WO2012081907A2 - 이콜라이 ｏ１５７：ｈ７균주에 대한 ｒｎａ 앱타머 - Google Patents

이콜라이 ｏ１５７：ｈ７균주에 대한 ｒｎａ 앱타머 Download PDF

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Definitions

  • Ekolai O157: H7 (E.coil O157: H7) It relates to an RNA aptamer that binds specifically to.
  • E.coil stands for the nomenclature of Escherichia coli Escherichia coli, yikolrayi O157: H7 strain, wherein one of O and O157 O (cell) antigens that cause agglutination of the serum protein of the O-antigen on the surface of E. coli, H wherein It has one H (anti flag) antigen that causes an aggregation reaction with one of the serum H7 .
  • the E. coli O157: H7 strain was first discovered in the United States in 1982. It is a type of pathogenic E. coli that inhabits the intestines of humans or animals and causes diarrhea or abdominal pain. This is because it is difficult to distinguish it because its shape and size are similar to those of general E. coli, and to distinguish it, it is possible to observe agglutination reaction with a certain antigen antibody in vitro or use serological method. It is a protein O-type antigen located at 157th among many types of protein O-type antigens, and is called O157 .
  • E. coli O157: H7 is very contagious and has an average incubation period of 3-8 days, which makes it difficult to determine the cause of food poisoning and is hard to prevent.It can cause abdominal pain, diarrhea and bloody stools once invading the human body. Like the dysentery, it produces a toxic protein compound called vero toxin, which spreads to the body, causing hemolytic uremic disease that destroys red blood cells and attacks the kidneys, causing the kidneys to lose function. Gastric uremic disease is secondary to the nervous system, respiratory system, and circulatory system, leading to death and eventually death. The mortality rate is reported to be from 5% to 10% and to be infected at all ages. Cause.
  • E. coli O157: H7 is infected when animals eat stool contaminated with livestock, sashimi, hamburgers, or vegetables at less than 65 ° C, or drink drinking water contaminated with animal stools, and also through patients infected with E. coli O157: H7.
  • E. coli O157: H7 In 1996, in Japan, elementary school children caused large-scale food poisoning and became a social problem, and in the United States, it is widely known as a dangerous substance of food poisoning. According to the US Centers for Disease Control, poor cooking when making hamburgers causes the bacteria to die and cause food poisoning, resulting in more than 20,000 cases of food poisoning per year, resulting in 200-500 deaths.
  • coli O157 H7 strain
  • four specific genes Verotoxin 2, barrier-associated pathogens, enzyme-specific genes
  • aptamer aptamer
  • Aptamers are single-chain DNA or RNA that can specifically bind to various compounds, such as biomolecules such as proteins and amino acids or small organic chemicals such as environmental hormones, and evolve using oligonucleotide libraries called SELEX.
  • SELEX oligonucleotide libraries
  • Aptamers which are recognized as replacements for antibodies, can be used as elements of biosensors that can recognize molecules in detection and analysis systems, just like antibodies.
  • Oligonucleotide-based aptamers have several advantages over protein-based antibodies. First, the aptamer is obtained in vitro, and second, various organic and inorganic materials including toxins can be used as target molecules of the aptamer. When specific aptamers that bind specifically are identified and obtained, they can be reproduced with low cost and high consistency by automated oligomer synthesis. It is also relatively easy for aptamers to introduce useful functional groups such as fluorescent molecules or photoreactive groups, and the structure of aptamers can have a longer time than that of antibodies because of the reversible process of denaturation by heat. have.
  • RNA aptamers select specific RNA molecules, namely aptamers, from any RNA library through repeated in vitro screening process.
  • RNA libraries are superior to other biological or synthetic libraries for selecting high affinity aptamers.
  • RNA aptamers have an advantage as inhibitors over small chemicals because they generally provide a broad binding site for the target protein.
  • Pathological protein-protein interactions can be excellent targets for RNA aptamers because high affinity RNA binds to the target protein and interferes with the binding of other proteins in the complex.
  • RNA aptamers can be expressed as intramers in cells using RNA vector systems.
  • RNA aptamer specifically binding to the E. coli O157: H7 strain is not disclosed.
  • the present invention aims to provide RNA degrading enzyme resistant RNA aptamer of E. coli O157: H7 strain and its use.
  • the present invention specifically binds to an E. coli O157: H7 strain, and has a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 4, wherein the 2 'hydroxyl group of uracil (U) and cytosine (C) is substituted with a fluorine group.
  • RNA degrading enzyme resistant RNA aptamers are provided.
  • the present invention provides a biosensor comprising the above RNA aptamer.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition and food additive composition for the prevention and treatment of food poisoning, hemolytic uremic syndrome and hemolytic anemia comprising a stomach RNA aptamer.
  • the RNA aptamer of the present invention is useful for the detection of the E. coli O157: H7 strain by specifically binding to the E. coli O157: H7 strain, which is the main cause of food poisoning.
  • the RNA aptamer of the present invention can prevent the corruption of food by specifically binding to the E. coli O157: H7 strain and inhibiting its action.
  • RNA aptamer of the present invention can be usefully used in pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of various diseases caused by the E. coli O157: H7 strain, that is, food poisoning, hemolytic uremic syndrome and hemolytic anemia.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of discovering RNA aptamers specific for the E. coli O157: H7 strain using the SELEX method.
  • Figure 2 shows the results of real-time PCR to confirm whether the SERNA aptamer clone 6 binds with E. coli O157: H7 strain.
  • Figure 3 shows the nucleotide sequence of 6 times SERNA aptamer clones.
  • Figure 4 shows the results of ELISA to select the aptamer binding to E. coli O157: H7 strain of SERNA aptamer clone 6.
  • FIG. 5 shows the results of real-time PCR to select RNA aptamers that bind with E. coli O157: H7 strains with high affinity among clones # 13, # 28, # 40, and # 49 RNA aptamers selected by ELISA. will be.
  • Figure 6 shows the structure of clone # 40 RNA aptamer selected by real-time PCR and the structure and location of the miniaturized aptamer.
  • RNA aptamers and aptamer miniaturization and yikolrayi O157 shows the check result through the control coupling between the specific binding with the H7 strain (binding assay).
  • Figure 8 shows the results confirmed by ELISA the binding of the cloned clone # 40 RNA aptamer and miniaturized aptamer and E. coli O157: H7 strain LPS.
  • the present invention specifically binds to E. coli O157: H7 and has a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 4 in which 2 ′ hydroxyl groups of uracil (U) and cytosine (C) are substituted with fluorine It is useful for the detection of E. coli O157: H7 bacteria, which is a major cause of food poisoning, and specifically binds to the E. coli O157: H7 strain, thereby preventing its decay and preventing food spoilage.
