KR20120068231A - 살모넬라 티피뮤리움 균주의 ｏｍｐＣ단백질에 대해 결합하는 ＲＮＡ 앱타머 - Google Patents

살모넬라 티피뮤리움 균주의 ｏｍｐＣ단백질에 대해 결합하는 ＲＮＡ 앱타머 Download PDF

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Abstract

본 발명은 살모넬라 티비뮤리움균주의 ompC 단백질에 대한 RNA 앱타머에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 살모넬라 티비뮤리움균주의 ompC 단백질에 특이적으로 결합하고, 그 염기 중 우라실(U) 및 시토신(C)의 2'히드록실기가 플루오르기로 치환되어 있는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 가짐으로써 식중독 등의 주요원인이 되는 살모넬라균의 검출에 유용하고, 살모넬라균에 특이적으로 결합하여 그 작용을 억제함으로써 식품의 부패를 방지할 수 있으며, 대장염, 식중독 및 티푸스성질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 예방 및 치료에 유용한 RNA 앱타머에 관한 것이다.

Description

살모넬라 티피뮤리움 균주의 ｏｍｐＣ단백질에 대해 결합하는 ＲＮＡ 앱타머 {RNA APTAMERS FOR SALMONELLA TYPHIMIRIUM OMPC PROTEINS}
본 발명은 살모넬라 티피뮤리움 균주의 ompC 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머에 관한 것이다.
살모넬라(Salmonella)는 그람음성 박테리아로서 살모넬라 엔테리카( Salmonella enterica)와 살모넬라 본고리(Salmonella bongori) 2가지로 구성되어 있으며 살모넬라 엔테리카는 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲa,Ⅲb,Ⅳ 및 Ⅵ으로 6개의 아종(subapeciea)으로 나누어져 있다. 살모넬라는 카우프만 화이트(Kauffmann-White)표를 기준으로 250개의 혈청형(serovar )으로 분류되어 있는데 살모넬라 아종Ⅰ중, 살모넬라 엔테리카 세로바 티피뮤리엄(Salmonella enterica serovar Typhimirium )은 세계적인 식중독 살모넬라 감염증으로부터 가장 자주 격리되는 혈청형이다.
살모넬라 티피뮤리움균은 그람 음성 박테리아로써 주로 소장의 내장에서 발견되는데 이 박테리아에 의한 독성은 박테리아의 외막에 존재하는 LPS에 의해 유발되게 된다. 이러한 LPS는 O-antigen, polysaccharide core 그리고 lipid A로 주로 구성되어져 있다. Lipid A는 2가지 종류의 인산화된 글루코사민의 형태로 이루어지는데 이러한 인산화 그룹의 형태가 박테리아에 의한 독성을 결정짓게 된다. 이러한 독성으로 인하여 병원성을 나타내게 되며 급성위장염, 식중독 등을 일으키게 된다.
살모넬라균은 주로 식품에 의해 감염되며 저온 및 냉동상태뿐만 아니라 건조에도 강하여 6~9월 가장 자주 발생하게 된다. 살모넬라균은 산발적 설사병의 원인균으로 주목받고 있으며 식품을 취급하는 사람의 보균율이 일반 건강자 보균율에 비해 약 10배 정도 높다고 알려져 있다. 이에 의한 식중독의 잠복기간은 8~48 시간으로 평균 24시간 전후이며 주요 증상은 복통, 설사, 발열로서 간혹 구토와 어지러움을 수반하게 된다.
위와 같이 사람에서는 식중독을 일으키며 가축에서의 살모넬라는 다양한 혈청형에 의해 감염되어 새끼돼지, 송아지, 닭에게서 설사 등의 증상과 함께 폐사에 이르는 등 농가에 큰 피해를 주고 있어 인수공통전염병으로서 중요하다.
그리하여 이러한 살모넬라균을 예방하고 치료하기 위하여 감염성 면역 및 백신에 관한 많은 연구가 활발히 진행되고 있으나 현재까지 밝혀진 약 2,400여 종의 살모넬라균 혈청형들은 특별한 숙주영역이 없고 비특이적 환경에서도 잘 서식하며 최소 한가지 이상의 동물에 감염되어 있어, 현실적으로 이들의 근원적인 제거란 불가능하다. 또한, 세균을 잡아먹은 탐식세포 내에서도 증식할 수 있는 특성이 있어 항생제로도 완치가 불가능하여 탁월한 효능을 지닌 백신을 제조하기가 너무나 어렵다. 또한, 항생제를 사용해서 살모넬라균 음성이 되어도 항생제 투약을 중지하면 살모넬라균에 의한 재감염 감수성만 증가하므로 정확한 진단과 예방이 가장 중요하다고 할 수 있다.
