種、または約六種、または約七種、または約八種、または約九種、または約１０、または約１１、または約１２、または約１３、または約１４、または約１５、または約１６、または約１７、または約１８、または約１９、または約２０、または約２５、または約３０、または約３５、または約４０、または約４５、または約５０、または約５５、または約６０、または約６５、または約７０、または約７５、または約８０、または約８５、または約９０、または約９５、または約１００、または約１５０、または約２００、または約２５０、または約３００、または約３５０、または約４００、または約４５０、または約５００、または約５５０、または約６００、または約６５０、または約７００、または約７５０、または約８００、または約８５０、または約９００、または約９５０、または約１０００、または約１５００、または約２０００、または約２５００、または約３０００、または約３５００、または約４０００、または約４５００、または約５０００、または約５５００、または約６０００、または約６５００、または約７０００、または約７５００、または８０００、または約８５００、または約９０００、または約９５００、または約１００００種の複数を含むことができる。

前述の組成物のいくつかの態様では、核酸分子のそれぞれの複数は、少なくとも約一種、または少なくとも約二種、または少なくとも三種、または少なくとも約四種、または少なくとも約五種、または少なくとも約六種、または少なくとも約七種、または少なくとも約八種、または少なくとも約九種、または少なくとも約１０、または少なくとも約１１、または少なくとも約１２、または少なくとも約１３、または少なくとも約１４、または少なくとも約１５、または少なくとも約１６、または少なくとも約１７、または少なくとも約１８、または少なくとも約１９、または少なくとも約２０、または少なくとも約２５、または少なくとも約３０、または少なくとも約３５、または少なくとも約４０、または少なくとも約４５、または少なくとも約５０、または少なくとも約５５、または少なくとも約６０、または少なくとも約６５、または少なくとも約７０、または少なくとも約７５、または少なくとも約８０、または少なくとも約８５、または少なくとも約９０、または少なくとも約９５、または少なくとも約１００、または少なくとも約１５０、または少なくとも約２００、または少なくとも約２５０、または少なくとも約３００、または少なくとも約３５０、または少なくとも約４００、または少なくとも約４５０、または少なくとも約５００、または少なくとも約５５０、または少なくとも約６００、または少なくとも約６５０、または少なくとも約７００、または少なくとも約７５０、または少なくとも約８００、または少なくとも約８５０、または少なくとも約９００、または少なくとも約９５０、または少なくとも約１０００、または少なくとも約１５００、または少なくとも約２０００、または少なくとも約２５００、または少なくとも約３０００、または少なくとも約３５００、または少なくとも約４０００、または少なくとも約４５００、または少なくとも約５０００、または少なくとも約５５００、または少なくとも約６０００、または少なくとも約６５００、または少なくとも約７０００、または少なくとも約７５００、または少なくとも８０００、または少なくとも約８５００、または少なくとも約９０００、または少なくとも約９５００、または少なくとも約１００００、または少なくとも約２００００、または少なくとも約３００００、または少なくとも約４００００、または少なくとも約５００００、または少なくとも約６００００、または少なくとも約７００００、または少なくとも約８００００、または少なくとも約９００００、または少なくとも約１０００００種の異なる種の核酸分子を含むことができる。

前述の組成物のいくつかの態様では、核酸分子のそれぞれの複数は、約一種、または約二種、または約三種、または約四種、または約五種、または約六種、または約七種、または約八種、または約九種、または約１０、または約１１、または約１２、または約１３、または約１４、または約１５、または約１６、または約１７、または約１８、または約１９、または約２０、または約２５、または約３０、または約３５、または約４０、または約４５、または約５０、または約５５、または約６０、または約６５、または約７０、または約７５、または約８０、または約８５、または約９０、または約９５、または約１００、または約１５０、または約２００、または約２５０、または約３００、または約３５０、または約４００、または約４５０、または約５００、または約５５０、または約６００、または約６５０、または約７００、または約７５０、または約８００、または約８５０、または約９００、または約９５０、または約１０００、または約１５００、または約２０００、または約２５００、または約３０００、または約３５００、または約４０００、または約４５００、または約５０００、または約５５００、または約６０００、または約６５００、または約７０００、または約７５００、または８０００、または約８５００、または約９０００、または約９５００、または約１００００、または約２００００、または約３００００、または約４００００、または約５００００、または約６００００、または約７００００、または約８００００、または約９００００、または約１０００００種の異なる種の核酸分子を含むことができる。

前述の組成物のいくつかの態様では、核酸分子の単一の複数内の異なる種の核酸分子は、互いに相補的ではない。

前述の組成物のいくつかの態様では、対応する複数のそれぞれのセットは、同じ数の複数を含む。いくつかの態様では、少なくとも一種のハイブリダイズされた複合体は、対応する複数のセット内の複数のそれぞれからの一種の核酸種を含む。

前述の組成物のいくつかの態様では、核酸分子の二種以上の複数は、別個の体積で存在する（すなわち、それらは、異なる容器内またはアレイの物理的に別個の部分などの、互いに物理的に別個である）。

前述の組成物のいくつかの態様では、対応する複数のセットは、少なくとも約二種の複数、少なくとも約三種の複数、少なくとも約四種の複数、少なくとも約五種の複数、少なくとも約六種の複数、少なくとも約七種の複数、少なくとも約八種の複数、少なくとも約九種の複数、または少なくとも約１０種の複数を含むことができる。

前述の組成物のいくつかの態様では、対応する複数のセットは、約二種の複数、約三種の複数、約四種の複数、約五種の複数、約六種の複数、七種の複数、約八種の複数、約九種の複数、または約１０種の複数を含むことができる。

前述の組成物いくつかの態様では、対応する複数のセットは、二種の複数、三種の複数、四種の複数、五種の複数、六種の複数、七種の複数、八種の複数、九種の複数、または１０種の複数を含むことができる。

前述の組成物のいくつかの態様では、対応する複数のセットの数は、
（式中、Ｘが、核酸分子の複数の総数と等しく、Ｙが、単一のハイブリダイズされた複合体を形成するように一緒にハイブリダイズする核酸の種の数と等しい）と等しい。例えば、ハイブリダイズされた複合体のそれぞれが、三種の核酸分子から構成される、核酸の１０種の複数を含む組成物は、１２０セットの対応する複数を有する。

非限定的な例では、対応する複数のセットが、二種の複数を含む場合、次いで、ハイブリダイズされた複合体は、二種の複数のそれぞれから一つである、二種の核酸分子を含む。非限定的な例では、対応する複数のセットが、三種の複数を含む場合、ハイブリダイズされた複合体は、三種の複数のそれぞれからの一つである、三種の核酸分子を含む。非限定的な例では、対応する複数のセットが、四種の複数を含む場合、ハイブリダイズされた複合体は、四種の複数のそれぞれからの一つである、四種の核酸分子を含む。

前述の組成物のいくつかの態様では、対応する複数のセットが、単一の反応で組み合わされるとき、少なくとも約一種、または少なくとも約二種、または少なくとも約三種、または少なくとも約四種、または少なくとも約五種、または少なくとも約六種、または少なくとも約七種、または少なくとも約八種、または少なくとも約九種、または少なくとも約１０、または少なくとも約１１、または少なくとも約１２、または少なくとも約１３、または少なくとも約１４、または少なくとも約１５、または少なくとも約１６、または少なくとも約１７、または少なくとも約１８、または少なくとも約１９、または少なくとも約２０、または少なくとも約２５、または少なくとも約３０、または少なくとも約３５、または少なくとも約４０、または少なくとも約４５、または少なくとも約５０、または少なくとも約５５、または少なくとも約６０、または少なくとも約６５、または少なくとも約７０、または少なくとも約７５、または少なくとも約８０、または少なくとも約８５、または少なくとも約９０、または少なくとも約９５、または少なくとも約１００種の異なるハイブリダイズされた複合体種を形成することができる。

前述の組成物のいくつかの態様では、対応する複数のセットが、単一の反応で組み合わされるとき、約一種、または約二種、または約三種、または約四種、または約五種、または約六種、または約七種、または約八種、または約九種、または約１０、または約１１、または約１２、または約１３、または約１４、または約１５、または約１６、または約１７、または約１８、または約１９、または約２０、または約２５、または約３０、または約３５、または約４０、または約４５、または約５０、または約５５、または約６０、または約６５、または約７０、または約７５、または約８０、または約８５、または約９０、または約９５、または約１００種の異なるハイブリダイズされた複合体種を形成することができる。

前述の組成物のいくつかの態様では、形成されたその少なくとも一種のハイブリダイズされた複合体は、少なくとも一種のハイブリダイズされた複合体が、適当なリガーゼおよび任意選択的に、ＭｕｔＳ酵素と接触される場合、次いで、本開示のアダマーは、ハイブリダイズされた複合体を形成するように、本開示のアダマーに対応する。

したがって、本開示は、本開示の少なくとも一つのアダマーを生成する方法を提供し、方法は、ａ）本開示の組成物を用意すること、ｂ）少なくとも一種のハイブリダイズされた複合体が形成されるように、核酸分子の対応する複数の少なくとも一つのセットを単一の反応体積で組み合わせること、ｃ）少なくとも一種のハイブリダイズされた複合体をリガーゼ酵素と接触させて、ヘアピンによって両末端でキャップされた二本鎖アダマー構造を形成することを含む。いくつかの態様では、ハイブリダイズされた複合体の少なくとも一種は、本明細書に記載される二本鎖アダマーアセンブリー方法に記載される通り、二種の一本鎖核酸分子を含む。いくつかの態様では、ハイブリダイズされた複合体の少なくとも一種は、本明細書に記載される三本鎖アダマーアセンブリー方法に記載される通り、三種の一本鎖核酸分子を含む。いくつかの態様では、ハイブリダイズされた複合体の少なくとも一種は、本明細書に記載される四本鎖アダマーアセンブリー方法に記載される通り、四種の一本鎖核酸分子を含む。

いくつかの態様では、前述の方法は、工程（ｃ）の生成物をエクソヌクレアーゼで処理し、これにより、適切にライゲートされたアダマーを精製することをさらに含むことができる。

