ES2659469T3

ES2659469T3 - Método para detectar e identificar Escherichia Coli enterohemorrágica

Info

Publication number: ES2659469T3
Application number: ES13747516.6T
Authority: ES
Inventors: Patrick Fach; Sabine Delannoy; Lothar Beutin
Original assignee: Bundesinstitut fur Risikobewertung; BUNDESINSTITUT fur RISIKOBEWERTUNG; Agence National de Securite Sanitaire de l'Alimentation de l'Environnement Et du Travail
Current assignee: Bundesinstitut fur Risikobewertung; BUNDESINSTITUT fur RISIKOBEWERTUNG; Agence National de Securite Sanitaire de l'Alimentation de l'Environnement Et du Travail
Priority date: 2012-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2018-03-15
Anticipated expiration: 2033-06-14
Also published as: WO2013186754A3; MX357697B; MX2014015130A; KR20150030783A; CN104619860B; CA2875919A1; WO2013186754A2; BR112014031370A2; CL2014003377A1; EP2861762A2; EP2674501A1; BR112014031370B1; JP2015519075A; US10190175B2; AU2013276084A8; AU2013276084A1; CA2875919C; EP2861762B1; KR102065053B1; JP6166365B2

Abstract

Un método para identificar el(los) serotipo(s) de Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) que se sospecha que están presentes en una muestra, donde dicho método comprende detectar la presencia o la ausencia, en dicha muestra o ADN aislado de la misma, de las siguientes secuencias CRISPR de E. coli: a) Secuencias CRISPR para identificar ECEH O157:[H7] en donde dichas secuencias CRISPR se seleccionan entre - las secuencias CRISPR SEQ ID NO; 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 3, en donde la presencia de una o más de dichas CRISPR SEQ ID NO: 1-3 es indicativa de la presencia de ECEH O157:[H7]; y/o; - la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 4, en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O157:[H7]; b) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O145:[H28], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 5, y en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O145:[H28]; y c) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O111:[H8], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 6, y en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O111:[H8]; y d) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O121:[H19], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 7, y en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O121:[H19]; y e) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O103:[H2] y/o ECEH O45:[H2], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 8, y en donde la presencia de la secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de O103:[H2] y/o de ECEH O45:[H2]; y f) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O104:[H4], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 9, y en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O104:[H4]; y g) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O26:[H11], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 10, y en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O26:[H11].

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Método para detectar e identificar Escherichia Coli enterohemorrágica

La invención se refiere a la identificación de E. coli productora de toxina Shiga (ECTS) que constituye un riesgo grave para la salud humana.

La Escherichia coli productora de toxina Shiga (ECTS) es un grupo diverso de E. coli que pertenece a más de 400 serotipos O:H de E. coli, algunos de los cuales causan brotes y casos esporádicos de enfermedades transmitidas por alimentos que van desde diarrea a colitis hemorrágica (CH) y el síndrome urémico hemolítico (SUH). Según su patogenicidad humana, las últimas cepas también se denominaron E. coli enterohemorrágica (ECEH) (Levine 1987, Nataro and Kaper 1998). Numerosos casos de CH y SUH se han atribuido a cepas ECEH con serotipo O157:H7, pero ahora se ha reconocido que otros serotipos de ECTS pertenecen al grupo ECEH.

Por lo tanto, la evidencia acumulada de numerosos países indica que hasta el 30-60% de las infecciones humanas por ECTS son causadas por ECTS no O157 y que tan solo de cinco a siete serotipos "prioritarios" de ECTS están implicados en brotes y casos esporádicos de Ch y SHU. Estos comprenden los serotipos O26:[H11], O45:[H2], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O145:[H28], O157:[H7] y sus derivados no móviles. Además, una cepa inusual de O104:[H4] se ha asociado con el mayor brote de cH y SUH mundial en 2011 (Scheutz et al., 2011; Frank et al., 2011; Struelens et al., 2011; Gault et al., 2011).

En consecuencia, muchas jurisdicciones están considerando la implementación de programas de inspección de alimentos para salvaguardar al público de estas cepas ECTS con alta virulencia para los humanos. Una estrategia racional para la detección de estas cepas de E. coli enterohemorrágica (ECEH), como parte de un programa de inspección de alimentos basado en el riesgo, requiere una definición clara de la característica distintiva de la ECTS prioritaria (p. ej., serogrupo, serotipos, virulencia y otros marcadores) y estrategias efectivas para detectar estos ECTS patógenos en los alimentos. La detección de ECEH no O157 es particularmente desafiante por que no tienen características específicas que las distingan de la gran cantidad de E. coli comensales inofensivas que comparten los mismos nichos. Karmali et al. (2003) han propuesto una clasificación de seropatotipo como un marco para identificar los O-serogrupos más importantes implicados en brotes transmitidos por alimentos, basado en la gravedad de la enfermedad, frecuencia y asociación con brotes, pero las razones de la diferencia en la virulencia entre las diversas cepas ECTS siguen sin estar claras. Es probable que esta diferencia se deba a diferencias en el patrón de genes de virulencia que poseen las cepas ECTS y se necesitan estudios para fundamentar esto y para identificar marcadores moleculares apropiados.

Existen técnicas para determinar la presencia de una contaminación por ECTS en una muestra detectando, por ejemplo, la presencia de los genes stx1/stx2 y el gen eae localizado en el LEE (locus de borrado del enterocito), un locus que se identificó por primera vez en E. coli enteropatógena ECEP. Pero la base genética de la patogenicidad de ECTS es mucho más compleja que la presencia o ausencia de uno o ambos de estos genes. En una muestra compleja (p. ej., muestras de alimentos, fecales y ambientales), que puede comprender una mezcla de cepas (p. ej., una mezcla de cepas ECTS y ECEP), la presencia de los genes stx1/2 y eae no es indicativa de la presencia de una ECEH en esta muestra.

Sin embargo, dado que algunas cepas ECTS pueden causar problemas de salud muy serios en humanos, la detección de una cepa de ECTS en un producto alimenticio conduce a descartar dicho producto, aunque es probable que esta ECTS no represente una amenaza para la salud humana. Esto da como resultado una gran cantidad de desperdicio debido a la falta de discriminación entre cepas ECTS no patógenas y cepas ECEH.

Se han descrito varios métodos: El documento PCT WO 03/062464 y Beutin et al. (Journal of Applied Microbiology, vol. 106, n°4, 2009, p. 1122-1132) proponen el uso de genes diana stx1 y stx2 en una detección basada en PCR múltiple de serotipos de ECEH; Burgarel el al. (Applied and Environmental Microbiology, vol. 77, n°7, 2011, p.2275- 2281) utiliza una PCR para detectar y caracterizar el serotipo O26:H11 de ECEH con genes diana stx1, stx2, espN, espK y espM2; Burgarel et al. (BMC Microbiology, Biomed Central, London GB, vol. 11, n°1, 2011 p.142) describe el análisis y la detección de una pluralidad de genes diana, stx1, stx2 y espK, en diferentes serotipos diana; el Instituto Superior di Sanita (“detection and identification of Verocytotoxin-producing Escherichia coli (ECVT) O104:H4 in food by real time PCR”, 2011) describe la detección de O104:H4 mediante la amplificación de un fragmento wzx por PCR.

Se ha propuesto utilizar, además de los marcadores stx1/stx2 y eae, otros marcadores genéticos para detectar selectivamente cepas ECEH y diferenciarlas de cepas ECTS no patógenas. Por ejemplo, el documento PCT WO 2011/018762 describe un método que implica la detección combinada de los genes stxl, stx2, eae, nleB y espK para predecir la presencia de ECEH en una muestra.

Sin embargo, todavía existe la necesidad de pruebas fiables que permitan una selección discriminativa de la presencia de ECEH, que incluya ECEH no O157, y una detección específica de los serotipos ECEH implicados, en particular en el caso de los "siete principales" serotipos O26:[H11], O45:[H2], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O145:[H28], O157:[H7].

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Los inventores ahora han identificado marcadores genéticos discriminativos asociados con varias cepas ECTS que constituyen un riesgo grave para la salud humana. En particular, han identificado marcadores genéticos localizados dentro de las secuencias CRISPR (Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas, por sus siglas en inglés) de cepas ECEH con alta virulencia para humanos.

Las CRISPR están presentes dentro de los genomas de muchas especies bacterianas, que incluyen E. coli. Consisten en secuencias en tándem que contienen repeticiones directas de 21 a 47 pb de longitud y separadas por espaciadores de tamaño similar. Los espaciadores se derivan de ácidos nucleicos extraños, tales como fagos o plásmidos, y se ha formulado la hipótesis de que pueden proteger a bacterias de infecciones posteriores por fagos y plásmidos homólogos.

Ibtissem et al. (BMC Bioinformatics, Biomed Central London, vol. 8, n°1, 2007, p.172) sugieren el uso de la base de datos de CRISPR y herramientas para identificar la secuencia CRISPR y Fabre et al. (PLOS ONE, vol. 7, n°5, 2012, p. e36995) describen el uso de la secuencia CRISPR para detectar subtipos y cepas de Salmonella; pero ninguna de estas descripciones sugieren la detección de serotipos de ECEH con una selección específica de secuencias diana CRISPR.

Los inventores han secuenciado los loci CRISPR de varias cepas ECEH que están asociadas con los casos clínicos más frecuentes del mundo, y han identificado diferentes espaciadores que se pueden utilizar para una identificación específica de los serotipos O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O45:[H2], O26:[H11], O104:[H4] de ECEH y sus derivados no móviles, que son responsables de la mayoría de Infecciones ECEh en humanos.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es un método para identificar el(los) serotipo(s) de ECEH que se sospecha que están presentes en una muestra, en donde dicho método comprende detectar la presencia o ausencia, en dicha muestra o ADN aislado de la misma, de las siguientes secuencias CRISPR de E. Coli:

a) secuencias CRISPR para identificar ECEH O157:[H7] en donde dichas secuencias CRISPR se seleccionan entre:

- las secuencias CRISPR SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 3, en donde la presencia de una o más de dichas secuencias SEQ ID NO: 1-3 es indicativa de la presencia de ECEH O157:[ H7]; y/o

- la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 4, en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O157:[H7]; y

b) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O145:[H28], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 5, y en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O145:[H28]; y

c) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O111:[H8], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 6, y en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O111:[H8]; y

d) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O121:[H19], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 7, y en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O121:[H19]; y

e) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O103:[H2] y/o ECEH O45:[H2], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 8, y en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O103:[H2] y/o de ECEH O45:[H2]; y

f) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O104:[H4], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 9, y en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O104:[H4]; y

g) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O26:[H11], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 10, y en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O26: [H11].

Según una realización preferida de la invención, dicho método comprende realizar un ensayo de PCR sobre dicha muestra o ADN aislado de la misma, con cebadores diseñados para amplificar dichas secuencias CRISPR, y verificar la presencia de los productos de amplificación correspondientes.

Preferiblemente, dicho ensayo de PCR se realiza con una combinación de cebadores que comprende:

a) cebadores para detectar ECEH O157:[H7], en donde dichos cebadores consisten en:

5

10

15

20

25

30

35

40

- un conjunto de cebadores dirigidos tanto a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 1 como a la SEQ ID NO: 2, en donde dichos cebadores están definidos por las siguientes secuencias:

GGGAACACAAACCGAAACACA (SEQ ID NO: 11)

CTTAGTGTGTTCCCCGCGC (SEQ ID NO: 12) y

- un conjunto de cebadores que se dirigen a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 3 en donde dichos cebadores están definidos por las siguientes secuencias:

GAACACTTTGGTGACAGTTTTTGT (SEQ ID NO: 13); CTTAGTGTGTTCCCCGCGC (SEQ ID NO: 14),

en donde la presencia de un producto de amplificación para al menos uno de dichos conjuntos de cebadores es indicativa de la presencia de ECEH O157:[H7]; y/o

- un conjunto de cebadores que se dirigen a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 4, en donde dichos cebadores están definidos por las siguientes secuencias:

GAACACAAACCGAAACACACG (SEQ ID NO: 15) ATAAACCGTCACCAAAACAGTG (SEQ ID NO: 16),

en donde la presencia de un producto de amplificación para dicho conjunto de cebadores es indicativa de la presencia de ECEH O157:[H7];y

b) cebadores para detectar ECEH O145:[H28], en donde dichos cebadores consisten en:

- un conjunto de cebadores que se dirigen a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 5, en donde dichos cebadores están definidos por las siguientes secuencias:

GAACTTGAGCCCTGCCAGAA (SEQ ID NO: 17)

ACCGCGATCTTTTCCTACCTG (SEQ ID NO: 18),

en donde la presencia de un producto de amplificación para dicho conjunto de conjunto de cebadores es indicativa de la presencia de ECEH O145:[H28]; y

c) cebadores para detectar ECEH O111:[H8], en donde dichos cebadores consisten en:

- un conjunto de cebadores que se dirigen a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 6, en donde dichos cebadores están definidos por las siguientes secuencias:

GTGACCGCCTGTACACGC (SEQ ID NO: 19)

CGGATATTTGGGCGTAATACC (SEQ ID NO: 20)

CTGCCGCGAGTGGTTTCAC (SEQ ID NO: 21),

en donde la presencia de un producto de amplificación para al menos uno de los pares de cebadores con SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21 es indicativa de la presencia de ECEH O111:[H8]; y

d) cebadores para detectar ECEH O121:[H19], en donde dichos cebadores consisten en:

- un conjunto de cebadores que se dirigen a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 7, en donde dichos cebadores están definidos por las siguientes secuencias:

CGGGGAACACTACAGGAAAGAA (SEQ ID NO: 22)

GGCGGAATACAGGACGGGTGG (SEQ ID NO: 23),

en donde la presencia de un producto de amplificación para dicho conjunto de cebadores es indicativa de la presencia de ECEH O121:[H19]; y

e) cebadores para detectar ECEH O103:[H2] y/o ECEH O45:[H2], en donde dichos cebadores consisten en:

- un conjunto de cebadores que se dirigen a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 8, en donde dichos cebadores están definidos por las siguientes secuencias:

GAGTCTATCAGCGACACTACC (SEQ ID NO: 24)

AACCGCAGCTCGCAGCGC (SEQ ID NO: 25),

5

10

15

20

25

30

35

40

45

en donde la presencia de un producto de amplificación para dicho conjunto de cebadores es indicativa de la presencia de ECEH O103:[H2] y/o ECEH O45:[H2]; y

f) cebadores para detectar ECEH O104:[H4], en donde dichos cebadores consisten en:

- un conjunto de cebadores que se dirigen a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 9, en donde dichos cebadores están definidos por las siguientes secuencias:

GGAACTCACCGAGCGCCG (SEQ ID NO: 26);

GCCTTTGCAGCGTCTTTCCGATC (SEQ ID NO: 27);

en donde la presencia de un producto de amplificación para dicho conjunto de cebadores es indicativa de la presencia de ECEH O104:[H4]; y

g) cebadores para detectar ECEH O26:[H11], en donde dichos cebadores consisten en:

- dos conjuntos de cebadores que se dirigen a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 10, en donde el primer conjunto de cebadores está definido por las siguientes secuencias:

ACAATCGTGTGTAAATTCGCGG (SEQ ID NO: 28)

GATAAACCGTGGTACGGAACA (SEQ ID NO: 29) y el segundo dicho conjunto de cebadores está definido por las siguientes secuencias:

TGAAACCACTCGCGGCAGAT (SEQ ID NO: 30);

ATAAACCGATCTCCTCATCCTC (SEQ ID NO: 31);

en donde la presencia de un producto de amplificación para al menos uno de los dichos conjuntos de cebadores es indicativa de la presencia de O26:[H11].

Los productos de amplificación se pueden detectar mediante cualquier método apropiado para la detección de productos de PCR. Por ejemplo, se pueden detectar por medio de sondas derivadas de las respectivas secuencias diana.

A continuación se dan ejemplos de sondas preferidas:

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, definida por la siguiente secuencia: CGATCAATCCGAATATGAGCGGT (SEQ ID NO: 32), y una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de la SEQ ID NO: 3, definida por la siguiente secuencia: CACTGTTTTGGTGACGGTTTATCC (SEQ ID NO: 33), y/o una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de la SEQ ID NO: 4, definida por la siguiente secuencia: ACAAAAAAACTACTACCAAGTGTTC (SEQ ID NO: 34);

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de la SEQ ID NO: 5, definida por la siguiente secuencia:

TGGGGCCTCTTTTGTACCCGG (SEQ ID NO: 35);

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de la SEQ ID NO: 6, definida por la siguiente secuencia:

TGTAATGGCTCACCGGTTTATCCCC (SEQ ID NO: 36);

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de la SEQ ID NO: 7, definida por la siguiente secuencia:

TCCGCCAACGGCGACAGGGG (SEQ ID NO: 37);

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de la SEQ ID NO: 8, definida por la siguiente secuencia:

TCGGAACGTGGCGCTATAGGTG (SEQ ID NO: 38);

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de la SEQ ID NO: 9, definida por la siguiente secuencia:

CTGGGAGGCGTATCTCACGTTCGGT (SEQ ID NO: 39);

5

10

15

20

25

30

35

40

45

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de la SEQ ID NO: 10, definida por la siguiente secuencia:

TGCTGTCTATATTTCGACCAGTGTTCC (SEQ ID NO: 40);

CCAGCTACCGACAGTAGTGTGTTCC (SEQ ID NO: 41);

Según otro aspecto de la presente invención, proporciona un método para predecir si una muestra contiene Escherichia coli enterohemorrágica típica (ECEH), (que se definen en la presente memoria como cepas de Escherichia coli positivas para stx y eae), y/o la ECEH O104:H4 atípica que dio positivo para stx y negativo para eae. Las cepas ECeH típicas incluyen, en particular, los serotipos O157:H7, O145:H28, O103:H2, O111:H8, O121:H19, O26:h11 y O45:H2 de ECEH y sus derivados no móviles.

Dicho método comprende la detección del gen espK y de uno o más de los siguientes genes diana: espV, ureD, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156 y Z6065.

Estas dianas génicas de E. coli corresponden a efectores tipo III no codificados por LEE derivados de varias islas O genómicas: OI-43, OI-44, OI-50, OI-57 y OI-71.

Las combinaciones de espK con uno o más de espV, ureD, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155 y Z1156, se identificaron por los inventores entre varias combinaciones de marcadores de virulencia putativos, como las más predictivas de ECEH típico (cepas de E. coli stx y eae positivas), y en particular de la presencia de cepas ECEH de los serotipos O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11] o O45:[H2] de ECEH. La combinación de espK con Z6065 es predictiva de la presencia de ECEH O104:H4 atípica.

Las combinaciones particularmente preferidas son las siguientes:

- espK con uno o más de espV, ureD, Z2098;

- espK con Z6065;

- espK con uno o más de espV, ureD, Z2098 y con Z6065.

Según una realización particular, dicho método comprende realizar un ensayo de PCR sobre dicha muestra o ADN aislado de la misma con una combinación de cebadores que comprende un conjunto de cebadores derivados de espK y un conjunto de cebadores derivados de al menos uno de espV, ureD, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156 y Z6065;

y detectar la presencia o la ausencia de un producto de amplificación para cada conjunto de cebadores de dicha combinación.

Según una realización preferida de este método, la combinación de cebadores además comprende un conjunto de cebadores derivados de stxl y un conjunto de cebadores derivados de stx2. Esto permite seleccionar muestras tanto para los genes stx, como marcadores de ECTS, como para los marcadores genéticos adicionales enumerados anteriormente, relacionados con los serotipos de ECTS prioritarios que están asociados con brotes y casos esporádicos de CH y SUH.

En contraste con los métodos de la técnica anterior, el método de la invención no necesita la detección del gen eae.

Los cebadores derivados de espK, espV, ureD, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156, Z6065, stxl o stx2 y adecuados para uso en el ensayo de PCR de la invención, así como las sondas que permiten la detección de los productos de amplificación obtenidos con estos cebadores, pueden ser fácilmente diseñados por un experto en la técnica, a partir de las secuencias de estos genes disponibles en las bases de datos, por ejemplo dentro de la secuencia anotada de Escherichia coli O157:H7 (cepa EDL933) disponible en GenBank bajo el número de acceso AE005174.2.

A continuación se dan ejemplos no limitativos de conjuntos de cebadores preferidos para uso en este ensayo de PCR:

- un conjunto de cebadores que se dirigen a espK, definidos por las siguientes secuencias: GCAGRCATCAAAAGCGAAATCACACC (SEQ ID NO: 42) TCGTTTGGTAACTGTGGCAGATACTC (SEQ ID NO: 43)

- un conjunto de cebadores que se dirigen a espV, definidos por las siguientes secuencias:

5

10

15

20

25

30

35

TCAGGTTCCTCGTCTGATGCCGC (SEQ ID NO: 44)

CTGGTTCAGGCCTGGAGCAGTCC (SEQ ID NO: 45)

- un conjunto de cebadores que se dirigen a ureD, definidos por las siguientes secuencias: GCAATAATTGACTCTGATTGCC (SEQ ID NO: 46)

GCTGCTGCGGTAAAATTTACT (SEQ ID NO: 47)

- un conjunto de cebadores que se dirigen a Z2098, definidos por las siguientes secuencias: CTGAAAAGAGCCAGAACGTGC (SEQ ID NO: 48)

TGCCTAAGATCATTACCCGGAC (SEQ ID NO: 49)

- un conjunto de cebadores que se dirigen a Z1153, definidos por las siguientes secuencias: CGATCATTGTGGGCATGTTATGCC (SEQ ID NO: 50)

CCTGAATTCACACGGTGATGCG (SEQ ID NO: 51)

- un conjunto de cebadores que se dirigen a Z1154, definidos por las siguientes secuencias: GCCTTTTTATGTTCATTATTGCGGTTG (SEQ ID NO: 52)

GTATAGTTTTAGCAATACCTTCCTGC (SEQ ID NO: 53)

- un conjunto de cebadores que se dirigen a Z1155, definidas por las siguientes secuencias: GATTGTGGCGATTAATGGGGG (SEQ ID NO: 54)

ACACCGATCTGGTCATTGGCG (SEQ ID NO: 55)

- un conjunto de cebadores que se dirigen a Z1156, definidos por las siguientes secuencias: AAACGCCTTTAAAATCTGCGTCT (SEQ ID NO: 56)

TGCCGTGCGCACAGTCATAAG (SEQ ID NO: 57)

- un conjunto de cebadores que se dirigen a Z1151, definidos por las siguientes secuencias: GCCCATGGCTCCACATCCTG (SEQ ID NO: 58)

CCAAAAAAGTTATGATGATTGCACTG (SEQ ID NO: 59)

- un conjunto de cebadores que se dirigen a Z6065, definidos por las siguientes secuencias: GCACTGGCCCTTGTTGCTCAGGC (SEQ ID NO: 60)

GCTCTTCCAGTGAGAATGTCTTTCCGG (SEQ ID NO: 61)

- un conjunto de cebadores que se dirigen a stxl y stx2, definidos por las siguientes secuencias: TTTGTYACTGTSACAGCWGAAGCYTTACG (SEQ ID NO: 62)

CCCCAGTTCARWGTRAGRTCMACRTC (SEQ ID NO: 63)

A continuación se dan ejemplos no limitativos de sondas para detectar los productos de amplificación:

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de espK, definida por la siguiente secuencia:

ATTCAGATAGAAGAAGCGCGGGCCAG (SEQ ID NO: 64);

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de espV, definida por la siguiente secuencia:

CTTGCAACACGTTACGCTGCCGAGTATT (SEQ ID NO: 65);

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de UreD, definida por la siguiente secuencia:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

TACGCTGATCACCATGCCTGGTGC (SEQ ID NO: 66);

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de Z2098, definida por la siguiente secuencia:

TAACTGCTATACCTCCGCGCCG (SEQ ID NO: 67);

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivada de Z1153, definida por la siguiente secuencia:

TGTAACACCCAGACGGTCAGCAACATG (SEQ ID NO: 68);

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivada de Z1154, definida por la siguiente secuencia:

TCACTTCCAGTTTCTGGTGATGTTTTGAT (SEQ ID NO: 69);

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivada de Z1155, definida por la siguiente secuencia:

TGGGTGAGGTTAAAATATAAAGAACGATTGC (SEQ ID NO: 70);

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivada de Z1156, definida por la siguiente secuencia:

TAAGATATTTTCTGACTTTCCGCATGCGCTT (SEQ ID NO: 71);

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivada de Z1151, definida por la siguiente secuencia:

AAAGAGCCAGCGCAGAGCTGACCAG (SEQ ID NO: 72);

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivada de Z6065, definida por la siguiente secuencia:

TTCGCTGGAAGCAGAGCCCGTGC (SEQ ID NO: 73);

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivada de stxl, definida por la siguiente secuencia:

CTGGATGATCTCAGTGGGCGTTCTTATGTAA (SEQ ID NO: 74);

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivada de stx2, definida por la siguiente secuencia:

TCGTCAGGCACTGTCTGAAACTGCTCC (SEQ ID NO: 75);

de forma ventajosa, la invención proporciona un método para predecir si una muestra contiene Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) típica de al menos uno de los serotipos O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11] y O45:[H2] de ECEH, y que además identifica el(los) serotipo(s) de dicha ECEH, en donde dicho método comprende:

- realizar un ensayo de PCR para evaluar si dicha muestra comprende o no ECEH de al menos uno de los serotipos O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11], O45:[H2] y O104:H4, como se describió anteriormente, y si los resultados de dicho ensayo de pCr son positivos,

- realizar un ensayo de PCR para identificar el(los) serotipo(s) de dicho ECEH, como se describió anteriormente.

Los ensayos de PCR de la invención se pueden utilizar para analizar cualquier muestra de una sustancia que potencialmente contenga ECEH, tal como muestras de alimentos, muestras de agua, muestras de suelo, etc.

Los ensayos de PCR de la invención se pueden llevar a cabo utilizando cualquier método adecuado para la amplificación de secuencias diana por PCR, utilizando cualquiera de las diversas enzimas naturales o modificadas disponibles para este fin. También se pueden utilizar métodos alternativos tales como amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA, por sus siglas en inglés), ADN ramificado, amplificación por desplazamiento de cadena o el método de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP, por sus siglas en inglés) (Compton 1991, Chang 1991, Walker et al. 1992, Notomi et al., 2000).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Los métodos particularmente preferidos son aquellos que implican amplificación por PCR en tiempo real como se describe por lan M. Mackay en “Real-time PCR in Microbiology: from diagnosis to characterization” (2007) Caister Academic Press, Norfolk, UK.