한편, 앱타머는 짧은 가닥의 올리고 뉴클레오타이드로 높은 친화도와 특이성으로 표적물질에 결합할 수 있는 3차원 구조를 형성하고 있다. 이러한 앱타머는 대부분은 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있을 뿐만 아니라 효율적으로 그 기능을 억제할 수도 있어 표적 단백질의 기능을 알아내는데 이용될 수 있다.
항체(antidbody)의 대체물질로 인식되는 앱타머는 항체와 마찬가지로 검출분석 시스템에서 분자를 인식할 수 있는 바이오센서의 요소로 이용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 기반의 앱타머는 단백질 기반의 항체에 비하여 몇 가지 장점을 가지는데 첫째, 앱타머의 수득은 생체 외(in vitro)에서 이루어지며, 둘째, 독소(toxic)를 비롯한 다양한 유기물과 무기물들이 앱타머의 표적(target)분자로 이용될 수 있으며, 셋째, 일단 표적분자에 특이적으로 결합하는 특정 앱타머가 확인되어 수득 되면 자동화된 올리고머 합성방법에 의해 낮은 비용과 높은 일관성으로 재생산이 가능하다. 또한, 앱타머는 형광분자 또는 광반응성 그룹 등과 같은 유용한 기능 그룹들을 도입하는 것이 항체에 비해 상대적으로 용이하며, 열에 의한 변성-회복과정이 가역적이므로 항체에 비해 긴 시간의 활성을 가질 수 있다.
이러한 장점을 지난 앱타머 중 RNA 앱타머는, 반복된 생체 외 선별과정을 통해 임의의 RNA 라이브러리로부터 특이적인 RNA분자, 즉 앱타머를 선별하는데, RNA라이브러리의 사이즈가 크고, 생체 외 효소작용에 의하므로 RNA 라이브러리는 고 친화도 앱타머를 선별하기 위한 다른 생물학적 라이브러리 또는 합성 라이브러리보다 우수하다. 이리하여 치료제로서 RNA 앱타머의 잠재적인 용도에 대한 관심이 증가하고 있는데 고 친화도 RNA 앱타머는 SELEX 과정에 의해 선별될 수 있다. 또한, RNA 앱타머는 작은 화학물질보다 억제제로서 이점이 있는데 이는 일반적으로 표적 단백질에 넓은 결합부위를 제공하기 때문이다. 병리학적인 단백질-단백질 상호작용은 RNA 앱타머의 훌륭한 표적이 될 수 있는데 이는 고 친화도 RNA가 표적 단백질에 결합하여 복합체에서 다른 단백질과의 결합을 방해하기 때문이다. 더욱이 RNA 앱타머는 세포에서 RNA 벡터시스템을 이용하여 인트라머로 발현될 수 있다.
그리하여 이러한 앱타머를 이용한 다양한 약제에 대한 특허들이 제안된 바 있으며 한국 특허공개 제2004-14307호는 응고 및 섬유소 용해를 촉진하는 RNA앱타머를 제시하고 있다. 그러나 살모넬라 티피뮤리움균주의 ompC단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머에 대해서는 공개되어 있지 않은 실정이다.
본 발명은 살모넬라 티피뮤리움균주의 ompC 단백질의 RNA 분해효소 저항성 RNA 앱타머 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 살모넬라 티피뮤리움균주의 ompC 단백질에 특이적으로 결합하며, U(우라실)와 C(시토신)의 2'히드록실기가 플루오르기로 치환되어 있는 서열번호 1 또는 2를 갖는 RNA 분해효소 저항성 RNA 앱타머를 제공한다.
또한, 본 발명은 위 RNA 앱타머를 포함하는 바이오 센서를 제공한다.
또한, 본 발명은 위 RNA 앱타머를 포함하는 식중독, 대장염 및 티푸스성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 식품 첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명의 RNA앱타머는 식중독의 원인이 되는 살모넬라 티피뮤리움균주의 ompC 단백질에 특이적으로 결합함으로써 살모넬라균의 검출에 유용하다.
