CN104619860B - 用于检测和鉴定肠出血性大肠杆菌的方法 - Google Patents

用于检测和鉴定肠出血性大肠杆菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及通过基因espK结合Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156、Z6065、Z2098、ureD或espV的至少一个遗传标记的检测和/或通过血清型特异的CRISPR序列的检测，用于预测样品是否含有EHECO157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O26:[H11]、O45:[H2]或O104:[H4]血清型的至少一个的肠出血性大肠杆菌(EHEC)的方法，以及用于鉴定所述血清型的方法。

Description

用于检测和鉴定肠出血性大肠杆菌的方法
本发明涉及对人类健康构成严重风险的产志贺毒素的大肠杆菌(STEC)的鉴定。
产志贺毒素的大肠杆菌(STEC)是属于超过400种大肠杆菌O:H血清型的大肠杆菌的一个多元化群体，其中的一些引起从腹泻至出血性肠炎(HC)和溶血性尿毒综合征(HUS)范围的食源性疾病的爆发和偶发事件。根据它们的人类致病性，再后菌株也被称为肠出血性大肠杆菌(EHEC)(Levine 1987,Nataro and Kaper 1998)。HC和HUS的许多病例已经被归因于EHEC血清型O157:H7株，但现在已经认识到STEC的其它血清型属于EHEC群体。
因此，来自许多国家的累积证据表明，高达30-60％的人类STEC感染是由非O157STEC引起的并且只有五至七种“优先级”STEC血清型与HC和HUS的爆发和偶发事件有关。这些包括血清型O26:[H11]、O45:[H2]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O145:[H28]、O157:[H7]以及它们的无运动性(non-motile)衍生物。此外，O104:[H4]的一株不寻常的菌株与2011年全球范围内HC和HUS的最大爆发有关(Scheutz et al.,2011；Frank et al.,2011；Struelens et al.,2011；Gault et al.,2011)。
因此，许多司法管辖区正在考虑实施食品检验计划(food inspection program)以保护公众免受这些对人类具有高毒力的STEC株的侵害。作为基于风险的食品检验计划的一部分，用于这些肠出血性大肠杆菌(EHEC)株的检测的理性方法需要优先级STEC的标志性特征的明确定义(例如血清群、血清型、毒力和其它标记)和在食品中检测这些致病性STEC的有效方法。非O157EHEC的检测尤其具有挑战性，因为它们没有特定特征将它们和共享同样生态位(niches)的大量无害共生大肠杆菌区分开。Karmali et al.(2003)提出了血清致病型分类，作为基于疾病的严重性、频率和与爆发的关联来鉴定参与食源性疾病爆发的最重要的O血清型的框架，但是各种STEC株之间的毒力差异的原因仍然不清楚。有可能这种差异是由于STEC株所具有的毒力基因谱的差异，需要研究以证实这一点并鉴定合适的分子标记。
已有技术通过例如检测stx1/stx2基因和定位于LEE(肠道细胞擦抹基因座，该基因座首次鉴定于肠致病性大肠杆菌(EPEC)中)上eae基因的存在，来测定样品中STEC污染的存在。但是STEC致病性的遗传基础比这些基因之一或二者的存在或不存在更加复杂得多。在复杂的样品(例如食品、粪便、环境样品)中可能包括菌株的混合物(例如STEC和EPEC株的混合)，stx1/2和eae基因的存在并不表示在该样品中存在EHEC。
然而，考虑到一些STEC株可引起人类非常严重的健康问题，在食品产品中检测到STEC株就会丢弃所述产品，即使可能该STEC不会对人类健康构成威胁。由于缺乏对非致病性STEC株和EHEC株的区分，这造成大量的浪费。
已经提出采用除stx1/2和eae标记外的其它遗传标记以选择性检测EHEC株并将它们与非致病性STEC株区分开。例如，PCT WO 2011/018762介绍了一种涉及基因stx1、stx2、eae、nleB和espK的组合检测以预测样品中EHEC的存在的方法。
但是，仍然需要可靠测试，用于区分性筛选包括非O157 EHEC的EHEC的存在，以及特异性检测EHEC血清型，尤其是在“排名前七位”血清型O26:[H11]、O45:[H2]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O145:[H28]、O157:[H7]中的EHEC血清型。
本发明人现在已经鉴定出了与构成人类健康严重风险的几种STEC株相关的区分性遗传标记。特别地，他们已经鉴定出了位于对人类具有高毒力的EHEC株的CRISPRs(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成簇的、规律间隔的短回文重复序列)序列内的遗传标记。
CRISPRs存在于许多细菌种属(包括大肠杆菌)的基因组内。它们由含有21至47bp长度并由相似大小的间隔序列分开的直接重复序列的串联序列组成。间隔序列衍生自外源核酸，如噬菌体或质粒，并且已有假说称它们可以保护细菌免受随后由同源噬菌体和质粒带来的感染。
本发明人已经对与全球最频繁的临床病例有关的各种EHEC株的CRISPR基因座进行了测序，并且已经鉴定出了不同的间隔序列，所述间隔序列可以用于特异性鉴定造成人类中大部分EHEC感染的EHEC血清型O157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O45:[H2]、O26:[H11]、O104:[H4]以及它们的无运动性衍生物。
因此，本发明的一个目的是一种用于鉴定怀疑存在于样品中的EHEC的血清型的方法，其中所述方法包括检测在所述样品或由其分离的DNA中以下大肠杆菌CRISPR序列的存在或不存在：
a)用于鉴定EHEC O157:[H7]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列选自以下的序列中：
-CRISPR序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，其中所述CRISPR SEQ IDNO:1-3的一个或多个序列的存在表示EHEC O157:[H7]的存在；和/或
-CRISPR序列SEQ ID NO:4，其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC O157:[H7]的存在；和
b)用于鉴定EHEC O145:[H28]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ IDNO:5，并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC O145:[H28]的存在；和
c)用于鉴定EHEC O111:[H8]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ IDNO:6，并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC O111:[H8]的存在；和
d)用于鉴定EHEC O121:[H19]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ IDNO:7，并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC O121:[H19]的存在；和
e)用于鉴定EHEC O103:[H2]和/或EHEC O45:[H2]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO:8，并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC O103:[H2]和/或EHECO45:[H2]的存在；和
f)用于鉴定EHEC O104:[H4]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ IDNO:9，并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC O104:[H4]的存在；和
g)用于鉴定EHEC O26:[H11]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ IDNO:10，并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC O26:[H11]的存在。
根据本发明的优选的实施方案，所述方法包括采用设计用于扩增所述CRISPR序列的引物对所述样品或由其分离的DNA进行PCR测定，并检查相应扩增产物的存在。
优选地，所述PCR测定是采用引物的组合进行的，所述引物的组合包括：
a)用于检测EHEC O157:[H7]的引物，其中所述引物由以下组成：