  • the present invention relates to RNA aptamers useful for the prevention and treatment of diseases selected from the group consisting of posterior and hemolytic anemia.
  • the RNA aptamer of the present invention specifically binds E. coli O157: H7 .
  • the RNA aptamer of the present invention preferably has a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 4, but is not limited thereto and adds an arbitrary nucleotide sequence to the base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 4. Even if it is included as long as it can specifically bind to E. coli O157: H7 can be said to be substantially the same as the RNA aptamer of the present invention.
  • uracil (U) and cytosine (C) are those in which the 2 ′ hydroxyl group is substituted with a fluorine group. This modification is carried out to produce RNA resistant to RNA degrading enzymes.
  • the pharmaceutical composition comprising the same has various diseases caused by E. coli O157: H7 , that is, food poisoning, hemolytic uremic syndrome and hemolytic It can be effective in preventing and treating anemia.
  • RNA aptamer of the present invention prevents the propagation of E. coli O157: H7 .
  • RNA library required to perform the SELEX process
  • a DNA library was prepared by PCR with the 5'-primer and 3'-primer below using a single oligonucleotide containing 60 bases as a template.
  • the 5-primer contains a T7 RNA polymerase promoter portion for synthesizing RNA.
  • PCR was performed by mixing 0.25 ⁇ M 5′-primer, 0.25 ⁇ M 3′-primer, 10 ⁇ PCR buffer, 200 ⁇ M dNTP mixture, DNA tap polymerase (Finzyme) 3 units. As a PCR cycle, 10 cycles were repeated under conditions of 95 ° C. 30 seconds, 55 ° C. 30 seconds, and 72 ° C. 30 seconds, and finally, various DNA libraries were prepared at 72 ° C. for 7 minutes.
  • RNA library having various base sequences was prepared using a T7 RNA polymerase (Epicentre Technologies) as a template, followed by in vitro transcription, to prepare an RNA library having various base sequences.
  • RNA was produced in which the fluorine group was modified every two times with pyrimidine groups.
  • RNA library was extracted from 7M urea-8% polyacrylamide gel after treatment with DNaseI (Epicentre Technologies) at 37 ° C. for 30 minutes to remove the DNA used as a template.
  • RNA library sequences obtained comprise N60 representing 60 nucleotides incorporated into the same mole of A, G, C and U positions respectively.
  • yikolrayi O157 using the SELEX method will be described in detail the excavation process, the specific RNA aptamer to H7 strains: yikolrayi O157 will showing a schematic view for discovering specific RNA aptamer to H7 strains using the following SELEX method.
  • RNA binding buffer (30 mM TrisHCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2 ,) in 3 ⁇ 10 6 K12 strain cells for 10 minutes at room temperature.
  • 2 mM dithiothreitol, and 1% BSA non-specific RNA reacted with K12 strain was precipitated and removed by centrifugation. Then, the supernatant was transferred to a new tube and reacted with 1 ⁇ 10 6 O157: H7 strains at room temperature for 10 minutes.
  • RNA was not bound to O157: H7 by centrifugation, and the pellet was washed 5 times with 400 ⁇ l binding buffer. Thereafter, 200ul of Elution buffer (10mM EDTA) was added thereto, followed by heat treatment at 95 ° C. for 5 minutes to extract bound RNA.
  • Elution buffer 10mM EDTA
  • Figure 3 shows the nucleotide sequence of 6 SERNA (RNA obtained after 6 selection) aptamer clones analyzed through the above process.
  • Figure 2 shows the confirmation of specific binding of SERNA aptamer pool 6 and E. coli O157: H7 strain by real-time PCR.
  • RNA aptamer subjected to the 6th SELEX process and the initial RNA library were reacted with 6 picomols and 5X10 6 O157: H7 and K12 strains , respectively, to obtain RNA binding to each.
  • RNA was obtained through phenol extract / ethanol deposition process, DEPC-H2O was added to dissolve RNA, 200 nM 3 ′ primer was added thereto, heated at 65 ° C. for 5 minutes, and RNA and 3 ′ primer were combined at room temperature for 10 minutes.
  • RTase After adding 1 mM dNTP, 5X RTase buffer, 200 units M-MLV RTase (Finzzyme) for 1 hour at 42 ° C, RTase was inactivated at 95 ° C for 5 minutes. Only one third of the back-transferred single DNA was used as a PCR template.
  • RNA obtained is measured repeatedly.
  • cDNA 100 nM 5 'primer, 100 nM 3' primer, 10 ⁇ l PCR buffer 10 ⁇ l, 500 ⁇ M dNTP , 7X of 5X RTase buffer, 100X Syber green, 2 unit tap polymerase (Finnzyme) was mixed and maintained at 95 ° C for 5 minutes, followed by 40 cycles of 95 ° C 30 seconds, 58 ° C 30 seconds, 72 ° C 30 seconds. The amount of RNA obtained is measured repeatedly.
  • Real-time PCR is a technology that monitors and interprets the increase in PCR amplification products in real time. As the amount of initial DNA increases, the amount of amplification products reaches a detectable amount rapidly, and thus the amplification curve rises steeply.As a result of real-time PCR using a standard sample diluted in stages, the amount of initial DNA is amplified side by side at regular intervals. A curve can be obtained. If you set the minimum threshold that causes a reaction in a suitable place, it calculates the point where the minimum threshold that causes a reaction meets the amplification curve (CT value), which is a value when the PCR amplification product is amplified by a certain amount. The number of cycles means that the greater the amount of DNA in the initial stage, the amount of amplification products reaches a faster detectable amount, so that the lower the CT value is, the larger the initial DNA amount is.
  • CT value amplification curve
  • CT value increases in the order of SERNA pool + O157: H7 , library SERNA pool + O157: H7 , library RNA pool + K12 strain , SERNA pool + K12 strain 6
  • the RNA pool obtained after 6 SELEX processes has a large amount of RNA aptamer specifically binding to the E. coli O157: H7 strain, which means that the SERNA pool 6 specifically binds to the E. coli O157: H7 strain. can confirm.
  • Figure 4 shows the result of ELISA to confirm the binding of each of the RNA aptamer clones and E. coli O157: H7 strains discovered through the six SELEX, clone # 13 RNA apps among the RNA aptamer clones found Tammer, # 31 RNA aptamer, # 40 RNA aptamer, # 49 RNA aptamer was confirmed that the binding to the E. coli O157: H7 strain.
  • A16 tail was applied to the 3 'end of the excavated RNA aptamer and nonspecific RNAs.
  • 30 picomolar of A16 tailed RNA and 10 picomolar of dT (16) -biotin were reacted at 10 ⁇ DEPC-H 2 O at room temperature for 30 minutes.
  • Bound hybrid RNA was immobilized on the plate for 30 minutes in a streptavidin-coated 96well plate.
