KR101459547B1 - 살모넬라 티피뮤리움에 특이적으로 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
살모넬라 티피뮤리움에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 압타머 및 그 제조방법이 개시된다. 압타머의 제조방법은 양 끝에 PCR용 프라이머 영역을 가지며 중앙에 무작위로 배열된 40~60개의 염기를 가지는 DNA들을 포함하는 DNA 라이브러리와 살모넬라 티피뮤리움을 결합버퍼 용액에 혼합하여 살모넬라 티피뮤리움-DNA 결합체를 유도하는 단계, 상기 DNA 라이브러리와 살모넬라 티피뮤리움의 혼합용액을 원심분리하여 상기 살모넬라 티피뮤리움-DNA 결합체를 추출하는 단계, 상기 살모넬라-DNA 결합체로부터 DNA를 분리하는 단계, 상기 분리된 DNA를 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭시키는 단계, 상기 증폭된 DNA를 원심분리 필터를 사용하여 농축하는 단계, 상기 농축된 DNA와 비-표적 미생물을 결합 버퍼 용액에 혼합하여 비-표적 미생물-DNA 결합체를 유도하는 단계, 및 상기 농축된 DNA와 비-표적 미생물의 혼합용액을 원심분리하여 상기 비-표적 미생물과 결합하지 않은 DNA를 추출하는 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 식중독균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 압타머(aptamer) 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
식중독균들은 부패한 채소, 농수산물, 각종 저장식품, 식품제조공정을 통하여 인체에 감염되면 식중독을 일으킬 수 있으므로, 식품의 안전성을 제고하고 보건위생환경을 개선하는 측면에서 이들 식중독균을 보다 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 기술을 개발하는 것에 관심이 높다. 그러나 지금까지 식중독균에 대한 효율적인 신속 검출법은 이상적인 리간드가 없어 어려움을 겪고 있다.
식중독균에 대한 신속 검출법으로 생물발광과 미생물대사결과의 반응산물을 이용하는 방법은 상대적으로 선택성이 결여되어 있으므로 단지 식중독균에 대한 일반적인 지표로만 활용될 수 있을 뿐이고, 부가적으로 선택성이 높은 면역학적 방법과 핵산중합을 사용하여 명확한 동정을 해야 하는 추가적인 단계가 필요하고 특별한 장비 및 실험시설이 있어야 하는 문제점이 있으며, 아울러 효소면역측정과 면역형광측정의 경우는 사용하는 항체의 불안전성으로 인해 물질의 보관 및 유통에 문제가 있으며 또한 항체는 식중독균의 세포벽에 의한 선택성 및 감도에 대한 단점이 있다.
한편, 압타머(Aptamer)는 저분자의 올리고 뉴클레오타이드로 표적분자에 특이적이고 선택적으로 결합한다. 널리 알려진 바와 같이 핵산은 뉴클레오티드가 공유결합으로 연결된 선형적인 다합체로서, 뉴클레오티드는 작은 유기화합물로서 인산, 당 및 퓨린(아데닌 혹은 구아닌) 혹은 피리미딘(사이토신, 티미딘, 우라실)으로 이루어져 있다.상호작용에 의해 결합하여 독특한 입체구조를 형성하는데, 이런 구조는 단일가닥의 염기서열에 의해 결정된다.
일반적으로 DNA와 RNA와 같은 핵산들은 세포구조 및 효소 등의 활성을 가진 단백질들을 발현하기 위한 정보의 저장체이나, 1982년에 RNA가 특정한 구조를 형성함으로써 효소로서의 활성도 갖고 있다는 보고가 나온 후로 핵산이 구조적인 특성과 그에 따른 특정 기능에 대한 많은 보고가 있다. 핵산은 4개의 염기의 반복으로 구성되어 높은 다양성을 유지하여 많은 입체구조를 형성하며 이런 입체구조는 특정물질과 상호작용을 하여 복합체를 형성하여 안정화된다.
이러한 특성으로 인해 핵산이 단백질을 포함하는 특정물질에 대하여 하나의 리간드(ligand)로서 작용할 수 있는 바, 다양한 염기순서로 배열된 단일가닥핵산이 조합된 라이브러리로부터 일정한 선별과정과 염기서열결정을 통하여 높은 결합력과 특이성으로 특정물질과 결합하는 압타머를 제작할 수 있다.