いくつかの態様では、前述の方法は、工程（ｂ）の後および工程（ｃ）の前に、部分的な二本鎖核酸分子をＭｕｔＳ酵素と接触させることをさらに含むことができる。

加えて、本開示は、本開示の少なくとも一種の二本鎖断片を精製する方法を提供し、方法は、ａ）本開示の組成物を用意すること、ｂ）ハイブリダイズされた複合体の少なくとも一種が形成されるように、核酸分子の対応する複数の少なくとも一つのセットを単一の反応体積で組み合わせること、ハイブリダイズされた複合体の少なくとも一種は、少なくとも一種の二本鎖断片を含む、を含む。いくつかの態様では、少なくとも一種の二本鎖断片は、本明細書に記載される通り、ｇＳｙｎｔｈ合成方法において使用するための断片である。

本開示のアダマーベースの方法および組成物

アダマー

本開示は、少なくとも一つのアダマーを含む組成物を提供する。本明細書で使用される場合、アダマーという用語は、両末端にヘアピン構造を含む二本鎖核酸分子を説明するために使用される。アダマーが固体表面に固定化されているいくつかの態様では、アダマーは、固体表面に結合していない分子の末端に位置する単一のヘアピンを含み得る。固体表面に固定化されたアダマー及び二つのアダマーの例示的な概略図が、図７に示される。アダマーは、本明細書に記載の一つ以上の特徴を含むことができる。

いくつかの態様では、アダマーは、ＤＮＡを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなることができる。

いくつかの態様では、アダマーは、一つ以上の多重クローニング部位（ＭＣＳ）配列を含むことができる。いくつかの態様では、ＭＣＳ配列は、対応する制限エンドヌクレアーゼで切断されて、３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑末端を生成することができる一つ以上の制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）配列を含むことができる。

当業者に理解されるであろうように、「平滑末端」は、不対合ヌクレオチドが存在しないＤＮＡ断片の末端を説明するために使用される。

当業者に理解されるであろうように、５’オーバーハングという用語は、鎖の一方の５’末端に位置する部分的二本鎖核酸分子の一本鎖部分を指すために使用される。

当業者に理解されるであろうように、３’オーバーハングという用語は、鎖の一方の３’末端に位置する部分的二本鎖核酸分子の一本鎖部分を指すために使用される。

いくつかの態様では、アダマーは、対応するＩＩ型Ｓ制限エンドヌクレアーゼ（以下、ＩＩＳＲＥ）で切断され得る少なくとも一つのオフセット切断ＩＩ型Ｓ制限エンドヌクレアーゼ（ＩＩＳＲＥ）配列（以下、ＩＩＳＲＥ配列）を含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、少なくとも一つのＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、少なくとも三つのＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、少なくとも四つのＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。

いくつかの態様では、ＩＩＳＲＥ配列は、対応するＩＩＳＲＥでの切断により「平滑末端」の作製がもたらされるような配列である。

いくつかの態様では、ＩＩＳＲＥ配列は、対応するＩＩＳＲＥでの切断により１ヌクレオチド長の５’オーバーハングの作製がもたらされるような配列である。いくつかの態様では、ＩＩＳＲＥ配列は、対応するＩＩＳＲＥでの切断により２ヌクレオチド長の５’オーバーハングの作製がもたらされるような配列である。いくつかの態様では、ＩＩＳＲＥ配列は、対応するＩＩＳＲＥでの切断により３ヌクレオチド長の５’オーバーハングの作製がもたらされるような配列である。いくつかの態様では、ＩＩＳＲＥ配列は、対応するＩＩＳＲＥでの切断により４ヌクレオチド長の５’オーバーハングの作製がもたらされるような配列である。いくつかの態様では、ＩＩＳＲＥ配列は、対応するＩＩＳＲＥでの切断により５ヌクレオチド長の５’オーバーハングの作製がもたらされるような配列である。いくつかの態様では、ＩＩＳＲＥ配列は、対応するＩＩＳＲＥでの切断により約１ヌクレオチド～約５ヌクレオチド長の５’オーバーハングの作製がもたらされるような配列である。

ＩＩＳＲＥ配列の非限定的な例に加えて、それらの対応するＩＩＳＲＥ、並びにＩＩＳＲＥ配列及び対応するＩＩＳＲＥの切断によって作製されるオーバーハング／平滑末端の説明が表２に示される。したがって、アダマーは、表２に記載のＩＩＳＲＥ配列のうちの一つ以上を含むことができる。

いくつかの態様では、アダマーの末端に位置するヘアピン構造又はヘアピン（互換的に使用される）は、少なくとも約１、又は少なくとも約二、又は少なくとも約三、又は少なくとも約四、又は少なくとも約五、又は少なくとも約六、又は少なくとも約七、又は少なくとも約八、又は少なくとも約九、又は少なくとも約１０、又は少なくとも約１１、又は少なくとも約１２、又は少なくとも約１３、又は少なくとも約１４、又は少なくとも約１５、又は少なくとも約１６、又は少なくとも約１７、又は少なくとも約１８、又は少なくとも約１９、又は少なくとも約２０、又は少なくとも約２１、又は少なくとも約２２、又は少なくとも約２３、又は少なくとも約２４、又は少なくとも約２５、又は少なくとも約２６、又は少なくとも約２７、又は少なくとも約２８、又は少なくとも約２９、又は少なくとも約３０、又は少なくとも約３１、又は少なくとも約３２、又は少なくとも約３３、又は少なくとも約３４、又は少なくとも約３５、又は少なくとも約３６、又は少なくとも約３７、又は少なくとも約３８、又は少なくとも約３９、又は少なくとも約４０、又は少なくとも約４１、又は少なくとも約４２、又は少なくとも約４３、又は少なくとも約４４、又は少なくとも約４５、又は少なくとも約４６、又は少なくとも約４７、又は少なくとも約４８、又は少なくとも約４９、又は少なくとも約５０ヌクレオチドを含むことができる。

上述のように、アダマーは、ヘアピン構造によりいずれかの末端がキャップされている。ヘアピン構造は、いくつかの役割を果たす。第一に、ヘアピンは、アダマーのエクソヌクレアーゼ消化に対する保護を提供する。これにより、本開示の方法における所与の反応からの未反応中間体の除去が可能になり、これにより、生成中のアダマー及びアダマー伸長後の産物の両方に純度が提供される。第二に、ヘアピン構造は、アダマーを固体支持体に結合させるための手段を提供する。これらの結合は、特定の固体支持結合リガンドに結合するアプタマーの結合によって、ＢａｍＨＩなどの従来のＲＥでの消化後のＭＣＳによるライゲーションによって、ラムダファージｃｏｓ部位によるライゲーションによって、又は一本鎖固体支持体結合アンカーＮＡへのハイブリダイゼーションによって、直接生成される。最後に、本明細書に記載のヘアピンは、ビオチンなどの非天然修飾を必要とすることなく、アダマーの固体支持体（例えば、ビーズ）への結合を可能にする。したがって、本開示のアダマーは、完全に天然の手段を使用して合成することができ、小規模及び／又は大規模なホスホラミダイト合成の必要性を取り除く。したがって、本開示のアダマー及び方法は、核酸分子のより高速で安価な合成を可能にし、毒性の低い廃棄物を発生させることができる。

いくつかの態様では、アダマーの末端に位置するヘアピンは、アダマーの親和性精製及び／又はアダマーの固体支持体（例えば、ビーズ）への結合を可能にする構造配列を含むことができる。

いくつかの態様では、アダマーの末端に位置するヘアピンは、制御された自己切断を可能にする酵素配列（例えば、ＤＮＡザイム配列）を含むことができる。

いくつかの態様では、アダマーの末端に位置するヘアピンは、一つ以上の制限酵素部位を含むことができる。理論に束縛されることを望むものではないが、ヘアピン内の一つ以上の制限酵素部位は、対応する制限酵素で切断されて、少なくとも一つの一本鎖オーバーハングを生成することができ、その後、これを使用して、切断されたアダマーを、少なくとも一つの一本鎖オーバーハングに相補的な核酸を含む固体支持体（例えば、ビーズ）にハイブリダイズ及び／又はライゲートすることができる。

いくつかの態様では、アダマーの末端に位置するヘアピンは、アプタマー配列を含むことができる。理論に束縛されることを望むものではないが、アプタマー配列は、親和性精製及び／又は固体支持体（例えば、ビーズ）への結合に使用することができる。アプタマー配列の非限定的な例が表３に示される。

いくつかの態様では、アダマーは、ラムダファージｃｏｓ部位を含むことができる。

いくつかの態様では、アダマーは、本明細書に記載の方法のうちの一つを使用して合成される核酸の断片を含む「Ｎ－ｍｅｒ配列」を含むことができる。「Ｎ－ｍｅｒ配列」、「ペイロード」、「ペイロード配列」、「Ｎ－ｍｅｒペイロード」および「二本鎖インサート」という用語は、本明細書で互換的に使用される。

いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約３ヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約３ヌクレオチド長である。３ヌクレオチド長のＮ－ｍｅｒ配列は、本明細書で３－ｍｅｒと称される。

いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約４ヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約４ヌクレオチド長である。４ヌクレオチド長のＮ－ｍｅｒ配列は、本明細書で４－ｍｅｒと称される。

いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約５ヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約５ヌクレオチド長である。５ヌクレオチド長のＮ－ｍｅｒ配列は、本明細書で５－ｍｅｒと称される。

いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約６ヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約６ヌクレオチド長である。６ヌクレオチド長のＮ－ｍｅｒ配列は、本明細書で６－ｍｅｒと称される。

いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、任意の数のヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも約５０ヌクレオチド、または少なくとも約７５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド、または少なくとも約１２５ヌクレオチド、または少なくとも約１５０ヌクレオチド、または少なくとも約１７５ヌクレオチド、または少なくとも約２００ヌクレオチド、または少なくとも約２２５ヌクレオチド、または少なくとも約２５０ヌクレオチド、または少なくとも約２７５ヌクレオチド、または少なくとも約３００ヌクレオチド長とすることができる。

いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、任意の数のヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、Ｎ－ｍｅｒ配列は、約２５ヌクレオチド、または約５０ヌクレオチド、または約７５ヌクレオチド、または約１００ヌクレオチド、または約１２５ヌクレオチド、または約１５０ヌクレオチド、または約１７５ヌクレオチド、または約２００ヌクレオチド、または約２２５ヌクレオチド、または約２５０ヌクレオチド、または約２７５ヌクレオチド、または約３００ヌクレオチド長とすることができる。