La PCR en tiempo real, también llamada reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qPCR, por sus siglas en inglés) o reacción en cadena de la polimerasa cinética, se utiliza para amplificar y cuantificar simultáneamente una molécula de ADN diana. Permite tanto la detección como la cuantificación (como número absoluto de copias o cantidad relativa cuando se normaliza para la entrada de ADN o genes normalizadores adicionales) de una secuencia específica en una muestra de ADN. El procedimiento sigue el principio general de la reacción en cadena de la polimerasa; su característica clave es que el ADN amplificado se cuantifica a medida que se acumula en la reacción en tiempo real después de cada ciclo de amplificación (Mackay 2007). Dos métodos comunes de cuantificación son el uso de tintes fluorescentes que se intercalan con el ADN bicatenario, y las sondas de oligonucleótidos de ADN modificado que emiten fluorescencia cuando se hibridan con un ADN complementario (Mackay 2007). En la presente invención, los inventores han mostrado el segundo de estos dos métodos, pero el otro método de cuantificación de productos de PCR basado en colorantes fluorescentes intercalados también está dentro del alcance de la presente invención.

Ejemplos no limitantes de marcadores fluorescentes adecuados incluyen 6-carboxifluoresceína (FAM), tetracloro-6- carboxifluoresceína (TET), 6-carboxi-X-rodamina (ROX). Ejemplos no limitativos de desactivadores adecuados para marcar sondas doblemente marcadas incluyen 6-carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA), DABCYL, desactivadores no fluorescentes tales como desactivadores de la familia Black Hole Quencher (BHQ), o que incluyen un grupo de ligandos de unión al surco menor (MGB).

Cada uno de los ensayos de PCR de la invención se puede llevar a cabo realizando una reacción de PCR separada para cada secuencia diana a detectar (PCR simple). Sin embargo, en muchos casos se preferirá llevar a cabo la PCR múltiple, que permite la amplificación de varias secuencias diana en una única reacción. De forma ventajosa, se puede utilizar una macromatriz, es decir, una estructura preformada tal como un sustrato sobre la que se han detectado los cebadores de ADN deseados. Tal macromatriz permite la realización rutinaria de ensayos de PCR múltiple descritos en la presente memoria. A modo de ejemplo, se puede utilizar la macromatriz GeneDisc® (Pall- GeneDisc Technology, Bruz, Francia) descrita, por ejemplo, por Beutin et al. (Beutin et al.2009) que permite la detección simultánea de múltiples dianas en microcámaras de reacción precargadas con los reactivos necesarios para detectar y cuantificar las dianas requeridas.

Para garantizar que los resultados del ensayo son representativos del contenido real de la muestra, también puede comprender un control de amplificación negativo para garantizar que cualquiera de los productos detectados son verdaderos positivos y también un control de inhibición para garantizar que el ADN de la muestra se puede amplificar y, por lo tanto, que no se generan falsos negativos.

La invención también incluye los conjuntos de cebadores y las sondas definidos anteriormente, que permiten llevar a cabo los ensayos de PCR de la invención, así como kits que asocian estos conjuntos de cebadores y estas sondas, eventualmente asociados con reactivos para realizar una reacción de PCR. Estos conjuntos también pueden comprender instrucciones para realizar dicha reacción de amplificación. Los productos de amplificación que utilizan los cebadores de la invención también son parte de la invención.

Según una primera realización, un kit de la invención comprende una combinación de cebadores que comprende:

- un conjunto de cebadores definidos por las secuencias SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 y un conjunto de cebadores definidos por las secuencias SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, y/o un conjunto de cebadores definidos por las secuencias sEq ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16;

- un conjunto de cebadores definidos por las secuencias SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18;

- un conjunto de cebadores definidos por las secuencias SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, y SEQ ID NO: 21;

- un conjunto de cebadores definidos por las secuencias SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23;

- un conjunto de cebadores definidos por las secuencias SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25;

- un conjunto de cebadores definidos por las secuencias SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27;

- un conjunto de cebadores definidos por las secuencias SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 29;

- un conjunto de cebadores definidos por las secuencias SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31;

preferiblemente, dicho kit también comprende:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de SEQ ID NO: 3, y/o una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de la SEQ ID NO: 4, como se definió anteriormente;

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de la SEQ ID NO: 5, como se definió anteriormente;

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de la SEQ ID NO: 6, como se definió anteriormente;

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de la SEQ ID NO: 7, como se definió anteriormente;

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de la SEQ ID NO: 8, como se definió anteriormente;

- una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de la SEQ ID NO: 9, como se definió anteriormente;

- dos sondas que permiten la detección de productos de amplificación derivados de la SEQ ID NO: 10, como se definió anteriormente;

Según una segunda realización, un kit de la invención comprende:

- un conjunto de cebadores derivados de espK, y

- uno o más conjuntos de cebadores seleccionados entre: un conjunto de cebadores derivados de espV, un conjunto de cebadores derivados de ureD, un conjunto de cebadores derivados de Z2098, un conjunto de cebadores derivados de Z1151, un conjunto de cebadores derivados de Z1153, un conjunto de cebadores derivados de Z1154, un conjunto de cebadores derivados de Z1155, un conjunto de cebadores derivados de Z1156, un conjunto de cebadores derivados de Z6065.

Preferiblemente, dicho kit también comprende una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de espK, y una o más sondas seleccionadas entre: una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de espV, una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de ureD, o una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de Z2098, una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de Zl151, una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de Z1153, una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de Z1154, una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de Z1155, una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de Z1156, una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de Z6065.

Los kits según la segunda realización descrita anteriormente pueden comprender además un conjunto de cebadores que se dirigen a stxl y un conjunto de cebadores que se dirigen a stx2, y preferiblemente una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de stxl, y una sonda que permite la detección de productos de amplificación derivados de stx2.

Para un mejor entendimiento de la invención y para mostrar cómo se puede llevar a cabo la misma, a continuación se mostrarán solo a modo de ejemplo, realizaciones específicas, métodos y procedimientos según la presente invención.

Ejemplo 1: Identificación de secuencias de ADN derivadas de los loci CRISPR de E. coli para la identificación específica de E. coli enterohaemorrágica (ECEH)

Materiales y métodos

Cepas bacterianas

Las cepas de E. coli (n = 955) que se investigaron en busca de sus loci CRISPR mediante PCR en tiempo real de alto rendimiento se dan a conocer en la Tabla I a continuación.

ECEH* * (n = 331)

O103:[H25] (n=6), O103:H2 (n=38), O111:H8 (n=49), O118:[H16] (n=3), O119:[H25] (n=4), O121:H19 (n=12), O123:H11, O127:H8s, O145, O145:[H28] (n=29), O156:H21, O156:H25 (n=10), O157:[H7] (n=75), O165:H25, O172:[H25], O172:H25, O172:NM, O177 (n=2), O177:[H25], O182:[H25], O26:[H11] (n=76), O3, O45:H2, O49:H16, O5 (n=8), O55, O76:H51, O84:H2, Ont:[H2], Or:H16, OX186:[H2]

ECEP (n = 344)

O100:[H25] (n=2), O102:H19, O103:H21, O103:H8, O108:H9 (n=6), O109:H25, O111, O111:B4, O111:H11, O111:H19 (n=3), O111:H2 (n=13), O111:H25 (n=2), O111:H47, O111:H9 (n=3), O113:H6 (n=2), O114:H2 (n=6), O114:H49 (n=5), O115:H38 (n=3), O117:H25, O117:H40b (n=3), O118:H5, O118:H8a (n=3), O119:[H25], O119:H2 (n=3), O119:H6 (n=4), O119:H8 (n=2), O119:H9, O119s:H2, O123/O4:H45 (n=2), O123:H25, O125:H6, O125ac:H6 (n=3), O126:H27, O126:H6, O127, O127:H19, O127:H40 (n=4), O127:H40b (n=2), O127:H6 (n=2), O128:[H2] (n=12),O128:H8, O128ac:H2, O142:H34, O142:H6 (n=3), O145:H34 (n=5), O15:H11, O15:H2 (n=3), O153:H14, O156, O156:[H8] (n=7), O156:H1 (n=2), O156:H25 (n=3), O157, O157:[H45] (n=2), O157:H16 (n=5), O157:H2, O157:H26 (n=2), O157:H39, O157:H45 (n=3), O177:H26, O186:[H45], O2:[H40] (n=2), O2:H40b, O2:H8, O21:H25, O22:H7, O26:[H11] (n=38), O26:H31, O26:H34, O28:H28 (n=4), O3:H40b, O3:H5, O3:H8a (n=3), O37:H10, O4:H16, O45, O45:H7, O45:H9, O49:[H10] (n=2), O49:H-, O5:H11, O51:H49 (n=3), O55:[H51], O55:[H7] (n=26), O55:H6 (n=5), O62:H9, O63:H6 (n=2), O66:H8/8a, O69:[H2], O69:H16 (n=2), O70/O86:H2, O70:H11 (n=5), O71:H40b, O76:H41, O76:H7 (n=5), O80:[H2] (n=3), O84:[H2], O86:[H34] (n=4), O86:H11 (n=2), O86:H40, O86:H8 (n=4), O86:H8a, O88:H8a, O89:[H2], O9:H10, OK8:H10, Ont:[H10], Ont:[H6], Ont:H11, Ont:H14, Ont:H2 (n=2), Ont:H21, Or:H40b, Or:H8a, Or:H9, OX177:H11 (n=2), OX177:H6

ECTS** (n = 160)

O100:NM (n=2), O101:H- (n=3), O104:H7, O105:H18, O109:H-, O110:H28, O111, O111:H10, O113:H4, O115:H18 (n=2), O116:H28, O117 (n=2), O117:H7 (n=2), O118:H12 (n=3), O125, O126, O126:H8, O128ab:H2, O130:H11, O136 (n=2), O138, O139, O139:H1, O141:[H4], O141ac, O146:H21, O146:H28 (n=2), O146:H8, O147, O149:H19, O15:H16, O153:H25 (n=3), O165:H11, O168:H8, O17/77:H41, O171:H-, O171:H2, O172:H21, O174:[H21] (n=11), O174:H2, O174:H8 (n=4), O176:H-, O178:H19, O179:H8, O181:H49, O2:H25, O2:H27, O21:H21 (n=3), O22/083, O22:H16 (n=2), O22:H8 (n=3), O23:H15, O3, O39:H48, O40:21, O40:H8, O46:H38 (n=2), O48:H21, O5, O5:[H19], O53, O6 (n=7), O6:H10 (n=2), O6:H34 (n=2), O68:H12, O73:H18, O74:H42, O75:H8, O76, O76:H19 (n=3), O77 (n=2), O79, O79:H48, O8:H10, O8:H19 (n=6), O8:H8, O85:H11, O86, O88:H25, O91 (n=6), O91:[H21] (n=5), O91:H10 (n=3), O91:H14 (n=2), O92,O107:H-, O92,O107:H48, O96:H19, Ont:H-, Ont:H7, Or:[H16], Or:H12, Or:H29, Or:H33, Or:H4, Or:H48, OX178:H19, OX185:H28, OX187:Hbev, OX3:H-, OX3:H2, OX3:H21, OX7:H16

E. coli no patógena (n = 120)

O103 (n=2), O103:H8, O104:H7, O110, O111:H12, O111:H21, O121:[H45], O126 (n=33), O126:H11, O126:H27 (n=3), O127 (n=8), O127:H10, O127:H21, O142 (n=8), O145:H2 (n=2), O150:H8, O153:H12, O156:H33, O156:H47, O156:H56, O157 (n=5), O157:H27, O180:H-, O26:H? (n=4), O26:H21/32, O26:H32 (n=6), O26:NM, O4:H5, O41:H7, O45:H7, O55 (n=8), O55:H19, O55:H21, O6:H4, O62:H30 (n=2), O8/O104:H10, O8/O104:H45, O86 (n=6), O86/O125ac, O86:H2, O86:H27, O88, O9:K9:H12, OX183:H18

Para cada serotipo, n=1 a menos que se indique lo contrario.

*Incluye los derivados de ECEH como se describe en (Bugarel et al., 2010). ** Incluye ECEH atípicas.

5

Las cepas de E. coli se dividieron en E. coli productora de toxina Shiga o ECTS (n = 160), E. coli enteropatógena o ECEP (n = 344), E. coli enterohemorrágica o ECEH (n = 331) y E. coli no patógena (n = 120). El tipo ECTS/ECEH se definió con la presencia de genes stx- y eae-. Las cepas ECEH se definieron como portadoras tanto de un gen stx (stxl y/o stx2) como de un gen eae, mientras que las cepas ECTS solo portaban stx. Las ECTS incluyeron cepas de 10 E. coli stx-positivas y eae-negativas de los serotipos O91:[H21], O113:[H21], O104:[H21], también denominadas ECEH atípicas, que están implicadas con menos frecuencia en enfermedades hemorrágicas que otras ECEH, pero son una causa frecuente de diarrea. Los derivados stx-negativos de cepas ECEH se designaron como similares a ECEH y se definieron en base a su perfil génico nle, subtipo y serotipo eae como se describe por Bugarel et al. (2010; 2011) excepto para las cepas similares a ECEH de serotipo O26:H11 que se identificaron en base a la 15 presencia del gen espK y su forma alélica 2 del gen arcA (Bugarel et al., 2011). Las cepas ECEP se definieron como se describe por Bugarel et al. (2011). Las E. coli no patógenas se definieron como cepas stx- y eae- negativas.