  • the primary antibody (100 ng / well) against the strain was reacted at room temperature for 1 hour, washed three times with buffer solution (0.1% Tween-20, 1.5 mM MgCl 2 , 1XPBS) and then HRP-conjugated secondary antibody (100 ng). / well) was reacted in 100 ⁇ l binding buffer (0.05% Tween-20, 1.5 mM MgCl 2 , 1XPBS) for 1 hour, washed three times with buffer solution, and dissolved in 100 ⁇ l QuantaBlu peroxidase substrate solution (Pierce). Fluorescence was measured with a wavelength of Excitation 325 nm and Emssion 420 nm (Fluoroskan, Thermo Scientific).
  • clone # 40 that specifically binds to the E. coli O157: H7 strain was selected from the sixth SERNA aptamer.
  • a clone # 40 aptamer specifically binding to the E. coli O157: H7 strain was selected.
  • a full length RNA aptamer was cut out stepwise to 64mer.
  • 38mer, 28mer miniaturized aptamer was prepared by in vitro transcription method using T7 polymerase.
  • Figure 6 shows the nucleotide sequence and structure of the selected clone # 40 RNA aptamer and the nucleotide sequence and structure of the aptamers downsized to three sizes.
  • the 5mer and 3 'primers were used for the 64mer clone # 40LS RNA aptamer, respectively, and the 5' and 3 'primers were used for the 38mer clone # 40L aptamer, respectively.
  • Aptamers were amplified by PCR using 5 'primers and 3' primers, respectively.
  • PCR was performed by mixing 0.25 ⁇ M 5′-primer, 0.25 ⁇ M 3′-primer, 5X PCR buffer, 200 ⁇ M dNTP mixture, Phusion DNA tap polymerase (Finzzyme) 0.4 unit, and the PCR cycle was 95 ° C 30 seconds. After repeating 25 cycles under the conditions of 55 ° C. 30 sec, 72 ° C. 30 sec, a DNA template was prepared at 72 ° C. for 7 minutes. The amplified double-stranded DNA template was subjected to in vitro transcription using a T7 RNA polymerase, wherein pyrimidine nucleotides were substituted with 2'-fluorine groups. Each of the prepared RNA aptamers was purified by electrophoresis on urea polyacrylamide gel.
  • treatment with only streptavidin-HRP used as a control and treatment with library RNA hardly bind to the E. coli O157: H7 strain, but clone # 40 RNA aptamer and clone # 40LS RNA aptamer, The clone # 40L RNA aptamer and the clone # 40S RNA aptamer did not bind to the K12 strain but were specifically bound to the E. coli O157: H7 strain.
  • RNA aptamers and nonspecific RNAs 5 picomolar of A16 tailed RNA and 10 picomolar of dT (16) -biotin were reacted at 10 ⁇ DEPC-H 2 O at room temperature for 30 minutes.
  • the bound hybrid RNA was reacted with O157: H7 strain of 5 ⁇ 10 6 in 200 ⁇ l binding buffer (30 mM TrisHCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2 , 2 mM dithiothreitol, and 1% BSA) and precipitated. Washed three times with 400ul binding buffer.
  • the pellet was released in 100 ⁇ l of streptavidin-HPR solution diluted 1: 1000 in 1X PBS, and then streptavidin-HRP and hybrid RNA were bound at room temperature for 30 minutes. After washing twice with 200 ⁇ l 1XPBS / MgCl 2, pellets were released in 100 ⁇ l QuantaBlu peroxidase substrate solution (Pierce), and fluorescence was measured at a wavelength of Excitation 325 nm and Emssion 420 nm with a Fluorometer (Fluoroskan, Thermo Scientific).
  • the clone # 40 RNA aptamer and clone # 40LS RNA aptamer, clone # 40L RNA aptamer, and clone # 40S RNA aptamer do not bind to the K12 strain but are specific to E. coli O157: H7 strain.
  • a label recognized as an external antigen ELISA was extracted from O157: H7 strain and K12 strain to bind clone # 40 RNA aptamer and miniaturized aptamer. Measured through.
  • Figure 8 shows the above results and the same as the results shown in the direct binding via streptavidin-HRP, LPS extracted from each strain, coated on a plate clone in the experiment of clone # 40 RNA aptamer and a small app Compared to the LPS of the K12 strain, the tamers specifically bind to the LPS of the E. coli O157: H7 strain.
  • O157 H7 strain and the process and the clone # 40 RNA aptamers and miniaturized aptamers are O157 that LPS produced a coated plate for K12 strain: H7 strain and K12 strain LPS describes the course of the experiment determining the binding specifically with do.
  • LPS to be used in the experiment was isolated by using LPS extraction kit (Intron Biotechnology) in 1X10 9 O157: H7 strain and K12 strain , respectively.
  • the separated LPS was diluted in PBS at 100 ng / well and dispensed in 100 ul into 96 well plates (TPP), followed by reaction in a 37 ° C. incubator and then at 4 ° C. for 16 hours.
  • LPS-coated plates were incubated for 1 hour at room temperature with blocking buffer (PBS with 5% BSA / yeast tRNA (10ug)). Then, A16 tail was performed at the 3 'end of the selected RNA aptamer and nonspecific RNAs.
  • the aptamer nucleotide sequence that can bind to the E. coli O157: H7 strain of the present invention with specific and high affinity was the same as the nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1-4.

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Abstract

[요약] 본 발명은 이콜라이 O157:H7균주에 대한 RNA 앱타머에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 이콜라이 O157:H7균주에 특이적으로 결합하고, 그 염기중 우라실(U) 및 시토신(C)의 2' 히드록실기가 플루오르기로 치환되어 있는 서열번호 1 내지 4로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열을 가짐으로서, 식중독의 주요 원인이 되는 이콜라이 O157:H7균주의 검출에 유용하고, 이콜라이 O157:H7균주에 특이적으로 결합하여 그 작용을 억제함으로써 식품의 부패를 방지할 수 있으며, 식중독, 용혈성 요독증후군 및 용혈성 빈혈로 이루어진 군에서 선택된 질환의 예방 및 치료에 유용한 RNA 앱타머에 관한 것이다. [대표도] 도6

Description

이콜라이 Ｏ１５７：Ｈ７균주에 대한 ＲＮＡ 앱타머
본 발명은 이콜라이 O157:H7(E.coil O157:H7)에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머에 관한 것이다.
E.coil 는 대장균의 학명인 Escherichia coli 의 약자이며, 이콜라이 O157:H7 균주는 대장균 표면에 있는 단백질 O형 항원의 O항 혈청 중의 하나인 O157과 응집 반응을 일으키는 O(균체)항원과, H항 혈청 중의 하나인 H7 과 응집 반응을 일으키는 H(편모) 항원을 가지고 있다.