いくつかの態様では、アダマーは、ＭＣＳ配列、第一のＩＩＳＲＥ配列、Ｎ－ｍｅｒ配列、及び少なくとも第二のＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、ＭＣＳ配列、続いて第一のＩＩＳＲＥ配列、続いてＮ－ｍｅｒ配列、続いて少なくとも第二のＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。前述のアダマーの例示的な概略図が、アダマー設計番号１～４として図８に示される。図８に示されるアダマー設計番号１～３の非限定的な例では、第一のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに４ヌクレオチド長の５’オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列であり、Ｎ－ｍｅｒ配列は、３－ｍｅｒ配列であり、少なくとも第二のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに平滑末端を作製するＩＩＳＲＥ配列である。図８に示されるアダマー設計番号４の非限定的な例では、第一のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに平滑末端を作製するＩＩＳＲＥ配列であり、Ｎ－ｍｅｒ配列は、３－ｍｅｒ配列であり、少なくとも第二のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに３ヌクレオチド長の５’オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列である。

いくつかの態様では、アダマーは、ＭＣＳ配列、第一のＩＩＳＲＥ配列、第二のＩＩＳＲＥ配列、Ｎ－ｍｅｒ配列、第三のＩＩＳＲＥ配列、及び少なくとも第四のＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。いくつかの態様では、ＭＣＳ配列、続いて第一のＩＩＳＲＥ配列、続いて第二のＩＩＳＲＥ配列、続いてＮ－ｍｅｒ配列、続いて第三のＩＩＳＲＥ配列、続いて少なくとも第四のＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。前述のアダマーの例示的な概略図が、アダマー設計番号５として図８に示される。図８に示されるアダマー設計番号５の非限定的な例では、第一のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに４ヌクレオチド長の５’オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列であり、第二のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに４ヌクレオチド長の５’オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列であり、Ｎ－ｍｅｒ配列は、３－ｍｅｒ配列であり、第三のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに４ヌクレオチド長の５’オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列であり、少なくとも第四のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに平滑末端を作製するＩＩＳＲＥ配列である。

いくつかの態様では、アダマーは、第一のＭＣＳ配列、第一のＩＩＳＲＥ配列、Ｎ－ｍｅｒ配列、少なくとも第二のＩＩＳＲＥ配列、及び少なくとも第二のＭＣＳ配列を含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、第一のＭＣＳ配列、続いて第一のＩＩＳＲＥ配列、続いてＮ－ｍｅｒ配列、続いて少なくとも第二のＩＩＳＲＥ配列、続いて少なくとも第二のＭＣＳ配列を含むことができる。前述のアダマーの例示的な概略図が、アダマー設計番号６として図８に示される。図８に示されるアダマー設計番号６の非限定的な例では、第一のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに平滑末端を作製するＩＩＳＲＥ配列であり、Ｎ－ｍｅｒ配列は、３－ｍｅｒ配列であり、少なくとも第二のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに４ヌクレオチド長の５－オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列である。

いくつかの態様では、アダマーは、第一のＭＣＳ配列、第一のＩＩＳＲＥ配列、第二のＩＩＳＲＥ配列、Ｎ－ｍｅｒ配列、第三のＩＩＳＲＥ配列、少なくとも第四のＩＩＳＲＥ配列、及び少なくとも第二のＭＣＳ配列を含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、第一のＭＣＳ配列、続いて第一のＩＩＳＲＥ配列、続いて第二のＩＩＳＲＥ配列、続いてＮ－ｍｅｒ配列、続いて第三のＩＩＳＲＥ配列、続いて少なくとも第四のＩＩＳＲＥ配列、続いて少なくとも第二のＭＣＳ配列を含むことができる。前述のアダマーの例示的な概略図が、アダマー設計番号７として図８に示される。図８に示されるアダマー設計番号７の非限定的な例では、第一のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに平滑末端を作製するＩＩＳＲＥ配列であり、第二のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに４ヌクレオチド長の５’オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列であり、Ｎ－ｍｅｒ配列は、３－ｍｅｒ配列であり、第三のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに４ヌクレオチド長の５’オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列であり、少なくとも第四のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに平滑末端を作製するＩＩＳＲＥ配列である。

いくつかの態様では、アダマーは、アプタマー配列、第一のＩＩＳＲＥ配列、Ｎ－ｍｅｒ配列、少なくとも第二のＩＩＳＲＥ配列、及びＭＣＳ配列を含むヘアピンを含むことができる。いくつかの態様では、アダマーは、アプタマー配列、続いて第一のＩＩＳＲＥ配列、続いてＮ－ｍｅｒ配列、続いて少なくとも第二のＩＩＳＲＥ配列、続いてＭＣＳ配列を含むヘアピンを含むことができる。前述のアダマーの例示的な概略図が、アダマー設計番号７として図８に示される。図８に示されるアダマー設計番号７の非限定的な例では、アプタマー配列は、トロンビンアプタマー配列であり、第一のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに４ヌクレオチド長の５’オーバーハングを作製するＩＩＳＲＥ配列であり、Ｎ－ｍｅｒ配列は、３－ｍｅｒ配列であり、少なくとも第二のＩＩＳＲＥ配列は、切断されたときに平滑末端を作製するＩＩＳＲＥである。

二つのＩＩＳＲＥ配列がアダマー内で互いに隣接して含まれている場合、これらのＩＩＳＲＥ配列は、「入れ子状ＩＩＳＲＥ配列」又は「入れ子状ＩＩＳＲＥ部位」と呼ぶことができる。いくつかの態様では、入れ子状ＩＩＳＲＥ配列は、互いに直接隣接する二つのＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。いくつかの態様では、入れ子状ＩＩＳＲＥ配列は、互いに隣接しているが、約１～約１０ヌクレオチド離れている二つのＩＩＳＲＥ配列を含むことができる。

理論に束縛されることを望むものではないが、いくつかのＩＩＳＲＥ部位が第一の部位とペイロードとの間の他のＩＩＳＲＥ部位に適合するようにそれらの認識部位から十分に離間された切断部位を有するため、ＩＩＳＲＥ部位を入れ子状にすることが可能である。したがって、いくつかの態様では、アダマーは、ペイロード（Ｎ－ｍｅｒ配列）の両側に固有の平滑切断部位及び４塩基オーバーハング部位を含むことができる。理論に束縛されることを望むものではないが、これにより、日常的な核酸生成を行うのに必要とされるアダマー試薬の数が有意に減少する。

理論に束縛されることを望むものではないが、入れ子状ＩＩＳＲＥ配列をアダマーに含めることにより、本開示の方法において二つの別個の部位を有する同じ位置で切断するためのいくつかの選択肢が提供される。二つの別個の部位を有する同じ位置で切断する選択肢は、一般的な核酸合成のためにライブラリ（以下を参照されたい）で必要とされる別個のアダマーの数を減少させることができる。

いくつかの態様では、アダマーは、増幅プライマーの同族配列を含むが、これに限定されない、クローニングを容易にするために当該技術分野で既知の任意の要素を含むことができる。理論に束縛されることを望むものではないが、増幅プライマーの同族配列をアダマーに含めることにより、クローン増殖のための特定のアダマー設計の回復が可能になり得る。

いくつかの態様では、アダマーは、プラスミド又はバクテリオファージ内での発酵によるアダマーの大規模な生成を容易にするために当該技術分野で既知の任意の要素を含むことができる。かかる要素には、ＤＮＡザイム瘢痕に対応する配列、及び／又はある特定のＤＮＡザイムを使用した切除後のアダマーの円滑な折り畳みを容易にする配列が含まれるが、これらに限定されない（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｐｒａｅｔｏｒｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７、５５２、８４－８７を参照されたい）。

本開示のアダマーを使用した核酸合成法

本明細書に記載のアダマーは、本明細書に記載の方法で使用されて、任意の標的核酸配列を含む核酸分子を合成することができる。標的核酸配列は、本明細書において「標的核酸」または「遺伝子」とも称される。

いくつかの態様では、標的核酸配列は、少なくとも約１００、又は少なくとも約２００、又は少なくとも約３００、又は少なくとも約５００、又は少なくとも約６００、又は少なくとも約７００、又は少なくとも約８００、又は少なくとも約９００、又は少なくとも約１０００、又は少なくとも約１５００、又は少なくとも約２０００、又は少なくとも約２５００、又は少なくとも約３０００、又は少なくとも約３５００、又は少なくとも約４０００、又は少なくとも約４５００、又は少なくとも約５０００ヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、標的二本鎖核酸は、少なくとも一つのホモポリマー配列を含むことができる。

いくつかの態様では、標的核酸配列は、少なくとも一つのホモポリマー配列を含むことができる。本明細書で使用される場合、ホモポリマー配列という用語は、単一のヌクレオチドの反復又は小さいモチーフの反復を含むが、これらに限定されない、任意のタイプの反復核酸配列を指すために使用される。いくつかの態様では、ホモポリマー配列は、少なくとも約１０ヌクレオチド、又は少なくとも約２０ヌクレオチド、又は少なくとも約３０ヌクレオチド、又は少なくとも約４０ヌクレオチド、又は少なくとも約５０ヌクレオチド、又は少なくとも約６０ヌクレオチド、又は少なくとも約７０ヌクレオチド、又は少なくとも約８０ヌクレオチド、又は少なくとも約９０ヌクレオチド、又は少なくとも約１００ヌクレオチド長とすることができる。

いくつかの態様では、標的核酸配列は、少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約のＧＣ含有量を有することができる。

本開示の合成法の一部として、一つ以上のアダマーを固体支持体に固定化することができる。固体支持体は、少なくとも一つのビーズを含むが、これに限定されない、当該技術分野で既知の任意の固体支持体とすることができる。いくつかの態様では、少なくとも一つのビーズは、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、アガロース、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの態様では、少なくとも一つのビーズは、磁性とすることができる。いくつかの態様では、固体支持体は、ウェル又はチャンバーを含む。いくつかの態様では、固体支持体は、複数のウェル又はチャンバーを含むことができる。いくつかの態様では、複数のウェルは、マルチウェルプレートを含む。いくつかの態様では、固体支持体は、ガラスを含むことができる。いくつかの態様では、固体支持体は、ガラススライドを含むことができる。いくつかの態様では、固体支持体は、石英を含むことができる。いくつかの態様では、固体支持体は、石英スライドを含むことができる。いくつかの態様では、固体支持体は、ポリスチレンを含むことができる。いくつかの態様では、固体支持体は、ポリスチレンスライドを含むことができる。いくつかの態様では、固体支持体は、コーティングを含むことができ、コーティングは、望ましくないタンパク質、望ましくない核酸、又は他の望ましくない生体分子の非特異的結合を防止する。いくつかの態様では、コーティングは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。いくつかの態様では、コーティングは、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）を含むことができる。