-靶向两个CRISPR序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物组，其中所述引物由以下序列定义：
GGGAACACAAACCGAAACACA(SEQ ID NO:11)
CTTAGTGTGTTCCCCGCGC(SEQ ID NO:12)和
-靶向CRISPR序列SEQ ID NO:3的引物组，其中所述引物由以下序列定义：
GAACACTTTGGTGACAGTTTTTGT(SEQ ID NO:13)；
CTTAGTGTGTTCCCCGCGC(SEQ ID NO:14)，
其中针对所述引物组至少之一的扩增产物的存在表示EHEC O157:[H7]的存在；和/或：
-靶向CRISPR序列SEQ ID NO:4的引物组，其中所述引物由以下序列定义：
GAACACAAACCGAAACACACG(SEQ ID NO:15)
ATAAACCGTCACCAAAACAGTG(SEQ ID NO:16)，
其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC O157:[H7]的存在；和
b)用于检测EHEC O145:[H28]的引物，其中所述引物由以下组成：
-靶向CRISPR序列SEQ ID NO:5的引物组，其中所述引物由以下序列定义：
GAACTTGAGCCCTGCCAGAA(SEQ ID NO:17)
ACCGCGATCTTTTCCTACCTG(SEQ ID NO:18)，
其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC O145:[H28]的存在；
和
c)用于检测EHEC O111:[H8]的引物，其中所述引物由以下组成：
-靶向CRISPR序列SEQ ID NO:6的引物组，其中所述引物由以下序列定义：
GTGACCGCCTGTACACGC(SEQ ID NO:19)
CGGATATTTGGGCGTAATACC(SEQ ID NO:20)
CTGCCGCGAGTGGTTTCAC(SEQ ID NO:21)，
其中针对引物对SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的至少之一的扩增产物的存在表示EHEC O111:[H8]的存在；和
d)用于检测EHEC O121:[H19]的引物，其中所述引物由以下组成：
-靶向CRISPR序列SEQ ID NO:7的引物组，其中所述引物由以下序列定义：
CGGGGAACACTACAGGAAAGAA(SEQ ID NO:22)
GGCGGAATACAGGACGGGTGG(SEQ ID NO:23)，
其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC O121:[H19]的存在；和
e)用于检测EHEC O103:[H2]和/或EHEC O45:[H2]的引物，其中所述引物由以下组成：
-靶向CRISPR序列SEQ ID NO:8的引物组，其中所述引物由以下序列定义：
GAGTCTATCAGCGACACTACC(SEQ ID NO:24)
AACCGCAGCTCGCAGCGC(SEQ ID NO:25)，
其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC O103:[H2]和/或EHEC O45:[H2]的存在；和
f)用于检测EHEC O104:[H4]的引物，其中所述引物由以下组成：
-靶向CRISPR序列SEQ ID NO:9的引物组，其中所述引物由以下序列定义：
GGAACTCACCGAGCGCCG(SEQ ID NO:26)；
GCCTTTGCAGCGTCTTTCCGATC(SEQ ID NO:27)；
其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC O104:[H4]的存在；和
g)用于检测EHEC O26:[H11]的引物，其中所述引物由以下组成：
-靶向CRISPR序列SEQ ID NO:10的两个引物组，其中第一引物组由以下序列定义：
ACAATCGTGTGTAAATTCGCGG(SEQ ID NO:28)
GATAAACCGTGGTACGGAACA(SEQ ID NO:29)和第二引物组由以下序列定义：
TGAAACCACTCGCGGCAGAT(SEQ ID NO:30)；
ATAAACCGATCTCCTCATCCTC(SEQ ID NO:31)；
其中针对所述引物组的至少之一的扩增产物的存在表示EHEC O26:[H11]的存在。
扩增产物可以通过用于检测PCR产物的任何合适的方法进行检测。例如，它们可以通过衍生自各自靶序列的探针的方式进行检测。
优选的探针的例子给出如下：
-允许检测衍生自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的扩增产物的探针，由以下序列定义：CGATCAATCCGAATATGAGCGGT(SEQ ID NO:32)，和允许检测衍生自SEQ ID NO:3的扩增产物的探针，由以下序列定义：CACTGTTTTGGTGACGGTTTATCC(SEQ ID NO:33)，和/或允许检测衍生自SEQ ID NO:4的扩增产物的探针，由以下序列定义：ACAAAAACTGTCACCAAAGTGTTC(SEQID NO:34)；
-允许检测衍生自SEQ ID NO:5的扩增产物的探针，由以下序列定义：
TGGGGCCTCTTTTGTACCCGG(SEQ ID NO:35)；
-允许检测衍生自SEQ ID NO:6的扩增产物的探针，由以下序列定义：
TGTAATGGCTCACCGGTTTATCCCC(SEQ ID NO:36)；
-允许检测衍生自SEQ ID NO:7的扩增产物的探针，由以下序列定义：
TCCGCCAACGGCGACAGGGG(SEQ ID NO:37)；
-允许检测衍生自SEQ ID NO:8的扩增产物的探针，由以下序列定义：
TCGGAACGTGGCGCTATAGGTG(SEQ ID NO:38)；
-允许检测衍生自SEQ ID NO:9的扩增产物的探针，由以下序列定义：
CTGGGAGGCGTATCTCACGTTCGGT(SEQ ID NO:39)；
-允许检测衍生自SEQ ID NO:10的扩增产物的探针，由以下序列定义：
TGCTGTCTATATTTCGACCAGTGTTCC(SEQ ID NO:40)；
-允许检测衍生自SEQ ID NO:10的扩增产物的探针，由以下序列定义：
CCAGCTACCGACAGTAGTGTGTTCC(SEQ ID NO:41)；
根据本发明的另一个方面，它提供一种用于预测样品是否含有典型的肠出血性大肠杆菌(EHEC)，(其在本文中定义为针对stx和eae均为阳性的大肠杆菌株)，和/或非典型的EHEC O104:H4(其测试针对stx阳性并且针对eae阴性)。典型的EHEC株尤其包括EHEC O157:H7、O145:H28、O103:H2、O111:H8、O121:H19、O26:H11和O45:H2血清型和它们的无运动性衍生物。
所述方法包括espK基因和以下靶基因的一个或多个的检测：espV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156和Z6065。
这些大肠杆菌基因靶标对应于非LEE编码的III型效应子，所述效应子衍生自各种基因组O岛：OI-43、OI-44、OI-50、OI-57和OI-71。
espK与espV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155和Z1156的一个或多个的组合，是由本发明人在几种推定的毒力标记的组合中鉴定出来的，作为典型的EHEC(stx和eae阳性大肠杆菌株)，并且特别是血清型EHEC O157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O26:[H11]或O45:[H2]的EHEC株的存在的更好的预测。espK与Z6065的组合可预测非典型EHEC O104:H4的存在。
特别优选的组合如下：
-espK与espV、ureD、Z2098的一个或多个；
-espK与Z6065；
-espK与espV、ureD、Z2098的一个或多个和与Z6065。
根据特定的实施方案，所述方法包括用包括衍生自espK的引物组和衍生自espV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156和Z6065至少之一的引物组的引物的组合，对所述样品或由其分离的DNA进行PCR测定；
和检测针对所述组合的每个引物组的扩增产物的存在或不存在。
根据该方法的优选的实施方案，所述引物的组合进一步包括衍生自stx1的引物组和衍生自stx2的引物组。这允许针对两个stx基因(作为STEC的标记)和针对上面所列的额外的遗传标记(与和HC和HUS的爆发和偶发事件有关的优先级STEC血清型相关)筛选样品。
与现有技术的方法相反，本发明的方法不必检测eae基因。