이콜라이 O157:H7 균주는 1982년 미국에서 처음 발견된 것으로, 사람이나 동물의 장관에 서식하며 설사나 복통을 일으키는 병원성 대장균의 일종으로 장관 출혈성 대장균에 속하며 통상적으로 혈액을 동반한 설사증을 유발한다. 이는 모양이나 크기 등이 일반 대장균과 유사하여 구분하기가 어렵기 때문에 이것을 구별하기 위하여 시험관 내에서 일정한 항원 항체에 대한 응집반응을 관찰하거나 혈청학적인 방법을 사용하는데, 이때 분류지표로 사용되는 것이 대장균 표면에 위치한 단백질 O형 항원이며 단백질 O형 항원의 많은 타입 중 157번째로 발견된 것이어서 O157 이라고 불린다.
이콜라이 O157:H7 균은 전염성이 매우 강하며 평균 잠복기간이 3~8일 정도로 길어 식중독의 원인을 알아내기 어렵고 그만큼 예방하기도 힘든 것으로, 이 균이 일단 인체에 침입하면 복통, 설사, 혈변을 일으키고, 이질과 마찬가지로‘베로톡신(vero toxin)'이라는 독성 단백질 합성물질을 만들며 이 독소가 몸에 퍼지면 적혈구를 파괴, 신장을 집중 공격하여 신장의 기능을 잃게 하는 용혈성 요독증을 발생시킨다. 위 요독증이 생기면 2차적으로 신경계, 호흡기계, 순환계 등에 장애가 와 종국에는 사망에 이르게 되며 치사율이 5%~10%에 달하고 모든 연령대에서 감염이 되는 것으로 보고되고 있으며 건강한 사람뿐만 아니라 만성질환자에게도 심한 질병을 일으키는 원인이 된다.
이콜라이 O157:H7 균은 동물의 변에 오염된 생간이나 육회, 햄버거 또는 야채를 65℃미만에서 설 익혀 먹거나 동물의 변에 오염된 식수를 마셨을 때 감염되며 이콜라이 O157:H7 균에 감염된 환자를 통해서도 감염되는 것으로, 1996년 일본에서는 초등학교 아동들에게 대규모의 식중독을 일으켜 사회적으로 문제시된 바 있으며, 미국에서도 식중독의 위험물질로 널리 알려져 있다. 미국질병관리센터에 의하면 햄버거를 만들 때 조리가 불량하면 이 균이 사멸되지 못하고 식중독을 야기하게 된다고 하며, 이로 인하여 연간 20,000 여건의 식중독 사례가 발생, 200~500 여명이 사망하는 것으로 추산하고 있다.
우리나라의 경우 2005년 식중독 발생건수는 109건이며 5711명에 달하는 환자 수를 기록하였고 2007년에는 510건, 9686명에 달하는 환자 수를 기록하며 증가하다 2009년에는 228건, 환자 수 5999명을 기록하며 감소하는 추세에 있다. 그러나 최근 외식이 생활화되고 있으며 음식점과 집단급식소를 중심으로 식중독이 발생하고 있는 실태를 살펴보면 이콜라이 O157:H7 균에 대한 식중독의 예방 및 치료법이 필요한 실정이다.
종래의 이콜라이 O157:H7 균주에 대한 연구로는 한국특허공개 제1999-68868호(대장균 O157:H7 검출용 단일클론 항체 및 용도)의 단일클론항체를 이용하여 면역학적인 진단방법에 사용하는 것으로 이콜라이 O157:H7 균의 오염여부를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 방법에 이용하기 위한 것과 한국특허공개 제1999-65107호(중합효소 연쇄반응을 이용한 대장균 O157:H7 균주의 다종 유전자 동시검출방법)의 중합효소 연쇄반응법(PCR)을 이용하여 병원성 대장균(이콜라이 O157:H7 균주)이 가지고 있는 특이유전자 4종(베로톡신 2종, 장벽부착 병원인자, 효소특이유전자)을 검출함으로써 식육의 병원선 대장균 검사뿐만 아니라 동물이나 사람에게도 응용이 되는 것들이 있기는 하나 이는 모두 앱타머(aptamer)를 이용하여 이콜라이 O157:H7 균을 검출하는 방법에 관한 것은 아니다.
앱타머란 단백질, 아미노산과 같은 생분자나 환경호르몬과 같은 작은 유기화학물질 등의 여러 가지 화합물질과 특이적으로 결합할 수 있는 단일사슬 DNA나 RNA를 말하며, SELEX라 불리는 올리고뉴클레오타이드 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득한다.
항체(antidbody)의 대체물질로 인식되는 앱타머는 항체와 마찬가지로 검출분석시스템에서 분자를 인식할 수 있는 바이오센서의 요소로 이용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 기반의 앱타머는 단백질 기반의 항체에 비하여 몇가지 장점을 가지는데 첫째, 앱타머의 수득은 생체 외(in vitro)에서 이루어지며, 둘째, 독소(toxic)를 비롯한 다양한 유기물과 무기물들이 앱타머의 표적(target)분자로 이용될 수 있으며, 셋째, 일단 표적분자에 특이적으로 결합하는 특정 앱타머가 확인되어 수득되면 자동화된 올리고머 합성방법에 의해 낮은 비용과 높은 일관성으로 재생산이 가능하다는 것이다. 또한 앱타머는 형광분자 또는 광반응성 그룹 등과 같은 유용한 기능 그룹들을 도입하는 것이 항체에 비해 상대적으로 용이하며, 앱타머의 구조는 열에 의한 변성-회복과정이 가역적이므로 항체에 비해 긴 시간의 활성을 가질 수 있다.
이러한 장점을 지난 앱타머 중 RNA 앱타머는, 반복된 생체 외 선별과정을 통해 임의의 RNA 라이브러리로부터 특이적인 RNA 분자, 즉 앱타머를 선별하는데, RNA 라이브러리의 사이즈가 크고, 생체 외 효소작용에 의하므로 RNA 라이브러리는 고 친화도 앱타머를 선별하기 위한 다른 생물학적 라이브러리 또는 합성 라이브러리보다 우수하다. 이리하여 치료제로서 RNA 앱타머의 잠재적인 용도에 대한 관심이 증가하고 있는데 고 친화도 RNA 앱타머는 SELEX 과정에 의해 선별될 수 있다. 또한, RNA 앱타머는 작은 화학물질보다 억제제로서 이점이 있는데 이는 일반적으로 표적 단백질에 넓은 결합부위를 제공하기 때문이다. 병리학적인 단백질-단백질 상호작용은 RNA 앱타머의 훌륭한 표적이 될 수 있는데 이는 고 친화도 RNA가 표적 단백질에 결합하여 복합체에서 다른 단백질과의 결합을 방해하기 때문이다. 더욱이 RNA 앱타머는 세포에서 RNA 벡터시스템을 이용하여 인트라머로 발현될 수 있다.