본 발명의 RNA앱타머는 살모넬라 균에 특이적으로 결합하여 그 작용을 억제함으로써 식품의 부패를 방지할 수 있다.
본 발명의 RNA앱타머는 살모넬라 균에 의한 여러 질환, 즉 식중독, 대장염 및 티푸스성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 6개의 히스티딘이 태그된 ompC 단백질을 보여주는 것이며, 도 1b는 ompC 단백질에 결합하는 RNA 앱타머를 발굴하기 위한 SELEX방법을 나타내는 모식도를 나타내는 것이다.
도 2는 5번 SERNA 앱타머 클론들이 ompC 단백질에 결합하는지를 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행한 결과를 나타내는 것이다.
도 3은 5번 SERNA 앱타머 클론들의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 4는 5번 SERNA 앱타머 클론 중 ompC 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선별하기 위하여 실시간 PCR과 EMSA를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 선별된 클론 #25 RNA 앱타머가 살모넬라 티피뮤리움균주에 결합하는지를 확인하기 위한 실험결과를 나타낸 것이다.
도 6은 선별된 클론 #25 RNA 앱타머가 살모넬라 티피뮤리움균주와 특이적으로 결합하는지를 확인하기 위한 실험결과를 나타낸 것이다.
도 7은 선별된 클론 #25 RNA 앱타머의 구조와 이의 43mer의 소형화한 앱타머의 위치를 나타낸 것이다.
도 8은 선별된 클론 #25 RNA 앱타머의 43mer 절단 RNA 앱타머의 ompC 단백질에 대한 결합을 EMSA를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 선별된 클론 #25 RNA 앱타머와 클론 #25 RNA 앱타머의 43mer 절단 RNA 앱타머의 ompC 단백질에 대한 결합력을 수치화하기 위하여 실시간 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 살모넬라 티피뮤리움균주의 ompC 단백질에 대해 특이적으로 결합하고, 그 염기 중 우라실(U) 및 시토신(C)의 2'히드록실기가 플루오르로 치환되어 있는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 가짐으로써 식중독의 주요원인이 되는 살모넬라 균의 검출에 유용하고, 살모넬라균에 특이적으로 결합하여 그 작용을 억제함으로써 식품의 부패를 방지할 수 있으며, 식중독, 대장염 및 티푸스성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 예방 및 치료에 유용한 RNA 앱타머에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 RNA앱타머는 특정의 구조를 갖는 살모넬라 티피뮤리움균의 ompC 단백질에 특이적으로 결합하는 것이다. 본 발명의 RNA 앱타머는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며 서열번호 1 또는 2의 염기서열에 임의의 염기서열을 추가로 포함하는 것이라도 살모넬라 티피뮤리움균의 ompC 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이면 실질적으로 본 발명의 RNA앱타머와 동일하다고 볼 수 있다.
서열번호 1 또는 2의 염기서열 중 우라실(U) 및 시토신(C)은 그 2' 히드록실기가 플루오르기로 치환된 것이다. 이러한 변형은 RNA분해효소에 저항성 있는 RNA를 제조하기 위해 수행된다.
본 발명의 RNA앱타머는 식중독을 일으키는 주요 균주 중 하나인 살모넬라균에 특이적으로 결합하기 때문에 음료등의 식품에 살모넬라균이 포함되어 있는 지를 확인할 수 있고, 환자가 살모넬라 균에 의한 여러 질환, 즉 대장염, 식중독 및 티푸스성 질환등에 걸렸는지 확인할 수 있는 센서로 기능할 수 있다.
또한, 본 발명의 RNA앱타머는 살모넬라균에 특이적으로 결합하여 그 기능을 저하시킬 수 있기 때문에, 이를 포함하는 약학 조성물은 살모넬라균에 의한 여러 질환, 즉 대장염, 티푸스성 질환 및 식중독의 예방 또는 치료에 효과적일 수 있다.