アダマーがアプタマー配列を含むヘアピンを含むいくつかの態様では、アダマーは、アプタマー配列への結合を介して固体支持体に固定化することができる。すなわち、固体支持体は、アダマー上のアプタマー配列に結合する少なくとも一つの部分を含むことができる。したがって、アダマーが表３に記載のアプタマー配列のうちの一つを含むヘアピンを含む非限定的な例では、固体支持体は、表３に列記される対応するリガンドを含むことができる。

アダマーがＭＣＳ配列を含むいくつかの態様では、アダマーは、ａ）アダマーを少なくとも一つの対応する制限エンドヌクレアーゼと接触させてＭＣＳ配列を切断し、それにより、５’オーバーハング又は３’オーバーハングを生成することと、ｂ）５’オーバーハング又は３’オーバーハングを固体支持体上の相補的な一本鎖核酸分子にハイブリダイズし、それにより、アダマーを固体支持体に固定化することとを含む方法によって、固体支持体に固定化することができる。前述の方法は、固体支持体上の相補的な一本鎖核酸分子にハイブリダイズされたアダマーをリガーゼと接触させ、それにより、アダマーと固体支持体上の相補的な一本鎖核酸分子をライゲートすることを更に含むことができる。

アダマーがＭＣＳ配列を含むいくつかの態様では、アダマーは、ａ）アダマーを少なくとも一つの対応する制限エンドヌクレアーゼと接触させてＭＣＳ配列を切断し、それにより、平滑末端を生成することと、ｂ）アダマーの平滑末端を固体支持体上に位置する核酸分子にライゲートし、それにより、アダマーを固体支持体に固定化することとを含む方法によって、固体支持体に固定化することができる。

いくつかの態様では、固体支持体に結合したアダマーは、本明細書で「結合スタッド」と称することができる。

本開示のアダマーベースの核酸アセンブリー／合成方法の概略図が、図９に示される。

本方法の第一のステップでは、固体支持体（図９ではビーズ又は表面として示されている）上に固定化されたアダマーが提供される。このアダマーは、本明細書で「結合スタッド」と称され、上述の方法のうちのいずれかを使用して一方の末端が固体支持体に接続されており、他方の末端がヘアピンでキャップされている。結合スタッドは、ＭＣＳ配列も含む。本方法の次のステップでは、結合スタッドが、ＭＣＳ配列を切断する制限エンドヌクレアーゼと接触し、それにより、３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑端部が生成される。本方法の次のステップでは、ＭＣＳ配列、第一のＩＩＳＲＥ配列（図９では「Ｌ１」として示されている）、第一のＮ－ｍｅｒ配列（図９では「ペイロード番号１」として示されている）、及び第二のＩＩＳＲＥ配列（図９では「Ｒ１」として示されている）を含む第一のアダマーが、ＭＣＳ配列を切断する制限エンドヌクレアーゼと接触し、それにより、３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑末端が生成される。

本方法の次のステップでは、切断された第一のアダマーは、切断された結合スタッドと、切断されたアダマーと、リガーゼ酵素とを接触させることによって、切断された結合スタッドにライゲートされ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第一のＩＩＳＲＥ配列、ペイロード番号１配列、及び第二のＩＩＳＲＥ配列を含む第一のライゲーション生成産物が生成される（図９の左側を参照されたい）。その後、第一のライゲーション産物がエクソヌクレアーゼで処理されて、あらゆるライゲートされていない結合スタッド及び／又は第一のアダマーが除去される。

その後、上述のステップが、固体支持体上に固定化された別のアダマーと、ＭＣＳ配列、第三のＩＩＳＲＥ配列（図９では「Ｒ２」として示されている）、第二のＮ－ｍｅｒ配列（図９では「ペイロード番号２」として示されている）、及び第四のＩＩＳＲＥ配列（図９では「Ｌ２」として示されている）を含む第二のアダマーとを用いて繰り返されて、固体支持体に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第三のＩＩＳＲＥ配列、ペイロード番号２配列、及び第四のＩＩＳＲＥ配列を含む第二のライゲーション産物が生成される（図９の右側を参照されたい）。

本方法の次のステップでは、第１のライゲーション産物が、第二のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ１）を切断するＩＩＳＲＥ（「図９ではＲ１酵素」として示されている）と接触し、それにより、３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑末端が生成され、それにより、ａ）固体支持体に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第一のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ１）、ペイロード番号１配列、及び３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑末端を含む第１の切断された産物と、ｂ）第二のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ１）を含む第２の切断された産物とが作製される。その後、第２の切断された産物が洗浄によって廃棄される。

本方法の次のステップでは、第２のライゲーション産物が、第四のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ２）を切断するＩＩＳＲＥ（図９では「Ｌ２酵素」として示されている）と接触し、それにより、３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑末端が生成され、それにより、ａ）溶液中に放出され、かつ一方の末端にヘアピン、第３のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ２）、ペイロード番号２配列、及び３’オーバーハング、５’オーバーハング、又は平滑末端を含む第３の切断された産物と、ｂ）固体支持体に固定化されており、かつＭＣＳ配列及び第四のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ２）を含む第４の切断された産物とが作製される。

次のステップでは、第１の切断された産物と第３の切断された産物が、第１の切断された産物と、第３の切断された産物と、リガーゼ酵素とを接触させる（例えば、第３の切断された産物を含む溶液が固体表面に固定化された第１の切断された産物を含む溶液に移され、リガーゼ酵素が溶液に添加される）ことによって一緒にライゲートされ、それにより、固体表面に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第一のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ１）、ペイロード番号１配列、ペイロード番号２配列、及び第三のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ２）を含む第３のライゲーション産物が生成される。その後、このライゲーション反応がエクソヌクレアーゼで処理されて、あらゆるライゲートされていない第１の切断された産物及び／又は第３の切断された産物が除去される。

上述のステップは、標的核酸配列が合成されるまで繰り返すことができる。

例示的な２７ヌクレオチド長の標的核酸配列の合成の概略図が図１０Ａ～１０Ｈに示される。合成される配列は、図１０Ａの上部に示されている。配列は、標的核酸配列を合成するために一緒にライゲートされるアダマーに組み込まれる３個のヌクレオチド又は４個のヌクレオチドのいずれかと重複する１１個の６－ｍｅｒ断片に細分される。図１０Ｂは、６－ｍｅｒ断片を含むアダマーがライゲートされて標的核酸配列を効率的に合成する順序をマッピングする例示的な標的核酸配列のアセンブリツリーを示す。アセンブリー及び奇数対偶数のオーバーハングの配置に矛盾するいくつかの異なる方法が存在するが、このアセンブリー順序は、ＩＩＳＲＥ酵素部位と生成される配列の適合性によって決定されるべきである。図１０Ｂでは、番号付けされた６－ｍｅｒ（１）～（１１）は、図１０Ｃ～１０Ｈの番号付けされた６－ｍｅｒに対応する。ツリーの各々のノードにおける数は、アセンブリーの各々のステップにおけるペイロード長に対応する。「４」及び「３」は、使用されるオーバーハングの長さを示す。結果として得られるペイロード配列の長さは、長さ＝ａ＋ｂ－ｎであり、式中、「ａ」及び「ｂ」は入力ペイロードの長さであり、「ｎ」はオーバーハングの長さである。

標的核酸配列の合成の第一のステップが図９Ｃに示されており、ＧＡＣの３－ｍｅｒ配列を含むアダマー及びＡＴＣの３－ｍｅｒ配列を含むアダマーのロードによりＧＡＣＡＴＧ ６－ｍｅｒを含むアダマーが形成されることを示しており、これは、図１０Ｂでは６－ｍｅｒ番号１である。ＧＡＣＡＴＧ六量体を生成するために、ＭＣＳ配列を含む第一の結合スタッドと、ＭＣＳ配列、第一のＩＩＳＲＥ配列（図１０Ｃでは「Ｌ１」として示されている）、配列ＧＡＣを含む３－ｍｅｒ配列、及び第二のＩＩＳＲＥ配列（図１０Ｃでは「Ｒ１」として示されている）を含む第一のアダマーとが一つ以上の制限エンドヌクレアーゼと接触してＭＣＳ配列を切断し、それにより、相補的なオーバーハングが生成される。その後、これらの相補的なオーバーハングがハイブリダイズされ、ハイブリダイズされた複合体をリガーゼ酵素と接触させることによってアダマーと結合スタッドが一緒にライゲートされて、固体表面に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第一のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ１）、３－ｍｅｒ配列ＧＡＣ及び第二のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ１）を含むライゲーション産物番号１が得られる。同じプロセスを、ＭＣＳ配列を含む第二の結合スタッドと、ＭＣＳ配列、第三のＩＩＳＲＥ配列（図１０Ｃでは「Ｌ２」として示されている）、配列ＡＴＧを含む３－ｍｅｒ配列決定、及び第四のＩＩＳＲＥ配列（図１０Ｃでは「Ｒ２」として示されている）を含む第二のアダマーを用いて繰り返して、固体表面に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第三のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ２）、３－ｍｅｒ配列ＡＴＧ、及び第四のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ２）を含むライゲーション産物番号２を得ることができる。次に、ライゲーション産物番号１が、第二のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ１）を切断するＩＩＳＲＥ（図１０Ｃでは「Ｒ１酵素」として示されている）と接触し、それにより、固体表面に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第一のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ１）、及び３－ｍｅｒ配列ＧＡＣ、続いて平滑末端を含む切断された産物番号１が生成される。同様に、ライゲーション産物番号２は、第三のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ２）を切断するＩＩＳＲＥ（図１０Ｃでは「Ｌ２酵素」として示されている）と接触し、それにより、溶液中に放出され、かつ平滑末端、３－ｍｅｒ配列ＡＴＧ、及び第四のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ２）を含む切断された産物番号２が生成される。その後、切断された産物番号１と切断された産物番号２がリガーゼ酵素を使用して一緒にライゲートされて、固体支持体に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第一のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ１）、６－ｍｅｒ配列ＧＡＣＡＴＧ、及び第四のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ２）を含むライゲーション産物番号３が得られる。これらの産物は、任意選択で、エクソヌクレアーゼで処理されて、あらゆるライゲートされていない切断された産物番号１及び／又は切断された産物番号２を除去することができる。本段落に記載のステップを、異なる３－ｍｅｒ配列を含む追加のアダマーを用いて繰り返して、図１０Ｂに示される６－ｍｅｒ配列番号２～１１を含むアダマーを生成することができる。