이러한 표적물질들과 특이적으로 결합하는 앱타머의 특성으로 인해 최근 들어 앱타머를 신약개발, 약물전달시스템 그리고 바이오 센서등의 연구에 이용하기 위해 많은 연구가 이루어지고 있는데 앱타머를 이용한 다양한 약제들에 대한 특허로는 한국특허공개 제2004-54412호에서 응고 및 섬유소용해를 촉진시키는 RNA 앱타머를 제시하고 있으며, 힌국특허공개 제2002-7009983호는 용액 중의 동족 리간드의 존재를 신호화하는데 사용되는 리포터분자를 함유하는 앱타머에 관해 기술하고 있다.
그러나 이콜라이 O157:H7 균주에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머에 대해서는 공개되어 있지 않은 실정이다.
본 발명은 이콜라이 O157:H7 균주의 RNA 분해효소 저항성 RNA 앱타머 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 이콜라이 O157:H7 균주에 특이적으로 결합하며, 우라실(U)과 시토신(C)의 2' 히드록실기가 플루오르기로 치환된 서열번호 1 내지 4로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 RNA 분해효소 저항성 RNA 앱타머를 제공한다.
또한, 본 발명은 위 RNA 앱타머를 포함하는 바이오 센서를 제공한다.
또한, 본 발명은 위 RNA 앱타머를 포함하는 식중독, 용혈성 요독증후군 및 용혈성 빈혈의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 식품 첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명의 RNA 앱타머는 식중독의 주요 원인이 되는 이콜라이 O157:H7 균주에 특이적으로 결합함으로써 이콜라이 O157:H7 균주의 검출에 유용하다.
본 발명의 RNA 앱타머는 이콜라이 O157:H7 균주에 특이적으로 결합하여 그 작용을 억제함으로써 식품의 부패를 방지할 수 있다.
본 발명의 RNA 앱타머는 이콜라이 O157:H7 균주에 의한 여러 질환, 즉 식중독, 용혈성 요독증후군 및 용혈성 빈혈의 예방 및 치료용 약학 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 SELEX 방법을 이용한 이콜라이 O157:H7 균주에 특이적인 RNA 앱타머를 발굴하는 개략도이다.
도 2는 6번 SERNA 앱타머 클론들이 이콜라이 O157:H7 균주와 결합하는지를 확인하기 위해 실시간 PCR을 수행한 결과를 나타내는 것이다.
도 3은 6번 SERNA 앱타머 클론들의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 4는 6번 SERNA 앱타머 클론들 중 이콜라이 O157:H7 균주에 결합하는 앱타머를 선별하기 위하여 ELISA를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 ELISA를 통하여 선별된 클론 #13, #28, #40, #49 RNA 앱타머 중 이콜라이 O157:H7 균주와 높은 친화도로 결합하는 RNA앱타머를 선별하기 위해 실시간 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실시간 PCR을 통해 선별된 클론 #40 RNA 앱타머의 구조와 소형화된 앱타머의 구조 및 위치를 나타낸 것이다.
도 7은 선별된 클론 #40 RNA 앱타머 및 소형화된 앱타머와 이콜라이 O157:H7 균주와의 특이적인 결합을 결합 어사이(binding assay)를 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 선별된 클론 #40 RNA 앱타머 및 소형화된 앱타머와 이콜라이 O157:H7 균주의 LPS와의 결합을 ELISA를 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 이콜라이 O157:H7 에 특이적으로 결합하고, 그 염기 중 우라실(U) 및 시토신(C)의 2'히드록실기가 플루오르기로 치환된 서열번호 1 내지 4로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열을 가짐으로써 식중독 등의 주요원인이 되는 이콜라이 O157:H7균의 검출에 유용하고, 이콜라이 O157:H7균주에 특이적으로 결합하여 그 작용을 억제함으로써 식품의 부패를 방지할 수 있으며, 식중독, 용혈성 요독증후군 및 용혈성 빈혈로 이루어진 군에서 선택된 질환의 예방 및 치료에 유용한 RNA앱타머에 관한 것이다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 RNA 앱타머는 이콜라이 O157:H7에 특이적으로 결합하는 것이다. 본 발명의 RNA앱타머는 서열번호 1 내지 4로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열을 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며 서열번호 1 내지 4로 이루어지는 군에서 선택되는 염기서열에 임의의 염기서열을 추가로 포함하는 것이라도 이콜라이 O157:H7에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 실질적으로 본 발명의 RNA앱타머와 동일하다고 볼 수 있다.
서열번호 1 내지 4의 염기서열 중 우라실(U) 및 시토신(C)은 그 2'히드록실기가 플루오르기로 치환된 것이다. 이러한 변형은 RNA 분해효소에 저항성 있는 RNA를 제조하기 위해 수행된다.
본 발명의 RNA 앱타머는 식중독을 일으키는 주요균주 중 하나인 이콜라이 O157:H7에 특이적으로 결합하기 때문에 음료등의 식품에 이콜라이 O157:H7균이 포함되어 있는지를 확인할 수 있고, 환자가 이콜라이 O157:H7에 의한 여러 질환, 즉 식중독, 용혈성 요독증후군 및 용혈성 빈혈에 걸렸는지를 확인하는 센서로 기능할 수 있다.
또한, 본 발명의 RNA앱타머는 이콜라이 O157:H7에 특이적으로 결합하여 그 기능을 저하시킬 수 있기 때문에, 이를 포함하는 약학 조성물은 이콜라이 O157:H7에 의한 여러 질환, 즉 식중독, 용혈성 요독증후군 및 용혈성 빈혈의 예방 및 치료에 효과적일 수 있다.
또한, 본 발명의 RNA앱타머를 식품 첨가제에 포함시켜 사용하면 이콜라이 O157:H7의 번식을 막을 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 이는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 발명의 범주 및 기술사상 범위내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 하기 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1
실시예
1. RNA 앱타머의 발굴
SELEX 과정을 수행하는데 필요한 RNA 라이브러리를 제조하기 위해, 60개의 염기가 무작위적으로 들어간 단일 올리고뉴클레오티드를 주형으로 이용하여 아래의 5'-프라이머와 3'-프라이머로 PCR을 통해 DNA 라이브러리를 제조하였다. 5-프라이머는 RNA를 합성하기 위한 T7 RNA 중합효소 프로모터 부분을 포함하고 있다.
5'-GGGTAATACGACTCACTATAGGGATACCAGCTTATTCAAT-3'(5'-프라이머)
5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'(3'-프라이머)
0.25μM 5'-프라미어, 0.25μM 3'-프라이머, 10 X PCR 버퍼, 200μM dNTP 혼합물, DNA 탭 중합효소(Finzyme) 3 유닛을 혼합하여 PCR을 수행하였다. 그리고 PCR 주기로는 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 10사이클을 반복한 뒤, 마지막으로 72℃ 7분으로 다양한 DNA 라이브러리를 제조하였다.