또한, 본 발명의 RNA앱타머를 식품 첨가제에 포함시켜 사용하면 살모넬라 균의 번식을 막을 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 이는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 하기 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1
실시예 1
1. RNA 앱타머의 발굴
SELEX 과정을 수행하는데 필요한 RNA 라이브러리를 제조하기 위하여, 40개의 염기가 무작위로 들어간 단일 올리고뉴클레오티드를 주형으로 이용하여 아래의 5'-프라이머와 3' -프라이머로 PCR을 통해 DNA 라이브러리를 제조하였다. 5' -프라이머는 RNA를 합성하기 위한 T7 RNA 폴리머라아제 프로모터 부분을 포함하고 있다.
(5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG-3'(5' -프라이머),
(5'-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3'(3' -프라이머),
0.25μM 5'-프라이머, 0.25μM 3'-프라이머, 10X PCR 버퍼, 200μM dNTP 혼합물, DNA 탭 중합효소(Finzzyme)3 유닛을 혼합하여 PCR을 수행하였다. PCR사이클로는 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 10 사이클을 반복한 뒤, 마지막으로 72℃ 7분으로 다양한 DNA 라이브러리를 제조하였다.
PCR을 통해 만들어진 다양한 염기서열을 가지는 DNA 라이브러리를 주형으로 T7 RNA 폴리머라아제(Epicentre Technologies)를 이용하여 시험관 내 전사 과정을 거쳐 다양한 염기서열을 갖는 RNA 라이브러리를 제조하였다. 이때 RNA 분해 효소에 저항성 있는 RNA를 제조하기 위하여 2'데옥시가 2'플루오르로 치환된 CTP와 UTP (Epicentre Technologies) 그리고 정상적인 GTP와 ATP들과 T7 RNA 폴리머라아제를 이용하여 시험관에서 합성된 주형의 전사에 의해 플루오르 그룹으로 매 2번 위치가 피리미딘기로 변형된 RNA를 생산하였다.
구체적으로 DNA 라이브러리, 5X 전사버퍼, 5mM DTT, 5mM ATP, GTP, 2'-F CTP, 2'-F UTP, T7 RNA 중합효소, DEPC-H2O로 20μl로 맞추고 37℃에서 6시간 동안 반응하였다. 여기에 DNaseI(Epicentre Technologies)를 37℃에서 30분간 처리하여 주형으로 사용된 DNA를 제거한 후 7M 우레아-8% 폴리아크릴아미드 겔에서 RNA 라이브러리를 추출하였다.
얻어진 아래의 RNA 라이브러리 염기서열은 A, G, C 그리고 U 각각 위치의 같은 몰로 혼입된 40개의 뉴클레오티드를 나타내는 아래의 N 40을 갖는다.
(5'GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCCN40CATAACCCAGAGGTCGATGGATCCCCCC3')을 갖는다.
도 1a는 6개의 히스티딘이 태그된 살모넬라 티피뮤리움 ompC 단백질을 나타낸 것이며, 도 1b는 SELEX방법을 이용한 살모넬라 티피뮤리움 ompC 단백질에 특이적인 RNA 앱타머를 발굴하는 개략도를 나타낸 것이다.
이하, SELEX 방법을 이용한 살모넬라 티피뮤리움 ompC 단백질에 특이적인 RNA 앱타머의 발굴과정을 상세히 설명한다.
SELEX에 사용할 ompC 단백질은 살모넬라 티피뮤리움 균주를 100℃에서 끓여 전체 유전체를 얻어낸 후 6개의 히스티딘을 태그하였다.
처음 150피코몰의 RNA 라이브러리를 실온에서 20분 동안 Ni-NTA 아가로스 비드와 200㎕ 결합 완충액(30mM TrisHCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1.5mM MgCl2, 2mM dithiothreitol, and 1% BSA)에서 반응하여 Ni-NTA 아가로스 비드와 반응하는 비특이적 RNA를 제거시켰다. 그 후 상층액을 새로운 튜브에 옮긴 후 75피코몰의 ompC 단백질과 실온에서 20분간 반응시겼다. 그 후 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 Ni-NTA 아가로스 비드와 실온에서 20분간 반응시켜 RNA가 결합된 ompC 단백질을 Ni-NTA 비드와 결합시켰다. 실온에서 20분간 반응 후 침전하여 펠렛을 400㎕ 결합 완충액으로 5번 씻어주었다. 이렇게 얻어진 RNA를 역전사-유전자 증폭기술과 시험관 전사를 반복하여 5번의 셀렉션 후 증폭된 DNA를 클로닝한 다음 22개의 클론의 염기서열을 분석하였다.