Todas las cepas investigadas en este trabajo se identificaron para los antígenos O (LPS) y H (flagelares) de E.coli y se han caracterizado por los genes stx- y eae- como se dio a conocer anteriormente (Bugarel et al. 2010). Para el examen, las bacterias se cultivaron en colonias individuales sobre placas de Caldo Luria y se dejaron crecer durante

la noche a 37°C. Se recogió una colonia y se extrajo el ADN utilizando la matriz InstaGene (Bio-Rad Laboratories, Mames La Coquette, Francia) antes de la prueba de PCR en tiempo real de alto rendimiento.

Secuenciación de ADN

5 Los loci CRISPR de las cepas de E. coli se amplificaron mediante PCR con los cebadores enumerados en la Tabla II. La secuenciación de ADN bicatenario de los amplicones CRISPR fue realizada por Eurofins MWG Operon (Courtaboeuf, Francia) utilizando los cebadores de secuenciación enumerados en la Tabla II.

Tabla II

Nombre del cebador: Secuencias (5'-3') del cebador directo y del cebador inverso SEQ ID NO: Número de acceso Ubicación dentro de la secuencia

CRISPR-I-F: GGTGAAGGAGYTGGCGAAGGCGTC 76 AE005174 3665412-3665435

CRISPR-I-R: CCGGTGGATTTGGATGGGTTACG 77 AE005174 3665885-3665863

CRISPR-II-F: TGTGAACCTCTCTGGCATGGAG 78 AP010953 3786919-3786940

CRISPR-II-R: TAAAGTTGGTAGATTGTGACTGGC 79 AP010953 3787672-3787649

10 PCR en tiempo real de alto rendimiento

El LightCycler® 1536 (Roche, Meylan, Francia) se utilizó para realizar amplificaciones mediante PCR en tiempo real de alto rendimiento. Para la configuración de la PCR de las placas multipocillo LightCycler® 1536, se utilizó el inyector automático de líquido Bravo (Agilent Technologies, Massy, Francia) equipado con un enfriador y el sellador térmico de microplacas PlateLoc (Agilent Technologies). Las reacciones de PCR contenían 0,5 pl de muestra y 1 pl 15 de mezcla maestra que contenía 1x RealTime ready DNA Probes Master (Roche) (que corresponde a 0,7x final), 300 nM de cada cebador y 300 nM de cada sonda (que corresponde a 200 nM final de cada uno). Las amplificaciones se realizaron utilizando sondas TaqMan® marcadas con FAM o HEX. Los cebadores y las sondas utilizados para amplificaciones mediante PCR se enumeran en la Tabla III. El sistema de PCR en tiempo real LightCycler® 1536 se utilizó con el siguiente perfil térmico: 95°C durante 1 min seguido de 35 ciclos de 95°C durante 20 0 s (incremento gradual de temperatura: 4,8°C/s) y 60°C durante 30 s (incremento gradual de temperatura: 2,5°C/s)

y una etapa de enfriamiento final a 40°C durante 30 s. Las configuraciones del software eran sondas de hidrólisis /sondas UPL de doble color y control maestro.

Tabla III

: Secuencias (5'-3') del cebador directo, del cebador inverso y de la sonda SEQ ID NO: Secuencia diana

SP_O157_A: GAACACAAACCGAAACACACG 15 (SEQ ID NO:4)

: ATAAACCGTCACCAAAACAGTG 16

: [ FAM ] -ACAAAAACTGTCACCAAAGTGTTC- [ BHQ1] 34

SP_O157_B: GGGAACACAAACCGAAACACA 11 (SEQ ID NO: 1 y

: CTTAGTGTGTTCCCCGCGC 12 2)

: [HEX]-CGATCAATCCGAATATGAGCGGT-[BHQ1] 32

SP 0157 C: GAACACTTTGGTGACAGTTTTTGT 13 (SEQ ID NO:3)

: CTTAGTGTGTTCCCCGCGC 14

: [HEX]-CACTGTTTTGGTGACGGTTTATCC-[BHQ1] 33

SP_O121: CGGGGAACACTACAGGAAAGAA 22 (SEQ ID NO: 7)

: GGCGGAATACAGGACGGGTGG 23

: [HEX]-TCCGCCAACGGCGACAGGGG-[BHQ1] 37

SP_O45: GAGTCTATCAGCGACACTACC 24 (SEQ ID NO: 8)

: AACCGCAGCTCGCAGCGC 25

: [HEX]-TCGGAACGTGGCGCTATAGGTG-[BHQ1] 38

SP_O145: GAACTTGAGCCCTGCCAGAA 17 (SEQ ID NO: 5)

: ACCGCGATCTTTTCCTACCTG 18

: [HEX]-TGGGGCCTCTTTTGTACCCGG-[BHQ1] 35

SP_O104: GGAACTCACCGAGCGCCG 26 (SEQ ID NO: 9)

: GCCTTTGCAGCGTCTTTCCGATC 27

: [HEX]-CTGGGAGGCGTATCTCACGTTCGGT-[BHQ1] 39

SP_O26_C: ACAATCGTGTGTAAATTCGCGG 28 (SEQ ID NO: 10)

: GATAAACCGTGGTACGGAACA 29

: [HEX]-TGCTGTCTATATTTCGACCAGTGTTCC-[BHQ1] 40

SP_O26_D: TGAAACCACTCGCGGCAGAT 30 (SEQ ID NO: 10)

: ATAAACCGATCTCCTCATCCTC 31

: [HEX]-CCAGCTACCGACAGTAGTGTGTTCC-[BHQ1] 41

SP_O111: GTGACCGCCTGTACACGC 19 (SEQ ID NO: 6)

: CGGATATTTGGGCGTAATACC 20

: CTGCCGCGAGTGGTTTCAC 21

: [HEX]-TGTAATGGCTCACCGGTTTATCCCC-[BHQ1] 36

Resultados

Identificación de secuencias de ADN específicas que se dirigen a los loci CRISPR de ECEH O157:H7

5 La secuenciación de los loci CRISPR de varias cepas ECEH O157:[H7] ha demostrado el polimorfismo de este locus para este serotipo. Las secuencias características de los loci cRisPr de cepas de ECEH O157:[H7] se dan a conocer en SEQ ID NO: 1,2, 3 y 4. En base a estas secuencias y al locus CRISPR de la cepa EDL933 (número de acceso AE005174), se diseñaron varios ensayos de PCR en tiempo real (SP_O157_A, SP_O157_B y sP_O157_C) para detectar ECEH O157:[H7]. La especificidad y sensibilidad de los ensayos se analizaron contra un panel de 955 10 cepas de E. coli, que incluía 75 cepas ECEH O157:[H7] (Tabla I). Los ensayos de PCR demostraron ser altamente sensibles y específicas para ECEH O157:[H7]. La sensibilidad de los ensayos oscilaba de 92,0% a 97,3% con solo pocas cepas de O157:[H7] que no fueron detectadas por cada ensayo. La especificidad de los ensayos de PCR fue alta, oscilando de 99,6 a 100%. El análisis de PCR SP_O157_B fue el único ensayo que dio reacción cruzada con muy pocas cepas del serogrupo O55. Combinando los ensayos de PCR SP_O157_B y SP_O157_C, se detectaron 15 correctamente las 75 cepas ECEH O157:[H7] (100% de sensibilidad) y solo 3 cepas aisladas del serogrupo O55 presentaron reacción cruzada (99,6% de especificidad).

Identificación de secuencias de ADN específicas que se dirigen al locus CRISPR de ECEH O145:H28

El locus CRISPR de ECEH O145:[H28] se caracterizó (SEQ ID NO: 5) secuenciando uno de los dos loci CRISPR identificados en E. coli. Se diseñó un ensayo de PCR (SP_O145) a partir de esta secuencia CRISPR para dirigirse a 20 ECEH O145:[H28]. Entre las 955 cepas de E. coli que se investigaron con este ensayo de PCR, solo las 29 cepas ECEH O145:[H28] y las 4 cepas ECEP O28:H28 dieron positivo. La sensibilidad y especificidad del ensayo de PCR SP_O145 fueron, respectivamente, de 100% y 99,5%.

Identificación de secuencias de ADN específicas que se dirigen al locus CRISPR de ECEH O111:H8

En base a la secuencia del locus CRISPR de ECEH O111:H8, (SEQ ID NO: 6), se diseñó un ensayo de PCR en tiempo real (SP_O111) para detectar ECEH O111:[H8]. La investigación de 980 cepas de E. coli mediante el ensayo de PCR SP_O111 dio resultados positivos para 47 cepas ECEH O111:[H8] de las 49 cepas O111:[H8] analizadas. 5 Solo una cepa ECEP del serotipo O45:H7 dio positivo. La sensibilidad y especificidad de este ensayo de PCR fueron altas, 95,9% y 99,9% respectivamente.

Identificación de secuencias de ADN específicas dirigidas al locus CRISPR de ECEH O121:H19

En este estudio se secuenció el locus CRISPR de ECEH O121:[H19] (SEQ ID NO: 7). Se diseñó un ensayo de PCR (SP_O121) a partir de esta secuencia para dirigirse a ECEH o121:[H19]. Entre las 955 cepas de E. coli analizadas 10 por el ensayo de PCR SP_O121, solo una cepa O104:H7 y las 12 cepas ECEH O121:[H19] dieron positivo, lo que

demuestra que este ensayo de PCR fue altamente sensible (100%) y específico (99,9 %).

Identificación de secuencias de ADN específicas dirigidas a los loci CRISPR de ECEH O103:H2 y O45:H2

En base a la determinación de la secuencia del locus CRISPR de ECEH O45:[H2] (SEQ ID NO: 8) y de la secuencia del locus CRISPR de ECEH O103:H2, emitida por la cepa 12009 (número de acceso APO10958), se diseñó un 15 ensayo de PCR (SP_ O45) y dio positivo una cepa ECEH O45:H2 y las 38 cepas ECEH O103:H2 investigadas en

este estudio. Por lo tanto, el ensayo de PCR SP_O45 ha demostrado una alta sensibilidad (100%) para ECEH O103:[H2] y O45:[H2]. Este ensayo tiene una especifidad de 98,6% cuando se ensayo sobre un panel grande de E. coli, que da solo reacciones cruzadas menores con pocas cepas de los siguientes serotipos: O118:H8, O128:[H2], O128:H8, O128:H2, O89:[H2], O46:H38, O8:H8, O142, O145:H2 y una cepa O103 que dio negativo para el flagelo 20 H2.

Identificación de secuencias de ADN específicas que se dirigen al locus CRISPR de ECEH O104:H4

En este estudio se secuenció el locus CRISPR de ECEH O104:[H4] (SEQ ID NO: 9). Se diseñó un ensayo de PCR (SP_O104) a partir de esta secuencia para dirigirse a ECEH O104: [H4]. El ensayo de PCR dirigido al locus CRISPR de E. coli O104:H4 se evaluó sobre un panel de 1303 cepas de E. coli que incluía los 186 serogrupos O conocidos y 25 56 tipos de H. Este ensayo de PCR dio resultados positivos para las 48 cepas aisladas O104:H4 (que incluye una

cepa aislada Or:H4), relacionadas con el brote que se produjo en mayo de 2011, y para una cepa aislada clínica O104:H4 notificada en 2001. Las 39 cepas de E. coli O104 que tienen tipos de H distintos de H4 dieron negativo. Las cepas de E. coli que portan un antígeno capsular k9 (O8:K9:h10, O8:K9:H45, O9:K9:H1, O9:K9:H12 y O9:K9:H51) que presentan reactividad cruzada mediante aglutinación con el suero anti-O104 dieron negativo. En 30 definitiva, entre las demás cepas de E. coli que incluían los 186 serogrupos O conocidos y 56 tipos de H, solo 5 cepas aisladas pertenecientes a los serotipos Ont:H2, O43:H2, O141:H2 y O174:H2 presentaron reacción cruzada con los cebadores y sondas diseñados en el locus CRISPR de ECEH O104:H4. Por lo tanto, se ensayaron cepas adicionales O174:H2, O141:H2 y O43:H2 para CRISPR-O104. Tres de doce O174:H2 dieron positivo, así como 3/4 O43:H2 y 1/8 de O141:H2. En conjunto, los datos mostraron que este ensayo de PCR fue altamente sensible (100%) 35 y específico (99.6%).

Identificación de secuencias de ADN específicas dirigidas al locus CRISPR de ECEH O26:H11

La secuenciación de los loci CRISPR de varias cepas ECEH O26:[H11] ha mostrado el polimorfismo de este locus para este serotipo. Se dio a conocer una secuencia característica de los loci CRISPR de ECEH O26:[H11] en la SEQ ID NO: 10. En base a estas secuencias y al locus CRISPR de la cepa ECEH O26:H11 11368 (números de acceso 40 AP010953, NC_013361), se diseñaron dos ensayos de PCR en tiempo real (SP_O26_C y SP_O26_D) para detectar

ECEH O26:[H11]. La especificidad y sensibilidad de los ensayos se analizaron contra un panel de 980 cepas de E. coli, que incluían 77 cepas de ECEH O26:[H11] y similares a ECEH O26:[H11]. Los dos ensayos de PCR demostraron ser sensibles y específicos para EceH O26:[H11]. La sensibilidad del ensayo de PCR sP_O26_C fue 87%, mientras que la sensibilidad del ensayo de PCR SP_O26_D fue 90,9%. Sólo pocas cepas O26:[H11] no fueron 45 detectadas por cada ensayo. La especificidad del ensayo de PCR SP_O26_C fue 98,7% (12 cepas presentaron reacción cruzada) mientras que la especificidad del ensayo de PCR SP_O26_D fue 98,1% (17 cepas presentaron reacción cruzada). Al combinar los ensayos de PCR SP_O26_C y SP_O26_D, solo 4 cepas similares a ECEH O26:H11 de las 77 cepas similares a EcEh y ECEH O26:[H11] no se detectaron (sensibilidad de 94,8%) y solo 26 E. coli presentaron reacción cruzada (especificidad de 97,1%).