衍生自espK、espV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156、Z6065、stx1或stx2和适合用于本发明的PCR测定的引物，以及允许检测由这些引物获得的扩增产物的探针，可以由本领域技术人员基于数据库中可用的这些基因的序列，例如在GenBank中登录号AE005174.2下可用的大肠杆菌O157:H7(株EDL933)的注释序列内简单地设计出来。
用于该PCR测定的优选的引物组的非限制性的例子给出如下：
-靶向espK的引物组，由以下序列定义：
GCAGRCATCAAAAGCGAAATCACACC(SEQ ID NO:42)
TCGTTTGGTAACTGTGGCAGATACTC(SEQ ID NO:43)
-靶向espV的引物组，由以下序列定义：
TCAGGTTCCTCGTCTGATGCCGC(SEQ ID NO:44)
CTGGTTCAGGCCTGGAGCAGTCC(SEQ ID NO:45)
-靶向ureD的引物组，由以下序列定义：
GCAATAATTGACTCTGATTGCC(SEQ ID NO:46)
GCTGCTGCGGTAAAATTTACT(SEQ ID NO:47)
-靶向Z2098的引物组，由以下序列定义：
CTGAAAAGAGCCAGAACGTGC(SEQ ID NO:48)
TGCCTAAGATCATTACCCGGAC(SEQ ID NO:49)
-靶向Z1153的引物组，由以下序列定义：
CGATCATTGTGGGCATGTTATGCC(SEQ ID NO:50)
CCTGAATTCACACGGTGATGCG(SEQ ID NO:51)
-靶向Z1154的引物组，由以下序列定义：
GCCTTTTTATGTTCATTATTGCGGTTG(SEQ ID NO:52)
GTATAGTTTTAGCAATACCTTCCTGC(SEQ ID NO:53)
-靶向Z1155的引物组，由以下序列定义：
GATTGTGGCGATTAATGGGGG(SEQ ID NO:54)
ACACCGATCTGGTCATTGGCG(SEQ ID NO:55)
-靶向Z1156的引物组，由以下序列定义：
AAACGCCTTTAAAATCTGCGTCT(SEQ ID NO:56)
TGCCGTGCGCACAGTCATAAG(SEQ ID NO:57)
-靶向Z1151的引物组，由以下序列定义：
GCCCATGGCTCCACATCCTG(SEQ ID NO:58)
CCAAAAAAGTTATGATGATTGCACTG(SEQ ID NO:59)
-靶向Z6065的引物组，由以下序列定义：
GCACTGGCCCTTGTTGCTCAGGC(SEQ ID NO:60)
GCTCTTCCAGTGAGAATGTCTTTCCGG(SEQ ID NO:61)
-靶向stx1和stx2的引物组，由以下序列定义：
TTTGTYACTGTSACAGCWGAAGCYTTACG(SEQ ID NO:62)
CCCCAGTTCARWGTRAGRTCMACRTC(SEQ ID NO:63)
用于检测所述扩增产物的探针的非限制性的例子给出如下：
-允许衍生自espK的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
ATTCAGATAGAAGAAGCGCGGGCCAG(SEQ ID NO:64)；
-允许衍生自espV的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
CTTGCAACACGTTACGCTGCCGAGTATT(SEQ ID NO:65)；
-允许衍生自UreD的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
TACGCTGATCACCATGCCTGGTGC(SEQ ID NO:66)；
-允许衍生自Z2098的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
TAACTGCTATACCTCCGCGCCG(SEQ ID NO:67)；
-允许衍生自Z1153的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
TGTAACACCCAGACGGTCAGCAACATG(SEQ ID NO:68)；
-允许衍生自Z1154的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
TCACTTCCAGTTTCTGGTGATGTTTTGAT(SEQ ID NO:69)；
-允许衍生自Z1155的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
TGGGTGAGGTTAAAATATAAAGAACGATTGC(SEQ ID NO:70)；
-允许衍生自Z1156的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
TAAGATATTTTCTGACTTTCCGCATGCGCTT(SEQ ID NO:71)；
-允许衍生自Z1151的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
AAAGAGCCAGCGCAGAGCTGACCAG(SEQ ID NO:72)；
-允许衍生自Z6065的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
TTCGCTGGAAGCAGAGCCCGTGC(SEQ ID NO:73)；
-允许衍生自stx1的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
CTGGATGATCTCAGTGGGCGTTCTTATGTAA(SEQ ID NO:74)；
-允许衍生自stx2的扩增产物的检测的探针，由以下序列定义：
TCGTCAGGCACTGTCTGAAACTGCTCC(SEQ ID NO:75)；
有利地，本发明提供了一种用于预测样品是否含有EHEC O157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O26:[H11]和O45:[H2]血清型的至少之一的典型的肠出血性大肠杆菌(EHEC)，并且进一步鉴定所述EHEC的血清型的方法，其中所述方法包括：
-进行用于评估所述样品是否包括如上所述的O157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O26:[H11]、O45:[H2]和O104:H4血清型的至少之一的EHEC的PCR测定，并且如果所述PCR测定的结果是阳性的，
-进行如上所述的用于鉴定EHEC的血清型的PCR测定。
本发明的PCR测定可以用于测试潜在含有EHEC的物质的任何样品，例如食物样品、水样品、土壤样品等。
本发明的PCR测定可以采用适合靶序列PCR扩增的任何方法，采用任何适用于该目的的各种天然或工程化的酶进行。还可以采用替代性方法(例如基于核酸序列的扩增(NASBA)、分支DNA、链置换扩增或环介导的等温扩增(LAMP)方法(Compton 1991,Chang1991,Walker et al.1992,Notomi et al.,2000))。
特别优选的方法是包括实时PCR扩增(如Ian M.Mackay in“Real-time PCR inMicrobiology:from diagnosis to characterization”(2007)Caister Academic Press,Norfolk,UK所述)的那些。
实时PCR，也称为定量实时聚合酶链式反应(qPCR)或动力学聚合酶链式反应，用于扩增并同时定量靶DNA分子。它使DNA样品中特定序列的检测和定量(为绝对拷贝数或用DNA添加量或额外标准化基因进行标准化时的相对量)同时进行。步骤遵循聚合酶链式反应的一般原理；其关键特征是所扩增的DNA随着其在反应在的累积在每个扩增循环后以实时方式定量(Mackay2007)。定量的两钟常用方法是采用插入双链DNA的荧光染料，和当与互补DNA杂交时发出荧光的经修饰的DNA寡核苷酸探针(Mackay 2007)。在本发明中，本发明人已经显示了这两种方法的第二种，但基于插入荧光染料的定量PCR产物的另一种方法也在本发明的范围之内。
合适的荧光标记的非限制性例子包括6-羧基-荧光素(FAM)、四氯-6羧基荧光素(TET)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)。用于标记双标记探针的合适的淬灭剂的非限制性例子包括6-羧基-四甲基-罗丹明(TAMRA)、DABCYL、非荧光淬灭剂如黑洞淬灭剂家族(BHQ)的淬灭剂或包括小沟结合物基团(MGB)。
本发明的每个PCR测定都可以通过对每个靶序列进行单独的PCR反应进行(单重PCR)。但是，在许多情况下，优选进行多重PCR，从而能够在单个反应中扩增几个靶序列。有利地，人们可以采用宏阵列(macroarray)，即例如基板的预制结构，所期望的DNA引物已经点样于其上。这样的宏阵列允许如本文所述的多重PCR测定的常规进行。通过举例的方式，可以采用例如由Beutin et al.(Beutin et al.2009)所述的宏阵列(Pall-GeneDisc Technology,Bruz,France)，其允许在预装有用于检测和定量所需靶标所必须的试剂的反应小室中同时对多个靶标进行检测。