도 3은 위의 과정을 거쳐 분석된 5번 SERNA(5번의 셀렉션 후 얻어진 RNA)앱타머 클론들의 염기서열을 나타낸 것이다.
2. 5차의 SELEX 후 얻어진 RNA 풀의 ompC 단백질과의 결합어세이(실시간 PCR이용)
5번 SERNA 앱타머 클론들이 ompC 단백질에 특이적으로 결합하는지 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행하여 ompC 단백질에 결합한 RNA의 양을 측정하였고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2를 살펴보면 5번 풀+ompc-1과 5번 풀+ompc-2의 CT값이 11.61, 11.23으로 작으며, 상대적인 RNA양도 5번 풀+ompc-1과 5번 풀+ompc-2가 16.49%, 19.48%로 확인되는바 5번 SERNA 앱타머 풀이 ompC 단백질에 특이적으로 결합함을 확인할 수 있다.
이하, 5번의 SELEX 과정이 수행된 RNA와 초기의 RNA 라이브러리를 이용하여 수행된 RT PCR과 실시간 PCR과정에 대해 상세히 설명한다.
5번의 SELEX 과정이 수행된 RNA와 초기의 RNA 라이브러리 각각 60펨토몰과 ompC 단백질 6피코몰을 각각 반응시킨 후 ompC 단백질에 결합하는 RNA를 얻어내었다.
페놀 추출물/에탄올 침적과정을 통해 RNA를 얻어낸 후 DEPC-H2O를 넣어 RNA를 녹이고 여기에 200nM 3' 프라이머를 넣어 65℃에서 5분간 가열한 뒤 상온에서 10분간 RNA와 3' 프라이머를 결합시켰다.
1mM dNTP, 5X RTase 버퍼, 200유닛 M-MLV RTase(Finzzyme)를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응한 뒤 95℃에서 5분간 RTase를 불활성화시켰다. 역 전사한 단일 DNA 중 1/3만 PCR 주형으로 사용하였다.
이때, 생성된 DNA의 실시간 양을 측정하기 위해 실시간 PCR (Rotor Gene RG-6000)을 다음과 같은 조건으로 수행하였는데 구체적으로, cDNA, 100nM 5' 프라이머, 100nM 3' 프라이머, 10X PCR 버퍼 10㎕, 500μM dNTP, 5X RTase 버퍼 7㎕, 100X Syber green, 2 유닛 탭 폴리머라아제(Finnzyme)을 혼합하여 처음 95℃ 5분간 유지한 후 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초 조건으로 40사이클을 반복하여 얻어진 RNA의 양을 측정하였다.
3. 발굴된 앱타머의 선별
3-1. 발굴된 앱타머의 ompC 단백질과의 결합 측정을 통한 선별(실시간 PCR 이용)
5번의 SELEX과정을 거쳐 얻어진 RNA 앱타머 클론들 중 ompC 단백질에 결합하는 최적화된 앱타머를 발견하기 위하여 실시간 PCR 과 EMSA를 수행하였다. 도 4를 참조하면, RNA 앱타머 클론중에 클론 #7과 클론 #25가 ompC 단백질에 가장 잘 결합하는 것을 확인하였다.
이하 수행된 실시간 PCR과정은 공지의 방법과 동일하므로 생략하기로 한다.
3-2. 발굴된 앱타머의 ompC 단백질과의 결합 측정을 통한 선별( EMSA 이용)
또한, 5번의 SELEX 과정을 거쳐 얻어진 RNA 앱타머 클론들 중 ompC 단백질에 결합하는 최적화된 앱타머를 발견하기 위하여 EMSA를 수행하였는바, 이하 수행되어진 EMSA에 대해 상세히 설명한다.