PCR을 통하여 만들어진 다양한 염기서열을 갖는 DNA 라이브러리를 주형으로 T7 RNA 중합효소(Epicentre Technologies)를 이용하여 시험관 내에서 전사 과정을 거쳐 다양한 염기서열을 갖는 RNA 라이브러리를 제조하였다.
이 때 RNA 분해 효소에 저항성 있는 RNA를 제조하기 위하여 2' 데옥시 2' 플루오르 CTP와 UTP (Epicentre Technologies) 그리고 정상적인 GTP와 ATP들과 T7 RNA 중합효소를 이용하여 시험관에서 합성된 주형의 전사에 의해 플루오르 그룹으로 매 2번 위치가 피리미딘기로 변형되어진 RNA를 생산하였다.
구체적으로 DNA 라이브러리, 5X 전사버퍼, 5 mM DTT, 5 mM ATP, GTP, 2'-F CTP, 2'-F UTP, T7 RNA 중합효소 , DEPC-H2O 로 20μl로 맞추고 37℃에서 6시간 동안 반응시켰다. DNaseI(Epicentre Technologies)를 37℃에서 30분간 처리하여 주형으로 사용된 DNA를 제거한 후 7M 우레아-8% 폴리아크릴아미드 겔에서 RNA 라이브러리를 추출하였다.
얻어진 아래의 RNA 라이브러리 염기서열은 A, G, C 그리고 U 각각 위치의 같은 몰로 혼입된 60개의 뉴클레오티드를 나타내는 N60을 포함한다.
5’ATA CCA GCT TAT TCA AT (N60) AGA TAG TAA GTG CAA TCT 3’
도 1은 SELEX 방법을 이용한 이콜라이 O157:H7 균주에 특이적인 RNA 앱타머를 발굴하는 개략도를 나타낸 것이며 이하 SELEX 방법을 이용한 이콜라이 O157:H7 균주에 특이적인 RNA 앱타머를 발굴과정을 상세히 설명한다.
counter SELEX 기법을 이용하여, 300피코몰의 RNA 라이브러리를 시작물질로, 상온에서 10분 동안 3X106개의 K12 strain cell에 200㎕ 결합 완충액 (30mM TrisHCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 2 mM 디티오트레이톨, and 1 % BSA)에서 반응하여, K12 strain 과 반응하는 비 특이적 RNA를 원심분리를 통하여 침전시켜 제거하였다. 그 후 상층액을 새로운 튜브에 옮겨서 1X106 개의 O157:H7균주와 상온에서 10분간 반응시켰다. 그 후 원심분리를 통해 O157:H7과 결합하지 않은 RNA를 제거한 후 펠렛을 400㎕ 결합 완충액으로 5번 씻어 주었다. 그 후 Elution buffer(10mM EDTA) 를 200ul 넣어준 뒤 95℃에서 5분간 열처리하여 결합된 RNA를 추출하였다. 이렇게 얻어진 RNA를 역전사-유전자 증폭기술과 시험관 전사를 반복하여 6번의 셀렉션을 수행하였다. 6번의 셀렉션을 수행한 후 증폭된 DNA를 클로닝 한 다음 43개의 클론의 염기서열을 분석하였다.
도 3은 위 과정을 거쳐 분석된 6번 SERNA(6번의 셀렉션 후 얻어진 RNA) 앱타머 클론들의 염기서열을 나타낸 것이다.
2. 발굴된 앱타머(6번 SERNA앱타머 클론)들의 이콜라이 O157:H7 균주와의 결합테스트(실시간 PCR이용)
도 2는 6번 SERNA 앱타머 풀과 이콜라이 O157:H7균주와의 특이적인 결합을 실시간 PCR로 확인한 것을 나타낸 것이다.
이하, 6번 SELEX 과정이 수행된 RNA 앱타머와 초기의 RNA 라이브러리를 이용하여 수행되어진 RT PCR과 실시간 PCR과정에 대해 상세히 설명한다.
6번 SELEX 과정이 수행된 RNA 앱타머와 초기의 RNA 라이브러리 각각 6피코몰과 5X106 개의 O157:H7과 K12 strain을 각각 반응시킨 후, 각각에 결합하는 RNA를 얻어내었다. 페놀 추출물/에탄올 침적과정을 통해 RNA를 얻어낸 후 DEPC-H2O를 넣어 RNA를 녹이고 여기에 200nM 3'프라이머를 넣고 65℃에서 5분간 가열한 뒤 상온에서 10분간 RNA와 3'프라미어를 결합시켰다.
1mM dNTP, 5X RTase 버퍼, 200 유닛 M-MLV RTase(Finzzyme)를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응한 뒤 95℃에서 5분간 RTase를 불활성화시켰다. 역 전사한 단일 DNA 중 1/3만 PCR 주형으로 사용하였다.
이때, 생성된 DNA의 실시간 양을 측정하기 위해 실시간 PCR(Rotor Gene RG-6000)을 다음과 같은 조건으로 사용하였는데, cDNA, 100nM 5'프라이머, 100nM 3'프라이머, 10X PCR 버퍼 10㎕, 500μM dNTP, 5X RTase 버퍼 7㎕, 100X Syber green, 2 유닛 탭 폴리머라아제(Finnzyme)을 혼합하여 처음 95℃ 5분간 유지한 후 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초 조건으로 40 사이클을 반복하여 얻어진 RNA의 양을 측정한다.
실시간 PCR은 PCR 증폭산물의 증가를 실시간으로 모니터링 하여 해석하는 기술이다. 초기의 DNA량이 많을수록 증폭산물량은 빠르게 검출가능한 양에 다다르게 되므로 증폭곡선이 가파르게 상승하게 되며 이때 단계적으로 희석한 표준샘플을 이용하여 실시간 PCR을 실시하면 초기 DNA량이 많은 차례대로 일정 간격으로 나란해진 증폭곡선을 얻을 수 있다. 여기서 적당한 곳에 반응을 일으키는 최소의 역가(threshold)를 설정하면 반응을 일으키는 최소의 역가와 증폭곡선이 만나는 점(CT값:Threshold Cycle)이 산출되는데, CT값은 PCR 증폭산물이 일정량 증폭되었을때의 싸이클 수를 의미하는 것으로, 초기의 해당 DNA량이 많을수록 증폭산물량은 빠르게 검출가능한 양에 다다르므로 대조군에 비하여 CT값이 낮을수록 초기의 해당 DNA량이 많다는 것을 의미한다.