为了确保该测定的结果代表该样品的真实内容物，其还可以包括阴性扩增对照以确保任何所检测到的产物是真正阳性的以及还包括抑制对照以确保来自该样品的DNA能够被扩增并因此没有产生假阴性结果。
本发明还涵盖允许进行本发明的PCR测定的上述引物组和探针，以及与这些引物组和这些探针相关、最终与进行PCR反应的试剂相关的试剂盒。这些试剂盒还可以包括进行所述扩增反应的说明书。采用本发明的引物所得的扩增产物也是本发明的一部分。
根据第一个实施方案，本发明的试剂盒包括引物的组合，所述引物的组合包括：
-由序列SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所定义的引物组和由序列SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所定义的引物组，和/或由序列SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所定义的引物组；
-由序列SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所定义的引物组；
-由序列SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所定义的引物组；
-由序列SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所定义的引物组；
-由序列SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所定义的引物组；
-由序列SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所定义的引物组；
-由序列SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所定义的引物组；
-由序列SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31所定义的引物组；
优选地，所述试剂盒还包括：
-允许检测衍生自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的扩增产物的探针，和允许检测衍生自SEQ ID NO:3的扩增产物的探针，和/或允许检测衍生自SEQ ID NO:4的扩增产物的探针，如上所定义的；
-允许检测衍生自SEQ ID NO:5的扩增产物的探针，如上所定义的；
-允许检测衍生自SEQ ID NO:6的扩增产物的探针，如上所定义的；
-允许检测衍生自SEQ ID NO:7的扩增产物的探针，如上所定义的；
-允许检测衍生自SEQ ID NO:8的扩增产物的探针，如上所定义的；
-允许检测衍生自SEQ ID NO:9的扩增产物的探针，如上所定义的；
-允许检测衍生自SEQ ID NO:10的扩增产物的两种探针，如上所定义的。
根据第二个实施方案，本发明的试剂盒包括：
-衍生自espK的引物组，和
-一个或多个选自以下引物组：衍生自espV的引物组、衍生自ureD的引物组、衍生自Z2098的引物组、衍生自Z1151的引物组、衍生自Z1153的引物组、衍生自Z1154的引物组、衍生自Z1155的引物组、衍生自Z1156的引物组、衍生自Z6065的引物组。
优选地，所述试剂盒还包括允许检测衍生自espV的扩增产物的探针，和一个或多个选自以下的探针：允许检测衍生自espV的扩增产物的探针、允许检测衍生自ureD的扩增产物的探针、或允许检测衍生自Z2098的扩增产物的探针、允许检测衍生自Z1151的扩增产物的探针、允许检测衍生自Z1153的扩增产物的探针、允许检测衍生自Z1154的扩增产物的探针、允许检测衍生自Z1155的扩增产物的探针、允许检测衍生自Z1156的扩增产物的探针、允许检测衍生自Z6065的扩增产物的探针。
根据上述第二个实施方案的试剂盒可以进一步包括靶向stx1的引物组和靶向stx2的引物组，和优选允许检测衍生自stx1的扩增产物的探针，和允许检测衍生自stx2的扩增产物的探针。
为了更好地理解本发明并且显示同样的内容如何付诸实施，将仅通过例子的方式显示本发明的具体实施方案、方法和过程。
具体实施方式
实施例1：用于肠出血性大肠杆菌(EHEC)的特异性鉴定的衍生自CRISPRS基因座的DNA序列的鉴定
材料与方法
菌株
通过高通量实时PCR研究其CRISPR基因座的大肠杆菌株(n＝955)列于下表I中。
表I：大肠杆菌株
对于每个血清型，除非另有说明否则n＝1。
*包括如(Bugarel et al.2010)中所述的EHEC衍生物。**包括非典型的EHEC。
大肠杆菌株分为产志贺毒素的大肠杆菌或STEC(n＝160)、肠致病性大肠杆菌或EPEC(n＝344)、肠出血性大肠杆菌或EHEC(n＝331)和非致病性大肠杆菌(n＝120)。STEC/EHEC型基于stx和eae基因的存在定义。EHEC株根据同时携带基因stx(stx1和/或stx2)和eae定义，而STEC株仅携带stx。STEC包括血清型O91:[H21]、O113:[H21]、O104:[H21]的stx阳性和eae阴性大肠杆菌株，也称为非典型的EHEC，其与其它EHEC相比更低频率参与出血性疾病，但是腹泻的常见原因。EHEC株的Stx阴性衍生物命名为EHEC样并基于其nle基因谱、eae亚型和如Bugarel et al.(2010；2011)所定义的血清型进行定义，除了血清型O26:H11的EHEC样株，其基于基因espK和它们的arcA基因的2型等位基因的存在进行鉴定(Bugarelet al.,2011)。EPEC株如Bugarel et al.(2011)所述的进行定义。非致病性大肠杆菌定义为stx和eae阴性株。
在该工作中所研究的所有菌株均针对大肠杆菌O(LPS)和H(鞭毛)抗原进行鉴定并已经如先前所报道的(Bugarel et al.2010)针对stx和eae基因进行了表征。为了进行检查，细菌于Luria-Broth平板上培养成单菌落并于37℃生长过夜。挑取一个菌落并在高通量实时PCR测试之前采用InstaGene matrix(Bio-Rad Laboratories,Marnes La Coquette,France)提取DNA。
DNA测序
采用表II所列的引物对大肠杆菌株的CRISPR基因座进行PCR扩增。通过EurofinsMWG Operon(Courtaboeuf,France)采用表II所列的测序引物进行CRISPR扩增子的双链DNA测序。
表II
高通量实时PCR
1536(Roche,Meylan,France)用于进行高通量实时PCR扩增。对于1536多孔平板的PCR设置，采用了配备有冷却器和PlateLoc热微孔板密封器(Agilent Technologies)的Bravo自动液体分配器(Agilent Technologies,Massy,France)。PCR反应含有0.5μl样品和1μl母混合物(master mix)，所述母混合物含有1xRealTime ready DNA Probes母液(Roche)(对应于最终0.7x)、300nM每种引物和300nM每种探针(对应于每种最终200nM)的。采用FAM或HEX标记的探针进行扩增。用于PCR扩增的引物和探针列于表III。1536实时PCR系统采用下面的热循环谱：95℃1min接着35个循环：95℃0s(变温速度：4.8℃/s)和60℃30s(变温速度：2.5℃/s)，以及最终冷却步骤40℃30s。软件设置为双色水解探针/UPL探针和主控制。
表III
结果
靶向EHEC O157:H7的CRISPRs基因座的特异性DNA序列的鉴定
对各种EHEC O157:[H7]株的CRISPR基因座的测序已经显示了该基因座对于该血清型的多态性。EHEC O157:[H7]株的CRISPR基因座的序列特征如SEQ ID NO:1、2、3和4中所示。基于这些序列和菌株EDL933(登录号AE005174)的CRISPR基因座，设计了用于检测EHECO157:[H7]的各种实时PCR测定(SP_O157_A、SP_O157_B和SP_O157_C)。针对包括75株EHECO157:[H7](表I)在内的一组955株大肠杆菌测试了所述测定的特异性和灵敏度。PCR测试证明对EHEC O157:[H7]具有高灵敏度性和特异性。所述测定的灵敏度范围为92.0％至97.3％，每个测定仅有少量O157:[H7]株未被检测到。PCR测试的特异性高，范围从99.6至100％。PCR测定SP_O157_B独特的测试，其提供与血清组O55的极少株的交叉反应。通过组合PCR测定SP_O157_B和SP_O157_C，所有的75株EHEC O157:[H7]均被正确检测到(100％的灵敏度)，仅血清组O55的3个分离株发生交叉反应(99.6％的特异性)。
靶向EHEC O145:H28的CRISPR基因座的特异性DNA序列的鉴定