50 Conclusión

Los resultados de este estudio se resumen en la Tabla IV a continuación.

Serotipo: Número PCR Sensibilidad Especifidad Reacción cruzada


: SP_O157_A 92,0% 100% -

O157:[H7]a: 75 SP_O157_B 97,3% 99,6% O55:[H7]a, O55:[H7] (n=2)b

: SP_O157_C 94,7% 100% -


: SP_O157_B+C 100% 99,6% O55:[H7]a, O55:[H7] (n=2)b

O103:H2a, O45:H2a: 38 1 SP_O45 100% 98,6% O118:H8a (n=3)b, O128:[H2]b, O128:H8b, O128ac:H2b, O89:[H2]b, O46:H38C, O8:H8C, O103d, O142d, O145:H2d

O111:H8a: 49 SP_O111 95.9% 99,9% O45:H7 (n=1)b

O121:H19a: 12 SP_O121 100% 99,9% O104:H7d

O145:[H28]a: 29 SP_O145 100% 99,5% O28:H28 (n=4)b

O104:[H4]a: 49 SP_O104 100% 99,6% Ont:H2, O43:H2 (n=4), O141:H2 (n=2), y O174:H2 (n=4)


: SP_O26_C 87% 98,7% O111:H11b, O111:H47b, O118:H16 (n=2)a, O118:H8a (n=3)b, O128:H8b, O26:H11b, O118:H2a, O103:H11a,





: O111b

O26:[H11]a: 77 SP_O26_D 90,9% 98,1% O118:H16 (n=3)a, O123:H11a, O26:H11 (n=9)b, O118:H2 (n=2)a, O86:H11 (n=2)b, O103:H11a


: SP_O26_C+D 94,8% 97,1% O111:H 11b, O111:H47b, O118:H16 (n=4)a, O118:H8a (n=3)b, O123:H11a, O128:H8b, O26:H11 (n=10)b, O86:H11 (n=2)b, O118:H2 (n=2)a, O103:H11a, O111b

Para cada serotipo, n=1 a menos que se indique lo contrario.

a)ECEH y similar a ECEH; a) b)ECEP; c)ECTS y ECEH atípica; d)E. coli no patógena 5

La secuenciación de los loci CRISPR de varias cepas ECEH ha mostrado la diversidad genética de las secuencias

CRISPR emitidas a partir de ECEH asociadas con los casos clínicos más frecuentes en el mundo. El análisis de las

secuencias espaciadoras localizadas entre las secuencias de repetición palindrómicas cortas de los loci CRISPR, permitió identificar marcadores genéticos útiles para detectar con alta sensibilidad y especificidad cepas de ECEH. 10 En base a una estrategia de PCR en tiempo real de alto rendimiento, se investigó un panel muy grande de cepas de E. coli, que comprendía ECEH, ECEP, ECTS y E. coli no patógena con respecto a su contenido de loci CRISPR. En definitiva, se detectaron ECEH O145:H28 (n = 29), O103:H2 (n = 38), O121:H19 (n = 12), O104:H4 (n = 49) y O45:H2 (n = 1) con sensibilidad de 100% con cada ensayo de PCR que se dirigen a varias secuencias de CRISPR derivadas de estos serotipos de ECEH. Se detectó ECEH O157:[H7] (n = 75) con 100% de sensibilidad cuando se 15 combinaron los ensayos de PCR SP_O157_B y SP_O157_C que se dirigen a dos secuencias diferentes de los loci CRISPR de ECEH O157. Se detectó ECEH O111:[H8] (n = 49) con sensibilidad de 95,9% (se detectaron 47/49 O111:[H8], solo dos no se detectaron). Al combinar los ensayos de PCR SP_O26_C y SP_O26_D que se dirigen a dos secuencias diferentes de los loci CRISPR de O26, se detectó ECEH O26:[H11] (n = 77) con sensibilidad de 94,8% (se detectaron 73/77 O26:[H11]; las únicas 4 cepas que no se detectaron fueron cepas similares a ECEH 20 O26:H11).

5

10

15

20

25

30

35

Los ensayos de PCR desarrollados en este estudio para dirigirse a los loci CRISPR de ECEH asociadas con los casos clínicos más frecuentes del mundo también fueron muy específicos. Estos ensayos tuvieron una especificidad de 97,1% a 100% cuando se analizaron en un panel muy grande de cepas de E. coli, dando solo reacciones cruzadas muy pequeñas (Tabla IV).

Ejemplo 2: Identificación de marcadores genético para identificar Escherichia coli productora de toxina shiga (ECTS), asociada con alta virulencia para humanos

El amplio repertorio de efectores tipo III no codificados por LEE (Tobe et al., 2006; Creuzburg et al., 2011) y adhesinas (Spears et al., 2006; Cergole-Novella et al., 2007;) representa la fuente más probable de determinantes de virulencia de ECTS. Sin embargo, las dianas genéticas que respaldan mejor una estrategia de evaluación del riesgo molecular se tienen que definir todavía. El control de ECEH en los alimentos requiere, en particular, la selección de marcadores genéticos capaces de discriminar claramente cepas ECEH de ECEP.

En un intento de identificar tales factores, exploramos la idoneidad de ciertos genes nle derivados de las islas O genómicas OI-43, OI-44, OI-50, OI-57 y OI-71 como candidatos para distinguir las cepas ECTS que constituyen un riesgo severo para la salud humana de las cepas ECEP y ECTS que no están asociadas con enfermedades severas y epidémicas. Los dianas del gen de E. coli utilizadas para la amplificación por PCR en tiempo real se dan a conocer en la Tabla V a continuación.

Tabla V

Gen (nombre de ORF si es cromosómico)a: Proteína codificada o efector de familia Soporte genético (elementos móviles)a

ureD (Z1142, Z1581): Proteína UreD asociada a ureasa OI-43 & OI-48

Z1151: Proteína hipotética OI-43

Z1153: Proteína hipotética OI-43

Z1154: Proteína de inmunidad a la colicina OI-43

Z1155: Supuestas proteínas de membrana OI-43

Z1156: Proteína hipotética OI-43

espV (Z1387): Efector de la familia AvrA OI-44

espK (Z1829): Repeticiones ricas en leucina OI-50

Z2098: Proteína hipotética OI-57

Z6065: Proteína hipotética OI-71

a) La nomenclatura de los ORF y elementos móviles se refiere a la secuencia de E. coli O157:H7 EDL933 (GenBank AE005174)

1) Marcadores genéticos espK, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156 y Z6065.

La distribución de marcadores genéticos derivados de la OI-43 (Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156), OI-50 (espK) y OI-71 (Z6065) se examinó entre diversos grupos patógenos de E. coli para evaluar su asociación con cepas ECTS con alta virulencia para humanos.

Materiales y métodos

Las 1252 cepas de E. coli investigadas en este estudio se dividieron en E. coli enterohemorrágica o ECEH (n = 466), E. coli enteropatógena o ECEP (n = 468), E. coli productora de toxina Shiga o ECTS (n = 179) y E. coli no patógena (n = 139), en base a la presencia de genes stx- y eae-. Las cepas ECTS solo portaban stx. Las cepas ECEP solo portaban eae. Las cepas de E. coli no patógenas (n = 139) se definieron como stx y eae negativas.

Se realizó una prueba de PCR en tiempo real de alto rendimiento como se describe en el Ejemplo 1 anterior.

Los cebadores y las sondas utilizados para las amplificaciones por PCR de los marcadores genéticos espK, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156 y Z6065 se enumeran en la Tabla VI. Los cebadores y las sondas para la detección de stxl, stx2 y eae se describieron anteriormente (Bugarel et al. 2010). Las amplificaciones de los genes stxl, stx2 y eae se utilizaron como controles internos y para fines de asignación grupal.

Secuencias (5'-3') del cebador directo, del cebador inverso y de la SEQ ID

sonda NO:

espK (1829) GCAGRCATCAAAAGCGAAATCACACC 42

TCGTTTGGTAACTGTGGCAGATACTC 43

[6FAM]-ATTCAGATAGAAGAAGCGCGGGCCAG-[BHQ1] 64

Z1153 CGATCATTGTGGGCATGTTATGCC 50

CCTGAATTCACACGGTGATGCG 51

[6FAM]-TGTAACACCCAGACGGTCAGCAACATG-[BHQ1] 68

Z1154 GCCTTTTTATGTTCATTATTGCGGTTG 52

GTATAGTTTTAGCAATACCTTCCTGC 53

[6FAM]-TCACTTCCAGTTTCTGGTGATGTTTTGAT-[BHQ1] 69

Z1155 GATTGTGGCGATTAATGGGGG 54

ACACCGATCTGGTCATTGGCG 55

[6FAM]-TGGGTGAGGTTAAAATATAAAGAACGATTGC-[BHQ1] 70

Z1156 AAAcgcctttaAAAtctgcgtct 56

TGCCGTGCGCACAGTCATAAG 57

[6FAM]-TAAGATATTTTCTGACTTTCCGCATGCGCTT-[BHQ1] 71

Z1151 GCCCATGGCTCCACATCCTG 58

CCAAAAAAGTTATGATGATTGCACTG 59

[6FAM]-AAAGAGCCAGCGCAGAGCTGACCAG-[BHQ1] 72

Z6065 GCACTGGCCCTTGTTGCTCAGGC 60

GCTCTTCCAGTGAGAATGTCTTTCCGG 61

[6FAM]-TTCGCTGGAAGCAGAGCCCGTGC-[BHQ1] 73

Resultados

5 Distribución de espK, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156 y Z6065 y combinación de los mismos entre los grupos patógenos de E. coli

La distribución de los diferentes marcadores genéticos espK, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156 y Z6065 entre los diferentes grupos patógenos de E. coli se muestra en la Tabla VII a continuación. En general, los marcadores genéticos investigados se detectaron principalmente en cepas ECEH con frecuencias que oscilan entre 51,9% 10 (Z6065) y 90,8% (espK). Estos marcadores estaban menos asociados con cepas ECEP con frecuencias que oscilan

entre 17,7% (Z1154) y 53,8% (Z1155) y raramente detectadas en ECTS (3,4 a 20,7%) y E. coli no patógena (3,6 a 9,4%).

Ninguno de los marcadores genéticos espK, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156 y Z6065 es, por sí solo, capaz de identificar de manera fiable todas las cepas ECEH. Sin embargo, cuando se combinó espK con marcadores 15 genéticos de la OI-43 (Z1151, Z1153, Z1154, Z1155 y Z1156) u OI-71 (Z6065), la mayoría de las cepas ECEH se detectaron con frecuencias que oscilaban entre 95,5% (espK/Z6065) y 98.3% (espK/ Z1155). Las mismas combinaciones detectaron cepas ECEP con frecuencias que oscilan entre 31,2% (espK/Z1156) y 61,8% (espK/Z1155), cepas ECTS con frecuencias de 6,7% a 23,5% y cepas de E. coli no patógenas con frecuencias entre 7,9% y 13,7%.

5

10

15

20

25

30

Marcadores genéticos: ECEH (n=466) ECEP (n=468) ECTS (n=179) EC (n=139)

Z1151: 79,8% 20,3% 20,7% 7,9%

Z1153: 89,3% 23,9% 12,3% 9,4%

Z1154: 83,3% 17,7% 3,4% 3,6%

Z1155: 79,4% 53,8% 16,8% 8,6%

Z1156: 88,8% 18,8% 12,8% 6,5%

Z6065: 51,9% 20,1% 5,0% 8,6%

espK: 90,8% 28,0% 3,4% 5,0%

espK/Z1151: 97,2% 34,0% 23,5% 12,2%

espK/Z1153: 97,4% 35,7% 15,1% 13,7%

espK/Z1154: 97,0% 31,8% 6,7% 7,9%

espK/Z1155: 98,3% 61,8% 19,6% 12,9%

espK/Z1156: 97,4% 31,2% 15,6% 10,1%

espK/Z6065: 95,5% 36,8% 8,4% 13,7%

espK/Z1151 representan cepas que dan un resultado positivo para espK y/o Z1151: espK/Z1153 representan cepas que dan un resultado positivo para espK y/o Z1153; espK/Z1154 representan cepas que dan un resultado positivo para espK y/o Z1154; espK/Z1155 representan cepas que dan un resultado positivo para espK y/o Z1155; espK/Z1156 representan cepas que dan un resultado positivo para espK y/o Z1156; espK/Z6065 representan cepas que dan un resultado positivo para espK y/o Z6065

Distribución de los marcadores genéticos en E. coli enterohemorrágica

La distribución de cada marcador genético espK, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156 y Z6065 fue significativamente diferente según los serotipos de ECEH (Tabla VIII). Curiosamente, el marcador genético Z6065 es el único marcador genético capaz de detectar ECEH O104:H4 (stx positivo, eae negativo, aggR positivo) que ha estado involucrado en el gran brote alemán en 2011.