本方法は図１０Ｄに続き、６－ｍｅｒ配列番号１を含むアダマーと６－ｍｅｒ配列番号２を含むアダマーのライゲーションを示している（図１０Ｂを参照されたい）。アダマー番号１は、固体表面に固定化されており、ＭＣＳ配列、図１０Ｃの第一のＩＩＳＲＥ部位（Ｌ１）、６－ｍｅｒ配列ＧＡＣＡＴＧ（図１０Ｂの６－ｍｅｒ配列番号１）、及び図１０Ｃの第四のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ２）を含む。アダマー番号２は、固体表面に固定化されており、ＭＣＳ配列、第五のＩＩＳＲＥ部位（図１０Ｄでは「Ｌ３」）、６－ｍｅｒ配列ＡＴＧＡＧＧ（図１０Ｂの６－ｍｅｒ配列番号２）、及び第六のＩＩＳＲＥ部位（図１０Ｄでは「Ｒ３」として示されている）を含む。アダマー番号１が第四のＩＩＳＲＥ部位（Ｒ２）を切断するＩＩＳＲＥと接触して、Ｎ－ｍｅｒ配列に一本鎖オーバーハングが生成され、それにより、固体表面に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第一のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ１）、及び一本鎖オーバーハングを有するＮ－ｍｅｒ配列を含む切断された産物番号３が生成される。アダマー番号２が第五のＩＩＳＲＥ部位（Ｌ３）を切断するＩＩＳＲＥと接触して、Ｎ－ｍｅｒ配列に一本鎖オーバーハングが生成され、それにより、溶液中に放出され、かつ一本鎖オーバーハングを有するＮ－ｍｅｒ配列及び第六のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ３）を含む切断された産物番号４が生成される。その後、切断された産物番号３と切断された産物番号４がリガーゼ酵素を使用して一緒にライゲートされて、固体表面に固定化されており、かつＭＣＳ配列、第一のＩＩＳＲＥ配列（Ｌ１）、Ｎ－ｍｅｒ配列ＧＡＣＡＴＧＡＧＧ（合成される標的核酸配列中の最初の九個のヌクレオチド）、及び第六のＩＩＳＲＥ配列（Ｒ３）を含むライゲーション産物番号４が得られる。ライゲーション産物番号４は、任意選択で、エクソヌクレアーゼで処理されて、あらゆるライゲートされていない切断された産物番号１及び／又は切断された産物番号２を除去することができる。

本方法は図１０Ｅに続き、ここで、ライゲーション産物番号４及び６－ｍｅｒ配列番号３（図１０Ｂを参照されたい）を含むアダマーが対応するＩＩＳＲＥで処理されて、切断された産物が生成され、その後、これらが一緒にライゲートされて、固体表面に固定化されており、かつ合成される標的核酸配列の最初の１１個のヌクレオチドであるＮ－ｍｅｒ配列ＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴ（配列番号１１６）を含むアダマーが生成される。

２７ヌクレオチド長の標的核酸配列に対応するＮ－ｍｅｒ配列を含むアダマーが合成されるまで、連続ＩＩＳＲＥ消化及びライゲーションが図１０Ｂに示されるアセンブリマップに従って図１０Ｆ～１０Ｈで繰り返される。最終ステップでは、最終合成アダマーを、２７ヌクレオチド長の標的核酸配列に隣接するＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥで処理することによって、２７ヌクレオチド長の標的核酸配列を最終合成アダマーから切除することができる。

前述の方法は、以下のように説明することができる：ａ）固体支持体に固定化された本開示の第一のアダマーを提供することであって、第一のアダマーが、第一のＩＩＳＲＥ配列、続いて第一のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第二のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示の第二のアダマーを提供することであって、第二のアダマーが、第三のＩＩＳＲＥ配列、続いて第二のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第四のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第一のアダマーを、第一のアダマー内に位置する第二のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第一のＩＩＳＲＥ配列と、第一のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも一つとを含む第一の切断された産物を生成することと、ｄ）第二のアダマーを、第二のアダマー内に位置する第三のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第二のＮ－ｍｅｒ配列と、第四のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも一つとを含む第二の切断された産物を生成することであって、第二の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第一の切断された産物と第二の切断された産物をライゲートして、第一のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第一の切断された産物及び／又は第二の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、ステップ（ａ）～（ｆ）を繰り返すことと。

前述の方法は、以下のように説明することができる：ａ）固体支持体に固定化された本開示の第一のアダマーを提供することであって、第一のアダマーが、第一のＩＩＳＲＥ配列、続いて第一のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第二のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示の第二のアダマーを提供することであって、第二のアダマーが、第三のＩＩＳＲＥ配列、続いて第二のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第四のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第一のアダマーを、第一のアダマー内に位置する第二のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第一のＩＩＳＲＥ配列と、第一のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも一つとを含む第一の切断された産物を生成することと、ｄ）第二のアダマーを、第二のアダマー内に位置する第三のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第二のＮ－ｍｅｒ配列と、第四のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも一つとを含む第二の切断された産物を生成することであって、第二の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第一の切断された産物と第二の切断された産物をライゲートして、第一のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第一の切断された産物及び／又は第二の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、ステップ（ｃ）～（ｆ）を繰り返すことと、を含む、方法、を含む、方法。

前述の方法は、以下のように説明することができる：ａ）固体支持体に固定化された本開示の第一のアダマーを提供することであって、第一のアダマーが、第一のＩＩＳＲＥ配列、続いて第一のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第二のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示の第二のアダマーを提供することであって、第二のアダマーが、第三のＩＩＳＲＥ配列、続いて第二のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第四のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第一のアダマーを、第一のアダマー内に位置する第二のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第一のＩＩＳＲＥ配列と、第一のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも一つとを含む第一の切断された産物を生成することと、ｄ）第二のアダマーを、第二のアダマー内に位置する第三のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第二のＮ－ｍｅｒ配列と、第四のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも一つとを含む第二の切断された産物を生成することであって、第二の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第一の切断された産物と第二の切断された産物をライゲートして、第一のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第一の切断された産物及び／又は第二の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、一つ以上の追加のアダマーを用いてステップ（ａ）～（ｆ）を繰り返すことと。

前述の方法は、以下のように説明することができる：ａ）固体支持体に固定化された本開示の第一のアダマーを提供することであって、第一のアダマーが、第一のＩＩＳＲＥ配列、続いて第一のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第二のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示の第二のアダマーを提供することであって、第二のアダマーが、第三のＩＩＳＲＥ配列、続いて第二のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第四のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第一のアダマーを、第一のアダマー内に位置する第二のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第一のＩＩＳＲＥ配列と、第一のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも一つとを含む第一の切断された産物を生成することと、ｄ）第二のアダマーを、第二のアダマー内に位置する第三のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第二のＮ－ｍｅｒ配列と、第四のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも一つとを含む第二の切断された産物を生成することであって、第二の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第一の切断された産物と第二の切断された産物をライゲートして、第一のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第一の切断された産物及び／又は第二の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、一つ以上の追加のアダマーを用いてステップ（ｃ）～（ｆ）を繰り返すことと、を含む、方法、を含む、方法。

前述の方法は、以下のように説明することができる：ａ）固体支持体に固定化された本開示の第一のアダマーを提供することであって、第一のアダマーが、第一のＩＩＳＲＥ配列、続いて第一のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第二のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示の第二のアダマーを提供することであって、第二のアダマーが、第三のＩＩＳＲＥ配列、続いて第二のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第四のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第一のアダマーを、第一のアダマー内に位置する第二のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第一のＩＩＳＲＥ配列と、第一のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも一つとを含む第一の切断された産物を生成することと、ｄ）第二のアダマーを、第二のアダマー内に位置する第三のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第二のＮ－ｍｅｒ配列と、第四のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも一つとを含む第二の切断された産物を生成することであって、第二の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第一の切断された産物と第二の切断された産物をライゲートして、第一のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第一の切断された産物及び／又は第二の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、ステップ（ｆ）の産物及び一つ以上の追加のアダマーを使用してステップ（ａ）～（ｆ）を繰り返すことと。

前述の方法は、以下のように説明することができる：ａ）固体支持体に固定化された本開示の第一のアダマーを提供することであって、第一のアダマーが、第一のＩＩＳＲＥ配列、続いて第一のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第二のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示の第二のアダマーを提供することであって、第二のアダマーが、第三のＩＩＳＲＥ配列、続いて第二のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第四のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第一のアダマーを、第一のアダマー内に位置する第二のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第一のＩＩＳＲＥ配列と、第一のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも一つとを含む第一の切断された産物を生成することと、ｄ）第二のアダマーを、第二のアダマー内に位置する第三のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第二のＮ－ｍｅｒ配列と、第四のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも一つとを含む第二の切断された産物を生成することであって、第二の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第一の切断された産物と第二の切断された産物をライゲートして、第一のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第一の切断された産物及び／又は第二の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、ステップ（ｆ）の産物及び一つ以上の追加のアダマーを使用してステップ（ｃ）～（ｆ）を繰り返すことと、を含む、方法、を含む、方法。

前述の方法は、以下のように説明することができる：ａ）固体支持体に固定化された本開示の第一のアダマーを提供することであって、第一のアダマーが、第一のＩＩＳＲＥ配列、続いて第一のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第二のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示の第二のアダマーを提供することであって、第二のアダマーが、第三のＩＩＳＲＥ配列、続いて第二のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第四のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第一のアダマーを、第一のアダマー内に位置する第二のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第一のＩＩＳＲＥ配列と、第一のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも一つとを含む第一の切断された産物を生成することと、ｄ）第二のアダマーを、第二のアダマー内に位置する第三のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第二のＮ－ｍｅｒ配列と、第四のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも一つとを含む第二の切断された産物を生成することであって、第二の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第一の切断された産物と第二の切断された産物をライゲートして、第一のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第一の切断された産物及び／又は第二の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、ステップ（ｆ）の産物及び／又は一つ以上の追加のアダマーを使用してステップ（ａ）～（ｆ）の任意の組み合わせを繰り返すことと。