특정물질과 결합하는 핵산을 선별하는 방법을 셀렉스(SELEX, Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment)라 하고, 이런 SELEX를 통하여 자연 상태에서 핵산과 결합할 수 있는 단백질뿐만 아니라 핵산과 결합하고 있지 않은 단백질을 비롯한 여러 생체분자와도 매우 높은 친화력으로 결합할 수 있는 분자들이 선별되고 있다.
최근 이러한 압타머를 이용하여 질병을 진단하고 치료하는 다양한 시도가 이루어지고 있다. 특히, 질병의 원인이 되는 각종 병원체들의 존재를 검출하는데 압타머를 이용함으로써 질병을 미연에 방지할 수 있다.
그러나 일반적으로 압타머는 하나의 표적 물질에만 결합하는 것이 아니라 유사한 구조를 가지는 다른 물질에도 결합할 수 있어 질병의 진단이나 병원체의 검출 정확도가 떨어지는 문제가 있다.
본 발명은 식중독을 일으키는 병원균, 특히 살모넬라 티피뮤리움에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 압타머를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 살모넬라 티피뮤리움에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 압타머의 제작방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라 살모넬라 티피뮤리움에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 21에 기재된 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가지는 단일가닥 DNA 압타머가 제공된다.
본 발명에 따라 양 끝에 PCR용 프라이머 영역을 가지며 중앙에 무작위로 배열된 40~60개의 염기를 가지는 DNA들을 포함하는 DNA 라이브러리와 살모넬라 티피뮤리움을 결합버퍼 용액에 혼합하여 살모넬라 티피뮤리움-DNA 결합체를 유도하는 단계; 상기 DNA 라이브러리와 살모넬라 티피뮤리움의 혼합용액을 원심분리하여 상기 살모넬라 티피뮤리움-DNA 결합체를 추출하는 단계; 상기 살모넬라-DNA 결합체로부터 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 DNA를 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭시키는 단계; 상기 증폭된 DNA를 원심분리 필터를 사용하여 농축하는 단계; 상기 농축된 DNA와 비-표적(non-target) 미생물을 결합 버퍼 용액에 혼합하여 비-표적 미생물-DNA 결합체를 유도하는 단계; 및 상기 농축된 DNA와 비-표적 미생물의 혼합용액을 원심분리하여 상기 비-표적 미생물과 결합하지 않은 DNA를 추출하는 단계를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움에 특이적으로 결합하는 압타머의 제조방법이 제공된다.
본 발명에 따르면, 상기 결합버퍼 용액은 인산버퍼 용액일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 비-표적 미생물은 대장균, 황색포도상구균, 및 살모넬라 엔테리타이디스(Salmonella enteritidis) 중 적어도 하나일 수 있다.
이하, 첨부도면과 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이하의 구체적 실시예는 본 발명의 설명을 위한 예시적 목적으로 기술되었으며, 본 발명의 범위는 이하의 실시예에 의해 제한되지 않는다.
본 발명에 따르면, 살모넬라 티피뮤리움과 유사한 식중독균인 대장균, 황색포도상구균 등과는 결합하지 않으면서 살모넬라 티피뮤리움과는 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA 압타머 및 그 제조방법을 제공함으로써, 살모넬라 티피뮤리움의 신속하고 정확한 검출이 가능해지게 된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일가닥 DNA 압타머의 제조과정을 도시한 다이어그램이다.
도 2는 PCR 과정을 거친 단일가닥 DNA의 전기영동 결과를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일가닥 DNA 압타머의 유세포 분석 결과를 도시한 도면이다.
도 2는 PCR 과정을 거친 단일가닥 DNA의 전기영동 결과를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일가닥 DNA 압타머의 유세포 분석 결과를 도시한 도면이다.
도 1을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 단일가닥 DNA 압타머의 제조방법을 보다 상세히 설명한다.