EHEC O145:[H28]的CRISPR基因座已经通过对大肠杆菌中鉴定的两个CRISPR基因座之一的测序进行了表征(SEQ ID NO:5)。根据该CRISPR序列设计了PCR测定(SP_O145)，靶向EHEC O145:[H28]。在该PCR测试研究的955种大肠杆菌株中，只有29株EHEC O145:[H28]和4株EPEC O28:H28测试为阳性。PCR测试SP_O145的灵敏度和特异性分别为100％和99.5％。
靶向EHEC O111:H8的CRISPR基因座的特异性DNA序列的鉴定
基于EHEC O111:H8的CRISPR基因座的序列(SEQ ID NO:6)，已经设计了实时PCR测定(SP_O111)来检测EHEC O111:[H8]。通过PCR测定SP_O111对980种大肠杆菌株进行的研究在49株所分析的O111:[H8]中有47株EHEC O111:[H8]获得了阳性结果。只有血清型O45:H7的一株EPEC株测试为阳性。该PCR测定的灵敏度和特异性高，分别为95.9％和99.9％。
靶向EHEC O121:H19的CRISPR基因座的特异性DNA序列的鉴定
在该研究中已经测序了EHEC O121:[H19]的CRISPR基因座(SEQ ID NO:7)。根据该序列已经设计了PCR测定(SP_O121)，靶向EHEC O121:[H19]。在通过PCR测定SP_O121所测试的955种大肠杆菌株中，仅有一株O104:H7和12株EHEC O121:[H19]测试为阳性，显示该PCR测试高度灵敏(100％)和特异(99.9％)。
靶向EHEC O103:H2和O45:H2的CRISPR基因座的特异性DNA序列的鉴定
基于EHEC O45:[H2]的CRISPR基因座的序列确定(SEQ ID NO:8)和EHEC O103:H2的CRISPR基因座的序列(由株12009(登录号AP010958)发布)，已经设计了PCR测定(SP_O45)并且在该研究中研究的一株EHEC O45:H2和所有38株EHEC O103:H2测试为阳性。因此，PCR测定SP_O45已经显示了针对EHEC O103:[H2]和O45:[H2]的高灵敏度(100％)。当针对大量大肠杆菌测试时，该测试具有98.6％的特异性，只产生与以下血清型的少量菌株的少数交叉反应：O118:H8、O128:[H2]、O128:H8、O128:H2、O89:[H2]、O46:H38、O8:H8、O142、O145:H2以及一株O103(针对鞭毛H2测试为阴性)。
靶向EHEC O104:H4的CRISPR基因座的特异性DNA序列的鉴定
在该研究中已经测序了EHEC O104:[H4]的CRISPR基因座(SEQ ID NO:9)。根据该序列已经设计了PCR测定(SP_O104)，靶向EHEC O104:[H4]。靶向大肠杆菌O104:H4的CRISPR基因座的PCR测定已经针对包括186个已知O血清组和56个H型的一组1303株大肠杆菌进行了评估。该PCR测定对与2011年5月发生的爆发有关的48个O104:H4分离株(包括一株Or:H4分离株)和2001年报道的O104:H4临床分离株给出了阳性结果。具有除了H4的其他H型的大肠杆菌O104的39株菌株测试为阴性。携带K9荚膜抗原的大肠杆菌株(O8:K9:H10、O8:K9:H45、O9:K9:H1、O9:K9:H12和O9:K9:H51，其与抗O104的血清通过凝集发生交叉反应)测试均为阴性。最终，在包括186个已知O血清组和56个H型的其它大肠杆菌株中，只有属于血清型Ont:H2、O43:H2、O141:H2和O174:H2的5个分离株与EHEC O104:H4的CRISPR基因座中设计的引物和探针进行交叉反应。因此，另外的O174:H2、O141:H2和O43:H2针对CRISPR-O104进行测试。十二株O174:H2中有三株测试为阳性，以及3/4 O43:H2和1/8 O141:H2为阳性。所有数据一起显示该PCR测试高灵敏度(100％)和特异性(99.6％)。
靶向EHEC O26:H11的CRISPR基因座的特异性DNA序列的鉴定
对各种EHEC O26:[H11]株的CRISPR基因座测序已经显示了该基因座对于该血清型的多态性。EHEC O26:[H11]的CRISPR基因座的序列特征如SEQ ID NO:10中所示。基于这些序列和EHEC O26:H11株11368的CRISPR基因座(登录号AP010953,NC_013361)，设计了两个实时PCR测定(SP_O26_C和SP_O26_D)用于检测EHEC O26:[H11]的。针对包括77株EHECO26:[H11]和EHEC样O26:[H11]的一组980株大肠杆菌测试了所述测定的特异性和灵敏度。两个PCR测试证明对EHEC O26:[H11]具有灵敏度性和特异性。SP_O26_C PCR测定的灵敏度为87.0％而SP_O26_D PCR测定的灵敏度为90.9％。每个测定仅有少量O26:[H11]株未被检测到。PCR测试SP_O26_C的特异性为98.7％(12株交叉反应)而PCR测试SP_O26_D的特异性为98.1％(17株交叉反应)。通过组合PCR测定SP_O26_C和SP_O26_D，77株EHEC样和EHEC O26:[H11]中仅4株EHEC样O26:H11未被检测到(94.8％的灵敏度)并且仅26株大肠杆菌发生交叉反应(97.1％的特异性)。
结论
该研究的结果总结于下表IV中。
表IV：灵敏度和特异性
对于每个血清型，除非另有说明否则n＝1。
a)EHEC&EHEC样；b)EPEC；c)STEC&非典型的EHEC；d)非致病性大肠杆菌
对各种EHEC株的CRISPR基因座的测序已经显示了来自与全球最常见的临床病例相关的EHEC的CRISPR序列的遗传多样性。对定位于CRISPR基因座的短回文重复序列之间的间隔序列的分析，能够鉴定出可用于以高灵敏度和特异性检测EHEC株的遗传标记。基于高通量实时PCR方法，研究了包括EHEC、EPEC、STEC和非致病性大肠杆菌在内的非常大组的大肠杆菌株的CRISPR基因座内容。最终，在靶向衍生自这些EHEC血清型的各CRISPR序列的PCR测定中以100％的灵敏度检测到EHEC O145:H28(n＝29)、O103:H2(n＝38)、O121:H19(n＝12)、O104:H4(n＝49)和O45:H2(n＝1)。当组合PCR测定SP_O157_B和SP_O157_C(其靶向EHECO157 CRISPR基因座的两个不同序列)时，以100％的灵敏度检测到EHEC O157:[H7](n＝75)。以95.9％的灵敏度检测到EHEC O111:[H8](n＝49)(检测到47/49 O111:[H8]，只有两株未被检测到)。当组合PCR测定SP_O26_C和SP_O26_D(其靶向O26 CRISPR基因座的两个不同序列)时，以94.8％的灵敏度检测到EHEC O26:[H11](n＝77)(检测到73/77 O26:[H11]，未被检测到的仅4株为EHEC样O26:H11株)
在该研究中开发的靶向与全球最常见的临床病例相关的EHEC的CRISPR基因座的PCR测定还是高度特异性的。当其针对非常多的大肠杆菌株测试时，这些测定具有97.1％至100％的特异性，仅产生极其少量的交叉反应(表IV)。
实施例2：用于鉴定与对人类的高毒力相关的产志贺毒素的大肠杆菌(STEC)的遗传标记的鉴定
非LEE编码的III型效应子(Tobe et al.,2006；Creuzburg et al.,2011)和粘附素(Spears et al.,2006；Cergole-Novella et al.,2007；)的扩展库(repertoire)是STEC毒力决定因素的最可能的来源。但是，最佳支持分子风险评估方法的遗传靶标仍有待确定。在食品中监测EHEC尤其需要选择能够清楚地从EPEC株区分EHEC的遗传标记。
为了鉴定此类因子，我们探讨了衍生自基因组O岛OI-43、OI-44、OI-50、OI-57和OI-71的某些nle基因作为区分构成人类健康的严重风险的STEC株和与严重并流行的疾病不相关的EPEC和STEC株的候选物的适用性。用于实时PCR扩增的大肠杆菌靶基因如下表V所示。
表V
a)ORFs和移动元件的命名参考大肠杆菌O157:H7 EDL933(GenBank AE005174)的序列
1)遗传标记espK、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156和Z6065
在各种大肠杆菌致病组中检查衍生自OI-43(Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156和Z6065)、OI-50(espK)和OI-71(Z6065)的遗传标记的分布以评估它们与对人类具有高毒力的STEC株的相关性。
材料与方法
在该研究中所研究的1252株大肠杆菌基于stx和eae基因的存在分为肠出血性大肠杆菌或EHEC(n＝466)、长致病性大肠杆菌或EPEC(n＝468)、产志贺毒素的大肠杆菌或STEC(n＝179)和非致病性大肠杆菌(n＝139)。STEC株仅携带stx。EPEC株仅携带eae。非致病性大肠杆菌(n＝139)定义为stx和eae阴性株。
如实施例1中所述的进行高通量实时PCR测试。