SELEX 과정이 수행되었던 RNA와 초기의 RNA 라이브러리 각각 60펨토몰에 ompC 단백질 6피코몰과 비특이적 결합을 없애기 위한 yeast tRNA 60펨토몰을 20㎕ 결합 완충액 (30mM TrisHCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1.5mM MgCl2, 2mM dithiothreitol)에서 실온에서 20분간 반응시킨 후 8% native 아크릴아미드 겔 (1X TBE, 8% 아크릴아미드, 10mM MgCl2, 2% 글리세롤)에서 100V의 전류로 4℃에서 2시간 30분 동안 전기영동을 하였다. 전기영동 후 0.5X TBE 완충용액에서 200mA로 4℃에서 1시간 동안 native 아크릴아미드에 있는 RNA들을 니트로셀룰로오스 멤브레인 으로 이동하였다. UV cross-linking으로 RNA를 니트로셀룰로오스 멤브레인에 고정한 뒤 5' 말단에 비오틴이 결합되어 있는 SELEX에 사용하였던 3' 프라이머 (5'-biotin-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3')을 사용하여 Brightstar BioDetectTM 검출키트(Ambion)의 실험방법에 따라 ompC 단백질에 결합된 RNA를 확인하였다.
4. 선별된 RNA 앱타머의 살모넬라 티피뮤리움균주와의 결합 확인
위의 실시간 PCR과 EMSA과정을 통해 선별된 클론 #7 RNA앱타머, 클론 #25 RNA앱타머가 ompC 단백질이 발현되고 있는 살모넬라 티피뮤리움균주와 결합하는지 확인하기 위하여, A16 tail된 RNA에 비오틴-dT(16) oligo를 결합시켜 스트렙트아비딘이 코팅된 96well 플레이트에 고정한 뒤, 살모넬라 티피뮤리움균주를 결합시켜 위 균주에 대한 항체를 형광을 통하여 검출하여 결합 정도를 확인하였다.
도 5를 참조하면, 살모넬라 티피뮤리움 ompC 단백질에 비특이적 RNA인 라이브러리, RM 9에 대한 형광수치와 살모넬라 티피뮤리움 ompC 단백질에 특이적인 클론 #7 RNA 앱타머에 대한 형광수치가 유사하게 검출되었는바, 클론 #25 RNA 앱타머만이 살모넬라 티피뮤리움균주에 대해 특이적으로 결합함을 확인하였다. 이는 클론 #25 RNA앱타머가 가지는 특이적인 염기서열에 의한 것으로 보인다.
이하 수행한 실험방법을 상세히 설명한다.
선별된 클론 #7 RNA 앱타머와 비특이적 RNA들의 3' 말단에 A16 tail을 하였다. A16 tail된 RNA 40피코몰과 dT(16)-biotin 10피코몰을 실온에서 10㎕ DEPC-H2O에서 30분간 반응시켰다. 결합시킨 중합 RNA를 스트렙트아비딘이 코팅된 96well ㅍ플레이트에서 30분간 플레이튼에 고정화시켰다.
1X107의 살모넬라 균주를 100㎕ 결합 완충액 (0.05% Tween-20, 1.5mM MgCl2, 1XPBS)에 풀어준 뒤 각 well에 처리하여 실온에서 20분간 중합 RNA와 살모넬라 티피뮤리움균주를 결합시켰다. 살모넬라 티피뮤리움균주에 대한 1차 항체(100ng/well)를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 완충용액(0.1% Tween-20, 1.5mM MgCl2,1XPBS)로 3회 씻어준 뒤 HRP-conjugated 2차 항체(100ng/well)를 100㎕ 결합 완충액(0.05% Tween-20, 1.5mM MgCl2,1XPBS)에서 1시간 동안 반응시켰다. 완충용액으로 3회 씻어준 뒤 100㎕ QuantaBlu peroxidase substrate solution (Pierce)에 풀어주고 Fluorometer (Fluoroskan, Thermo Scientific)로 Excitation 325nm, Emssion 420nm의 파장으로 형광을 측정하였다.
5. 선별된 클론 #25 RNA 앱타머의 살모넬라 티피뮤리움균주에의 특이성 확인
선별된 클론 #25 RNA 앱타머가 살모넬라 티피뮤리움균주의 ompC 단백질을 특이적으로 인지하여 결합하는지 확인하기 위하여, 대조 균주로써 스타필로코코스 아우레우스균주를 사용하여 스트렙트아비딘-HRP를 이용, 균주와 결합한 RNA를 형광을 통하여 검출하여 결합 정도를 측정하였다.
도 6을 참조하면, 대조군으로 사용한 dT-비오틴과 비특이적 RNA(dano)는 모든 균주에 거의 결합하지 않지만, 클론 #25 RNA앱타머는 스타필로코코스 아우레우스균주에는 결합하지 않고 살모넬라 티피뮤리움균주에만 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다. 이를 통하여 선별된 클론 #25 RNA 앱타머가 살모넬라 티피뮤리움균주의 ompC 단백질을 인지하여 결합한다는 것을 확인하였다.