DNA 풀의 형성
살모넬라 티피뮤리움에 특이적으로 결합하는 단일가닥 핵산의 선별을 위해, 아래와 같이 양끝에 프라이머 결합용 고정서열을 가지며 중앙에 60개의 염기가 무작위로 배열된 염기서열을 가지는 DNA들로 구성된 DNA 라이브러리(100)를 준비하였다.
5'-[고정서열1]-N60-[고정서열2]-3'
여기서 고정서열1 및 고정서열2는 DNA 라이브러리(100)에 포함된 DNA들의 고정된 부위이며 N60은 60개의 A, G, T, C등의 염기들이 무작위로 배열된 염기서열이다.
PCR시에 이용되는 FW 프라이머는 위의 염기배열의 밑줄 친 염기들의 5' 말단의 고정서열1과 염기결합을 할 수 있고 PCR의 RE 프라이머는 위의 염기배열의 밑줄 친 염기들의 3' 말단의 고정서열2와 염기결합을 할 수 있다. 또한, 5' 말단 및 3' 말단의 고정서열에는 각각 제한효소가 인식하는 특정 염기서열을 포함한다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 5' 말단의 고정서열에는 제한효소 EcoRI의 인식서열인 GAATCC가 포함되어 있으며, 3' 말단의 고정서열에는 제한효소 BamHI의 제한효소의 인식서열인 GGATCC가 포함되어 있다.
DNA 라이브러리(100) 내의 단일가닥 DNA를 표적 미생물(300)인 살모넬라 티피뮤리움과 결합시키기 전에, 95℃에서 10분, -20℃에서 10분간 열처리하여 변성시켰다. 이러한 열변성을 통해 유도된 3차원 구조를 가지는 단일가닥 DNA들(200)이 단일가닥 DNA 풀을 구성한다.
결합 특이성을 가지는 단일가닥 DNA의 선별(SELEX)
무작위 서열을 포함하는 단일가닥 DNA들(200)을 표적 미생물(300)인 살모넬라 티피뮤리움과 함께 121℃에서 15분간 고압멸균된 결합버퍼용액(인산 버퍼용액, Phosphate buffered saline, pH 7.2)에 넣고 혼합하여 상온에서 반응시켜 결합을 유도한다. 이러한 결합버퍼용액은 표적 미생물인 살모넬라 티피뮤리움의 활동에 영향을 미치지 않으므로 표적 미생물(300)인 살모넬라 티피뮤리움이 최적의 상태에서 단일가닥 DNA들(200)과 결합할 수 있도록 한다.
혼합액 중의 표적 미생물-단일가닥 DNA 결합체(310)와 미결합 단일가닥 DNA(210)를 분리하기 위해 5,000g에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리는 살아 있는 표적 미생물에 최대한 영향을 주지 않은 상태로 표적 미생물-단일가닥 DNA 결합체(310)를 분리하는 바람직한 방법이다.
원심분리 직후, 표적 미생물과 결합하지 않은 미결합 단일가닥 DNA(210)를 제거하기 위해 상층액을 분리한다. 표적 미생물-단일가닥 DNA 결합체(310)는 남은 혼합 용액에 존재한다. 표적 미생물-단일가닥 DNA 결합체(310)의 단일가닥 DNA는 본 발명에 따른 압타머 후보 DNA가 된다.
미생물-단일가닥 DNA 결합체(310)만 남은 혼합 용액에 동일한 부피의 멸균 증류수를 첨가하여 95℃에서 10분간 가열하여 열처리함으로써 단일가닥 DNA를 표적 미생물로부터 용리하고, 이 용액을 5,000g에서 10분간 원심분리한다. 용리된 압타머 후보 단일가닥 DNA(220)는 원심분리 후 용액의 상층에 부유하므로, 상층액만을 적출하여 PCR 증폭을 수행한다.
이때, 표적 미생물과 결합된 단일가닥 DNA가 미량이므로 PCR 증폭 후에도 DNA 밴드 확인이 어려운 문제가 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 본 발명의 실시예에서는 PCR 증폭 후, 원심분리 필터를 사용하여 20배의 농축과정을 거쳤다.
도 2는 원심분리 전후의 DNA 전기영동 분석 결과를 도시한 도면이다.