Excepto Z1151 que no se detectó en ninguna ECEH O45:[H2] y Z6065 que estaba ausente en 18 de los 19 O121:[H19] probados (5,3%), todos los demás marcadores genéticos investigados se encontraron en cepas ECEH de los 7 serotipos principales, con frecuencias que oscilan entre 15,4% (prevalencia de Z6065 en O26:[H11]) y 100%.

Al combinar espK con uno de los siguientes marcadores genéticos de la OI-43: Z1151, Z1153, Z1154, Z1155 y Z1156, se detectaron la mayoría de las cepas ECEH de los 7 principales serotipos de ECEH. Por lo tanto, cualquiera que sea la combinación de marcadores genéticos utilizados, todas las cepas de ECEH de los 7 serotipos principales dieron positivo, con la excepción de 1 a 2 cepas ECEH O121:[H19] que dieron negativo con espK/Z1154 y espK/z6065 respectivamente; una cepa de O103:[H2] que no se pudo detectar con espK/Z1154 y 7 a 8 cepas de ECEH O26:[H11] que se detectaron negativas con todas las asociaciones probadas de marcadores genéticos. Por lo tanto, solo unas pocas cepas ECEH no reaccionaron con los marcadores genéticos probados aquí. Estas podrían ser cepas anómalas, no representativas para los tipos clásicos de ECEH. Considerar otros genes en estas cepas anecdóticas o secuenciar su genoma podría revelar más diferencias que aclaren las cosas con respecto a su estado. Deberíamos asumir, en principio, que no es necesariamente el caso que todos los miembros de un serotipo particular sean EHEC.

Curiosamente, otras cepas ECEH, con otros serotipos que aquellos de los 7 serotipos principales, fueron altamente detectadas con frecuencias que oscilan entre 87,5% y 95,5%. Este hallazgo indicó que las combinaciones probadas de los marcadores genéticos podrían detectar ECEH típica (cepas de E. coli tanto stx como eae positivas) con alta sensibilidad. La introducción del marcador genético Z6065 permite detectar además ECEH O104:H4 (stx positivo, eae negativo, aggR positivo) que ha estado involucrado en el gran brote alemán en 2011.

Tabla VIII

Marcadores: O26:H11 O45:H2 O103:H2 O111:H8 O121:H19 O145:H28 O157:H7 Otras ECEH

genéticos: (n=117) (n=19) (n=61) (n=33) (n=19) (n=31) (n=98) (n=88)

Z1151: 105/117 (89,7%) 0/19 (0%) 44/61 (72,1%) 33/33 (100%) 5/19 (26,3%) 30/31 (96,8%) 91/98 (92,9%) 64/88 (72,7%)

Z1153: 107/117 (91,5%) 19/19 (100%) 48/61 (78,7%) 33/33 (100%) 18/19 (94,7%) 31/31 (100%) 91/98 (92,9%) 69/88 (78,4%)

Z1154: 87/117 (74,4%) 19/19 (100%) 48/61 (78,7%) 31/33 (93,9%) 15/19 (78,9%) 29/31 (93,5%) 91/98 (92,9%) 68/88 (77,3%)

Z1155: 75/117 64,1% 16/19 (84,2%) 41/61 (67,2%) 33/33 (100%) 14/19 (73,7%) 25/31 (80,6%) 97/98 (99,0%) 69/88 (78,4%)

Z1156: 106/117 (90,6%) 19/19 (100%) 48/61 (78,7%) 33/33 (100%) 18/19 (94,7%) 31/31 (100%) 91/98 (92,9%) 68/88 (77,3%)

Z6065: 18/117 (15,4%) 19/19 (100%) 59/61 (96,7%) 7/33 (21,2%) 1/19 (5,3%) 6/31 (19,4%) 85/98 (86,7%) 47/88 (53,4%)

espK: 108/117 (92,3%) 19/19 (100%) 60/61 (98,4%) 33/33 (100%) 17/19 (89,5%) 31/31 (100%) 92/98 (93,9%) 63/88 (71,6%)

espK/Z1151: 110/117 (94,0%) 19/19 (100%) 61/61 (100%) 33/33 (100%) 19/19 (100%) 31/31 (100%) 98/98 (100%) 82/88 (93,2%)

espK/Z1153: 110/117 (94,0%) 19/19 (100%) 61/61 (100%) 33/33 (100%) 19/19 (100%) 31/31 (100%) 98/98 (100%) 83/88 (94,3%)

espK/Z1154: 110/117 (94,0%) 19/19 (100%) 60/61 (98,4%) 33/33 (100%) 18/19 (94,7%) 31/31 (100%) 98/98 (100%) 83/88 (94,3%)

espK/Z1155: 113/117 (96,6%) 19/19 (100%) 61/61 (100%) 33/33 (100%) 19/19 (100%) 31/31 (100%) 98/98 (100%) 84/88 (95,5%)

espK/Z1156: 110/117 (94,0%) 19/19 (100%) 61/61 (100%) 33/33 (100%) 19/19 (100%) 31/31 (100%) 98/98 (100%) 83/88 (94,3%)

espK/Z6065: 109/117 (93,2%) 19/19 (100%) 61/61 (100%) 33/33 (100%) 17/19 (89,5%) 31/31 (100%) 98/98 (100%) 77/88 (87,5%)

espK/Z1151 representan cepas que dan un resultado positivo para espK y/o Z1151; espK/Z1153 representan cepas que dan un resultado positivo para espK y/o Z1153; espK/Z1154 representan cepas que dan un resultado positivo para espK y/o Z1154; espK/Z1155 representan cepas que dan un resultado positivo para espK y/o Z1155;

5 espK/Z1156 representan cepas que dan un resultado positivo para espK y/o Z1156; espK/Z6065 representan cepas que dan un resultado positivo para espK y/o Z6065

2) Marcadores genéticos espK, espV, Z2098y UreD

La producción de toxina Shiga (Stx) por E. coli enterohemorrágica (ECEH) es el rasgo de virulencia primario responsable de colitis hemorrágica (CH) y síndrome urémico hemolítico (SUH), pero muchas cepas de E. coli que 10 producen Stx (ECTS) no causan CH ni sUh. Además de la capacidad de producir uno o más tipos de toxinas Shiga, las cepas ECTS asociadas con infecciones humanas portan otros factores que podrían utilizarse para distinguir cepas ECTS que constituyen un riesgo grave para la salud humana de cepas ECTS que no están asociadas con enfermedades graves y epidémicas. En un intento de identificar tales factores, exploramos la idoneidad de ciertos

19

genes nle derivados de las islas O genómicas OI-43, OI-44, OI-50 y OI-57 como candidatos para distinguir cepas ECTS que constituyen un riesgo grave para la salud humana de cepas ECEP y ECTS que no están asociadas con enfermedades graves ni epidémicas. Nos centramos en ureD (actividad ureasa) codificada por OI-43 y/o OI-48, espK 5 (EspK) portado por OI-50, un locus implicado en la persistencia de ECEH O157:H7 en los intestinos de terneros inoculados via oral (Vlisidou et al. al. 2006). Además, nos centramos en Z2098, una secuencia derivada de OI-57, una isla genómica que puede estar asociada con una mayor virulencia de cepas ECTS en humanos (Coombes et al., 2008; Imamovic et al, 2010; Bugarel et al., 2011). La secuenciación del genoma de cepas ECEH (EcEH O157:H7, O111, O103 y O26) también ha mostrado otros marcadores genéticos, tales como espV, cuyo papel en la 10 enfermedad no se ha evaluado. Este gen está localizado en OI-44 de ECEH O157:H7, pero su prevalencia en otros grupos patógenos de E. coli aún no se ha documentado. En este estudio, evaluamos la distribución de ureD, espV, espK y Z2098 en diversos grupos patógenos de E. coli para evaluar su asociación con cepas ECTS con alta virulencia para humanos y para probar su idoneidad para distinguir claramente ECEH de otros grupos patógenos de E. coli.

15 Materiales y métodos

Las cepas de E. coli (n=1100) utilizadas en este estudio fueron principalmente las descritas en los estudios anteriores. Las cepas tipo ECEH (n=340) y se definieron en presencia de genes stx- y eae-. Las cepas ECTS (n=193) portaron solo stx. Las cepas ECEP (n=392) portaron solo eae. La E. coli no patógena (n=175) se definió como cepas stx- y eae- negativas. El cultivo de bacterias y la preparación de ADN se realizó como se describió 20 anteriormente.

También se realizaron amplificaciones por PCR en tiempo real de alto rendimiento como se describió anteriormente.

Los cebadores y las sondas TaqMan® marcadas con FAM utilizadas para amplificaciones por PCR de stxl, stx2 y eae se describieron previamente (Bugarel et al. 2010). Los cebadores y las sondas utilizados para dirigirse a ureD, espK, Z2098 y espV se enumeran en la Tabla IX a continuación.

25 Tabla IX

Gen diana3: Secuencias (5'-3') del cebador directo, del cebador inverso y SEQ Localización dentro de la

: de la sonda ID NO: secuencia AE005174

: GCAGRCATCAAAAGCGAAATCACACC 42 1673422-1673397

espK: TCGTTTGGTAACTGTGGCAGATACTC 43 1673312-1673338

(Z1829): [6FAM]-ATTCAGATAGAAGAAGCGCGGGCCAG-[BHQ] 64 1673395-16673370

: TCAGGTTCCTCGTCTGATGCCGC 44 1295446-1295424

espV: CTGGTTCAGGCCTGGAGCAGTCC 45 1295360-1295382

(Z1387): [6FAM]-CTTGCAACACGTTACGCTGCCGAGTATT-[BHQ] 65 1295422-1295395

: GCAATAATTGACTCTGATTGCC 46 1078824-1078845

ureD: GCTGCTGCGGTAAAATTTACT 47 1078892-1078872

(Z1142): TACGCTGATCACCATGCCTGGTGC-[BHQ] 66 1078847-1078870

: CTGAAAAGAGCCAGAACGTGC 48 1888173-1888193

Z2098: TGCCTAAGATCATTACCCGGAC 49 1888308-1888287

: [6FAM]TAACTGCTATACCTCCGCGCCG[BHQ] 67 1888286-1888265

a) Numeración como en EDL933

Resultados

Distribución de ureD, espV, espK y Z2098 y combinación de los mismos entre grupos patógenos de E. coli

La distribución de los marcadores genéticos ureD, espV, espK y Z2098 entre los diferentes grupos patógenos de E. 30 coli se muestra en la Tabla X. En general, los marcadores genéticos investigados se detectaron principalmente en cepas ECEH con frecuencias que oscilan entre 84,4% (espV) y 92,4% (espK). Estos marcadores estaban menos asociados con cepas ECEP con frecuencias que oscilan entre 18,1% (ureD) y 45,2% (espV) y raramente detectadas en ECTS (0,5 a 3,6%) y E. coli no patógenas (0,6 a 2,9%). En general, observamos que el 26,5% de las cepas ECEP que dieron positivo para al menos uno de los marcadores genéticos investigados pertenecían a los 7 35 principales serotipos de ECEH. Por lo tanto, es digno de mención que 57/113 cepas ECEP que son positivas para

20

5

10

15

20

25

espK pertenecían a los 7 principales serotipos de ECEH. Asimismo, 59/177 cepas ECEP positivas para espV pertenecían a los 7 principales serotipos de ECEH. También es notable que 68/91 cepas ECEP positivas para Z2098 y 58/71 cepas ECEP positivas para ureD también pertenecían a los 7 principales serotipos de ECEH. Curiosamente, otras cepas ECEP que tienen un serotipo de ECEH conocido como O55:H7, O103:H25 y O156:H25 también se detectaron positivas para al menos uno de estos marcadores genéticos (datos no mostrados). Estos hallazgos indicarían que tales cepas aisladas podrían ser Stx negativas derivadas de ECEH que también se designan como cepas similares a ECEH (Bugarel et al., 2011). Supusimos que estas cepas aisladas eran derivadas de ECEH según sus serotipos y el contenido de genes nle, pero también podrían ser cepas ECEP que aún no podemos discriminar de las derivadas de ECEH. Investigaciones adicionales que utilizan la secuenciación completa del genoma podrían aclarar la designación exacta de estas cepas en el futuro.

Ninguno de los marcadores genéticos ureD, espV, espK y Z2098 es, por sí solo, capaz de identificar de manera fiable todas las cepas ECEH. Se exploraron las combinaciones de los marcadores genéticos para identificar aquellos que detectan ECEH con la mejor especificidad. Los resultados se presentan en la Tabla X. En combinación, esos marcadores genéticos estaban altamente asociados con ECEH con frecuencias que oscilaban entre 97,9% (espK/Z2098) y 98,8% (espK/ureD). Las mismas combinaciones detectadas de cepas ECEP con frecuencias que oscilaban entre 33,4% (espK/ureD) y 54,1% (espK/espV), cepas ECTS con frecuencias de 1,6% a 3,6% y cepas de E. coli no patógenas con frecuencia entre 1,1% y 3,4%.