도 2의 평균 CT 값을 살펴보면 6번 SERNA 풀 + O157:H7, 라이브러리 SERNA 풀+ O157:H7, 라이브러리 RNA 풀 + K12 strain, 6번 SERNA 풀 + K12 strain 의 순서대로 CT값이 증가하는 것을 알 수 있는데 이는 6번의 SELEX 과정 후 얻어진 RNA 풀에 이콜라이 O157:H7 균주에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머의 양이 많다는 것을 의미하는 것으로, 이로서 6번 SERNA 풀이 이콜라이 O157:H7균주에 특이적으로 결합함을 확인할 수 있다.
3. 발굴된 앱타머의 선별
3-1. 발굴된 앱타머의 O157:H7 균주와의 결합 측정을 통한 선별(ELISA : Streptavidin coated plate이용)
도 4는 6번의 SELEX을 통해 발굴되어진 각각의 RNA 앱타머 클론들과 이콜라이 O157:H7균주와의 결합을 확인하기 위해 ELISA를 실시한 결과이며, 이로서 발굴된 RNA 앱타머 클론들중에 클론 #13 RNA 앱타머, #31 RNA 앱타머, #40 RNA 앱타머, #49 RNA 앱타머가 이콜라이 O157:H7균주에 대해서 결합함을 확인할 수 있었다.
이하 수행되어진 ELISA 과정을 상세히 설명한다.
발굴된 RNA 앱타머와 비특이적 RNA들의 3' 말단에 A16 tail을 하였다. A16 tail된 RNA 30피코몰과 dT(16)-비오틴 10피코몰을 상온에서 10㎕ DEPC-H2O에서 30분간 반응시켰다. 결합시킨 혼성 RNA를 스트렙트아비딘이 코팅된 96well 플레이트에서 30분간 플레이트에 고정화시켰다. 이후 blocking 버퍼(PBS with 5%BSA /yeast tRNA(10ug)로 상온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 5X106의 O157:H7균주를 100㎕ 결합 완충액 (0.05% Tween-20, 1.5mM MgCl2, 1XPBS)에 풀어준 뒤 각 well에 처리하여 상온에서 20분간 혼성 RNA와 O157:H7균주를 결합시켰다. 이후 결합 완충액 (0.05% Tween-20, 1.5mM MgCl2, 1XPBS)으로 3회 세척한 후 O157:H7균주에 대한 1차 항체(100ng/well)를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 완충용액 (0.1% Tween-20, 1.5mM MgCl2, 1XPBS)로 3회 씻어준 뒤 HRP-conjugated 2차 항체(100ng/well)를 100㎕ 결합 완충액 (0.05% Tween-20, 1.5mM MgCl2, 1XPBS)에서 1시간 동안 반응시켰다. 완충용액으로 3회 씻어준 뒤 100㎕ QuantaBlu peroxidase substrate solution (Pierce)에 풀어주고 Fluorometer (Fluoroskan, Thermo Scientific)로 Excitation 325nm, Emssion 420nm의 파장으로 형광을 측정하였다.
3-2. ELISA를 통해 선별된 RNA앱타머 클론들의 O157:H7 균주와의 결합 측정 (실시간 PCR이용)
또한, 이콜라이 O157:H7균주에 대해 높은 친화도로 결합하는 클론을 알아내기 위하여, 대조군으로서 라이브러리 풀, 클론 #28 RNA 앱타머 및 ELISA로 확인한 결과 대조군에 비해 2~3배 증가한 클론 #13 RNA 앱타머, #31 RNA 앱타머, #40 RNA 앱타머, #49 RNA 앱타머에 실시간 PCR을 수행하였다. 수행된 실시간 PCR은 공지의 방법과 동일하므로 자세한 설명은 생략하기로 한다.
도 5를 참조하면, 실시간 PCR이 수행되어진 클론 #13 RNA 앱타머, #31 RNA 앱타머, #40 RNA 앱타머, #49 RNA 앱타머와 라이브러리 풀, 클론 #28중 클론 #40 RNA 앱타머만이 이콜라이 O157:H7균주에 대해서 높은 친화도로 결합함을 확인하였다.
즉, 발굴된 6번 SERNA앱타머 중에서 이콜라이 O157:H7균주와 특이적으로 결합하는 클론 #40를 선별하였다.
4. 절단 RNA 앱타머제작
이상에서 살펴본 바와 같이, 이콜라이 O157:H7균주와 특이적으로 결합하는 클론 #40앱타머를 선별하였는바, 선별된 클론 #40 RNA 앱타머의 최적화를 위해 full length의 RNA 앱타머를 단계적으로 잘라내어 64mer, 38mer, 28mer의 소형화된 앱타머를 T7 중합효소를 이용한 시험관 전사방법을 통하여 제작하였다. 도 6은 선별된 클론 #40 RNA 앱타머의 염기서열과 그 구조 및 3가지의 크기로 소형화한 앱타머들의 염기서열과 구조를 보여준다.
이하, 64mer, 38mer, 28mer로 소형화된 앱타머를 제작하는 방법에 대해 상세히 설명한다.
64mer의 클론 #40LS RNA 앱타머에는 각각 아래의 5' 프라이머 및 3' 프라이머를 사용하였고, 38mer의 클론 #40L 앱타머에는 각각 아래의 5' 프라이머 및 3' 프라이머를 사용하였으며, 28mer의 클론 #40S 앱타머에는 각각 아래의 5' 프라이머 및 3' 프라이머를 사용하여 각각 PCR로 증폭시켰다.
이들 프라이머의 서열은 아래와 같다.
5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTCTTCCTGGACTGTCGAAAA-3'(64mer의 클론 #40LS RNA 앱타머의 5' 프라이머)
5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTACTATCTATAAACCAAATACG-3'(64mer의 클론 #40LS RNA 앱타머의 3' 프라이머)
5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTCTTCCTGGACTGTCGAAAA-3'(38mer의 클론 #40L RNA 앱타머의 5' 프라이머)
5'-TTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCCGATACTGAATTTTCGACAGTC-3'(38mer의 클론 #40L RNA 앱타머의 3' 프라이머)
5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTACGTATTTGGTT-3'(28mer의 클론 #40S RNA 앱타머의 5' 프라이머)
5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTACTATCTATAAACCAAATACG-3'(28mer의 클론 #40S RNA 앱타머의 3' 프라이머)
구체적으로 0.25 μM 5'-프라이머, 0.25 μM 3'-프라이머, 5X PCR 버퍼, 200 μM dNTP 혼합물, Phusion DNA 탭 중합효소(Finzzyme) 0.4 유닛을 혼합하여 PCR을 수행하였으며, PCR 사이클로는 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 25 사이클을 반복한 뒤, 마지막으로 72℃ 7분으로 DNA주형을 제조하였다. 증폭시킨 이중나선 DNA 주형을 T7 RNA 중합효소를 이용하여 시험관 내 전사를 수행하였으며 이때 피리미딘 뉴클레오티드들은 2'-플루오르기로 치환된 것들을 사용하였다. 제작된 각각의 RNA 앱타머들은 우레아 폴리아크릴아미드 겔로 전기영동 한 후 정제하였다.