前述の方法は、以下のように説明することができる：ａ）固体支持体に固定化された本開示の第一のアダマーを提供することであって、第一のアダマーが、第一のＩＩＳＲＥ配列、続いて第一のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第二のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｂ）固体支持体に固定化された本開示の第二のアダマーを提供することであって、第二のアダマーが、第三のＩＩＳＲＥ配列、続いて第二のＮ－ｍｅｒ配列、続いて第四のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含む、提供することと、ｃ）第一のアダマーを、第一のアダマー内に位置する第二のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、固体支持体に固定化されており、かつ第一のＩＩＳＲＥ配列と、第一のＮ－ｍｅｒ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも一つとを含む第一の切断された産物を生成することと、ｄ）第二のアダマーを、第二のアダマー内に位置する第三のＩＩＳＲＥ配列を切断するＩＩＳＲＥと接触させ、それにより、溶液中に放出され、かつ第二のＮ－ｍｅｒ配列と、第四のＩＩＳＲＥ配列と、３’オーバーハング、５’オーバーハング、及び平滑末端のうちの少なくとも一つとを含む第二の切断された産物を生成することであって、第二の切断された産物がヘアピン構造により一方の末端がキャップされている、生成することと、ｅ）リガーゼ酵素を使用して第一の切断された産物と第二の切断された産物をライゲートして、第一のライゲーション産物を生成することと、ｆ）ステップ（ｅ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、ライゲートされていない第一の切断された産物及び／又は第二の切断された産物を除去することと、ｇ）標的核酸配列を含む核酸分子が合成されるまで、ステップ（ｆ）の産物及び／又は一つ以上の追加のアダマーを使用してステップ（ｃ）～（ｆ）の任意の組み合わせを繰り返すことと、を含む、方法、を含む、方法。

「プールされる合成方法」と呼ばれる別のアダマーベースの遺伝子合成方法が、図６に概略図で示される。図６に示すように、プールされる合成方法では、複数の異なるアダマー種を含む複数のアダマーが、共通の体積でもたらされる。アダマー種のそれぞれは、ヘアピン、続いて第一のＩＩＳＲＥ配列、続いてペイロード配列、続いて第二のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピンを含む。アダマー種のうちの二つは、完全にアセンブリー／合成された標的核酸配列を放出する方法の終わりに切断される「末端ＩＩＳＲＥ配列」を含む。これらのアダマー種の概略図が、図６に示される。ＩＩＳＲＥ配列は、点線のボックスとして示され、末端ＩＩＳＲＥ配列は、特異的に標識される。ペイロード配列は、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ｄ」および「Ｅ」と示される。すなわち、図６に示される非限定的な例では、標的遺伝子は、アセンブリープロセス目的のため五つの断片に分割されている。複数のアダマーを共通の体積でもたらした後、アダマーは、末端ＩＩＳＲＥ配列を除き、ＩＩＳＲＥ配列のそれぞれを切断する一つ以上のＩＩＳＲＥと接触させ、これにより、一本鎖オーバーハング部位を得、これは、「１」、「２」、「３」、「４」、「５」および「６」と標識された縞模様のボックスによって図６に示される。次のステップでは、相補的な一本鎖オーバーハング部位は、一緒にハイブリダイズされ、得られたハイブリダイズされた複合体はリガーゼと接触されて、消化されたアダマーを一緒にライゲーションされる。図６に示されるように、このライゲーション工程は、ＩＩＳＲＥの存在下で行うことができる。ライゲーション後、ライゲーション産物をＴ７エクソヌクレアーゼで処理して、任意のライゲーションされていないアダマーを除去することができる。ライゲーションステップおよびＴ７エクソヌクレアーゼ消化ステップの結果が、図６の下部に示され、すなわち、標的核酸配列（「Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ」）は、完全にアセンブリーされ、両側のヘアピンに隣接する。次いで、標的核酸配列は、末端ＩＩＳＲＥ配列を切断する一つ以上のＩＩＳＲＥを用いて、この生成物によって切断され得る。

プールされる合成方法では、選択されるＩＩＳＲＥおよびＩＩＳＲＥ配列は、一本鎖オーバーハング配列のハイブリダイゼーション後に標的核酸配列のアセンブリーをもたらす相補的な一本鎖オーバーハングのセットを生成するように設計される。プールされる合成方法のいくつかの態様では、標的核酸をアセンブリーするために使用されるべき複数のアダマー内の利用可能なＩＩＳＲＥ配列の数は二であり、第一のＩＩＳＲＥ配列は、最初のアセンブリーを達成するために使用され、第二のＩＩＳＲＥ配列は、プラスミドまたはバクテリオファージにおけるその後のクローニングのために、アセンブリーされた遺伝子を放出するためである。設計における追加の考慮事項は、アセンブリーの全長ならびにそれぞれの断片の長さである。ライゲーションと干渉するＧ四重鎖などの二次構造が形成される場合があるため、部位に隣接する配列を考慮する必要がある。遺伝子をアセンブリーするために使用される断片の数も、重要な考慮事項である。４００ｂｐの遺伝子アセンブリーは、例えば、それぞれ２００ｂｐの二つのアダマーペイロードのみを必要とする。同様に、１ｋｂの遺伝子は、２００ｂｐの少なくとも五つのアダマーペイロードを必要とするであろう。

したがって、本開示者、標的核酸配列を含む核酸分子を合成する方法を提供し、標的核酸配列は、二つ以上の配列断片に分けられ、方法は、ａ）複数のアダマーを用意すること、複数のアダマーは、複数の異なるアダマー種を含み、アダマー種のそれぞれは、ヘアピン構造、続いて第一のＩＩＳＲＥ配列、続いてペイロード配列、続いて第二のＩＩＳＲＥ配列、続いてヘアピン構造を含み、アダマー種のペイロード配列は、標的核酸配列の配列断片のうちの一つに対応し、複数のアダマーは、全ての配列断片について少なくとも一つのアダマーを含む、ｂ）複数のアダマーを、アダマーのそれぞれにおける少なくとも一つのＩＩＲＳＲＥ配列を切断し、これにより、少なくとも一つの一本鎖オーバーハングを生成する少なくとも一つのＩＩＳＲＥと接触させること、ｃ）切断されたアダマーを少なくとも一つのリガーゼ酵素と接触させることによって切断されたアダマーを一緒にライゲーションし、これにより、標的核酸配列を含む核酸分子を合成することを含む。いくつかの態様では、前述の方法は、ＭｕｔＳ酵素処理ステップをさらに含むことができる。いくつかの態様では、前述の方法は、ステップ（ｃ）の産物をエクソヌクレアーゼで処理し、それにより、適切にライゲートされた産物を精製することを更に含むことができる。

特定の標的核酸の合成のためのアダマー設計は、アセンブリー／合成されるべき配列を分析し、ＩＩＳＲＥ部位が存在しないことを確認し、次に、個々の遺伝子断片のライゲーションに最適な接合部位を選択する。接合部位は、ｇＳｙｎｔｈのアセンブリープロセスを開発する過程で発見された互換性基の集合に由来する。互換性基には、五個の４塩基５’オーバーハング部位（国際公開第２０２１０５５９６２Ａ１号として公開される、ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０５１８３８号を参照）という少ないものから３５個の４塩基５’オーバーハング部位（Ｐｏｔａｐｏｖ Ｖ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｆｏｕｒ Ｂａｓｅ Ｏｖｅｒｈａｎｇ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｂｙ Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ．ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．２０１８，７，１１，２６６５－２６７４ ａｎｄ Ｐｒｙｏｒ Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎａｂｌｉｎｇ ｏｎｅ－ｐｏｔ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｏｆ ｕｎｐｒｅｃｅｄｅｎｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｄａｔａ－ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｄｅｓｉｇｎ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １５（９）：ｅ０２３８５９２．２０２０）という多いものまであり、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーにおいて使用されている。

本開示の方法のいくつかの態様では、リガーゼ酵素は、ヒトＤＮＡリガーゼＩＩＩ（ｈＬｉｇ３）とすることができる。当業者に理解されるであろうように、ｈＬｉｇ３は、高い平滑末端ライゲーション効率（６０％超）を呈する。本開示の方法のいくつかの態様では、リガーゼ酵素は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼとすることができる。当業者に理解されるであろうように、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、２、３、又は４ヌクレオチド長の３’オーバーハング又は５’オーバーハングを含む核酸断片の高いライゲーション効率（８０％超）を呈する。リガーゼ酵素は、当該技術分野で既知の任意のリガーゼ酵素とすることができる。

本開示の方法のいくつかの態様では、エクソヌクレアーゼは、Ｔ７エクソヌクレアーゼとすることができる。

改変されたＣａｓ９酵素を使用して、完全な二本鎖切断の代わりにニックを生成することができることが示されている（Ｍａｌｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，ＣＡＳ９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ３１，ｐ８３３－８３８，２０１３，ａｎｄ Ａｎｎ Ｒａｎ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｃｅｌｌ，ｖｏｌｕｍｅ １５４，ｉｓｓｕｅ ６，ｐ１３８０－１３８９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １２，２０１３）。かかるＣａｓ９ニッカーゼ活性は、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によって標的ＤＮＡ中の特定の部位に向けられ得る。加えて、このニッカーゼ活性は、反対の様式で別個のプラスＤＮＡ鎖およびマイナスＤＮＡ鎖に向けることができ、これにより、消化後にオーバーハングしている一本鎖ＤＮＡを曝露するニックをもたらす。このような反対のニッキング部位の研究は、１０～１５塩基オーバーハングが最良のライゲーション結果をもたらし、興味深いことに、１０塩基対の間隔が、二重らせんの一巻きの距離であることを示す（Ｗａｎｇ．Ｒ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｎｉｃｋｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，Ｍａｒｃｈ ２０１３，Ｖｏｌｕｍｅ ８，Ｉｓｓｕｅ ３，ｅ５７９４３）。したがって、アダマーベースの合成方法のいくつかの態様では、アダマー内のペイロードの末端を標的とするｓｇＲＮＡと組み合わせれた変異Ｃａｓ９を使用して、ＩＲＥＥ配列およびＩＲＥＳではなく、対象の遺伝子をアセンブリーするためにライゲーションされ得るオーバーハングを生成することができる。