Tabla X

Marcadores genéticos: ECEH (n=340) ECEP (n=392) ECTS (n=193) EC (n=175)

espK: 92,4% 28,8% 0,5% 1,1%

ureD: 89,4% 18,1% 3,1% 2,9%

Z2098: 87,4% 23,2% 3,6% 1,1%

espV: 84,4% 45,2% 1,6% 0,6%

espK/espV: 98,5% 54,1% 1,6% 1,1%

espK/ureD: 98,8% 33,4% 3,6% 3,4%

espK/Z2098: 97,9% 36,7% 3,6% 2,3%

espK/espV representan cepas que dan un resultado positivo para espK y/o espV; espK/ureD representan cepas que dan un resultado positivo para espK y/o ureD; espK/Z2098 representan cepas que dan un resultado positivo para Z2098 y/o espK

Distribución de ureD, espV, espK, espN, Z2098y espMI y combinación de los mismos entre los serotipos de ECEH

La distribución de cada marcador genético ureD, espV, espK y Z2098 fue significativamente diferente según los serotipos de ECEH. La distribución de cada marcador genético en varios serogrupos de ECEH se notifica en la Tabla XI. Excepto espV que no se detectó en ningún ECEH O45:[H2], todos los demás marcadores genéticos investigados se encontraron altamente prevalentes en cepas ECEH de los 7 serotipos principales, con frecuencias que oscilan entre 71,4% (prevalencia de ureD en O103:[h2]) y 100%.

Tabla XI

Marca dores genétic os: 7 seroti pos de ECEH principa les O103: H2 O111: H8 O121: H19 O145: H28 O157: H7 O26: H11 O45: H2 Otra ECEH (nueva ECEH emer gente)a ECEH total

Z2098: 250/277 (90,3%) 49/49 (100%) 47/51 (92,2%) 17/20 (85,0%) 30/30 (100%) 49/66 (74,2%) 44/44 (100%) 14/17 (82,4%) 47/63 (74,6%) 297/340 (87,4%)

espK: 269/277 (97,1%) 48/49 (98,0%) 51/51 (100%) 19/20 (95,0%) 29/30 (96,7%) 61/66 (92,4%) 43/44 (97,7%) 17/17 (100%) 45/63 (71,4%) 314/340 (92,4%)

espV: 248/277 (89,5%) 48/49 (98.0%) 51/51 (100%) 20/20 (100%) 30/30 (100%) 65/66 (98,5%) 34/44 (77,3%) 0/17 (0%) 39/63 (61,9%) 287/340 (84,4%)

ureD: 257/277 35/49 51/51 16/20 30/30 64/66 44/44 17/17 47/63 304/340

: (92,8%) (71,4%) (100%) (80,0%) (100%) (97,0%) (100%) (100%) (74,6%) (89,4%)

a) O103:[H25] (n=2), O118:[H16] (n=4), O118:H2, O119:[H25] (n=5), O123:H11, O127:H8s, O145, O145:[H25] (n=5), O156:H21, O156:H25 (n=11), O165:H25 (n=2), O172:[H25] (n=2), O172:NM, O177 (n=2), O177:[H25], O182:[H25], O3, O49:H16, O5 (n=11), O55:[H7] (n=2), O76:H51, O84:H2, Ont:[H2], Ont:H25 (n=2), Or:H16, OX186:[H2].

5 La detección de los 7 principales serotipos de ECEH basada en diferentes combinaciones de estos marcadores genéticos se dan a conocer en la Tabla XII. La detección de espK y/o Z2098 permitió detectar la mayoría de los serotipos de ECEH asociados con infecciones humanas. Por lo tanto, todas las cepas ECEH O111:[H8], O26:[H11], O45:[H2], O103:[H2] y O145:[H28] dieron un resultado positivo para espK y/o Z2098, mientras que el 97,0% de O157:[H7] y el 95% de O121:[H19] dieron positivo. La asociación de espK con espV o ureD también permitió 10 detectar la mayoría de las cepas de los 7 principales serotipos de ECEH. Por lo tanto, todas las cepas de los serotipos O157:[H7], O145:[H28], O111:[H8], O103:[H2], O45:[H2] y O121:[H19] dieron resultados positivos para espK y/o espV, y el 97,7% de O26:[H11] dio un resultado positivo para espK y/o espV. Los datos fueron muy similares al probar espK en asociación con ureD. En ese caso, todas las cepas de los 7 principales serotipos de ECEH dieron un resultado positivo para espK y/o ureD.

15 Tabla XII

Asocia ción de genes: 7 seroti pos de ECEH princi pales O103: H2 O111: H8 O121: H19 O145: H28 O157: H7 O26: H11 O45: H2 Otra ECEH (nueva ECEH emer gen te)a ECEH total

espK/espV: 276/277 (99,6%) 49/49 (100%) 51/51 (100%) 20/20 (100%) 30/30 (100%) 66/66 (100%) 43/44 (97,7%) 17/17 (100%) 59/63 (93,7%) 335/340 (98,5%)

espK/ureD: 277/277 (100%) 49/49 (100%) 51/51 (100%) 20/20 (100%) 30/30 (100%) 66/66 (100%) 44/44 (100%) 17/17 (100%) 59/63 (93,7%) 336/340 (98,8%)

espK/Z2098: 275/277 (99,3%) 49/49 (100%) 51/51 (100%) 19/20 (95,0%) 30/30 (100%) 65/66 (98,5%) 44/44 (100%) 17/17 (100%) 59/63 (93,7%) 334/340 (98,2%)

espK/espV representan cepas que dan un resultado positivo para espK y/o espV; espK/ureD representan cepas que 20 dan un resultado positivo para espK y/o ureD; espK/Z2098 representan cepas que dan un resultado positivo para Z2098 y/o espK

3) Compendio

Los estudios anteriores permitieron seleccionar los marcadores genéticos Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156,

25 Z6065, ureD, espV, espK y Z2098 útiles para detectar cepas ECEH típicas y, en particular, las pertenecientes a los

siete serotipos de ECEH principales notificados en todo el mundo en infecciones humanas. La distribución de estos marcadores genéticos diferentes se ha investigado entre los diferentes grupos patógenos de E. coli, que permite diseñar subcombinaciones óptimas de estos marcadores. Los resultados de estos estudios se resumen a continuación.

30 Los marcadores genéticos ureD, espV, espK, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156 y Z6065 se detectaron a diferentes frecuencias entre los serotipos de ECEH. Exploramos las diversas asociaciones de estos marcadores genéticos para buscar las mejores combinaciones de marcadores que proporcionan la mayor especificidad y

5

10

15

20

25

30

35

40

45

sensibilidad para detectar ECEH. La asociación del marcador genético espK con uno de los otros nueve marcadores genéticos permite detectar la mayoría de las cepas ECEH típicas y, en particular, las pertenecientes a los 7 principales serotipos de ECEH. Los marcadores genéticos espV, ureD y Z2098 se mostraron los mejores candidatos para ser combinados con espK para detectar ECEH. Tomados individualmente no fueron capaces de detectar todas las cepas de los 7 principales serotipos de ECEH, mientras que en asociación detectaron de 99,3% a 100% de las 7 principales cepas ECEH. La asociación de espK con espV, ureD o Z2098 demostró ser la mejor combinación para una detección más específica y sensible de cepas ECEH. Por lo tanto, se observó un resultado positivo para espK y/o espV en 99,6% de cepas ECEH pertenecientes a los siete principales serotipos de ECEH notificados en todo el mundo en infecciones humanas (solo una cepa aislada ECEH O26:H11 dio negativo). Además, el 93,7% de cepas ECEH con serotipos distintos a los de los 7 principales serotipos dieron positivo para espK y/o espV. En definitiva, solo un subconjunto (54,1%) de cepas ECEP dieron positivo para espK y/o espV. La mayoría de las cepas ECTS y E. coli no virulentas se detectaron negativas con espK y espV. Otra estrategia interesante fue asociar espK con Z2098. Esta combinación de marcadores genéticos dio como resultado la detección de 99,3% de cepas ECEH pertenecientes a los siete principales serotipos de ECEH y de 93,7% de cepas ECEH con serotipos diferentes de los 7 principales serotipos. La detección de espK y/o Z2098 se notificó solo para 36,7% de ECEP, 3,6% de ECTS y 2,3% de cepas no patógenas de E. coli. La mejor estrategia para detectar ECEH con la mayor especificidad y sensibilidad fue combinar espK con ureD. Esta asociación permitió detectar 100% de ECEH de los 7 principales serotipos y 93,7% de cepas ECEH con otros serotipos. La detección de espK y/o ureD también se notificó para solo 33,4% de ECEP, 3,6% de ECTS y 3,4% de cepas no patógenas de E. coli.

Estos hallazgos mostraron que al combinar la detección de espK con espV, ureD o Z2098 es una estrategia altamente sensible y específica para identificar con > 99% de confianza los serotipos de ECEH relacionados con los casos clínicos más frecuentes en el mundo. La detección de estos marcadores genéticos en combinación con stx en muestras complejas (alimentos o muestras fecales) proporcionaría un diagnóstico más dirigido a ECEH que al combinar solo stx y eae. Curiosamente, la introducción de Z6065 en el esquema de detección permite detectar el EHEC O104:H4 atípico que estuvo involucrado en el brote grave y más grande de STEC que ocurrió en Europa. Dada la rapidez de estos ensayos de PCR, esta estrategia debería tener un impacto importante en las investigaciones de vigilancia y brotes de los 7 principales ECEH y es probable que sea beneficioso para la salud pública. Además, la detección de estos conjuntos de marcadores genéticos en 93,7% de cepas ECEH que tienen serotipos diferentes de los 7 principales serotipos de ECEH puede ser útil para identificar nuevas cepas ECEH emergentes.

Conclusión

Utilizamos una estrategia de PCR de alto rendimiento para explorar el viruloma de diferentes grupos patógenos de E. coli en un intento de identificar rasgos genéticos que caracterizarían las cepas ECTS patógenas. Se investigó la distribución de diez marcadores genéticos (Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156, Z6065, ureD, espV, espK y Z2098) en un gran panel de E. coli que comprende cepas ECEH, ECEP, ECTS y de E. coli no patógenas. La distribución de estos marcadores genéticos varió entre los grupos patógenos de E. coli y según los serotipos.

En general, las asociaciones de espK con los otros nueve genes (Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156, Z6065, ureD, espV y Z2098) mostraron las mejores combinaciones para detectar cepas de ECEH pertenecientes a los siete principales serotipos de ECEH notificados en todo el mundo en infecciones humanas. Estos hallazgos mostraron que al utilizar estas combinaciones relevantes de genes, la mayoría de las cepas ECEH dieron positivo, mientras que solo un subconjunto de las cepas ECEP presentaba reacción cruzada. Además, solo las cepas ECTS muy pequeñas y de E. coli no virulentas presentaron reacción cruzada al utilizar tal estrategia. Además de la detección de cepas ECEH típicas, la combinación espK/Z6065 permite detectar la ECEH O104:H4 atípica (stx positivo, eae negativo, aggR positivo) que estuvo involucrada en la epidemia más grande de CH y SUH que se produjo en Europa en 2011.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Bibliografía

Beutin, L., S. Jahn, and P. Fach. 2009. Evaluation of the 'GeneDisc' real-time PCR system for detection of enterohaemorrhagicEscherichia coli (ECEH) O26, O103, O111, O145 and O157 strains according to their virulence markers and their O- and H-antigen-associated genes. J. Appl. Microbiol. 106(4): 1122-1132.

Bugarel M, Martin A, Fach P, Beutin L. 2011. Virulence gene profiling of enterohemorrhagic (ECEH) and enteropathogenic (ECEP) Escherichia coli strains: a basis for molecular risk assessment of typical and atypical ECEP strains. BMC Microbiol. Jun 21 ;11:142.

Bugarel M, Beutin L, Scheutz F, Loukiadis E, Fach P. 2011. Identification of genetic markers for differentiation of Shiga toxin-producing, enteropathogenic, and avirulent strains of Escherichia coli 026. Appl Environ Microbiol. Apr;77(7):2275-81.

Bugarel M, Beutin L, Martin A, Gill A, Fach P. 2010. Micro-array for the identification of Shiga toxin-producing Escherichia coli (ECTS) seropathotypes associated with Hemorrhagic Colitis and Hemolytic Uremic Syndrome in humans. Int J Food Microbiol. Sep 1 ;142(3):318-29.

Bugarel M, Beutin L, Fach P. 2010. Low-density macroarray targeting non-locus of enterocyte effacement effectors (nle genes) and major virulence factors of Shiga toxin- producing Escherichia coli (ECTS): a new approach for molecular risk assessment of ECTS isolates. Appl Environ Microbiol. Jan;76(1):203-11.

Cergole-Novella MC, Nishimura LS, Dos Santos LF, Irino K, Vaz TM, Bergamini AM, Guth BE. 2007. Distribution of virulence profiles related to new toxins and putative adhesins in Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from diverse sources in Brazil. FEMS Microbiol Lett. Sep;274(2):329-34. Epub 2007 Jul 25.

Chang, C. 1991 “Branched DNA Amplification Multimers for the Sensitive, Direct Detection of Human Hepatitis Viruses,” Nucleic Acids Symposium Series, no. 24: 197-200.

Compton, J. 1991 “Nucleic Acid Sequence-Based Amplification,” Nature 350, no. 6313: 91- 92.

Coombes BK, Wickham ME, Mascarenhas M, Gruenheid S, Finlay BB, Karmali MA. 2008. Molecular analysis as an aid to assess the public health risk of non-0157 Shiga toxin-producing Escherichia coli strains. Appl Environ Microbiol. Apr;74(7):2153-60.

Creuzburg K, Middendorf B, Mellmann A, Martaler T, Holz C, Fruth A, Karch H, Schmidt H. 2011. Evolutionary analysis and distribution of type III effector genes in pathogenic Escherichia coli from human, animal and food sources. Environ Microbiol. Feb;13(2):439-52.