5. 선별된 RNA 앱타머 및 그의 절단 앱타머의 이콜라이 O157:H7 균주와의 결합특이성 확인
5-1. 클론 #40 RNA 앱타머 및 그의 소형화 한 앱타머의 O157:H7 균주와의 결합 측정(Streptavidin-HRP)
도 7은 클론 #40 RNA 앱타머 및 3가지의 크기로 소형화한 앱타머가 이콜라이 O157:H7균주에 대해서 특이적으로 결합하는지 확인하기 위하여 비오틴에 대한 스트렙트아비딘-HRP를 이용, 형광을 측정하여 그 결합정도를 확인한 것이다.
도 7을 참조하면 대조군으로 사용한 스트렙트아비딘-HRP 만 처리한 경우와 라이브러리 RNA를 처리한 경우는 이콜라이 O157:H7균주와 거의 결합하지 않지만, 클론 #40 RNA 앱타머와 클론 #40LS RNA 앱타머, 클론 #40L RNA 앱타머, 클론 #40S RNA 앱타머의 경우는 K12 strain균주에는 결합하지 않고 이콜라이 O157:H7균주에만 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
이하, 클론 #40 RNA 앱타머 및 소형화 한 앱타머의 스트렙트아비딘-HRP 를 이용한 이콜라이 O157:H7균주와의 결합정도의 측정과정을 상세히 설명한다.
선별된 RNA 앱타머와 비특이적 RNA들의 3' 말단에 A16 tail을 하였다. A16 tail된 RNA 5피코몰과 dT(16)-비오틴 10피코몰을 상온에서 10㎕ DEPC-H2O에서 30분간 반응시켰다. 결합시킨 혼성 RNA를 5X106의 O157:H7균주와 200㎕ 결합 완충액 (30mM TrisHCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 2 mM dithiothreitol, and 1 % BSA)에서 반응한 뒤 침전하여 펠렛을 400㎕ 결합 완충액으로 3번 씻어 주었다. 펠렛을 1X PBS에 1:1000으로 희석된 streptavidin-HPR solution 100㎕에 풀어 준 뒤 상온에서 30분간 streptavidin-HRP와 혼성 RNA를 결합시켰다. 200㎕ 1XPBS/MgCl2로 2회 씻어준 뒤 펠렛을 100㎕ QuantaBlu peroxidase substrate solution (Pierce)에 풀어주고 Fluorometer(Fluoroskan, Thermo Scientific)로 Excitation 325nm, Emssion 420nm의 파장으로 형광을 측정하였다.
5-2. 클론 #40 RNA 앱타머 및 그의 소형화 한 앱타머의 O157:H7 균주 및 K12 strain 의 LPS와의 결합 측정
도 7에서 살펴본 바와 같이 클론 ＃40 RNA 앱타머와 클론 ＃40LS RNA 앱타머, 클론 ＃40L RNA 앱타머, 클론 ＃40S RNA 앱타머의 경우 K12 strain 균주에는 결합하지 않고 이콜라이 O157:H7균주에만 특이적으로 결합하는 바, 외부항원으로 인지하는 하나의 표지인 LPS와도 결합하는지를 살펴보기 위하여 O157:H7균주 및 K12 strain에서 LPS를 추출하여 클론 ＃40 RNA 앱타머 및 소형화한 앱타머들과의 결합을 ELISA를 통하여 측정하였다.
도 8은 상기의 결과를 보여주는 것이며 스트렙트아비딘-HRP를 통한 직접적인 결합에서 보여진 결과와 동일하게, 각각의 균주에서 LPS를 추출, 플레이트에 코팅하여 한 실험에서도 클론 ＃40 RNA 앱타머 및 소형화한 앱타머들이 K12 strain의 LPS와는 거의 결합하지 않는 것에 비해 이콜라이 O157:H7균주의 LPS와는 특이적으로 결합함을 확인할 수 있었다.
이하, O157:H7균주 및 K12 strain의 LPS가 코팅된 플레이트를 제작하는 과정과 클론＃40 RNA 앱타머 및 소형화한 앱타머들이 O157:H7균주 및 K12 strain LPS와의 결합을 측정한 실험과정을 상세히 설명한다.
실험에 사용할 LPS는 각각 1X109 개의 O157:H7균주 및 K12 strain에서 LPS 추출키트(인트론바이오테크놀로지)를 이용하여 분리하였다. 분리된 LPS를 100ng/well로 PBS 에 희석하여 96well 플레이트(TPP)에 100ul씩 분주한 후 37℃ 인큐베이터에서 반응한 뒤 4℃에서 16시간 반응하였다. 먼저 LPS가 코팅된 플레이트를 blocking 버퍼(PBS with 5%BSA / yeast tRNA(10ug)로 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 선별된 RNA 앱타머와 비특이적 RNA들의 3'말단에 A16 tail을 하였다. A16 tail된 RNA 30피코몰과 dT(16)-비오틴 10피코몰을 상온에서 10㎕ DEPC-H2O에서 30분간 반응시켰다. 결합시킨 혼성 RNA를 각각의 LPS-코팅된 96well 플레이트에서 30분간 반응시킨 후 결합 완충액(0.05% Tween-20, 1.5mM MgCl2, 1XPBS)로 3회 씻어낸 후 상온에서 30분간 스트렙트아비딘-HRP와 LPS가 결합된 혼성 RNA를 결합시켰다. 완충용액으로 3회 씻어준 뒤 100㎕ QuantaBlu peroxidase substrate solution(Pierce)에 풀어주고 Fluorometer (Fluoroskan, Thermo Scientific)로 Excitation 325nm, Emssion 420nm의 파장으로 형광을 측정하였다.
본 발명의 이콜라이 O157:H7균주에 대해 특이적이고 높은 친화도로 결합 할 수 있는 앱타머 염기서열은 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어지는 군에 선택되는 염기서열과 같았다.

Claims (5)

  1. 이콜라이 O157:H7에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 RNA 앱타머.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호 1 내지 4의 우라실(U) 및 시토신(C)은 2' 히드록실기가 플루오르로 치환된 것인 RNA 앱타머.
  3. 청구항 1 또는 2의 RNA 앱타머를 포함하는 이콜라이 O157:H7 검출용 바이오 센서.
  4. 청구항 1 또는 2의 RNA 앱타머를 포함하는 식중독, 용혈성 요독증후군 및 용혈성 빈혈로 이루어진 군에서 선택된 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 청구항 1 또는 2의 RNA 앱타머를 포함하는 식품 첨가제 조성물.
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