用于遗传标记espK、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156和Z6065的PCR扩增的引物和探针列于表VI中。用于检测stx1、stx2和eae的引物和探针如先前所述(Bugarel etal.2010)。基因stx1、stx2和eae的扩增用作内标并用于组分配目的。
表VI
结果
espK、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156和Z6065及其组合在大肠杆菌致病组中的 分布
不同遗传标记espK、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156和Z6065在不同大肠杆菌致病组中的分布如下表VII所示。总体而言，所研究的遗传标记在EHEC株中检测到的最多，频率范围从51.9％(Z6065)至90.8％(espK)。这些标记与EPEC株较少相关，频率范围从17.7％(Z1154)至53.8％(Z1155)并且在STEC(3.4-20.7％)和非致病性大肠杆菌(3.6-9.4％)中很少被检测到。
遗传标记espK、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156和Z6065本身均不能够可靠鉴定所有EHEC株。但是，当espK与遗传标记OI-43(Z1151、Z1153、Z1154、Z1155和Z1156)或者OI-71(Z6065)组合时，大部分EHEC株可以被检测到，频率范围从95.5％(espK/Z6065)至98.3％(espK/Z1155)。同样的组合检测到EPEC株，频率范围从31.2％(espK/Z6065)至61.8％(espK/Z1155)；检测到STEC株，频率为6.7％-23.5％；检测到非致病性大肠杆菌株，频率在7.9％和13.7％之间。
表VII
espK/Z1151代表针对espK和/或Z1151给出阳性结果的株；espK/Z1153代表针对espK和/或Z1153给出阳性结果的株；espK/Z1154代表针对espK和/或Z1154给出阳性结果的株；espK/Z1155代表针对espK和/或Z1155给出阳性结果的株；espK/Z1156代表针对espK和/或Z1156给出阳性结果的株；espK/Z6065代表针对espK和/或Z6065给出阳性结果的株
遗传标记在肠出血性大肠杆菌中的分布
根据EHEC血清型，espK、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156和Z6065中每个遗传标记的分布显著不同(表VIII)。有趣的是，遗传标记Z6065是能够检测与2011年的德国大规模爆发有关的EHEC O104:H4(stx阳性，eae阴性，aggR阳性)的唯一的遗传标记。
除了没有在任何EHEC O45:[H2]中检测到的Z1151和在所测试的19株O121:[H19]中有18株(5.3％)中不存在的Z6065，所研究的所有其它遗传标记在排名前7位的血清型的EHEC中均被发现了，其频率范围从15.4％(Z6065在O26:[H11]中的流行率)至100％。
通过将espK与OI-43的Z1151、Z1153、Z1154、Z1155和Z1156遗传标记之一组合，检测到排名前7位的EHEC血清型的大部分EHEC株。因此，无论采用遗传标记的何种组合，排名前7位的所有EHEC株均测试为阳性，除了EHEC O121:[H19]的1-2株，其用espK/Z1154和espK/Z6065分别测试为阴性，O103:[H2]的一株，其用espK/Z1154无法检测到，以及EHECO26:[H11]的7-8株，其用所有测试的遗传标记组合均测试为阴性。因此，只有少数EHEC株不与本文所测试的遗传标记反应。这些可能是异常株，不代表经典的EHEC类型。关注这些零星株中的其它基因或对它们的基因组进行测序可能会显示更多的差异，使得它们的状态更清楚。我们应当假设，原则上，具体血清型的所有成员不必都是EHEC。
有趣的是，血清型不是排名前7位的血清型的其它EHEC株，以范围从87.5％至95.5％的高频率被检测到。该发现表明，所测试的遗传标记组合可以高灵敏度检测典型的EHEC(stx和eae均为阳性的大肠杆菌株)。此外，遗传标记Z6065的引入允许检测EHEC O104:H4(stx阳性，eae阴性，aggR阳性)，其与2011年的德国大规模爆发有关。
表VIII
espK/Z1151代表针对espK和/或Z1151给出阳性结果的株；espK/Z1153代表针对espK和/或Z1153给出阳性结果的株；espK/Z1154代表针对espK和/或Z1154给出阳性结果的株；espK/Z1155代表针对espK和/或Z1155给出阳性结果的株；espK/Z1156代表针对espK和/或Z1156给出阳性结果的株；espK/Z6065代表针对espK和/或Z6065给出阳性结果的株
2)遗传标记espK、espV、Z2098和UreD
肠出血性大肠杆菌(EHEC)产生志贺毒素(Stx)是造成出血性肠炎(HC)和溶血性尿毒综合征(HUS)的主要毒力性质，但是许多产生Stx的大肠杆菌株(STEC)并不引起HC和HUS。除了能够产生一种或多种志贺毒素，与人类感染有关的STEC株还携带其它因子，所述因子可以用于区分构成人类健康的严重风险的STEC株和与严重并流行的疾病不相关的STEC株。为了鉴定这样的因子，我们探讨了衍生自基因组O岛OI-43、OI-44、OI-50和OI-57的某些nle基因作为区分构成人类健康的严重风险的STEC株和与严重并流行的疾病不相关的EPEC和STEC株的候选者的适用性。我们专注于由OI-43和/或OI-48编码的ureD(脲酶活性)、由OI-50携带的espK(EspK)，涉及EHEC O157:H7在口服接种的小牛的肠道中的持久性的基因座(Vlisidou et al.2006)。我们还专注于Z2098，其衍生自OI-57的序列，是可能与STEC株对人类的增加的毒力相关的基因岛(Coombes et al.,2008；Imamovic et al,2010；Bugarelet al.,2011)。EHEC株(HEC O157:H7、O111、O103和O26)的基因组测序也已经指出其它遗传标记，例如espV，其在疾病中的作用还未被评估。该基因位于EHEC O157:H7的OI-44，但其在其它大肠杆菌致病组中的流行还没有被记载。在该研究中，我们评估了ureD、espV、espK和Z2098在各种大肠杆菌致病组中的分布以评估它们与对人类具有高毒力的STEC株的相关性并测试其用于清楚地区分EHEC和其它大肠杆菌致病组的适用性。
材料与方法
用于该研究的大肠杆菌株(n＝1100)主要是在以上的研究中所描述的那些。EHEC型株(n＝340)根据stx和eae基因的存在进行定义。STEC株(n＝193)仅携带stx。EPEC株(n＝392)仅携带eae。非致病性大肠杆菌(n＝175)定义为stx和eae阴性株。细菌的培养和DNA的制备如先前所述进行。
也如上述的进行高通量实时PCR扩增。
之前描述了用于stx1、stx2和eae的PCR扩增的引物和FAM标记探针(Bugarel al.2010)。用于靶向ureD、espK、Z2098和espV的引物和探针列于下表IX中。
表IX
a)如在EDL933中进行编号
结果
ureD、espV、espK和Z2098及其组合在大肠杆菌致病组中的分布
遗传标记ureD、espV、espK和Z2098在不同大肠杆菌致病组中的分布示于表X中。总体而言，所研究的遗传标记在EHEC株中大部分被检测到，频率为84.4％(espV)至92.4％(espK)。这些标记与EPEC株较少相关，频率为18.1％(ureD)至45.2％(espV)，并且在STEC(0.5-3.6％)和非致病性大肠杆菌(0.6-2.9％)中很少被检测到。总体而言，我们观察到针对至少一种所研究的遗传标记测试为阳性的26.5％的EPEC株属于排名前7位的EHEC血清型。因此，值得注意的是，针对espK呈阳性的57/113 EPEC株属于排名前7位的EHEC血清型。类似地，针对espV呈阳性的59/177 EPEC株属于排名前7位的EHEC血清型。还值得注意的是针对Z2098呈阳性的68/91 EPEC株和针对ureD呈阳性的58/71 EPEC株也属于排名前7位的EHEC血清型。有趣的是，具有已知EHEC血清型(例如O55:H7、O103:H25和O156:H25)的其它EPEC株也针对至少一种这些遗传标记为阳性(数据未显示)。这些发现表明，这样的分离株可能是EHEC的Stx阴性衍生物，也被命名为EHEC样株(Bugarel et al.2011)。我们根据它们的血清型和nle基因内容假设这些分离株是EHEC衍生物，但是它们可能也是我们仍然无法将其与EHEC衍生物区分开的EPEC株。未来采用全基因组测序的进一步研究可以澄清这些株的确切命名。
遗传标记ureD、espV、espK和Z2098均不能通过其本身可靠鉴定所有EHEC株。探讨了所述遗传标记的组合以鉴定出以最佳特异性检测EHEC的组合。结果呈现在表X中。通过组合，这些遗传标记与EHEC高相关，频率为97.9％(espK/Z2098)至98.8％(espK/ureD)。同样的组合检测EPEC株，频率为33.4％(espK/ureD)至54.1％(espK/espV)、检测STEC株频率为1.6％-3.6％并且检测非致病性大肠杆菌株，频率为1.1％至3.4％。