이하, 클론 #25 RNA 앱타머의 스트렙트아비딘-HRP를 이용한 살모넬라 티피뮤리움균주에의 특이성을 확인한 실험과정을 상세히 설명한다.
선별된 #25 RNA 앱타머와 비특이적 RNA들의 3' 말단에 A16 tail을 하였다.
A16 tail된 RNA 10피코몰과 dT(16)-비오틴 100피코몰을 실온에서 10㎕ DEPC-H2O에서 30분간 반응시켰다. 결합시킨 중합 RNA를 1X107의 살모넬라 균주와 200㎕ 결합 완충액 (30mM TrisHCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1.5mM MgCl2, 2 mM dithiothreitol, and 1% BSA)에서 반응한 뒤 침전하여 펠렛을 400㎕ 결합 완충액으로 2번 씻어 주었다. 펠렛을 1X PBS에 1:1000으로 희석된 스트렙트아비딘-HPR 스용액 100㎕에 풀어 준 뒤 실온에서 30분간 스트렙트아비딘-HRP와 중합 RNA를 결합시켰다. 200㎕ 1XPBS로 2회 씻어준 뒤 펠렛을 100㎕ QuantaBlu peroxidase substrate solution (Pierce)에 풀어주고 Fluorometer (Fluoroskan, Thermo Scientific)로 Excitation 325nm, Emssion 420nm의 파장으로 형광을 측정하였다.
6. 절단 RNA 앱타머제작
이상에서 살펴본 바와 같이, 살모넬라 티비뮤리움균주와 특이적으로 결합하는 클론 #25 RNA앱타머를 선별하였는바, 선별된 클론 #25 RNA 앱타머의 최적화를 위해 full length의 RNA 앱타머를 잘라내어 43mer의 소형화된 앱타머를 제작하였다. 도 7은 선별된 클론 #25 RNA 앱타머의 구조와 43mer의 소형화된 앱타머의 위치를 보여준다. 이하, 43mer의 소형화된 앱타머를 제작하는 방법에 대해 상세히 설명한다.
43mer의 소형화 된 앱타머에 각각 아래의 5' 및 3' 프라이머를 사용하여 각각 PCR로 증폭시켰다.
이들 프라이머의 서열은 아래와 같다.
5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTGAGAGCCGTGAGTG-3'(5' 프라이머)
5'-GGGTCCGATCTTTGTCGCGGCCTTTCACTCACGGCTC-3'(3' 프라이머)
구체적으로 0.25 μM 5'-프라이머, 0.25 μM 3'-프라이머, 5X PCR 버퍼, 200 μM dNTP 혼합물, Phusion DNA 탭 중합효소(Finzzyme) 0.4 유닛을 혼합하여 PCR을 수행하였으며, PCR사이클로는 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 25사이클을 반복한 뒤, 마지막으로 72℃ 7분으로 DNA주형을 제조하였다. 증폭시킨 이중나선 DNA 주형을 T7 RNA 중합효소를 이용하여 시험관 내 전사를 수행한다. 이때 피리미딘 뉴클레오티드들은 2'-플루오르기로 치환된 것들을 사용하였다. 제작된 각각의 RNA 앱타머들은 우레아 폴리아크릴아미드 겔로 전기영동 한 후 정제하였다.
7. 클론 #25 RNA 앱타머 및 그의 소형화한 앱타머의 살모넬라 티피뮤리움균 주와의 결합 친화도 측정
이어, 클론 #25 RNA 앱타머의 소형화한 앱타머가 살모넬라 티피뮤리움 균주의 ompC 단백질에 결합하는지를 확인하기 위하여 EMSA를 수행하였으며, 도 8을 참고하면, Full length 클론 #25 RNA 앱타머와 마찬가지로 43mer 소형화한 앱타머 역시 ompC 단백질에 결합하는 것을 확인하였다.