本開示の方法のいくつかの態様では、合成された標的核酸配列は、少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の純度を有する。

いくつかの態様では、合成された標的核酸配列の純度は、正しい／所望のライゲーション産物に対応する、単回のライゲーション反応又は複数回のライゲーション反応の一部として形成された総ライゲーション産物のパーセンテージを指す。理論に束縛されることを望むものではないが、核酸分子のライゲーションを含む本開示の方法は、複数のライゲーション産物を生成することができ、それらのうちのいくつかは正しい／所望のライゲーション産物に対応し、それらのうちのいくつかは望ましくないもの（副反応、誤ったライゲーションなど）である。ライゲーション産物又は合成される標的分子の純度は、正しい／所望のライゲーション産物に対応する、形成された総ライゲーション産物のパーセンテージに対応するパーセンテージとして表すことができる。

本開示のｇＳｙｎｔｈ法および組成物

本明細書に開示されるプールされたオリゴヌクレオチド合成方法および組成物は、国際公開第２０２１０５５９６２Ａ１号として公開される、ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０５１８３８号に詳細に記載されるｇＳｙｎｔｈ方法と組み合わせて使用することができる。ｇＳｙｎｔｈ方法は、長い任意の二本鎖核酸配列の合成のための「二本鎖幾何学的合成（ｇＳｙｎｔｈ）」およびそれと関連する組成物とも呼ばれる。二本鎖ｇＳｙｎｔｈアセンブリー反応では、標的配列（すなわち、合成されるべき配列）は、隣接する二本鎖核酸断片のセットに計算して分解され、次いで、これらの隣接する二本鎖核酸断片は、系統的アセンブリー方法において、一対の並列ライゲーション反応において一緒にライゲートされる。これらの断片は、３’および／または５’オーバーハング一本鎖Ｎ－ｍｅｒ部位を有し、以下の三つの特性を有する：１）Ｎｍｅｒ部位は、ライゲーション反応において自己ハイブリダイズまたは自己反応性ではない。２）断片の一方の端のＮｍｅｒ部位は、他方の端のＮｍｅｒ部位と交差ハイブリダイズまたは交差反応しない。最後に、３）ライゲーション反応において隣接する断片とハイブリダイズおよびライゲーションし、新規のより長い二本鎖断片をもたらす、隣接する断片対のそれぞれの断片上に一つのＮ－ｍｅｒ部位がある。国際公開第２０２１０５５９６２Ａ１号として公開される、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０５１８３８号は、より効率的かつ正確なライゲーション反応を促進し、これにより、本開示の二本鎖ｇＳｙｎｔｈ法が、既存の核酸アセンブリーおよび合成技術を使用して達成できない前例のない長さの核酸配列を合成するために使用されることを可能にする、好ましいＮ－ｍｅｒ部位を提供する。本開示の二本鎖断片は、本明細書に記載される方法を使用して生成することができる。

図１１Ａ～１１Ｇは、二本鎖ｇＳｙｎｔｈアセンブリー反応の非限定的な例を示す。図１１Ａは、本開示の二本鎖ｇＳｙｎｔｈ法を使用して合成されるべき標的配列（「５０５０Ｓｅｑ０３」と称される）である。太字および下線の配列の部分は、選択された４ｍｅｒのオーバーハングに対応し、したがって、配列全体を合成するために使用される断片を定義する。図１１Ｂは、５０５０Ｓｅｑ０３を構築するために本開示の二本鎖ｇＳｙｎｔｈ法において使用される、図１１Ａに示される配列の個々の二本鎖核酸断片を示す。図１１Ｄは、図１１Ａに示される配列を合成するための二本鎖ｇＳｙｎｔｈ法における第一ラウンドのライゲーションの概略図である。第一のライゲーションラウンドにおいて、断片１および２、断片３および４、断片５および６、断片７および８、断片９および１０、断片１１および１２、ならびに断片１３および１４は、それらの相補的な５’オーバーハングを介してハイブリダイズされ、次いで、一緒にライゲートされて、断片１＋２、断片３＋４、断片５＋６、断片７＋８、断片９＋１０、断片１１＋１２、および断片１３＋１４が生成される。図１Ｅは、図１１Ａに示される配列を合成するための二本鎖ｇＳｙｎｔｈ法における第二ラウンドのライゲーションの概略図である。第二のライゲーションラウンドにおいて、断片１＋２および３＋４、断片５＋６および７＋８、ならびに断片１１＋１２および１３＋１４は、それらの相補的な５’オーバーハングを介してハイブリダイズされ、次いで、一緒にライゲートされて、断片１＋２＋３＋４、断片５＋６＋７＋８、および断片１１＋１２＋１３＋１４が生成される。図１Ｆは、図１１Ａに示される配列を合成するための二本鎖ｇＳｙｎｔｈ法における第三ラウンドのライゲーションの概略図である。第三のライゲーションラウンドにおいて、断片１＋２＋３＋４および５＋６＋７＋８、ならびに断片９＋１０および１１＋１２＋１３＋１４は、それらの相補的な５’オーバーハングを介してハイブリダイズされ、次いで、一緒にライゲートされて、断片１＋２＋３＋４＋５＋６＋７＋８および断片９＋１０＋１１＋１２＋１３＋１４が生成される。図１Ｇは、図１１Ａに示される配列を合成するための二本鎖ｇＳｙｎｔｈ法における第四および最終ラウンドのライゲーションの概略図である。第四のライゲーションラウンドにおいて、断片１＋２＋３＋４＋５＋６＋７＋８および９＋１０＋１１＋１２＋１３＋１４は、それらの相補的な５’オーバーハングを介してハイブリダイズされ、一緒にライゲートされ、これにより、図１１Ａに示される配列が生成される。

したがって、本明細書に開示されるプールされたオリゴヌクレオチド合成方法および組成物を使用して、上記、および国際公開第２０２１０５５９６２Ａ１号として公開される、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０５１８３８号において記載されるｇＳｙｎｔｈ法において使用される二本鎖断片を生成することができる。

追加の例示的実施形態

１．二本鎖アダマーであって、
ａ）相補的オーバーハングにライゲーションする能力があるオーバーハングの生成を可能にする第一の配列；
ｂ）ペイロード配列；
ｃ）相補的オーバーハングにライゲーションする能力があるオーバーハングの生成を可能にする第二の配列；および
ｄ）アダマー、アダマーの少なくとも一つの端が、ヘアピン構造を含む、を含む、二本鎖アダマー。

２．両末端にヘアピン構造を含む、請求項１に記載のアダマー。

３．相補的オーバーハングにライゲーションする能力があるオーバーハングの生成を可能にする第一の配列および第二の配列が、制限エンドヌクレアーゼニッカーゼ認識部位である、請求項１に記載のアダマー。

４．相補的オーバーハングにライゲーションする能力があるオーバーハングの生成を可能にする第一の配列および第二の配列が、ｓｇＲＮＡの存在下で変異Ｃａｓ９のニッキング活性を支持する部位である、請求項１に記載のアダマー。

５．生成されたオーバーハングが、０、１、２、３、４または５個の塩基である、請求項１に記載のアダマー。

６．生成されたオーバーハングが、１０～１５個の塩基である、請求項１に記載のアダマー。

７．生成されたオーバーハングが、特異的な互換性基の４塩基オーバーハングに対応する、請求項１に記載のアダマー。

８．オリゴヌクレオチドのプールであって、それぞれのオリゴヌクレオチドが、アダマーの鎖であるが、プール内の任意の他のオリゴヌクレオチドと直接的に相補的ではない、オリゴヌクレオチドのプール。

９．オリゴヌクレオチドの二つ、いくつかまたは多くのプールであって、それぞれのオリゴヌクレオチドが、アダマーの鎖であり、任意の二つ、三つ、四つ、または五つのプールの混合物が、遺伝子または遺伝子の断片を含むアダマーまたはアダマーの群の形成を独自に導く、オリゴヌクレオチドの二つ、いくつかまたは多くのプール。

１０．アダマーの生成方法であって、オリゴヌクレオチドの二つ以上のプールの混合物が、ハイブリダイゼーションに好ましい条件下で、アダマー構造の形成を導き、
ａ）ハイブリダイゼーション
ｂ）固有のニックを分解するためのライゲーション
ｃ） 非アダマーＤＮＡを除去するためのエクソヌクレアーゼを用いた処理のステップを含む、アダマーの生成方法。

１１．混合物をＨｉｓタグ付したＴａｑ ＭｕｔＳおよびＮｉ－ＮＴＡアガロースで処理して、ミスマッチ塩基対を含有するアダマーを除去する、請求項１０に記載の方法。

１２．遺伝子アセンブリー方法、共通の体積の消化のための内部部位および外部部位を有するアダマーの群が、
ａ）それぞれのアダマーの内部部位の一方または両方のヘアピンを除去するために短い核酸と組み合わされたエンドヌクレアーゼ酵素または酵素のセットまたは酵素を用いて処理され、
ｂ）適当なバッファーにおいてリガーゼを用いて処理され、
ｃ）ライベートされていない物質を除去するためにエクソヌクレアーゼで処理される、遺伝子アセンブリー方法。

実施例

実施例１－アダマーおよび長い配列アセンブリーを生成するためのプールされたオリゴヌクレオチドの使用

この実施例では、オリゴヌクレオチドのプール（本明細書において複数のプールとも呼ぶ）を使用して、アダマーの群を生成し、続いて、これらのアダマーを、全長標的核酸配列にアセンブリーすることができる。

この実施例では、グラフ理論的法を使用して、４３１ｂｐ配列を五つの断片（Ｆ１～Ｆ５）にプログラムで分割し、これにより、断片にわたってほぼ等しいＧＣ含有量を最適化し、サイズ約１００ｂｐの断片を選択した（図１２を参照）。予測した断片は、１００％の推定ライゲーション忠実度を有する、適合する一本鎖オーバーハング（ＣＡＴＣ、ＡＡＣＧ、ＴＴＧＡ、ＣＡＧＡ）を有していた（図１３を参照）。