表X
espK/espV代表针对espK和/或espV给出阳性结果的株；espK/ureD代表针对espK和/或ureD给出阳性结果的株；espK/Z2098代表针对espK和/或Z2098给出阳性结果的株
ureD、espV、espK、espN、Z2098和espM1及其组合在EHEC血清型中的分布
对于EHEC血清型，ureD、espV、espK和Z2098中每个遗传标记的分布显著不同。每个遗传标记各种EHEC血清组中的分布列于表XI中。除了没有在任何EHEC O45:[H2]检测到的espV，所研究的所有其它遗传标记在排名前7位的血清型的EHEC中均被发现了，其频率范围从71.4％(在O103:[H2]中ureD的流行)至100％。
表XI
a)O103:[H25](n＝2),O118:[H16](n＝4),O118:H2,O119:[H25](n＝5),O123:H11,O127:H8s,O145,O145:[H25](n＝5),O156:H21,O156:H25(n＝11),O165:H25(n＝2),O172:[H25](n＝2),O172:NM,O177(n＝2),O177:[H25],O182:[H25],O3,O49:H16,O5(n＝11),O55:[H7](n＝2),O76:H51,O84:H2,Ont:[H2],Ont:H25(n＝2),Or:H16,OX186:[H2]。
基于这些遗传标记的不同组合的排名前7位的血清型的检测列于表XII中。espK和/或Z2098的检测允许检测与人类感染相关的大部分的EHEC血清型。因此，所有的EHECO111:[H8]、O26:[H11]、O45:[H2]、O103:[H2]和O145:[H28]株针对espK和/或Z2098均给出阳性结果，而97.0％的O157:[H7]和95％的O121:[H19]测试为阳性。espK与或者espV或者ureD的组合还可以检测排名前7位的EHEC血清型的大多数株。因此，血清型O157:[H7]、O145:[H28]、O111:[H8]、O103:[H2]、O45:[H2]和O121:[H19]的所有株针对espK和/或espV给出阳性结果，并且97.7％的O26:[H11]针对espK和/或espV给出阳性结果。当测试espK与ureD的组合时，数据非常相似。在该情况下，排名前7位的EHEC血清型的所有株针对espK和/或ureD均给出阳性结果。
表XII
a)O103:[H25](n＝2),O118:[H16](n＝4),O118:H2,O119:[H25](n＝5),O123:H11,O127:H8s,O145,O145:[H25](n＝5),O156:H21,O156:H25(n＝11),O165:H25(n＝2),O172:[H25](n＝2),O172:NM,O177(n＝2),O177:[H25],O182:[H25],O3,O49:H16,O5(n＝11),O55:[H7](n＝2),O76:H51,O84:H2,Ont:[H2],Ont:H25(n＝2),Or:H16,OX186:[H2]。
espK/espV代表针对espK和/或espV给出阳性结果的株；espK/ureD代表针对espK和/或ureD给出阳性结果的株；espK/Z2098代表针对Z2098和/或espK给出阳性结果的株
3)总结：
以上研究允许选择遗传标记Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156、Z6065、ureD、espV、espK和Z2098能够用于检测典型的EHEC株并且特别是那些属于全球报道的人类感染中的七种主要血清型的EHEC。已经研究了这些不同的遗传标记在不同的大肠杆菌致病组中的分布，从而能设计这些标记的最佳的亚组合。这些研究的结果总结如下。
在EHEC血清型中以不同的频率检测到遗传标记ureD、espV、espK、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156和Z6065。我们探讨了这些遗传标记的各种组合以查找给出对于EHEC检测产生较高特异性和灵敏度的标记的最佳组合。遗传标记espK与其它九个遗传标记之一的组合能够检测大多数典型的EHEC株并且特别是那些属于排名前7位的EHEC血清型的菌株。遗传标记espV、ureD和Z2098经证明是与espK组合用于检测EHEC的最佳候选者。它们均不能单独检测排名前7位的EHEC血清型的所有株，而在组合中，它们检测了99.3％-100％的排名前7位的EHEC株。espK与espV、ureD或者Z2098的组合被证明是更特异性和灵敏的检测EHEC株的最佳组合。因此，在属于全球报道的人类感染中的七种主要血清型的EHEC中99.6％的菌株观察到针对espK和/或espV的阳性结果(只有所测试的一株EHEC O26:H11为阴性)。而且，血清型不是排名前7位的血清型的93.7％的EHEC株针对espK和/或espV测试为阳性。最终，只有一个亚组的EPEC(54.1％)针对espK和/或espV测试为阳性。发现大部分的STEC和无毒力的大肠杆菌株为espK和espV均阴性。另一个有趣的方法是将espK与Z2098组合。该遗传标记的组合能够检测属于七种主要EHEC血清型的99.3％的EHEC株和血清型不是排名前7位的血清型的93.7％菌株。报道espK和/或Z2098的检测仅针对36.7％的EPEC、3.6％的STEC和2.3％的非致病性大肠杆菌株。以最高特异性和灵敏度检测EHEC的最佳方法是将espK与ureD组合。该组合能够检测排名前7位的血清型的100％的EHEC株和具有其它血清型的93.7％的EHEC株。还报道espK和/或ureD的检测仅针对33.4％的EPEC、3.6％的STEC和3.4％的非致病性大肠杆菌株。
这些发现显示将espK与espV、ureD或者Z2098的组合检测是用于以≥99％可信度鉴定与全球最常见的临床病例相关的EHEC血清型的高度灵敏和特异的方法。在复杂样品(食品或粪便样本)中这些遗传标记与stx的组合的检测可以提供比仅组合stx和eae更高靶向EHEC的诊断。有趣的是，在检测方案中引入Z6065能够检测非典型的EHEC O104:H4，其参与在欧洲发生的严重的和最大的STEC爆发。考虑到这些PCR测定的迅速，该方法将对排名前7位的EHEC的监测和爆发研究具有重大影响并且可能对公众健康有利。此外，在血清型不是排名前7位的血清型的93.7％的EHEC株中检测这些遗传标记组可能有助于鉴定新出现的EHEC株。
结论
我们采用高通量PCR方法来探索不同大肠杆菌致病组的毒力组学(virulome)，以鉴定可以表征致病性STEC株的遗传性状。在一大组包括EHEC、EPEC、STEC和非致病性大肠杆菌株的大肠杆菌中研究了十个遗传标记(Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156、Z6065、ureD、espV、espK和Z2098)的分布。这些遗传标记的分布在大肠杆菌致病组之间并根据血清型发生改变。
总体而言，显示espK与其它九个基因(Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156、Z6065、ureD、espV和Z2098)的组合是用于检测属于全球报道的人类感染中的七种主要血清型的EHEC的EHEC株的最佳组合。这些发现显示采用基因的该相关组合，大多数EHEC株测试为阳性，而只有一个亚组的EPEC株发生交叉反应。而且，只有极少量的STEC和无毒力的大肠杆菌株在采用这样的方法时交叉反应。除了典型的EHEC株的检测，espK/Z6065的组合可以检测非典型的EHEC O104:H4(stx阳性，eae阴性，aggR阳性)，其与2011年在欧洲发生的HC和HUS较大规模的流行病有关。
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Claims (10)

1.一种用于鉴定怀疑存在于样品中的肠出血性大肠杆菌(EHEC)的血清型的方法，其中所述方法用于非诊断目的，其中所述方法包括检测在所述样品或由其分离的DNA中以下大肠杆菌CRISPR序列的存在或不存在：
a)用于鉴定EHEC O157:[H7]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列选自以下的序列：
-CRISPR序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，其中所述CRISPR SEQ ID NO:1-3的一个或多个序列的存在表示EHEC O157:[H7]的存在；和/或
-CRISPR序列SEQ ID NO:4，其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC O157:[H7]的存在；
b)用于鉴定EHEC O145:[H28]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO:5，并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC O145:[H28]的存在；和