또한, 이러한 결합력을 수치화하기 위하여 실시간 PCR을 통하여 친화도를 확인하였다. 도 9를 참조하면 Full length의 클론 #25 RNA 앱타머는 20.27±4.372의 친화도를, 클론 #25의 43mer 소형화한 앱타머는 27.64±4.784의 친화도를 나타냄을 확인할 수 있는데 이로써, 클론 #25의 Full length RNA 앱타머 및 그의 43mer 소형화한 앱타머를 살모넬라 티피뮤리움균주를 특이적으로 검출하는데에 이용할 수 있을 것이다.
이하, 클론 #25의 Full length RNA 앱타머와 이의 43mer 소형화한 RNA 앱타머의 ompC 단백질과의 결합친화도를 보여주는 실시간 PCR 실험과정을 상세히 설명한다.
Full length 클론 #25의 RNA앱타머와 이의 소형화한 43mer RNA앱타머 각각 60펨토몰과 ompC단백질을 60펨토몰(0.3nM)부터 122.88피코몰(614.4nM)까지 단백질을 늘리면서 200㎕ 결합 완충액 (30mM TrisHCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1.5mM MgCl2, 2mM 디티오트레이톨)에서 실온에서 20분간 반응시킨 후, Ni-NTA 아가로스 비드와 실온에서 20분간 반응 후 펠렛을 400㎕ 결합 완충액으로 5번 씻어 주었다.
페놀 추출/ 에탄올 침전과정을 통해 RNA를 얻어낸 후, DEPC-H2O를 넣어 RNA를 녹이고 여기에 200nM 3' 프라이머를 넣고 65℃에서 5분간 가열한 뒤 상온에서 10분간 RNA와 3' 프라이머를 결합시켰다. 그 후, 1mM dNTP, 5X RTase 버퍼, 200 유닛 M-MLV RTase(Finzzyme)를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응한 뒤 95℃에서 5분간 RTase를 불활성화시켰다. 역 전사한 단일 DNA 중 1/3만 PCR주형으로 사용하였다. 이때, 실시간 양을 측정하기 위해 실시간 PCR(Rotor Gene RG-6000)을 다음과 같은 조건으로 사용하였다. cDNA, 100nM 5' 프라이머, 100nM 3' 프라이머, 10X PCR 버퍼 10㎕, 500μM dNTP, 5X RTase 버퍼 7㎕, 100X Syber green, 2유닛 탭 폴리머라아제(Finnzyme)을 혼합하여 처음 95℃ 5분간 유지한 후 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초 조건으로 40사이클을 반복하여 얻어진 RNA의 양을 측정하였다.
Full length 클론 #25의 RNA앱타머의 PCR에 사용한 프라이머는
5'-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3'(5'프라이머)
5'-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3'(3'프라이머)를 사용하였고,
클론 #25의 RNA앱타머의 43mer에 사용한 프라이머는
5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTGAGAGCCGTGAGTG-3'(5'프라이머),
5'TTTTTTTTTTTTTTTTGGGTCCGATCTTTGTCGC-3'(3'프라이머)를 사용하였다.
얻어진 RNA의 양을 측정하기 위하여 알고 있는 양의 각각의 RNA를 표준 PCR 을 통하여 구하였다.
본 발명의 살모넬라 티피뮤리움균주의 ompC 단백질에 대해 특이적이고 높은 친화력으로 결합할 수 있는 앱타머 염기서열은 서열번호 1 또는 2와 같았다.
<110> Korea Food Research Institute <120> RNA APTAMERS FOR SALMONELLA TYPHIMIRIUM OMPC PROTEINS <130> p-2010-2 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 89 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clone 25 <400> 1 gggagagcgg aagcgugcug gguaguguga gagccgugag ugaaaggccg cgacaaagau 60 cggacauaac ccagaggucg auggucccc 89 <210> 2 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> clone 25 43mer <400> 2 gggugagagc cgugagugaa aggccgcgac aaagaucgga ccc 43

Claims (5)

  1. 살모넬라 티피뮤리움의 ompC 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 갖는 RNA 앱타머.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호 1 또는 2의 우라실(U) 및 시토신(C)은 2'히드록실기가 플루오르기로 치환된 것인 RNA 앱타머.
  3. 청구항 1 또는 2의 RNA 앱타머를 포함하는 살모넬라균 검출용 바이오 센서.
  4. 청구항 1 또는 2의 RNA 앱타머를 포함하는 대장염, 티푸스성 질환 및 식중독으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 청구항 1 또는 2의 RNA 앱타머를 포함하는 식품첨가제 조성물.
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