それぞれの予測した断片配列を使用して、ペイロードのいずれかの端にＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ部位（ＩＩＳＲＥ）を含むアダマー生成した。末端断片Ｆ１およびＦ５はまた、増幅のためのＰＣＲプライマー部位およびその後のクローニング工程のための制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）部位を含有する（図１３を参照）。

それぞれのアダマーを、本明細書に記載する核酸分子のプール（複数）から提供される三つのオリゴヌクレオチド配列から形成させた。次いで、アダマーを、図６および上でさらに詳細に記載したプールした合成方法を使用してアセンブリーした。図６に示すように、ＩＩＳＲＥを使用して、アダマーのそれぞれをキャップを外し、これにより、４ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを残した（この実施例では、ＩＩＳＲＥはＢｓａＩである）。Ｆ１の始めおよびＦ５の終わりのキャップはインタクトなままであり、故に、断片を、アセンブリーの生成物である単一の大きなアダマーにアセンブリーする。このより大きなアダマー配列を、後のステップで、異なるＩＩＳＲＥ（この実施例ではＢｂｓＩ）を用いた処理によって残ったオーバーハングを介して、より長い配列にアセンブリーするように設計した。より大きなアダマー生成物を増幅し、ＲＥｓ ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、クローニングベクターにライゲーションした。プラスミドクローンをキャピラリーシーケンシングに供した。最後に、アセンブリーした遺伝子が、キャピラリーシーケンシングの結果を整列させることによって、所望の標的配列を有することを確認した（図１４を参照）。

上記のプロトコールをまた使用して、方法の一般化可能性を示すために、追加の標的配列を生成した。これらの追加の標的配列のアセンブリー手法のそれぞれの設計を図１５に示し、これは、標的配列の取得断片数を（「断片数」カラム）に細分し、それぞれの断片に対応するアダマーを生成するために、いくつの個々の核酸分子を使用したか（「一つの断片当たりのオリゴ」カラム）を含む。これらの実験は、最大で六つの断片を組み合わせて、アダマーを用いてより大きな配列を生成することができることを示す。加えて、成分アダマーに対して生成するために使用したオリゴヌクレオチド配列の数は、最大四個までであり得、配列Ｆの場合と同様に、最大２２個の異なるオリゴヌクレオチド配列の混合したプールで同時に使用することができる（図１５を参照）。

これらの結果は、本明細書に記載する組成物および方法を使用して、アダマーベースのアセンブリー方法を使用して標的核酸配列をアセンブリーし、合成することができ、個々のアダマーは、プールしたオリゴヌクレオチド合成を使用して生成した核酸分子のプール（複数）を使用して生成することを示す。

Claims (25)

1. 核酸分子の二種以上の複数を含む組成物であって、
   前記核酸分子の複数のそれぞれが、二種以上の核酸分子を含み、
   異なる種の核酸分子が、異なる核酸配列を含み、
   対応する複数の少なくとも一つのセットが、単一の反応体積で組み合わされるとき、前記セット内の異なる複数からの核酸分子が、一緒にハイブリダイズして、ハイブリダイズした複合体の少なくとも一種を形成するように、前記核酸分子の二種以上の複数内に、前記対応する複数の少なくとも一つのセットがある、組成物。
2. 前記組成物が、核酸分子の約
   ａ）六種；
   ｂ）１０種；
   ｃ）１５種；
   ｄ）２０種；または
   ｅ）５０種
   の複数を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 核酸分子のそれぞれの複数が、少なくとも約２５種の異なる種の核酸分子を含む、請求項１～２のいずれか一項に記載の組成物。
4. 対応する複数のそれぞれのセットが、同じ数の複数を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記少なくとも一種のハイブリダイズされた複合体が、対応する複数の前記セット内に前記複数のそれぞれから一種の核酸種を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 核酸分子の前記二種以上の複数が、別個の体積で存在する、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 対応する複数の前記少なくとも一つのセットが、核酸分子の少なくとも約
   ａ）二種；
   ｂ）三種；
   ｃ）四種；または
   ｄ）五種
   の複数を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 対応する複数のセットの前記数が、
   （式中、Ｘが、核酸分子の複数の総数と等しく、Ｙが、単一のハイブリダイズされた複合体を形成するように一緒にハイブリダイズする核酸の種の数と等しい）と等しい、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
9. ａ）対応する複数の前記少なくとも一つのセットが、二種の複数を含み、前記少なくとも一つのハイブリダイズされた複合体が、二つの核酸分子を含む；
   ｂ）対応する複数の前記少なくとも一つのセットが、三種の複数を含み、前記少なくとも一つのハイブリダイズされた複合体が、三つの核酸分子を含む；または
   ｃ）対応する複数の前記少なくとも一つのセットが、四種の複数を含み、前記少なくとも一つのハイブリダイズされた複合体が、四つの核酸分子を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 対応する複数のセットが、単一の反応で組み合わされ、少なくとも約五種の異なるハイブリダイズされた複合体種が、形成される、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 核酸分子の単一の複数内の前記異なる種の核酸分子が、互いに相補的ではない、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 少なくとも一つのアダマーを生成する方法であって、
    ａ）請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物を用意すること；
    ｂ）少なくとも一種のハイブリダイズされた複合体が形成されるように、核酸分子の対応する複数の少なくとも一つのセットを単一の反応体積で組み合わせること；
    ｃ）前記少なくとも一種のハイブリダイズされた複合体を少なくとも一つのリガーゼ酵素と接触させて、ヘアピンによって両末端でキャップされた少なくとも一つのアダマーを形成することを含む、方法。
13. 工程（ｃ）の前記生成物を、エクソヌクレアーゼを用いて処理し、これにより、適切にライゲートされたアダマーを精製することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記少なくとも一種のハイブリダイズされた複合体をＭｕｔＳ酵素と接触させることをさらに含む、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
15. 前記アダマーが、
    ａ）第一のＩＩ型Ｓ制限エンドヌクレアーゼ（ＩＩＳＲＥ）配列；
    ｂ）ペイロード配列；
    ｃ）少なくとも第二のＩＩＳＲＥ配列を含み、
    前記アダマーの少なくとも一つの端が、ヘアピン構造を含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
    
16. 前記アダマーが、前記アダマーの両末端にヘアピン構造を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記アダマーが、
    ａ）第一のＩＩＳＲＥ配列；
    ｂ）第二のＩＩＳＲＥ配列；
    ｃ）ペイロード配列；および
    ｄ）少なくとも第三のＩＩＳＲＥ配列を含む、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記アダマーが、
    ａ）第一のＩＩＳＲＥ配列；
    ｂ）第二のＩＩＳＲＥ配列；
    ｃ）ペイロード配列；
    ｄ）第三のＩＩＳＲＥ配列；および
    ｅ）少なくとも第四のＩＩＳＲＥ配列を含む、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記アダマーが、多重クローニング部位（ＭＣＳ）配列をさらに含み、前記ＭＣＳ配列が、一つ以上の制限エンドヌクレアーゼ配列を含む、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記ＩＩＳＲＥ配列の少なくとも一つが、ＭｌｙＩ配列、ＮｇｏＡＶＩＩ配列、ＳｓｐＤ５Ｉ配列、ＡｌｗＩ配列、ＢｃｃＩ配列、ＢｃｅｆＩ配列、ＰｌｅＩ配列、ＢｃｅＡＩ配列、ＢｃｅＳＩＶ配列、ＢｓｃＡＩ配列、ＢｓｐＤ６Ｉ配列、ＦａｕＩ配列、ＥａｒＩ配列、ＢｓｐＱＩ配列、ＢｆｕＡＩ配列、ＰａｑＣＩ配列、Ｅｓｐ３Ｉ配列、ＢｂｓＩ配列、ＢｂｖＩ配列、ＢｔｇＺＩ配列、ＦｏｋＩ配列、ＢｓｍＦＩ配列、ＢｓａＩ配列、ＢｃｏＤＩ配列およびＨｇａＩ配列から選択される、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 少なくとも一つのヘアピン構造が、アプタマー配列を含む、請求項１２～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記アプタマー配列が、ｐＬ１アプタマー配列、トロンビン２９－ｍｅｒアパタマー配列、Ｓ２．２アプタマー配列、ＡＲＴ１１７２アプタマー配列、Ｒ１２．４５アプタマー配列、Ｒｂ００８アプタマー配列および３８ＮＴ ＳＥＬＥＸアパタマー配列から選択される、請求項１２～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 標的核酸配列を含む核酸分子を合成する方法であって、
    ａ）請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物を用意することであって、前記組成物が、対応する複数のセットが、単一の反応体積で組み合わされるとき、前記セット内の異なる複数からの核酸分子が一緒にハイブリダイズして、二種以上のハイブリダイズされた複合体を形成するように、核酸分子の対応する複数の前記セットを含み、前記二種以上のハイブリダイズされた複合体が、前記標的核酸配列の断片を含む、用意すること；
    ｂ）前記二種以上のハイブリダイズされた複合体が形成されるように、核酸分子の対応する複数の前記セットを単一の反応体積で組み合わせること；
    ｃ）前記二種以上のハイブリダイズされた複合体を少なくとも一つのリガーゼ酵素と接触させて、ヘアピンによって両末端でキャップされた二種以上のアダマーを形成すること；
    ｄ）前記二種以上の種のアダマーをアセンブリーして、前記標的核酸配列を含む前記核酸分子を合成することを含む、方法。
24. 前記二種以上のアダマーをアセンブリーすることが、前記アダマーを
    ａ）一つ以上の制限酵素；および
    ｂ）一つ以上のリガーゼを用いて、
    同時または連続のいずれかで処理し、これにより、前記標的核酸配列を含む前記核酸分子をアセンブリーすることを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記二種以上のアダマーをアセンブリーすることが、前記アダマーを
    ａ）少なくとも一つのガイドＲＮＡと組み合わせてニッカーゼ活性を示す改変されたＣａｓ９；および
    ｂ）一つ以上のリガーゼを用いて、
    同時または連続のいずれかで処理し、これにより、前記標的核酸配列を含む前記核酸分子をアセンブリーすることを含む、請求項２３に記載の方法。