C1, C2는 SELEX 시작 전의 DNA 라이브러리 내의 DNA 분석 결과이며, S1-1은 1차 SELEX에서 추출된 단일가닥 DNA, S1-2는 S1-1의 단일가닥 DNA를 원심분리 필터를 사용하여 20배로 농축한 때의 분석결과이다. S5-1과 S5-2는 각각 5차 SELEX에서 추출된 단일가닥 DNA, S5-1의 단일가닥 DNA를 원심분리 필터를 사용하여 20배로 농축한 때의 분석결과이다.
도 2에 잘 나타나 있듯이, DNA 밴드는 SELEX 횟수가 증가할수록 확인이 쉬워지지만, 원심분리 필터에 의해 농축과정을 거치면 현저하게 분명해진다. 1차 SELEX에서 농축된 DNA(S1-2)는 5차 SELEX에서 농축되지 않은 DNA(S5-1)에 비해서도 DNA 밴드가 더 분명하게 확인되며, 5차 SELEX에서 농축된 DNA(S5-2)는 밴드가 확실하게 관찰된다.
이와 같이, SELEX에서 원심분리 필터를 사용하여 DNA를 농축함으로써, SELEX 성공률이 현저하게 증가된다.
1차 SELEX에서 결합된 단일가닥 DNA만을 선택적으로 증폭한 후, 동일한 과정으로 10회에 걸쳐 표적 미생물과 선택적으로 결합하는 단일가닥 DNA를 획득하였다.
비-표적(non-target) 미생물과 결합하는 압타머 후보 단일가닥 DNA의 제외(counter-SELEX)
10차 SELEX 종료 후, 비-표적 미생물과 결합하는 단일가닥 DNA를 제외하기 위해 카운터-SELEX(counter-SELEX)를 실시하였다.
본 발명의 일실시예에서는 대장균, 황색포도상구균 및 살모넬라 엔테리타이디스(Salmonella enteritidis)에 대해 각각 2회에 걸쳐 상기 SELEX와 동일한 조건으로 카운터-SELEX를 실시하였다.
즉, 압타머 후보 단일가닥 DNA들(220)을 비-표적 미생물(400)과 결합 버퍼용액에 혼합하여 결합을 유도하고 원심분리에 의해 비-표적 미생물-단일가닥 DNA 결합체(410)와 미결합 단일가닥 DNA(230)를 분리한 후, 미결합 단일가닥 DNA(230)만PCR 증폭하면, 살모넬라 티피뮤리움과 특이적으로 결합하면서 비-표적 미생물, 예컨대 대장균 및 황색포도상구균 등과는 결합하지 않는 단일가닥 DNA를 얻을 수 있다.
최종적으로 얻어진 단일가닥 DNA 압타머와 살모넬라 티피뮤리움의 결합 특이성을 확인하기 위해 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. 유세포 분석시, 살모넬라 티피뮤리움과 압타머와의 결합력을 확인하기 위해 형광표지된 압타머를 사용하였다.
유세포 분석을 통해 특이적 결합이 확인된 단일가닥 DNA의 염기서열은 아래의 표 1과 같다.
| 서열번호 | 염기서열 |
| 1 | GCGTG TC |
| 2 | GCGTG CGG |
| 3 | GTCTG TAGG |
| 4 | GGAGG TCTG |
| 5 | GGTCT GTAGG |
| 6 | TCTGC GGGGC G |
| 7 | CCAGG ATGGG A |
| 8 | TCTGC GGGGC G |
| 9 | GAGCC AGGAT GGG |
| 10 | GCGTG CGGAG CCAG |
| 11 | TCTGC GGGGC GTGG |
| 12 | GTGCG GAGCC AGGAT GGGA |
| 13 | GCGTG CGGAG CCAGG ATGG |
| 14 | AGGTC TGCGG GGCGT G |
| 15 | AGGTC TGTAG GTCTG CGGGG CGTGG |
| 16 | GATGG GAGGT CTGTA GGTCT GCGGG |
| 17 | GGTGT CGTCC GGTGG CTGTG GGGCT G |
| 18 | CCAGG ATGGG AGGTC TGTAG GTCTG CGGGG CG |
| 19 | GAGCC AGGAT GGGAG GTCTG TAGGT CTGCG GGGCG TGG |
| 20 | GCGTG CGGAG CCAGG ATGGG AGGTC TGTAG GTCTG CGGG |
| 21 | GCGTG CGGAG CCAGG ATGGG AGGTC TGTAG GTCTG CGGGG CGTG |
도 3에 도시된 바와 같이, 살모넬라 티피뮤리움만 분석한 결과(a)와 형광표지된 압타머와 결합한 살모넬라 티피뮤리움을 분석한 결과(b)를 비교하면 압타머 결합 살모넬라 티피뮤리움에서 주기적 형광신호가 검출되어 압타머-살모넬라 티피뮤리움의 특이적 결합이 확인되었다.