Frank C, Werber D, Cramer JP, Askar M, Faber M, an der Heiden M, Bernard H, Fruth A, Prager R, Spode A, Wadi M, Zoufaly A, Jordan S, Kemper MJ, Follin P, Muller L, King LA, Rosner B, Buchholz U, Stark K, Krause G; SUH Investigation Team. Epidemic profile of Shiga-toxin-producing Escherichia coli O104:H4 outbreak in Germany. N Engl J Med. 2011 Nov 10;365(19): 1771-80

Gault G, Weill FX, Mariani-Kurkdjian P, Jourdan-da Silva N, King L, Aldabe B, Charron M, Ong N, Castor C, Mace M, Bingen E, Noel H, Vaillant V, Bone A, Vendrely B, Delmas Y, Combe C, Bercion R, d'Andigne E, Desjardin M, de Valk H, Rolland P. Outbreak of haemolytic uraemic syndrome and bloody diarrhoea due to Escherichia coli O104:H4, southwest France, June 2011. Euro Surveill. 2011 Jun 30;16(26).

Imamovic L, Tozzoli R, Michelacci V, Minelli F, Marziano ML, Caprioli A, Morabito S. 2010. OI-57, a genomic island of Escherichia coli O157, is present in other seropathotypes of Shiga toxin-producing E. coli associated with severe human disease. Infect Immun. Nov;78(11):4697-704.

Karmali, M. A., M. Mascarenhas, S. Shen, K. Ziebell, S. Johnson, R. Reid-Smith, J. Isaac- Renton, C. Clark, K. Rahn, and J. B. Kaper. 2003. Association of genomic O island 122 of Escherichia coli EDL 933 with verocytotoxin-producing Escherichia coli seropathotypes that are linked to epidemic and/or serious disease. J. Clin. Microbiol. 41: 4930-4940.

Levine, M. M. 1987. Escherichia coli That Cause Diarrhea - Enterotoxigenic, Enteropathogenic, Enteroinvasive, Enterohemorrhagic, and Enteroadherent. J. Infect. Dis. 155: 377-389.

Mackay, I. 2007. Real-time PCR in Microbiology, from diagnosis to characterization. Caister Academic Press, Norfolk, UK.

Nataro, J. P. and J. B. Kaper. 1998. Diarrheagenic Escherichia coli. Clinical Microbiol. Rev. 11: 142-201.

Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., and Hase, T. 2000 Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Research 28, no. 12: E63.

Scheutz F, Nielsen EM, Frimodt-M0ller J, Boisen N, Morabito S, Tozzoli R, Nataro JP, Caprioli A. Characteristics of the enteroaggregative Shiga toxin/verotoxin-producing Escherichia coli O104:H4 strain causing the outbreak of haemolytic uraemic syndrome in Germany, May to June 2011. Euro Surveill. 2011 Jun 16; 16(24).

5 Spears KJ, Roe AJ, Gaily DL. 2006. A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis. FEMS Microbiol Lett. Feb;255(2):187-202.

Struelens MJ, Palm D, Takkinen J. Enteroaggregative, Shiga toxin-producing Escherichia coli O104:H4 outbreak: new microbiological findings boost coordinated investigations by European public health laboratories. Euro Surveill. 2011 Jun 16; 16(24).

10 Tobe T, Beatson SA, Taniguchi H, Abe H, Bailey CM, Fivian A, Younis R, Matthews S, Marches O, Frankel G, Hayashi T, Pallen MJ. 2006. An extensive repertoire of type III secretion effectors in Escherichia coli O157 and the role of lambdoid phages in their dissemination. Proc Natl Acad Sci USA. Oct 3; 103 (40): 14941-6.

Vlisidou I, Marches O, Dziva F, Mundy R, Frankel G, Stevens MP. 2006. Identification and characterization of EspK, a type III secreted effector protein of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. FEMS Microbiol Lett. 15 Oct;263(1):32-40.

Walker, G., Fraiser, M., Schram, J., Little, M., Nadeau, J., and Douglas P. Malinowski, D. 1992 Strand Displacement Amplification—An Isothermal, In Vitro DNA Amplification Technique, Nucleic Acids Research 20, no. 7: 1691-1696.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar el(los) serotipo(s) de Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) que se sospecha que están presentes en una muestra, donde dicho método comprende detectar la presencia o la ausencia, en dicha muestra o ADN aislado de la misma, de las siguientes secuencias CRISPR de E. coli:

a) Secuencias CRISPR para identificar ECEH O157:[H7] en donde dichas secuencias CRISPR se seleccionan entre

- las secuencias CRISPR SEQ ID NO; 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 3, en donde la presencia de una o más de dichas CRISPR SEQ ID NO: 1-3 es indicativa de la presencia de ECEH O157:[H7]; y/o;

- la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 4, en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O157:[H7];

b) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O145:[H28], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 5, y en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O145:[H28]; y

c) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O111:[H8], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 6, y en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O111:[H8]; y

d) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O121:[H19], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 7, y en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O121:[H19]; y

e) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O103:[H2] y/o ECEH O45:[H2], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 8, y en donde la presencia de la secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de O103:[H2] y/o de ECEH O45:[H2]; y

f) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O104:[H4], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 9, y en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O104:[H4]; y

g) una secuencia CRISPR para identificar ECEH O26:[H11], en donde dicha secuencia CRISPR es la secuencia SEQ ID NO: 10, y en donde la presencia de dicha secuencia CRISPR es indicativa de la presencia de ECEH O26:[H11].
2. Un método de la reivindicación 1, en donde dicho método comprende realizar un ensayo de PCR sobre dicha muestra o ADN aislado de la misma con una combinación de cebadores que se dirigen a dicha secuencia CRISPR.
3. Un método de la reivindicación 2, en donde dicha combinación de cebadores comprende:

a) cebadores para detectar ECEH O157:[H7], en donde dichos cebadores consisten en:

- un conjunto de cebadores que se dirigen a las secuencias CRISPR SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, en donde dichos cebadores se definen por las siguientes secuencias:

GGGAACACAAACCGAAACACA (SEQ ID NO: 11)

CTTAGTGTGTTCCCCGCGC (SEQ ID NO: 12) y

- un conjunto de cebadores que se dirigen a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 3 en donde dichos cebadores se definen por las siguientes secuencias:

GAACACTTTGGTGACAGTTTTTGT (SEQ ID NO: 13);

CTTAGTGTGTTCCCCGCGC (SEQ ID NO: 14),

en donde la presencia de un producto de amplificación para al menos uno de dichos conjuntos de cebadores es indicativa de la presencia de ECEH O157:[h7]; y/o:

- un conjunto de cebadores que se dirigen a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 4, en donde dichos cebadores se definen por las siguientes secuencias:

GAACACAAACCGAAACACACG (SEQ ID NO: 15)

5

10

15

20

25

30

35

40

ATAAACCGTCACCAAAACAGTG (SEQ ID NO: 16),

en donde la presencia de un producto de amplificación para dicho conjunto de cebadores es indicativa de la presencia de ECEH O157:[H7]; y

b) cebadores para detectar ECEH O145:[H28], en donde dichos cebadores consisten en:

- un conjunto de cebadores que se dirigen a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 5, en donde dichos cebadores se definen por las siguientes secuencias:

GAACTTGAGCCCTGCCAGAA (SEQ ID NO: 17)

ACCGCGATCTTTTCCTACCTG (SEQ ID NO: 18),

en donde la presencia de un producto de amplificación para dicho conjunto de cebadores es indicativa de la presencia de la presencia de ECEH O145:[H28]; y

c) cebadores para detectar ECEH O111:[H8], en donde dichos cebadores consisten en:

- un conjunto de cebadores que se dirigen a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 6, en donde dichos

cebadores se definen por las siguientes secuencias:

GTGACCGCCTGTACACGC (SEQ ID NO: 19)

CGGATATTTGGGCGTAATACC (SEQ ID NO: 20)

CTGCCGCGAGTGGTTTCAC (SEQ ID NO: 21),

en donde la presencia de un producto de amplificación para al menos uno de los pares de cebadores SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21 es indicativa de la presencia de ECEH O111:[H8]; y

d) cebadores para detectar ECEH O121:[H19], en donde dichos cebadores consisten en:

- un conjunto de cebadores que se dirigen a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 7, en donde dichos

cebadores se definen por las siguientes secuencias:

CGGGGAACACTACAGGAAAGAA (SEQ ID NO: 22)

GGCGGAATACAGGACGGGTGG (SEQ ID NO: 23),

en donde la presencia de un producto de amplificación para dicho conjunto de cebadores es indicativa de la presencia de ECEH O121:[H19]; y

e) cebadores para detectar ECEH O103:[H2] y/o ECEH O45:[H2], en donde dichos cebadores consisten en:

- un conjunto de cebadores que se dirigen a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 8, en donde dichos cebadores se definen por las siguientes secuencias:

GAGTCTATCAGCGACACTACC (SEQ ID NO: 24)

AACCGCAGCTCGCAGCGC (SEQ ID NO: 25),

en donde la presencia de un producto de amplificación para dicho conjunto de cebadores es indicativa de la presencia de ECEH O103:[H2] y/o de ECEH O45:[H2]; y

f) cebadores para detectar ECEH O104:[H4], en donde dichos cebadores consisten en:

- un conjunto de cebadores que se dirigen a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 9, en donde dichos cebadores se definen por las siguientes secuencias:

GGAACTCACCGAGCGCCG (SEQ ID NO: 26);

GCCTTTGCAGCGTCTTTCCGATC (SEQ ID NO: 27);

en donde la presencia de un producto de amplificación para dicho conjunto de cebadores es indicativa de la presencia de ECEH O104:[H4]; y

g) cebadores para detectar ECEH O26:[H11], en donde dichos cebadores consisten en:

- dos conjuntos de cebadores que se dirigen a la secuencia CRISPR SEQ ID NO: 10, en donde el primer conjunto de cebadores está definido por las siguientes secuencias:

5

10

15

20

25

30

35

40

ACAATCGTGTGTAAATTCGCGG (SEQ ID NO: 28)

GATAAACCGTGGTACGGAACA (SEQ ID NO: 29) y el segundo dicho conjunto de cebadores está definido por las siguientes secuencias:

TGAAACCACTCGCGGCAGAT (SEQ ID NO: 30);

ATAAACCGATCTCCTCATCCTC (SEQ ID NO: 31);

en donde la presencia de un producto de amplificación para al menos uno de los dichos conjuntos de cebadores es indicativa de la presencia de ECEH O26:[H11].
4. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una etapa previa para predecir si dicha muestra contiene Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) de al menos uno de los serotipos O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11], O45:[H2] y O104:[H4] de ECEH, en donde dicho método además comprende la detección del gen espK y de uno o más de los siguientes genes diana: espV, ureD, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156, y Z6065.
5. Un método de la reivindicación 4, en donde dicha etapa previa para predecir si dicha muestra contiene Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) de al menos uno de los serotipos O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11], O45:[H2] y O104:[H4] de ECEH, comprende la detección del gen espK, de al menos un gen seleccionado entre espV, ureD, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156, y del gen Z6065.
6. Un método de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en donde dicha etapa previa para predecir si dicha muestra contiene Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) de al menos uno de los serotipos O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11], O45:[H2] y O104:[H4] de ECEH comprende realizar un ensayo de PCR sobre dicha muestra o ADN aislado de la misma con una combinación de cebadores que comprende un conjunto de cebadores derivados de espK y un conjunto de cebadores derivados de al menos uno de espV, ureD, Z2098, Z1151, Z1153, Z1154, Z1155, Z1156, y Z6065 y detectar la presencia o la ausencia de un producto de amplificación para cada conjunto de cebadores de dicha combinación.
7. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde dicha etapa previa para predecir si dicha muestra contiene Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) de al menos uno de los serotipos O157:[H7], O145:[H28], O103:[H2], O111:[H8], O121:[H19], O26:[H11], O45:[H2] y O104:[H4] de ECEH comprende además realizar un ensayo de PCR sobre dicha muestra o ADN aislado de la misma con una combinación de cebadores que comprende un conjunto de cebadores derivados de stxl y un conjunto de cebadores derivados de stx2 y detectar la presencia o la ausencia de un producto de amplificación para cada conjunto de cebadores de dicha combinación.
8. Un kit para la identificación del(de los) serotipo(s) de Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH), que comprende los conjuntos de cebadores definidos en la reivindicación 3, y opcionalmente las sondas para detectar los productos de amplificación para cada dicho conjunto de cebadores.
9. Un kit de la reivindicación 8, que comprende además un conjunto de cebadores derivados de espK, y al menos un conjunto de cebadores seleccionados entre: un conjunto de cebadores derivados de espV, un conjunto de cebadores derivados de ureD, un conjunto de cebadores derivados de Z2098, un conjunto de cebadores derivados de Z1151, un conjunto de cebadores derivados de Z1153, un conjunto de cebadores derivados de Z1154, un conjunto de cebadores derivados de Z1155, un conjunto de cebadores derivados de Z1156, un conjunto de cebadores derivados de Z6065, y opcionalmente las sondas para detectar los productos de amplificación para cada dicho conjunto de cebadores.
10. Un kit de una de las reivindicaciones 8 o 9, que comprende además un conjunto de cebadores que se dirigen a stxl y stx2, y opcionalmente una sonda para detectar el producto de amplificación a partir de stxl y una sonda para detectar el producto de amplificación a partir de stx2.