c)用于鉴定EHEC O111:[H8]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO:6，并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC O111:[H8]的存在；和
d)用于鉴定EHEC O121:[H19]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO:7，并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC O121:[H19]的存在；和
e)用于鉴定EHEC O103:[H2]和/或EHEC O45:[H2]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO:8，并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC O103:[H2]和/或EHECO45:[H2]的存在；和
f)用于鉴定EHEC O104:[H4]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO:9，并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC O104:[H4]的存在；和
g)用于鉴定EHEC O26:[H11]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO:10，并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC O26:[H11]的存在。
2.权利要求1的方法，其中所述方法包括对所述样品或由其分离的DNA用靶向所述CRISPR序列的引物的组合进行PCR测定。
3.权利要求2的方法，其中所述引物的组合包括：
a)用于检测EHEC O157:[H7]的引物，其中所述引物由以下组成：
-靶向两个CRISPR序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物组，其中所述引物的序列为以下序列：
GGGAACACAAACCGAAACACA(SEQ ID NO:11)
CTTAGTGTGTTCCCCGCGC(SEQ ID NO:12)和
-靶向CRISPR序列SEQ ID NO:3的引物组，其中所述引物的序列为以下序列：
GAACACTTTGGTGACAGTTTTTGT(SEQ ID NO:13)；
CTTAGTGTGTTCCCCGCGC(SEQ ID NO:14)，
其中针对所述引物组至少之一的扩增产物的存在表示EHEC O157:[H7]的存在；和/或：
-靶向CRISPR序列SEQ ID NO:4的引物组，其中所述引物的序列为以下序列：
GAACACAAACCGAAACACACG(SEQ ID NO:15)
ATAAACCGTCACCAAAACAGTG(SEQ ID NO:16)，
其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC O157:[H7]的存在；和
b)用于检测EHEC O145:[H28]的引物，其中所述引物由以下组成：
-靶向CRISPR序列SEQ ID NO:5的引物组，其中所述引物的序列为以下序列：
GAACTTGAGCCCTGCCAGAA(SEQ ID NO:17)
ACCGCGATCTTTTCCTACCTG(SEQ ID NO:18)，
其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC O145:[H28]的存在；和
c)用于检测EHEC O111:[H8]的引物，其中所述引物由以下组成：
-靶向CRISPR序列SEQ ID NO:6的引物组，其中所述引物的序列为以下序列：
GTGACCGCCTGTACACGC(SEQ ID NO:19)
CGGATATTTGGGCGTAATACC(SEQ ID NO:20)
CTGCCGCGAGTGGTTTCAC(SEQ ID NO:21)，
其中针对引物对SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的至少之一的扩增产物的存在表示EHEC O111:[H8]的存在；和
d)用于检测EHEC O121:[H19]的引物，其中所述引物由以下组成：
-靶向CRISPR序列SEQ ID NO:7的引物组，其中所述引物的序列为以下序列：
CGGGGAACACTACAGGAAAGAA(SEQ ID NO:22)
GGCGGAATACAGGACGGGTGG(SEQ ID NO:23)，
其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC O121:[H19]的存在；和
e)用于检测EHEC O103:[H2]和/或EHEC O45:[H2]的引物，其中所述引物由以下组成：
-靶向CRISPR序列SEQ ID NO:8的引物组，其中所述引物的序列为以下序列：
GAGTCTATCAGCGACACTACC(SEQ ID NO:24)
AACCGCAGCTCGCAGCGC(SEQ ID NO:25)，
其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC O103:[H2]和/或EHEC O45:[H2]的存在；和
f)用于检测EHEC O104:[H4]的引物，其中所述引物由以下组成：
-靶向CRISPR序列SEQ ID NO:9的引物组，其中所述引物的序列为以下序列：
GGAACTCACCGAGCGCCG(SEQ ID NO:26)；
GCCTTTGCAGCGTCTTTCCGATC(SEQ ID NO:27)；
其中针对所述引物组的扩增产物的存在表示EHEC O104:[H4]的存在；和
g)用于检测EHEC O26:[H11]的引物，其中所述引物由以下组成：
-靶向CRISPR序列SEQ ID NO:10的两个引物组，其中第一引物组的序 列为以下序列：
ACAATCGTGTGTAAATTCGCGG(SEQ ID NO:28)
GATAAACCGTGGTACGGAACA(SEQ ID NO:29)，第二引物组的序列为以下序列：
TGAAACCACTCGCGGCAGAT(SEQ ID NO:30)；
ATAAACCGATCTCCTCATCCTC(SEQ ID NO:31)；
其中针对所述引物组的至少之一的扩增产物的存在表示EHEC O26:[H11]的存在。
4.一种用于预测样品是否含有EHEC O157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O26:[H11]、O45:[H2]和O104:[H4]血清型的至少之一的EHEC的方法，其中所述方法用于非诊断目的，其中所述方法包括espK基因、Z6065基因和以下靶基因的一个或多个的检测：espV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155和Z1156。
5.权利要求4的方法，其中所述方法包括对所述样品或由其分离的DNA用包括衍生自espK的引物组和衍生自espV、ureD、Z2098、Z1151、Z1153、Z1154、Z1155、Z1156和Z6065至少之一的引物组的引物的组合进行PCR测定和检测针对所述组合的每个引物组的扩增产物的存在或不存在。
6.权利要求4-5任一项的方法，其进一步包括对所述样品或由其分离的DNA用包括衍生自stx1的引物组和衍生自stx2的引物组的引物的组合进行PCR测定和检测针对所述组合的每个引物组的扩增产物的存在或不存在。
7.权利要求1-3任一项的方法，其包括用于预测所述样品是否含有EHEC O157:[H7]、O145:[H28]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O26:[H11]、O45:[H2]和O104:[H4]血清型的至少一个的肠出血性大肠杆菌(EHEC)的在前步骤，其中所述在前步骤是通过权利要求4-5任一项的方法进行的。
8.一种用于肠出血性大肠杆菌(EHEC)的血清型的鉴定的试剂盒，包括权利要求3中所述的引物组，和任选的用于检测针对所述引物组的每个的扩增产物的探针。
9.权利要求8的试剂盒，进一步包括衍生自espK的引物组和至少一个选自以下的引物组：衍生自espV的引物组、衍生自ureD的引物组、衍生自Z2098的引物组、衍生自Z1151的引物组、衍生自Z1153的引物组、衍生自Z1154 的引物组、衍生自Z1155的引物组、衍生自Z1156的引物组、衍生自Z6065的引物组，和任选的用于检测针对所述引物组的每个的扩增产物的探针。
10.权利要求8或9任一项的试剂盒，进一步包括靶向stx1和stx2的引物组，和任选的用于检测来自stx1的扩增产物的探针和用于检测来自stx2的扩增产物的探针。
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