100 : DNA 라이브러리 200 : 변형된 단일가닥 DNA
300 : 표적 미생물 400 : 비-표적 미생물
300 : 표적 미생물 400 : 비-표적 미생물
<110> Republic of Korea(Management : Rural Development Administraion)
<120> SINGLE STRANDED NUCLEIC ACID APTAMER SPECIFICALLY BINDING TO
SALMONELLA TYPHIMURIUM
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<170> KopatentIn 2.0
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aptamer specifically binding to Salmonella typhimurium
<400> 19
cagccaggat gggaggtctg taggtctgcg gggcgtgg 38
<210> 20
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aptamer specifically binding to Salmonella typhimurium
<400> 20
gcgtgcggag ccaggatggg aggtctgtag gtctgcggg 39
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aptamer specifically binding to Salmonella typhimurium
<400> 21
gcgtgcggag ccaggatggg aggtctgtag gtctgcgggg cgtg 44
Claims (4)
- 살모넬라 티피뮤리움에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 21에 기재된 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가지는 단일가닥 DNA 압타머.
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Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120131693A KR101459547B1 (ko) | 2012-11-20 | 2012-11-20 | 살모넬라 티피뮤리움에 특이적으로 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120131693A KR101459547B1 (ko) | 2012-11-20 | 2012-11-20 | 살모넬라 티피뮤리움에 특이적으로 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20140064399A KR20140064399A (ko) | 2014-05-28 |
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Family
ID=50891843
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020120131693A KR101459547B1 (ko) | 2012-11-20 | 2012-11-20 | 살모넬라 티피뮤리움에 특이적으로 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101459547B1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230126800A (ko) | 2022-02-24 | 2023-08-31 | (주)바이오세상 | 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 |
| KR20230126803A (ko) | 2022-02-24 | 2023-08-31 | (주)바이오세상 | 병원성대장균에 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120050540A (ko) * | 2010-11-10 | 2012-05-21 | 건국대학교 산학협력단 | 살모넬라 엔타라이티디스에 특이적인 앱타머 및 그 응용 |
| KR20120068231A (ko) * | 2010-12-17 | 2012-06-27 | 한국식품연구원 | 살모넬라 티피뮤리움 균주의 ｏｍｐＣ단백질에 대해 결합하는 ＲＮＡ 앱타머 |
-
2012
- 2012-11-20 KR KR1020120131693A patent/KR101459547B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120050540A (ko) * | 2010-11-10 | 2012-05-21 | 건국대학교 산학협력단 | 살모넬라 엔타라이티디스에 특이적인 앱타머 및 그 응용 |
| KR20120068231A (ko) * | 2010-12-17 | 2012-06-27 | 한국식품연구원 | 살모넬라 티피뮤리움 균주의 ｏｍｐＣ단백질에 대해 결합하는 ＲＮＡ 앱타머 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| J. Agric. Food Chem., Vol. 60, pp. 4034-4038 * |
| J. Agric. Food Chem., Vol. 60, pp. 4034-4038* |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230126800A (ko) | 2022-02-24 | 2023-08-31 | (주)바이오세상 | 황색포도상구균에 특이적으로 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 |
| KR20230126803A (ko) | 2022-02-24 | 2023-08-31 | (주)바이오세상 | 병원성대장균에 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20140064399A (ko) | 2014-05-28 |
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